DE69620870T2

DE69620870T2 - Affinitäts-selektion von liganden mittels massenspektroskopie

Info

Publication number: DE69620870T2
Application number: DE69620870T
Authority: DE
Inventors: D. Dollinger; D. Huebner
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1995-01-19
Filing date: 1996-01-16
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2016-01-17
Also published as: EP0804729B1; JPH10512673A; AU4963796A; DE69620870D1; CA2209988C; US5891742A; JP3422493B2; WO1996022530A1; ATE216777T1; CA2209988A1; EP0804729A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete Arzneimittelentwicklung und Massenspektroskopie. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der Massenspektroskopie zur Identifizierung von Liganden, die an einen selektierten Rezeptor aus einem Pool ähnlicher Liganden binden.

Hintergrund der Erfindung

Geysen, EP 198855, beschreibt ein Verfahren zur gleichzeitigen Synthese einer großen Anzahl unterschiedlicher Peptide. Grundsätzliche umfasst dieses Verfahren die Synthese von Peptiden an der Oberfläche eines festen Polymers, z. B. Polyethylen, das in die Form eines Stabs oder eines Stifts geformt sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens sind diese Stäbe oder Stifte so in einer Halterung positioniert, dass sie eine 12 mal 8-Matrix bilden, wobei die Stäbe oder Stifte so positioniert sind, dass der Abstand dem der Vertiefungen von Mikrotiterplatten entspricht, die in großem Umfang ELISA (Enzym-gekoppelte Immunoassay)-Tests verwendet werden.
Huebner et al., US 5,182,366 offenbaren ein Verfahren zur Herstellung großer Gemische von Peptiden an Festphasenharzen in äquimolaren Verhältnissen. Dies ermöglicht eine schnelle Suche nach Verbindungen, die an einen Liganden binden oder mit einem Liganden reagieren, indem der Ligand (z. B. ein gebundener Rezeptor) mit einem Satz von Peptidgemischen in Kontakt gebracht wird und festgestellt wird, welche Glieder des Satzes binden oder reagieren. Typischerweise werden die Sätze präpariert, indem eine bekannte Aminosäure an einer Position oder zwei Positionen eines Oligopeptids spezifiziert wird und Gemische von Aminosäuren an den anderen Positionen bereitgestellt werden. So könnte ein Peptidgemisch aus einem Pool von Hexapeptiden der Formel Gly-Gly-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4;, worin X anzeigt, dass alle Aminosäuren in dieser Position gefunden werden, bestehen. Das nächste Peptidgemisch wäre Gly-Ala-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4;, gefolgt von Gly-Cys-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4;, usw. Der Satz, der aus all diesen Gemischen besteht, wird als "Bibliothek" bezeichnet. Eine Bibliothek wird durchgemustert, indem jedes einzelne Gemisch untersucht wird und notiert wird, welche Gemische eine positive Antwort erzeugen. In einigen Formaten können die Gemische gleichzeitig durchgemustert werden. Die positiven Gemische werden dann mit zusätzlichen spezifizierten Positionen resynthetisiert. Wenn z. B. das Gemisch, das Phe-Tyr-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;- X&sub4; enthält, positiv war, dann könnte das nächste synthetisierte Gemisch Phe-Tyr-Gly-X&sub1;-X&sub2;-X&sub3;-X&sub4; sein. Dieses Verfahren (als "Entfaltung" ("deconvolution") bezeichnet) wird wiederholt, bis einzelne Peptide synthetisiert und untersucht sind.
Bartlett et al., WO 91/19735 und Zuckermann et al., WO 94/06451 offenbarten ein Verfahren zur Ausdehnung einer kombinatorischen Bibliothekssynthese auf andere Verbindungen als Peptide. Bartlett und Zuckermann haben Modulverbindungen beschrieben, die auf N-substituierten Polyamiden, Polycarbamaten und anderen Hauptketten beruhen, was es ermöglicht, nach Nichtpeptidverbindungen zu forschen. Diese Bibliotheken werden ebenfalls durch Entfaltung analysiert.
US-A-4 022 876 offenbart einen immunologischen Assay, in dem stabile oder langlebige Isotope bestimmter Elemente verwendet werden, um Antigene oder Antikörper zu markieren; der Immunoassay wird durch Massenspektrometrie analysiert.

Offenbarung der Erfindung

Wir haben nun ein Verfahren zur direkten Bestimmung der Identität von Bindungsliganden durch Massenspektrometrie, Eliminierung der Notwendigkeit der Entfaltung von Verbindungspools erfunden. Dies erlaubt es, kombinatorische Bibliotheksresultate direkt ohne Resynthese der Gemische zu analysieren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der relativen Affinitäten ähnlicher aktiver Verbindungen, die in einem Gemisch vorliegen, durch Selektieren von Verbindungen bei zwei oder mehreren verschiedenen Verbindung:Ziel-Verhältnissen und durch Vergleich der Spektren.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Selektieren einer Verbindung bereit, die fähig ist, an ein selektiertes Ziel zu binden, wobei die Verbindung in einem Gemisch aus Verbindungen vorliegt und das Verfahren umfasst:
a) Bereitstellen eines Gemisches aus mindestens 10 Verbindungen, die im Wesentlichen durch dasselbe Syntheseverfahren bereitgestellt wurden, und einer Zielkomponente;
b) Inkontaktbringen des Ziels mit dem Gemisch aus Verbihdungen unter Bildung von Verbindung-Ziel-Komplexen;
c) Abtrennen der Verbindungen, die nicht an das Ziel binden, von den Verbindung-Ziel-Komplexen; und
d) Durchführen der Verbindung-Ziel-Komplexe durch ein Massenspektrometer.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Bestimmung der relativen Affinitäten von Verbindungen bezüglich einer Zielverbindung bereit, wobei das Verfahren umfasst:
a) Bereitstellen eines Gemisches aus mindestens 10 Verbindungen, die im Wesentlichen durch das selbe Syntheseverfahren hergestellt wurden, und einer Zielkomponente;
b) Inkontaktbringen des Ziels mit dem Gemisch aus Verbindungen in einem ersten Verbindung: Ziel-Verhältnis unter Bildung von Verbindung-Ziel-Komplexen;
c) Abtrennen der Verbindungen, die nicht an das Ziel binden, von den Verbindung-Ziel-Komplexen;
d) Durchführen der Verbindung-Ziel-Komplexe durch ein Massenspektrometer unter Erhalt eines ersten Spektrums; und
e) Wiederholen der Stufen a) bis d) bei einem zweiten Verbindung:Ziel-Verhältnis, das sich von dem ersten Verbindung:Ziel-Verhältnis unterscheidet, unter Erhalt eines zweiten Spektrums.

Modi zur Durchführung der Erfindung

A. Definitionen

Der Ausdruck "Ziel" bezieht sich auf eine beliebige Verbindung, ein Protein, einen Rezeptor oder dergleichen, für die eine bindende oder reagierende Verbindung gesucht wird. Wenn z. B. eine Bibliothek nach Verbindungen durchgemustert wird, die an den Endothelrezeptor binden, ist der Endothelrezeptor das Ziel. Das Ziel kann löslich sein oder z. B. an einer festen Phase oder einer Zelloberfläche immobilisiert sein.
Der Ausdruck "Verbindung" bezieht sich auf eine chemische Einheit, die durch Massenspektroskopie analysiert werden kann und die biologische Aktivität hat. Verbindungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 1000 amu, bevorzugter von etwa 200 bis 900 amu. Der Ausdruck "ähnliche Verbindungen" bezieht sich auf einen Satz von Verbindungen, die im Wesentlichen durch dasselbe Syntheseverfahren hergestellt wurden und die vorzugsweise bestimmte Eigenschaften gemeinsam haben. Beispielsweise bildet ein Gemisch aus Peptiden einen Satz ähnlicher Verbindungen im Rahmen dieser Definition. Ein Satz aus Peptoiden, die auf einer gemeinsamen Hauptkette basieren, ist ein Satz ähnlicher Verbindungen, ungeachtet des Unterschieds in der Polarität, Hydrophobität, dem pK oder anderer Eigenschaften.
Der Ausdruck "Gemisch ähnliche Verbindungen "bezieht sich auf eine Lösung oder Suspension ähnlicher Verbindungen (wie sie oben definiert sind), die mindestens 10 verschiedene Verbindungen, bevorzugter mindestens 100 verschiedene Verbindungen, noch bevorzugter mindestens 1000 verschiedene Verbindungen hat.

B. Allgemeines Verfahren

Eine Affinitätsselektion wird durchgeführt, indem Verbindungsgemische, die typischerweise aus einer kombinatorischen Bibliothek resultieren, verwendet werden. Die Verbindungen sind vorzugsweise eher löslich als an eine feste Phase gebunden und haben vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen etwa 200 und etwa 700 Dalton. Die Verbindungen können nach einem beliebigen Verfahren, vorzugsweise dem, das von Bartlett et al., WO 91/19735, beschrieben ist, oder dem, das von Zuckermann et al., WO 94/06451 beschrieben ist, hergestellt werden.
Das Ziel kann entweder gebunden oder löslich sein, ist aus kinetischen Gründen aber vorzugsweise löslich. Das Ziel wird typischerweise unter Verwendung gängiger Techniken der Molekularbiologle bereitgestellt. Immobilisierte Ziele werden bereitgestellt, indem z. B. ein clonierter Rezeptor an der Oberfläche einer geeigneten Wirtszelle (z. B. eine transfizierte CHO-Zelle oder eine rekombinante Baculovirus-infizierte Sf9- Zelle) exprimiert wird oder indem der Rezeptor in löslicher Form (z. B. durch Stutzen des Rezeptors, so dass eine Transmembranankerdomäne ausgeschlossen ist) exprimiert und an einer geeigneten Oberfläche (z. B. durch nichtspezifische Affinität zu Nylon- oder Polystyrol-Assayplatten oder durch spezifische Bindung unter Verwendung von Antikörpern oder Biotin-Avidin-Kupplungssystemen) immobilisiert wird.
Das Ziel und die Verbindungen (oder die Bibliothek) werden entweder in Lösungsphase oder mit einer Komponente, die an eine feste Phase gebunden ist, in Kontakt gebracht, reagieren oder binden gelassen, und dann werden die nichtbindenden Verbindungen von den bindenden Verbindungen (oder Verbindung- Ziel-Komplexen) abgetrennt. Wenn die Verbindungen oder das Ziel an eine feste Phase gebunden sind, wird diese Trennung einfach durch Waschen des Festphasenträgers erreicht. Wenn der Assay in Lösung durchgeführt wird, kann die Trennung mit Hilfe einer Größentrennungssäule oder eines Affinitätseinfangens des Ziels erfolgen. Größentrennungssäulen sind im Allgemeinen nützlich, da alle Verbindungen in einer gegebenen Bibliothek wahrscheinlich eine ähnliche Größe haben und wahrscheinlich viel kleiner sind als das Ziel oder der Verbindung-Ziel-Komplex. Eine Affinitätseinfangen kann angewendet werden, indem z. B. das Ziel mit einem "tag" oder Liganden versehen wird, das/der an einen Antikörper oder Bindungspartner (z. B. Avidin/Biotin) bindet. Derzeit ist es bevorzugt, nichtgebundene Verbindungen von Verbindung-Ziel-Komplexen durch einer schnellen Größenausschlusschromatographie-HPLC (SEC-HPLC) zu trennen.
Wenn die Verbindungen abgetrennt sind, werden sie entweder von den Zielen eluiert oder direkt einer Massenspektrometrie (MS)-Analyse unterworfen. Eine Elution kann durch Verdünnung, pH, Wettbewerb mit einem spezifischen Liganden und dergleichen erfolgen. Einige MS-Ionisationsmethoden, z. B. Elektrospray, APCI, Laserdesorption und Elektronenstoß sind ausreichend, um die Verbindung von dem Ziel zu disoziieren und können somit direkt ohne vorherige Elution angewendet werden. So kann eine SEC-HPLC-Säule direkt an den Eingang eines Es-MS zur Bildung eines Geräts mit schnellem Durchsatz gekoppelt sein. Bei Kenntnis der vorliegenden potentiellen Verbindungen (d. h. der Verbindungen, die im Anfangsgemisch vorliegen), kann man die meisten oder alle bindenden Verbindungen, die aus dem Gemisch selektiert werden, typischerweise unter Verwendung eines MS-Detektors mit einer Auflösung von etwa 1 amu identifizieren.
Die exakten verwendeten Parameter (z. B. Lösungsmittel, Temperaturen, pH und dergleichen) werden in Folge der breiten allgemeinen Natur des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Diversität möglicher Verbindungen und Ziele in Abhängigkeit von den Verbindungen und dem Ziel ausgewählt. Allerdings können solche Parameter unter Anwendung von Routineversuchen bestimmt werden, wobei als Ausgangspunkt die physiologischen Bedingungen genommen werden, von denen erwartet wird, dass die Verbindung und das Ziel in vivo bei diesen wechselwirken. Ausgehend von diesen Anfangsbedingungen kann man das Lösungsmittel oder den Träger verändern, um eine Solubilisierung hydrophober Ziele und/oder Verbindungen zu unterstützen, und man kann im Allgemeinen die Temperatur, den pH und die Ionenstärke erhöhen, um den Assay stringenter zu machen. Man kann bei etwa 500 umol Rezeptor und 500 umol jeder Verbindung (etwa 1 umol für das Gemisch als ganzes) mit oder ohne Überschuss eines kompetitiven Liganden beginnen.
Außerdem kann man Strukturaffinitätsbeziehungen (SAR) ableiten, indem man das Verhältnis Verbindung:Ziel verändert. Bei einem 1 : 1 Verhältnis Verbindung:Ziel z. B. werden nur die engsten Bindungsverbindungen selektiert. Wenn aber das Verhältnis auf 0,3 : 1 Verbindung: Ziel reduziert wird, werden auch Verbindungen mit geringerer Affinität selektiert. Ein Vergleich der Massenspektren, die bei verschiedenen Verhältnissen erhalten werden, liefert einen Hinweis für die relativen Affinitäten der im Gemisch vorhandenen Verbindungen. Verbindungen, die in Spektren vorliegen, die bei hohen Verhältnissen Verbindung:Ziel aufgenommen wurden, zeigen eine hohe Affinität, während Verbindungen, die nur in Spektren vorliegen, die bei niedrigen Verbindung:Ziel-Verhältnissen aufgenommen wurden, eine Affinität zeigen, die unter der der ersten Gruppe liegt. Zusammen mit der Kenntnis der selektierten Verbindungen erlaubt diese Information es, schnell zu bestimmen, welche Merkmale der Verbindungen (z. B. Vorliegen hydrophiler oder hydrophober Gruppen, Wasserstoffbindung, Aromatizität) für die Aktivität wichtig sind. Die Bestimmung wird vorzugsweise bei 3 oder mehr unterschiedlichen Verhältnissen Verbindung:Ziel, z. B. bei Verhältnissen 3 : 1, 1 : 1, 0,3 : 1, 0,01 : 1 und 0,03 : 1 Verbindung: Ziel durchgeführt.

C. Beispiele

Die im folgenden angeführten Beispiele werden als weiterer Leitfaden für den Fachmann auf diesem Gebiet angeführt und sind nicht zur Beschränkung der Erfindung in irgendeiner Weise gedacht.

Beispiel 1

(Selektion von sUPAR-bindenden Verbindungen)

Humaner Urokinase-Plasminogen-Aktivator-Rezeptor (UPAR) wurde in löslicher, geglätteter Form exprimiert, wie es von Rosenberg et al., WO 94/28145 beschrieben wird; diese Literaturstelle wird hier als Referenz aufgenommen. Peptoid- Verbindungen wurden hergestellt, wie es von Bartlett et al., WO 91/19735 beschrieben ist. Es wurden vier N-substituierte Glycinpeptoide hergestellt, die Tyramin in der ersten Nterminalen Position, 5-Aminoindan in der zweiten Position und die folgenden Seitenketten in der dritten (letzten) Position haben: Diphenyl, Phenylphenylether, Indan und 1,4- Benzodioxan. Von den Verbindungen, die Diphenyl oder Phenylphenylether in der dritten Position haben, wurde gezeigt, dass sie Affinität für uPAR (> 10 umol) aufweisen, während die beiden anderen Verbindungen unbedeutende Aktivität zeigten. Der Ligand uPA&sub1;&submin;&sub4;&sub8; wurde hergestellt, wie es von Rosenberg, supra, beschrieben ist.
Ein Gemisch aus 576 N-substituierten Glycinpeptoiden, einschließlich der vier oben spezifizierten Verbindungen, wurde hergestellt. Das Gemisch (1 umol pro Verbindung) wurde in Gegenwart und in Abwesenheit von uPA&sub1;&submin;&sub4;&sub8; (2 umol) mit sUPAR (1 gmol) in Kontakt gebracht, 30 Minuten inkubiert und auf eine SEC-HPLC-Säule (Pharmacia HSIO/IO) aufgetragen. Der Verbindung-Ziel-Komplex, der in dem Ausschlussvolumen der Säule eluiert wurde, wurde gesammelt und mit einem ES-MS (PE-Sciex) analysiert. Die Resultate zeigten, dass dieselben zwei Peptoide (die Diphenyl oder Phenylphenylether in der dritten Position hatten) selektiert wurden, wenn sie in Abwesenheit von uPA&sub1;&submin;&sub4;&sub8; in Kontakt gebracht wurden: Die Spezifität wurde durch Kompetition in Gegenwart von uPA&sub1;&submin;&sub4;&sub8; bestätigt. Die Identität der Verbindungen wurde durch Fragmentierung in einem CCID- Massenspektrum (stoßinduzierte Dissoziation) bestätigt.
Die Resultate beweisen, dass selbst Verbindungen mit einer relativ geringen Affinität für das Ziel schnell und genau selektiert werden können, ohne dass die Notwendigkeit für eine Deconvolution besteht.

Claims

1. Verfahren zum Selektieren einer Verbindung, die fähig ist, an ein selektiertes Ziel zu binden, wobei die Verbindung in einem Gemisch aus Verbindungen vorliegt und das Verfahren umfasst:

a) Bereitstellen eines Gemisches aus mindestens 10 Verbindungen, die im Wesentlichen durch dasselbe Syntheseverfahren hergestellt wurden, und einer Ziel-Komponente;

b) Inkontaktbringen des Ziels mit dem Gemisch aus Verbindungen unter Bildung von Verbindung-Ziel-Komplexen;

c) Abtrennen der Verbindungen, die nicht an das Ziel binden, von den Verbindung-Ziel-Komplexen; und

d) Durchführen der Verbindung-Ziel-Komplexe durch ein Massenspektrometer.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch aus Verbindungen und das Ziel löslich sind.

3. Verfähren nach Anspruch 2, wobei Stufe c) Auftragen der Verbindungen und Komplexe auf eine chromatographische Säule umfasst.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die chromatographische Säule eine Größentrennungssäule umfasst.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die chromatographische Säule eine reversed phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule umfasst.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Massenspektrometer ein Elektrospray-MS ist.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das außerdem umfasst:

e) Identifizierung einer Verbindung, die an einem Verbindung-Ziel-Komplex beteiligt ist.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gemisch aus Verbindungen ein Gemisch aus mindestens 100 Verbindungen ist, die im Wesentlichen nach demselben Syntheseverfahren hergestellt wurden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Gemisch aus Verbindungen ein Gemisch aus mindestens 1000 Verbindungen ist, die im Wesentlichen nach demselben Syntheseverfahren hergestellt wurden.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verbindungen in dem. Gemisch ein Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 1000 amu haben.

11. Verfahren zur Bestimmung der relativen Affinitäten von Verbindungen bezüglich einer Zielverbindung, wobei das Verfahren umfasst:

a) Bereitstellen eines Gemisches aus mindestens 10 Verbindungen, die im Wesentlichen durch dasselbe Syntheseverfahren hergestellt wurden, und einer Zielkomponente;

b) Inkontaktbringen des Ziels mit dem Gemisch aus Verbindungen in einem ersten Verbindung: Ziel-Verhältnis unter Bildung von Verbindung-Ziel-Komplexen;

c) Abtrennen der Verbindungen, die nicht an das Ziel binden, von den Verbindung-Ziel-Komplexen;

d) Durchführen der Verbindung-Ziel-Komplexe durch ein Massenspektrometer unter Erhalt eines ersten Spektrums; und

e) Wiederholen der Stufen a) bis d) bei einem zweiten Verbindung. Ziel-Verhältnis, das sich von dem ersten Verbindung. Ziel-Verhältnis unterscheidet, unter Erhalt eines zweiten Spektrums.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Gemisch aus Verbindungen ein Gemisch aus mindestens 100 Verbindungen ist, die im Wesentlichen nach demselben Syntheseverfahren hergestellt wurden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Gemisch aus Verbindüngen ein Gemisch aus mindestens 1000 Verbindungen ist, die im Wesentlichen nach demselben Syntheseverfahren hergestellt wurden.

14. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, wobei die Verbindungen im Gemisch ein Molekulargewicht von etwa 1000 amu haben.