DE69619948T2 - Neues Nitrilase-Gen - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid mit Nitrilaseaktivität und ein Gen, das dieses codiert.
• Es ist bekannt, dass Mikroorganismen oder aus Mikroorganismen gewonnene Enzyme als Katalysatoren zur Hydrolyse von Nitrilverbindungen verwendet werden können, um Carbonsäuren, wie optisch aktive α-Hydroxysäuren (siehe die offengelegten japanischen Patentveröffentlichungs-Nrn. 99495/92, 99496/92, 218385/92 (= US 5.223.416, = EP-A- 0449648), 84198/90 (= US 5.283.193, = EP-B-0348901), 99497/92 (= US 5.234.826, = EP-A- 0473328), 192189/93 (= US 5.326.702, = EP-A-0486289) und 237789/94 (= EP-A-0610048)) und Aminosäuren herzustellen (siehe die offengelegten japanischen Patentveröffentlichungs- Nrn. 317394/89, 117493/91 und 79894/92).
• Verglichen mit solchen herkömmlichen Verfahren kann man erwarten, dass die Hydrolyse von Nitrilen durch ein Nitrilase-Gen, das durch genetische Rekombination cloniert wurde, die katalytische Fähigkeit von Mikroorganismen erheblich verbessert, da diese so konstruiert werden können, dass sie multiple Kopien des selben Gens enthalten.
• Kobayashi et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 20746-20751 beschreiben die Clonierung und Sequenzierung eines Nitrilase-Gens aus Rhodococcus rhodochrous J1 und die Herstellung der Nitrilase in E. coli.
• Um einen bakteriellen Katalysator mit höherer katalytischer Aktivität herzustellen und die vorliegende Erfindung fertig zu stellen, clonierten die Erfinder ein Nitrilase-Gen von Gordona terrae MA-1. Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid mit Nitrilaseaktivität und eine DNA, die dieses codiert. Des Weiteren kann es sich bei dieser DNA um ein Analogon handeln, das durch Homologie im genetischen Code gewonnen wurde.
• Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung eine DNA, die ein Polypeptid codiert, das Nitrilaseaktivität besitzt, und das eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Homologie dazu besitzt.
• Diese DNA kann die Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 enthalten. Die DNA kann imstande sein, an die Nucleotidsequenz der SEQ ID Nr. 2 oder ein Fragment davon, das ein Polypeptid codiert, welches Nitrilaseaktivität besitzt, zu hybridisieren. Es kann sich um isolierte DNA handeln.
• Die Erfindung stellt weiterhin bereit:
• - einen DNA-Expressionsvektor, umfassend eine DNA der Erfindung, die funktionell mit einem Promotor verknüpft ist;
• - eine Wirtszelle, umfassend eine oder mehrere Kopien einer DNA der Erfindung;
• - ein Polypeptid, das Nitrilaseaktivität und eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt, besitzt, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Homologie dazu;
• - ein Verfahren zur Herstellung einer Nitrilase, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle gemäß der Erfindung und gegebenenfalls die Gewinnung der Nitrilase; und
• - ein Verfahren zur Hydrolyse einer Nitrilverbindung, umfassend das Inkontaktbringen der Nitrilverbindung mit einer durch das Verfahren gemäß der Erfindung hergestellten Nitrilase unter Bedingungen, die geeignet sind, die entsprechende Carbonsäure, insbesondere eine α- Hydroxysäure herzustellen, wobei das Verfahren weiterhin gegebenenfalls die Gewinnung der Carbonsäure umfasst.
• Die beigefügte Zeichnung Fig. 1 stellt eine Restriktionsenzymkarte von pMA001 dar, in der die dicke Linie den Vektor pUC118 bezeichnet, und die dünne Linie den Bereich der von MA-1 erhaltenen DNA bezeichnet. Der Pfeil im Bereich der MA-1-DNA bezeichnet Lage und Richtung des Nitrilase-Gens, das in der vorliegenden Erfindung gefunden wurde.
• Im Folgenden wird die Erfindung in Einzelheiten beschrieben. Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Schritten durchgeführt.
(1) Herstellung chromosomaler DNA aus Gordona terrae MA-1
• Die chromosomale DNA wird isoliert und hergestellt aus MA-1.
(2) Herstellung einer Sonde
• Zwei Arten synthetischer DNA, die hoch homologen Teilsequenzen der verschiedenen Nitrilasen entsprechen, werden hergestellt und als Primer in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit der chromosomalen DNA aus MA-1 als Matrize verwendet, wodurch ein Teil eines Nitrilase-Gens amplifiziert wird. Das auf diese Weise amplifizierte Fragment wird als Sonde verwendet.
(3) Herstellung einer DNA-Genbank
• Um eine Genbank zu erhalten, wird die chromosomale DNA mit Restriktionsenzymen gespalten, und die entstehenden Fragmente werden in den Piasmidvektor pUC118 eingefügt.
(4) Herstellung von Transformanten und Auswahl rekombinanter DNA
• Die in Schritt (3) hergestellte rekombinante DNA-Genbank wird verwendet, um Escherichia coli zu transformieren, und die Transformanten werden durch Koloniehybridisierung abgesucht, wobei das in Schritt (2) erhaltene DNA-Fragment als Sonde verwendet wird, um eine Transformante zu identifizieren, die die rekombinante Ziel-DNA enthält.
(5) Herstellung eines rekombinanten Plasmids
• Ein Plasmid wird aus der in Schritt (4) erhaltenen Rekombinante hergesteht.
(6) Erstellung einer Restriktionskarte und Identifizierung der Lage des Nitrilase-Gens
• Eine Restriktionskarte des in Schritt (5) erhaltenen Plasmids wird erstellt und der Bereich (des Nitrilase-Gens), der mit der Sonde hybridisiert, identifiziert.
(7) Nucleotidsequenzierung
• Die Nucleotidsequenz in der Umgebung des Bereiches, der in Schritt (6) identifiziert wurde, wird bestimmt.
• Der Stamm MA-1 wurde als Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535) und das Plasmid pMA001, das das Nitrilase-Gen enthält, als Transformante E. coli JM109/pMA001 (FERM BP-5547), die das Gen enthält, im National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.
• Verglichen mit herkömmlichen Verfahren wird erwartet, dass die Hydrolyse von Nitrilen durch ein Nitrilase-Gen, das durch genetische Rekombination cloniert wurde, die katalytische Fähigkeit von Mikroorganismen erheblich verbessert, da diese so konstruiert werden können, dass sie multiple Kopien des selben Gens enthalten.
• Die vorliegende Erfindung wird in Einzelheiten durch Verweis auf folgende Beispiele erläutert, die jedoch nicht beabsichtigen, den Anwendungsbereich der Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1 (1) Herstellung chromosomaler DNA aus Gordona terrae MA-1
• MA-1 wurde bei 30ºC für 72 Stunden in 100 ml MY-Medium (0,5% Polypepton; 0,3% Bacto-Hefeextrakt; 0,3% Bacto-Malzextrakt; 1% Glucose) unter Schütteln angezogen. Die Zeilen wurden geerntet, und das Sediment wurde in 4 ml physiologischer Kochsalz- EDTA-Lösung (0,1 M EDTA; 0,15 M NaCl (pH 8,0)) suspendiert. Der Suspension wurden 8 mg Lysozym zugegeben. Die Suspension wurde bei 37ºC für 1 bis 2 Stunden inkubiert und dann eingefroren. Unter sanftem Schütteln wurde 10 ml Tris-SDS-Lösung (1% SDS, 0,1 M NaCl, 0,1 M Tris (pH 9,0)) zugegeben, dann wurde 0,1 mg Proteinase K (ein Produkt von Merck) zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert. Nach der Zugabe eines gleichen Volumes von TE-gesättigtem Phenol (TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8,0)) wurde gerührt und zentrifugiert. Dem Überstand wurde ein zweifacher Überschuss an Ethanol zugesetzt. Die so gefällte DNA wurde mit einem Glasstab gewonnen, und, um das Phenol zu entfernen, wurde die DNA der Reihe nach mit 90%, 80% und 70% Ethanol gespült. Dann wurde die DNA in 3 ml TE gelöst. Eine RNase A-Lösung (vorher für 15 Minuten bei 100ºC behandelt) wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 ug/ml zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von Proteinase K wurde die Probe bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Eine gleiche Menge von TE-gesättigtem Phenol wurde zugegeben, dann wurde das Gemisch durch Zentrifugation in obere und untere Phase getrennt. Die obere Phase wurde zweimal dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben unterworfen und mit der gleichen Menge an Chloroform, das 4% Isoamylalkohol enthielt, in der gleichen Weise extrahiert (diese Verfahren werden im Folgenden als Behandlung mit Phenol bezeichnet). Dann wurde ein zweifacher Überschuss an Ethanol zugegeben und die gefällte DNA mit einem Glasstab gewonnen, wodurch chromosomale DNA erhalten wurde.
(2) Herstellung einer Sonde
• 10 ul der in Schritt (1) erhaltenen chromosomalen DNA (20-fache Verdünnung), 10 ul Reaktionspuffer (10-fach konzentriert); 3 ul 50 mM MgCl&sub2;; 2 ul 10 mM dNTP, je 1 ul (100 pmol) des Oligonucleotids, dargestellt in SEQ ID Nr. 4 als Primer #1, und des Oligonucleotids, dargestellt in SEQ ID Nr. 5 als Primer #2; und 1 ul Taq-DNA-Polymerase (ein Produkt von GIBCO BRL) wurden gemischt und das Volumen wurde auf 100 ul aufgefüllt. Die Primer wurden auf der Basis von Aminosäuresequenzen, die eine hohe Homologie unter den bekannten Nitrilasen aufwiesen, entworfen. Die Lösung wurde bei 93ºC für 30 Sekunden (Denaturierungsschritt), bei 55ºC für 30 Sekunden (Anlagerungsschritt) und bei 72ºC für 2 Minuten (Verlängerungsschritt) inkubiert, und dieser Zyklus wurde 30-mal wiederholt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Amplifikationsprodukt 3-mal mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die so gewonnene DNA wurde durch Elektrophorese auf einem 0,7 %igem Agarosegel aufgetrennt, wobei ein etwa 500 bp (450 bis 550 bp) großes DNA- Fragment erhalten wurde, das in Betracht kam, das MA-1 Nitrilase-Gen zu codieren. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde mit Hilfe des DIG-DNA-Markierungs-Kits (Boehringer Mannheim) markiert und als Sonde verwendet.
(3) Herstellung einer DNA-Genbank
• 50 ul der chromosomalen DNA aus MA-1 wurden bei 37ºC für 10 bis 20 Minuten mit einem Gemisch aus 10 ul Reaktionspuffer (10-fach konzentriert), 37 ul sterilisiertem Wasser und 0,5 ul Restriktionsenzym Sau 3AI umgesetzt, und die DNA wurde durch Fällung mit Ethanol wiedergewonnen. Sie wurde durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und DNA-Fragmente mit einer Länge von 6 kb oder größer wurden aus dem Gel herausgeschnitten und mit DNA PREP (K. K. Dia Yatoron) wiedergewonnen. Diese DNA-Fragmente wurden in die Bam HI-Schnittstelle eines Fragmentes des E. coli-Vektors pUC 118 unter Verwendung eines Ligierungs-Kits (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingefügt, wodurch eine rekombinante DNA- Genbank erhalten wurde.
• Das in der Ligierung verwendete Fragment von pUC 118 wurde auf folgende Weise hergestellt.
• 10 ul pUC118 wurden bei 37ºC für 2 Stunden mit einem Gemisch aus 10 ul Reaktionspuffer (10-fach konzentriert), 77 ul sterilisiertem Wasser und 2 ul Restriktionsenzym Bam HI umgesetzt, und das Fragment wurde einer Behandlung mit Phenol unterworfen, dann mit Ethanol gefällt, getrocknet und in 50 ul sterilisiertem Wasser gelöst. Im Weiteren wurde es bei 65ºC mit einem Gemisch aus 1 ul Alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co. Ltd.), 10 ul Reaktionspuffer (10-fach konzentriert) und 39 ul sterilisiertem Wasser umgesetzt. Das Fragment wurde einer Behandlung mit Phenol unterworfen, dann mit Ethanol gefällt, getrocknet und in sterilisiertem Wasser gelöst.
(4) Herstellung von Transformanten und Auswahl rekombinanter DNA
• 1 ml LB-Medium (1% Bacto-Trypton; 0,5% Bacto-Hefeextrakt; 0,5% NaCl) wurde mit E. coli JM109 angeimpft und bei 37ºC für 5 Stunden inkubiert. 100 ul der Anzucht wurden zu 50 ml SOB-Medium (2% Bacto-Trypton; 0,5% Bacto-Hefeextrakt; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 1 mM MgSO&sub4;; 1 mM MgCl&sub2;) gegeben und bei 18ºC für 20 Stunden angezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, und 13 ml einer kalten TF- Lösung (20 mM PIPES-KOH (ph 6,0); 200 mM KCl; 10 mM CaCl&sub2;; 40 mM MnCl&sub2;) wurden zu dem Sediment gegeben. Das Sediment wurde bei 0ºC für 10 Minuten stehen gelassen und wieder zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Präzipitat aus E. coli wurde in 3,2 ml kalter TF-Lösung suspendiert. Der Suspension wurden 0,22 ml Dimethylsulfoxid zugegeben, und bei 0ºC für 10 Minuten stehen gelassen. Zu 200 ul auf diese Weise hergestellten kompetenten Zellen wurden 10 ul der rekombinanten Plasmide (DNA-Genbank), die in Schritt (3) erhalten worden waren, gegeben. Das Gemisch wurde bei 0 ºC für 30 Minuten stehen gelassen, dann bei 42ºC für 30 Sekunden mit Hitze geschockt und für 2 Minuten auf 0ºC abgekühlt, darauf erfolgte die Zugabe von 0,8 ml SOC-Medium (2% Bacto-Trypton; 0,5% Bacto-Hefeextrakt; 20 mM Glucose; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 1 mM MgSO&sub4;; 1 mM MgCl&sub2;). Das Gemisch wurde bei 37ºC für 60 Minuten unter Schütteln inkubiert. 200 ul der Kultur wurden pro Platte auf LB-Agar-Platten, die 100 ug/ml Ampicillin enthielten, ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37ºC inkubiert. Zur Auswahl einer Transformante mit einem Nitrilase-Gen wurden die auf der Platte wachsenden Kolonien wie folgt der Koloniehybridisierung unterworfen: Die auf der Platte wachsenden Kolonien wurden auf eine Nylonmembran (Biodain A, hergestellt durch Nippon Paul K. K.) übertragen, und die Mikroorganismen wurden lysiert. Die DNA wurde an die Membran gebunden und dann mit der Sonde (Fragment mit etwa 500 kb), die in Schritt (2) erhalten wurde, hybridisiert. Eine Transformante, welche die rekombinante Ziel-DNA besaß, wurde unter Verwendung des DIG-Lumineszenz-Erkennungs-Kits (Boehringer Mannheim) ausgewählt.
(5) Herstellung eines rekombinanten Plasmids
• Die in Schritt (4) ausgewählte Transformante wurde bei 37ºC in 100 ml LB-Medium über Nacht angezogen, dann geerntet und mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Zu den Zellen wurden 5 ml Lösung I (2 mM Glucose; 10 mM EDTA; 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)) und 25 mg Lysozym gegeben. Das Gemisch wurde bei 0ºC für 30 Minuten stehen gelassen. 10 ml der Lösung II (1 N NaOH; 5% SDS) wurden dem Gemisch zugegeben. Das Gemisch wurde bei 0 ºC für 5 Minuten stehen gelassen. 7,5 ml der Lösung III (3 M Natriumacetat (pH 4,8)) wurde dem Gemisch zugegeben. Das Gemisch wurde bei 0ºC für 30 Minuten stehen gelassen. Dann wurde das Gemisch zentrifugiert, anschließend wurden dem Überstand 50 ml Ethanol zugesetzt, und der Überstand wurde durch Zentrifugation entfernt. 5 ml der Lösung IV (10 mM Natriumacetat; 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)) und 2,5 ul einer Lösung von RNase A (10 mg/ml) wurden dazugegeben, und bei Zimmertemperatur für 20 Minuten stehen gelassen. 12 ml Ethanol wurden dazugegeben, und das Plasmid wurde durch Zentrifugation gewonnen und mit 70% Ethanol gespült, getrocknet und in 0,4 ml sterilisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde einer Behandlung mit Phenol unterworfen, und das Plasmid wurde durch Fällung mit Ethanol gewonnen, getrocknet und in 0,4 ml sterilisiertem Wasser gelöst. Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pMA001 bezeichnet.
(6) Herstellung einer Restriktionskarte und Identifizierung der Lage des Nitrilase-Gens
• Das Plasmid pMA001, das in Schritt (5) erhalten wurde, wurde mit mehreren Restriktionsenzymen geschnitten, um seine Restriktionskarte zu erstellen (Fig. 1). Getrennt davon, wurde pMA001 mit Restriktionsenzymen wie Kpn I, Xho I, Pst I, Sal I usw. geschnitten, und die Fragmente wurden einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen. Das Fragment, das mit der Sonde hybridisierte, wurde durch Southern-Hybridisierung identifiziert.
(7) Nucleotidsequenzierung
• Die Nucleotidsequenz in der Umgebung des Bereiches, der in Schritt (6) identifiziert wurde, wurde mit dem Fluoreszenz-Sequenzierer ALF II (Pharmacia) bestimmt. Das Ergebnis zeigt die Gegenwart einer Nucleotidsequenz an, wie sie in SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, und es wurde ein offenes Leseraster gefunden, das eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, codiert. Ein Vergleich mit der Aminosäure-Datenbank NBRF (National Biomedical Research Foundation) zeigte, dass dieses Gen auf Aminosäureebene 30 bis 50% Homologie mit bekannten Nitrilasen aufweist, und dass diese Nitrilase zudem hoch homologe Bereiche mit bekannten Nitrilasen gemeinsam hat, was vermuten läßt, dass es sich bei dieser Nitrilase um eine neuartige Nitrilase handelt. Die Nucleotidsequenz des offenen Leserasters ist in SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
Beispiel 2
• MA-1 wurde aerob bei 30ºC für 72 Stunden in einem Medium angezogen (20 g/l Glycerin; 3 g/l Hefeextrakt; 6,8 g/l Kaliumdihydrogenphosphat; 7,1 g/l Dinatriumhydrogenphosphat; 2,8 g/l Natriumsulfat; 0,4 g/l Magnesiumchlorid; 0,04 g/l Calciumchlorid; 0,03 g/l Mangansulfat; 0,006 g/l Eisenchlorid; 0,003 g/l Zinksulfat; 0,5 g/l Benzylcyanid). Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und das Sediment wurde mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,2) gewaschen und in dem gleichen Puffer suspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen und zentrifugiert, um einen Überstand (Zellextrakt) herzustellen. Ein Teil des Überstandes wurde einer SDS-Polyacrylamid- Elektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen und die Proteine wurden auf eine PVDF-Membran (Immobilon PSQ (ein Produkt von Millipore)) übertragen. Die Membran wurde mit Coomassie Blue gefärbt und eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 40 kDa, die nur erschien, wenn ein Induktor dem Medium zugefügt worden war, wurde ausgeschnitten, und ihre N-terminale Aminosäuresequenz wurde durch einen von der Shimadzu Corporation hergestellten PSQ-1 Aminosäure-Analysator bestimmt. Die so erhaltene Sequenz Thr-Thr- Asp-Tyr-Ser stimmt mit den N-terminalen Aminosäuren (unter Ausschluß des N-terminalen Met), die aus der Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 2) abgeleitet wurden, überein.
• Darüberhinaus läßt die Analyse der Aminsosäuresequenz vermuten, dass das N-terminale Met nicht abgespalten wird und noch vorhanden ist.
SEQUENZPROTOKOLL SEQ ID NR. 1:
• LÄNGE: 344 Aminosäuren
• ART: Aminosäure
• TOPOLOGIE: linear
• ART DES MOLEKÜLS: Protein
• QUELLE
• ORGANISMUS: Gordona terrae
• STAMM MA-1 BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 1:
SEQ ID NR. 2:
• LÄNGE: 1035 Basenpaare
• ART: Nucleinsäure
• STRÄNGIGKEIT: doppelt
• TOPOLOGIE: linear
• QUELLE
• ORGANISMUS: Gordona terrae
• STAMM: MA-1 BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 2:
SEQ ID NR. 3:
• LÄNGE: 1200 Basenpaare
• ART: Nucleinsäure
• STRÄNGIGKEIT: doppelt
• TOPOLOGIE: linear
• QUELLE
• ORGANISMUS: Gordona terrae
• STAMM: MA-1 BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 3:
SEQ ID NR. 4:
• LÄNGE: 20 Basenpaare
• ART: Nucleinsäure
BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 4:
• CGBCGBAARCTSAARCCNAC
• (In der Sequenz steht B für G, C oder T; R für G oder A; 5 für G oder C; und N für G, C, A oder T)
SEQ ID NR. 5:
• LÄNGE: 20 Basenpaare
• ART: Nucleinsäure
BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 5:
• GARTARTGRCCSACVGGRTC
• (In der Sequenz steht R für G oder A; S für G oder C; V für G, C oder A)

Claims (9)

1. DNA, die ein Polypeptid codiert, das Nitrilaseaktivität besitzt und eine Aminosäuresequenz aufweist, wie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90% Homologie dazu.

2. DNA nach Anspruch 1, die die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst.

3. DNA nach Anspruch 1, die in der Lage ist, mit der in SEQ ID Nr. 2 dargestellten Nucleotidsequenz oder einem Fragment davon zu hybridisieren, das ein Polypeptid mit Nitrilaseaktivität codiert.

4. DNA nach einem der vorangehenden Ansprüche, die eine isolierte DNA ist.

5. DNA-Expressionsvektor, umfassend eine DNA nach einem der vorangehenden Ansprüche, der funktionell mit einem Promotor verknüpft ist.

6. Wirtszelle, umfassend eine oder mehrere Kopien einer DNA nach einem der vorangehenden Ansprüche.

7. Polypeptid, das eine wie in Anspruch 1 definierte Nitrilaseaktivität besitzt.

8. Verfahren zur Herstellung einer Nitrilase, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle nach Anspruch 6 und gegebenenfalls die Gewinnung der Nitrilase.

9. Verfahren zur Hydrolyse einer Nitrilverbindung, umfassend das Inkontakibringen der Nitrilverbindung mit einer durch das Verfahren nach Anspruch 8 hergestellten Nitrilase unter Bedingungen, die geeignet sind, die entsprechende Carbonsäure, insbesondere eine α-Hydroxysäure herzustellen, wobei das Verfahren weiterhin gegebenenfalls die Gewinnung der Carbonsäure umfasst.