DE69535540T9

DE69535540T9 - Zusammensetzung enthaltend nukleinsäuren und kationische polymere, zubereitung und verwendung

Info

Publication number: DE69535540T9
Application number: DE69535540T
Authority: DE
Inventors: Jean-Paul Behr; Otmane Boussif; Barbara Demeneix; Franck Lezoualch; Mojgan Mergny; Daniel Scherman
Original assignee: Centelion SAS
Current assignee: Centelion SAS
Priority date: 1994-07-13
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 2012-03-15
Also published as: CA2194797C; JP4275728B2; DE69535540D1; CA2194797A1; EP0770140B1; ES2290952T3; US6013240A; IL114566A; ATE367448T1; NO323110B1; KR970704889A; JPH10502918A; FI970115L; IL114566A0; FI970115A0; MX9700270A; ZA955849B; KR100424802B1; FR2722506A1; PT770140E

Description

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen auf der Grundlage von Nukleinsäuren, deren Herstellung und deren Verwendung. Insbesondere betrifft sie Zusammensetzungen, welche wenigstens eine Nukleinsäure und bestimmte kationische Polymere umfassen, und deren Verwendung für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen, insbesondere im Rahmen einer Gentherapie.
Die Gentherapie besteht darin, einen Mangel oder eine Anomalie (Mutation, aberrante Expression u. s. w.) zu korrigieren oder die Expression eines Proteins von therapeutischem Interesse durch Einführung einer genetischen Information in die erkrankte Zelle oder das erkrankte Organ sicherzustellen. Diese genetische Information kann eingeführt werden entweder in vitro in eine aus dem Organ entnommene Zelle, wobei die modifizierte Zelle dann in den Organismus wieder eingeschleust wird, oder direkt in vivo in das geeignete Gewebe. Für den Transfer von dieser genetischen Information sind verschiedene Techniken beschrieben worden, darunter verschiedene Transfektionstechniken, an welchen Komplexe von DNA und von DEAE-Dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), von DNA und von nukleären Proteinen (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), von DNA und von Lipiden (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), von DNA und von Polylysin, der Einsatz von Liposomen (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) u. s. w. beteiligt sind. Vor kürzerer Zeit ist der Einsatz von Viren als Vektoren für den Transfer von Genen als eine vielversprechende Alternative zu diesen physikalisch-chemischen Transfektionstechniken in Erscheinung getreten. In dieser Hinsicht wurden verschiedene Viren auf ihr Vermögen, bestimmte Zellpopulationen zu infizieren, hin getestet. Insbesondere die Retroviren (RSV, HMS, MMS u. s. w.), das HSV-Virus, die adeno-assoziierten Viren und die Adenoviren.
Gleichwohl erlauben die bis heute entwickelten Techniken nicht, die mit dem Transfer von Genen in die Zellen und/oder den Organismus verbundenen Schwierigkeiten auf zufrieden stellende Weise zu meistern. Insbesondere sind die mit dem Eindringen der Nukleinsäure in die Zellen verbundenen Probleme nicht vollständig gelöst. Tatsächlich verhindert insbesondere die polyanionische Natur der Nukleinsäuren ihr Hindurchtreten durch die Zellmembranen hindurch. Wenn auch gezeigt worden ist, dass die nackten Nukleinsäuren in der Lage sind, durch die Plasmamembran von bestimmten Zelltypen in vivo hindurchzuwandern (siehe insbesondere die Anmeldung Nr. WO 90/11092 ), bleibt die Transfektionseffizienz ziemlich gering. Außerdem haben die nackten Nukleinsäuren eine kurze Plasma-Halbwertszeit aufgrund ihres Abbaus durch die Enzyme und deren Eliminierung durch das uropoetische System. Auch wenn außerdem die rekombinanten Viren erlauben, die Transfereffizienz der Nukleinsäuren zu verbessern, weist deren Einsatz bestimmte Risiken, wie Pathogenität, Übertragung, Replikation, Rekombination, Transformation, Immunogenität u. s. w., auf. Zudem weist deren Herstellung gemäß den Normen der guten Herstellungspraxis bestimmte Schwierigkeiten auf.
Die Patentanmeldung WO A 93 20090 offenbart Konjugate von kationischen Polymeren und Oligonukleotiden, die miteinander durch kovalente Bindung mittels eines Kopplungsmittels gekoppelt werden, wobei das Verhältnis von Kationen zu Anionen der Konjugate zwischen 0,8 und 2 eingeschlossen liegt.
Die Patentanmeldung EPA 0424688 offenbart ein Verfahren zum Modifizieren von pflanzlichen Zellen, um eine fremde DNA zu inkorporieren. Dieses Verfahren umfasst einen Vorbehandlungsschritt der Zellen mit einem Polykation, dann die Behandlung der vorbehandelten Zelle mit einer Suspension, welche Nukleinsäure und kationische Liposomen enthält.
Die Erfindung stellt eine vorteilhafte Lösung für diese unterschiedlichen Probleme bereit. Die Anmelderin hat tatsächlich gezeigt, dass bestimmte kationische Polymere besonders vorteilhafte Eigenschaften für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen in vitro wie in vivo aufweisen. Außerdem weisen diese Polymere den Vorteil auf, dass sie leicht zugänglich und wenig kostspielig sind. Die Verwendung der kationischen Polymere gemäß der Erfindung erlaubt gleichfalls, die mit dem Einsatz von viralen Vektoren verbundenen Unzulänglichkeiten (potentielle Gefahren, begrenzte Größe des transferierten Gens, hoher Preis u. s. w.) zu vermeiden.
Insbesondere besteht die Erfindung in dem Nachweis der transfizierenden Eigenschaften der Polymere der Formel (I):
in welcher:

– R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel
sein kann;
– n eine ganze Zahl zwischen 2 und 10 eingeschlossen ist;
– p und q ganze Zahlen sind, mit der Maßgabe, dass die Summe p + q derart ist, dass das mittlere Molekulargewicht des Polymers zwischen 100 und 10⁷ Da eingeschlossen liegt, und
– wobei die jeweiligen Anteile des Polymers und der Nukleinsäure derart ausgewählt werden, dass das Verhältnis R der Amingruppen des Polymers zu den Phosphatgruppen der Nukleinsäure zwischen 5 und 30 eingeschlossen liegt.

Es versteht sich, dass in der Formel (I) der Wert von n zwischen den verschiedenen Motiven p variieren kann. So fasst die Formel (I) zugleich die Homopolymere und die Heteropolymere zusammen.
Ein erster Gegenstand der Erfindung besteht folglich in einer Zusammensetzung, welche gebildet wird aus einer Nukleinsäure und einer Lösung eines kationischen Polymers, die vereinigt und homogenisiert worden sind, wobei das kationische Polymer die allgemeine Formel (I) aufweist, wie oben definiert.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Verwendung der kationischen Polymere der Formel (I) für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen.
Noch bevorzugter liegt in der Formel (I) n zwischen 2 und 5 eingeschlossen. Insbesondere weisen die Polymere von Polyethylenimin (PEI) und Polypropylenimin (PPI) ganz und gar vorteilhafte Eigenschaften auf.
Die bevorzugten Polymere für das Ausführen der Erfindung sind jene, deren Molekulargewicht zwischen 10³ und 5 × 10⁶ Da eingeschlossen liegt. Als Beispiel kann man Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 50000 Da (PEI50K) oder Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 800000 Da (PEI800K) aufführen.
Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Polymere können auf verschiedene Weisen erhalten werden. Sie können zuallererst chemisch ausgehend von dem entsprechenden Monomer unter Bedingungen einer anionischen Polymerisation (beispielsweise Polymerisation von Ethylenimin) oder durch Reduktion von Polyamiden, die durch Polykondensation von Disäuren mit Diaminen erhalten worden sind, oder ferner durch Reduktion von Iminen, die durch Polykondensation von Dialdehyden mit Diaminen erhalten worden sind, synthetisiert werden. Außerdem ist eine bestimmte Anzahl von diesen Polymeren kommerziell zugänglich, wie insbesondere PEI50K oder PEI800K.
Um eine optimale Wirkung der Zusammensetzungen der Erfindung zu erhalten, werden die jeweiligen Anteile des Polymers und der Nukleinsäure vorzugsweise derart bestimmt, dass das Molverhältnis R = Amingruppen des Polymers/Phosphatgruppen der Nukleinsäure zwischen 0,5 und 50 eingeschlossen, mehr bevorzugt zwischen 5 und 30 eingeschlossen liegt. Ganz besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erhalten, indem 5 bis 15 Äquivalente von Polymer-Amingruppen pro Nukleinsäure-Ladung eingesetzt werden. Dieses Verhältnis kann selbstverständlich durch den Fachmann auf diesem Gebiet abhängig von dem eingesetzten Polymer, dem Vorhandensein eines Hilfsstoffs (siehe unten), der Nukleinsäure, der Zielzelle und der verwendeten Verabreichungsweise angepasst werden.
In den Zusammensetzungen der Erfindung kann die Nukleinsäure ebenso gut eine Desoxyribonukleinsäure wie eine Ribonukleinsäure sein. Es kann sich um Sequenzen natürlichen oder artifiziellen Ursprungs und insbesondere um genomische DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, hybride Sequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen handeln. Außerdem kann die Nukleinsäure eine sehr variable Größe haben, welche vom Oligonukleotid bis zum Chromosom geht. Diese Nukleinsäuren können humanen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen u. s. w. Ursprungs sein. Sie können durch eine jegliche Technik, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, und insbesondere durch Screening von Banken, durch chemische Synthese oder ferner durch gemischte Verfahren, welche die chemische oder enzymatische Modifizierung von Sequenzen, die durch Screening von Banken erhalten worden sind, umfassen, erhalten werden. Sie können außerdem in Vektoren, wie Plasmidvektoren, eingefügt werden.
Insbesondere bezüglich Desoxyribonukleinsäuren können diese einzel- oder doppelsträngig sein. Diese Desoxyribonukleinsäuren können therapeutische Gene, die Transkription oder die Replikation regulierende Sequenzen, Antisinn-Sequenzen, Bindungsregionen für andere Zellbestandteile u. s. w. tragen.
Im Sinne der Erfindung versteht man unter einem therapeutischen Gen insbesondere ein jegliches Gen, welches ein Proteinprodukt mit einer therapeutischen Wirkung kodiert. Das so kodierte Proteinprodukt kann ein Protein, ein Peptid u. s. w. sein. Dieses Proteinprodukt kann gegenüber der Zielzelle homolog sein (d. h. ein Produkt, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert wird, wenn diese keinerlei Pathologie aufweist). In diesem Falle erlaubt die Expression eines Proteins beispielsweise eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines aufgrund einer Modifizierung inaktiven oder schwach aktiven Proteins zu beheben oder ferner das Protein überzuexprimieren. Das therapeutische Gen kann auch eine Mutante eines zellulären Proteins mit einer erhöhten Stabilität, einer modifizierten Aktivität u. s. w. kodieren. Das Proteinprodukt kann gleichfalls gegenüber der Zielzelle heterolog sein. In diesem Falle kann ein exprimiertes Protein beispielsweise eine mangelhaft vorhandene Aktivität in der Zelle vervollständigen oder beitragen, was es dieser erlaubt, eine Pathologie zu bekämpfen oder eine Immunantwort zu stimulieren. Das therapeutische Gen kann gleichfalls ein im Organismus sekretiertes Protein kodieren.
Unter den therapeutischen Produkten im Sinne der Erfindung kann man insbesondere die Enzyme, die Blutderivate, die Hormone, die Lymphokine: Interleukine, Interferone, TNF u. s. w. ( FR 9203120 ), die Wachstumsfaktoren, die Neurotransmitter oder deren Vorstufen oder Syntheseenzyme, die trophischen Faktoren, BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/Pleiotrophin u. s. w.; die Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE u. s. w. ( FR 93 05125 ), Dystrophin oder ein Minidystrophin ( FR 9111947 ), das mit Mukoviszidose in Zusammenhang stehende Protein CFTR, die Tumorsuppressorgene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev u. s. w. ( FR 93 04745 ), die Gene, welche an der Gerinnung beteiligte Faktoren: Faktoren VII, VIII, IX, kodieren, die an der Reparatur der DNA teilnehmenden Gene, die Suizidgene (Thymidinkinase, Cytosindesaminase) u. s. w. aufführen.
Das therapeutische Gen kann gleichfalls ein Gen oder eine Antisinn-Sequenz sein, deren Expression in der Zielzelle erlaubt, die Expression von Genen oder die Transkription von zellulären mRNAs zu kontrollieren. Solche Sequenzen können beispielsweise in der Zielzelle in zu zellulären mRNAs komplementäre RNAs transkribiert werden und so deren Translation in Protein blockieren gemäß der in dem Patent EP 140 308 beschriebenen Technik. Es kann sich auch um synthetische, gegebenenfalls modifizierte Oligonukleotide handeln ( EP 92 574 ). Die Antisinn-Moleküle umfassen gleichfalls die Sequenzen, die Ribozyme, die in der Lage sind, selektiv Ziel-RNAs zu zerstören, kodieren ( EP 321 201 ).
Wie weiter oben angegeben, kann die Nukleinsäure gleichfalls ein oder mehrere Gene umfassen, die ein antigenes Peptid, welches in der Lage ist, beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort zu erzeugen, kodieren. Bei dieser besonderen Ausführungsweise erlaubt die Erfindung folglich die Realisierung entweder von Impfstoffen oder von immuntherapeutischen Behandlungen, die beim Menschen oder Tier angewendet werden, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebserkrankungen. Es kann sich insbesondere um für das Epstein-Barr-Virus, das HIV-Virus, das Hepatitis B-Virus ( EP 185 573 ), das Pseudorabiesvirus spezifische oder ferner tumorspezifische ( EP 259 212 ) antigene Peptide handeln.
Bevorzugt umfasst die Nukleinsäure gleichfalls Sequenzen, welche die Expression des therapeutischen Gens und/oder des Gens, welches das antigene Peptid kodiert, in der gewünschten Zelle oder dem gewünschten Organ erlauben. Es kann sich um Sequenzen handeln, die von Natur aus für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen in der Lage sind, in der infizierten Zelle ihre Funktion auszuüben. Es kann sich gleichfalls um Sequenzen unterschiedlicher Herkunft handeln (die für die Expression von anderen Proteinen verantwortlich sind oder sogar synthetisch sind). Es kann sich insbesondere um Promotorsequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Es kann sich beispielsweise um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle, die man zu infizieren wünscht, stammen. Es kann sich ebenso um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht kann man beispielsweise die Promotoren der Gene E1A, MLP, CMV, RSV u. s. w. aufführen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügung von Aktivierungs-, Regulationssequenzen oder von Sequenzen, welche eine gewebespezifische Expression erlauben, modifiziert werden.
Außerdem kann die Nukleinsäure gleichfalls insbesondere strangaufwärts von dem therapeutischen Gen eine Signalsequenz umfassen, welche das synthetisierte therapeutische Produkt in Richtung der Sekretionswege der Zielzelle dirigiert. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, es kann sich aber gleichfalls um eine jegliche andere funktionsfähige Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln.
Noch überdies kann die Nukleinsäure gleichfalls, insbesondere strangaufwärts von dem therapeutischen Gen, eine Sequenz umfassen, welche das synthetisierte therapeutische Produkt in Richtung eines bevorzugten Zellkompartiments dirigiert, wie eine Kernlokalisierungssequenz.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können als solche oder in Kombination mit anderen Verbindungen oder Zusammensetzungen eingesetzt werden. So umfassen in einer besonderen Ausführungsweise die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen außerdem einen Hilfsstoff, welcher in der Lage ist, sich mit dem Polymer/Nukleinsäure-Komplex zu assoziieren und das Transfektionsvermögen zu erhöhen, wobei der Hilfsstoff unter den Lipiden, Proteinen, Lipopolyaminen und synthetischen Polymeren ausgewählt wird, welche in der Lage sind, sich mit dem Polymer/Nukleinsäure-Komplex zu assoziieren. Wie dies die Beispiele der vorliegenden Anmeldung zeigen, manifestiert sich diese Erhöhung sowohl in vitro als auch in vivo.
Die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bevorzugt eingesetzten Hilfsstoffe sind kationische Lipide (welche eine oder mehrere kationische Ladungen in ihrem polaren Abschnitt umfassen) oder neutrale Lipide.
Bezüglich der kationischen Lipide kann es sich insbesondere um Lipopolyamine, d. h. um ein jegliches amphiphiles Molekül, welches wenigstens eine hydrophile Polyamin-Region und eine lipophile Region, welche miteinander kovalent durch einen chemischen Arm verbunden sind, umfasst, handeln. Die Polyamin-Region der im Rahmen der Erfindung eingesetzten Lipopolyamine entspricht vorteilhafterweise der allgemeinen Formel H₂N-(-(CH)_m-NH-)_l-H, in welcher m eine ganze Zahl größer oder gleich 2 ist und l eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist, wobei m zwischen den verschiedenen Kohlenstoffgruppen, die zwischen zwei Amingruppen enthalten sind, variieren kann. Vorzugsweise liegt m zwischen 2 und 6 eingeschlossen und liegt l zwischen 1 und 5 eingeschlossen. Noch mehr bevorzugt wird die Polyamin-Region durch Spermin oder ein Analog von Spermin, bei welchem dessen DNA-Bindungseigenschaften erhalten geblieben sind, repräsentiert.
Die lipophile Region kann aus einer oder mehreren, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffketten, Cholesterol, einem natürlichen Lipid oder einem synthetischen Lipid, welche in der Lage sind, lamellare oder hexagonale Phasen zu bilden, bestehen.
Man setzt im Rahmen der Erfindung vorteilhafterweise Lipopolyamine, wie in der Patentanmeldung EP 394 111 definiert, ein. Diese Anmeldung beschreibt gleichfalls ein Verfahren, das für die Herstellung dieser Lipopolyamine eingesetzt werden kann. Besonders vorteilhaft verwendet man im Rahmen der Erfindung Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) oder 5-Carboxyspermylamid von Palmitoylphosphatidylethanolamin (DPPES).
Andere Hilfsstoffe, die für die Herstellung der Zusammensetzungen der Erfindung besonders bevorzugt sind, werden durch die neutralen Lipide repräsentiert. Die Verwendung von neutralen Lipiden ist besonders vorteilhaft, wenn das Ladungsverhältnis R (Amingruppen/Phosphatgruppen) gering ist. Mehr bevorzugt sind die im Rahmen der Erfindung eingesetzten neutralen Lipide Lipide mit 2 Fettketten.
Besonders vorteilhaft setzt man natürliche oder synthetische, zwitterionische Lipide oder solche, die unter physiologischen Bedingungen frei von Ionenladung sind, ein. Sie können insbesondere unter Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamin (POPE), Distearoyl-, -palmitoyl-, -myristoylphosphatidylethanolamin wie auch deren 1- bis 3-fach N-methylierten Derivaten; den Phosphatidylglycerolen, den Diacylglycerolen, den Glycosyldiacylglycerolen, den Cerebrosiden (wie insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie insbesondere den Sphingomyelinen) oder ferner den Asialogangliosiden (wie insbesondere den AsialoGM1 und GM2), ausgewählt werden.
Diese unterschiedlichen Lipide können entweder durch Synthese oder durch Extraktion ausgehend von Organen (Beispiel: dem Gehirn) oder von Eiern durch klassische Techniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, erhalten werden. Insbesondere kann die Extraktion von natürlichen Lipiden mittels organischer Lösemittel ausgeführt werden (siehe gleichfalls Lehninger, Biochemie).
Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen bevorzugt außer dem kationischen Polymer in den vorstehend aufgeführten Verhältnissen 0,1 bis 20 Moläquivalente Hilfsstoff auf 1 Moläquivalent von Phosphatgruppen der Nukleinsäure und mehr bevorzugt 1 bis 5.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsweise umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung ein Targeting-Element, welches erlaubt, den Transfer der Nukleinsäure orientiert auszuführen. Dieses Targeting-Element kann ein extrazelluläres Targeting-Element, welches erlaubt, den Transfer der Nukleinsäure in Richtung von bestimmten Zelltypen oder bestimmten gewünschten Geweben (Tumorzellen, Leberzellen, hämopoetische Zellen u. s. w.) zu orientieren, sein. Es kann sich gleichfalls um ein intrazelluläres Targeting-Element handeln, welches erlaubt, den Transfer der Nukleinsäure in Richtung von bestimmten privilegierten Zellkompartimenten (Mitochondrien, Zellkern u. s. w.) zu orientieren.
Das Targeting-Element ist mehr bevorzugt kovalent oder nicht-kovalent an das Polymer der Formel (I) gebunden. Die Bindung kann insbesondere durch ionische Wechselwirkung mit den Ammoniumgruppen oder durch nukleophilen Angriff der Amingruppen des Polymers an Targenting-Elementen, welche eine nukleofuge Gruppe (Halogen, Tosylat u. s. w.), einen aktivierten Ester (Hydroxysuccinimid u. s. w.) oder ferner ein Isothiocyanat umfassen, erhalten werden. Das Targeting-Element kann gleichfalls an die Nukleinsäure gebunden sein.
Unter den Targeting-Elementen, die im Rahmen der Erfindung einsetzbar sind, kann man die Zucker, die Peptide, die Oligonukleotide oder die Lipide aufführen. Bevorzugt handelt es sich um Zucker und/oder Peptide, wie Antikörper oder Antikörperfragmente, Liganden von zellulären Rezeptoren oder um Fragmente von diesen, Rezeptoren oder Fragmente von Rezeptoren u. s. w. Es kann sich insbesondere um Liganden von Wachstumsfaktorrezeptoren, von Zytokinrezeptoren, von zellulären Lektinrezeptoren oder von Adhäsionsproteinrezeptoren handeln. Man kann gleichfalls den Transferinrezeptor, den Rezeptor der HDL und der LDL aufführen. Das Targeting-Element kann gleichfalls ein Zucker sein, welcher erlaubt, zielgerichtet die Asialoglycoproteinrezeptoren anzusteuern, oder ferner ein Fab-Antikörperfragment, welches erlaubt, zielgerichtet den Rezeptor des Fc-Fragments der Immunglobuline anzusteuern.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Hinblick auf Verabreichungen auf topischem, kutanem, oralem, rektalem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem, transdermalem u. s. w. Wege formuliert werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten vorzugsweise einen für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion im Bereich des gewünschten Organs oder für eine Verabreichung auf topischem Wege (auf die Haut und/oder Schleimhaut) pharmazeutisch annehmbaren Träger. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die je nach Fall durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung die Bildung von injizierbaren Lösungen erlauben. Die für die Injektion eingesetzten Nukleinsäuredosen wie auch die Anzahl von Verabreichungen können abhängig von verschiedenen Parametern und insbesondere abhängig von der eingesetzten Verabreichungsweise, der betreffenden Pathologie, dem zu exprimierenden Gen oder ferner der angestrebten Behandlungsdauer angepasst werden.
Wie weiter oben angegeben, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen in vivo, in vitro oder ex vivo eingesetzt werden. Insbesondere zeigen die Beispiele, dass die kationischen Polymere der Erfindung eingesetzt werden können, um auf sehr effiziente Weise Nukleinsäuren in zahlreiche Zellarten und insbesondere in bestimmte Zellarten, die gewöhnlich schwierig zu transfizieren sind, zu transferieren. Unter den getesteten Zellarten kann man insbesondere die Fibroblasten, die Leberzellen, die Karzinome, die Nierenzellen und die Neuronen aufführen. Außerdem veranschaulichen die nachfolgend aufgeführten Beispiele gleichfalls die Effizienz der Polymere der Erfindung für den Transfer von Genen in vivo. Die mit den Vektoren der Erfindung erhaltenen Ergebnisse sind jenen, die unter den gleichen Bedingungen mit anderen Transfektionsmitteln beobachtet werden, überlegen und zeigen so das hohe Potential der Zusammensetzungen der Erfindung.
Die Anmeldung beschreibt ein besonders vorteilhaftes Verfahren für die Behandlung von Krankheiten, welches die Verabreichung einer Nukleinsäure, welche in der Lage ist, die Krankheit zu korrigieren, assoziiert mit einem kationischen Polymer, wie oben definiert, in vivo umfasst. Insbesondere ist dieses Verfahren anwendbar auf die Krankheiten, die aus einem Mangel an einem Protein- oder Nukleinsäureprodukt resultieren, und kodiert die verabreichte Nukleinsäure dieses Proteinprodukt oder sie enthält das Nukleinsäureprodukt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung bilden so besonders vorteilhafte Hilfsmittel (Tools) für die Verabreichung und den Transfer von Nukleinsäuren in vivo.
Die Erfindung wird vollständiger mit Hilfe der folgenden Beispiele, die als veranschaulichend angesehen werden müssen, beschrieben.
Legende der Figuren:
1: Transfektionseffizienz von PEI800K bei pH 7 abhängig von dem Verhältnis R (Amingruppen des Polymers/Phosphatgruppen der Nukleinsäure).
2: Transfektionseffizienz von PEI800K bei pH 6 abhängig von der DNA-Menge.
3: Transfektionseffizienz von PEI800K bei pH 6 abhängig von dem Verhältnis R.
4: Transfektionseffizienz von PEI800K abhängig vom pH.
5: Vergleich zwischen PEI800K und Polylysin.
6: Zytotoxizitätstest von PEI50K.
7: Transfektionseffizienz von PEI50K in Gegenwart von Hilfsstoffen.
8: Wirksamkeit von PEI für die Transfektion von HeLa-Zellen.
9: Wirksamkeit von PEI für die Transfektion von Leber- und Nierenzellen.
10: Wirksamkeit von PEI für den Transfer von Plasmid-DNA in embryonale Neuronen.
11: Wirksamkeit von PEI für den Transfer von Oligonukleotiden in embryonale Neuronen.
12: Wirksamkeit von PEI für den Transfer von DNA in vivo.
BEISPIEL 1 – Für den Transfer von Genen in vivo eingesetzte Plasmide
Es wurden drei Arten von Konstrukten eingesetzt, um die Aktivität der Zusammensetzungen der Erfindung nachzuweisen: Plasmide, welche das Luciferase (Luc) kodierende Gen umfassen, Plasmide, welche das β-Galactosidase kodierende Gen (LacZ-Gen) umfassen, und Plasmide, welche das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierende Gen umfassen.
1.1 Plasmide, welche das Luc-Gen umfassen
Das Plasmid pCMV-luc umfasst den Promotor des Zytomegalievirus (CMV), welcher aus dem Plasmidvektor pcDNA3 (Invitrogen) extrahiert worden ist durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen MluI und HindIII, welcher sich strangaufwärts von dem Luciferase kodierenden Gen befindet, inseriert in die MluI- und HindIII-Stellen in dem Vektor pGL basic Vector (Promega).
Das Plasmid pGL2-Luc ist von kommerzieller Herkunft (Promega).
Das Plasmid T3RE-Luc enthält ein synthetisches Oligonukleotid, welches einem palindromischen Schilddrüsenhormon-Response-Element (Glass et al., Cell 56 (1989) 697) entspricht.
1.2 Plasmide, welche das LacZ-Gen umfassen.
Das Plasmid pCMV-βGal (Clontech) umfasst den CMV-Promotor, welcher strangaufwärts von dem LacZ-Gen, welches β-Galactosidase von Escherichia coli kodiert, gelegen ist. Der Vektor pSV-nls LacZ (pAOnlsLacZ) umfasst den gleichen Promotor, eine Kernlokalisierungssequenz (welche von dem SV40-Virus stammt) lokalisiert im Raster und strangaufwärts von dem LacZ-Gen. Dieses Konstrukt erlaubt die Expression des Fusionsproteins nls-β-Galactosidase im Kern der Zellen (siehe De Luze et al., PNAS 90 (1993) 7322).
1.3 Plasmide, welche das CAT-Gen umfassen.
Die Plasmide, welche als Reportergen das Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierende Gen unter der Kontrolle des RSV-Promotors (pRSV-CAT) und des SV40-Promotors (pSV40-CAT) aufweisen, sind veröffentlicht worden (Boutiller et al., Prog. NeuroPhychoPharmacol. et Biol. Psychiat. 16 (1992) 959; de Luze et al., PNAS 90 (1993) 7322).
BEISPIEL 2 – Transfer von Nukleinsäure in Fibroblasten
Dieses Beispiel beschreibt den Transfer des Plasmids pGL2-luc in 3T3-Fibroblasten mittels Polyethylenimin von 800000 Da.
Protokoll: Es wird eine 5,375 μM Lösung von PEI800K hergestellt und der pH wird mittels einer 1 N Salzsäurelösung auf 7 eingestellt. Diese Lösung wird für die Gentransferexperimente eingesetzt.
Transfektionsprotokoll: Die 3T3-Fibroblasten werden in einer Schale mit 24 Vertiefungen 24 h vor der Transfektion ausgesät (50000 Zellen pro Vertiefung). Sie werden mit 2 μg pGL2-Luc-Plasmid pro Vertiefung gemäß dem folgenden Protokoll transfiziert:
2 μg Plasmid und unterschiedliche Volumina der 5,375 μM Lösung von PEI800K (abhängig von dem gewünschten Ladungsäquivalentverhältnis) werden getrennt in 50 μl 150 mM NaCl verdünnt und gemischt. Nach 10 min werden die beiden Lösungen vereinigt und homogenisiert. Nach einem erneuten Zeitraum von 10 min werden 900 μl DMEM zugesetzt. Die so erhaltene Lösung wird homogenisiert und sie wird nach 10 min auf den vorab mit DMEM-Medium ohne Serum gespülten Zellen verteilt. Am Ende von 2 h Transfektion werden 100 μl FCS (fötales Kälberserum) pro Vertiefung zugegeben. Die Expression wird 24 h später gestoppt.
Quantitative Bestimmung der Luciferase: Dafür wurde der Überstand in Gegenwart eines Luciferin, Coenzym A und ATP enthaltenden Puffers inkubiert und das emittierte Licht (im Allgemeinen während 10 s) wurde mit einem Luminometer gemessen (Wood K. (1990) Promega Notes, 28).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 1 aufgeführt. Sie zeigen, dass das PEI erlaubt, das Plasmid pGL2-Luc effizient in die Fibroblasten zu transferieren. Sie zeigen gleichfalls, dass die Aktivität in relativen Lichteinheiten (RLU = „relative light unit”) besonders gut ist, wenn man zwischen 5 und 20 Äquivalente von Amingruppen des PEI bezogen auf die Phosphatgruppen der DNA verwendet. In einem Kontrollexperiment ergibt das Plasmid allein ein Signal von etwa 100 RLU.
BEISPIEL 3 – Wirkung der DNA-Menge auf die Transfektionseffizienz
Dieses Beispiel beschreibt die Auswirkung der Nukleinsäuremenge auf die Transfereffizienz in 3T3-Fibroblasten durch PEI800K.
Die 3T3-Fibroblasten werden 24 h vor der Transfektion in einer Schale mit 24 Vertiefungen ausgesät (50000 Zellen pro Vertiefung). Sie werden mit steigenden Mengen von pCMV-Luc-Plasmid pro Vertiefung und einem konstanten Ladungsverhältnis (9 Äquivalente) gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll transfiziert. Es wurden zwei Punkte realisiert, indem die Plasmidmenge auf zwei μg pro Vertiefung durch pGEM-Plasmid (PROMEGA), welches das untersuchte Gen nicht enthält, vervollständigt wurde. Am Ende von 3 h Transfektion werden 100 μl FCS-Serum pro Vertiefung zugesetzt. Die Expression wird 24 h danach gestoppt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 2 dargestellt.
Die Transfektionseffizienz nimmt mit der während der Transfektion eingesetzten Plasmidmenge zu. Die Zugabe von nicht-transkribierter Träger-DNA (pGEM) leistet keinen Beitrag zur Transfektion.
BEISPIEL 4 – Transfer von Nukleinsäuren in Fibroblasten: Untersuchung des Einflusses des Verhältnisses Amingruppen/Phosphatgruppen.
Dieses Beispiel beschreibt den Transfer von Nukleinsäuren in Fibroblasten bei pH 6 mittels einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, welche die Nukleinsäure und PEI800K in unterschiedlichen Verhältnissen R (Amingruppen/Phosphatgruppen) umfasst.
Protokoll: Es wird eine 5,375 μM Lösung von PEI800K hergestellt und der pH wird mittels einer 1 N Salzsäurelösung auf 6 eingestellt. Diese Lösung wird für die Gentransferexperimente eingesetzt.
Die 3T3-Fibroblasten werden in einer Schale mit 24 Vertiefungen 18 h vor der Transfektion ausgesät (50000 Zellen pro Vertiefung). Sie werden mit 2 μg pGL2-Luc-Plasmid pro Vertiefung gemäß dem in Beispiel 2 eingesetzten Protokoll transfiziert.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 3 aufgeführt. Sie zeigen, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen im gesamten Spektrum von R-Verhältnissen zwischen 6 und 22 eingeschlossen besonders effizient sind.
BEISPIEL 5 – Transfektionseffizienz in Abhängigkeit vom pH.
Dieses Beispiel beschreibt den Transfer von Nukleinsäuren in Fibroblasten mittels einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, welche die Nukleinsäure und PEI800K umfasst, unter unterschiedlichen pH-Bedingungen.
Das eingesetzte Protokoll ist identisch mit jenem, das in Beispiel 2 beschrieben worden ist. Der pH wird durch die Zugabe von 1 N Salzsäure eingestellt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 4 aufgeführt. Sie zeigen, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bei unterschiedlichen pHs und insbesondere in Bereichen eines physiologischen pHs (pH 5–8) eingesetzt werden können.
BEISPIEL 6 – Vergleich der Transfektionseffizienz von PEI und von Polylysin
Dieses Beispiel beschreibt die Vergleichsergebnisse, die mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung und mit einem anderen kationischen Polymer, Polylysin, hinsichtlich des Transfers von Nukleinsäuren in Fibroblasten erhalten wurden.
Protokoll: Das in diesem Experiment eingesetzte Polylysin (PLL) ist das Polylysin HBr mit einem mittleren Gewicht von 50 K. Die Endkonzentration an Chloroquin beträgt 100 μM. Das PEI wird bei pH 6 eingesetzt.
Protokoll: Die 3T3-Fibroblasten werden in einer Schale mit 24 Vertiefungen 18 h vor der Transfektion ausgesät (50000 Zellen pro Vertiefung). Sie werden mit pCMV-Luc-Plasmid gemäß dem in Beispiel 2 eingesetzten Protokoll transfiziert. Die mit PLL in Gegenwart von Chloroquin transfizierten Zellen werden nach 2 h gespült und in Medium mit 10% Serum gegeben. Die Expression wird 24 h später gestoppt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 5 aufgeführt. Sie zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erlauben, Nukleinsäuren in Fibroblasten zu transferieren mit einer Effizienz, die deutlich höher als bei den früheren kationischen polymeren Vektoren, wie Polylysin, ist.
BEISPIEL 7 – Vergleich der Transfektionseffizienz von NIH 3T3-Fibroblasten durch PEI50K und PEI800K
Dieses Beispiel beschreibt den Einsatz und den Vergleich von zwei Polymeren von PEI (PEI50K und PEI800K) für den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen.
Protokoll: Die Zellen werden 24 h vor der Transfektion in einer Menge von 50000 Zellen pro 16 mm-Vertiefung ausgesät. Sie werden mit dem mit PEI komplexierten Plasmid pCMV-Luc transfiziert. Das Moläquivalentverhältnis Amingruppen von PEI/Phosphatgruppen der Nukleinsäure variiert von 6 bis 45 Äquivalente. Für jede Vertiefung verdünnt man getrennt das PEI und 2 μg DNA in 50 μl NaCl (150 mM). Die Lösungen werden dann gemischt, dann homogenisiert. Nach 10 min wird dieses Volumen zu den Zellen hinzugegeben. Nach 24 h werden die Zellen lysiert, die Lyselösung wird zentrifugiert und der Überstand eingesetzt, um die Luciferase-Aktivität zu quantifizieren. Die Quantifizierung des Proteins erfolgt an einem Aliquot von diesem Überstand durch den BCA-Test. Die Luciferase-Aktivität wird ausgedrückt in Lichteinheiten (RLU)/10 s Integration/mg Protein.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.

R O 6 Äqu. 9 Äqu. 18 Äqu. 45 Äqu.

PEI50K RLU/10 s/mg Prot. 7100 11 000 760 000 12 000 000 2 450 000

PEI800K RLU/10 s/mg Prot. 6253 200 000 16 700 000 5 650 000 525 000
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass das PEI50K ebenso vorteilhafte transfizierende Eigenschaften wie PEI800K aufweist.
BEISPIEL 8 – Zytotoxizitätstest von PEI
Wir wollten die etwaige Toxizität von PEI50K an NIH 3T3-Fibroblasten untersuchen. Für diese Untersuchung haben wir den MTT-Test ausgewählt, welcher erlaubt, das Vermögen der Zellen, MTT-Tetrazolium durch das mitochondriale Enzym Succinatdehydrogenase zu MTT-Formazan zu reduzieren, auszuwerten. Das Transfektionsprotokoll ist das gleiche wie in Beispiel 7 (die DNA-Menge pro Vertiefung bleibt gleich (2 μg), die Anzahl von Moläquivalent von Amingruppen von PEI/Phosphatgruppen der DNA variiert von 9 bis 24). Nach 24 h Transfektion werden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, dann 90 min mit 0,05 mg/ml MTT inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wird das Medium der Zellen entfernt, die Zellen werden dreimal mit PBS gewaschen, dann in 1 ml 10% SDS 10 min gelöst. Die optische Dichte der Proben wird bei 540 nm abgelesen.
Die Ergebnisse sind in der 6 aufgeführt. Sie zeigen, dass unter den Bedingungen unserer Untersuchung das PEI50K keine signifikante Mortalität für die NIH 3T3-Fibroblasten zur Folge hat.
BEISPIEL 9 – Verwendung eines Hilfsstoffs, um das Transfektionsvermögen zu verbessern.
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, welche ein kationisches Polymer und einen Hilfsstoff umfassen. Der eingesetzte Hilfsstoff ist entweder ein neutrales Lipid (DOPE) oder ein Lipopolyamin (DOGS).
Protokoll: Zugabe von DOPE:
Es wurden vier Moläquivalentverhältnisse von Amingruppen von PEI/Phosphatgruppen der DNA untersucht: 6, 9, 18 und 21. Für jede Vertiefung werden 12 Nanomole DOPE zu der Mischung von PEI und DNA zugesetzt. Diese Lösung wird dann für die Transfektion, wie in Beispiel 7 beschrieben, eingesetzt.
Zugabe von DOGS: Für jede Vertiefung werden 4 Moläquivalente Amingruppen von DOGS/Phosphatgruppen der DNA (entsprechend 6 Nanomolen von DOGS auf 6 Nanomole von Phosphatgruppen) zu der PEI-Lösung vor dem Komplexierungsschritt mit der DNA zugesetzt. Die Transfektion erfolgt dann, wie in Beispiel 7 beschrieben.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 7 aufgeführt. Sie zeigen klar, dass die Zugabe von DOPE oder von DOGS erlaubt, die Transfektionseigenschaften weiter zu verbessern, insbesondere bei niedrigen Moläquivalentverhältnissen von Amingruppen von PEI/Phosphatgruppen der DNA.
BEISPIEL 10 – Gentransfer in HeLa-Zellen
Dieses Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für den Transfer von Genen in unterschiedliche Zellarten und insbesondere in die Uteruskarzinomzellen HeLa eingesetzt werden können.
Protokoll: Die HeLa-Zellen werden 24 h vor der Transfektion in einer Menge von 50000 Zellen pro 16 mm-Vertiefung ausgesät. Sie werden dann mit dem Plasmid pCMV-Luc, welches entweder mit PEI oder mit dem Lipopolyamin (DOGS) komplexiert ist, transfiziert. Es wurden vier Moläquivalentverhältnisse von PEI50K- oder PEI800K-Amingruppen/Phosphatgruppen der DNA untersucht: 6, 9, 18, 21. Das Lipopolyamin wird in einer Konzentration von 8 Moläquivalenten Amingruppen/Phosphatgruppen (12 Nanomole von DOGS) eingesetzt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 8 aufgeführt. Sie zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, welche ein kationisches Polymer gegebenenfalls mit einem Hilfsstoff assoziiert umfassen, erlauben, die HeLa-Zellen auf viel effizientere Weise als die früheren Systeme (insbesondere das Lipopolyamin DOGS) zu transfizieren.
BEISPIEL 11 – Transfer von Genen in unterschiedliche Zellarten
Dieses Beispiel zeigt ferner, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für den Transfer von Genen in sehr unterschiedliche Zellarten, wie Fibroblasten, Uteruskarzinome, Hepatozytome oder Nierenzellen, eingesetzt werden können. Insbesondere beschreibt dieses Beispiel die Transfektion von HepG2-Zellen, K562-Zellen und von primären Kulturen von glattem Muskel vom Kaninchen durch PEI bei 9 Ladungsäquivalenten und bei pH 6.
Die HepG2-Zellen werden in Schalen mit 24 Vertiefungen 24 h vor der Transfektion (50000 Zellen pro Vertiefung) ausgesät. Sie werden mit dem Plasmid pCMV-Luc gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll transfiziert. Nach 4 h Transfektion werden 100 μl FCS-Serum pro Vertiefung zugesetzt. Die Expression wird 30 h danach gestoppt.
Die K562-Zellen werden in Schalen mit 24 Vertiefungen in 0,5 ml RPMI-Medium ohne Serum eine Stunde vor der Transfektion ausgesät. Sie werden mit dem Plasmid pCMV-Luc gemäß dem folgenden Protokoll transfiziert: Die Menge von gewünschtem Plasmid und das PEI werden getrennt in 50 μl 150 mM NaCl verdünnt und gemischt. Nach 10 min werden die beiden Lösungen vereinigt und homogenisiert. Nach einem neuerlichen Zeitraum von 10 min werden 400 μl RMPI zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird homogenisiert und nach 10 min wird sie auf den Zellen verteilt. Nach 4 h Transfektion werden 100 μl FCS-Serum pro Vertiefung zugegeben. Die Expression wird 30 h danach gestoppt.
Die primären Kulturen von glattem Muskel vom Kaninchen wurden hergestellt, wie von Fallier-Becker beschrieben. Die Zellen wurden dann entweder mit 1 μg oder mit 2 μg mit PEI komplexiertem pCMV-Luc-Plasmid (gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Protokoll) transfiziert. Die Expression der Luciferase wird 24 h oder 48 h nach der Transfektion gestoppt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 9 aufgeführt. Sie zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen die effiziente Transfektion von sehr vielgestaltigen und unterschiedlichen Zellarten erlauben.
BEISPIEL 12 – Transfer von Plasmid-DNA in eine primäre Kultur von embryonalen Neuronen: Nachweis einer biologischen Aktivität
Die primären Kulturen von Neuronen wurden hergestellt, wie von Lezoualc'h et al. beschrieben. Nach 36 h wurden die Kulturen mit 2 μg TRE-Luc-Plasmid (welches das Luc-Gen unter der Kontrolle eines T3-Schilddrüsenhormon-Response-Elements umfasst) und 0,5 μg Träger-DNA pro Vertiefung transfiziert.
Es wurden zwei Versuchsbedingungen untersucht:

– 9 Äquivalente von Amingruppen bezogen auf die Phosphatgruppen: 1 μg Plasmid wurde in 2,28 μl einer wässrigen Lösung von PEI800K, 100 mM, pH 7, gegeben.
– 13 Äquivalente von Amingruppen bezogen auf die Phosphatgruppen: 1 μg Plasmid wurde in 3,33 μl einer wässrigen Lösung von PEI800K, 100 mM, pH 7, gegeben.

Vor der Komplexierung wurde das Plasmid in 50 μl 150 mM NaCl verdünnt und das PEI wurde ebenfalls in einem zweiten Aliquot von 50 μl 150 mM NaCl verdünnt. Die Lösungen wurden dann gemischt und auf die Zellen während 1 h aufgetragen. Das Transfektionsmedium wurde dann abgenommen und durch frisches Kulturmedium mit oder ohne T3 (1 nM) ersetzt. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert, die Lyselösung wurde zentrifugiert und der Überstand eingesetzt, um die Luciferase-Aktivität zu quantifizieren.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 10 aufgeführt. Sie zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erlauben, die DNA in die neuronalen Zellen zu transferieren und dass die so transferierte DNA funktionsfähig ist, denn ihre Aktivität wird in Gegenwart von T3 verstärkt. In dem Kontrollexperiment, das in Gegenwart des Plasmids allein ausgeführt wurde, wurde keinerlei Luciferase-Aktivität nachgewiesen.
BEISPIEL 13 – Transfer von Antisinn-Oligonukleotiden in eine Primärkultur von embryonalen Neuronen.
Die Experimente wurden an primären Kulturen von Neuronen, die wie in Beispiel 12 hergestellt wurden, ausgeführt. Nach 36 h wurden die Kulturen mit 2 μM 18-merem Antisinn-Oligonukleotid (ODN), welches mit 9 Äquivalenten Amingruppen bezogen auf die Phosphatgruppen von PEI800K komplexiert war, transfiziert.
Das eingesetzte ODN ist gegen eine Region des Gens, welche den alpha-Rezeptor der Schilddrüsenhormone kodiert, gerichtet. Seine Sequenz ist die folgende:
5'-GCTGGGCTTCTGTTCCAT-3'
Für 4 Vertiefungen von 250 μl Kulturmedium wurden die folgenden Produkte eingesetzt:

– 8 μl einer 0,25 mM ODN-Lösung, verdünnt in 10 μl 150 mM NaCl, und
– 20,8 μl einer wässrigen 12 mM Lösung von PEI800K, pH 7, die vorab in einem zweiten Aliquot von 51,2 μl 150 mM NaCl verdünnt worden waren.

Die Lösungen wurden dann gemischt und 20 μl der Mischung wurden auf die Zellen während 45 min aufgetragen. Das Transfektionsmedium wurde dann abgenommen und durch frisches Kulturmedium ersetzt. Die Zellen wurden dann in einer 4%-igen Paraformaldehydlösung fixiert, gespült, in Mowiol eingedeckt und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 11 aufgeführt. Sie zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erlauben, Antisinn-Oligonukleotide in die neuronalen Zellen zu transferieren. In dem in Gegenwart von Oligonukleotid allein ausgeführten Kontrollexperiment wurde keinerlei Fluoreszenz detektiert.
BEISPIEL 14 – Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung für den Transfer von Nukleinsäuren in vivo in das Gehirn von neugeborenen Mäusen.
Dieses Beispiel beschreibt den Transfer des Plasmids pCMV-Luc in vivo in das Gehirn von neugeborenen Mäusen. Es zeigt die besonders vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen insbesondere für Gentherapie-Anwendungen.
30 μg pCMV-luc-Plasmid (7,5 μl einer Stammlösung mit 4 μg/μl) wurden in 22,5 μl 5%-iger steriler Glucoselösung (Endkonzentration 1 μg/μl) verdünnt. Dann wurden 8,5 μl 100 mM PEI800K (hergestellt in Wasser und auf pH 6,9 gepuffert) zugesetzt. Die so erhaltene Zusammensetzung enthält folglich 9 Äquivalente Amingruppen bezogen auf die Phosphatgruppen.
Die Mischung wurde schnell gevortext und für intrazerebrale Injektionen bei neugeborenen Mäusen eingesetzt. Dafür wurden die Mäuse durch Kälte anästhesiert (auf eine Aluminiumfolie in Kontakt mit Eis gelegt), dann wurden 2 μl Mischung (2 μg Nukleinsäure) pro Maus injiziert. Die Injektionen erfolgten in den Kortex mit Hilfe eines Mikromanipulators und einer Mikrospritze, die mit einer Mikroelektrode verbunden waren.
Die Gehirne wurden 48 h später entnommen, homogenisiert, zentrifugiert und der Überstand für die Quantifizierung der Luciferase eingesetzt. Dafür wurde der Überstand in Gegenwart eines Luciferin, Coenzym A und ATP enthaltenden Puffers inkubiert und das emittierte Licht (im Allgemeinen während 10 s) wurde mit einem Luminometer gemessen (Wood, K. (1990) Promega Notes, 28).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 12 aufgeführt. Sie zeigen klar, dass die Zusammensetzungen erlauben, das Plasmid effizient in das Gehirn der Mäuse zu transferieren, wohingegen keinerlei signifikante Luciferase-Aktivität beobachtet wird, wenn der Transfer mittels des Plasmids allein erfolgt.

Claims

Zusammensetzung, gebildet aus einer Lösung einer Nukleinsäure und einer Lösung eines kationischen Polymers, die vereinigt und homogenisiert worden sind, wobei das kationische Polymer die allgemeine Formel (I) aufweist:
in welcher: – R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel
sein kann; – n eine ganze Zahl zwischen 2 und 10 eingeschlossen ist; – p und q ganze Zahlen sind, mit der Maßgabe, dass die Summe p + q derart ist, dass das mittlere Molekulargewicht des Polymers zwischen 100 und 10⁷ Da eingeschlossen liegt, und – wobei die jeweiligen Anteile des Polymers und der Nukleinsäure derart ausgewählt werden, dass das Verhältnis R der Amingruppen des Polymers zu den Phosphatgruppen der Nukleinsäure zwischen 5 und 30 eingeschlossen liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Formel (I) n zwischen 2 und 5 eingeschlossen ist.
Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein mittleres Molekulargewicht zwischen 10³ und 5.10⁶ Da eingeschlossen aufweist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer unter Polyethylenimin (PEI) und Polypropylenimin (PPI) ausgewählt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer unter Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 50000 (PEI50K) und Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 800000 (PEI800K) ausgewählt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis R zwischen 5 und 15 eingeschlossen liegt.
Zusammensetzungen nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem einen oder mehrere Hilfsstoffe umfasst, die in der Lage sind, sich mit dem Polymer/Nukleinsäure-Komplex zu assoziieren und das Transfektionsvermögen zu erhöhen, wobei der Hilfsstoff unter den Lipiden, Proteinen, Lipopolyaminen und synthetischen Polymeren ausgewählt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Hilfsstoff ein kationisches Lipid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Lipid ein oder mehrere Lipopolyamine ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopolyamin der allgemeinen Formel H₂N-(-(CH)_m-NH-)l-H entspricht, in welcher m eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 eingeschlossen ist und l eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 eingeschlossen ist, wobei m zwischen den verschiedenen Kohlenstoff-Gruppen, die zwischen zwei Aminen enthalten sind, variieren kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopolyamin unter Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) oder 5-Carboxyspermylamid von Palmitoylphosphatidylethanolamin (DPPES) ausgewählt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Hilfsstoff ein oder mehrere neutrale Lipide ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die neutralen Lipide ausgewählt werden unter den synthetischen oder natürlichen Lipiden, die unter physiologischen Bedingungen zwitterionisch oder frei von Ionenladung sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die neutralen Lipide Lipide mit 2 Fettketten sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die neutralen Lipide ausgewählt werden unter Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamin (POPE), Distearoyl-, -palmitoyl-, -myristoylphosphatidylethanolamin wie auch deren 1- bis 3-fach N-methylierten Derivaten; den Phosphatidylglycerolen, den Diacylglycerolen, den Glycosyldiacylglycerolen, den Cerebrosiden (wie insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie insbesondere den Sphingomyelinen) und den Asialogangliosiden (wie insbesondere den AsialoGM1 und GM2).
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch modifiziert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Antisense-Nukleinsäure ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein therapeutisches Gen umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein antigenes Protein kodiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein virales Protein kodiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie 0,1 bis 20 Moläquivalente Hilfsstoff auf 1 Moläquivalent Phosphatgruppen der Nukleinsäure und mehr bevorzugt 1 bis 5 umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem ein Targeting-Element, das aus einem Zucker und/oder einem Peptid gebildet wird, wie einen Antikörper oder Antikörperfragment, einen Ligand eines zellulären Rezeptors oder ein Fragment eines solchen oder einen Rezeptor oder ein Rezeptorfragment, umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Targeting-Element auf kovalente Weise mit dem Polymer der Formel (I) verknüpft ist.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Träger für eine injizierbare Formulierung umfasst.
Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger für ein Auftragen auf die Haut und/oder die Schleimhäute umfasst.
Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 27 definiert, für eine Verwendung als Arzneimittel.
Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 27 definiert, für eine Verwendung als Impfstoff.
Verwendung eines kationischen Polymers, wie in Anspruch 1 definiert, für den in vitro-Transfer von Nukleinsäuren in Zellen.