DE69535433T2

DE69535433T2 - Verwendung eines Adsorptionsmittels für Interleukine, Verfahren zu deren Entfernung

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Publication number: DE69535433T2
Application number: DE69535433T
Authority: DE
Inventors: Fumiyasu Osaka Factory Kaneka Corp. Hirai; Nobutaka Osaka-shi TANI; Takamune Kobe-shi YASUDA; Takashi Kobe-shi ASAHI; Yuji Takasago-shi OKUBO; Osamu Takasago-shi ODAWARA; Michio Kakogawa-shi NOMURA
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-18
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2015-09-19
Also published as: EP0729784A4; EP1275437A3; DE69535433D1; US5902877A; WO1996009115A1; CA2177049A1; EP1275437B1; CA2177049C; DE69530670D1; JP3901214B2; EP0729784A1; EP1275437A2; EP0729784B1; DE69530670T2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Adsorbens für Interleukine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin-8 (im folgenden als IL-8 bezeichnet), Interleukin-1β (im folgenden als IL-1β bezeichnet), Interleukin 6 (im folgenden als IL-6 bezeichnet) und Interleukin-2 (im folgenden als IL-2 bezeichnet) und das Verfahren zum Entfernen durch das oben genannte Absorbens aus einer Körperflüssigkeit und die Absorptionsmittelvorrichtung unter Verwendung des Absorbens.
Stand der Technik
Ein Cytokin ist eine sehr wichtige proteinartige Substanz als biophylaktischer Faktor, der nahe verwandt mit verschiedenen Arten von Antigen-spezifischen, nicht spezifischen immun-inflammatorischen Reaktionen ist. Seine Existenz ist notwendig und unerlässlich, um die biologische Homöostase aufrecht zu erhalten und das Cytokin wird übermäßig bei einer Erkrankung mit Inflammation bzw. Entzündung erzeugt, die mit der Bildung und der Dauer der Pathologie der Erkrankung einhergeht.
„IL-8" ist eine Art von Cytokin, gereinigt als ein von Monocyten abgeleiteter neutrophiler chemotaktischer Faktor (MDNCF) durch Matsushima et al. und das Gen davon wurde auch 1987 geklont. IL-8 ist ein Neutrophil-Aktivierungs-Migrations-regulierender Faktor, der von verschiedenen Zellarten erzeugt wird.
Es ist bekannt, dass IL-8 auf ein Neutrophil einwirkt, um die Funktionen zur Inhibierung des Wachstums von Candida albicans und Mycobacterium, die das Neutrophil aufweist, zu verbessern und es wird angenommen, dass IL-8 als ein immun-aktivierendes Mittel wirkt (Nipponigakukan, Cytokine From Foundation to The Latest Information, 1991, Seiten 65-72). Daher bestand ein Bedürfnis nach einer Methode, um IL-8 wirksam in großer Menge aus einer Körperflüssigkeit oder einem Kulturmedium zu reinigen.
Andererseits schädigt die kontinuierliche Verabreichung von IL-8 in einer großen Menge die Gewebe beträchtlich und führt zu einer Zerstörung von Geweben beim respiratorischen Atemnot-Syndrom von Erwachsenen in einer Alveole, sowie zur Zerstörung von Geweben mit der Infiltration von Lymphozyten in einer großen Menge bei Arthrose. Experimentell wurde gezeigt, dass IL-8 wesentlich die Infiltration von Neutrophilen bei Dermatitis betrifft, die von Lipopolysacchariden stammen (LPS) und während der Reperfusion nach Ischämie. Dies wurde dadurch bewiesen, dass die Zerstörung von Geweben, die durch die vorstehende Infiltration von Lymphozyten oder Neutrophilen begleitet wird, fast vollständig inhibiert werden kann durch Verabreichung eines neutralisierenden Antikörpers gegen IL-8. Darüber hinaus wurde eine abnormal höhere Konzentration an IL-8 in einer entzündeten Stelle oder im peripheren Blut von Patienten mit Erkrankungen festgestellt, wie rheumatoide Arthritis (RA), gichtige Arthritis, Psoriasis, Kontakt-Dermatitis, Septikämie, idiopathisch fibroide Lunge, respiratorisches Schmerzsyndrom beim Erwachsenen, entzündliche Darmerkrankung, Immun-Angiitis, glomeruläre Nephritis, Infektion des Harntraktes, Herzinfarkt, Asthma, Infektion der Atemwege, perinatale infektiöse Erkrankung und Abstoßung bei Organtransplantation, als bei einem normalen Menschen (Menekiyakuri, 12, Nr. 1, Seiten 15-21 (1994)). Und es wird angenommen, dass IL-8 einen Bezug zu diesen Erkrankungen hat. Bisher wurde jedoch keine wirksame Methode zur Inhibierung der Funktion von IL-8 bei diesen Erkrankungen gefunden.
„IL-1β" ist ein inflammatorisches Cytokin, das hauptsächlich durch einen Monocyten und/oder einen Makrophagen unter Stimulierung von Fremdmaterial, wie Bakterien erzeugt wird und 1984 wurde das Human-Gen durch Auron et al. geklont.
Wie aus der Tatsache ersichtlich, dass IL-1β als ein endogenes Pyrogen (EP), ein leukozytischer endogener Mediator (LEM), ein Lymphozyten-Aktivierungsfaktor (LAF), ein B-Zellen-aktivierender Faktor (BAF) und dergleichen entdeckt wurde, bis der standartisierte Name von Interleukin 1 (IL-1) als gleiche Substanz im The 2nd International Lymphokine Workshop 1979 bestimmt wurde, zeigt sich seine Bioaktivität in verschiedenen Funktionen.
Obwohl IL-1β, bei dem es sich um einen Haupt-Mediator einer Entzündung handelt, eine wichtige Rolle bei verschiedenen Arten von Reaktionen, einschließlich Homöostase eines lebenden Körpers im Normalzustand, spielt, war es klar, dass IL-1β die Zerstörung von Geweben oder die Bildung und/oder Verschlechterung der Pathologie bei inflammatorischen Erkrankungen induziert, wenn IL-1β übermäßig oder während eines langen Zeitraums in gewissen Mechanismen produziert wird (Biomedica, 9, 1993, Seiten 703-707). Die Reaktion von IL-1β auf jeden pathologischen Zustand wie ein toxisches Syndrom einschließlich Septikämie, RA, Lyme-Erkrankung, Osteoporose, Kawasaki-Erkrankung, Gicht, Glomerulonephritis, ektatische Kardiomyopathie, Endometritis, vorzeitige Wehen, Granulom, akute myelogene Leukämie, Alzheimer-Erkrankung, Down-Syndrom, hepatische Fibrose, Hepatom, wird darüber hinaus alkoholische Hepatitis stark vermutet (Nipponigakukan, Cytokine – From Foundation to The Latest Information –, 1991, Seiten 13-20 und Seiten 177-187) und es besteht ein großes Bedürfnis und wird intensiv nach Methode zur spezifischen Inhibierung von IL-1β geforscht.
Obwohl als Beispiel ein AntiIL-1β-Antikörper, ein AntiIL-1β-Rezeptor-Antikörper, ein IL-1-Rezeptor-Antagonist (IL-1ra) und dergleichen entwickelt wurden (Igakunoayumi, 167, 1993, Seiten 432-435) und ein Teil davon klinischen Untersuchungen von Septikämie als objektiver Erkrankung unterzogen wurde, ergab sich jeweils kein erwarteter Erfolg und eine Umsetzung in die Praxis erfolgte nicht.
Auch „IL-6" wurde ursprünglich als ein differenzierender Faktor einer B-Zelle isoliert und die Struktur des Gens davon wurde durch Hirano, Kishimoto et al. 1986 bestimmt. Es wurde erkannt, dass IL-6 eine Funktion als Hauptmediator für Entzündungen ausübt, beispielsweise wirkt er als proliferierender Faktor für Myelocytome und als Antrieb einer akuten Proteinphase in der Leber.
Durch Erzeugung einer transgenen Maus wurde gezeigt, dass die abnormale Erzeugung von IL-6 zu einer polyklonalen Aktivierung einer B-Zelle führt und Plasmocytomie bewirkt. Es wurde allgemein auch beobachtet, dass IL-6 in Blut einen hohen Wert bei vielen inflammatorischen Erkrankungen oder Bakterieninfektionen, Virusinfektionen, Verbrühungen, Myokardinfarkt und dergleichen zeigt. Es wurde ein Beispiel berichtet, wonach der IL-6-Spiegel zum Zeitpunkt eines Eingriffs, wie einer Verbrühung oder einer chirurgischen Operation angehoben wurde und in einer Cerebrospinal-Flüssigkeit eines Patienten mit einer akuten bakteriellen Meningitis (durch Pneumococcus, Staphylococcus, Listeria) wurden bis zu 500 ng/ml IL-6 festgestellt. Andererseits wurde IL-6 in lokalen entzündeten Geweben oder allgemein in einem Körper bei chronischer Hepatitis festgestellt. Bei einer Autoimmunerkrankung, wie RA, Castleman Disease oder Atrialmyxom erfolgt die abnormale Produktion von IL-6 und es wird angenommen, dass hierdurch die Produktion von Proteinen bei der Hypergammaglobulinämie angeregt wird. Darüber hinaus wird angenommen, dass eine Beteiligung von IL-6 an Erkrankungen wie Krebs der Uterus Cervix, Aids, alkoholischer Hepatitis, multiples Myelom, Lennert T-Lymphom, mesangiale proliferative Nephritis und renale Cytom-Psoriasis sowie Septicämie (Nipponigakukan, Cytokine – Foundation to The Latest Information –, 1991, Seiten 177-187) besteht. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt besteht jedoch keine wirksame Methode zur Inhibierung speziell der Funktion von IL-6 bei diesen Erkrankungen.
Darüber hinaus ist „IL-2" ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 15 kDa, das im allgemeinen als Wachstumsfaktor für T-Zellen (TCGF) bezeichnet wird und es ist ein Cytokin, von dem das Gen durch Taniguchi et al. 1983 geklont wurde. Es wird angenommen, dass die Anwendung von IL-2 ein Heilmittel für Krebs gemäß einer einzigen Therapie oder lokalen adoptiven Immuntherapie ist, da IL-2 eine die Proliferation erleichternde Wirkung gegen T-Zellen hat.
Andererseits besteht die Vermutung, dass IL-2, kontinuierlich an einem Ort (in diesem Falle am Pankreas) produziert, eine der potenten Pathogenesen für Auto-Immun-Diabetes-Mellitus ist, gemäß einem Experiment unter Verwendung einer transgenen Maus (Heath W. R., Allison J. et al.: Nature, 359, Seite 547, 1992). Es wurde berichtet, dass die Verabreichung von IL-2 die Entwicklung von sowohl systemischem Lupus erythematosus (SLE) als auch RA bewirkte (Chazerain P., Meyer O., Kahn M.-F., Ann. Intern. Med., 116, Seite 427, 1992 und Wandl U. B., Nagel-Hiemke M., May D. et al.: Clin. Immunol. Immunopathol., 65, Seite 70, 1992). Darüber hinaus wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass IL-2 zusammen mit TNF-α stark mit den pathologischen Bedingungen des septischen Schocks zusammenhängt (Endo S., Inada K., Inoue Y. et al.: Circulatory Shock, 38, Seite 264, 1992). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es jedoch keine wirksame Methode zur Inhibierung der Funktion von IL-2 bei diesen Erkrankungen.
Ein Verfahren zum Entfernen eines Proteins, welches Sulfatid ablagert, wurde in JP-A-3016639 beschrieben. Das Verfahren umfasst die Herstellung einer Verbindung, welche eine anionische funktionelle Gruppe oder eine funktionelle Gruppe, welche in der Lage ist, in eine anionische Gruppe umgewandelt zu werden, aufweist. Die Verbindung wird in ein Gefäß für die Absorptionsbehandlung gegeben.
In US-A-5,338,834 wird ein Verfahren zur Herstellung von reinem menschlichen Interleukin-6 beschrieben. Das Verfahren umfasst einen Schritt der Kationenaustausch-Chromatographie.
Zieht man die vorstehende Situation in Betracht, so haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Methode untersucht zur Adsorption und Entfernung von IL-8, IL-1β, IL-6 und/oder IL-2 als eine pathogene Substanz aus einer Körperflüssigkeit eines Patienten und, falls notwendig, eine Methode zu deren Rückgewinnung. Als Ergebnis wiederholter intensiver Untersuchungen haben die Erfinder gefunden, dass ein wasserunlöslicher Träger mit einer Schwefelsäureestergruppe als einer anionischen funktionellen Gruppe beim Kontakt mit einer Körperflüssigkeit stark IL-8, IL-1β, IL-6 und IL-2 in der Körperflüssigkeit adsorbiert und so wurde die Erfindung fertiggestellt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die selektive Adsorption und Entfernung von IL-8, IL-1β, IL-6 und/oder IL-2 aus einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Plasma und Serum und falls notwendig deren Rückgewinnung.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Adsorbens, welches einen wasserunlöslichen porösen Cellulosegelträger mit einer anionischen funktionellen Gruppe zur Adsorption von mindestens einem Interleukin umfasst, welches ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin-8, Interleukin-1β, Interleukin-6 und Interleukin-2 aus einer Körperflüssigkeit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Aszites und Gewebeflüssigkeit, worin die anionische funktionelle Gruppe mindestens ein Vertreter, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Sulfonsäuregruppe, einer Carboxylgruppe und eine Phosphorsäureestergruppe, ist.
Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Adsorbieren, Entfernen und Zurückgewinnen von mindestens einem wie oben beschriebenen Interleukin. Die Erfindung betrifft ferner ein Adsorbens für die oben beschriebene Adsorption, umfassend den oben beschriebenen porösen Cellulosegelträger zur Adsorption von mindestens einem der beschriebenen Interleukine.
In dem oben erwähnten Adsorbens kann die anionische Gruppe z.B. aus einem Polystyrolsulfonat stammen und/oder z.B. eine polyanionische funktionelle Gruppe mit mehreren anionischen funktionellen Gruppen innerhalb der funktionellen Gruppe sein.
Auch ist in dem vorstehend genannten Adsorbens der wasserunlösliche Träger vorzugsweise hydrophil, porös und/oder es liegt in dem wasserunlöslichen Träger eine funktionelle Endgruppe, dargestellt durch -OH, vor.
Erfindungsgemäß bedeutet die Körperflüssigkeit Blut, Plasma, Serum, Aszites und Gewebeflüssigkeit und ein Teilbestandteil, welches davon erhalten wird, aus einem Körper.
„IL-8" ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 und es wurde berichtet, dass es als Monomeres oder Dimeres existiert (Science, 264, Seiten 90 bis 92).
„IL-1β" ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 17500, welches 153 Aminosäuren umfasst und dessen isoelektrischer Punkt 7 bis 8 ist. IL-8 wird von einem Monocyten oder einem Makrophagen erzeugt und weist verschiedene biologische Aktivitäten auf, wie die Derivation der Proliferation oder Differentiation einer immunkompetenten Zelle, eine endogene Pyrogenaktivität und Derivation einer Entzündungsreaktion, wie die Synthese des inflammatorischen Proteins der akuten Phase in der Leber. „IL-6" ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 21000 bis etwa 28000, das aus einer nicht-lymphoiden Zelle sowie aus einer lymphoiden Zelle erzeugt wird.
„IL-2" ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 15000, das von einer T-Zelle erzeugt wird. Es ist bekannt, dass IL-2 die Proliferation, Differentiation oder Aktivierung einer Funktion gegen eine T-Zelle, eine B-Zelle, eine NK-Zelle, einen Monocyten, einen Makrophagen und dergleichen erleichtert.
Der erfindungsgemäß verwendete wasserunlösliche Träger ist bei Raumtemperatur unter normalem Druck fest und die feste Oberfläche kann mit einem wasserunlöslichen Material beschichtet sein.
Die Form des wasserunlöslichen Trägers der Erfindung unterliegt keiner speziellen Begrenzung. Beispielsweise ist die Form die eines Teilchens, einer Platte, einer Folie, einer Faser oder dergleichen. Im Falle der Faserform kann die Faser hohl sein. Erfindungsgemäß kann der wasserunlösliche Träger in eine Säule beschickt sein.
Wird ein Adsorbens verwendet, mit dem eine Säule beschickt wird, so ist es bevorzugt, dass Blut durchlaufen kann. Ausreichende Öffnungen zum Durchlaufen der im Blut enthaltenen Zellen sind bevorzugt. Wenn beispielsweise das Adsorbens in der Form eines Teilchens vorliegt und beabsichtigt wird, dass IL-8 adsorbiert wird, so ist es bevorzugt, wenn die durchschnittliche Teilchengröße 5 bis 1000 μm beträgt. Vorzugsweise liegt die durchschnittliche Teilchengröße bei 25 bis 1000 μm und besonders bevorzugt liegt die durchschnittliche Teilchengröße bei 50 bis 300 μm. Wenn die durchschnittliche Teilchengröße nicht mehr als 5 μm ist, kann eine Körperflüssigkeit nicht stabil durch das Adsorbens mit hoher Fließgeschwindigkeit während eines längeren Zeitraums laufen. Wenn sie nicht weniger als 1000 μm ist, wird die Adsorptionswirkung verringert. Im Falle eines Teilchens ist es besonders bevorzugt, wenn die Verteilung der Teilchengröße eng ist.
Wenn das Adsorbens in der Form einer Faser vorliegt und hohl ist, ist es bevorzugt, wenn der innere Durchmesser nicht weniger als 5 μm beträgt. Wenn IL-8 adsorbiert werden soll, ist der innere Durchmesser vorzugsweise 20 bis 1000 μm und besonders bevorzugt 30 bis 300 μm.
Im Falle der Form einer Faser, deren Inneres nicht leer ist, ist es bevorzugt, wenn der Durchmesser nicht weniger als 1 μm beträgt. Falls beabsichtigt wird IL-8 zu adsorbieren, ist der Durchmesser vorzugsweise 2 bis 500 μm und besonders bevorzugt 5 bis 200 μm. Es ist bevorzugt, wenn die Oberfläche des wasserunlöslichen Trägers glatt ist. Es ist nicht bevorzugt, wenn die Oberfläche rauh ist, da eine nicht spezifische Adsorption vergrößert und die Selektivität verringert wird.
Die anionische funktionelle Gruppe kann erfindungsgemäß jede sein, welche eine funktionelle Gruppe enthält, welche bei einem ungefähr neutralen pH-Wert negativ geladen ist und ist zumindest ein Vertreter, ausgewählt aus einer Sulfonsäuregruppe, einer Carboxylgruppe und einer Phosphorsäureestergruppe ist. Die typischen Beispiele für solch eine funktionelle Gruppe sind z.B. Carboxylgruppe, Sulfonsäuregruppe, Schwefelsäuregruppe, Silanolgruppe, Phosphorsäureestergruppe, Phenolhydroxylgruppe und ähnliche. Hiervon sind die Sulfonsäuregruppe und die Schwefelsäureestergruppe bevorzugt, um IL-1β, IL-6 und/oder IL-2 zu absorbieren, allerdings ist die anionische funktionelle Gruppe hierauf nicht beschränkt. Darüber hinaus können diese funktionellen Gruppen alleine oder in Kombination von mindestens zwei Arten dieser Gruppen verwendet werden. Um IL-8 zu absorbieren, können als Beispiele für die bevorzugte anionische funktionelle Gruppe die Schwefelsäureestergruppe, die Sulfonsäuregruppe, die Carboxylgruppe und die Phosphorsäureestergruppe genannt werden.
Darüber hinaus kann in der vorliegenden Erfindung die anionische funktionelle Gruppe ein monoanionische funktionelle Gruppe sein mit einer anionischen funktionellen Gruppe pro Molekül oder kann eine polyanionische funktionelle Gruppe mit mehreren monoanionischen funktionellen Gruppen sein. Die polyanionische funktionelle Gruppe ist bevorzugt, da die polyanionische funktionelle Gruppe eine hohe Affinität für IL-8, IL-1β, IL-6 und IL-2 hat und es leicht ist, mehrere monoanionische funktionelle Gruppen in eine Einheitsmenge des wasserunlöslichen Trägers einzuführen. Unter diesen ist die polyanionische funktionelle Gruppe mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als 1000 bevorzugt im Hinblick auf die Affinität für IL-8, IL-1β, IL-6 und IL-2 und im Hinblick darauf, dass zahlreiche monoanionische funktionelle Gruppen in den Träger eingeführt werden können. Die monoanionische funktionelle Gruppe, welche die polyanionische Gruppe aufweist, kann von einer Art sein oder es können Gruppen von zwei oder mehreren Arten sein.
Um IL-8 zu adsorbieren ist es bevorzugt, wenn 100 nmol bis 10 mmol der anionischen funktionellen Gruppe gemäß der Erfindung pro Volumeneinheit (1 ml) des wasserunlöslichen Trägers vorhanden sind. Vorzugsweise ist eine Menge von 1 bis 200 μmol und besonders bevorzugt von 5 bis 100 μmol enthalten. Wenn sie weniger als 100 nmol ist, ist die Wirkung der anionischen funktionellen Gruppe gering und wenn sie mehr als 10 mmol ist, erfolgt eine nicht spezifische Adsorption von Substanzen, die sich von den vorstehend erwähnten Interleukinen unterscheiden.
Repräsentative Beispiele für die Verbindung in die die polyanionische funktionelle Gruppe eingeführt werden kann, sind synthetische polyanionische Verbindungen wie Poly(acrylsäure), Poly(vinylschwefelsäure), Poly(vinylsulfonsäure), Poly(vinylphosphorsäure), Poly(styrolsulfonsäure), Poly(styrolphosphorsäure), Poly(glutaminsäure), Poly(aspartinsäure), Poly(methacrylsäure), Poly(phosphorsäure) und Styrol-Maleinsäurecopolymer und Polysaccharide mit einer anionischen funktionellen Gruppe, wie Heparin, Dextransulfat, Chondroitin, Chondroitinsulfat und Phosphomammam, jedoch ist die Verbindung nicht hierauf begrenzt. Auch sind repräsentative Beispiele für die Verbindung zur Einführung der monoanionischen funktionellen Gruppe Verbindungen wie Schwefelsäure, wobei jedoch auch hierauf keine Beschränkung besteht. Vorzugsweise stammt die anionische funktionelle Gruppe von mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Schwefelsäure, Dextransulfat und Poly(styrolsulfonsäure).
Darüber hinaus umfasst die anionische funktionelle Gruppe der Erfindung mindestens eine Art von funktionellen Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe der vorstehenden monoanionischen funktionellen Gruppe und/oder polyanionischen funktionellen Gruppe und sie kann mindestens zwei Arten davon umfassen. Auch können die monoanionische funktionelle Gruppe und eine polyanionische funktionelle Gruppe zusammen enthalten sein.
Als wasserunlöslicher Träger mit einer anionischen funktionellen Gruppe, bei der es sich um das erfindungsgemäße Adsorbens handelt, kann eine Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe selbst verwendet werden. Es kann auch ein Polymer, erhalten durch Polymerisation von Monomeren mit anionischen funktionellen Gruppen oder ein wasserunlöslicher Träger, erhalten durch Einführen einer anionischen funktionellen Gruppe, verwendet werden.
Um eine nicht spezifische Adsorption von Komponenten von Blutzellen während des Durchlaufs von Blut durch das Adsorbens zu vermeiden, kann das Adsorbens beispielsweise mit einem geeigneten Makromolekül beschichtet sein, wie einem Polymer von Hydroxyethylmethacrylat. Diese Beschichtung kann auch durchgeführt werden, um zu verhindern, dass von dem Adsorbens feine Teilchen erzeugt werden.
Beispiele für den wasserunlöslichen Träger, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind z.B. anorganische Träger wie Glasperlen, Silikagel und Aluminiumoxid, organische Träger, enthaltend ein synthetisches Makromolekül wie vernetzter Poly(vinylalkohol), vernetztes Polyacrylat, vernetztes Polyacrylamid oder vernetztes Polystyrol, oder ein Polysaccharid wie kristalline Cellulose, vernetzte Cellulose, vernetztes Agarose oder vernetztes Dextran, und darüber hinaus Komplexträger wie organische-organische Träger und organisch-anorganische Träger, welche durch Kombinationen davon erhalten werden können und dergleichen. Hiervon ist ein hydrophiler Träger bevorzugt, da die nicht spezifische Absorption selten auftritt und die Adsorptionsselektivität von IL-8, IL-1β, IL-7 und IL-2 hervorragend ist. Hier versteht man unter dem hydrophilen Träger einen Träger, welcher einen Kontaktwinkel von mindestens 60 Grad mit Wasser aufweist. Der Kontaktwinkel ist von einer Verbindung, welche den Träger darstellt, welcher in der Form einer ebenen Fläche angeordnet ist. Als solch einen Träger können beispielsweise Träger, enthaltend ein Polysaccharid wie Cellulose, Chitosan, Sepharlose oder Dextran, Poly(vinylalkohol), verseiftes Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Polyacrylamid, Poly(acrylsäure), Poly(methacrylsäure), Poly(methylmethacrylat), Poly(acrylsäure- Pfropfpolyethylen), Poly(acrylamid-Pfropfpolyethylen), Glas oder ähnliches genannt werden. Hiervon ist ein Träger, in welchem -OH-Gruppen vorliegen, bevorzugt hinsichtlich der Adsorptionsperformance und -selektivität. Hiervon ist ein poröses Cellulosegel am meisten bevorzugt für einen Träger, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, da er überlegene Punkte wie folgt aufweist:

➀ Der Träger eines porösen Cellulosegels wird kaum zerstört oder erzeugt fein verteilte Teilchen durch Bewegungsvorgänge und dergleichen, da er eine relativ hohe mechanische Festigkeit und Zähigkeit aufweist. Der Träger wird weder kompaktiert, noch verklumpt, wenn eine Säule damit beschickt wird und eine Körperflüssigkeit durch die Säule mit hoher Fließgeschwindigkeit geleitet wird. Darüber hinaus wird die Porenstruktur schwerlich durch Hochdruck-Dampfsterilisation verändert.
➁ Der Träger ist hydrophil, da das Gel aus Cellulose gebildet wird. Es können viele Hydroxylgruppen zur Bindung eines Liganden vorhanden sein und die nicht spezifische Adsorption ist gering.
➂ Wenn das Porositätsvolumen vergrößert wird, kann ein vergleichbares Adsorptionsvolumen zu einem Softgel erzielt werden, da die Festigkeit relativ hoch ist.
➃ Die Sicherheit ist groß im Vergleich mit einem synthetischen makromolekularen Gel und dergleichen. Der Träger ist nicht auf die vorstehend genannten Träger beschränkt. Es kann auch jeder der vorstehend genannten Träger allein oder durch Vermischen von gegebenenfalls zwei oder mehreren Arten davon verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Adsorbens kann IL-8, IL-1β, IL-6 und/oder IL-2 nur an der äußeren Oberfläche adsorbieren. Die für die wasserunlöslichen Träger zur Adsorption von mehr IL-8, IL-1β, IL-6 und/oder IL-2 erforderlichen Charakteristika sind, dass das Adsorbens zahlreiche Poren adäquater Größe aufweist, nämlich dass das Adsorbens porös ist. Das Molekulargewicht von IL-8, welches ein durch das erfindungsgemäße Adsorbens zu adsorbierendes Objekt ist, weist ein Molekulargewicht von etwa 8000 auf, IL-1β hat ein Molekulargewicht von etwa 17500, IL-6 hat ein Molekulargewicht von etwa 21000 bis etwa 28000 und IL-2 hat ein Molekulargewicht von etwa 15000. Daher ist es zur wirksamen Adsorption dieser Proteine bevorzugt, wenn IL-8, IL-1β, IL-6 und IL-2 in die Poren mit etwas größerer Wahrscheinlichkeit eintreten können und der Eintritt anderer Proteine nicht auftritt oder so gering wie möglich ist.
Um die Porengröße zu messen, wird am häufigsten die Methode der Quecksilber-Porosimetrie angewendet. Im Falle des erfindungsgemäß verwendeten porösen wasserlöslichen Trägers kann die Methode der Quecksilber-Porosimetrie nicht so oft angewendet werden und es ist zweckmäßig, eine Molekulargewichts-Ausschlussgrenze als ein Maß für die Porengröße des Gels zu verwenden. Die Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht entspricht dem minimalen Molekulargewicht des Moleküls, das in einem Gelpermeationschromatographen nicht in eine Pore eintreten kann (d.h. das Molekül wird ausgeschlossen) (beschrieben von Hiroyuki Hatano und Toshihiko Hanai, Experimental High Performance Liquid Chromatography, Kagaku Dojin). Das Molekulargewicht der Ausschlussgrenze für ein globuläres Protein, Dextran, Polyethylenglykol oder dergleichen wurde allgemein untersucht und im Falle der erfindungsgemäß eingesetzten Träger ist es zweckmäßig einen Wert zu verwenden, der unter Verwendung des globulären Proteins erhalten wurde.
Das Molekulargewicht von IL-1β ist etwa 17500 und das Molekulargewicht von IL-6 ist etwa 21000 bis etwa 28000. Um daher IL-1β und/oder IL-6 zu adsorbieren, wenn der Träger eine Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von weniger als 3 × 10⁴ aufweist, ist die Menge an adsorbiertem und entferntem IL-1β und/oder IL-6 gering und die Durchführbarkeit wird verschlechtert. Daher ist eine bevorzugte Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht des Trägers, der für IL-1β und/oder IL-6 verwendet wird, nicht weniger als 3 × 10⁴ und darüber hinaus ist es bevorzugt, wenn das Molekulargewicht der Ausschlussgrenze nicht weniger als 5 × 10⁴ beträgt.
Da das Molekulargewicht von IL-2 etwa 15000 beträgt, ist im Hinblick auf die Adsorption von IL-2 bei Verwendung eines Trägers mit einer Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht von weniger als 1 × 10⁴ die adsorbierte und entfernte Menge an IL-2 gering und die Durchführbarkeit wird verschlechtert. Daher ist die bevorzugte Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht des Trägers, der für IL-2 verwendet wird, nicht geringer als 1 × 10⁴ und darüber hinaus ist es bevorzugt, wenn die Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht nicht weniger als 2 × 10⁴ ist. Hinsichtlich der Verwendung von Plasma oder Serum als Körperflüssigkeit besteht keine obere Begrenzung des Molekulargewichts der Ausschlussgrenze.
Wird darüber hinaus Blut als Körperflüssigkeit verwendet, besteht die Tendenz, dass der Prozentsatz der Adhäsion von Blutplättchen vergrößert wird, wenn die Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht über 5 × 10⁶ liegt. Falls das erfindungsgemäße Adsorbens in einem Hämokatharsis-System zur direkten Hämoperfusion (DHP)-Typ verwendet wird, wird eine ausreichende Durchführbarkeit nicht notwendigerweise erzielt. Es ist daher bevorzugt, dass die Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht nicht mehr als 5 × 10⁶ beträgt. So beträgt die Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht im Falle der Verwendung von Blut als Körperflüssigkeit 3 × 10⁴ bis 5 × 10⁶, bevorzugt 5 × 10⁴ bis 5 × 10⁶.
Andererseits ist für die Adsorption von IL-8 die Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht 1 × 10⁴ bis 1 × 10⁶, vorzugsweise 3 × 10⁴ bis 5 × 10⁵ und besonders bevorzugt 5 × 10⁴ bis 2 × 10⁵. Dieser Wert ist im Wesentlichen konstant, selbst wenn der Träger in der Form eines Teilchens, einer Platte oder einer Faser vorliegt.
Im folgenden wird die poröse Struktur des Trägers erläutert. Zieht man die Leistungsfähigkeit der Adsorption pro Volumeneinheit des Adsorbens in Betracht, so ist eine vollständige Porosität bevorzugter als eine Oberflächenporosität. Es ist auch bevorzugt wenn das Porositätsvolumen nicht weniger als 20 % und die spezifische Oberfläche nicht weniger als 3 m²/g betragen. Im Hinblick auf die Form des Trägers können ein Teilchen, eine Faser, Hohlfasern oder dergleichen gegebenenfalls gewählt werden.
Es ist darüber hinaus vorteilhaft für eine Immobilisierungsreaktion von Liganden, wenn eine funktionelle Gruppe zur Immobilisierungsreaktion von Liganden an der Oberfläche des Trägers existiert. Beispiele für die funktionelle Gruppe sind die Hydroxylgruppe, Aminogruppe, Aldehydgruppe, Carboxylgruppe, Thiolgruppe, Silanolgruppe, Amidogruppe, Epoxygruppe, eine Halogengruppe, Succinylimidgruppe, Säureanhydridgruppe und dergleichen.
Als erfindungsgemäß zu verwendender Träger können sowohl ein harter als auch ein weicher Träger verwendet werden. Im Falle der Verwendung des Adsorbens zur extrakorporalen Zirkulationsbehandlung ist es, wenn eine Säule mit dem Träger beschickt wird und eine Flüssigkeit hindurchläuft und dergleichen, wichtig, dass die Säule nicht verstopft wird. Aus diesem Grunde ist eine ausreichende mechanische Festigkeit erforderlich. Daher ist es bevorzugter, wenn der erfindungsgemäß verwendete Träger hart ist. Der erfindungsgemäß verwendete Ausdruck „harter Träger", bedeutet beispielsweise für den Fall, dass wie in dem nachstehend beschriebenen Bezugsbeispiel ein Gel ein granuliertes Gel ist, dass bei dem Träger eine Beziehung zwischen dem Druckverlust ΔP und der Fließgeschwindigkeit vorliegt, bei der es sich um eine lineare Beziehung bis zu 0,3 kg/cm² Druckverlust handelt, wenn eine zylindrische Säule gleichmäßig mit dem Gel beschickt wird und eine wässrige Flüssigkeit durch die Säule hindurchläuft.
Das erfindungsgemäß verwendete Adsorbens ist dadurch charakterisiert, dass das Adsorbens den wasserunlöslichen Träger mit einer anionischen funktionellen Gruppe aufweist. Um einen wasserunlöslichen Träger mit einer anionischen funktionellen Gruppe zu erhalten, gibt es verschiedene Methoden zur Einführung einer anionischen funktionellen Gruppe in den wasserunlöslichen Träger und die anionische funktionelle Gruppe kann mittels jeder Methode eingeführt werden. Als repräsentative Beispiele für die Einführungsmethode können genannt werden:

(1) Ein Verfahren zur Bildung eines Adsorbens durch Polymerisation unter Verwendung eines Monomers oder eines Vernetzungsmittels in Form einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe oder einer funktionellen Gruppe, die leicht in die anionische funktionelle Gruppe überführt werden kann.
(2) ein Verfahren zur Immobilisierung einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe auf dem wasserunlöslichen Träger und
(3) ein Verfahren zur Immobilisierung einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe auf dem wasserunlöslichen Träger durch direkte Reaktion der Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe mit dem wasserunlöslichen Träger.

Als repräsentative Beispiele des Monomers oder des Vernetzungsmittels mit einer anionischen funktionellen Gruppe oder einer funktionellen Gruppe, die leicht in eine in dem Verfahren (1) verwendete anionische funktionelle Gruppe überführt werden kann, können Acrylsäure und ein Ester davon, Methacrylsäure und ein Ester davon, Styrolsulfonsäure und dergleichen genannt werden. Das Monomer oder Vernetzungsmittel ist jedoch nicht auf diese Verbindungen beschränkt.
Als Methode (2), nämlich die Methode zur Immobilisierung einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe auf dem wasserunlöslichen Träger, gibt es ein Verfahren zur physikalischen Adsorption, ein Verfahren mittels einer ionischen Bindung, ein Verfahren zur Immobilisierung durch kovalente Bindung und dergleichen und jede Methode kann verwendet werden. Da es wichtig ist, dass die Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe nicht freigesetzt wird, um die Konservierung und Sicherheit des Adsorbens sicherzustellen, ist die Methode mittels einer kovalenten Bindung, die zur Bildung starker Immobilisierung geeignet ist, bevorzugt.
Wenn die Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe mittels einer kovalenten Bindung immobilisiert wird, ist es bevorzugt, wenn die Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe eine polyfunktionelle Verbindung mit einer funktionellen Gruppe, die zur Immobilisierung geeignet ist und sich von der anionischen funktionellen Gruppe unterscheidet, ist. Für den Fall, dass die Verbindung mit einer polyanionischen funktionellen Gruppe immobilisiert wird, kann die Immobilisierung unter Verwendung eines Teils der anionischen funktionellen Gruppe durchgeführt werden.
Als repräsentatives Beispiel für die funktionelle Gruppe, die zur Immobilisierung geeignet ist, können genannt werden die Aminogruppe, Amidgruppe, Carboxylgruppe, Säureanhydridgruppe, Succinylimidgruppe, Hydroxylgruppe, Thiolgruppe, Aldehydgruppe, eine Halogengruppe, die Epoxygruppe, Silanolgruppe und dergleichen. Die funktionelle Gruppe, die zur Immobilisierung verfügbar ist, ist nicht auf diese Verbindungen begrenzt.
Wenn beispielsweise eine Verbindung mit einer Schwefelsäureestergruppe an dem wasserunlöslichen Träger durch eine kovalente Bindung immobilisiert ist, wie im repräsentativen Beispiel einer Verbindung mit einer Schwefelsäureestergruppe, kann als Beispiel eine Schwefelsäureestergruppe genannt werden, die sich von einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe ableitet, wie einem Alkohol, Saccharid oder Glykol. Unter diesen ist eine partielle Schwefelsäureester-Verbindung, die sich von einem Polyalkoho ableitet, und insbesondere eine Schwefelsäureester-Verbindung, die sich von einem Polysaccharid ableitet, besonders bevorzugt, da sie sowohl eine Schwefelsäureestergruppe als auch eine funktionelle Gruppe aufweist, die notwendig ist zur Immobilisierung, da sie leicht an dem wasserunlöslichen Träger immobilisiert werden kann.
Ein Beispiel für die Methode (3), nämlich die Methode zur Einführung einer anionischen funktionellen Gruppe durch Immobilisierung einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe an dem wasserunlöslichen Träger durch direkte Reaktion der Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe mit dem wasserunlöslichen Träger, kann eine Methode angegeben werden zur Einführung einer Schwefelsäureestergruppe in den wasserunlöslichen Träger mit einer Hydroxylgruppe. In diesem Falle kann die Schwefelsäureestergruppe direkt durch Reaktion des wasserunlöslichen Trägers mit der Hydroxylgruppe mit einem Reagenz eingeführt werden, wie Chlorsulfonsäure oder konzentrierte Schwefelsäure.
Außer den drei genannten Methoden gibt es eine Methode (4) zur Herstellung eines wasserunlöslichen Trägers mit einer polyanionischen funktionellen Gruppe durch Pfropfpolymerisation einer Verbindung mit einer anionischen funktionellen Gruppe oder einer funktionellen Gruppe, die leicht in die anionische funktionelle Gruppe umgewandelt werden kann, als Monomer auf den wasserunlöslichen Träger.
Es gibt verschiedene Verfahrensweisen als Methode zur Adsorption und Entfernung des Interleukins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IL-8, IL-1β, IL-6 und IL-2, in einer Körperflüssigkeit durch Inkontaktbringen des Adsorbens, das den wasserunlöslichen Träger mit einer anionischen funktionellen Gruppe umfasst, mit einer Körperflüssigkeit, Als repräsentative Methode wird eine Methode vom Batch-Typ angegeben, bei der eine Körperflüssigkeit entnommen und in einem Beutel oder dergleichen gelagert wird und das Adsorbens damit vermischt wird, um das aus der Gruppe, bestehend aus IL-8, IL-1β, IL-6 und IL-2 gewählte Interleukin zu adsorbieren und zu entfernen, und anschließend wird das Adsorbens abfiltriert, um die Körperflüssigkeit zu erhalten, aus der das Interleukin aus der Gruppe, bestehend aus IL-8, IL-1β, IL-6 und IL-2 entfernt wird. Es gibt auch ein Verfahren vom kontinuierlichen Typ, bei dem ein Gefäß mit einem Einlass und einem Auslass für eine Flüssigkeit mit einem Filter ausgerüstet wird, durch welchen eine Körperflüssigkeit hindurch laufen kann und das Adsorbens nicht hindurchlaufen kann, und das Gefäß wird mit dem Adsorbens beschickt und die Körperflüssigkeit strömt unter Normaldruck oder unter hohem Druck hindurch. Es gibt auch andere Methoden. Alle Methoden können verwendet werden. Die letztere Verfahrensweise ist jedoch einfach und IL-8, IL-1β, IL-6 und IL-2 können wirksam online aus einer Körperflüssigkeit eines Patienten durch Einbeziehen der letztgenannten Methode in einen extrakorporalen Kreislauf entfernt werden. Daher ist das erfindungsgemäße Adsorbens für diese Methode geeignet. Beide Methoden können kombiniert und miteinander verwendet werden.
Die Gewinnung von IL-8, das an dem Adsorbens adsorbiert ist, kann durchgeführt werden durch Behandeln des Adsorbens an dem IL-8 adsorbiert ist, mit beispielsweise einer wässrigen Lösung mit einer hohen Salzkonzentration, z.B. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), die Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,5 M enthält und durch Eluieren des adsorbierten IL-8. Eine Pufferlösung mit einem Konzentrationsgradienten an Salzen kann ebenso verwendet werden. Außerdem können IL-1β, IL-2 und/oder IL-6 ebenfalls in gleicher Weise gewonnen werden.
Die vorstehend genannte Entfernung und Gewinnung kann sowohl nach der Methode vom Batch-Typ oder nach der kontinuierlichen Methode oder einer Kombination dieser beiden Methoden durchgeführt werden. Im Falle der Methode vom kontinuierlichen Typ ist es auch einfach, IL-8 von dem Adsorbens durch einen einfachen Verfahrensschritt zu gewinnen. Diese Methoden sind wirksam, beispielsweise in dem Fall, wenn IL-8 aus einem Kulturmedium, das IL-8 durch Kultur eines Mikroorganismus in den das Gen von IL-8 eingearbeitet ist, gewonnen wird oder im Falle der Gewinnung von IL-8 aus Blut.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein schematischer Querschnitt von einem Beispiel für einen Adsorber für IL-8, IL-1β, IL-6 und/oder IL-2, der erfindungsgemäß verwendet wird.
2 ist eine Graphik, die das Ergebnis der Untersuchung der Beziehung der Strömungsgeschwindigkeit und des Druckverlustes unter Verwendung von 3 Gelarten zeigt.
Beste Durchführungsform der Erfindung
Im folgenden wird der erfindungsgemäße Adsorber für IL-1β unter Einsatz des Adsorbens für IL-1β, basierend auf der 1, erläutert, bei der es sich um einen Querschnitt eines Beispiels dafür handelt, Die Adsorber für IL-8, IL-1β, IL-6 und/oder IL-2 sind gleich wie der vorstehend erwähnte Adsorber für IL-1β.
In der Figur ist 1 ein Einlass für eine Körperflüssigkeit, 2 ein Auslass für eine Körperflüssigkeit, 3 ist das Adsorbens für IL-1β (IL-8, IL-6, IL-1β und/oder IL-2) gemäß der Erfindung, 4 und 5 sind Einrichtungen, um das Adsorbens für IL-1β (IL-8, IL-6, IL-1β und/oder IL-2) daran zu hindern auszufließen, durch die eine Körperflüssigkeit und in der Körperflüssigkeit enthaltene Komponenten hindurchlaufen können, das Adsorbens jedoch nicht passieren kann, 6 ist eine Säule, 7 ist ein Adsorber. Die Form und Qualität des Materials für das Gefäß des vorstehend genannten Adsorbers unterliegen keiner Begrenzung. Als konkretes Beispiel kann ein zylindrisches Gefäß mit einem Volumen von etwa 150 bis etwa 400 ml und einem Durchmesser von etwa 4 bis etwa 10 cm angegeben werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Detail unter Verwendung der noch folgenden Beispiele erläutert; allerdings ist die vorliegende Erfindung nicht auf die nachfolgenden Beispiele beschränkt.
Bezugsbeispiel
Jede der zylindrischen Säulen aus Glas (Innendurchmesser 9 mm, Länge der Säule 150 mm), ausgerüstet mit Filtern mit einer Porengröße von 15 μm an beiden Enden, wurde gleichmäßig mit einem Agarosegel (Biogel A-5m, hergestellt von BIO-RAD, Teilchengröße: 50 bis 100 mesh), einem Polymergel vom Vinyltyp (TOYOPEARL HW-65, hergestellt von der TOSOH Corporation, Teilchengröße: 50 bis 100 μm) oder einem Cellulosegel (CELLULOFINE GC 700-m, hergestellt von der CHISSO CORPORATION, Teilchengröße: 45 bis 105 μm) beschickt. Die Beziehung zwischen der Strömungsgeschwindigkeit und dem Druckverlust ΔP wurde gemessen durch Hindurchleiten von Wasser durch die Säulen mittels einer peristaltischen Pumpe. Die Ergebnisse sind in der 2 dargestellt.
Wie aus 2 ersichtlich, wurde gefunden, dass die jeweilige Fließgeschwindigkeit im Falle von TOYOPEARL HW-65 und CELLULOFINE GC-700m fast proportional zum Anstieg des Druckes ansteigt. Andererseits wurde gefunden, dass Biogel A-5m eine Kompaktierung bewirkt und die Fließgeschwindigkeit nicht ansteigt, wenn der Druck erhöht wird. Erfindungsgemäß wird ein Gel, bei dem die Beziehung zwischen dem Druckverlust ΔP und der Strömungsgeschwindigkeit in linearer Beziehung bis zu 0,3 kg/cm² besteht, als hartes Gel definiert.
Beispiel 1
Herstellung eines Adsorbens: zu 10 ml CELLULOFINE GC 200-m (Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht für ein globuläres Protein: 120000, Teilchengröße 44 bis 105 μm, hergestellt von der CHISSO CORPORATION) (im folgenden als GC 200-m bezeichnet) als poröses Cellulosegel, wurden 4 g 20 % NaOH, 12 g Heptan und ein Tropfen eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, Tween 20, gefügt. Nach 2stündigem Rühren bei 40°C wurden 5 g Epichlorhydrin zugesetzt und es wurde weitere 2 Stunden bei 40°C gerührt. Anschließend wurde das erhaltene Gel mit Wasser gewaschen und filtriert unter Erzielung eines epoxidierten Cellulosegels. Die Menge an eingeführter Epoxygruppe betrug 30 μmol pro ml des Volumens der Säule. Zu 2 ml des erhaltenen Gels wurden 0,12 g Natriumdextransulfat mit einer begrenzenden Viskositätszahl von 0,027 dl/g und einem Schwefelgehalt von 17,7 % und 2 ml Wasser gefügt (die Konzentration an Natriumdextransulfat war etwa 2,5 %). Das erhaltene Gemisch wurde auf den pH 11 eingestellt und 16 Stunden bei 45°C geschüttelt. Anschließend wurde das Gel abfiltriert und mit einer 2M wässrigen Lösung von Natriumchlorid, einer 0,5M Lösung von Natriumchlorid und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen unter Erzielung eines Cellulosegels an dem Natriumdextransulfat immobilisiert war (im folgenden als G-1 bezeichnet).
Herstellung von Human-IL-8: E. coli-exprimiertes rekombinantes Human-IL-8 (hergestellt von R & D Systems) wurde hergestellt unter Bildung einer vorbestimmten Konzentration unter Verwendung einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) mit einem Gehalt von 0,1 % BSA.
Adsorptionsvorgang: Eine PBS-Lösung, die so hergestellt wurde, dass sie 10 mg GC 200-m oder das vorstehend erhaltene G-1 als Trockengewicht und 5 ng/ml Human-IL-8 enthielt, wurde in ein Polypropylenrohr (hergestellt von Eppendorf) gefüllt und das erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden bei 37°C geschüttelt.
Analysenmethode: Ein Teil der überstehenden Flüssigkeit jeder Probe wurde entnommen und die Konzentration an IL-8 wurde gemessen unter Verwendung eines Meßkits für Human-IL-8, hergestellt von R & D Systems. Das Adsorptionsverhältnis von IL-8 wurde berechnet.
Die Ergebnisse der Analyse sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Beispiel 2
Die Herstellung des Adsorbens G-1 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Die Herstellung von Human-IL-8 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Adsorptionsvorgang: Eine PBS-Lösung, die so hergestellt wurde, dass sie 10 mg GC 200-m oder G-1, hergestellt in gleicher Weise wie in Beispiel 1, als Trockengewicht, 50 % Human-Serum bezogen auf das Endvolumen und 5 mg/ml Human-IL-8 enthielt, wurde in ein Polypropylenrohr (hergestellt von Eppendorf) gefüllt und das erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden bei 37°C geschüttelt.
Analysenmethode: Jede Probe wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Die Ergebnisse der Analyse sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Beispiel 3
Die Herstellung des Adsorbens G-1 erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 1.
Die Herstellung von Human-IL-8 erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 1.
Adsorptionsverfahren: Eine PBS-Lösung wurde so hergestellt, dass sie 10 mg GC 200-m oder G-1 als Trockengewicht, 70 % Human-Serum bezogen auf das Endvolumen und 5 ng/ml Human-IL-8 enthielt, wurde in ein Polypropylenrohr (hergestellt von Eppendorf) gefüllt und das erhaltene Gemisch wurde 2 Stunden bei 37°C geschüttelt.
Analysenmethode: Jede Probe wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Die Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3
Beispiel 4
Die Herstellung des Adsorbens G-1 erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 1.
Die Herstellung von Human-IL-8 erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 1.
Adsorptions- und Gewinnungsverfahren: SEPACOL MINI PP, bei dem es sich um eine kleine Säule aus Polypropylen (hergestellt von der SEIKAGAKU CORPORATION) handelte, wurde mit 500 μl einer PBS-Suspension beschickt, die G-1-Gel (Trockengewicht 30 mg) enthielt und 3 ml einer 5 ng/ml-Lösung von Human-IL-8 mit einem Gehalt von 90 normalem Human-Serum wurde hindurchgeleitet. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf etwa 0,1 ml/min. mittels einer peristaltischen Pumpe gesteuert. Human-IL-8 und der erhaltene Abstrom wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Darüber hinaus wurde IL-8 anschließend freigesetzt und gewonnen mit einer PBS-Lösung, die 0,5 M NaCl enthielt.
Analysenverfahren: Jede Probe wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Das Ergebnis der Analyse des Adsorptionsverhältnisses ist in der Tabelle 4 aufgeführt. Die Wiedergewinnung von Human-IL-8 betrug 98 % (die adsorbierte Menge wurde als 100 % betrachtet).
Tabelle 4
Beispiel 5
Herstellung des Adsorbens: 10 ml GC 200-m wurden entnommen und getrocknet mittels einer Trocknung bei dem kritischen Punkt in Ethanol. Das getrocknete Gel wurde in 10 ml eines ausreichend entwässerten Pyridins suspendiert und mit Eis gekühlt. Hierzu wurden 2 ml Chlorsulfonsäure unter Rühren getropft und es wurde weitere 10 Minuten nach der Zugabe gerührt. Nach der Reaktion wurde das Gel filtriert und mit Pyridin und anschließend Wasser gewaschen unter Erzielung eines Cellulosegels, in das eine Menge an Schwefelsäureestergruppen von 0,05 mmol/ml pro Volumeneinheit (1 ml) eingeführt war (im folgenden als G-2 bezeichnet).
Die Herstellung von Human-IL-8 erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 1.
Die Adsorption und die Gewinnung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 4.
Analysenmethode: Jede Probe wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gemessen.
Das Ergebnis der Analyse des Adsorptionsverhältnisses ist in der Tabelle 5 aufgeführt. Die Ausbeute an Human-IL-8 betrug 98 % (die adsorbierte Menge wurde als 100 % betrachtet).
Tabelle 5
Beispiel 6
Herstellung des Adsorbens: 100 ml Celluloseperlen CK-A3 (hergestellt von der CHISSO CORPORATION, Ausschlussgrenze für das Molekulargewicht für ein globuläres Protein: 5 × 10⁶, Teilchengröße 45 bis 105), 100 ml Wasser, 50 ml 2M Natriumhydroxid und 20 ml Epichlorhydrin wurden in einem Reaktionsgefäß vermischt und 2 Stunden bei 40°C umgesetzt unter Erzielung von epoxidierten Celluloseperlen CK-A3. In einem Reaktionsgefäß wurden 100 ml der erhaltenen epoxidierten Celluloseperlen CK-A3, 100 ml Wasser und 10 ml 28 % Ammoniakwasser vermischt und über Nacht bei Raumtemperatur umgesetzt unter Erzielung von aminierten Celluloseperlen CK-A3. Andererseits wurden 10 g Poly(natriumstyrolsulfonat), 1 ml Thionylchlorid und 250 ml Toluol in einem Reaktionsgefäß vermischt und 8 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt unter Bildung von partiell chloriertem Poly(natriumstyrolsulfonat). In einem Reaktionsgefäß wurden 10 g des erhaltenen chlorierten Poly(natriumstyrolsulfonats), 100 ml der aminierten Celluloseperlen CK-A3 und 100 ml Wasser vermischt und über Nacht umgesetzt unter Erzielung von Poly(styrolsulfonsäure)-immobilisierten Celluloseperlen CK-A3.
Bewertung des Adsorbens: die erhaltenen Poly(styrolsulfonsäure)-immobilisierten Celluloseperlen CK-A3 wurden mit physiologischer Salzlösung equilibriert, Die Perlen (0,5 ml) wurden in ein Testrohr eingeführt und überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. Hierzu wurden 3 ml Human-Serum mit einem Gehalt von etwa 1,3 ng/ml an IL-1β oder etwa 750 pg/ml an IL-2 gefügt und 2 Stunden bei 37°C geschüttelt. Die Konzentration an IL-1β oder IL-2 in der überstehenden Flüssigkeit wurden nach der ELISA-Methode gemessen.
Die Analysenergebnisse sind in der Tabelle 6 aufgeführt.
Beispiel 7
Herstellung des Adsorbens: Zu 100 ml epoxidierten Celluloseperlen CK-A3, erhalten in gleicher Weise wie im Beispiel 6, wurden 6 g Natriumdextransulfat mit einer limitierenden Viskositätszahl von 0,27 dl/g und einem Schwefelgehalt von 17,7 % und 100 ml Wasser gefügt (die Konzentration des Natriumdextransulfats betrug etwa 2,5 %) und es wurde auf den pH 11 eingestellt und 16 Stunden bei 45°C geschüttelt. Anschließend wurde das erhaltene Gel abfiltriert und mit Wasser gewaschen unter Erzielung von Natriumdextransulfat-immobilisierten Celluloseperlen CK-A3.
Die Bewertung des Adsorbens wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 6 bezogen auf die Natriumdextransulfat-immobilisierten Celluloseperlen CK-A3 vorgenommen.
Die Ergebnisse der Analyse sind in der Tabelle 6 dargestellt.
Vergleichsversuch 1
Bezüglich der Celluloseperlen CK-A3, die im Beispiel 6 verwendet wurden, erfolgte die Bewertung der vorstehend genannten Perlen in gleicher Weise wie in Beispiel 6.
Die Analysenergebnisse sind in der Tabelle 6 aufgeführt. Tabelle 6
Es zeigte sich, dass im Gegensatz zum Vergleichsversuch 1 jeweils die Konzentration an IL-1β und IL-2 in der überstehenden Flüssigkeit im Bezugsbeispiel 2 und im Beispiel 6 verringert wurden und IL-1β und IL-2 in einer Körperflüssigkeit wirksam adsorbiert und unter Verwendung des erfindungsgemäßen Adsorbens entfernt werden können.
Beispiel 8
Herstellung des Adsorbens: In gleicher Weise wie im Beispiel 6 wurde ein Poly(styrolsulfonsäure)-immobilisiertes Cellulose CK-A3 hergestellt.
Bewertung des Adsorbens: Die erhaltenen Poly(styrolsulfonsäure)-immobilisierten Celluloseperlen CK-A3 wurden mit physiologischer Salzlösung equilibriert. Die Perlen (0,5 ml) wurden in ein Testrohr eingebracht und überschüssige physiologische Salzlösung wurde entfernt. Hierzu wurden 3 ml Human-Serum mit einem Gehalt von etwa 420 pg/ml an IL-6 gefügt und es wurde 2 Stunden bei 37°C geschüttelt. Die Konzentration an IL-6 in der überstehenden Flüssigkeit wurde nach der ELISA-Methode gemessen.
Die Ergebnisse der Analyse sind in der Tabelle 7 aufgeführt.
Beispiel 9
Herstellung des Adsorbens: In gleicher Weise wie im Beispiel 7 wurden Natriumdextransulfat-immobilisierte Celluloseperlen CK-A3 hergestellt.
Die Bewertung des Adsorbens wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 8, bezogen auf Natriumdextransulfat-immobilisierte Celluloseperlen CK-A3, durchgeführt.
Die Analysenergebnisse sind in der Tabelle 7 zusammengestellt.
Vergleichsversuch 2
Im Hinblick auf die im Beispiel 6 verwendeten Celluloseperlen CK-A3 erfolgte die Bewertung der vorstehend genannten Perlen in gleicher Weise wie im Beispiel 8.
Die Analysenergebnisse sind in der Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7
Es wurde gefunden, dass im Gegensatz zum Vergleichsversuch 2 jegliche Konzentration an IL-6 in der überstehenden Flüssigkeit in den Beispielen 8 und 9 verringert wird und IL-6 aus einer Körperflüssigkeit wirksam adsorbiert und entfernt werden kann, wenn das erfindungsgemäße Adsorbens verwendet wird.
Industrielle Anwendbarkeit
Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können IL-8, IL-1β, IL-6 und/oder IL-2, bei denen es sich um pathogene Substanzen handelt, aus einer Körperflüssigkeit eines Patienten, wie Blut, Plasma oder Serum wirksam adsorbiert und entfernt und, falls gewünscht, wiedergewonnen werden.

Claims

Verwendung eines Adsorbens, das einen in Wasser unlöslichen porösen Cellulosegel-Träger mit einer anionischen funktionellen Gruppe enthält, zur Adsorption von mindestens einem Interleukin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus von Interleukin-8, Interleukin-1β, Interleukin-6 und Interleukin-2 aus einer Körperflüssigkeit, ausgewählt aus der Gruppe von Blut, Plasma, Serum, Aszites und Gewebeflüssigkeit, worin die anionische funktionelle Gruppe mindestens ein Vertreter, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Sulfonsäuregruppe, einer Carboxylgruppe und einer Phosphorsäureestergruppe, ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die anionische funktionelle Gruppe von Poly(styrolsulfonsäure) abgeleitet ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die anionische funktionelle Gruppe eine polyanionische funktionelle Gruppe mit mehreren anionischen funktionellen Gruppen innerhalb dieser funktionellen Gruppe ist.
Verfahren zur Adsorption und Entfernung von mindestens einem Interleukin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin-8, Interleukin-1β, Interleukin-6 und Interleukin-2, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorbens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in Kontakt gebracht wird mit einer Körperflüssigkeit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Aszites und Gewebeflüssigkeit.
Verfahren zur Zurückgewinnung von mindestens einem Interleukin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin-8, Interleukin-1β, Interleukin-6 und Interleukin-2, das eine Stufe zur Adsorption eines Interleukins durch Inkontaktbringen eines in Wasser unlöslichen porösen Cellulosegel-Trägers, der eine anionische funktionelle Gruppe aufweist mit einer Körperflüssigkeit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Aszites und Gewebeflüßssigkeit, sowie eine Stufe zum Eluieren des adsorbierten Interleukins, wobei die anionische funktionelle Gruppe mindestens ein Vertreter, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Sulfonsäuregruppe, einer Carboxylgruppe und einer Phosphorsäureestergruppe, ist, umfasst.
Verwendung eines Adsorbers, der ein Gefäß mit einem Einlass und einem Auslass für eine Flüssigkeit und ein Adsorbens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, beschickt in das Gefäß, enthält, wobei das Gefäß mit Einrichtungen ausgerüstet ist, die das Adsorbens daran hindern aus dem Gefäß auszufließen, zur Adsorption von mindestens einem Interleukin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Interleukin-8, Interleukin-1β, Interleukin-6 und Interleukin-2, aus einer Körperflüssigkeit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Aszites und Gewebeflüssigkeit.