DE69535061T2

DE69535061T2 - Virale nukleotidsequenz vr-2332 und nutzungsverfahren

Info

Publication number: DE69535061T2
Application number: DE69535061T
Authority: DE
Inventors: P. Michael Roseville MURTAUGH; R. Margaret Minneapolis ELAM; T. Laura Hopkins KAKACH
Original assignee: University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Current assignee: University of Minnesota Twin Cities; University of Minnesota System
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-08-04
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2015-08-05
Also published as: ES2262142T3; DK0783321T3; JPH10504191A; ATE329616T1; CA2196555A1; PT783321E; JP3748887B2; CA2196555C; EP0783321A1; EP0783321B1; WO1996004010A1; MX9700817A; DE69535061D1; US5998601A; EP0783321A4; EP1704869A1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Molekulargenetik und insbesondere die Verwendung von künstlichen Nucleotiden zur Diagnose von Tierkrankheiten oder zum Impfen von Tieren gegen Krankheiten. Genauer stammen die bevorzugten Nucleotide von einem immunologisch unterscheidbaren Stamm des Reproduktions- und Atemwegssyndromvirus der Schweine ("PRRS"-Virus) und steuern gezielt dieses Virus bei der Anwendung der Impfung oder der diagnostischen Techniken an.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Eine neue Virenkrankheit bei Schweinen wurde 1987 in Nordamerika entdeckt und es wurde darüber von Hill, Overview and History of Mystery Swine Disease (Swine Infertility and Respiratory syndrome) in Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 6. Oktober, Denver, CO, vom Livestock Conservation Institute of Madison, Wisconsin, Seiten 29–30 (1990)) berichtet. Eine Krankheit mit im Wesentlichen den identischen klinischen Zeichen wurde in Europa 1990 gefunden, wie von Paton et al., Blue ear disease of pigs, 128 Vet Rec. 617 (1991) berichtet. Die klinisch beobachtete Krankheit ist allgemein unter verschiedenen Namen bekannt, einschließlich Reproduktions- und Atemwegssyndrom bei Schweinen ("PRRS"), Schweineunfruchtbarkeits- und Atemwegssyndrom ("SIRS"), seuchenhaftes Abort- und Atemwegssyndrom bei Schweinen ("PEARS") und mysteriöse Schweinekrankheit; hier soll der Ausdruck PRRS all diese Namen beinhalten.
Die Folgen dieser Krankheit schlossen Spätabort und Totgeburten bei Säuen ebenso wie Atemwegsinsuffizienzen bei säugenden Ferkeln ein, die sich schlecht entwickelten und schnell starben. Es wurde beobachtet, dass sich die Konzeptionsraten bei Säuen und die Größe der Würfe verringerten. Schätzungen gaben an, dass etwa 10 bis 15% der Schweineproduktion jährlich aufgrund des reproduktiven Versagens verloren gingen. Frühe klinische Zeichen der Krankheit schlossen Anorexie und eine milde Pyrexie ein. Andere Zeichen schlossen bläuliche Verfärbungen auf der Haut von erkrankten Herdentieren ein, wobei die Verfärbungen hauptsächlich an den Ohren, Zitzen, der Schnauze und den vorderen Teilen von Hals und Schultern auftraten. Nekropsieergebnisse zeigten verdickte Alveolarsepten, die durch die Gegenwart von Makrophagen, degenerierenden Zellen und Zellbruchstücken in Alveolarräumen verursacht wurden. Diese Anomalitäten deuteten auf die Gegenwart von PRRS-Virus hin.
Das verursachende virale Agens wurde in einem kleinen, umhüllten positiv-RNA-strängigen Virus vermutet, das hauptsächlich aus Alveolarmakrophagen von infizierten Schweinen gewonnen wurde, wie von Benfield et al. in Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332), 4 J. Vet. Diagn. Invest. 127–133 (1992) und Wensvoort et al., Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad, 33 Vet. Micro. 185–193 (1992) berichtet. Die Isolierungstechnik für den Lelystad-("LV")-Virus schloss die Homogenisierung von infi ziertem Schweinelungengewebe; das Vermischen des Homogenisats mit einer physiologischen Kochsalzlösung, z.B. Ringer-Lösung, Hank's ausgeglichener Salzlösung und Minimalessentialinedium ("MEM"), mit 10% Gewicht/Volumen des Homogenisats und Filtrieren der Mischung durch eine Reihe von Filtern mit 0,45, 0,2 und 0,1 μm ein.
Das LV-Virus schien eng verwandt zu sein mit Arteriviren in Bezug auf Morphologie, Genomorganisation, Transkriptionsregulierung und Makrophagenspezitität, gemäß Plagemann et al., Lactate dehydrogenaseelevating virus, equine arteritis virus and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive-strand RNA viruses, 41 Adv. Vir. Res. 99–192 (1992).
Die vollständige Nucleotidsequenz des LV-Stamms des PRRS-Virus wurde von Meulenberg et al. identifiziert, Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV, 192 Virology 62–72 (1993). Eine Teil-LV-Sequenz wurde auch von Conzelmann et al., Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group, 193 Virology 193, 329–339, identifiziert. Das Genom des positiven Strangs des LV-Virus (Sequenz-ID-Nr. 14 bis 26) schloss acht offene Leserahmen ("ORFs") ein, die eine gewisse Ähnlichkeit im Vergleich zu den Genen von Coronaviren und Arteriviren hatten. Zwei offene Leserahmen codierten wahrscheinlich für die virale RNA-Polymerase. LV-ORFs 2 bis 6 schienen für Strukturproteine zu codieren, die mit viralen Membranen assoziiert waren, und es wurde angenommen, dass LV-ORF 7 ein Nucleocapsid codierte.
Die viralen Proteine von LV wurden von einem ineinander gesetzten Satz von RNA-Transkripten exprimiert, die überlappende 3'-Enden hatten. Obwohl diese Expressionsstrategie mit der Coronavirusfamilie geteilt wird, brachten die physikalischen Eigenschaften den LV-Virus ursprünglich in die Togavirusfamilie. Plagemann et al. (siehe oben) schlug eine neue Familie vor, die Arteriviridae, um Viren mit diesen Doppeleigenschaften einzuschließen. Diese Familie schloss den PRSS-Virus, Pferdearteritisvirus ("EAV"), Lactatdehydrogenase erhöhenden Virus ("LDV") und den hämorrhagisches Fieber bei Affen verursachenden Virus ("SHFV") ein.
Ein zweiter Stamm ("VR-2332") des PRRS-Virus wurde als vierte Zellkulturpassage isoliert, wie von Benfield et al. in Characterization of swine infertility and respiratory snydrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332), 4 J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127–133 (1992) berichtet. Nichstdestotrotz wurde das virale Genom nicht sequenziert. Das VR-2332-Isolat wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt und hat nun die ATCC-Katalognummer VR-2332. Der VR-2332-Virus werde als kugelförmig charakterisiert mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 62 nm und einem Kern von 25 bis 30 nm, der von einer Hülle umgeben ist. Virenteilchen hatten eine Schwebedichte von 1,18 bis 1,19 g/ml in Cäsiumchlorid und wurden aus filtrierten Gewebehomogenisaten durch Zentrifugation auf Cäsiumchloridgradienten weiter gereinigt.
Die jeweiligen VR-2332- und LV-Virusisolate zeigten starke Unterschiede in Bezug auf die antigenische Variation, insbesondere im Hinblick auf ihre gemeinsame Morphologie und die gleichen klinischen Zeichen bei Schweinen. Eine Vergleichsuntersuchung zwischen 24 Feldseren und 7 Virenisolaten aus Europa und Nordamerika konnte kein einziges gemeinsames Antigen unterscheiden, das eine Infektion in zuverlässiger Weise für beide Viren diagnostizieren konnte, wie von Wensvoort et al. in Antigenic comparison of Lelystad virus and swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus, 4 J. Vet. Diagn. Invest. 134–138 (1992) berichtet. Trotz der strukturellen und symptomologischen Ähnlichkeiten zwischen den zwei Virusstämmen ist es daher unwahr scheinlich, dass ein einziger Impfstoff aus einem Stamm des Virus entwickelt werden könnte, um Schweine gegen beide Stämme zu immunisieren.
WO 93/03760 beschreibt einen Impfstoff und Seren zur Behandlung der Mysteriösen Schweinekrankheit. Suarez et al. (1994) Arch. Virol. 135:89–99 beschreiben Untersuchungen zum Nachweis des PRRS-Virus durch RT-PCR. Meng et al. (1994), Journal of General Virology 75:1795–1801 beschreiben Untersuchungen zur molekularen Klonierung und Nucleotidsequenzierung der 3'-terminalen genomischen RNA des PRRS-Virus.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme, die oben ausgeführt wurden, indem künstliche Nucleotidsequenzen für den immunologisch unterscheidbaren VR-2332-Stamm des PRRS-Virus, ebenso wie Impfstoffe, die von diesen Nucleotiden abgeleitet sind und entsprechende Methoden zur Impfung bereitgestellt werden.
Allgemein gesagt, schließt die vorliegende Erfindung Materialien und Methoden ein, die von der VR-2332-Form des PRRS-Pathogens abgeleitet sind. Die Materialien schließen bevorzugt auf VR-2332-Virus basierende Nucleinsäuren und Proteine mit solchen Längen ein, die ausreichen, um sie einzigartig im Vergleich zu der LV-Form des PRRS-Pathogens zu machen. Die Methoden beinhalten die Verwendung dieser Materialien in diagnostischen Tests und Impfverfahren.
Ein besonders bevorzugtes Material der vorliegenden Erfindung schließt cDNA-Sequenzen ein, wie in den Ansprüchen definiert. Diese Sequenzen sind einzigartig im Hinblick auf das LV-Virusgenom und codieren bevorzugt die Expression eines Polypeptids, das eine anti-VR-2332-PRRS-Immunantwort bei Schweinen induzieren kann. Trotz der Ähnlichkeit der klinischen Zeichen von PRRS und der viralen Morphologie zwischen VR-2332 und LV-Viren, können auf VR-2332 basierende Oligonucleotide als Primer der Polymerasekettenreaktion ("PCR") für die selektive Amplifikation von VR-2332-cDNA verwendet werden. Diese Sequenzen schließen auch inverse komplementäre Oligonucleotidsequenzen ein, die aus dem VR-2332-Genom stammen. Diese Oligonucleotidsequenzen können auch als Sonden in Hybridisierungsuntersuchungen verwendet werden, um Wildtyp-VR-2332-cDNA selektiv zu identifizieren.
Teile der VR-2332-Nucleotidsequenz können mit einem chimären Vektor rekombiniert werden, um das Insert mit der VR-2332-codierenden Region unter die Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz und einer Terminationssequenz zu bringen. Dieser Vektor kann für die Expression eines Proteins, das von dem Insert codiert wird, in einem Wirt verwendet werden. Die Expression in dem Wirt kann entweder in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen erreicht werden. Diese Vektoren können als rekombinante Plasmide konstruiert werden und direkt in das Schwein injiziert werden, um eine Immunantwort zu induzieren, da der Schweinewirt virale Proteine erzeugt. Alternativ können die viralen Proteine in Zellkulturen erzeugt werden und in Schweine zu Immunisierungszwecken injiziert werden.
Diese Nucleotidsequenzen können auch in diagnostischen PCR-Tests verwendet werden unter Verwendung von Primern, die selektiv entweder auf VR-2332 basierende cDNA oder auf LV basierende cDNA amplifizieren. Alternativ können diese Primersequenzen in Hybridisierungsreaktionen verwendet werden, die auf die Gegenwart eines speziellen PRRS verursachenden Virus hinweisen.
Andere Aufgaben, Vorteile und herausragende Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung, die, wenn sie in Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet wird, eine Anzahl von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung offenbart.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Positionsorganisation von VR-2332-ORFs 2 bis 7 unter Bezugnahme auf schattierte Bereiche, die den cDNA-Fragmenten aus verschiedenen Klonen entsprechen, die verwendet wurden, um die Nucleotidsequenz des VR-2332-Stamms des PRRS-Virus zu bestimmen, was SEQ ID Nr. 1 lieferte.
2 zeigt die Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von VR-2332-ORFs 2 bis 7, die den SEQ ID Nr. 1 bis 13 entsprechen;
3A zeigt einen Vergleich zwischen den jeweiligen Aminosäure-Alignments von ORF 7 für VR-2332 und LV-Virus gemäß dem Einzelbuchstabenaminosäurecode von IUPAC, wobei identische Reste durch große Buchstaben dargestellt sind und unterschiedliche Reste durch kleinere Buchstaben gezeigt sind, und wobei die Code-Sequenzen im vollen Dreibuchstabenaminosäurecode für diese Reste in SEQ ID Nr. 13 (VR-2332) und SEQ ID Nr. 26 (LV-Virus) bereitgestellt werden;
3B zeigt ein Hydropathieprofil für VR-2332-ORF 7, wobei die Ordinate den Hydrophobizitätswert zeigt und die Abszisse die Anzahl der Reste zeigt;
3C zeigt ein Hydropathieprofil für LV-Virus-ORF 7, das im Wesentlichen dem von 3B entspricht;
4A zeigt einen Vergleich zwischen den jeweiligen Aminosäure-Alignments von ORF 6 für VR-2332 und LV-Virus gemäß dem Einzelbuchstabenaminosäurecode von IUPAC, wobei identische Reste durch große Buchstaben dargestellt sind und unterschiedliche Reste durch kleinere Buchstaben dargestellt sind, und wobei die Sequenzen für diese Reste im vollständigen Dreibuchstabenaminosäurecode in SEQ ID Nr. 11 (VR-2332) und SEQ ID Nr. 24 (LV-Virus) angegeben sind;
4B zeigt ein Hydropathieprofil für VR-2332-ORF 6, wobei die Ordinate den Hydrophobizitätswert zeigt und die Abszisse die Anzahl der Reste zeigt;
4C zeigt ein Hydropathieprofil für LV-Virus-ORF 6, das im Wesentlichen dem von 4B entspricht;
5A zeigt einen Vergleich zwischen den jeweiligen Aminosäure-Alignments von ORF 5 für VR-2332 und LV-Virus gemäß dem Einzelbuchstabenaminosäurecode von IUPAC, wobei identische Reste durch Großbuchstaben dargestellt sind und unterschiedliche Reste durch kleinere Buchstaben dargestellt sind, und wobei Sequenzen mit dem vollständigen Dreibuchstabenaminosäurecode für diese Reste in SEQ ID Nr. 9 (VR-2332) und SEQ ID Nr. 22 (LV-Virus) angegeben sind;
5B zeigt ein Hydropathieprofil für VR-2332-ORF 5, wobei die Ordinate den Hydrophobizitätswert zeigt und die Abszisse die Anzahl der Reste zeigt;
5C ein Hydropathieprofil für LV-Virus-ORF 5, das im Wesentlichen dem von 5B entspricht;
6A zeigt einen Vergleich zwischen den jeweiligen Aminosäure-Alignments von ORF 4 für VR-2332 und LV-Virus gemäß dem Einzelbuchstabenaminosäurecode von IUPAC, wobei identische Reste durch Groß buchstaben dargestellt sind und unterschiedliche Reste durch kleinere Buchstaben dargestellt sind, und wobei die Sequenzen mit dem vollständigen Dreibuchstabenaminosäurecode für diese Reste in SEQ ID Nr. 7 (VR-2332) und SEQ ID Nr. 20 (LV-Virus) angegeben sind;
6B zeigt ein Hydropathieprofil für LV-Virus-ORF 4, worin die Ordinate den Hydrophobizitätswert zeigt und die Abszisse die Anzahl der Reste zeigt;
6C zeigt ein Hydropathieprofil für LV-Virus-ORF 4, das im Wesentlichen dem von 6B entspricht;
7A zeigt einen Vergleich zwischen den jeweiligen Aminosäure-Alignments von ORF 3 für VR-2332 und LV-Virus gemäß dem Einzelbuchstabenaminosäurecode von IUPAC, wobei identische Reste durch Großbuchstaben dargestellt sind und unterschiedliche Reste durch kleinere Buchstaben dargestellt sind und wobei die Sequenzen mit dem vollständigen Dreibuchstabenaminosäurecode für diese Reste in SEQ ID Nr. 5 (VR-2332) und SEQ ID Nr. 18 (LV-Virus) angegeben sind;
7B zeigt ein Hydropathieprofil für VR-2332-ORF 3, wobei die Ordinate den Hydrophobizitätswert zeigt und die Abszisse die Anzahl der Reste zeigt;
7C zeigt ein Hydropathieprofil für LV-Virus-ORF 3, das im Wesentlichen dem von 7B entspricht;
8A zeigt einen Vergleich zwischen den jeweiligen Aminosäure-Alignments von ORF 2 für VR-2332 und LV-Virus gemäß dem Einzelbuchstabenaminosäurecode von IUPAC, wobei identische Reste durch Großbuchstaben dargestellt sind und unterschiedliche Reste durch kleinere Buchstaben dargestellt sind, und wobei die Sequenzen mit dem vollständigen Dreibuchstabenaminosäurecode für diese Reste in SEQ ID Nr. 3 (VR-2332) und SEQ ID Nr. 16 (LV-Virus) angegeben sind;
8B zeigt ein Hydropathieprofil für VR-2332-ORF 2, wobei die Ordinate den Hydrophobizitätswert zeigt und die Abszisse die Anzahl der Reste zeigt;
8C zeigt ein Hydropathieprofil für LV-Virus-ORF 2, das im Wesentlichen dem von 8B entspricht; und
9 zeigt einen Vergleich zwischen den jeweiligen 3'-untranslatierten Regionen von VR-2332 und LV-Virus.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Die folgenden nicht beschränkenden Beispiele geben bevorzugte Methoden und Materialien zur Durchführung der vorliegenden Erfindung an.
Beispiel 1
Wachstum des VR-2332-Virus
Eine viral reine MA-104-Zelllinienkultur des ATCC-VR-2332-Virus wurde dankenswerterweise von Boehringer Ingelheim in Ridgefield, Connecticut erhalten zur Verwendung als Vireninoculum.
Eine Kultur wurde hergestellt, um VR-2332-Inoculum zu vermehren. Der VR-2332-Virus wurde in Zellen aus einer Affennierenzelllinie gezüchtet gemäß den Methoden, die von Gravell et al. in 181 Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 112–119, ausgeführt sind. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann alternativ auf eine Zelllinie wie die 2621-, MA-104- oder USU-104-Zelllinie zurückgreifen. Nicht infizierte Zellen wurden in 50 ml Eagle's MEM-Medium (erworben von Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) gezüchtet, das mit 10% fötalem Kälberserum und 50 μg/ml Gentamicin von Sigma Chemical Co. aus St. Louis, MO, ergänzt war. Die Zellen wurden von der Kolbenoberfläche mit Trypsin-Versene verdrängt, zentrifugiert, um die Zellen zur Abtrennung von dem Trypsin-Versene-Überstand zu pelletisieren, und 1:4 zur Subkultivierung aufgeteilt. Die Zellen wurden in einer 5% angefeuchteten CO₂-Atmosphäre bei 37°C in 75 cm²-Kunststoffgewebekulturkolben gehalten mit einer Medienpassage in Intervallen von 5 bis 7 Tagen.
Die vier 50-ml-Zellkulturen wurden jeweils infiziert, indem das Wachstumsmedium dekantiert wurde und das VR-2332-Inoculum in 1 ml Wachstumsmedium mit einem Titer von ungefähr 10⁵ bis 10⁶ gewebekulturinfektiösen Dosen (TCID₅₀) zugefügt wurde. Die entstehende Mischung wurde 30 Minuten inkubiert, wonach 30 ml frisches MEM-Medium, das 4% fötales Kälberserum enthielt, zugegeben wurden. Die infizierten Zellen wurden unter CO₂, wie oben beschrieben, 24 bis 48 Stunden lang inkubiert und geerntet, indem die Medien dekantiert wurden, was die Zellen, die an den Kolbenwänden hafteten, zurückließ.
Beispiel 2
Konstruktion einer cDNA-Bibliothek
Die geernteten Zellen aus Beispiel 1 wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und durch Zugabe von 5 M Guanidinisothiocyanat lysiert. Die gesamte zelluläre RNA wurde extrahiert gemäß den Protokollen, die von Chomczynski et al. in Single-step method of RNA Isolation by acid guanidinium thiocyanatephenol-chloroform extraktion, 162 Anal. Biochem. 156–159 (1987) beschrieben werden. Poly-A-haltige RNA wurde durch Oligo-dT-Säulenchromatographie selektiert unter Verwendung einer üblichen Ausstattung und von Verfahren von Gibco BRL Gaithersburg, MD.
Eine cDNA-Bibliothek wurde in dem unidirektionalen Lambdaphagenvektor, UniZap^TMXR, unter Verwendung des Gigapack^®-li-Gold-Verpackungsextrakts und von E.-coli-SURE^TM-Zellen konstruiert, nach den Anweisungen des Kitherstellers (Stratagene, La Jolla, CA). Dieses Verfahren ist unten unter Bezugnahme auf Materialien, die in dem kommerziell erhältlichen Kit bereitgestellt werden, zusammengefasst.
Die mit Poly-A selektierte RNA, die aus 2 ml Zelllysat erhalten wurde, wurde revers transkribiert mit der reversen Transkriptase aus Moloney-Mausleukämievirus und einem synthetischen Oligo-dT-Primer mit 50 Basen, der eine Sequenz aufwies mit einer Xho-I-Restriktionsstelle wie folgt:
5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
Der Ansatz zur Synthese des ersten Strangs enthielt auch 5-Methyl-dCTP. Die Synthese des zweiten Strangs wurde erreicht, indem DNA-Polymerase I und Standard-dCTP anstelle von 5-Methyl-dCTP verwendet wurden. Die Enden der doppelsträngigen cDNA wurden mit T4-DNA-Polymerase geglättet und EcoRI-Adaptoren wurden mit T4-DNA-Ligase zugefügt. Die Adaptoren hatten die folgenden synthetischen Nucleotidsequenzen:
5'-AATTCGGCACGAG-3'
3'-GCCGTGCTC-5'
Die entstehende cDNA wurde mit Polynucleotidkinase versetzt, um die 5'-Enden zu phosphorylieren, vollständig mit Xho I verdaut und auf einer Sephacryl-S-400-Säule gereinigt.
Die cDNA wurde mit den Uni-ZAP^TM-XR-Vektorarmen mit DNA-Ligase ligiert und in dem hoch effizienten Verpackungsextrakt Gigapack^® II Gold verpackt. Das entstehende verpackte infektiöse Phagenpräparat wurde auf der E.-coli-Zelllinie SURE^TM plattiert.
Beispiel 3
Screening der cDNA-Bibliothek mit PCR
Viele erfolglose Versuche wurden unternommen, um die cDNA-Bibliothek von Beispiel 2 zu screenen, um VR-2332-positive Plaques mit Polymerasekettenreaktion zu identifizieren unter Verwendung von PCR-Primersequenzen, die aus dem angegebenen LV-Virus stammten. Synthetische DNA-Fragmente oder Primer wurden erzeugt und mit ³²P als Indikator gemäß üblichen Protokollen markiert. Diese Oligonucleotidprimer replizierten Teile der LV-Virus-ORFs 2, 6 und 7, wie von Meulenberg et al., Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV, 192 Virology 62–72 (1993), berichtet. Unter einer Vielzahl von Bedingungen wurden keine mit PCR amplifizierte Nucleotidprodukte erhalten.
Das beobachtete vollständige Versagen der PCR-Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen aus VR-2332 zeigte, dass die zwei Viren (LV und VR-2332) erhebliche Nucleotidsequenzunterschiede aufweisen, die ausreichend sind, um eine spezifische PCR-Amplifikation von VR-2332-cDNA unter Verwendung von von LV abgeleiteten Primern zu verhindern. Daher wurde eine alternative Klonierungsstrategie entwickelt unter Verwendung von LV-Sequenzen zur Hybridisierung, nicht aber zur PCR, um die Nucleotidsequenz zu bestimmen, die den Strukturgenen des VR-2332-Stamms des PRRS-Virus entsprach.
Beispiel 4
Screening der cDNA-Bibliothek mit Plaquehybridisierung
Ein mit PCR erzeugtes Nucleotidfragment, das cDNA aus LV-ORF 7 (SEQ ID Nr. 26 des LV-Virus) replizierte, wurde mit ³²P markiert und verwendet, um Northern Blots zu sondieren, die erhalten wurden unter Verwendung von MA-104-Zellen, die mit dem VR-2332-Virus infiziert waren. Radiographische Banden wurden für infizierte Zellen erhalten, nicht aber für nicht infizierte Zellen. Diese Banden zeigten, dass LV und VR-2332 gleiche Sequenzen haben, die hybridisieren konnten, obwohl das PCR-Screening in Beispiel 3 versagte.
Mehrere Agarplatten mit 15 cm, die insgesamt etwa 50.000 Plaques enthielten, wurden gescreent von doppelten Stempeln auf NitroPlus-Nitrocellulosemembranen (Micron Separations Inc., Westboro, MA). Positive Plaques, die mit der entsprechenden LV-Virussonde hybridisierten, wurden durch die entsprechenden radiographischen Banden identifiziert, was durch Belichtung eines Röntgenfilms bestimmt wurde. Diese positiven Plaques wurden wieder plattiert und wieder zur Bestätigung gescreent. Der bei der Hybridisierung positive rekombinante Uni-ZAP^TM-XR-Phage wurde einer in-vivo-Exzision unterzogen, wie im Handbuch von Stratagene beschrieben, um Plasmid-DNA für die Sequenzanalyse zu erhalten. Eine Zusammenfassung des Stratagene-Verfahrens ist unten angegeben.
Der rekombinante Phage wurde mit E.-coli-XL1-Blue-Zellen ebenso wie mit ExAssist-Helper-Phage bei 37°C 15 Minuten lang vereinigt und danach in gehaltvollen Medien 2 bis 3 Stunden lang unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Die Kultur wurde 20 Minuten lang auf 70°C erwärmt und durch Zentrifugation geklärt. Der Überstand, der gerettetes Phagemid enthielt, wurde SOLR-Zellen zugefügt und auf ampicillinhaltigen Agarplatten plattiert. Diese Bakterienkolonien enthielten rekombinante Plasmide.
Die entstehenden Klone wurden in Flüssigkultur amplifiziert. Die DNA wurde extrahiert und weiter durch EcoRI- und XhoI-Restriktionsendonucleaseverdau (10 × Überschuss) analysiert. Die Größen der VR-2332-spezifischen Inserts wurden durch Elektrophorese in Agarosegelen mit Molekulargewichtsstandards abgeschätzt. Als nächstes wurde die Nucleotidsequenz von 23 Klonen am 3'-Ende bestimmt durch Didesoxynucleotidsequenzierung unter Verwendung von Sequenase, ³⁵S-dATP und synthetischen M13-20-Primern von Stratagene:
5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.
Die Sequenzierungsprodukte wurden auf 6% denaturierenden Polyacrylamidgelen analysiert. 20 von 23 Klonen hatten identische 3'-Sequenzen, was darauf hindeutet, dass diese Klone co-terminal ineinander gesetzt waren. Sechs dieser 20 Klone mit verschiedenen Größen, die alle ein identisches 3'-Ende enthielten, wurden für die weitere DNA-Sequenzierung ausgewählt.
Beispiel 5
VR-2332-Sequenzanalyse
Nucleotidsequenzdaten wurden für jeden der sechs ausgewählten Klone von Beispiel 4 erhalten durch manuelle Didesoxynucleotidsequenzierung mit Sequenase (US Biochemicals, Cleveland, OH) und automatisierte Fluoreszenzsequenzierung (Applied Biosystems, Foster City, CA).
1 stellt schematisch die nativen Positionen der sechs Klone dar, d.h. die mit 761, 712, 431, 412, 513 und 416 bezeichneten, die für die weitere Sequenzanalyse ausgewählt wurden. Die Fragmentlängenskala geht von 0 bis etwa 3,5 kb mit einer Positionsreferenz auf SEQ ID Nr. 1. Die Klone 431, 412, 513 und 416 wurden von ihren 5'-Enden sequenziert, um mit der Sequenz, die von dem nächstkleineren Klon erzeugt wurde, zu überlappen. Der Spalt zwischen dem 5'-Ende von Klon 416 und dem Beginn von ORF 2, der aus beiden Klonen 712 und 761 sequenziert wurde, wurde von beiden Enden sequenziert, indem VR-2332-spezifische Primer synthetisiert wurden. Eine zusätzliche Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Sequenz auf dem Gegenstrang zu bestätigen. Diese Strategie erzeugte eine Sequenz mit 3358 Nucleotiden, d.h. SEQ ID Nr. 1, auf beiden Strängen aus einer Kombination von sechs unabhängigen Klonen. 2 zeigt diese Gesamtsequenz zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuretranslation.
Zahlreiche Unterschiede zwischen LV- und VR-2332-Viren traten über die 3'-genomischen Sequenzen auf, die die ORFs 2 bis 7 ebenso wie die 3'-untranslatierte Region codierten. Diese Unterschiede beruhten auf Nucleotidsubstitutionen, Basendeletionen und Basenzufügungen. Die Sequenzdivergenz entstand wahrscheinlich durch fehlerhafte Replikation und deutet darauf hin, dass die virale Replikase eine schlechte Zuverlässigkeit hat und der DNA-Reparatur-Mechanismus fehlt.
Beispiel 6
Vergleich der Aminosäuresequenz und immunologische Kreuzreaktivität
Eine Anfangsuntersuchung deutete darauf hin, dass die aus diesen sechs VR-2332-ORFs abgeleiteten Proteine grob den bekannten ORFs 2 bis 7 in jedem der Viren LV, LDV und EAV entsprachen. Eine detaillierte Vergleichsstudie wurde daher durchgeführt, um Unterschiede zwischen den Aminosäuresequenzen von VR-2332- und LV-Virus zu bestimmen ebenso wie von anderen Arteriviridae einschließlich LDV und EAV. Der Aminosäuresequenzvergleich wurde durchgeführt unter Verwendung von GCG-(University of Wisconsin, Madison, WI) und Intelligenetics, Inc. (Mountain View, CA)-Software. Sequenz ID Nr. 1 schließt die VR-2332-Sequenz für die dem 3'-Ende nächsten 3442 Basen der VR-2332-Nucleotidsequenz ein ebenso wie die dem 5'-Ende nächsten 84 Basen, die dem Start von ORF 2 vorhergehen. Diese 3358 Nucleotide codieren die Strukturproteine des Virus und schließen sechs ORFs ein, wobei die ORFs jeweils den Sequenzen ID Nr. 2 bis 13 entsprechen. Diese VR-2332-ORFs haben unterschiedliche Homologiegrade im Vergleich zu den LV-ORFs 2 bis 7 ebenso wie zu anderen Mitgliedern der Arteriviridae-Familie einschließlich LV-Virus, LDV und EAV. Genauer zeigt eine vergleichende Sequenzanalyse einen Grad an Aminosäuresequenzhomologie zwischen VR-2332-Virus und LV-Virus im Bereich von 55% bei ORF 5 bis 79% bei ORF 6. Tabelle 1 liefert die Ergebnisse dieses Arteriviridae-Familienvergleichs. Tabelle 1 Aminosäureidentität von VR-2332 mit LV LDV und EAV in Prozent

^*Homologien wurden bestimmt unter Verwendung des Needleman-Wunsch-Algorithmus, um Sequenzen auszurichten und die Anzahl identischer Aminosäuren durch die Gesamtzahl der Aminosäuren in dem kleineren ORF zu teilen. Da ORF 3 von LDV und EAV signifikant kleiner ist als der ORF 3 von VR-2332, wird die Homologie, die auf der Division durch VR-2332 basiert, auch in Klammern gezeigt.

Obwohl die ORFs von VR-2332 meistens wie die des LV-Virus waren, zeigte der Vergleich von VR-2332 mit LDV, dass VR-2332 eine Evolutionsgeschichte mit LDV teilt. VR-2332 teilt 55% Identität mit ORF 5 von LV-Virus, hat aber den niedrigsten Homologiegrad insgesamt mit LV. Der ORF 5 von VR-2332 hat den größten Grad an Gesamthomologie im Hinblick auf den entsprechenden LDV-Teil. Der ORF 5 von VR-2332, der etwa 52% Identität mit dem LDV-ORF 5 hatte, war nur etwas ähnlicher mit LV als mit LDV. Wenn VR-2332 mit LDV verglichen wurde, waren die Homologien höher für die ORFs 5, 6 und 7, als für die ORFs 2, 3 und 4. Außer dass eine Basis zur Erklärung der beobachteten Antigenvarianz zwischen diesen verwandten Viren geliefert wird, ist die weitere Bedeutung dieser Divergenzen unklar, teilweise, weil die Funktionen der von den ORFs 2, 3 und 4 abgeleiteten Proteine unbekannt sind.
Diese Aminosäuresequenzanalysen zeigten auch, dass mit wenigen Ausnahmen die Sequenzunterschiede breit verteilt waren. Die Hauptunterschiede waren in den die Signalsequenz codierenden 5'-Enden der ORFs lokalisiert und bei ORF 4 im Bereich der Aminosäurereste 50 bis 70.
Sowohl VR-2332 als auch LV-Virus wurden als verschiedene infektiöse Mittel identifiziert, die die klinischen Zeichen von PRRS verursachen, zeigten aber wenig, falls überhaupt immunologische Kreuzreaktivität, wie von Wensvoort et al. (siehe oben) berichtet. Nichtsdestotrotz zeigte die vom 3'-Ende von VR-2332 abgeleitete Aminosäuresequenz (Sequenz ID Nr. 3, 5, 7, 9, 11 und 13) eine Genomorganisation, die für die Arteriviridae charakteristisch ist, d.h. überlappende codierende Regionen in unterschiedlichen Leserahmen von Sequenz ID Nr. 1.
Eine Dot-Matrixanalyse wurde durchgeführt, indem die GCG-Software verwendet wurde, um die vorhergesagten Proteinstrukturen für die ORFs 2 bis 7 von VR-2332 und dem LV-Virus zu vergleichen. Wie der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, wurde die Dot-Matrixanalyse mit einer konventionellen Technik durchgeführt, indem ein Gleitfenster von 21 Aminosäuren mit dem Erfordernis von 13 identischen Resten an jedem Ort verwendet wurde. Diese Analyse zeigte, dass alle ORFs im Wesentlichen co-linear waren zwischen VR-2332 und LV, d.h. die jeweiligen Virenstrukturen waren sehr ähnlich trotz erheblicher Aminosäurediversität. Die nahezu co-lineare Natur der VR-2332- und LV-ORFs zeigte auch, dass die Aminosäureunterschiede nicht durch Genomumlagerungen entstanden. Tabelle 2 liefert einen detaillierten Vergleich der verschiedenen abgeleiteten Aminosäurereste, die den jeweiligen ORFs in VR-2332 und LV-Virus entsprechen. Tabelle 2 Vergleich von VR-2332 und LV-Virus-ORFs 2 bis 7

* Nicht alle vorhergesagten Stellen sind identisch.

Obwohl diese Untersuchungen zeigten, dass VR-2332 mit dem LV-Virus enger verwandt war als mit anderen Mitgliedern der Arteriviridae, waren die Homologien für zwei Viren, die die gleiche Krankheit verursachen, viel geringer als erwartet, d.h. Substitutionen, Deletionen und Additionen traten über die Vergleichssequenzen auf. Die vorhergesagten Proteine hatten unterschiedliche Molekulargewichte, unterschiedliche isoelektrische Punkte und unterschiedliche vorhergesagte Glycosylierungsstellen (Tabelle 2).
Obwohl die Aminosäurehomologien wesentlich geringer waren, als für Viren erwartet, die eine identische Krankheit zu verursachen scheinen, waren die Erkenntnisse konsistent mit der überraschenden atigenen Diversität, die in serologischen Untersuchungen von Wensvoort et al. berichtet wird. Diese Untersuchungen lieferten eine Erklärung darüber, warum nur eine geringe, falls überhaupt, serologische Kreuzreaktivität zwischen natürlich vorkommenden VR-2332- und LV-Antigenen beobachtet wird. Antigene Unterschiede zwischen VR-2332- und LV-Virus beruhen auf immunologischen Antworten von Schweinen auf ungleiche Aminosäuresequenzregionen der Viren.
Beispiel 7
Hypathieprofilstudien
Andere Eigenschaften der vorhergesagten Proteine einschließlich der Hydropathieprofile und des Prozentanteils basischen Charakters wurden verglichen. Die Ergebnisse bestätigten, dass die zwei Viren (LV und VR-2332) Funktionen und Strukturen hatten, die signifikant ähnlicher waren, als durch den Aminosäurevergleich von Beispiel 6 und die Berichte über die immunologische Kreuzreaktivität gezeigt wurden.
Vergleichende Hydropathieprofile wurden erzeugt unter Verwendung der EUGENE-Softwarepackung von Daniben Systems Inc. aus Cincinnati, Ohio, basierend auf den abgeleiteten Aminosäuresequenzen für VR-2332 (Sequenz ID Nr. 2 bis 13) und LV-Virus (Sequenz ID Nr. 14 bis 26). Diese Profile deuteten darauf hin, dass die ORFs von VR-2332 und LV-Virus sich strukturell entsprachen trotz signifikanter Aminosäuresequenzunterschiede. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den beobachteten biologischen Ähnlichkeiten, die im Gegensatz stehen zu den unterschiedlichen serologischen Eigenschaften zwischen den Isolaten aus VR-2332 und LV-Virus.
Die Hydropathieprofile verglichen jeden entsprechenden ORF in VR-2332 und dem LV-Virus, um zu zeigen, dass Proteinstrukturen und Proteinfunktionen konserviert waren trotz der erheblichen Sequenzunterschiede. Diese Profile zeigten sehr ähnliche Bereiche ungeladener und geladener Aminosäuren und sagen Regionen gleicher Funktionalität in membranassoziierten Proteinen genau vorher, die entweder die Membran durchspannen oder nicht. Somit sind die VR-2332-Proteine in Struktur und Funktion denen von LV-Virus ähnlich, aber erhebliche Aminosäureunterschieden in den viralen Proteinen sorgen für die erheblichen Unterschiede in der serologischen Kreuzreaktivität.
Die 3, 3A, 3B und 3C zeigen das Aminosäuresequenz-Alignment und die Hydropathieprofile für ORF 7 von VR-2332 (Sequenz ID Nr. 13) und LV (Sequenz ID Nr. 26). Dieser ORF ist am 3'-Ende des LV-Genoms lokalisiert, wo das Nucleocapsidprotein auch in LDV und EAV kartiert wurde, wie von Godeny et al. berichtet, Map location of lactate dehydrogenase-elevating virus (LDV) capsid protein (Vpl) gene, 177 Virol. 768–771 (1990) und de Vries et al., Structural proteins of equine arteritis virus, 66 J. Virol. 6294–6303 (1992). ORF 7 bildet höchstwahrscheinlich das Nucleocapsidprotein im PRRS-Virus. Das Protein war zu 64% gleich zwischen VR-2332 und LV-Virus und VR-2332-ORF 7 war um fünf Aminosäuren kleiner. Nichtsdestotrotz war die N-terminale Hälfte beider Proteine, die von ORF 7 codiert wurden, zu 26 bis 28% basisch und die Hydrophobizitätsprofile waren nahezu identisch. Die basischen Reste erleichtern wahrscheinlich Interaktionen mit dem RNA-Genom.
Die 4, 4A, 4B und 4C zeigen das Aminosäuresequenz-Alignment und die Hydropathieprofile für ORF 6 von VR-2332 (Sequenz ID Nr. 11) und LV (Sequenz ID Nr. 24). ORF 6 war das VR-2332-Protein, das dem LV-Virusgegenstück am ähnlichsten war und war der einzige ORF, der für eine wahrscheinliche aminoterminale Signalsequenz codierte. Die LV- und VR-2332-Proteine teilen 79% Identität und eine vorhergesagte Glycosylierungsstelle (der LV-Virus hat eine zusätzliche Stelle, die in VR-2332 nicht zu finden ist). Die Hydropathieprofile von ORF 6 von VR-2332, LV und EAV zeigten alle drei äußerst hydrophobe Regionen in der N-terminalen Hälfte des Proteins, die auf membrandurchspannende Domänen deuten. Diese Regionen scheinen eine konservierte Eigenschaft aller Mitglieder der Arteriviridae zu sein.
Die 5, 5A, 5B und 5C zeigen das Aminosäuresequenz-Alignment und die Hydropathieprofile für ORF 5 von VR-2332 (SEQ ID Nr. 9) und LV (SEQ ID Nr. 22). ORF 5 scheint ein Hüllprotein von Arteriviridae zu codieren wegen seines Hydropathieprofils und der möglichen Glycosylierungsstellen. Gemäß de Vries et al. (siehe oben) ist in gleicher Weise das G_L oder ORF-5-Protein für EAV glycosyliert. VR-2332-ORF 5 enthält drei potenzielle Glycosylierungsstellen, von denen zwei mit LV geteilt werden. Die Hydropathieprofile von LV und VR-2332 sind sehr ähnlich, obwohl ihre Identität in Prozent (55%) die geringste für alle ORFs war. Insbesondere sind nur sieben Reste in den aminoterminalen 40 Aminosäuren gleich, die Hydropathieprofile sind jedoch praktisch identisch. Potenzielle membrandurchspannende Domänen zwischen den Resten 65 und 130 sind ausgeprägter in VR-2332.
Die 6, 6A, 6B und 6C zeigen das Aminosäuresequenz-Alignment und die Hydropathieprofile für ORF 4 von VR-2332 (Sequenz ID Nr. 7) und LV (Sequenz ID Nr. 20). Nach ORF 6 ist ORF 4 der am stärksten konservierte ORF. Das Carboxyende ist auch außergewöhnlich hydrophob bei beiden Viren. Fünf mögliche membrandurchspannende Domänen sind viel distinkter in VR-2332 als im LV-Virus.
Die 7, 7A, 7B und 7C zeigen das Aminosäuresequenz-Alignment und die Hydropathieprofile für ORF 3 von VR-2332 (Sequenz ID Nr. 7) und LV (Sequenz ID Nr. 18). ORF 3 ist zu 60% gleich zwischen VR-2332 und LV-Virus. Nichtsdestotrotz ist ORF 3 das am wenigsten ähnliche Protein zwischen den beiden Viren bezogen auf Hydropathieprofile und carboxyterminale Deletionen von 12 Aminosäuren in VR-2332. Als Ergebnis dieser Unterschiede hat das entsprechende LV-Protein einen stark hydrophilen Bereich, der auf Rest 240 zentriert ist, wohingegen das VR-2332-Protein in diesem Bereich amphipathisch zu sein scheint. Die nominelle Molekülmasse von ORF 3 ist ungefähr 30 kD, enthält aber sieben potenzielle Glycosylierungsstellen in jedem Virus, so dass die wahrscheinliche Größe deutlich größer sein kann.
Die 8, 8A, 8B und 8C zeigen das Aminosäuresequenz-Alignment und die Hydropathieprofile für ORF 2 von VR-2332 (Sequenz ID Nr. 5) und LV (Sequenz ID Nr. 16). Es wurde bestimmt, dass ORF 2 der größte der 3'-ORFs in VR-2332 ist und die Expression von 256 Aminosäuren codiert. Es hatte einen sehr basischen isoelektrischen Punkt von 11,0, der nur von ORF 6 übertroffen wurde, das einen pI von 11,3 hatte. Die Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen VR-2332 und LV-Virus waren über den ORF verteilt, aber die Hauptwirkung auf das Hydropathieprofil schien im Aminoterminus zu sein.
9 VR-2332 zeigt ein Alignment der 3'-untranslatierten Sequenz, die ORF 7 folgt in VR-2332 und LV-Virus. Diese Region besteht aus 151 Nucleotiden und einem Poly-A-Schwanz aus 19 bis 20 Basen in VR-2332. In gleicher Weise hat der LV-Virus einen nicht codierenden Bereich von 115 Basen. Die Basen 50 bis 171 des nicht codierenden Bereichs bei VR-2332 haben eine starke Homologie mit den Basen 13 bis 135 des nicht codierenden Bereichs von LV.
Beispiel 8
Isolierung von VR-2332-RNA
Virale RNA aus Zellüberständen von infizierten Zellen wird isoliert zur Verwendung für die reverse Transkription und PCR-Amplifikationsreaktionen, die selektiv entweder die viralen Nucleotide von VR-2332 oder dem LV-Virus amplifizieren, als diagnostisches Tool für LV oder PRRS. Zusätzlich wird die PCR-Amplifikation verwendet, um solche Mengen an Nucleotiden zu erzeugen, die für Impfstoffe verwendet werden können.
Als diagnostisches Mittel werden Homogenisate aus Schweinelungengewebe bevorzugt erhalten, indem Gewebeproben mit Alveolaranormalitäten ausgewählt werden, die typisch sind für PRRS; diese Proben homogenisiert werden; das Homogenisat mit einer geeigneten physiologischen Kochsalzlösung, z.B. Minimalessenzialmedium, auf eine Konzentration von 10% (G/V) Gewebe vermischt werden und die Homogenisatmischung durch eine Reihe von Filtern mit Öffnungen von 0,45, 0,2 und 0,1 μm filtriert werden.
Das filtrierte Homogenisat wird als Inoculum verwendet, um Zellen einer geeigneten Zelllinie, z.B. Affennierenzellen oder MA-104 zu infizieren. Die geimpfte Kultur wird inkubiert, bis ein Kulturvorrat erhalten wird mit einem hohen Virustiter von etwa log 5 bis log 7.
Eine erste Lösung wird hergestellt, die 5 M Guanidiniumisothiocyanat, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA, 0,5 G/V Sarcosyl und 1% (VN) 2-Mercaptoethanol enthält. Ein 10-ml-Aliquot dieser Lösung wird mit 100 μl 2-Mercaptoethanol vermischt. Ein 2-ml-Anteil der Virusvorratskultur wird in einem Röhrchen mit 2 ml des ersten Lösungsaliquots vermischt, ebenso wie mit 0,4 ml 2 M Natriumacetat, 4 ml Phenol und 1 ml einer Chloroform-Isoamylalkohollösung, die in einem Verhältnis von 24 Teilen Chloroform zu 1 Teil Isoamylalkohol gemischt wurde. Die virushaltige Mischung wird kurz nach Zugabe jedes Reagenzes verwirbelt. Die fertige Mischung wird 30 Sekunden verwirbelt, 15 Sekunden auf Eis gekühlt, dann mit 8.000 U/min 20 Minuten bei 4°C in einem JA-20-Rotor zentrifugiert. Die wässrige Phase trennt sich nach oben bei der Zentrifugation ab und enthält die interessierende RNA.
Die wässrige Phase wird dekantiert und in ein neues Röhrchen überführt. Etwa 4 ml steriles Wasser, das 2 Vol.-% Diethylpyrocarbonat vor dem Autoklavieren enthält, werden diesem zweiten Röhrchen zugefügt, ebenso wie 4 ml Phenol und 1,6 ml der 24:1-Chloroform-Isoamylalkohol-Mischung. Diese Inhaltsstoffe werden verwirbelt, 15 Minuten auf Eis gekühlt, mit 8.000 U/min 20 Minuten lang bei 4°C in einem 7A-20-Rotor zentrifugiert und die wässrige Phase wiederum extrahiert. Der entstehende wässrige Extrakt wird mit einem gleichen Volumen Isopropanol vermischt und 1 Stunde auf Eis gekühlt, um die RNA auszufällen.
Die ausgefällte RNA wird 20 Minuten lang bei 4°C in einem JA-20-Rotor mit 8.000 U/min durch Zentrifugation sedimentiert. Das Isopropanol wird dekantiert und das unsichtbare RNA-Pellet wird in 0,3 ml einer Lösung, die 5 M Guanidiniumisothiocyanat, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM EDTA, 0,5% Sarcosyl und 1% 2-Mercaptoethanol enthält, und 0,1% 2-Mercaptoethanol gelöst. Die Lösung, die das gelöste Pellet enthält, wird in ein 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen überführt und die RNA wird wiederum mit 0,3 ml Isopropanol 1 Stunde auf Eis ausgefällt. Die gekühlte Lösung wird mit 15.000 U/min in einer Mikrofuge 10 Minuten lang zentrifugiert, wonach das Isopropanol dekantiert wird. Das entstehende Pellet wird mit etwa 0,5 ml einer Lösung gewaschen, die 75% Ethanol vermischt mit 25% Wasser enthält, die 0,2 Vol.-% Diethylpyrocarbonat enthält. Nach dem Waschen wird die Mischung verwirbelt und 5 bis 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Alkohol wird dekantiert und das RNA-Pellet etwa 3 Minuten lang im Vakuum getrocknet. Das Pellet wird in 50 ml Wasser, das 0,2 Vol.-% Diethylpyrocarbonat enthält, gelöst.
Beispiel 9
Reverse Transkription von RNA, μm cDNA zu bilden
Die Lösung von Beispiel 8, die RNA und 0,2% Diethylpyrocarbonat in Wasser enthält, wird als nächstes einer reversen Transkription der RNA unterworfen, um komplementäre cDNA-Fragmente zu erzeugen. Dieses Verfahren wird bevorzugt durchgeführt, indem im Handel erhältliche Kits verwendet werden, wie z.B. der RT-PCR-Kit von Perkin Elmer. Die Kits werden nach der Anleitung des Herstellers verwendet, der die richtige Verwendung der Kit-Reagenzien beschreibt.
Beispielsweise wird eine Mastermischung hergestellt aus den aufgeführten Reagenzien des RT-PCR-Kits, indem 4 μl MgCl₂, 2 μl 10 X Puffer, 2 μl dGTP, 2 μl dATP, 2 μl dCTP, 2 μl TTP, 1 μl RNase-Inhibitor und 1 μl reverse Transkriptase vermischt werden. Ein 3-μl-Aliquot der RNA und 0,2% Diethylpyrocarbonat-Wasser-Mischung werden in Mikrofugenröhrchen gegeben, wobei, falls notwendig, darauf geachtet wird, das Aliquot mit 0,2% Diethylpyrocarbonat-Wasser so zu verdünnen, dass nicht mehr als 1 μg RNA insgesamt in dem Röhrchen enthalten sind. Der Kit enthält eine Mischung statistischer Hexamere und 1 μl dieser Mischung wird der RNA und der Diethylpyrocarbonat-Wasser-Mischung zugefügt. Die Lösung wird dann gegebenenfalls 5 bis 10 Minuten lang auf eine Temperatur von etwa 65 bis 70°C erhitzt und auf Eis gestellt. Die 16-μl-Mastermischung wer den der Probe zugegeben und etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird das Röhrchen in einer Temperaturwechselvorrichtung bzw. einem Thermal Cycler unter den folgenden Bedingungen inkubiert: 42°C 15 Minuten, 99°C 5 Minuten und 5°C 5 Minuten. Das Röhrchen wird aus der Temperaturwechselvorrichtung entnommen und bei 4°C aufbewahrt. Das Ergebnis dieser Reverse-Transkriptase-Reaktion ist cDNA, die anschließend der PCR-Amplifikation unterzogen wird.
Beispiel 10
Selektive PCR-Amplifikation von cDNA
Bei der Vorbereitung zur PCR-Amplifikation wird eine Mastermischung der folgenden Reagenzien hergestellt. 1 μl MgCl₂, 2 μl 10 X Puffer, 0,5 μl 5'-Primer, 0,5 μl 3'-Primer, 15,875 μl steriles Wasser und 0,125 μl Taq-Polymerase. Die 5'- und 3'-Primer sollten eine Konzentration von ungefähr 10 μM haben und sind bevorzugt aus synthetischen Nucleotiden aufgebaut basierend auf den unten in Tabelle 3 aufgeführten Sequenzen. Ein 5-μl-Aliquot der Lösung für die Reverse-Transkriptase-Reaktion von Beispiel 9 wird zu 20 μl Mastermischung zugefügt. Die entstehenden 25 μl der Kombination aus Mastermischung und cDNA-Aliquot für die reverse Transkriptase werden in einem Röhrchen mit 100 μl Mineralöl überschichtet. Das Röhrchen wird in einer Temperaturwechselvorrichtung unter den folgenden Bedingungen inkubiert: ein Zyklus mit 4 Minuten bei 93°C; 30 Sekunden bei 55°C, 45 Sekunden bei 72°C und 45 Sekunden bei 93°C über 30 Zyklen und 30 Sekunden bei 55°C und anschließend 10 Minuten bei 72°C über einen Zyklus. Nach diesen 32 Zyklen wird die Lösung auf 4°C gehalten, bis sie aus der Temperaturwechselvorrichtung entnommen wird. Die entstehende Lösung, die mit PCR amplifizierte cDNA enthält, wird auf einem Agarosegel analysiert.
Das bevorzugte Agarosegel enthält 1,5% Agarose vermischt mit TAE-Puffer, d.h. 1,5 g Agarose pro 100 ml Puffer. Die Mischung wird in der Mikrowelle geschmolzen und 1 μl 10 mg/ml Ethidiumbromidlösung werden pro 100 ml des Gels zugegeben. Die Mischung wird in einen Gießstand gegossen und 30 bis 45 Minuten lang härten gelassen. Ein 5-μl-Aliquot der PCR-Reaktionslösung wird in ein Röhrchen gegeben und 2 μl UV-empfindlicher Lauffarbstoff werden zu dem Aliquot zugefügt. Ein weiteres Aliquot von 1 bis 2 μl eines geeigneten Molekulargewichtsmarkers wird auch zugefügt, z.B. eine 100-Basenleiter von Gibco-BRL. Das Gel wird in eine Elektrophoresekammer gegeben und die Kammer wird mit einem üblichen TAE-Laufpuffer gefüllt. Die Proben werden aufgebracht und 1 Stunde lang bei 80 V laufen gelassen. Die mit Elektrophorese behandelten PCR-Produkte werden unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die durch PCR erzeugten Fragmente, die unter UV-Licht sichtbar gemacht werden nach der Agarosegelelektrophorese, werden der DNA-Sequenzierung unterzogen für eine unzweideutige Bestätigung der Identität des viralen Nucleotidprodukts.
Beispiel 11
Oligonucleotidaufbau für selektive PCR-Amplifikation oder Hybridisierung
Die 5'- und 3'-Primer, die für die PCR-Amplifikation von Beispiel 10 verwendet wurden, werden bevorzugt mit üblichen Protokollen oder kommerziell konstruiert als synthetische Nucleotidsequenzen, die interessierende Regionen des VR-2332-Genoms replizieren. Der Primeraufbau schließt bevorzugt ein, dass geeignete Pri mer als vollständige Aminosäure codierende Sequenzen des Virenproteins, ausgewählte ORFs oder am meisten bevorzugt für Aminosäuresequenzen, die Proteinfragmente darstellen, codierende Regionen ausgewählt werden.
Die bevorzugten Oligonucleotide werden so ausgewählt, dass solche enthalten sind, die spezifisch kleine Teile der VR-2332 codierenden Region einschließen, aber nicht mit von LV abgeleiteten Nucleotiden hybridisieren können. Diese bevorzugten Oligonucleotide werden als Primer für die PCR-Amplifikationstechniken verwendet, um lange Sequenzen von cDNA zu replizieren, die durch die Primer ausgewählt werden, zur Verwendung in Impfstoffen und für Impfmethoden. In gleicher Weise werden die Oligonucleotide auch als Sonden für die nachfolgende Hybridisierung, Klonierung und Wirtsexpression von Proteinfragmenten und Nucleotidprodukten für die nachfolgende Verwendung in Impfstoffen verwendet.
Bevorzugte Beispiele für cDNA, die Regionen für exprimierte Proteinfragmente codiert, die zur Verwendung ausgewählt werden, um Impfstoffe zu erzeugen, schließen solche ein, in denen die translatierten hydrophoben endständigen Aminosäuresequenzen entfernt sind, da diese endständigen Sequenzen gewöhnlich an reifen Formen des Virenproteins nicht vorhanden sind. Ausgewählte codierende cDNA-Bereiche können auch für Proteinfragmente codieren, bei denen mögliche membrandurchspannende Sequenzen entfernt sind, da die membrandurchspannenden Sequenzen wahrscheinlich keine Immunantworten induzieren und diese Entfernung vereinfacht im Allgemeinen die Erzeugung von immunologisch empfindlichen Proteinen durch rekombinante DNA-Techniken.
Die in Tabelle 3 aufgeführten Sequenzen stellen beispielhafte Primer dar mit Positionsreferenzen auf das beigefügte Sequenzprotokoll. Alle Sequenzen sind in der Orientierung 5' zu 3' angegeben. Beispielsweise bedeutet Primer A die Sequenz 5'-GCTGTTAAACAGGGAGTGG-3'. Primer A' ist das inverse Komplement der Sequenz 5'-GTCACCTATTCAATTAGGG-3' (Sequenz ID Nr. 1, Positionen 3271–3289), d.h. die Sequenz 5'-CCCTAATTGAATAGGTGAC-3', in der in umgekehrter Reihenfolge komplementäre Nucleotide für die Sequenz an den Positionen 3271 bis 3289 ersetzt wurden. Tabelle 3

* Ein synthetisches Oligonucleotid kann konstruiert werden, so dass es eine BamHI-Restriktionsstelle in der Sequenz einschließt, d.h. die zusätzlichen 5'-GCGGATCC-Nucleotide zur Insertion in den pAcGP67B-Plasmidvektor von Pharmingen
** Ein synthetisches Oligonucleotid kann konstruiert werden, um eine inverse komplementäre EcoRI-Restriktionsstelle in die Sequenz einzubringen, d.h. die zusätzlichen 5'-CCGAATTC-Nucleotide zur Insertion in den pAcGP67B-Plasmidvektor von Pharmingen
*** Ein synthetisches Oligonucleotid kann konstruiert werden, um eine NdeI-Restriktionsstelle in die Sequenz einzufügen, d.h. die zusätzlichen 5'-GCGCA-Nucleotide zur Insertion in den pET25b-Plasmidvektor von Novagen
**** Ein synthetisches Oligonucleotid kann konstruiert werden, um eine inverse komplementäre HindIII-Restriktionsstelle in die Sequenz einzufügen, d.h. die zusätzlichen 5'-GCGAAGCT-Nucleotide zur Insertion in den pET25b-Plasmidvektor von Novagen

Die Primer A und A' von Tabelle 3 amplifizieren die Protein codierenden Nucleotide des ORF 7 von VR-2332 in einer Art und Weise, die die VR-2332-Nucleotide von anderen Virennucleotidisolaten, einschließlich LV-Isolaten, unterscheidet. In gleicher Weise amplifizieren die Primer B und B' selektiv die Protein codierenden Nucleotide des ORF 6 von VR-2332 in einer Art und Weise, die die VR-2332-Nucleotide von anderen Virennucleotidisolaten unterscheidet. Andererseits amplifizieren die Primer C und C' selektiv die codierende Region des ORF 6 von LV-Virus ohne den ORF 6 von VR-2332 zu amplifizieren. Die Primer D und D' amplifizieren selektiv LV-ORF 7 ohne Amplifikation des ORF 7 von VR-2332.
Die bevorzugten Oligonucleotide von Tabelle 3 werden zur Diagnose der spezifischen PRRS verursachenden Stämme oder Viren verwendet durch versuchte PCR-Amplifikation der cDNA oder übliche Hybridisierungsreaktionen. Wenn beispielsweise die PRRS-Zeichen klinisch bei einem kranken Tier bestätigt werden und wenn die Primer, die für die Amplifikation des Lelystad-Virus (z.B. Primer C, C' und D, D') spezifisch sind, die cDNA-Amplifikation in der PCR-Reaktion nicht erzeugen können, dann würde die Abwesenheit von LV-cDNA übereinstimmen mit einer Diagnose einer VR-2332-Infektion. Andererseits würde das Versagen der VR-2332-Primer A, A' oder B, B' in der PCR-Amplifikation übereinstimmen mit einer Diagnose der LV-Infektion.
In Fällen, in denen die Gegenwart von viraler cDNA durch Hybridisierung dieser Primer oder Sondensequenzen von Tabelle 3 bestätigt wird, tritt die Hybridisierung in Lösung entweder mit cDNA oder RNA auf, die an einen festen Träger gebunden ist, z.B. Nitrocellulose oder Nylonmembranen. Das gewonnene hybridisierte Produkt wird mit üblichen radioaktiven oder nicht radioaktiven Techniken nachgewiesen, die die Gegenwart von viraler Nucleotidsequenz zeigen. Der Fachmann auf diesem Gebiet versteht, dass eine elementare Liste von diagnostischen Techniken Dot-Blot-Hybridisierung, Slot-Blot-Hybridisierung, Lösungs-Hybridisierung, Southern Blot, Northern Blot und RNase-Schutztests einschließt.
Beispiel 12
Klonierung von VR-2332-Protein codierenden Sequenzen in Wirtsexpressionssystemen zur Erzeugung von rekombinant erzeugten viralen Proteinen
Ausgewählte Teile der VR-2332-Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10 und 12) werden verwendet, um einen offenen Leserahmen oder eine Vielzahl von offenen Leserahmen zu klonieren, in einem im Handel erhältlichen Plasmid, das für die Proteinexpression in einem Wirtsorganismus vorgesehen ist. Beispiele für im Handel erhältliche oder selbst entworfene Systeme, die zur Expression von Virenproteinen in eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen verwendet werden können, folgen.
Das im Handel erhältliche eukaryotische Baculovirussystem von Pharmingen in San Diego, Kalifornien, das den Vektor pAcGP67B einschließt, ist bevorzugt zur Verwendung mit den Primern C und C'. Wie in Tabelle 3 angegeben, können die Primer C und C' mit den jeweiligen BamHI- und EcoRI-Restriktionsstellen versehen werden, die aus synthetisch zugefügten Nucleotiden gebildet werden zur Verbindung dieser Primer mit dem pAcGP67B-Vektor. Mit dieser Methode würde die entstehende amplifizierte cDNA im Wesentlichen die gesamte codierende Region des ORF 7 von VR-2332 beinhalten und würde auch eine 5'-ständige BamHI-Stelle ebenso wie eine 3'-ständige EcoRI-Stelle haben. Diese Restriktionsstellen werden verwendet, um die codierende Region von VR-2332 unter die Kontrolle des geeigneten pAcGP67B-Promotors und der Terminationssequenzen für eukaryotische Wirtsexpression von ORF-7-Proteinen von VR-2332 zu bringen.
Die prokaryotische Wirsexpression von viralen Proteinen wird erreicht in einer Vielzahl von im Handel erhältlichen Wirtsexpressionssystemen. Das PET-System von NovaGen in Madison, Wisconsin, ist bevorzugt für die prokaryotische Expression und schließt den Vektor pET25b ein. Das PET-System ist bevorzugt zur Verwendung mit den Primern D und D', die mit NdeI- bzw. HindIII-Restriktionsstellen versehen werden können, die für ORF 7 von VR-2332 codierende Region unter die Kontrolle der geeigneten Promotor- und Terminationssequenzen zu bringen.
Das dem ORF 7 von VR-2332 entsprechende Protein von Sequenz ID Nr. 12 und 13 wird exprimiert, indem ausgewählte Protein codierende Sequenzen, die dem vermeintlichen reifen Protein von ORF 7 entsprechen, amplifiziert werden. Dieses Amplifikationsverfahren folgt dem RT-PCR-Amplifikationsverfahren, das in den Beispielen 8, 9 und 10 ausgeführt ist. Die PCR-Primer sind bevorzugt so aufgebaut, dass sie NdeI- und HindIII-Restriktionsstellen zur Klonierung in den pET25b-Vektor einschließen. Diese Stellen führen zu einem Protein ohne einen peIB-Leader oder eine HisTag-Sequenz, die alternative Optionen für andere Expressionssysteme liefern. Das reife Protein wird ohne eine Signalpeptidsequenz exprimiert, indem die Nucleotidsequenz so begonnen wird, dass sie entweder für die Aminosäure Nr. 20 oder Nr. 30 codiert. Die PCR-Fragmente werden in die mit pET25b-Vektor amplifizierte Sequenz kloniert und in einem Wirtsexpressionssystem verwendet.
Bei der Auswahl von Protein codierenden Regionen außer ORF 7 ist es vorteilhaft, bestimmte Protein codierende Regionen zu deletieren oder zu trunkieren, z.B. die Deletion der membrandurchspannenden C-terminalen 17 Aminosäuren von ORF 4 wird wahrscheinlich Antikörperantworten auf biologisch relevante Teile des Proteins richten.
Die rekombinanten Klone werden in BL21-Zellen transformiert zur Induktion mit Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid ("IPTG"). Nach Induktion und geeigneter Inkubation wird das exprimierte rekombinante Bioprotein auf einem Gel nachgewiesen, indem Lysate aus induzierten und nicht induzieren Zellen verglichen werden. Einschlusskörperpräparate werden mit Harnstoff oder Guanidin in einer Konzentration gewaschen, die kontaminierende Proteine entfernt, ohne das ORF-4-Protein zu solubilisieren. Aggregate werden wieder in Harnstoff aufgelöst und in oxidiertem und reduziertem Glutathion wieder gefaltet. Das entstehende lösliche dialysierte Protein wird weiter mit Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie gereinigt.
Beispiel 13
Induktion einer Immunantwort in einem Tier durch Injektion von rekombinanten viralen Proteinen
Die gereinigten Proteine aus den bakteriellen oder eukaryotischen Expressionssystemen, wie in Beispiel 12 erzeugt, werden Tieren auf üblichen Immunisierungswegen injiziert, um Immunantworten hervorzurufen, die ausreichen, um das Tier gegen VR-2332-Stämme von PRRS-Virus zu immunisieren. Die Proteine alleine oder in Kombination mit einem üblichen Adjuvans werden durch intramuskuläre Injektion, intradermale Injektion, subcutane Injektion oder in anderer Weise verabreicht.
Als Alternative werden lebende molekulargenetisch verarbeitete Bakterien oder Viren, die Proteine exprimieren, die den VR-2332-Sequenzen entsprechen, Tieren durch Injektion der Expression von VR-2332-Proteinen in vivo verabreicht. Diese in-vivo-Expression von rekombinanten Proteinen ruft auch eine Immunantwort auf den VR-2332-Virus hervor.
Beispiel 14
Verwendung von VR-2332-DNA, um eine direkte Immunantwort in einem Tier zu induzieren
Auf VR-2332 basierende Oligonucleotidfragmente, die für ORFs oder fragmentarische Teile von ORFs codieren, werden verwendet, um eine direkte Immunantwort in einem Tier zu erzeugen. Diese Methode folgt allgemein dem von Omer et al. in 259 Science 1745–1749 (1993) beschriebenen Verfahren. Die DNA wird bevorzugt in Plasmidkonstrukte eingefügt, die in Bakterien gezüchtet werden, gereinigt werden und in Tiere durch intramuskuläre, intradermale Injektion oder auf anderen Wegen verabreicht werden. Das injizierte Tier exprimiert typischerweise das klonierte Protein und erzeugt eine entsprechende Immunantwort auf das Protein, das exprimiert wird.
Literaturstellen
Die folgenden Literaturstellen betreffen PRRS-Viren and werden hier durch Bezugnahme miteingeschlossen.

Benfield, D.A., Nelson, E., Collins, J.E., Harris, L., Goyal, S.M., Robison, D., Christianson, W.T., Morrison, R.B., Gorcyca, D.E. and Chladek, D.W. (1992). Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332). J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127–133.
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Claims

Isolierte cDNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenz ID Nr. 3, 5, 7, 9, 11 und 13.
cDNA-Sequenz nach Anspruch l, wobei die Aminosäuresequenz Sequenz ID Nr. 7 ist.
cDNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die cDNA-Sequenz in einem Phagen-lambda-Vektor enthalten ist.
cDNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die cDNA-Sequenz von einer Wirtszelle getragen wird.
cDNA-Sequenz nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle ist.
PRRSV-spezifische cDNA enthaltend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID Nr. 1, 2, 4, 6, 8, 10 und 12.
cDNA-Insert nach Anspruch 6, wobei das cDNA-Insert in einem Plasmid enthalten ist.
cDNA-Insert nach Anspruch 6, wobei das cDNA-Insert von einer Wirtszelle getragen wird.
cDNA-Sequenz nach Anspruch 8, wobei die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle ist.
Impfstoff enthaltend ein Protein, das von einer PRRSV-spezifischen cDNA codiert wird, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3, 5, 7, 9, 11 und 13.
Impfstoff nach Anspruch 10, wobei das Protein Sequenz ID Nr. 7 enthält.
Verwendung eines Proteins, das von einer PRRSV-spezifischen cDNA abgeleitet ist, zur Herstellung eines Impfstoffs, um Schweine gegen Reproduktions- und Atemwegssyndrom der Schweine (PRRS) zu immunisieren, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3, 5, 7, 9, 11 und 13.