DE69532953T2

DE69532953T2 - Molekularanalysator und verfahren zu seiner verwendung

Info

Publication number: DE69532953T2
Application number: DE69532953T
Authority: DE
Inventors: Robert E Fields
Original assignee: Fields Robert E Menlo Park
Current assignee: Igene inc (ndgesdstaates Delaware) Menlo Par
Priority date: 1994-02-01
Filing date: 1995-02-01
Publication date: 2005-06-02
Also published as: AU1745495A; JPH09511572A; DE69532953D1; AU699986B2; EP0752105A1; JP3383310B2; DE69532953T8; WO1995021382A2; ATE265686T1; EP0752105B1; CA2182513A1; WO1995021382A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren, durch das spezifische Moleküle in einer Flüssigkeitsprobe oder spezifische Teile von Molekülen in einer Flüssigkeitsprobe schnell und genau nachgewiesen werden können. Die Moleküle können als unabhängige Gebilde in Lösung oder als Bestandteil von Molekülkomplexen vorliegen, die durch schwache oder durch kovalente Bindungen gebunden sind. Im Fall von Biopolymeren kann das nachgewiesene Element auf eine eindeutige körperliche Konfiguration beschränkt sein, z. B. ein Epitop auf einem Protein oder eine spezielle Sequenz von Nukleotidbasen in einem größeren RNA- oder DNA-Molekül.
Unter Wissenschaftlern und Technikern besteht großer Bedarf an Einrichtungen zur sicheren Durchführung von Experimenten, bei denen Stoffe zum Einsatz kommen, die radioaktiv, karzinogen, korrosiv, toxisch oder infektiös sein können. Diagnostische Tests mit Hilfe von Blut oder Laborexperimente mittels biologisch aktiver Verbindungen oder Radioisotope gehen mit dem Risiko der Kontamination der Umgebung und Schäden für Personal einher, besonders wenn diese Tests oder Experimente manuelle Manipulationen von Proben beinhalten. Andere Kontaminationsrisiken entstehen, wenn die Produkte einer chemischen oder enzymatischen Reaktion selbst gesundheitsschädlich sind. Ein Beispiel dafür ist die Polymerasekettenreaktion ("PCR"), die die millionenfache Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz ermöglicht. Entweichen Spuren des amplifizierten Produkts aus einem Experiment in die Umgebung, können sie ein zweites PCR-Experiment kontaminieren und, indem sie als Matrize zur Amplifikation dienen, die Anwesenheit der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz in der zweiten Probe falsch anzeigen. Kontamination nur durch ein einziges ampli fiziertes Produktmolekül aus einem Experiment reicht aus, ein falsch positives Signal in einem weiteren Experiment zu erzeugen. Die Erfindung wird primär anhand von Ausführungsformen beschrieben, die zur PCR-Durchführung geeignet sind, aber der Fachmann wird erkennen, daß die Erfindung auf andere chemische Reaktionen oder Analyseneinrichtungen gleichermaßen anwendbar ist.
Der PCR-Einsatz zum Nachweis des menschlichen Immundefekt-Virus 1 ("HIV"), des Erregers des erworbenen Immunschwächesyndroms ("AIDS"), sorgte für einen Weg zum Nachweisen kleiner Anzahlen von HIV-Nukleinsäuremolekülen im Blut. Ähnlich ist ein genauer Nachweis winziger Mengen anderer Pathogene mit Hilfe der PCR möglich. Aber obwohl bekannt ist, daß PCR-Tests für einen direkten Nachweis von Pathogenen sorgen und potentiell empfindlicher als andere Verfahren sind, die auf dem Screening nach Ersatzmarkern basieren, ist die PCR-Verwendung klinisch derzeit nicht weit verbreitet. Das liegt an den höheren Kosten für Tests mit Hilfe der PCR und den praktischen Schwierigkeiten, Kontamination der Testeinrichtung zu verhindern. Dadurch wird die PCR nicht von Blutbanken verwendet, um den Blutvorrat vor HIV oder anderen Pathogenen zu schützen, und findet keinen Routineeinsatz in der klinischen Diagnose, der biotechnologischen, pharmazeutischen oder Nahrungsmittelindustrie, wo ihre Empfindlichkeit von größerem Nutzen als derzeit verwendete Tests wäre.
Die PCR ist ein Verfahren zum Amplifizieren und Nachweisen einer beliebigen Target- bzw. Zielnukleinsäuresequenz, wenn diese in einer Testprobe vorhanden ist. Allgemein wird sie wie folgt durchgeführt: Eine Testprobe, die doppelsträngige Ziel-DNA enthalten kann, wird zunächst erwärmt, um die beiden komplementären Stränge zu trennen, die die DNA-Doppelhelix bilden. Jeder getrennte DNA-Strang wird zu einer Matrize zur Bildung seiner spiegelbildlichen Kopie. Danach wird die DNA-Lösung in Gegenwart von kurzen komplementären DNA-Strängen und DNA-Polymerase, einem Enzym, das die DNA-Stränge bis zur Herstellung einer neuen spiegelbildlichen Kopie der Ausgangsmatrize verlängert, abgekühlt, und zwei neue DNA-Doppelhelixmoleküle werden erzeugt.
Wird die Lösung erneut auf Schmelztemperatur erwärmt, trennen sich die Stränge der beiden neu gebildeten DNA-Moleküle, um zu vier Matrizensträngen zu werden. Die weitere zyklische Behandlung der Reaktionsmischung erhöht die Anzahl von DNA-Molekülen exponentiell. Nach der Wärmezyklusbehandlung werden die Moleküle amplifizierter DNA durch ein beliebiges einer Anzahl dem Fachmann bekannter Laborverfahren nachgewiesen.
Die PCR gemäß der Beschreibung in der US-A-4683202 (Mullis) wurde manuell durchgeführt. Seither gab es Verbesserungen der Chemie und Vorrichtungen zur Durchführung der Wärmezyklusbehandlung, aber andere Gebiete blieben arbeitsintensiv, z. B. Vorbereiten von Proben, manuelles Laden von Probenröhrchen und Entfernen von Lösungen aus Probenröhrchen nach Wärmezyklusbehandlung. Zum Nachweisen des amplifizierten Produkts wurden viele Techniken entwickelt. Die empfindlichsten Nachweistechniken, z. B. mittels Flüssighybridisierung mit einer radioaktiven Sonde, gefolgt von Gelelektrophorese und Autoradiographie, erfordern den Gebrauch von Radioisotopen und sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Andere Nachweisverfahren unter Verwendung immobilisierter Hybridisierungssonden in Mikrotiterplatten sind schneller, aber teuer und leiden unter dem Problem von DNA-Kontamination.
Kontamination von Testeinrichtungen ist ein kritisches Problem, das durch die derzeitigen Verfahren zum Nachweis amplifizierter DNA verschärft wird. Wird z. B. ein Probenröhrchen nach Wärmezyklusbehandlung geöffnet, werden Aerosole freigesetzt, die Moleküle der amplifizierten DNA enthalten. Auch beim Einsatz von Verunreinigungshauben und streng gesteuerter Arbeitsbedingungen war es nahezu unmöglich, die Kontamination einer Testeinrichtung mit Molekülen amplifizierter DNA zu verhindern, was als "Verschleppungs-DNA" bekannt ist.
Die von Mullis beschriebene Wärmezyklusbehandlung wurde manuell durchgeführt, wobei ein temperaturgesteuertes Wasserbad und ein Mikrozentrifugenröhrchen verwendet wurden, das eine gepufferte DNA-Matrizenlösung, einen Molüberschuß zweier Oligonukleotidprimer, Nukleotidtriphosphate und DNA-Polyme rase enthielt. Seit dieser Zeit entstanden zahlreiche Publikationen, die Verbesserungen der Chemie, des Produktnachweises und der Vorrichtungen zur Durchführung der Wärmezyklusbehandlung beschreiben. Programmierbare Vorrichtungen zur Wärmezyklusbehandlung unter Verwendung von massiven Heizblöcken, temperaturgesteuertem Wasser und Heißluft wurden beschrieben. Vorrichtungen zur Wärmezyklusbehandlung des Stands der Technik unter Verwendung von Metallheizblöcken haben Wärmeübergangsgeschwindigkeiten im Bereich von 1 °C je Sekunde und erfordern gewöhnlich 60 bis 90 Minuten, um 30 Zyklen der PCR-Amplifikation durchzuführen. Mit Hilfe von Standardnachweisverfahren sind oft ein bis zwei Tage erforderlich, um PCR-Ergebnisse zu erhalten. Dies beschränkt die PCR-Anwendung stark auf vielen medizinischen und wissenschaftlichen Gebieten und begrenzt die Anzahl von Proben, die analysiert werden können. Schnellere Wärmezyklusvorrichtungen unter Einsatz von Heißluft sind verfügbar, finden aber wegen Schwierigkeiten bei der Probenhandhabung keinen breiten Einsatz.
Die PCT-Veröffentlichung WO 92/20778 (Corbett) beschreibt ein Gerät, das einen Probenhalterring mit mehreren Vertiefungen zum Aufnehmen von Probenröhrchen aufweist, die Proben enthalten. Vorgesehen sind Einrichtungen zum Erwärmen und Abkühlen des Probenhalterrings, wodurch das Gerät Proben im Probenröhrchen zyklisch erwärmen und abkühlen kann. Die Einrichtung zum Abkühlen des Rings verfügt über einen Ventilator zur Kühlluftansaugung über den Ring und Kühlventilatoren, die vom Ring radial nach innen positioniert sind, um beim Lenken von Kühlluft über den Ring zu unterstützen.
Die Erfindung verbessert Corbett durch Bereitstellung eines Molekularanalysators und eines Verwendungsverfahrens zum empfindlichen, schnellen und genauen Nachweis spezifischer Moleküle oder spezifischer Bestandteile von Molekühlen in einer Testprobe, die ohne Verwendung von Radioisotopen nachzuweisen sind. Außerdem stellt die Erfindung ein eindeutiges Nachweisverfahren bereit, das den Nachweis von Zielmolekühlen mit hoher Kapazität aus einer kleinen Probenmenge in kurzer Zeit ermöglicht.
Das gegenwärtige Auftreten neuer Krankheiten wie AIDS und Lassa-Fieber und das Wiederaufleben alter Erkrankungen wie Tuberkulose und Lungenpest erhöht die Dringlichkeit, ein umfassendes System der internationalen Krankheitsüberwachung zu schaffen. Nur die PCR mit ihrer Fähigkeit, Stämme von Viren und Bakterien zu unterscheiden und detaillierte Molekülinformationen aus kleinen Probenmengen zu liefern hat das Vermögen, diese Informationen bereitzustellen. Mit der derzeitigen Technologie wäre aber eine Realisierung von PCR-Tests im erforderlichen Maßstab untragbar teuer. PCR mit einem hohen Durchsatzvermögen würde vielen Gebieten der öffentlichen Gesundheit, Umweltüberwachung, den Zweigen der Nahrungsmittelindustrie Nutzen bringen und weitreichendes Screening auf genetische Erkrankungen ermöglichen.
Daher wäre es erwünscht, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren zum Nachweis spezifischer Moleküle oder spezifischer Bestandteile von Molekülen in einer Probe z. B. mit Hilfe der PCR bereitzustellen, das detaillierte Molekülinformationen aus einer kleinen Probenmenge liefern kann.
Erwünscht wäre ferner, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das detaillierte Molekülinformationen in kurzer Zeit liefern kann.
Außerdem wäre es erwünscht, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das Kontamination von Umgebungsbedingungen im Labor eliminiert.
Zudem wäre es erwünscht, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das billiger als derzeitige Nachweisverfahren ist.
Erwünscht wäre weiterhin, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das weniger arbeitsintensiv als derzeitige Nachweisverfahren ist.
Außerdem wäre erwünscht, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das für empfindlichen Nachweis amplifizierter DNA ohne Verwendung von radioaktiven Materialien sorgt.
Weiterhin wäre erwünscht, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das völlig automatisiert ist.
Erwünscht wäre zudem, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das für Nachweis spezifischer Moleküle oder spezifischer Bestandteile von Molekülen mit hoher Kapazität in einer Probe sorgen kann.
Zusätzlich wäre erwünscht, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das die Temperatur einer Probe genau und schnell steuern kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Daher besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren zum Nachweis spezifischer Moleküle oder spezifischer Bestandteile von Molekülen in einer Probe z. B. mit Hilfe der PCR bereitzustellen, das detaillierte Molekülinformationen aus einer kleinen Probenmenge liefern kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das detaillierte Molekülinformationen in kurzer Zeit liefern kann.
Aufgabe der Erfindung ist weiterhin, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das Kontamination von Umgebungsbedingungen im Labor eliminiert.
Zudem besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das billiger als derzeitige Nachweisverfahren ist.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das weniger arbeitsintensiv als derzeitige Nachweisverfahren ist.
Aufgabe der Erfindung ist ferner, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das für empfindlichen Nachweis amplifizierter DNA ohne Gebrauch von Radioaktivität sorgt.
Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das völlig automatisiert ist.
Eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung ist, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das für Nachweis spezifischer Moleküle oder spezifischer Bestandteile von Molekülen mit hoher Kapazität in einer Probe sorgen kann.
Zudem besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, einen Molekularanalysator und ein Verwendungsverfahren bereitzustellen, das die Temperatur einer Probe genau und schnell steuern kann.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden gemäß den Grundsätzen der Erfindung realisiert durch Bereitstellung eines Molekularanalysators und eines Verwendungsverfahrens zum empfindlichen, schnellen und genauen Nachweis spezifischer Moleküle oder spezifischer Bestandteile von Molekülen in einer Testprobe, die ohne Verwendung von Radioisotopen nachzuweisen sind. Erfindungsgemäß kann ein Probenröhrchenhalter mit mindestens einem Probenröhrchen, dessen Innenflächen fähig sein können, die zu analysierenden Moleküle spezifisch zu binden, einen Rahmen mit daran angepaßten Elastomerteilen aufweisen. Der Rahmen oder die Elastomerteile ist (sind) mit mindestens einer Innenkammer zum Aufnehmen eines Nachweisreagenz und einer evakuierten Kammer versehen, wobei beide Kammern mit dem mindestens einen Probenröhrchen kommunizieren, z. B. mittels Innenleitungen. Ferner ist der Probenröhrchenhalter mit einer Einrichtung zum Blockieren und Freigeben der Innenleitungen versehen, so daß bei Blockierung der Innenleitungen keine Kommunikation zwischen dem mindestens einen Probenröhrchen, der mindestens einen Innenkammer und der evakuierten Kammer auftritt und daß bei selektiver Freigabe der Leitungen Kommunikation auftritt und in den Innenkammern enthaltene Reagenzien durch das mindestens eine Probenröhrchen und in die evakuierte Kammer selektiv gesaugt werden, ohne daß Moleküle in der Probe in die Atmosphäre entweichen konnten.
Alternativ kann der Probenröhrchenhalter einen Rahmen mit Elastomerteilen aufweisen, die mindestens ein Probenröhrchen haben, das dazwischen abgedichtet gehalten wird, und mindestens ein Paar Öffnungen zum Bereitstellen eines ab dichtbaren Zugangs zum mindestens einen Probenröhrchen haben. Der Rahmen ist mit mindestens einer Innenkammer zum Aufnehmen eines Nachweisreagens und einer evakuierten Kammer versehen, wobei beide Kammern mit dem mindestens einen Probenröhrchen kommunizieren. Das Proben- und das Nachweisreagens können durch eine des mindestens einen Paars Öffnungen nacheinander geladen werden, wo sie durch das mindestens eine Probenröhrchen in die evakuierte Kammer nacheinander gesaugt werden können und aus der anderen des mindestens einen Paars Öffnungen entfernt werden können. Zusätzlich kann der Rahmen mit Vertiefungen versehen sein, so daß die Elastomerteile in den Vertiefungen im Rahmen so angeordnet sein können, daß die Elastomerteile und das mindestens eine Probenröhrchen vom Rahmen zusammen entfernbar sind.
Alternativ kann der Probenröhrchenhalter einen. Rahmen aufweisen, der mit Elastomerteilen versehen ist, die mindestens ein Probenröhrchen haben, das dazwischen abgedichtet gehalten wird, wobei eines der Elastomerteile mit mindestens einer Innenkammer versehen ist, die ein Nachweisreagens enthält, und das andere der Elastomerteile eine evakuierte Kammer hat, wobei sowohl die mindestens eine Innenkammer als auch die evakuierte Kammer mittels Innenleitungen mit dem mindestens einen Probenröhrchen kommunizieren. Der Probenröhrchenhalter kann mit einer Einrichtung zum aufeinanderfolgenden Blockieren und Freigeben der Innenleitungen versehen sein, die Hohlnadeln mit End- und Seitenlöchern aufweisen kann, so daß bei Blockierung der Innenleitungen keine Kommunikation zwischen der mindestens einen Innenkammer und dem mindestens einen Probenröhrchen auftritt und bei Freigabe der Innenleitungen Kommunikation auftritt und die Reagenzien nacheinander durch das mindestens eine Probenröhrchen in die evakuierte Kammer geführt werden.
Alternativ kann der Probenröhrchenhalter aufweisen: einen starren Rahmen mit mindestens einem Probenröhrchen, das zwischen gegenüberliegenden Seiten des Rahmens abgedichtet gehalten wird, einer Reagenskammer, die mit einer Seite des Rahmens in Gleiteingriff gebracht werden kann, und einer evakuierten Kammer, die mit der anderen Seite des Rahmens in Gleiteingriff gebracht werden kann, so daß ein Fluiddurchgang zwischen der Reagenskammer, dem mindestens einen Probenröhrchen und der evakuierten Kammer vorgesehen ist, wenn die Reagenskammer und die evakuierte Kammer mit dem Rahmen in Eingriff gebracht sind. Ferner kann der Rahmen mit mindestens einer Tür versehen sein, die am Rahmen schwenkbar befestigt ist, um das mindestens eine Paar Enden des mindestens einen Probenröhrchens sicher zu halten.
Ein erfindungsgemäßer Molekularanalysator kann auch eine Einrichtung zum Steuern der Temperatur der Testprobe aufweisen. Vorgesehen ist vorzugsweise eine Drei-Kammer-Luftwärmesteuerung mit einer Heißluftkammer zum Umwälzen von Heißluft, einer Kaltluftkammer zum Umwälzen von Kaltluft und einer Probenkammer zum Umwälzen von Luft und in der Probenröhrchen plaziert sind, wobei eine drehbare Tür zwischen der Heißluftkammer und der Probenkammer vorgesehen ist und eine drehbare Tür zwischen der Kaltluftkammer und der Probenkammer vorgesehen ist. Öffnen und Schließen der Türen ändert die Luftströmungswege zwischen den drei Kammern. Die Türen können so geöffnet und geschlossen werden, daß Temperaturen in der Probenkammer erreicht werden, die für die DNA-Polymeraseaktivität optimal und zur DNA-Anlagerung optimal sind.
Außerdem ist die Probenkammer der Temperatursteuerung vorzugsweise in ein oberes Teilstück und ein unteres Teilstück durch eine wärmeleitende Basis aufgeteilt, die beliebige der Probenröhrchenhalter der Erfindung hält, wobei das untere Teilstück auf der Temperatur der Kaltluftkammer gehalten wird. Die Reagenzien, die in den Reagenskammern des Probenröhrchenhalters enthalten sind, der in der Basis ruht, können dadurch auf der Temperatur der Kaltluftkammer gehalten werden.
Ein Molekularanalysator der Erfindung kann auch eine Einrichtung zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit mindestens eines Zielmoleküls in einer Testprobe haben, u. a. der Produkte einer Molekularanalyse und ferner u. a. der DNA-Produkte einer Polymerasekettenreaktion, ohne Verwendung von Radioisotopen und ohne die Testproben aus den Probenröhrchen entfernen zu müssen. Messen läßt sich die Chemilumineszenz einer Testprobe durch aufeinanderfolgendes Bewegen der in einem Probenröhrchenhalter gehaltenen Probenröhrchen in einen Wagen mit einem oberen Teilstück, das mit einem Spiegel versehen ist, der vorzugsweise ein vorderseitig verspiegelter Parabolspiegel ist, und einem unteren Teilstück, das mit einer Linse versehen ist, so daß Licht vom Probenröhrchen durch den Spiegel in die Linse reflektiert wird und durch die Linse auf ein Detektorelement fokussiert wird, an dem Photonen gezählt werden. Messen läßt sich auch die Fluoreszenzemission einer Testprobe durch aufeinanderfolgendes Bewegen der in einem Probenröhrchenhalter gehaltenen Probenröhrchen zwischen einem Spiegel, der vorzugsweise ein vorderseitig verspiegelter Parabolspiegel ist, und einem unteren Teilstück, das mit einer Linse versehen ist, so daß Fluoreszenzemission vom Probenröhrchen durch den Spiegel in die Linse reflektiert und durch die Linse auf ein Detektorelement fokussiert wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Diese und weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden näheren Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen hervor, in denen gleiche Bezugszeichen durchweg gleiche Elemente darstellen. Es zeigen:
1 eine bevorzugte Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
2 eine Querschnittansicht an der Linie 2–2 von 1;
3A–C Querschnittansichten an der Linie 3–3 von 1;
4A eine projizierte Ansicht einer weiteren Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
4B eine Schnittansicht an der Linie 4B–4B von 4A;
5A das Einbringen von Proben in den Probenröhrchenhalter von 4A;
5B eine Schnittansicht an der Linie 5B–5B von 4A;
6A eine Draufsicht auf eine weitere bevorzugte Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
6B eine Isometrie eines Abschnitts des Probenröhrchenhalters gemäß 6A;
7A–C Schnittansichten eines Probenröhrchenhalters der Erfindung, die den Nachweis amplifizierter DNA durch Chemilumineszenz zeigen;
8 einen Probenröhrchenhalter der Erfindung, der mehrere Probenröhrchen enthält, und das Einbringen von Proben in die Probenröhrchen;
9A eine weitere bevorzugte Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
9B eine Schnittansicht des Probenröhrchenhalters von 9A, die den Mechanismus zum Nachweis zeigt;
9C–E den Nachweismechanismus des Probenröhrchenhalters von 9A und 9B;
10 eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, die besonders zum großvolumigen Einsatz geeignet ist;
11A–C Draufsichten auf eine bevorzugte Ausführungsform einer Wärmesteuerung der Erfindung;
12 eine Schnittansicht eines Abschnitts der Wärmesteuerung von 11A–C;
13A, 13A' und 13B Aufzeichnungen von Temperaturen, die in der Wärmesteuerung von 11 und 12 und in einem Probenröhrchen vorgenommen wurden;
14A und 14B Teilansichten eines bevorzugten Verfahrens zum Nachweisen von Zielmolekülen;
15 eine Isometrie einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
16 eine Schnittansicht an der Linie 16–16 von 15;
17 eine Schnittansicht an der Linie 17–17 von 15;
18 eine Schnittansicht an der Linie 17–17 von 15 einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung;
19A–C Teilschnittansichten eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
20 eine Isometrie einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
21 eine Schnittansicht an der Linie 21–21 von 20;
22A und 22C Draufsichten auf eine weitere bevorzugte Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
22B eine Schnittansicht des Probenröhrchenhalters von 22A;
23 eine Isometrie einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters der Erfindung;
24 eine Schnittansicht einer Gruppe von Probenröhrchenhaltern, die in einem Gestell gehalten werden, waagerecht über den Mittelabschnitt des Gestells;
25 eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Nachweiseinrichtung; und
26 eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform einer vollständigen erfindungsgemäßen Vorrichtung zur automatisierten PCR.
Nähere Beschreibung der Zeichnungen
In 1-26 sind der Molekularanalysator und Verwendungsverfahren gemäß der Erfindung dargestellt. Primär wird die Erfindung hierin anhand der PCR beschrieben; allerdings sind die Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung nicht auf die PCR beschränkt, was dem Fachmann klar sein wird.
1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters 10 des Molekularanalysators der Erfindung. Diese Ausführungsform der Erfindung ermöglicht, mehrere Flüssigkeitsproben in den Probenröhrchenhalter 10 zur gleichzeitigen Behandlung, z. B. Wärmezyklusbehandlung, zu laden, und ermöglicht auch, die Produkte einer Reaktion nachzuweisen, ohne die Umgebung Molekülen im Probenröhrchen auszusetzen.
Vorzugsweise weist der Probenröhrchenhalter 10 einen Rahmen 11 auf, der vorzugsweise eine rechtwinklige Form und vorzugsweise Maße von etwa 10,2 Zentimetern (4,0 Inch) Länge L, 5,7 Zentimetern (2,25 Inch) Höhe H und 0,8 Zentimetern (0,3 Inch) Breite W hat. Allerdings wird verständlich sein, daß jede Größe oder Konfiguration des Rahmens 11 erfindungsgemäß verwendet werden kann.
Gemäß 2 ist der Rahmen 11 mit einer evakuierten Innenabfallkammer 20 in der Länge L eines seiner Seitenteile versehen. Ferner ist der Rahmen 11 mit einer ersten und einer zweiten Innenreagenskammer 22, 24 in der Länge L des anderen der Seitenteile des Rahmens 11 versehen. Alternativ können die evakuierte Kammer 20 und die Innenreagenskammern 22, 24 einzeln oder alle in Elastomerteilen 15 vorgesehen sein. Die Innenreagenskammern 22, 24 sind mit beliebigen Nachweisreagenzien gefüllt, die für die spezielle durchgeführte Analyse geeignet sind. Wird zum Beispiel eine PCR durchgeführt und sollen amplifizierte DNA-Produkte durch Chemilumineszenz nachgewiesen werden, könnte die erste Innenreagenskammer 22 eine Lösung aus alkalischem Phosphatasekonjugat enthalten, und die zweite Innenreagenskammer 24 könnte eine Lösung aus Dioxetan enthalten. Jede Anzahl von Innenreagenskammern 22, 24 kann vorgesehen sein; die Anzahl und die Inhalte der Innenreagenskammern 22, 24 hängen von der Art der durchgeführten Analyse ab.
Ferner ist der Probenröhrchenhalter 10 mit einem Paar entgegengesetzt angeordneten Elastomerteilen 15 versehen, die vorzugsweise aus Silikonkautschuk hergestellt sind. Die Elastomerteile 15 sind an den Rahmen 11 gemäß 1 und 2 eng angepaßt. Dazu ist der Rahmen 11 mit Verlängerungen 12 gemäß 2 versehen. Probenröhrchen 23, die normalerweise ReporterTubes^TM mit 10 Mikrolitern sind, erstrecken sich zwischen den Elastomerteilen 15 und stehen mit den Elastomerteilen 15 so in Dichteingriff, daß ein Vakuum in jedem Probenröhrchen 23 vor dem Befüllen mit einer flüssigen Testprobe vorhanden ist. Vorzugsweise acht Probenröhrchen 23 sind in jedem Probenröhrchenhalter 10 enthalten, aber jede Anzahl von Probenröhrchen 23 kann verwendet werden.
Vorzugsweise sind die Probenröhrchen 23 aus Glas oder einem anderen transparenten steifen Material mit Molekülen hergestellt, die an ihren Innenflächen angelagert und fähig sind, Zielmoleküle in der Testprobe auf spezifische Weise zu binden, wodurch sie bewirken, daß die Zielmoleküle an den Innenflächen der Probenröhrchen 23 gebunden werden.
Mehrere Probenladeanschlüsse 26 sind in einem der Elastomerteile 15 vorgesehen. Die Anzahl von Probenladeanschlüssen 26 ist mit der Anzahl gehaltener Probenröhrchen 23 identisch. Die Probenladeanschlüsse 26 erstrecken sich durch das Elastomerteil 15, um Leitungen in das Probenröhrchen 23 zu bilden. Die Probenladeanschlüsse 26 können mit Lippen 27 und einer Öffnung 21 ähnlich wie die in 4B und 5B gezeigten versehen sein.
Die Probenröhrchen 23 können mit einer zu bewertenden flüssigen Testprobe wie folgt gefüllt werden: Pipettorspitzen 118 eines Mehrkanal-Mikropipettors 150 (siehe 5A und 5B) werden in Fläschchen oder andere Behälter eingeführt, die die flüssige Testprobe enthalten. Die Pipettorspitzen 118 werden mit den Flüssigkeitsproben gefüllt. Die Lippen 27 und die Öffnung 21 der Probenladeanschlüsse 26 des Probenröhrchenhalters 10 sind so ausgebildet, daß sie das Plazieren und Herabdrücken der Pipettorspitzen 118 in die Öffnung 21 erleichtern und führen. Danach bewirkt das Ausüben einer abwärts gerichteten Kraft, daß die Pipettorspitze 118 die Lippen 27 durchsticht und in einen Hohlraum 25 gemäß 2 und ähnlich einem Hohlraum 125 gemäß 5B eintritt. Anschließend wird die in der Pipettorspitze 118 enthaltene Flüssigkeitsprobe durch Vakuum in das Probenröhrchen 23 gesaugt.
Weiterhin ist der Probenröhrchenhalter 10 mit einer ersten Ventileinsatzstange 30 und einer zweiten Ventileinsatzstange 31 versehen. Die Ventileinsatzstangen 30 und 31 erstrecken sich längs durch die Elastomerteile 15, was 1-3 zeigen. Die Ventileinsatzstangen 30 und 31 sind in Richtung der Länge L des Rahmens 11 beweglich. Die Ventileinsatzstangen 30 und 31 sind mit Ventileinsatzstangen-Massivabschnitten 38 und Ventileinsatzstangen-Kanalabschnitten 36 gemäß 3A–C versehen. Die Ventileinsatzstangen-Kanalabschnitte 36 sind nicht massiv und sorgen für einen offenen Weg zwischen den Innenreagenskammern 22, 24 und dem Probenröhrchen 23.
Gemäß 2 erstreckt sich eine erste Reagensleitung 32 von der ersten Innenreagenskammer 22 durch das Elastomerteil 15, bis sie die erste Ventileinsatzstange 30 erreicht. Eine zweite Reagensleitung 34 erstreckt sich von der zweiten Innenreagenskammer 22, bis sie die erste Ventileinsatzstange 30 erreicht.
Nach Befüllen der Probenröhrchen 23 mit der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe und nach Amplifikation durch Wärmezyklusbehandlung müssen die in den Innenreagenskammern 22, 24 enthaltenen Reagenzien auch in die Probenröhrchen 23 geladen werden, damit ein Nachweis von Zielmolekülen erfolgen kann. Die Erfindung ermöglich eine aufeinanderfolgende Zugabe der in der ersten Innenreagenskammer 22 und zweiten Innenreagenskammer 24 enthaltenen Reagenzien, ohne die Reagenzien oder die zu analysierende Testprobe der Atmosphäre auszusetzen, auf die im folgenden beschriebene Weise.
Vor Zugabe eines der in den Innenreagenskammern 22, 24 enthaltenen Reagenzien zu den Probenröhrchen 23 befindet sich die erste Ventileinsatzstange 30 in der Position gemäß 3A. Ist die erste Ventileinsatzstange 30 in dieser Position, stehen die Massivabschnitte 38 der ersten Ventileinsatzstange 30 mit der ersten und zweiten Reagensleitung 32, 34 in Kontakt. Dadurch sind sowohl die erste als auch die zweite Reagensleitung 32 und 34 blockiert, und keines der in den Innenreagenskammern 22, 24 enthaltenen Reagenzien kann in die Probenröhrchen 23 fließen. Ähnlich blockiert die zweite Ventileinsatzstange 31 eine dritte Leitung 35, um eine Verbindung zwischen dem Probenröhrchen 23 und der evakuierten Kammer 20 zu verhindern.
Soll nach Wärmezyklusbehandlung das erste Reagens den Probenröhrchen 23 zugegeben werden, wird die erste Ventileinsatzstange 30 in die Position von 3B geschoben, und gleichzeitig wird die zweite Ventileinsatzstange 31 zu einem Punkt geschoben, an dem die dritte Leitung 35 freigegeben ist und eine Verbindung zwischen dem Probenröhrchen 23 und der evakuierten Kammer 20 auftritt. In dieser Position kommunizieren die Ventileinsatzstangen-Kanalabschnitte 36 mit der ersten Reagensleitung 32, um einen Weg in die Probenröhrchen 23 zu bilden. Danach wird das erste Reagens durch das Vakuum in der evakuierten Kammer 20 in die Probenröhrchen 23 in Richtung der Pfeile gemäß 3B gesaugt.
Soll das zweite Reagens den Probenröhrchen 23 zugegeben werden, wird die erste Ventileinsatzstange 30 zur Position gemäß 3C geschoben. In dieser Position kommunizieren die Ventileinsatzstangen-Kanalabschnitte 36 mit der zweiten Reagensleitung 34, um einen Weg in die Probenröhrchen 23 zu bilden. Die zweite Ventileinsatzstange 31 bleibt in einer Position, in der die dritte Leitung 35 freigegeben ist. Somit wird das zweite Reagens durch das Vakuum in der evakuierten Kammer 20 in die Probenröhrchen 23 in Richtung der Pfeile gemäß 3C gesaugt.
Die Ventileinsatzstangen 30 und 31 stellen eine bevorzugte Einrichtung zum Blockieren und Freigeben der ersten und zweiten Reagensleitung 32 und 34 und der dritten Leitung 35 bereit. Dem Fachmann wird klar sein, daß verschiedene andere Einrichtungen dazu verwendet werden können.
4A–5B zeigen eine weitere Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters 100 zur Verwendung mit der Erfindung. Diese Art von Probenröhrchenhalter 100 ist zur PCR-Durchführung besonders nützlich, wenn es notwendig ist, amplifizierte DNA-Produkte nach Wärmezyklusbehandlung zurückzugewinnen, oder zum Nachweisen anderer Moleküle, wenn solche Moleküle zur weiteren Verwendung zurückgewonnen werden sollen. Diese Ausführungsform der Erfindung ermöglicht, mehrere flüssige Testproben gleichzeitig zu laden, und verfügt vorzugsweise über einen Rahmen 111, der Probenröhrchen 123 enthält, die so mit dem Rahmen 111 in Abdichteingriff stehen, daß ein Vakuum in jedem Probenröhrchen 123 herrscht, bevor das Probenröhrchen 123 mit Testprobe zur Bewertung gefüllt wird. Jedes Probenröhrchen 123 kann auch evakuiert sein, während es sein Vakuum behält. Vorzugsweise ist der Rahmen 111 aus einem Elastomermaterial hergestellt, z. B. Silikonkautschuk.
Der Rahmen 111 hat mehrere darin gebildete Hohlräume 125 gemäß 4B. Ein Hohlraum 125 ist vorzugsweise am Ende eines abgedichteten Probenröhrchens 123 positioniert. Jeder Hohlraum 125 kann mit Lippen 127 und einer Öffnung 121 gebildet sein, die so ausgebildet sind, daß sie eine Pipettorspitze 118 beim Plazieren und Herabdrücken in die Öffnung 121 führen, wo eine ausgeübte Abwärtskraft bewirkt, daß die Pi pettorspitze 118 die Lippen 127 durchsticht und in den Hohlraum 125 eintritt, was in 5B gezeigt ist. Enthält die Pipettorspitze 118 eine Flüssigkeitsprobe, wird diese Flüssigkeit hierbei durch Vakuum in den Hohlraum 125 und das Probenröhrchen 123 gesaugt. 5A zeigt einen Mehrkanal-Mikropipettor 150 in Teilansicht, der jede seiner Spitzen 118 in die Öffnungen 121 eingreifen läßt.
Gemäß 4B und 5B sind die Lippen 127 so gebildet, daß nach Herausziehen der Spitze 118 der durch den Eintritt der Spitze 118 erzeugte Eingangsweg verschlossen wird, und Innendruck, der sich im Probenröhrchen 123 aufbauen kann, tendiert dazu, das Loch abzudichten, was Moleküle am Entweichen hindert.
Nach Wärmezyklusbehandlung kann es erwünscht sein, die flüssigen Testproben aus den Probenröhrchen 123 zu entfernen, um z. B. die amplifizierte DNA zum Gebrauch in anderen Experimenten zu reinigen. Erfindungsgemäß ist es nach Wärmezyklusbehandlung der Testproben möglich, die Flüssigkeitsproben aus den Probenröhrchen 123 zu entfernen, ohne die Atmosphäre einer Kontamination durch Moleküle in der Probenlösung auszusetzen. Eine kleine Menge Mineralöl wird in jede Öffnung 121 gegossen und bedeckt die Oberflächen jeder Öffnung 121. Ein Mikropipettor 150 mit mehreren aerosolbeständigen Spitzen 118 dient zum Einführen der Spitzen 118 in die Hohlräume 125 entlang einem Ende der Probenröhrchen 123. Die Spitzen 118 werden aus dem Mikropipettor 150 gelöst und bleiben an Ort und Stelle, wo sie für eine gefilterte Verbindung zwischen den Probenröhrchen 123 und der Atmosphäre sorgen. Danach wird der Mikropipettor 150 mit zusätzlichen mehreren aerosolbeständigen Spitzen 118 neu beladen. Die zusätzlichen Spitzen 118 werden dann in die Öffnungen 121 gedrückt, die an den entgegengesetzten Enden der Probenröhrchen 123 liegen, was 4A und 5A zeigen. Anschließend wird der Mikropipettor 150 verwendet, die Inhalte der Probenröhrchen 123 in die Spitzen 118 abzuziehen. Da die gegenüberliegenden Enden der Probenröhrchen 123 offen sind, besteht kein Widerstand gegen das Absaugen der Proben. Danach wird der Mikropipettor 150 langsam angehoben, und während die Spitzen 118 die Öffnungen 121 des Probenröhrchenhalters 100 verlassen, gewährleistet die Schicht aus Mineralöl 117 gemäß 5B, daß keine Moleküle aus der Probenlösung den Probenröhrchenhalter 123 verlassen und in die Atmosphäre eintreten können. Das Öl 117 bedeckt die Außenseite der Pipettorspitze 118, und bei ihrem Herausheben aus der Ölschicht 117 wird das Ende der Spitze 118 durch Öl abgedichtet, das herabläuft und sich an ihrem Ende sammelt. Danach können die Inhalte der Spitzen 118 in zusätzliche Probenröhrchen oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die mit Öl beschichtet wurde, überführt werden, so daß die wäßrige Probe unterhalb des Öls ausgetrieben wird. Abgeschlossen wird die Überführung durch Aufnahme einer kleinen Ölmenge in jede der Spitzen, wenn sie aus den Probenvertiefungen gehoben werden, so daß die Pipettorspitzen vor Entsorgung mit Öl abgedichtet sind.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Probenentnahme, das die Kontaminationsgefahr durch amplifizierte DNA-Moleküle minimiert, verwendet eine geformte Wand 119, die die Öffnungen 121 gemäß 4B und 5B umgibt.
6A und 6B zeigen eine weitere Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters 200. In dieser Ausführungsform hält ein Paar Elastomerstreifen 220 zahlreiche Probenröhrchen 223. Die Probenröhrchen 223 werden durch die Elastomerstreifen 220 an jedem ihrer Enden gemäß 6A gehalten. Öffnungen 210 sorgen für Zugang zu den Probenröhrchen 223 wie zuvor beschrieben.
Die Elastomerstreifen 220 werden in einem starren Rahmen 224 gehalten, der normalerweise aus thermoplastischem Material hergestellt ist. 6B zeigt den starren Rahmen 224 ohne Probenröhrchen 223 oder Elastomerstreifen 220. Der starre Rahmen 224 kann mit Vertiefungen 229 versehen sein, um die Elastomerstreifen 220 unterzubringen. Ferner kann der starre Rahmen 224 mit Aussparungen 230 versehen sein, die ermöglichen, daß die Probenröhrchen 223 im starren Rahmen 224 durchgehen können.
7A–C zeigen Schnittansichten eines Probenröhrchenhalters 300, der zum Nachweis von amplifizierter DNA durch Chemilumineszenz besonders nützlich ist. Der Probenröhrchen halter 300 ist mit einem Rahmen 311, Elastomerteilen 333 und Innenreagenskammern 331, 332 versehen, die innerhalb eines der Elastomerteile 333 gebildet sind. Die Innenreagenskammern 331 und 332 können Reagenzien enthalten, um z. B. amplifizierte DNA nach Wärmezyklusbehandlung nachzuweisen, beispielsweise Lösungen aus Dioxetan und alkalischem Phosphatasekonjugat, oder um z. B. gebundene Antigene im Probenröhrchen 323 nachzuweisen. Die Elastomerteile 333 halten die Probenröhrchen 323 abgedichtet zwischen ihnen. Ferner ist der Probenröhrchenhalter 300 mit einer evakuierten Kammer 320 versehen. Die evakuierte Kammer 320 kann zwischen dem Rahmen 311 und dem anderen der Elastomerteile 333 vorgesehen sein, das keine Innenreagenskammern 331, 332 enthält. Alternativ kann die evakuierte Kammer 320 in einem der Elastomerteile 333 vorgesehen sein.
Nach dem Befüllen der Probenröhrchen 323 mit einer flüssigen Testprobe und nach Wärmezyklusbehandlung gemäß der vorstehenden Beschreibung müssen die in den Innenreagenskammern 331, 332 enthaltenen Reagenzien in die Probenröhrchen 323 eingebracht werden. Hohlnadeln 334 und 335 stellen eine Einrichtung zum Transportieren der in den Innenreagenskammern 331, 332 enthaltenen Nachweisreagenzien in die Probenröhrchen 323 bereit. In 7A–C sind die Nadeln 334, 335 in 90°-Orientierung zu den Probenröhrchen 323 gezeigt; allerdings können die Nadeln 334, 335 parallel zu den Probenröhrchen 323 oder in jedem anderen gewünschten oder zweckmäßigen Winkel orientiert sein. Gemäß 7A–C kann diese Operation durchgeführt werden, ohne die Reagenzien oder die Flüssigkeitsprobe der Atmosphäre auszusetzen, wo Kontamination wahrscheinlich wäre.
Die Hohlnadeln 334 und 335 sind mit Endlöchern 339 an ihren Enden 339A versehen. Ferner sind die Hohlnadeln 334 und 335 mit Seitenlöchern 338 auf ihren Seiten 338A versehen. Schiebt man die Nadeln 334, 335 etwa 2 Millimeter in die Position gemäß 7B, bilden die Endlöcher 339 und Seitenlöcher 338 einen Durchgang für das in der Kammer 332 enthaltene Reagens, um in und durch das Probenröhrchen 323 und anschließend in die evakuierte Kammer 320 zu fließen. Das in der In nenreagenskammer 332 enthaltene Reagens fließt zunächst durch das Seitenloch 338 der Nadel 334 über eine kurze Entfernung durch die Nadel 334 und fließt dann durch das Endloch 339 der Nadel 334 in und durch das Probenröhrchen 323. Das Vakuum in der evakuierten Kammer 320 zieht das in der Innenreagenskammer 332 enthaltene Reagens durch das Probenröhrchen 323. Danach fließt das Reagens durch das Endloch 339 der Nadel 335 über eine kurze Entfernung durch die Nadel 335 und dann nach außen in die evakuierte Kammer 320 durch das Seitenloch 338 der Nadel 335.
Beispielsweise ist bei einer PCR-Analyse eine Lösung aus alkalischer Phosphatase in Konjugation mit Streptavidin in der Innenreagenskammer 332 enthalten. Die alkalische Phosphataselösung wäscht ungebundene Materialien aus dem Probenröhrchen 323 in die evakuierte Kammer 320 aus. Enzym wird durch biotinylierte Amplimere aufgefangen, die an die Innenseite des Probenröhrchens 323 gebunden sind. Auf diese Weise werden ungebundene Materialien aus dem Probenröhrchen 323 ausgewaschen, und Moleküle amplifizierter DNA werden mit alkalischem Phosphataseenzym gekoppelt.
Nach dem Waschen der Probenröhrchen 323 mit dem in der Kammer 332 enthaltenen Reagens werden die Nadeln 334 und 335 getrennt in die Positionen gemäß 7C geschoben. Zuerst wird die Nadel 334 weiter in das Elastomerteil 333 geschoben. Das Loch 339 der Nadel 334 bildet einen Durchgang für das in der Kammer 331 enthaltene Reagens, um über eine kurze Entfernung durch die Nadel 334, dann durch das Seitenloch 338 und danach in das Probenröhrchen 323 zu fließen.
Beispielsweise wäscht bei einer PCR-Analyse eine Dioxetanlösung ungebundenes Enzym aus, das zuvor durch das Probenröhrchen 323 geführt wurde und das Röhrchen 323 füllt.
Während das zweite Reagens, das in der Innenreagenskammer 332 enthalten war, das Probenröhrchen 323 füllt, bleibt die Nadel 335 in der Position gemäß 7B.
Nach dem Auswaschen von ungebundenem Enzym oder einem anderen Reagens, das zuvor durch das Probenröhrchen 323 geführt wurde, bewegt sich die Nadel 335 in die Position gemäß 7C, um den Strom aus dem Probenröhrchen 323 in die eva kuierte Kammer 320 abzusperren. Jetzt sind die abgedichteten Probenröhrchen 323 zu Chemilumineszenzmessungen bereit.
Natürlich wird dem Fachmann klar sein, daß jede andere geeignete Einrichtung, z. B. in Verbindung mit 1 bis 3 beschriebene Ventileinsatzstangen, verwendet werden kann, um für Zugang zu den Probenröhrchen 323 für Reagenzien zu sorgen, die in den Innenreagenskammern 331, 332 enthalten sind.
Ein erfindungsgemäßer Molekularanalysator kann einen Probenröhrchenhalter 400 mit einer beliebigen Anzahl von Probenröhrchen 423 verwenden. Zum Beispiel zeigt 8 einen Probenröhrchenhalter 400 mit 36 Probenröhrchen 423, die mit Hilfe eines 36-Kanal-Pipettors 445 mit Einwegspitzen 418 beladen werden können. Ein solcher Pipettor 445 kann durch eine (nicht gezeigte) Robotervorrichtung betätigt werden, wodurch jeweils 36 Proben geladen und entladen werden.
9A zeigt eine weitere Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters 500, der mit zwei Elastomerteilen 510 und 520 versehen ist, die viele Probenröhrchen 523 haben, die abgedichtet zwischen ihnen gehalten werden. Der Probenröhrchenhalter 500 kann viele Tausende Probenröhrchen 523 sowie eine beliebige Anzahl im Inneren enthaltener Nachweisreagenzien halten. Zur zweckmäßigen Lagerung und Abgabe kann der Probenröhrchenhalter 500 gemäß 9A gerollt werden.
9B zeigt Einzelheiten der Anordnung des kontinuierlichen Probenröhrchenhalters 500 von 9A, u. a. Innenelemente, die eine automatisierte Reagensabgabe vorsehen. Ein erstes Elastomerteil 510 ist mit Öffnungen 521 und Lippen 527 versehen, durch die flüssige Testproben in evakuierte Hohlräume 525 geladen werden können. Danach wird die Flüssigkeitsprobe durch Vakuum in die Probenröhrchen 523 wie zuvor beschrieben gesaugt.
Das erste Elastomerteil 510 ist ferner mit einer ersten Innenreagenskammer 522 und einer zweiten Innenreagenskammer 524 versehen. Die Innenreagenskammern 522, 524 können mit jedem Nachweisreagens gefüllt sein, das zur durchzuführenden Analyse geeignet ist. Ist z. B. eine PCR durchzuführen, könnte die erste Innenreagenskammer 522 eine Lösung aus alkalischem Phosphatasekonjugat enthalten, und die zweite Innenrea genskammer 524 könnte eine Lösung aus Dioxetan enthalten. Jede Anzahl von Innenreagenskammern kann vorgesehen sein; die Anzahl und die Inhalte solcher Kammern hängen von der Art der durchgeführten Analyse ab.
Außerdem ist das erste Elastomerteil 510 mit einer ersten Leitung 543 versehen, die zwischen der ersten und zweiten Innenreagenskammer 522, 524 liegt. Die erste Leitung 543 wirkt mit dem Probenröhrchen 523 zusammen, um eine Fluidverbindung dazwischen herzustellen. Im ersten Elastomerteil 510 ist auch eine erste Hohlnadel 534 vorgesehen. Die erste Hohlnadel 534 ist mit einem ersten Nadelseitenloch 534A versehen. Das erste Nadelseitenloch 534A ermöglicht eine Fluidkommunikation zwischen der ersten Innenreagenskammer 522 und der ersten Leitung 543 und auch zwischen der zweiten Innenreagenskammer 524 und der ersten Leitung 543, was später näher beschrieben wird.
Das zweite Elastomerteil 520 ist mit einer evakuierten Innenkammer 540 versehen. Die evakuierte Kammer 540 hat ein so großes Volumen wie im zweiten Elastomerteil 520 praktikabel, da der motorische Zug, der durch das in der evakuierten Kammer 540 enthaltene Vakuum bereitgestellt wird, bewirkt, daß die Reagenzien durch die Probenröhrchen 523 fließen.
Das zweite Elastomerteil 520 ist auch mit einer zweiten Leitung 545 versehen, die so angeordnet ist, daß sie Umgebungssegmente des zweiten Elastomerteils zwischen sich und der evakuierten Kammer 540 hat, was selektives Zusammenwirken zwischen Probenröhrchen 523 und der evakuierten Kammer 540 ermöglicht. Die zweite Leitung 545 wirkt mit dem Probenröhrchen 523 zusammen, um eine Fluidverbindung dazwischen herzustellen. Im zweiten Elastomerteil 520 ist auch eine zweite Hohlnadel 535 vorgesehen. Die zweite Hohlnadel 535 ist mit einem zweiten Nadelseitenloch 535A versehen. Das zweite Nadelseitenloch 535A ermöglicht eine Fluidkommunikation zwischen der evakuierten Innenkammer 540 und der zweiten Leitung 545, was später näher beschrieben wird.
9C–D zeigen die Ausführungsform des Probenröhrchenhalters gemäß 9A und 9B in Verbindung mit einem Verfahren zur automatisierten Analysenquantitation nach Wärmezyk lusbehandlung. Diese Ausführungsform ist bevorzugt, wenn Millionen von Proben pro Jahr mit Hilfe von PCR zu analysieren sind, z. B. zur Bluttestung, klinischen Diagnose, Krankheitsüberwachung und für Umwelttests.
9C–D zeigen einen Transportrahmen mit einem ersten und einem zweiten Transportrahmenteil 552, 554. Der Transportrahmen kann eine Komponente einer Probenlesevorrichtung (nicht gezeigt) sein. Das erste Transportrahmenteil 552 umgibt das erste Elastomerteil 510, und das zweite Transportrahmenteil 554 umgibt das zweite Elastomerteil 520. Ein erstes Paar Innenrollen 562 ist im ersten Transportrahmenteil 552 allgemein im Bereich vorgesehen, der die Innenreagenskammern 522, 524 umgibt. Ein zweites Paar Innenrollen 564 ist im zweiten Transportrahmenteil 554 allgemein im Bereich vorgesehen, der die evakuierte Innenkammer 540 umgibt.
Wenn kurz nach der Wärmezyklusbehandlung der Probenröhrchenhalter 500 in eine Probenröhrchen-Lesevorrichtung (nicht gezeigt) eintritt, entsprechen die Relativpositionen der ersten und zweiten Innenrollen 562, 564, des ersten und zweiten Elastomerteils 510, 520 und der ersten und zweiten Nadel 534, 535 9C. Die erste und zweiten Nadel 534 und 535 haben noch nicht die erste Leitung 543 oder zweite Leitung 545 kontaktiert, weshalb keine Reagenzien aus der ersten oder zweiten Innenreagenskammer 522 oder 524 in das Probenröhrchen 523 eingetreten sind.
Als nächstes bewegen sich das erste und zweite Paar Innenrollen 562, 564 in die Positionen gemäß 9D abwärts. Das erste Paar Rollen 562 hat sich in eine Position abwärts bewegt, in der das erste Elastomerteil 510 bis zu dem Punkt zusammengedrückt wird, an dem die erste Nadel 534 die erste Leitung 543 kontaktiert. Die zweiten Innenrollen 564 haben sich in eine Position abwärts bewegt, in der das zweite Elastomerteil 520 bis zu dem Punkt zusammengedrückt wird, an dem die zweite Nadel 535 die zweite Leitung 545 kontaktiert. Das erste Nadelseitenloch 534A bildet einen Fluiddurchgang für das erste Reagens, das in der ersten Innenreagenskammer 522 enthalten ist, um durch die erste Leitung 522 in das Probenröhrchen 523 zu fließen. Das erste Reagens wird durch die erste Leitung 543 durch das Probenröhrchen 523 und durch die zweite Leitung 545 in die evakuierte Kammer 540 durch das Vakuum in der evakuierten Kammer 540 gesaugt. Das zweite Nadelseitenloch 535A bildet einen Fluiddurchgang für das erste Reagens zusammen mit den ungebundenen Molekülen, die aus dem Probenröhrchen 523 durch das erste Reagens gewaschen wurden, um in die evakuierte Kammer 540 zu fließen. Zum Beispiel wäscht bei einer PCR-Analyse alkalische Phosphatasekonjugatlösung ungebundene Moleküle aus dem Probenröhrchen 523 und bindet sich an amplifizierte DNA, die mit immobilisierten Sonden im Probenröhrchen 523 hybridisiert ist.
Nachdem das erste Reagens das Probenröhrchen 523 durchlaufen hat, bewegen sich als nächstes die ersten und zweiten Innenrollen 562, 564 in die Positionen gemäß 9E abwärts. Das erste Paar Innenrollen 562 hat sich weiter in eine solche Position abwärts bewegt, daß das erste Elastomerteil 510 weiter bis zu dem Punkt zusammengedrückt wird, an dem die erste Nadel 534 die zweite Innenreagenskammer 524 kontaktiert. Das erste Nadelseitenloch 534A bildet einen Fluiddurchgang für das zweite Reagens, das in der zweiten Innenreagenskammer 524 enthalten ist, um durch die erste Leitung 543 in das Probenröhrchen 523 zu fließen. Das zweite Reagens wird durch die erste Leitung 543 durch das Probenröhrchen 523 und durch die zweite Leitung 545 in die evakuierte Kammer 540 durch das Vakuum in der evakuierten Kammer 540 gesaugt. Zum Beispiel wäscht bei einer PCR-Analyse Dioxetansubstratlösung ungebundenes Enzym aus dem Probenröhrchen 523 und füllt das Probenröhrchen 523.
Nach Auswaschen der ungebundenen Moleküle aus dem Probenröhrchen 523 und in die evakuierte Kammer 540 ziehen sich die zweiten Innenrollen 564 zurück und kehren in ihre Ausgangspositionen zurück, wodurch sie die Substratströmung aus dem Probenröhrchen 523 absperren. Dem Fachmann wird klar sein, daß andere Einrichtungen als die zuvor beschriebenen Hohlnadeln verwendet werden können, um Fluiddurchgänge zur Reagensströmung bereitzustellen.
10 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, die zur großvolumigen Analyse bevorzugt ist. Ein Probenröhrchen halter 500, der gerollt ist und Tausende von Probenröhrchen 523 gemäß 9A enthält, kann in einer Abgabevorrichtung 551 gelagert sein. Der Probenröhrchenhalter 500 wird entlang einer Bahn 554 in eine Probenladestation 552 geführt, wo ein Mehrkanal-Pipettor 553 die zu analysierenden Proben in die Probenröhrchen 523 lädt, was dem Verfahren von 8 stark ähnelt. Die beladenen Probenröhrchen 523 treten in eine Luftwärmesteuerung 555 ein und werden einer Wärmezyklusbehandlung unterzogen. Nach dem letzten Amplifikationszyklus treten die Probenröhrchen 523 in eine Amplimerfixationskammer 556 ein, in der amplifizierte DNA in den Probenröhrchen 523 an Hybridisierungssonden angelagert wird, die an den Innenflächen der Probenröhrchen 523 angelagert sind. Das Protokoll, das eingehalten wird, bestimmt sich durch die Art der durchzuführenden Analyse und kann eine Vorabmanipulation der Temperatur der Probenlösungen aufweisen, um das DNA-Polymeraseenzym zu denaturieren oder zu deaktivieren, bevor einem Temperaturprotokoll gefolgt wird, das eine Auswahl zur maximalen Bindung von Amplimer mit Hybridisierungssonden und Bindung von DNA-Polymerase mit geprimtem Amplimer trifft, ohne DNA-Extension auftreten zu lassen. Danach kann das gebundene Enzym verwendet werden, um das Signal der amplifizierten DNA zu verstärken, indem ein Substrat für affinitätsbasierte Nachweisreagenzien bereitgestellt wird. Nach Amplimerfixation laufen die Probenröhrchen 523 als nächstes in einen Probenröhrchenleser 557, wo Nadeln in die Probenröhrchenhalter 550 gedrückt werden oder jede andere Einrichtung zum Einsatz kommt, um ungebundene Moleküle aus den Probenröhrchen 523 auszuwaschen und um Reagenzien zuzugeben, bevor die gebundene DNA nachgewiesen wird.
11A–C zeigen eine bevorzugte Ausführungsform einer Wärmesteuerung 40 zur Wärmezyklusbehandlung oder jeder anderen gewünschten Temperaturmanipulation der in den Probenröhrchen 23 der Erfindung enthaltenen Testproben. Eine Heißluftkammer 60 wälzt Luft bei einer erhöhten Temperatur, normalerweise 200 °C, mit Hilfe eines ersten Ventilators 61 um, der die Luft um eine erste Mittelwand 62 und durch ein Heizelement 63 drückt. Eine Kaltluftkammer 70 wälzt Luft bei einer niedrigen Temperatur, normalerweise 0 °C, mittels eines zweiten Ventilators 71 um, der die Luft um eine zweite Mittelwand 72 und durch ein Kühlelement 73 drückt. Luft wird in einer Probenkammer 80 mittels eines Mehrschaufel-Turbinenventilators 81 umgewälzt, der die Luft durch die Probenröhrchenhalter 10 oder jede der anderen Ausführungsformen des Probenröhrchenhalters der Erfindung und um eine dritte Mittelwand 83 drückt.
Außerdem ist die Wärmesteuerung 40 mit Türen 90 und 91 versehen, die zwischen geschlossenen Positionen und jedem Grad von offenen Positionen bewegt werden können. Die Türen 90 und 91 wirken zusammen, um die Lufttemperatur in der Probenkammer 60 zu steuern. Die Türen 90 und 91 können durch einen Servomechanismus (nicht gezeigt) gedreht werden, dem Anweisungen durch Mikroprozessorsteuerung erteilt werden. Zum Beispiel kann der Mikroprozessor Informationen über die Temperatur an verschiedenen Stellen in der Wärmesteuerung 40 verwenden, um zu berechnen, ob die Tür 90 oder Tür 91 geöffnet sowie in welchem Grad die Tür 90 oder Tür 91 geöffnet werden sollte, um möglichst genau ein Protokoll durchzuführen, das zur Temperatursteuerung von Testproben eingegeben ist, die in den Probenröhrchen 23 enthalten sind.
11B zeigt die Luftströmung in der Wärmesteuerung 40, nachdem die erste Tür 90 geöffnet wurde. Heißluft aus der Heißluftkammer 60 tritt in die Probenkammer 80 in Richtung der mit "H" bezeichneten Pfeile ein, wo sie in den Mehrschaufel-Turbinenventilator 81 eingezogen wird. Der Mehrschaufel-Turbinenventilator 81 kombiniert und mischt Luftströme mit unterschiedlichen Temperaturen, die in ihn eintreten, bevor er die gemischte Luft zwingt, die im Probenröhrchenhalter 10 gehaltenen Probenröhrchen 23 zu kontaktieren. Luft aus der Probenkammer 80 verläßt die Probenkammer 80 und tritt in die Heißluftkammer 60 in Richtung der mit "S" bezeichneten Pfeile ein.
Ähnlich kann Luft aus der Kaltluftkammer 70 in die Probenkammer 80 eintreten, wenn die zweite Tür 91 gemäß 11C gedreht wird. Kaltluft aus der Kaltluftkammer 70 tritt in die Probenkammer 80 in Richtung der mit "C" bezeichneten Pfeile ein, wo sie in den Mehrschaufel-Turbinenventilator 81 gesaugt wird. Luft aus der Probenkammer 80 verläßt die Probenkammer 80 und tritt in die Kaltluftkammer 70 in Richtung der mit "S" bezeichneten Pfeile ein.
Die Konfiguration der Wärmesteuerung 40 der Erfindung ermöglicht schnelle Temperaturänderungsgeschwindigkeiten von Probenlösungen, die in den Probenröhrchen 23 enthalten sind. Dadurch verlaufen Bewegungen von Elongations- zu Denaturierungs- und Anlagerungstemperaturen praktisch unverzüglich. Somit sind Reaktionszykluszeiten minimiert, und der höchste Grad an DNA-Targetspezifität und amplifizierter Produktausbeute wird erhalten. Außerdem bildet schnelles Abkühlen einer Probe nach einer PCR-Amplifikation eine Möglichkeit zum Einfangen von Zielmolekülen auf der Innenfläche eines Probenröhrchens vor Nachweis durch Chemilumineszenz, Fluorimetrie oder andere Techniken. Schnelle Temperaturübergänge reduzieren auch stark falsches Priming.
Zum Maximieren der Kostenwirksamkeit und Produktivität sollten PCR-Probenlösungen möglichst viel Zeit bei optimalen Polymeraseextensionstemperaturen mit möglichst kurzen Interventionen für Übergänge zu Denaturierungs- und Anlagerungstemperaturen verbringen. Beispielsweise werden Türbewegungen der Wärmesteuerung 40 der Erfindung während eines 10-sekündigen PCR-Wärmezyklus beschrieben. Eine Aufzeichnung der Temperaturänderungen, die in einem Probenröhrchen 23 der Wärmesteuerung 40 während eines solchen 10-sekündigen Wärmezyklus protokolliert wurden, zeigt 13B. Der die Probenröhrchen 23 enthaltende Probenröhrchenhalter 10 wird in die Probenkammer 80 geladen. Die Luft in der dritten Probenkammer 80 wird zwischen 72 °C und 78 °C gehalten. Die Luft in der Heißluftkammer 60 wird auf 200 °C gehalten. Die Luft in der Kaltluftkammer 70 wird auf 0 °C gehalten.
Beim Öffnen der ersten Tür 90 strömt Heißluft bei 200 °C aus der Heißluftkammer 60 in die Probenkammer 80, während gleichzeitig Luft bei 72–78 °C aus der Probenkammer 80 in die Heißluftkammer 60 strömt. Der Nettoeffekt ist, daß die Temperatur der Luft in der Probenkammer 80 schnell erhöht wird. Temperaturmessungen werden durch die Wärmesteuerung 40 ver wendet, um den Grad, in dem die Tür 90 geöffnet werden sollte, und die Zeit für ihr vollständiges Schließen zu berechnen, damit eine abschließende Zieltemperatur erreicht wird, in diesem Beispiel 96–97 °C, wobei bei dieser Temperatur die in der Testprobe vorhandene DNA sofort denaturiert wird.
Jetzt kann die Temperatur der Lösung schnell auf eine optimale Anlagerungstemperatur durch Öffnen der zweiten Tür 91 gesenkt werden. Kaltluft bei 0 °C aus der Kaltluftkammer 70 strömt in die Probenkammer 80, während gleichzeitig Luft bei 96 °C aus der Probenkammer in die Kaltluftkammer 70 strömt. Dadurch kann die Temperatur der Luft in der Probenkammer 80 schnell von 96 °C auf 54 °C oder eine andere optimale Temperatur gesenkt werden, bei der es zur Anlagerung von Primern an Matrizen-DNA kommt. Die Anlagerung kann praktisch unverzögert erfolgen oder kann wenige Sekunden benötigen.
Die Anlagerung kann praktisch unverzögert erfolgen oder kann wenige Sekunden benötigen. Die Wärmesteuerung 40 der Erfindung kann Probentemperaturen auf jeder gewünschten Temperatur mit großer Genauigkeit halten, indem nach Bedarf die erste Tür 90 oder zweite Tür 91 geöffnet wird, um kleine Mengen von Heißluft oder Kaltluft in die Probenkammer 80 einzulassen, wobei die Menge zugegebener Heiß- oder Kaltluft durch den Mikroprozessor und Software auf der Grundlage von Temperaturmessungen berechnet wird, die in der Probenkammer 80 kontinuierlich vorgenommen werden.
Nach erfolgter Anlagerung wird die erste Tür 90 erneut geöffnet. Luft bei 200 °C aus der Heißluftkammer 60 strömt in die Probenkammer 80, während Luft bei 54 °C aus der Probenkammer 80 in die Heißluftkammer 60 strömt. Der Nettoeffekt ist, daß die Temperatur der Luft in der Probenkammer 80 auf 78 °C oder eine andere optimale Temperatur zur Polymeraseextension des angelagerten Primers angehoben wird. Die zur Extension erforderliche Zeitdauer hängt hauptsächlich von der Länge der amplifizierten DNA, die herzustellen ist, und der Sequenz der DNA ab. Beispielsweise werden in Taq-Polymerase Nukleotidbasen mit einer Geschwindigkeit von 30 bis 80 Basen pro Sekunde eingebaut. Nach Gewähren einer ausreichenden Zeit zur Extension ist jeder Strang des ursprünglichen DNA-Doppel strangmoleküls dupliziert, und das Wärmezyklusverfahren kann normalerweise über 30 bis 50 Durchgänge wiederholt werden.
Die Konfiguration der Wärmesteuerung 40 der Erfindung ermöglicht ferner, daß Nachweisreagenzien, die in den Innenreagenskammern 22, 24 der Probenröhrchenhalter 10 oder jedes der anderen hierin beschriebenen Probenröhrchenhalter enthalten sind, während der Wärmezyklusbehandlung oder einer anderen Temperaturmanipulation kühl gehalten werden. Von Vorteil ist dies, weil bestimmte bevorzugte Nachweisreagenzien, z. B. alkalische Phosphatase oder andere Enzyme und organische Reagenzien bei hohen Temperaturen instabil sind. Vorzugsweise sollten diese Reagenzien zwecks Stabilität bei Raumtemperatur oder darunter gehalten werden. Dazu ist die Probenkammer 80 der Wärmesteuerung 40 vorzugsweise mit einer Basis 84 versehen, die in 12 gezeigt ist. Die Basis 84 ist vorzugsweise aus einem stark leitfähigen Metall hergestellt, z. B. Aluminium. Die Basis 84 ist mit Räumen 86 versehen, in denen die Probenröhrchenhalter 10 aufzunehmen sind. Während der Wärmezyklusbehandlung ruhen die Probenröhrchenhalter 10 in den Räumen 86. Außerdem ist die Basis 84 mit Rippen 88 versehen, die beim Verbessern des Kühlwirkungsgrads der Probenröhrchenhalter 10 helfen.
Die Aluminiumbasis 84 teilt die Probenkammer 80 effektiv in ein erstes Teilstück 80A und ein zweites Teilstück 80B auf. Nur das erste Teilstück 80A wird Heißluft aus der Heißluftkammer 60 ausgesetzt, wenn die Tür 90 geöffnet wird. Das zweite Teilstück 80B wird durch die abgekühlte Luft aus der Kaltluftkammer 70 stets kalt gehalten. Daher werden die Aluminiumbasis 84 und die im Probenröhrchenhalter 10 enthaltenen Nachweisreagenzien kühl gehalten, während die Probenröhrchen 23 Heißluft bei der Wärmezyklusbehandlung ausgesetzt werden.
13A und 13A' zeigen Daten, die von einer Luftwärmesteuerung 40 der Erfindung erhalten wurden. Vorzugsweise induziert die Wärmesteuerung Temperaturänderungen von 200 °C pro Sekunde im Temperaturbereich von 50 °C und 100 °C in Probenlösungen, die in Probenröhrchen 23 in der Wärmesteuerung 40 enthalten sind. Natürlich ist klar, daß die Wärmesteuerung 40 für alle gewünschten Temperaturänderungen in jedem ge wünschten Temperaturbereich sorgen kann, indem einfach die Temperaturen in der Heißluftkammer 60 und Kaltluftkammer 70 eingestellt und indem die Geschwindigkeiten reguliert werden, mit denen die erste und zweite Tür 90 und 91 geöffnet werden. 13B ist eine Aufzeichnung von Temperaturänderungen in einem Probenröhrchen 23, die durch eine Wärmesteuerung 40 der Erfindung induziert wurden, und zeigt die schnellen Wärmeübergänge, die zwischen Denaturierungs-, Anlagerungs- und Elongationstemperaturen zur Amplifikation von DNA mittels PCR erreicht werden können.
Nach Wärmezyklusbehandlung werden Amplimere durch Hybridisierungssonden eingefangen, die an die Innenflächen der Probenröhrchen 23 kovalent angelagert wurden. Diese Sonden stören die PCR-Amplifikation nicht, da alle Amplimere, die durch Sonden während des Anlagerungsschritts möglicherweise gebunden werden, durch die DNA-Polymerase während der Extensionsreaktion abgestoßen werden. Nach der abschließenden Amplifikation können die Lösungen kurz auf 130 °C erwärmt werden, um DNA-Polymeraseaktivität zu zerstören, bevor die Lösungen bei einer optimalen Anlagerungstemperatur zum Einfangen von Amplimeren durch gebundene Sonden inkubiert werden. Alternativ können die Lösungen auf Denaturierungstemperatur geführt und dann schnell auf unter 20 °C gebracht werden. Einzelsträngige DNA bildet stabile Hybriden mit Sonden bei dieser Temperatur; allerdings ist die DNA-Polymerase nicht aktiv und entfernt nicht die Ziel-DNA von ihrer Sonde oder der Wand des Probenröhrchens 23.
24 zeigt eine bevorzugte Anordnung von Probenröhrchen 23 zur Wärmezyklusbehandlung. 24 ist eine Schnittansicht eines Abgrenzbehälters 17, der eine Gruppe von Probenröhrchenhaltern 10A–H hält, waagerecht über die Mittelabschnitte der durch die Probenröhrchenhalter 10A–H gehaltenen Probenröhrchen 23. Deutlich ist, daß die Anordnung gemäß 24 für alle Ausführungsformen von Probenröhrchenhaltern der Erfindung praktikabel ist, die hierin beschrieben sind. Jede Reihe von Probenröhrchen 23, die in den Haltern 10A–H enthalten sind, ist gegenüber der anderen versetzt. Erreichen läßt sich dies durch Verwendung von Probenröhrchenhaltern 10, in denen die Probenröhrchen 23 nicht symmetriseh gehalten werden. Dadurch ist die Entfernung zwischen dem ersten Röhrchen 23A des Probenröhrchenhalters 10A und dem Ende des Abgrenzbehälters 17 kleiner als die Entfernung zwischen dem letzten Probenröhrchen 23B des Probenröhrchenhalters 10A und dem entgegengesetzten Ende des Abgrenzbehälters 17. Damit läßt sich die bevorzugte Konfiguration durch Drehen abwechselnder Probenröhrchenhalter 10 im Abgrenzbehälter 17 erreichen. Die Probenröhrchenhalter 10B, 10D, 10F und 10H sind gegenüber den Probenröhrchenhaltern 10A, 10C, 10E und 10G um 180° gedreht, so daß die Entfernungen zwischen den Probenröhrchen 23 und Probenröhrchenhatern 10A–H umgekehrt sind. Ergebnis ist, daß im Abgrenzbehälter 17 enthaltene Nachbarprobenröhrchen 23 nicht ausgerichtet sind, aber gleiche Abstände voneinander haben, was die Luftströmung um jedes Probenröhrchen 23 maximiert. Die Pfeile zeigen die Luftströmungsrichtung um die Probenröhrchen 23 in der Temperatursteuerung 40 zur Wärmezyklusbehandlung. Das Versetzen der Probenröhrchen 23 zueinander kann alternativ durch Staffelung abwechselnder Probenröhrchenhalter 10 realisiert sein (nicht gezeigt).
Zahlreiche Verfahren zum Nachweis von Zielmolekülen in einem Probenröhrchen 23 der Erfindung nach Wärmezyklusbehandlung können mit Hilfe der Vorrichtung der Erfindung zum Einsatz kommen. Ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis durch Chemilumineszenz ist in 14A–B gezeigt. Gemäß diesem Verfahren wird nach Einbringen von Nachweisreagenzien in die im Probenröhrchenhalter 10 oder in jedem der anderen hierin beschriebenen Probenröhrchenhalter gehaltenen Probenröhrchen der Probenröhrchenhalter 10 in einem Wagen 800 einer Probenlesekammer (nicht gezeigt) plaziert, in der Photonen für jedes Probenröhrchen 23 gezählt werden. Der Wagen 800 weist ein oberes Teilstück 810 und ein unteres Teilstück 820 auf. Das obere Teilstück 810 enthält einen Spiegel 830. Vorzugsweise ist der Spiegel 830 ein vorderseitig verspiegelter Parabolspiegel mit vorzugsweise 1 Inch × 0,0250 Inch Größe, um den Maßen der bevorzugten Ausführungsform des Probenröhrchenhalters 10 gemäß 1 bis 3 zu entsprechen. Das untere Teilstück 820 des Wagens 800 enthält eine Linse 840; die vorzugs weise eine konvexe oder bikonvexe Linse ist. Unter der Linse 840 am Brennpunkt der Linse 840 ist ein Detektionselement 850 einer digitalen Photovervielfacherröhre 852 angeordnet.
Der Probenröhrchenhalter 10 wird zwischen dem ersten und zweiten Teilstück 810, 820 so positioniert, daß sich ein im Probenröhrchenhalter 10 gehaltenes Probenröhrchen 23 zwischen dem Spiegel 830 und der Linse 840 gemäß 14A befindet. Danach bewegt sich der Spiegel 830 in die Position zum Ablesen der Chemilumineszenz gemäß 14B abwärts, wobei das Probenröhrchen 23 zwischen dem Spiegel 830 und der Linse 840 so angeordnet ist, daß der Spiegel 830 Chemilumineszenzlicht vom Probenröhrchen 23 in die Linse 840 reflektiert. Ist der Spiegel 830 ein Parabolspiegel 830, liegt das Probenröhrchen 23 im Brennpunkt des Parabolspiegels 830. Von der Probe im Probenröhrchen 23 emittierte Photonen werden durch den Spiegel 830 in. die Linse 840 reflektiert und auf dem Detektorelement 850 der digitalen Photovervielfacherröhre 852 fokussiert, wodurch sie gezählt werden können. Befindet sich der Wagen 800 in der Position gemäß 14B, liegen das erste und zweite Teilstück 810 und 820 so eng an, daß Außenlicht ausgeschlossen bleibt, u. a. das von benachbarten Probenröhrchen 23, so daß die erhaltenen Ablesungen ausschließlich von Licht stammen, das vom abgelesenen Probenröhrchen emittiert wird.
Nach Ablauf der ausgewählten Zeit einer Photonenzählung wird der Spiegel 830 in die Position gemäß 14A zurückgezogen. Die zum Zählen von Photonen ausgewählte Zeit hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, u. a. der erforderlichen Empfindlichkeit, den speziellen Enzymen und Substraten, die zum Einsatz kommen, und dem gewählten Meßverfahren. Normalerweise steigt die Luminanz einer Chemilumineszenzreaktion linear mit einer zur Menge von vorhandenem Enzym proportionalen Rate, bis ein Plateaubereich erreicht ist. Die Anstiegsgeschwindigkeit der Luminanz in der Anfangsperiode der linearen Zunahme kann durch periodische Messungen am Probenröhrchen 23 bestimmt werden. Die Luminanzsteigungsrate, die sich anhand dieser Messungen berechnen läßt, bekannt als "dynamische Ablesungen", stellt ein genaueres Maß für die Chemilumineszenz als Einpunktbestimmungen dar, die nach Ablauf einer festgelegten Zeitperiode vorgenommen werden.
Danach wird das nächste im Probenröhrchenhalter 10 gehaltene Probenröhrchen 23 zwischen das erste und zweite Teilstück 810 und 820 bewegt, und das Verfahren zum Ablesen von Photonen wird für dieses Probenröhrchen 23 wiederholt. Dieser Ablauf wird für jedes im Probenröhrchenhalter 10 gehaltene Probenröhrchen 23 wiederholt.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines Probenröhrchenlesers (nicht gezeigt) nutzt eine Karussellabgabevorrichtung, die bis zu 12 Probenröhrchenhalter 10 hält, die nacheinander im Wagen 800 zur Photonenzählung plaziert werden, wodurch mehrfache Ablesungen an jedem Probenröhrchen 23 vorgenommen werden können. Normalerweise sind 5 Sekunden für jedes Probenröhrchen 23 zur Photonenzählung erforderlich.
25 ist eine schematische Darstellung einer weiteren bevorzugten Einrichtung zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Stoffen durch Fluorimetrie in einem Probenröhrchen 23. Ein fragmentarischer Schnitt des Probenröhrchens 23 ist vor einem Hintergrund des Probenröhrchenhalters 10 gezeigt. Vorgesehen ist ein langgestreckter Spiegel 180, der eine Einrichtung zum Bewegen (nicht gezeigt) in den durch ein Probenröhrchen 23 umgebenen Raum und eine Einrichtung zum eigenen Anordnen (nicht gezeigt) im Hinblick auf ein Probenröhrchen 23 hat, so daß das Probenröhrchen 23 zwischen dem Spiegel 180 und einer Linse 186 plaziert ist. Vorzugsweise hat der Spiegel 180 die Krümmung einer Parabel. ist er ein Parabolspiegel, wird der Spiegel 180 so bewegt, daß das Probenröhrchen 23 im Brennpunkt der Parabel liegt. Fluoreszierende Stoffe, die in einem Probenröhrchen 23 vorhanden sein können, können durch Beleuchten des Probenröhrchens 23 mit Stimulationslicht 184 aus einer Lichtquelle 181, vorzugsweise einem Laser, detektiert werden. Fluoreszenzemission, dargestellt durch Radiallinien "L" um das Probenröhrchen 23, wird auf kollimierte Weise 185 durch den Spiegel 180 in die Linse 186 reflektiert, die das Licht 184 in das Detektorelement 183 fokussiert, wo Messungen durchgeführt werden.
Deutlich wird sein, daß zahlreiche Nachweismöglichkeiten mit Hilfe der Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung möglich sind. Beispielsweise können Abwandlungen der Anordnung von 25 ohne Laser 181 verwendet werden, um Szintillationsemission oder Chemilumineszenz zu messen oder um die Lichtabsorptionsmenge bei einer speziellen Wellenlänge durch eine Lösung im Probenröhrchen 23 zu messen.
Im folgenden wird ein weiteres Beispiel für den Chemilumineszenznachweis von DNA-Zielmolekülen nach PCR-Amplifikation in einem Probenröhrchen der Erfindung beschrieben. In diesem Fall werden Primer in doppelsträngige DNA während der PCR-Amplifikation eingebaut. Die DNA-Primer sind 5'-markiert mit Biotin, Digoxigenin oder einer anderen Markierung. Doppelsträngige DNA wird denaturiert, um Einzelstränge von DNA zu erhalten, die dann mit Hilfe von Hybridisierungssonden eingefangen werden können, die eine Komplementärsequenz zu einem Innenabschnitt der amplifizierten Produktsequenz haben.
Nach Wärmezyklusbehandlung und Anlagerung von Amplimeren an den Innenflächen von Probenröhrchen werden die beiden Lösungen, die im Probenröhrchenhalter gespeichert sind, nacheinander verwendet. Zuerst werden alle ungebundenen Moleküle aus dem Probenröhrchen durch eine Lösung ausgewaschen, die alkalische Phosphatase in Konjugation mit Streptavidin enthält, wenn biotinylierte Primer verwendet wurden, oder mit Anti-Digoxigeninantikörper, wenn die Primer mit Digoxigenin markiert waren. Natürlich wird dem Fachmann klar sein, daß Nachweisenzyme auf anderem Weg an Amplimeren angelagert sein können, z. B. Enzym-Antikörper-Konjugate mit Primern, die mit vielfältigen Epitopmolekülen markiert sind, oder durch Verwendung komplementärer Paare von DNA- oder RNA-Molekülen. Danach wird ungebundenes Enzym mit Hilfe einer Lösung ausgewaschen, die Dioxetan oder ein anderes Chemilumineszenzsubstrat enthält, und es erfolgen Messungen der Chemilumineszenz, die durch die katalytische Wechselwirkung des Substrats mit dem oberflächengebundenen Enzym erzeugt wird. Nach den Ablesungen wird der Probenröhrchenhalter entsorgt, ohne geöffnete Probenröhrchen zu haben oder die Umgebung amplifizierten DNA-Produkten auszusetzen.
Als weiteres Beispiel kann auch ein fluorometrischer Nachweis von DNA-Zielmolekülen nach PCR-Amplifikation in einem Probenröhrchen der Erfindung mit Hilfe der Vorrichtung der Erfindung zum Einsatz kommen. In diesem Fall werden mit Fluoreszenzanhängen oder mit Seltenerde-Chelatbildnergruppen markierte Primer in doppelsträngige DNA während der PCR-Amplifikation eingebaut. Doppelsträngige DNA wird denaturiert, um Einzelstränge von DNA zu erhalten, die dann mit DNA-Proben eingefangen werden können, die eine Komplementärsequenz zu einem Innenabschnitt der amplifizierten Produktsequenz haben.
Nach Wärmezyklusbehandlung wird amplifizierte DNA durch die glasgebundenen Sonden eingefangen. Nur jene amplifizierten Produkte, die mit den Sonden hybridisieren, werden detektiert. Eine Waschlösung kann Eu +++ oder Sm +++ enthalten, wenn Chelatbildnergruppen verwendet wurden, die in einer der Reagenskammern im Probenröhrchenhalter gespeichert ist und dann verwendet wird, alle ungebundenen Moleküle in eine evakuierte Kammer im Probenröhrchenhalter auszuwaschen, bevor Amplimere durch Fluoreszenz oder durch zeitaufgelöste Fluorimetrie quantifiziert werden.
Als weiteres Beispiel kann auch ³²p-Markierung zum Nachweis von DNA-Zielmolekülen nach PCR-Amplifikation in einem Probenröhrchen der Erfindung mit Hilfe der Vorrichtung der Erfindung verwendet werden. In diesem Fall erfolgt die PCR mit Hilfe eines ³²p dNTP, z. B. α³²p Thymidin-5'-triphosphat, was in doppelsträngige DNA während der PCR-Amplifikation eingebaut wird. Nach Wärmezyklusbehandlung wird amplifizierte DNA mit eingebautem ³²p mit Sonden hybridisiert. Nachgewiesen werden nur jene amplifizierten Produkte, die mit den Sonden hybridisieren. Danach wird Szintillationslösung, die in einer Kammer im Probenröhrchenhalter gespeichert ist, zum Auswaschen aller ungebundenen Moleküle und zum Nachweis eingefangener Produkte in den Probenröhrchen verwendet. Messungen werden an jedem Röhrchen mit einem quantitativen Photonenzähler durchgeführt. Danach können amplifizierte Produkte anhand einer Standardkurve quantifiziert werden. Nach Durchführung der Ablesungen wird der Probenröhrchenhalter entsorgt, ohne geöffnete Probenröhrchen zu haben oder die Umgebung amplifizierten DNA-Produkten auszusetzen.
Als weiteres Beispiel kann auch der Nachweis von Zielmolekülen in einem Probenröhrchen der Erfindung mit Hilfe monoklonaler Antikörper unter Verwendung der Vorrichtung der Erfindung erfolgen. In diesem Fall werden monoklonale Antikörper, die den zu messenden Stoff erkennen, zuerst an den Innenflächen der Probenröhrchen chemisch angelagert, bevor die Probenröhrchen im Probenröhrchenhalter zusammengestellt werden. Probenlösungen, die unbekannte Mengen von Zielmolekülen enthalten, werden durch die in ihren Probenröhrchenhaltern gehaltenen Probenröhrchen geführt. Danach werden die Probenröhrchenhalter in einem Leser verarbeitet, der ungebundene Moleküle auswäscht und gebundene Zielmoleküle mit einem Nachweisreagens zur Reaktion bringt, z. B. alkalischer Phosphatase in Konjugation mit einem zweiten Antikörper, der das Target erkennt. Anschließend wird ungebundenes Enzym durch eine das Substrat enthaltende Lösung ausgewaschen, und das Röhrchen wird abgedichtet und abgelesen.
Nach Anlagerung von Zielmolekülen an den Innenflächen von Probenröhrchen können eine oder zwei Lösungen, die in Kammern in den Probenröhrchenhaltern gespeichert sind, in Abhängigkeit vom zu verwendenden Nachweisverfahren nacheinander zum Einsatz kommen. Probenröhrchen, die andere gebundene Zielmoleküle als DNA oder RNA enthalten, können in derselben Instrumentierung automatisch verarbeitet werden, die zum Verarbeiten von Proben nach der PCR-Reaktion verwendet wird. Dieses Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit pathogener Organismen kann bevorzugt sein, da die Quantifizierung erfolgt, ohne daß die Probenröhrchen geöffnet werden oder die Umgebung den Röhrcheninhalten ausgesetzt wird. Nach Quantifizierung können der Probenröhrchenhalter und die abgedichteten Probenröhrchen, die infektiöse Substanzen enthalten können, sicher entsorgt werden.
15 zeigt eine weitere Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters 400, der zahlreiche Probenröhrchen 423 enthalten kann. Die Probenröhrchen 423 überspannen die Breite des Rahmenteils 410 des Probenröhrchenhalters 400 und sind mit dem Rahmenteil 410 abgedichtet verbunden. Enden 428, 429 der Probenröhrchen 423 sind durch eine Innenverrohrung 444 (in 15 mit Strichlinien gezeigt) mit ersten, zweiten und dritten Anschlüssen 421, 422 und 424 verbunden, die im Probenröhrchenhalter 400 gebildet sind. Die ersten und zweiten Anschlüsse 421 und 422 stellen Verbindungswege zwischen den Probenröhrchenhaltern 423 und der Atmosphäre bereit, während die dritten Anschlüsse 424 Verbindungswege zwischen den Probenröhrchen 423 und einem evakuierten Raum 450 eines Hohlblocks 430 vorsehen.
17 ist eine Schnittansicht an der Linie 17–17 von 15. 17 zeigt die Innenverbindungen zwischen dem Probenröhrchen 423 und den Anschlüssen 421, 422. Elastomerröhrchenhalter 439 bilden eine Einrichtung zum Abdichten zwischen dem Probenröhrchen 423 und Rahmenteil 410.
Die Stirnfläche jedes Anschlusses 421, 422, 424 ist durch ein Elastomerkissen 431, 441, 425 abgedichtet, das durch einen Haltefederbügel 432 auf eine Anschlußstirnfläche gepreßt wird. Vorzugsweise ist der Federbügel 432 entlang seinem Außenumfang mit scharfen Kanten ausgebildet, damit er in die Anschlüsse 421, 422 und 424 so gedrückt werden kann, daß sich seine Kanten in die Wände der Anschlüsse 421, 422 und 424 graben, was verhindert, daß der Federbügel 432 aus dem Anschluß 421, 422 und 424 austritt. Der Mittelabschnitt des Federbügels 432 ist vorzugsweise zu einem Loch in der Mitte des Federbügels 432 verjüngt. Diese Verjüngung bildet eine Einrichtung für den Federbügel 432, um eine Nadel (nicht gezeigt) zu führen, die möglicherweise nicht zur Mitte des Dichtungskissens 431, 441, 425 ausgerichtet ist, bevor die Nadel in das Dichtungskissen 431, 441, 425 eintritt.
Gemäß 15 und 16 steht der evakuierte Hohlblock 430 im Gleiteingriff mit dem Rahmenteil 410 mittels Bolzen 443, die mit zylindrischen Aussparungen 427 zusammenwirken. Die Bolzen 443 stehen von der Seite des evakuierten Blocks 430 vor, die zum Rahmenteil 410 weist. Die zylindrischen Aussparungen 427 sind in der Seite des Rahmenteils 410 gebildet, die zum evakuierten Block 430 weist und gegenüber den Anschlüssen 422 liegt. Die zylindrischen Aussparungen 427 sind so gebildet, daß sie die Bolzen 443 des evakuierten Blocks 430 aufnehmen, wenn der evakuierte Block 430 an das Rahmenteil 410 gedrückt wird.
Die Bolzen 443 tragen Hohlnadeln 426 in ihrem Inneren und entlang ihrer Mittelachsen, was 16 zeigt. Die Hohlnadeln 426 kommunizieren mit Innenräumen 450 des evakuierten Blocks 430, indem sie in eine Innenwand 428 des evakuierten Blocks 430 an einem Punkt 445 eintreten. Spitzen 457 der Hohlnadeln 426 sind durch Elastomerdichtungen 456 bedeckt, die Vakuumverlust aus den Innenräumen 450 verhindern.
Durch Druckkraftausübung zwischen dem Block 430 und Rahmen 410 werden die Bolzen 443 in die Aussparungen 427 gedrückt. Die Bolzen 443 können sich in die Aussparungen 427 bewegen, bis die oberen Außenflächen der Dichtungen 456 die Kissen 425 berühren. Infolge von weiterer Bewegung durch die Bolzen 443 durchstechen die Nadelspitzen 457 die Dichtungen 456 und treten in die Kissen 425 ein. Weitere Bewegung durch die Bolzen 443 bewirkt, daß die nunmehr nicht abgedichteten Hohlnadelspitzen 457 die Kissen 425 völlig durchdringen, was eine Möglichkeit für Fluid schafft, sich zwischen dem Probenröhrchen 423 und dem evakuierten Raum 450 im Block 430 zu bewegen.
Ein Ringraum 458 ist im Ende jedes Bolzens 443 gebildet, um einen Aufenthaltsort für die durchstochene Dichtung 456 vorzusehen, nachdem der Bolzen 443 maximal in das Kissen 425 geschoben wurde. Der Hohlblock 430 ist an einem Ende mit einem Elastomerdichtnippel 442 abgedichtet, der durch einen Federbügel (nicht gezeigt) so festgehalten wird, wie die Anschlüsse 421 und 422 durch die Federbügel 432 abgedichtet sind. Der Abdichtnippel 442 ist so ausgebildet, daß durch atmosphärischen Druck der Mittelabschnitt unter die Höhe des Federbügels herabgedrückt wird, nachdem der Block 430 evakuiert wurde. Durch Vakuumverlust kann die Elastizität des Elastomers die Partialdruckdifferenz zwischen einem teilweise evakuierten Raum 450 und der Atmosphäre überwinden, wodurch der Nippel 442 in eine neue Zwischenkonfiguration "vorspringt", was eine Möglichkeit zum Detektieren von Vakuumverlust im Block 430 schafft.
18 ist eine Schnittansicht an der Linie 17–17 von 15, die eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung veranschaulicht, in der Variationen des Verrohrungsdurchmessers zwischen dem Anschluß 422 und dem Probenröhrchen 423 vorliegen. Die dargestellte Ausführungsform enthält ein Filterelement 435, um Komponenten zu einer zu analysierenden Probenlösung zuzugeben oder daraus zu entfernen. Zum Beispiel können Detergensentfernungsperlen eingebaut sein, um selektiv Detergenzien aus Proben zu adsorbieren, die aus Geweben stammen, bevor eine Wärmezyklusbehandlung in einer der so gebildeten Kammern erfolgt. Klar wird sein, daß die Variationen des Verrohrungsdurchmessers, zu denen auch die Bereitstellung zusätzlicher Anschlüsse oder der Gebrauch von Einwegventilen gehören können, die jeweils unterschiedliche Nutzeffekte ergeben können, möglich sind und daß solche Variationen im Schutzumfang der Erfindung liegen. Daher beschränkt die Ausführungsform von 18 keineswegs die Art von Verrohrungsanordnungen, die zum Einsatz kommen können.
Bevor eine Probe in das Probenröhrchen 423 injiziert wird, durchdringt eine Spritzeneinrichtung (nicht gezeigt) die Dichtung 431 des Anschlusses 422 und evakuiert das Probenröhrchen 423. Danach kann eine Probe in das Probenröhrchen 423 durch den Anschluß 421 injiziert werden, gefolgt von einem ausreichenden Luftvolumen, um die Probe vollständig aus einer Verrohrung 419 zwischen dem Anschluß 421 und seiner Verbindung 433 mit der Verrohrung zwischen dem Anschluß 422 und dem Probenröhrchen 423 zu drücken. Die Probe vom Anschluß 422 wird dann vollständig in das Probenröhrchen 423 mittels einer Injektion eines Gases oder einer Flüssigkeit oder einer Kombination aus beiden gedrückt. Ein abschließendes Volumen einer Sperrflüssigkeit wird vom Anschluß 422 injiziert, das so berechnet ist, daß es eine erste Kammer 434 füllt, deren Volumen größer als das einer zweiten Kammer 436 ist.
Nach Durchführung der Wärmezyklusbehandlung oder einer anderen Behandlung kann eine Spritzeneinrichtung (nicht gezeigt) die Dichtung des Anschlusses 422 durchdringen und ausreichende Sperrflüssigkeit aus der. ersten Kammer 434 entnehmen, damit die gesamte Probe im Probenröhrchen 423 in die zweite Kammer 436 gesaugt wird, um Reagenzien oder Perlen 435 mit angelagerten Reagenzien ausgesetzt zu werden. Nach Inkubation kann die Probenmischung zum Probenröhrchen 423 zur weiteren Wärmezyklusbehandlung oder einer anderen Behandlung durch Rückinjizieren der Sperrflüssigkeit zurückgeführt werden. Alternativ kann der evakuierte Block 430 an den Rahmen 410 gepreßt werden, damit das Probenröhrchen 423 evakuiert wird. Zu beachten ist, daß die Zeichnungen zur Veranschaulichung dienen und nicht maßstäblich sind. Die Volumina der zu verwendenden Verrohrungskammern variieren in der Praxis normalerweise von 2 bis 20 Mikrolitern.
19A–C sind Schnittansichten einer Ausführungsform einer Röhrchenenddichtung 95 und eines Probenröhrchens 23, das eine Probe enthält und mit jeder der Ausführungsformen des Molekularanalysators der Erfindung verwendet werden kann. Das Probenröhrchen 23 kann ein Kapillarröhrchen sein. In dieser Ausführungsform weist ein Innenhohlraum 96 der Röhrchenenddichtung 95 einen ersten Abschnitt 96A und einen zweiten Abschnitt 96B auf. Der erste Abschnitt 96A des Innenhohlraums 96 paßt sich eng und abdichtend über das Ende des Probenröhrchens 23 auf. Der zweite Abschnitt 96B des Innenhohlraums 96 bildet einen Raum für den Eintritt einer Hohlnadel 31, damit Stoffe in das Probenröhrchen 23 injiziert oder daraus entnommen werden können.
19B ist eine Schnittansicht eines Probenröhrchens 23, das in eine Röhrchenenddichtung 95 eingesetzt wurde. Das Probenröhrchen 23 ist in den ersten Abschnitt 96A des Innenhohlraums 96 eingepaßt. Die Hohlnadel 31, die in die Röhrchenenddichtung 95 rechtwinklig zur Mittelachse des Probenröhrchens 23 eingetreten ist, kann Stoffe aus dem Probenröhrchen 23 entfernen oder ihm zugeben.
19C ist eine Schnittansicht der Röhrchenenddichtung 95 und des Probenröhrchens 23 und zeigt die Hohlnadel 31, die in die Röhrchenenddichtung 95 entlang der Mittelachse des Probenröhrchens 23 eingetreten ist und Stoffe aus den Probenröhrchen 23 entfernen oder ihm zugeben kann.
20 ist eine weitere Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters 500, der 12 Probenröhrchen 523, die durch E lastomer-Enddichtungen 581 abgedichtet sind, und einen umspannenden Rahmen 530 enthält. Der Rahmen 530 kann mit zwei Türen 529 versehen sein, die die Elastomer-Enddichtungen 581 im Rahmen 530 halten. 20 zeigt eine solche Tür 529 auf der linken Seite des Rahmens 530. Die Tür 529 auf der rechten Seite des Rahmens 530 ist in 20 nicht gezeigt, damit die Enddichtungen 581 dargestellt werden können. Eine evakuierte Abfallkammer 508 und eine Reagenskammer 509 sind mit dem Rahmen 530 des Probenröhrchenhalters 500 auf der linken bzw. rechten Seite verbunden. Die evakuierte Abfallkammer 508 und die Reagenskammer 509 können auf ähnliche Weise wie in der Beschreibung anhand von 15 im Gleiteingriff mit dem Rahmenteil 530 stehen.
21 ist eine Schnittansicht allgemein an der Linie 21-21 von 20 und zeigt Innenverbindungen zwischen der evakuierten Abfallkammer 508, Nadeln 531, Röhrchenenddichtungen 581, dem Probenröhrchen 523 und der Reagenskammer 509. Das Rahmenteil 530 kann mit einem oder mehreren in ihm gebildeten zerbrechlich abgedichteten Probenladeanschlüssen 546 versehen sein, die als Nadelführungen dienen können, um das Einbringen von Stoffen in die Probenröhrchen 523 zu ermöglichen, z. B. unter Verwendung einer Spritze und Nadel gemäß 19B. Normalerweise ist die gleiche Anzahl von Löchern 546 im Rahmenteil 530 vorgesehen wie Probenröhrchen 523 vorhanden sind. Die Löcher 546 sind nur auf der Seite des Rahmenteils 530 vorgesehen, die zur Reagenskammer 509 benachbart ist.
Die Reagenskammer 509 ist mit Reagensladeanschlüssen 542 versehen, die mit zerbrechlichen Dichtungen 543 versehen sind. Normalerweise sind genauso viele Reagensladeanschlüsse 542, die in der Reagenskammer 509 vorgesehen sind, wie Probenröhrchen 523 vorhanden. Die Reagensladeanschlüsse 542 sorgen für Zugang zu einem Raum 544 und anschließend in die Probenröhrchen 523 zum aufeinanderfolgenden Laden der Reagenzien, die zur Durchführung der gewünschten Analyse notwendig sind.
Durch Zusammenwirken zwischen der Reagenskammer 509, dem Rahmenteil 530 und der evakuierten Abfallkammer 508 kommt es zu einer Fluidverbindung, die herzustellen ist und für im Raum 544 vorhandene Lösungen dient, damit sie die Möglichkeit haben, durch das Probenröhrchen 523 in den evakuierten Abfallkammerraum 545 zu strömen, was anhand anderer Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurde.
Wie Teilansichten in 22A und 22B zeigen, kann eine weitere Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters 600 der Erfindung zahlreiche Probenröhrchen 623 enthalten. Der Probenröhrchenhalter 600 ist mit zwei Elastomerteilen 610 und 620 versehen, die zusammen beide Enden eines oder mehrerer zwischen ihnen gehaltener Probenröhrchen 623 gemäß 22C abdichten. Gemäß 22B können die Innenhohlräume 696, die im Probenröhrchenhalter 600 gebildet sind, Ringwülste 619 enthalten, die den Eindringgrad des Probenröhrchens 623 begrenzen, um so einen zweiten Abschnitt 696B des Hohlraums 696 hinter dem Probenröhrchen 623 ähnlich wie beim Hohlraum 96 gemäß 19A–C vorzusehen. Der zweite Abschnitt 696B und der Hohlraum 696 können beim Bereitstellen des Zugangs zu einem Probenröhrchen 623 mittels der Hohlnadel 31 gemäß 19B und 19C nützlich sein.
Löcher 625 sind im Elastomerteil 610 zum Aufnehmen der Probenröhrchen 623 vorgesehen. Schlitze 626 können ebenfalls im Elastomerteil 610 über und unter den Löchern 625 im Abstand von 180° an einem Durchmesser der Löcher 625 gebildet sein. Die Schlitze 626 ermöglichen eine Kommunikation zwischen der Außenluft und dem Inneren eines im Elastomerteil 610 gehaltenen Probenröhrchens 623, wenn ein solches Probenröhrchen 623 nicht über die Tiefe hinaus eingesetzt ist, die durch den Schlitz 626 erreicht wird. Auf diese Weise kann eine Gruppe von Probenröhrchen 626 mit einer flüssigen Testprobe gleichzeitig durch Kapillarwirkung gefüllt werden.
Nach dem Füllen der Probenröhrchen 623 kann das zweite Elastomerteil 620 über den Enden der gefüllten Probenröhrchen 623 planiert werden, und beide Elastomerteile 610 und 620 können zusammengeschoben werden, um beide Enden der gefüllten Probenröhrchen 623 abzudichten, was 22C zeigt. Diese Konfiguration ermöglicht auch einen leichten Zugang zu den Inhalten der Probenröhrchen 623 an einem späteren Punkt.
23 zeigt eine Ausführungsform eines Probenröhrchenhalters 700, der zahlreiche Probenröhrchen 723 hält. In dieser Ausführungsform sind die Probenröhrchen 723 in einem Rahmenteil 705 des Probenröhrchenhalters 705 durch Elastomerröhrchenhalter 729 auf ähnliche Weise wie in 6A und 6B abgedichtet. Das Rahmenteil 705 kann mit Türen 783 versehen sein, um die Elastomerröhrchenhalter 729 zu befestigen. Die Türen 783 sind am Rahmenteil 705 durch Scharniere 721 angebracht, mit denen die Türen 783 geöffnet werden können. Die Tür 783, die auf der linken Seite des Rahmenteils 705 liegt, ist in der offenen Position in 23 gezeigt. Löcher 787, 788 können in den Türen 783 oder in der Seite des Rahmenteils 705 gebildet sein, um Nadeln (nicht gezeigt) für die Zugabe oder Entfernung von Reagenzien oder Probenlösungen in die Probenröhrchen 723 oder aus ihnen zu führen.
26 ist eine schematische Darstellung, die eine Anordnung von Komponentenvorrichtungen zeigt, die zusammenwirken können, um eine Ausführungsform einer vollständigen Vorrichtung der Erfindung bereitzustellen, um für automatisierte PCR-Analyse zu sorgen. Ein Bahnmechanismus 270, auf dem ein Roboterarm (nicht gezeigt) fahren kann, sorgt für Zugang zu einem Pipettenspitzen-Anbauwerkzeug 271 und Reagenskolben 272. Das Werkzeug 271 wird durch den Roboterarm verwendet, um Pipettenspitzen oder Einweg-Mikrospritzen (nicht gezeigt) abgedichtet zu ergreifen und zu entsorgen. Ein Förderband 273 bildet eine Einrichtung zum Transportieren einer Plattform 274, die Schalen für Pipettenspitzen oder Einweg-Mikrospritzen (nicht gezeigt) zur Verwendung durch den Roboterarm tragen kann. Ein zweites Förderband 275 transportiert eine Plattform 276, die Probenlösungen in Vertiefungen tragen kann, die in einer Probenplatte (nicht gezeigt) gebildet sind. Ein Transportmechanismus 277 bildet eine Einrichtung zum Bewegen einzelner Gruppen von Probenröhrchen 23, die in erfindungsgemäßen elastomeren oder starren Röhrchenhaltern 278 gehalten werden, wobei er solche Probenröhrchen 23 in die Position zum Zugang durch den Roboterarm bewegt, so daß die Probenröhrchen 23 mit Proben beladen werden können.
Gruppen von Probenröhrchen 23 können in einem Lager 279 gelagert sein, von wo aus sie zum Transportmechanismus 277 abgegeben werden. Alternativ kann eine kontinuierliche Rolle mit Probenröhrchen gemäß 9A verwendet werden. Das Laden der Probenröhrchen 23 kann ein Zusammenwirken mit einer Nadeleinrichtung 280 beinhalten, die an einem Spritzenpumpmechanismus oder einer Vakuumquelle angeschlossen ist. Werden einzelne Gruppen von Probenröhrchen 23 verwendet, wird nach Laden einer Gruppe diese durch den Transportmechanismus 277 zu einem Gestell 281 transportiert. Eine zweite Gruppe von Probenröhrchen 23 wird dann durch den Roboterarm geladen und anschließend zu 281 transportiert. Ist das Gestell mit Gruppen von Probenröhrchen 23 gefüllt, bewegt der Transportmechanismus 277 das beladene Gestell 281 in eine Wärmesteuerung 282, die eine Einrichtung zum Organisieren der Probenröhrchen 23 in einer gestaffelten Konfiguration gemäß 24 vor der Wärmezyklusbehandlung vorsieht.
Nach Abschluß der Wärmezyklusbehandlung werden die Probenröhrchen 23 in ein Nachweismodul 283 transportiert. Bei Verwendung von Probenröhrchenhaltern mit Nachweisreagenzien, z. B. den in 1, 7 oder 9 gezeigten, ist das Nachweismodul 283 mit einer Einrichtung zum Freigeben dieser Reagenzien in die Probenröhrchen 23 versehen. Bei Verwendung einer Ausführungsform von Probenröhrchenhaltern wie die in 15 gezeigte ist das Nachweismodul 283 mit Nadeleinrichtungen zum Einleiten von Reagenzien in die Probenröhrchen 23 und Einrichtungen zum Zusammendrücken der evakuierten Abfallkammer mit dem Probenröhrchenhalter versehen, bevor eine Gruppe von Probenröhrchen 23 in das Nachweismodul 283 transportiert wird, das mit einer Einrichtung zum Nachweisen von Reaktionsprodukten versehen ist, wobei z. B. eine der zuvor beschriebenen Nachweiseinrichtungen verwendet wird.
Somit ist deutlich, daß ein Molekularanalysator mit hoher Kapazität und ein Verwendungsverfahren bereitgestellt werden, die spezifische Moleküle oder spezifische Bestandteile von Molekülen in einer Probe nachweisen können und weniger kostspielig, weniger arbeitsintensiv sind und die Kontamination von Laborumgebungsbedingungen vermeiden. Verständlich wird sein, daß die vorstehende Beschreibung lediglich zur Veranschaulichung der Grundsätze der Erfindung dient und daß verschiedene Abwandlungen vom Fachmann vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang und Grundgedanken der Erfindung abzuweichen. Die beschriebenen Ausführungsformen dienen zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung, und die Erfindung ist nur durch die nachfolgenden Ansprüche beschränkt.

Claims

Molekularanalysator zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zielmolekülen in einer Testprobe, der einen Probenröhrchenhalter (10) mit mindestens einem Proben enthaltenden Probenröhrchen (23) aufweist, wobei eine Einrichtung zum Erwärmen und Abkühlen des Probenröhrchenhalters (10) vorgesehen ist, wodurch die Vorrichtung Proben zyklisch erwärmen und abkühlen kann; dadurch gekennzeichnet, daß der Probenröhrchenhalter einen Rahmen (11) mit entgegengesetzt angeordneten Seiten hat, wobei jede der gegenüberliegenden Seiten des Rahmens (11) mindestens einen Hohlraum aufweist, der mit einem Innenvolumen der Probe kommuniziert; der Molekularanalysator eine Einrichtung zum Steuern der Temperatur der Testprobe aufweist, so daß die Zielmoleküle an eine Innenfläche des mindestens einen Probenröhrchens (23) spezifisch gebunden werden und andere Moleküle in der Testprobe ungebunden sind; der Analysator eine Einrichtung zum Durchführen mindestens eines Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen (23) aufweist, so daß die ungebundenen Moleküle ausgewaschen werden; und der Molekularanalysator eine Einrichtung zum Messen der Menge der Zielmoleküle aufweist.
Molekularanalysator nach Anspruch 1 mit einem starren Rahmen, wobei: der Probenröhrchenhalter ferner Elastomerteile aufweist, die an den starren Rahmen angepaßt sind und in enger Verbindung mit ihm gehalten werden, und wobei das mindestens eine Probenröhrchen zwischen den Elastomerteilen abgedichtet gehalten wird; der mindestens eine Hohlraum einer der gegenüberliegenden Seiten des Rahmens mit einem Nachweisreagens gefüllt ist; eine Fülleinrichtung mindestens einen Anschluß aufweist, der in einem der Elastomerteile vorgesehen ist, wobei der mindestens eine Anschluß für abdichtbaren Zugang für eine Testprobe sorgt, die in das mindestens eine Probenröhrchen einzubringen ist; der andere der gegenüberliegenden Hohlräume eine evakuierte Kammer bildet, die innerhalb einer weiteren der Seiten des Rahmens enthalten ist und in Kommunikation mit dem mindestens einen Probenröhrchen steht; und die Einrichtung zum Durchführen des Nachweisreagens eine Einrichtung zum Blockieren und Freigeben mindestens einer Innenleitung aufweist, die zwischen dem Hohlraum mit dem Nachweisreagens und dem Probenröhrchen vorgesehen ist, so daß im blockierten Zustand der mindestens einen Innenleitung keine Kommunikation zwischen dem Hohlraum und dem Probenröhrchen erfolgt und im freigegebenen Zustand der mindestens einen Innenleitung Kommunikation zwischen dem Hohlraum und dem Probenröhrchen erfolgt, wodurch das Nachweisreagens durch die mindestens eine Innenleitung, das mindestens eine Probenröhrchen und in die evakuierte Kammer fließen kann.
Molekularanalysator nach Anspruch 2, wobei der mindestens eine Anschluß eine Öffnung und ein Paar Lippen aufweist, wobei die Öffnung so geformt ist, daß sie eine mit der Testprobe gefüllte Fülleinrichtung aufnimmt, und die Lippen so geformt sind, daß sie eine Dichtung zwischen mindestens einem Innenhohlraum, der in dem einen der Elastomerteile hinter dem mindestens einen Probenröhrchen gebildet ist, und der Atmosphäre vor dem Befüllen des mindestens einen Innenhohlraums mit der Testprobe bilden.
Molekularanalysator nach Anspruch 1, wobei der Rahmen zwei Paar gegenüberliegende Seiten aufweist und mit mindestens einem Paar Innenhohlräumen versehen ist, die in jeder von einer des Paars gegenüberliegenden Seiten des Rahmens gebildet sind, und mindestens ein Probenröhrchen ein Innenvolumen hat, das in Kommunikation mit jedem des mindestens einen Paar Innenhohlräume steht, wobei: das mindestens eine Probenröhrchen zwischen einem der Paare gegenüberliegender Seiten des Rahmens abgedichtet gehalten wird; mindestens ein Paar Öffnungen vorgesehen ist, wobei jede des Paars Öffnungen in jeder von einer des Paars gegenüberliegender Seiten des Rahmens vorgesehen ist, wobei das mindestens eine Paar Öffnungen für abdichtbaren Zugang zu dem mindestens einen Paar Innenhohlräumen sorgt; eine Einrichtung zum Befüllen des mindestens einen Probenröhrchens mit einer Testprobe so angepaßt ist, daß die Testprobe in eine des mindestens einen Paars Öffnungen eingebracht wird und in das mindestens eine Probenröhrchen fließt; und die Einrichtung zum Durchführen mindestens eines Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen so angepaßt ist, daß das mindestens eine Nachweisreagens in eine des mindestens einen Paars Öffnungen eingebracht wird, durch das mindestens eine Probenröhrchen fließt und aus der anderen des mindestens einen Paars Öffnungen entfernt wird.
Molekularanalysator nach Anspruch 4, wobei der Rahmen ein Elastomermaterial aufweist.
Molekularanalysator nach Anspruch 4 oder 5, wobei das mindestens eine Paar Öffnungen ferner ein Paar Lippen aufweist, die so geformt sind, daß sie für eine Dichtung zwischen dem mindestens einen Paar Innenhohlräumen und der Atmosphäre vor dem Füllen der Testprobe in das mindestens eine Probenröhrchen sorgen.
Molekularanalysator nach Anspruch 1 mit einem Probenröhrchenhalter, der einen starren Rahmen aufweist, der mit entgegengesetzt angeordneten Vertiefungen versehen ist, wobei: die Vertiefungen ein Paar Elastomerstreifen aufnehmen; das mindestens eine Probenröhrchen zwischen den Elastomerstreifen abgedichtet gehalten wird, wobei die Elastomerstreifen und das mindestens eine Probenröhrchen vom Rahmen zusammen entfernbar sind; mindestens ein Hohlraum innerhalb eines der Elastomerteile auf einer der gegenüberliegenden Seiten des Rahmens gebildet und hinter jedem des mindestens einen Probenröhrchens angeordnet ist; mindestens ein Paar Öffnungen vorgesehen ist, wobei jede des Paars Öffnungen in jedem von einem des Paars Elastomerstreifen vorgesehen ist, wobei das mindestens eine Paar Öffnungen für abdichtbaren Zugang zu den Innenhohlräumen sorgt; die Einrichtung zum Befüllen des mindestens einen Probenröhrchens mit einer Testprobe so angepaßt ist, daß die Testprobe in eine des mindestens einen Paars Öffnungen eingebracht wird und in das mindestens eine Probenröhrchen fließt; und die Einrichtung zum Durchführen mindestens eines Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen so angepaßt ist, daß das mindestens eine Nachweisreagens in eine des mindestens einen Paars Öffnungen eingebracht wird, durch das mindestens eine Probenröhrchen fließt und aus der anderen des mindestens einen Paars Öffnungen entfernt wird.
Molekularanalysator nach Anspruch 1 mit einem Probenröhrchenhalter, der einen starren Rahmen aufweist, wobei: der Probenröhrchenhalter ferner mit einem Paar entgegengesetzt angeordneter Elastomerstreifen versehen ist und das mindestens eine Probenröhrchen zwischen den Elastomerstreifen abgedichtet gehalten wird; der mindestens eine Hohlraum einer der gegenüberliegenden Seiten des Rahmens mit einem Nachweisreagens gefüllt ist, wobei der mindestens eine Hohlraum im Inneren eines der Elastomerstreifen enthalten ist; die Fülleinrichtung mindestens einen Anschluß aufweist, der in einem der Elastomerstreifen vorgesehen ist, wobei der mindestens eine Anschluß für abdichtbaren Zugang für eine Testprobe sorgt, die in das mindestens eine Probenröhrchen einzubringen ist; der andere der gegenüberliegenden Hohlräume eine evakuierte Kammer bildet, die innerhalb eines weiteren der Elastomerstreifen angeordnet ist; und die Einrichtung zum Durchführen des Nachweisreagens eine Einrichtung zum Bilden eines Wegs zwischen dem mindestens einen Hohlraum und der evakuierten Kammer aufweist, wodurch das Nachweisreagens aus dem Innenreagenshohlraum durch das mindestens eine Probenröhrchen und in die evakuierte Kammer fließt.
Molekularanalysator nach Anspruch 8, wobei die Einrichtung zum Bilden eines Wegs aufweist: eine erste Hohlnadel, die in einem der Elastomerstreifen angeordnet und zwischen einer ersten Position und einer zweiten Position beweglich ist, und eine zweite Hohlnadel, die im anderen des Paars Elastomerstreifen angeordnet und zwischen einer ersten Position und einer zweiten Position beweglich ist, und wobei jede der Nadeln ein Seitenloch und ein Endloch hat; wodurch: wenn sich die erste Hohlnadel in der ersten Position befindet und sich die zweite Nadel in der ersten Position befindet, das Nachweisreagens daran gehindert ist, aus dem mindestens einen Hohlraum durch das Probenröhrchen und in die evakuierte Kammer zu fließen, und wenn sich die erste Hohlnadel in der zweiten Position befindet und sich die zweite Hohlnadel in der ersten Position befindet, das Nachweisreagens aus dem mindestens einen Hohlraum durch das Seitenloch der ersten Hohlnadel, die erste Hohlnadel, das Endloch des Probenröhrchens, das mindestens eine Probenröhrchen, das Endloch der zweiten Hohlnadel, die zweite Hohlnadel, das Seitenloch der zweiten Hohlnadel und in die evakuierte Kammer fließt.
Molekularanalysator nach Anspruch 9, wobei die erste Hohlnadel ferner in eine dritte Position beweglich ist und die zweite Hohlnadel ferner in eine dritte Position beweglich ist, wodurch: wenn sich die erste Hohlnadel in der dritten Position befindet und sich die zweite Nadel in der zweiten Position befindet, das Nachweisreagens aus einer zweiten Innenreagenskammer aus der zweiten Innenreagenskammer durch das Endloch der ersten Hohlnadel, die erste Hohlnadel, das Seitenloch der ersten Hohlnadel, das mindestens eine Probenröhrchen, das Endloch der zweiten Hohlnadel, die zweite Hohlnadel, das Seitenloch der zweiten Hohlnadel und in die evakuierte Kammer fließt.
Molekularanalysator nach Anspruch 1, ferner mit: einem Paar entgegengesetzt angeordneten Elastomerteilen, wobei mehrere Probenröhrchen zwischen den Elastomerteilen abgedichtet gehalten werden; und mindestens einem Hohlraum einer der gegenüberliegenden Seiten des Rahmens, der mit dem Nachweisreagens gefüllt ist, wobei der mindestens eine Hohlraum innerhalb eines der Elastomerteile enthalten ist; mindestens einem weiteren Innenhohlraum, der hinter jedem des mindestens einen Probenröhrchens gebildet ist, wobei der mindestens eine weitere Innenhohlraum mit dem Innenvolumen des mindestens einen Probenröhrchens kommuniziert; wobei: die Fülleinrichtung mindestens einen Anschluß aufweist, der in einem der Elastomerteile vorgesehen ist, wobei der mindestens eine Anschluß für abdichtbaren Zugang für eine Testprobe sorgt, die in Kommunikation mit dem Innenvolumen des mindestens einen Probenröhrchens einzubringen ist; der andere der gegenüberliegenden Hohlräume eine evakuierte Kammer bildet, die innerhalb eines weiteren der Elastomerteile enthalten ist und in Kommunikation mit dem mindestens einen Probenröhrchen steht; die Einrichtung zum Durchführen des Nachweisreagens eine Einrichtung zum Blockieren und Freigeben der mindestens einen Innenleitung aufweist, die zwischen dem Hohlraum mit dem Nachweisreagens und dem Probenröhrchen vorgesehen ist, so daß im blockierten Zustand der mindestens einen Innenleitung keine Kommunikation zwischen dem mindestens einen Hohlraum und dem mindestens einen Probenröhrchen erfolgt und im freigegebenen Zustand der mindestens einen Innenleitung Kommunikation zwischen dem mindestens einen Hohlraum und dem mindestens einen Probenröhrchen erfolgt.
Molekularanalysator nach Anspruch 11, wobei die Einrichtung zum Blockieren und Freigeben aufweist: eine erste Hohlnadel, die innerhalb eines der Elastomerteile angeordnet ist, eine zweite Hohlnadel, die innerhalb des anderen der Elastomerteile angeordnet ist, und einen Transportrahmen, der ein erstes Paar Rollen, die das eine der Elastomerteile umgeben und zwischen einer ersten Position und einer zweiten Position beweglich sind, und ein zweites Paar Rollen aufweist, die das andere der Elastomerteile umgeben und zwischen einer ersten Position und einer zweiten Position beweglich sind, wodurch: wenn sich die ersten Rollen in der ersten Position der ersten Rollen befinden und sich die zweiten Rollen in der ersten Position befinden, das eine der Elastomerteile nicht zusammengedrückt ist und die mindestens eine Innenleitung blockiert ist, und wenn sich die ersten Rollen in der zweiten Position der ersten Rollen befinden und sich die zweiten Rollen in der zweiten Position befinden, beide Elastomerteile zusammengedrückt sind und die mindestens eine Innenleitung freigegeben ist.
Molekularanalysator nach Anspruch 1 mit einem Probenröhrchenhalter, der einen starren Rahmen mit zwei Paaren gegenüberliegender Seiten aufweist, mindestens einem Probenröhrchen, das zwischen einem Paar der gegenüberliegenden Seiten gehalten wird, wobei eine Seite mit mindestens einer Aussparung versehen ist, die in der Seite gebildet ist, und der mindestens eine Innenhohlraum innerhalb der anderen Seite des Paars gegenüberliegender Seiten des Rahmens gebildet ist und hinter dem Innenvolumen des mindestens einen Probenröhrchens angeordnet ist und mit ihm kommuniziert, wobei: die Fülleinrichtung mindestens einen Probenanschluß aufweist, der innerhalb der Seite der anderen der einen des Paars gegenüberliegender Seiten der Rahmen vorgesehen ist, wobei der mindestens eine Probenanschluß für abdichtbaren Zugang für eine Testprobe sorgt, die in das mindestens eine Probenröhrchen einzubringen ist; mindestens ein Reagensanschluß innerhalb der Seite der anderen der einen des Paars gegenüberliegender Seiten der Rahmen vorgesehen ist, wobei der mindestens eine Reagensanschluß für abdichtbaren Zugang für mindestens ein Nachweisreagens sorgt, das in das mindestens eine Probenröhrchen einzubringen ist; und ein evakuierter Block mit einer Innenhohlkammer und mindestens einem Bolzen zum Eingreifen in die mindestens eine Aussparung so vorgesehen ist, daß bei Aufnahme des mindestens einen Bolzens durch die mindestens eine Aussparung ein Fluidweg zwischen dem mindestens einen Innenhohlraum und der Innenhohlkammer gebildet ist.
Molekularanalysator nach Anspruch 1 mit einem Probenröhrchenhalter, der einen starren Rahmen mit zwei Paaren gegenüberliegender Seiten aufweist, und mindestens einem Probenröhrchen, das zwischen einem Paar der gegenüberliegenden Seiten gehalten wird, wobei: einer der gegenüberliegenden Hohlräume eine Reagenskammer bildet und ein Innenvolumen hat und mit einer Seite eines der Paare gegenüberliegender Seiten in Gleiteingriff gebracht werden kann, wobei die Reagenskammer mit mindestens einem Reagensanschluß versehen ist, der für abdichtbaren Zugang für mindestens ein Reagens sorgt, das in die Reagenskammer einzubringen ist; der andere der gegenüberliegenden Hohlräume eine evakuierte Kammer bildet, die ein Innenvolumen hat und mit einer anderen Seite eines der Paare gegenüberliegender Seiten in Gleiteingriff gebracht werden kann; wodurch: ein Fluiddurchgang zwischen dem Innenvolumen der Reagenskammer, dem Probenröhrchen und dem Innenvolumen der evakuierten Kammer gebildet ist, wenn die Reagenskammer und die evakuierte Kammer mit dem Rahmen in Eingriff gebracht sind.
Molekularanalysator nach Anspruch 14, wobei der Rahmen ferner mindestens eine Tür aufweist, die mit dem Rahmen schwenkbar verbunden ist, wobei die mindestens eine Tür eine Sperre zwischen der Atmosphäre und mindestens einem Paar Enden des mindestens einen Probenröhrchens bildet, das zwischen einem der Paare gegenüberliegender Seiten des Rahmens abgedichtet gehalten wird.
Molekularanalysator nach Anspruch 14 oder 15, wobei die evakuierte Kammer ferner eine Einrichtung zum Aufspüren des Vakuumverlusts in der evakuierten Kammer aufweist.
Molekularanalysator nach Anspruch 1, der einen Probenröhrchenhalter mit einem starren Rahmen aufweist, wobei: der Probenröhrchenhalter ferner entgegengesetzt angeordnete Elastomerteile aufweist, die an jede der Seiten des Rahmens angepaßt sind und in enger Verbindung mit ihr gehalten werden, und wobei das mindestens eine Probenröhrchen zwischen den Elastomerteilen abgedichtet gehalten wird; der mindestens eine Hohlraum einer der gegenüberliegenden Seiten des Rahmens mit einem Nachweisreagens gefüllt ist; die Fülleinrichtung mindestens einen Anschluß aufweist, der in einem der Elastomerteile vorgesehen ist, wobei der mindestens eine Anschluß für abdichtbaren Zugang für eine Testprobe sorgt, die in das mindestens eine Probenröhrchen einzubringen ist; der andere der gegenüberliegenden Hohlräume eine evakuierte Kammer bildet, die innerhalb des Probenröhrchenhalters enthalten ist und in Kommunikation mit dem mindestens einen Probenröhrchen steht; und die Einrichtung zum Durchführen des Nachweisreagens eine Einrichtung zum Blockieren und Freigeben mindestens einer Innenleitung aufweist, so daß im blockierten Zustand der mindestens einen Innenleitung keine Kommunikation zwischen dem mindestens einen Hohlraum und dem mindestens einen Probenröhrchen erfolgt und im freigegebenen Zustand der mindestens einen Innenleitung Kommunikation zwischen dem mindestens einen Hohlraum und dem mindestens einen Probenröhrchen erfolgt, wodurch das Nachweisreagens durch die mindestens eine Innenleitung, das mindestens eine Probenröhrchen und in die evakuierte Kammer fließen kann.
Molekularanalysator nach Anspruch 2 oder 17, wobei die Einrichtung zum Blockieren und Freigeben eine Ventileinsatzstange aufweist, die mit Massivteilstücken und Kanalteilstücken versehen ist.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 8, 11, 17 und 18, wobei jeder der Hohlräume mit einem Reagens gefüllt ist, das zur Verwendung beim Nachweisen von DNA-Produkten einer Polymerasekettenreaktion durch Chemilumineszenz geeignet ist.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 4 bis 7 und 13 bis 16, wobei die Nachweisreagenzien zur Verwen dung beim Nachweisen von DNA-Produkten einer Polymerasekettenreaktion durch Chemilumineszenz geeignet sind.
Molekularanalysator nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Reagenzien alkalisches Phosphatasekonjugat und Dioxetan enthalten.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das mindestens eine Probenröhrchen mit mehreren Molekülen versehen ist, die mindestens ein in der Testprobe vorhandenes Zielmolekül binden können, wobei die mehreren Moleküle an einer Innenfläche des mindestens einen Probenröhrchens angelagert sind; wodurch: das mindestens eine Zielmolekül an der Innenfläche gebunden wird.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 22, ferner mit einer Einrichtung zum Steuern der Temperatur der Testprobe.
Molekularanalysator nach Anspruch 23, wobei die Einrichtung zum Steuern der Temperatur der Testprobe aufweist: eine Probenkammer, wobei die Probenkammer mit einer Einrichtung zum Halten mindestens eines Probenröhrchenhalters und einem ersten Ventilator zum Umwälzen von Luft bei einer ersten Temperatur innerhalb der Probenkammer versehen ist; eine Heißluftkammer, wobei die Heißluftkammer mit einem Heizelement und einem zweiten Ventilator zum Umwälzen von Heißluft bei einer zweiten Temperatur innerhalb der Heißluftkammer versehen ist; eine Kaltluftkammer, wobei die Kaltluftkammer mit einem Kühlelement und einem dritten Ventilator zum Umwälzen von Kaltluft bei einer dritten Temperatur innerhalb der Kaltluftkammer versehen ist; eine erste Tür, die zwischen der Probenkammer und der Heißluftkammer angeordnet ist, wobei die erste Tür zwi schen einer geschlossenen Position der ersten Tür und mindestens einer offenen Position der ersten Tür beweglich ist; eine zweite Tür, die zwischen der Probenkammer und der Kaltluftkammer angeordnet ist, wobei die zweite Tür zwischen einer geschlossenen Position der zweiten Tür und mindestens einer offenen Position der zweiten Tür beweglich ist; wobei: wenn sich die erste Tür in der geschlossenen Position der ersten Tür befindet und sich die zweite Tür in der geschlossenen Position der zweiten Tür befindet, keine Luft zwischen der Probenkammer und der Heißluftkammer zirkuliert und keine Luft zwischen der Probenkammer und der Kaltluftkammer zirkuliert; wenn sich die erste Tür in der mindestens einen offenen Position der ersten Tür befindet und sich die zweite Tür in der geschlossenen Position der zweiten Tür befindet, Luft aus der Probenkammer und der Heißluftkammer zwischen der Probenkammer und der Heißluftkammer zirkuliert und keine Luft zwischen der Probenkammer und der Kaltluftkammer zirkuliert; und wenn sich die erste Tür in der geschlossenen Position der ersten Tür befindet und sich die zweite Tür in der mindestens einen offenen Position der zweiten Tür befindet, Luft aus der Probenkammer und der Kaltluftkammer zwischen der Probenkammer und der Kaltluftkammer zirkuliert und keine Luft zwischen der Probenkammer und der Heißluftkammer zirkuliert.
Molekularanalysator nach Anspruch 23, wobei die Einrichtung zum Steuern der Temperatur der Testprobe aufweist: eine Probenkammer, wobei die Probenkammer mit einer Einrichtung zum Halten mindestens eines Probenröhrchenhalters und einem ersten Ventilator zum Umwälzen von Luft innerhalb der Probenkammer versehen ist; eine Heißluftkammer, wobei die Heißluftkammer mit einem Heizelement und einem zweiten Ventilator zum Umwälzen von Heißluft innerhalb der Heißluftkammer versehen ist; eine Kaltluftkammer, wobei die Kaltluftkammer mit einem Kühlelement und einem dritten Ventilator zum Umwälzen von Kaltluft innerhalb der Kaltluftkammer versehen ist; eine erste Tür, die zwischen der Probenkammer und der Heißluftkammer angeordnet ist, wobei die erste Tür zwischen einer geschlossenen Position der ersten Tür und mindestens einer offenen Position der ersten Tür beweglich ist; eine zweite Tür, die zwischen der Probenkammer und der Kaltluftkammer angeordnet ist, wobei die zweite Tür zwischen einer geschlossenen Position der zweiten Tür und mindestens einer offenen Position der zweiten Tür beweglich ist; wobei: wenn sich die erste Tür in der geschlossenen Position der ersten Tür befindet und sich die zweite Tür in der geschlossenen Position der zweiten Tür befindet, keine Luft zwischen der Probenkammer und der Heißluftkammer zirkuliert und keine Luft zwischen der Probenkammer und der Kaltluftkammer zirkuliert; wenn sich die erste Tür in der mindestens einen offenen Position der ersten Tür befindet und sich die zweite Tür in der geschlossenen Position der zweiten Tür befindet, Luft aus der Probenkammer und der Heißluftkammer zwischen der Probenkammer und der Heißluftkammer zirkuliert und keine Luft zwischen der Probenkammer und der Kaltluftkammer zirkuliert; und wenn sich die erste Tür in der geschlossenen Position der ersten Tür befindet und sich die zweite Tür in der mindestens einen offenen Position der zweiten Tür befindet, Luft aus der Probenkammer und der Kaltluftkammer zwischen der Probenkammer und der Kaltluftkammer zirkuliert und keine Luft zwischen der Probenkammer und der Heißluftkammer zirkuliert.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 1 bis 25, ferner mit einer Einrichtung zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von (des) mindestens einem (einen) Zielmolekül(s), das in der Testprobe enthalten ist.
Molekularanalysator nach Anspruch 26, wobei die Einrichtung zum Nachweisen eine Einrichtung zum Messen: (a) der Chemilumineszenz der Testprobe; (b) der Fluoreszenzemission der Testprobe; (c) der Szintillationsemission der Testprobe; oder (d) einer Menge von Lichtabsorption bei einer speziellen Wellenlänge der Testprobe aufweist.
Molekularanalysator nach Anspruch 27(a), wobei die Einrichtung zum Nachweisen aufweist: einen Leser, der eine erste Zählung einer Menge von Photonen durchführen kann, die von jedem des mindestens einen Probenröhrchens emittiert werden; einen Wagen, der ein oberes Teilstück und ein unteres Teilstück aufweist, wobei das obere Teilstück einen Spiegel aufweist und das untere Teilstück eine Linse aufweist; eine Einrichtung zum Bewegen des Probenröhrchenhalters zwischen dem oberen und unteren Teilstück des Wagens, so daß jedes des mindestens einen Probenröhrchens nacheinander zwischen dem oberen und unteren Teilstück des Wagens plaziert wird, um zwischen dem Spiegel und der Linse so angeordnet zu sein, daß der Spiegel Chemilumineszenzlicht aus dem mindestens einen Probenröhrchen in die Linse reflektiert; wobei: wenn jedes des mindestens einen Probenröhrchens zwischen dem oberen und unteren Teilstück des Wagens angeordnet ist, sich das erste Teilstück des Wagens nach unten bewegt und das untere Teilstück so berührt, daß Außenlicht daran gehindert wird, das mindestens eine Probenröhrchen zu erreichen.
Molekularanalysator nach Anspruch 28, wobei der Spiegel ein vorderseitig verspiegelter Parabolspiegel mit einem Brennpunkt ist und die Einrichtung zum Bewegen des Probenröhrchenhalters zwischen dem oberen und unteren Teilstück des Wagens den mindestens einen Probenröhrchenhalter so bewegt, daß jedes des mindestens einen Probenröhrchens nacheinander innerhalb des Brennpunkts des Parabolspiegels angeordnet wird.
Molekularanalysator nach Anspruch 27(b), wobei die Einrichtung zum Nachweisen aufweist: einen Spiegel; eine Lichtquelle zum Bereitstellen von Stimulationslicht zum Beleuchten des mindestens einen Probenröhrchens; eine Linse zum Fokussieren des Lichts in eine Einrichtung zum Messen einer Menge von Fluoreszenzemission, die in dem mindestens einen Probenröhrchen vorhanden ist; eine Einrichtung zum Bewegen des Probenröhrchenhalters zwischen dem Spiegel und der Linse, so daß jedes des mindestens einen Probenröhrchens nacheinander zwischen dem Spiegel und der Linse plaziert wird, um zwischen dem Spiegel und der Linse so angeordnet zu sein, daß der Spiegel Fluoreszenzemission aus dem mindestens einen Probenröhrchen in die Linse reflektiert; und eine Einrichtung zum Ablesen der Menge von Fluoreszenzemission, die in dem mindestens einen Probenröhrchen vorhanden ist.
Molekularanalysator nach Anspruch 30, wobei der Spiegel ein vorderseitig verspiegelter Parabolspiegel mit einem Brennpunkt ist und die Einrichtung zum Bewegen des Probenröhrchenhalters zwischen dem Spiegel und der Linse den mindestens einen Probenröhrchenhalter so bewegt, daß jedes des mindestens einen Probenröhrchens nachein ander innerhalb des Brennpunkts des Parabolspiegels angeordnet wird.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 17 bis 31, wobei der mindestens eine Hohlraum und die evakuierte Kammer innerhalb einer der gegenüberliegenden Seiten der Elastomerteile oder innerhalb einer der gegenüberliegenden Seiten des Rahmens angeordnet sind.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 25 bis 32, wobei die Probenkammer ferner versehen ist mit einem ersten Teilstück, einem zweiten Teilstück, das auf der gleichen Temperatur wie die Kaltluftkammer durch die Kaltluft gehalten wird, die zwischen der Kaltluftkammer und dem zweiten Teilstück der Probenkammer rezirkuliert, und die Einrichtung zum Halten des mindestens einen Probenröhrchenhalters eine wärmeleitende Basis aufweist, die die Probenkammer in das erste und zweite Teilstück teilt; wodurch: die Nachweisreagenzien auf der dritten Temperatur gehalten werden.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei die erste Temperatur eine Temperatur ist, die für DNA-Polymeraseaktivität optimal ist.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 24 bis 34, wobei die zweite Temperatur auf 200 °C gehalten wird und die dritte Temperatur auf 0 °C gehalten wird.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 24 bis 35, wobei die erste Temperatur auf etwa 96 °C angehoben wird, wenn die erste Tür aus der geschlossenen Position der ersten Tür in die mindestens eine offene Position der ersten Tür bewegt wird.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 24 bis 36, wobei die erste Temperatur auf eine Temperatur gesenkt wird, die zur DNA-Anlagerung optimal ist, wenn die zweite Tür aus der geschlossenen Position der zweiten Tür in die mindestens eine offene Position der zweiten Tür bewegt wird.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 24 bis 37, wobei die Probenkammer ferner versehen ist mit einem ersten Teilstück, einem zweiten Teilstück, das auf der dritten Temperatur durch die Kaltluft gehalten wird, die zwischen der Kaltluftkammer und dem zweiten Teilstück der Probenkammer rezirkuliert, und die Einrichtung zum Halten des mindestens einen Probenröhrchenhalters eine wärmeleitende Basis aufweist, die die Probenkammer in das erste und zweite Teilstück teilt; wodurch: das mindestens eine Nachweisreagens, das innerhalb des Probenröhrchenhalters enthalten ist, auf der dritten Temperatur gehalten wird.
Molekularanalysator nach einem der Ansprüche 24 bis 38, wobei die Probenkammer ferner versehen ist mit einem ersten Teilstück, das auf der ersten Temperatur gehalten wird, einem zweiten Teilstück, das auf der dritten Temperatur durch die Kaltluft gehalten wird, die zwischen der Kaltluftkammer und dem zweiten Teilstück der Probenkammer rezirkuliert, und einer Basis zum Halten des mindestens einen Probenröhrchenhalters, die ein wärmeleitendes Material aufweist, das die Probenkammer in das erste und zweite Teilstück teilt; wobei: die Nachweisreagenzien auf der dritten Temperatur gehalten werden.
Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zielmolekülen in einer Testprobe unter Verwendung eines Molekularanalysators, der einen Probenröhrchenhalter (10) mit mindestens einem Proben enthaltenden Probenröhrchen (23) aufweist, wobei eine Einrichtung zum Erwärmen und Abkühlen des Probenröhrchenhalters (10) vorgesehen ist, wodurch die Vorrichtung Proben in dem mindestens einen Probenröhrchen (23) zyk lisch erwärmen und abkühlen kann, und mit den folgenden Schritten: Einbringen einer Testprobe in das mindestens eine Probenröhrchen (23), das in einem Probenröhrchenhalter (10) gehalten wird, der einen Rahmen (11) mit entgegengesetzt angeordneten Seiten aufweist und das mindestens eine Probenröhrchen (23) darin abgedichtet hält; Bereitstellen mindestens eines Nachweisreagens; Steuern der Temperatur der Testprobe, so daß die Zielmoleküle an eine Innenfläche des mindestens einen Probenröhrchens (23) spezifisch gebunden werden und andere Moleküle in der Testprobe ungebunden sind; Durchführen des mindestens einen Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen (23), so daß die ungebundenen Moleküle ausgewaschen werden; und Messen der Menge der Zielmoleküle.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei: das Probenröhrchen in entgegengesetzt angeordneten Elastomerteilen abgedichtet gehalten wird, die an einen starren Rahmen angepaßt sind und in enger Verbindung mit ihm gehalten werden, eine der Seiten des Rahmens mit mindestens einem Nachweisreagens versehen ist, das in ihrem Inneren enthalten ist, und die andere der Seiten des Rahmens mit einer evakuierten Kammer versehen ist, die in ihr enthalten ist; der Durchführschritt den folgenden Schritt aufweist: Durchführen des mindestens einen Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen und in die evakuierte Kammer, so daß die ungebundenen Moleküle in die evakuierte Kammer ausgewaschen werden.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der Probenröhrchenhalter einen starren Rahmen mit entgegengesetzt angeordneten Vertiefungen aufweist, wobei die Vertiefungen ein Paar Elastomerteile aufnehmen, die mit mindestens einem Innenhohlraum versehen sind, der hinter dem mindestens einen Probenröhrchen angeordnet ist; der Durchführschritt den folgenden Schritt aufweist: Einbringen mindestens eines Nachweisreagens in das mindestens eine Probenröhrchen, so daß die ungebundenen Moleküle durch das mindestens eine Probenröhrchen und in den mindestens einen Innenhohlraum ausgewaschen werden.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei: das mindestens eine Probenröhrchen zwischen entgegengesetzt angeordneten Elastomerteilen abgedichtet gehalten wird, mindestens eines der Elastomerteile mit mindestens einem Nachweisreagens versehen ist, das in seinem Inneren enthalten ist, und das andere der Elastomerteile mit einer evakuierten Kammer versehen ist, die in ihr enthalten ist; der Durchführschritt den folgenden Schritt aufweist: Bereitstellen einer Einrichtung zum Durchführen des mindestens einen Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen und in die evakuierte Kammer, so daß die ungebundenen Moleküle in die evakuierte Kammer ausgewaschen werden.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei: der Probenröhrchenhalter mit entgegengesetzt angeordneten Elastomerteilen versehen ist, die an einen starren Rahmen angepaßt sind und mit ihm in enger Verbindung gehalten werden, eines der Elastomerteile mit mindestens einem Nachweisreagens versehen ist, das in seinem Inneren enthalten ist, und das andere der Elastomerteile mit einer evakuierten Kammer versehen ist, die in ihm enthalten ist; wobei der Durchführschritt den folgenden Schritt aufweist: Durchführen des mindestens einen Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen und in die evakuierte Kammer, so daß die ungebundenen Moleküle in die evakuierte Kammer ausgewaschen werden.
Verfahren nach Anspruch 40 mit den folgenden Schritten: Einbringen einer Testprobe in mindestens ein Probenröhrchen, das in einem Probenröhrchenhalter gehalten wird, der einen starren Rahmen mit zwei Paaren entgegengesetzt angeordneter Seiten aufweist, wobei eine Seite eines der Paare gegenüberliegender Seiten mit mindestens einer Aussparung versehen ist, die in der Seite gebildet ist, wobei der Schritt des Bereitstellens mindestens eines Nachweisreagens den folgenden Schritt aufweist: Einbringen mindestens eines Nachweisreagens in die Seite des anderen des einen der Paare gegenüberliegender Seiten des Rahmens; wobei das Verfahren ferner die folgenden Schritte aufweist: In-Eingriff-bringen eines mit einer Innenhohlkammer versehenen evakuierten Blocks und mindestens eines Bolzens zum Eingreifen in die mindestens eine Aussparung, so daß bei Aufnahme des mindestens einen Bolzens durch die mindestens eine Aussparung ein Fluidweg gebildet ist, wodurch das mindestens eine Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen und in die Innenhohlkammer geführt wird, so daß die ungebundenen Moleküle in die evakuierte Kammer ausgewaschen werden.
Verfahren nach Anspruch 40, ferner mit den folgenden Schritten: In-Eingriff-bringen einer Reagenskammer mit einem Innenvolumen mit einer Seite eines der Paare gegenüberliegender Seiten, wobei die Reagenskammer mit mindestens einem Nachweisreagens versehen ist; In-Eingriff-bringen eines mit einer Innenhohlkammer versehenen evakuierten Blocks mit einer anderen Seite eines der Paare gegenüberliegender Seiten, so daß ein Fluidweg gebildet ist, wodurch das mindestens eine Nachweisreagens durch das mindestens eine Probenröhrchen und in das Innenvolumen der evakuierten Kammer geführt wird, so daß die ungebundenen Moleküle in die evakuierte Kammer ausgewaschen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 46, ferner mit dem Schritt des Steuerns der Temperatur einer Testprobe, der die folgenden Schritte aufweist: (a) Einbringen mindestens eines Probenröhrchenhalters in eine Probenkammer, die auf einer ersten Temperatur einer Wärmesteuerung gehalten wird, wobei die Wärmesteuerung ferner eine Heißluftkammer und eine Kaltluftkammer aufweist; (b) Öffnen einer ersten Tür, die zwischen der Heißluftkammer und der Probenkammer angeordnet ist, so daß die erste Temperatur innerhalb der Probenkammer schnell auf eine zweite Temperatur erhöht wird, bei der die Zielmoleküle denaturiert werden; (c) Halten des mindestens einen Probenröhrchenhalters auf der zweiten Temperatur innerhalb der Probenkammer für eine erste Zeit, die lang genug ist, vollständige Denaturierung der Testprobe zu gewährleisten; (d) Öffnen einer zweiten Tür, die zwischen der Kaltluftkammer und der Probenkammer angeordnet ist, so daß die zweite Temperatur innerhalb der Probenkammer schnell auf eine dritte Temperatur gesenkt wird, bei der die Zielmoleküle an die Primermoleküle angelagert werden; (e) Halten des mindestens einen Probenröhrchenhalters auf der dritten Temperatur innerhalb der Probenkammer für eine zweite Zeit, die lang genug ist, um eine vollständige Anlagerung der Testprobe zu gewährleisten; (f) Öffnen der ersten Tür, so daß die dritte Temperatur innerhalb der Probenkammer schnell auf eine vierte Temperatur erhöht wird, bei der optimale DNA-Polymeraseaktivität auftritt; und (g) ausreichend langes Wiederholen der Schritte (b) bis (f), um eine nachweisbare Menge amplifizierter DNA-Zielmoleküle zu erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 47, ferner mit dem Schritt des Messens der Chemilumineszenz einer Testprobe, der die folgenden Schritte aufweist: Bewegen des mindestens einen Probenröhrchens in eine Probenablesekammer und Anordnen des mindestens einen Probenröhrchens zwischen einem Spiegel und einer Linse, so daß das mindestens eine Probenröhrchen zwischen dem Spiegel und der Linse so angeordnet ist, daß der Spiegel Licht, das aus dem mindestens einen Probenröhrchen emittiert wird, in die Linse reflektiert; Verhindern, daß Außenlicht in die Probenablesekammer eintritt; Bereitstellen einer Einrichtung zum Zählen von Photonen; und Durchführen einer Ablesung einer Anzahl von Photonen, die aus dem mindestens einen Probenröhrchen emittiert werden, unter Verwendung der Einrichtung zum Zählen von Photonen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 48, ferner mit dem Schritt des Messens der Fluoreszenzemission einer Testprobe, der die folgenden Schritte aufweist: Bewegen mindestens eines Probenröhrchens in eine Probenablesekammer und Anordnen des mindestens einen Probenröhrchens zwischen einem Spiegel und einer Linse, so daß das mindestens eine Probenröhrchen zwischen dem Spiegel und der Linse so angeordnet ist, daß der Spiegel Fluoreszenzemission aus dem mindestens einen Probenröhrchen in die Linse reflektiert; Bereitstellen von Stimulationslicht in der Probenablesekammer aus einer Lichtquelle zum Beleuchten des mindestens einen Probenröhrchens; Bereitstellen einer Einrichtung zum Zählen von Photonen; Verhindern, daß Stimulationslicht in die Einrichtung zum Zählen von Photonen eintritt; Verhindern, daß Außenlicht in die Einrichtung zum Zählen von Photonen eintritt, und Durchführen einer Ablesung einer Menge von Fluoreszenzemission aus dem mindestens einen Probenröhrchen.
Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, wobei der Spiegel ein vorderseitig verspiegelter Parabolspiegel mit einem Brennpunkt ist und der Schritt des Anordnens des mindestens einen Probenröhrchens zwischen dem Spiegel und der Linse ferner den Schritt des Anordnens des mindestens einen Probenröhrchens innerhalb des Brennpunkts des Parabolspiegels aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 50, ferner mit dem Schritt des aufeinanderfolgenden Anordnens mehrerer des mindestens einen Probenröhrchens zwischen dem Spiegel und der Linse.