DE69532582T2

DE69532582T2 - Biologische bekämpfung von insekten

Info

Publication number: DE69532582T2
Application number: DE69532582T
Authority: DE
Inventors: John Benjamin REED; Mark Richard SANDEMAN; Spencer David CHANDLER
Original assignee: TROBE UNIVERSITY BUNDOORA; La Trobe University; Nufarm Australia Ltd
Current assignee: La Trobe University; Nufarm Australia Ltd
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-15
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2015-06-16
Also published as: JP4124481B2; EP0765117A4; CA2194014A1; US5985273A; AU688054B2; EP0765117A1; EP0765117B1; AU2665695A; BR9508041A; CA2194014C; CN1158551A; MX9606538A; CN1074900C; ES2214502T3; WO1995035031A1; NZ287816A; DE69532582D1; ZA954989B; DK0765117T3; IL114191A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von Insekten und diesbezügliche Zusammensetzungen.
Im Besonderen betrifft die Erfindung die Bekämpfung des Insektenbefalls von Tieren oder Pflanzen und die Prophylaxe von Infektionen von Tieren oder Pflanzen, welche von Insekten übertragen werden. Die Erfindung kann ferner Anwendung finden zur Besserung von Infektionen, welche infolge Insektenbefalls auftreten.
Im Besonderen betrifft die Erfindung die Verwendung von Zusammensetzungen, welche Peptidase-Inhibitoren umfassen, für die Bekämpfung von Insekten und betrifft ferner die Verwendung von insektenresistenten transgenen Organismen, welche Peptidase-Inhibitoren exprimieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Insekten verursachen weltweit erhebliche Schädlingsprobleme an einer Vielzahl verschiedener Tiere und Pflanzen; man schätzt, dass trotz der derzeitigen Bekämpfungsmaßnahmen pro Jahr 13% der Ernteproduktion verlorengehen. Insektenspezies der Ordnung Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera, Psocoptera, Isoptera, Thysanoptera und Homoptera verursachen massive Verluste bei einer Vielzahl von Erntegütern, welche im Garten oder auf großen Flächen angebaut werden, sowie bei eingelagerten und verarbeiteten Kornpro dukten. Diptera, Anoplura, Malophaga und Siphonaptera verursachen parasitische Infektionen bei Tieren und beim Menschen. Andere Ordnungen (Hymenoptera, Dictyoptera, Isoptera) umfassen wichtige Haus- und Industrieschädlinge.
Viele der bekannten Bekämpfungsmaßnahmen für Insekten beruhen auf dem Einsatz von chemischen Insektiziden, z. B. chlorierte Kohlenwasserstoffe (DDT, Endosulfan etc.), Organophosphate (Chlorpyrifos, Diazinon, Marathion, Parathion), Organocarbamate (Carbaryl, Methomyl, Proxypur) und synthetische Pyrethroide (Cypermethrin, Deltamethrin).
Zu den Problemen, welche mit der Verwendung von chemischen Insektiziden einhergehen, zählen die Entwicklung von Resistenz bei den Zielinsekten (Organophosphate, synthetische Pyrethroide), die Persistenz der Chemikalien in der Umwelt sowie im pflanzlichen und tierischen Gewebe und die Schadwirkungen auf Nichtzielorganismen (Organochlorine, Insektenwachstumsregulatoren).
Borverbindungen (Borax, Polybor) sind ebenfalls für insektizide Zwecke zum Einsatz gelangt. Borverbindungen sind stabil, töten die Insekten relativ langsam bei praktischen Dosierungen (Mullens und Rodriguez, 1992), und die Aufnahme hoher Dosen durch den Menschen kann tödlich sein (Anon, 1991).
Andere Kategorien von Insektiziden umfassen Insektenwachstumsregulatoren (IGRs) und insektizide bakterielle Toxine (z. B. aus Bacillus thuringiensis (B.t.-Toxine)). IGRs sind Verbindungen, welche auf eine Weise in die Chitinsynthese eingreifen. Sie umfassen Juvenilhormonanaloga (Methopren), Chitinsynthesehemmer (Fenoxycarb, Diflubenzuron, Flurazuron) und Triazin-Derivate (Cyromazin). Gegenüber zahlreichen Klassen von IGRs ist bereits Resistenz bemerkt worden. Resistenzentwicklung tritt auch bei bestimmten Lepidopteren gegen B.t.-Toxine auf. Sowohl bei IGRs als auch bei B.t.-Toxinen gestaltet es sich schwierig, sicherzustellen, dass die Insekten in einem geeigneten Stadium ihres Lebenszyklus getötet werden. Einige IGRs sind stabil und können eine Umweltgefahr darstellen.
Die nützlichsten Gruppen von Insektiziden sind jene, welche eine hohe insektizide Aktivität und eine geringe Persistenz in der Umwelt aufweisen (Organophosphate, synthetische Pyrethroide). Bei ihnen ist jedoch die Entwicklung von Resistenz bei den Zielinsekten das größte Problem. Man glaubt, dass 90% des Insektizideinsatzes immer noch auf den klassischen neurotoxischen Insektiziden beruht. Die Suche nach alternativen rückstandsarmen Insektiziden, die auf Insekten wirksam sind, welche gegen existierende Insektizide resistent sind, ist daher besonders dringlich.
Als Synergisten bezeichnete Mittel können verwendet werden, um die Effektivität bestimmter Insektizide zu maximieren. Die Synergisten können selbst insektizide Wirkung besitzen oder auch nicht. Blood und Studdert (1988) definieren einen Synergisten als ein Agens, welches mit einem anderen zusammenwirkt oder dessen Wirkung verbessert. Als Beispiel sei angeführt, dass Piperonylbutoxid ein Synergist für synthetische Pyrethroide ist. Synergisten, welche in Kombination mit einem Insektizid wirksam sind, sind möglicherweise in der Kombination mit einem anderen Insektizid nicht wirksam. Synergisten können verwendet werden, um Probleme der Insektenresistenz zu überwinden, wenngleich gegenüber Synergisten gleichfalls Insektenresistenz auftreten kann. Die Synergistenrolle in insektiziden Formulierungen kann entscheidend sein für die Erzielung eines ökonomisch sinnvollen Ergebnisses und für das Insektizidresistenzmanagement. Die Suche nach effektiven synergistischen Kombinationen ist ebenso dringlich wie die Suche nach wirksamen Insektiziden per se (Forrester et al., 1993).
In neuerer Zeit sind Insekten-Peptidasen in den Brennpunkt der Aufmerksamkeit gerückt, deren Hemmung möglicherweise ein Mittel zur Insektenbekämpfung bereitstellen kann. Peptidasen sind ubiquitäre Enzyme, welche Proteine und Peptide aufspalten und damit das Verdauungsgeschehen sowohl im Darm als auch in den Zellen unterstützen. Sie nehmen an der Reorganisation des Gewebes während der Embryonalentwicklung, Häutung und Verpuppung von Insekten teil. Sie sind ferner an der Abwehr invadierender Organismen und an der Proteinregulierung beteiligt.
Peptidasen sind eine vielfältige Gruppe von Enzymen. Das Prinzip, nach dem sie gegenwärtig klassifiziert werden, beruht

(a) auf der Reaktion, die katalysiert wird
(2) auf der chemischen Natur des katalytisch aktiven Zentrums und
(3) auf der evolutionären Beziehung, wie durch die Struktur offenbart (Barrett, 1994)

Die International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMC), in: Enzyme Nomenclature (1992), klassifiziert Peptidasen nach Enzymklasse-(EC-)Kategorien. Diese Kategorien sind EC 3.4.11 bis 3.4.19 für Exopeptidasen (jene Enzyme, welche nur nahe den Enden der Peptidketten wirken) und EC 3.4.21 bis 3.4.99 für Enzyme, welche bevorzugt auf die inneren Regionen der Peptide wirken. Die Gruppe EC 3.4.99 ist eine Gruppe von Peptidasen, deren katalytischer Mechanismus noch unerkannt oder noch nicht charakterisiert ist.
Die folgenden Ausführungen geben einen Überblick über die Peptidase-Klassen und ihre Beziehung zur Biochemie der Insekten.
1. Serin-Peptidasen
Diese Gruppe umfasst Serin-Typ-Carboxypeptidasen, EC 3.4.16, und Serin-Endopeptidasen, EC 3.4.21.
Serin-Peptidasen sind typisch erkennbar durch eine katalytisch aktive Serinaminosäure an ihrem aktiven Zentrum und durch ihre Empfindlichkeit gegenüber einem Enzymhemmstoff, 3,4-Dichlorisocumarin (3,4-DCI). Bevorzugte pH-Werte für die Aktivität von Säugetier-Serin-Peptidasen liegen im Bereich von 2 bis 8; Insekten-Serin-Peptidasen sind jedoch im Allgemeinen alkalischen Bedingungen angepasst (pH 9 bis über 11 bei einigen Lepidopteren-Larven).
Die Aktivität der Serin-Peptidasen bei Insekten ist ferner im Allgemeinen definiert durch die Reaktion der Enzyme mit synthetischen Substraten. Die drei üblichen Kategorien von Insekten-Serinpeptidasen (trypsinartig, chymotrypsinartig und elastinartig) können auf diesem Wege identifiziert werden.
Trypsinartige Serin-Peptidasen reagieren mit den synthetischen Substraten P-Tosyl-L-argininmethylester (TAME), α-N-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE), α-N-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) und Benzoyl-DL-argininnapthylamin (BANA).
Chymotrypsinartige Peptidasen können identifiziert werden durch ihre Reaktion mit:
N-Acetyl-L-phenylalaninester (APNE)
N-Acetyl-L-tyrosinethylester (ATEE)
N-Benzoyl-L-tyrosinethylester (BTEE)
N-Benzoyl-L-tyrosin-p-nitroanilid (BTPNA)
L-Glutaryl-L-phenylalanin-p-nitroanilid (GPPNA)
N-Succinyl-L-phenylalanin-p-nitroanilid (SPAPNA)
L-Glutaryl-L-phenylalaninnaphthylanid (GPNA)
Elastaseartige Serinpeptidase-Inhibitoren können identifiziert werden durch ihre Reaktion mit synthetischen Substraten wie N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilid (SAAPLpNA).
Die Aktivität von Serin-Peptidasen kann auch in Beziehung zu ihrer Reaktion mit Enzyminhibitoren beschrieben werden. Peptidasen der Serin-Gruppe werden im Allgemeinen durch Diisopropylfluorophosphat (DipF/DFP) und Paraphenylmethylsulphonylfluorid (PMSF) inhibiert. Trypsinartige Peptidasen werden durch Tosyl-L-lysinchloromethylketon (TLCK) inhibiert. Chymotrypsinartige Peptidasen werden durch Tosyl-L-phenylalaninchloromethylketon (TPCK) inhibiert. Elastaseartige Peptidasen werden durch Eglin-C gehemmt.
Von einer Anzahl von natürlicherweise vorkommenden Proteinen wurde gefunden, dass sie zur Inhibition von Serin-Peptidasen befähigt sind. Diese umfassen den kristallinen Trypsininhibitor aus Sojabohnen von Kunitz (SBTI) und den Trypsininhibitor aus Sojabohnen von Bowman-Birk (BBTI). Verschiedene andere Leguminosensamen enthalten Peptidase-Inhibitor bei 1 bis 4% des Gesamtproteins, z. B. der Trypsin-/Chymotrypsininhibitor aus der Kichererbse (CI), der Trypsininhibitor aus der Limabohne (LBTI) und der Trypsininhibitor aus der Kuhbohne (CPTI) (Macintosh et al., 1990). Serin-Peptidase-Inhibito ren tierischer Herkunft umfassen Trypsininhibitor aus Rinderpankreas (BPTI, Aprotinin), Ovomucoid aus Ei und α-1-Antitrypsin aus Blut.
Von Serin-Peptidasen mit pH-Optima im alkalischen Bereich wurde erkannt, dass sie von primärer Wichtigkeit als lösliche Enzyme in den digestiven Fluiden von Insekten sind. Beispiele umfassen Sphingidae (Miller et al., 1974), Noctuidae (Ahmed et al., 1976, 1980; Ishaaya et al., 1971; Prichet et al., 1981; Teo et al., 1990; Broadway und Duffy, 1986), Bombycidae (Sasaki und Suzuki, 1982; Euguchi und Iwanito, 1976; Euguchi und Kuriyama, 1985), Pieridae (Lecadet und Dedonder, 1966; Broadway et al., 1989), Pyralidae (Larocque und Houseman, 1990; Houseman et al., 1989; Mohammed und Altias, 1987) und Diptera (Bowles et al., 1990). Christeller et al. (1992) zeigten, dass Serin-Peptidasen an der (Casein-)Verdauungsaktivität von zwölf phythophagen Lepidopteren beteiligt sind. In diesem Artikel hat Christeller gefunden, dass kein anderer Typ von Peptidase signifikante Anzeichen von Verdauungsaktivität zeigt. Von Serin-Peptidasen wurde ferner gefunden, dass sie eine entscheidende Rolle bei keratinverdauenden Lepidopteren spielen (Christeller et al., 1994; Prowning und Irzykiewicz 1962; Ward, 1975 a, b). Ferner kommt ihnen eine bedeutende Rolle in der Verdauungsaktivität einiger Coleopteren (McGhie et al., 1995, Dymock et al., 1992), einiger Orthopteren (Sakal et al., 1989; Christeller et al., 1990), einiger Heteropteren (Cohen, 1993) und einiger Dipteren (Bowles et al., 1990) zu.
Die Verdauungs-Serinpeptidasen unterscheiden sich beträchtlich sowohl nach Anzahl als auch in ihren katalytischen Eigenschaften innerhalb einer Art und von Art zu Art (Applebaum, 1985). In einigen Fällen sind Inhibitoren für Serin-Peptidasen in Insektendiäten sowohl als fraßabschreckend als auch als verdauungshemmend wirkend erkannt worden (Dymock et al., 1992).
Trypsinartige Serin-Peptidasen sind als am Schlüsselwachstumsregulationsbereich der Häutung beteiligt erkannt worden. Sie zeigen mehrere Rollen, einschließlich Prozesskontrolle, Aussetzen der Chitinfibrillen dem Einfluss von Chitinase-Enzymen und Wiederverwertung cuticularen Materials (Samuels und Paterson, 1991).
Wegen ihren vorherrschenden metabolischen Rollen, ihrem allgemein natürlichen Vorkommen und dem Auftreten von zahlreichen natürlichen Inhibitoren in Pflanzen und Tieren ist den Serin-Peptidasen die größte Aufmerksamkeit als Agenzien für die Insektenbekämpfung zuteil geworden. Es sollte beachtet werden – das ist wichtig – dass das Umfeld des Einsatzes von Serin-Peptidasen in der Insektenbekämpfung bisher fast ausschließlich auf dem Gebiet der transgenen Pflanzen liegt.
2. Cystein-(Thiol-)Peptidasen
Diese Gruppe umfasst Cystein-Typ-Carboxypeptidasen (EC 3.4.18) und Cystein-Endopeptidasen (EC 3.4.22).
Diese Enzyme sind charakterisiert durch den Besitz eines katalytisch aktiven Cystein-Restes an ihrem aktiven Zentrum und durch ihre Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Inhibitoren. Cystein-Peptidasen werden charakteristisch unter reduzierenden Bedingungen aktiviert (Zusatz von Cystein, Dithiothreitol oder anderer reduzierender Agenzien). Cystein-Peptidasen sind lösliche Enzyme, die im Allgemeinen in Mitteldarminhalten von Insekten gefunden werden. Säugetier-Cysteinpeptidasen üben ihre Funktion im Allgemeinen in einem Milieu niedriger pH-Werte aus, wohingegen in Insekten fast neutrale oder leicht saure pH-Werte favorisiert werden (Wolfson und Murdock, 1987).
Die Aktivität von Cystein-Peptidasen wird exemplarisch aufgezeigt durch ihre Reaktion mit den synthetischen Substraten n-α-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) oder Benzoyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-(4 methyl)-cumarylamid (Z-Phe-Arg-MCA). Die Aktivität von Cysteinpeptidasen kann ferner beschrieben werden in Beziehung zu ihrer Reaktion mit Enzyminhibitoren, wie Iodacetamid, Iodacetat, Schwermetallen, p-Chlormercuribenzoat, Cystincyanid, N-Ethylmaleimid und, charakteristisch, E-64. E-64 ist ein kleines Peptid (L-trans-Epoxysuccinylleucylamido-(4-guanidinobutan), welches aus einem Stamm von Aspergillus japonicus erhalten wird. Natürlich vorkommende Cysteinpeptidase-Inhibitoren sind in Mikroben (E-64), Pflanzen (Oryzacystatine I und II aus Reiskörnern und Kartoffel-Multicystatin (PMC) aus Kartoffelknollen) und Tieren (Cystatin aus Hühnerei, HEC) identifiziert worden. Antipain ist ein weiterer wohlbekannter Cysteinpeptidase-Inhibitor.
Cystein-Peptidasen spielen eine wichtige Rolle als lösliche Verdauungsenzyme des Darms einiger Insekten, insbesondere bei Coleopteren (Orr et al., 1994; Thie und Houseman, 1990; Liang et al., 1991). Die Verwendung von Cystein-Peptidase-Inhibitoren zur Bekämpfung von Insekten ist weitgehend im Zusammenhang mit transgenen Pflanzen untersucht worden (Orr et al., 1994; Wolfson und Murdock, 1987).
3. Asparaginsäure-Peptidasen (EC 3.4.23)
Diese Enzyme werden typisch als zwei Aspartyl-Reste am aktiven Zentrum tragend erkannt. Zahlreiche Asparaginsäure-Peptidasen sind am aktivsten bei niedrigen pH-Werten. Synthetische Substrate für diese Enzyme umfassen N-Carbobenzoxyglutamyl-L-tyrosin und N-Acetyl-L-phenanyldiiodtyrosin. Charakteristische Inhibitoren für Asparaginsäure-Peptidasen umfassen Pepstatin und Diphenyldiazomethan (McDonald, 1985). Pepstatin ist ein natürlich vorkommender Inhibitor aus mikrobieller Quelle.
Applebaum (1985) hat eine Bedeutung der Asparaginsäure-Peptidasen für Dipteren nahegelegt. Wolfson und Murdock (1987) haben eine Wachstumshemmung bei einer Käferart (Colorado-Kartoffelkäferlarve) durch Pepstatin demonstriert; eine größere Wachstumshemmung wurde jedoch durch Cystein-Peptidase-Targeting erreicht.
Eine eingehende Durchsicht der Literatur über Peptidasen hat gezeigt, dass nur in begrenztem Umfang Untersuchungen über Insekten-Aspartylpeptidasen zur Insektenbekämpfung entweder durch transgene Modifikation von Pflanzen oder durch topikale Applikation angestellt worden sind. Christeller et al. (1992) haben gefunden, dass eine Asparaginsäure-Peptidase-Aktivität in Darmmaterial von phytophagen Lepidopteren augenscheinlich nicht evident ist.
4. Metall-Peptidasen
Diese Enzyme werden typisch als ein katalytisch aktives Metallion (üblicherweise Zink) am aktiven Zentrum tragend erkannt sowie durch ihre Empfindlichkeit gegenüber komplexbildenden Agenzien. Die Kategorie der Metall-Peptidasen umfasst einige Endopeptidasen (Enzyme, welche innerhalb der Peptid kette spalten) und Exopeptidasen (Enzyme, die Aminosäure(n) vom Ende der Peptide abspalten). Exopeptide können ferner kategorisiert werden als Carboxypeptidasen (welche Aminosäure(n) vom C-Terminus abspalten) oder Aminopeptidasen (welche Aminosäuren vom N-Terminus abspalten).
Metall-Endopeptidasen (EC 3.4.22)
Diese Enzyme sind an der Biochemie der Insekten nicht beteiligt bis auf eine mögliche Rolle bei der Wolleverdauung von keratinphagen Lepidopteren (Prowning und Irykiewicz, 1962; Ward, 1975 a und b; Christeller et al., 1990, 1994).
Metall-Carboxypeptidasen (EC 3.4.17)
Metall-Carboxypeptidasen verlangen ein bivalentes Kation (üblicherweise Zn²⁺) für die Aktivität. Sie existieren sowohl in freier als auch in membrangebundener Form und favorisieren eine Aktivität bei hohen pH-Werten (8 bis 10). Synthetische Substrate für Carboxypeptidasen umfassen Hippuryl-DL-phenylmilchsäure und Hippuryl-L-arginin für Carboxypeptidase vom Typ A bzw. Typ B. Die Typ-A-Carboxypeptidase-Enzyme erscheinen bei Insekten üblicher; sie wurden in Orthopteren, Coleopteren, Dipteren und Lepidopteren gefunden.
Synthetische Inhibitoren für Metall-Carboxypeptidasen umfassen 1,10-Phenanthrolin, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), β-Hydroxychinolin und Phosphoramidon. Ein natürlich vorkommender Inhibitor für Metall-Carboxypeptidasen ist der Carboxypeptidase-Inhibitor aus der Kartoffel (PCPI).
Carboxypeptidase-Enzyme in freier sowie in membrangebundener Form sind in Mitteldarmmaterial von Lepidopteren-Larven erkannt worden (Ferreira et al., 1994; Christeller, 1990). Christeller et al. (1992) haben diese Enzyme als erwartete Komponenten des Proteinverdauungssystems beschrieben. Vor dem Prioritätdatum der vorliegenden Anmeldung sind diese Enzyme offensichtlich nicht als Ziele für transgene Modifikationen von Pflanzen erkannt worden, geschweige denn als Komponenten für topikale Bekämpfungsmittel.
Amino-Peptidasen (EC 3.4.11–3.4.13)
Amino-Peptidasen hydrolysieren Aminosäuren vom N-terminalen Ende der Peptidkette und werden im Allgemeinen nach ihrer Abhängigkeit von Metallionen (Zn²⁺ oder Mg²⁺) klassifiziert. Die am besten untersuchten Aminopeptidasen werden im Verdauungstrakt von Säugetieren sowohl in membrangebundener als auch in löslicher Form gefunden. Die Benennung der Aminopeptidasen wird üblicherweise vorgenommen mit einem angehängten Buchstaben, der ihr pH-Optimum bezeichnet, d. h. sauer (A), basisch (B) oder neutral (N), oder durch ihren membrangebundenen (M-)Zustand oder durch Anzahl und Typ der Aminosäuren, die von Peptidsubstraten abgespalten werden. Diese Benennungen sind nicht ausschließlich; demnach ist eine Leucin-Aminopeptidase M oder N ein Enzym, welches bevorzugt, aber nicht ausschließlich Leucin von einem Peptid entfernt, membrangebunden ist und dessen Aktivität bei neutralem pH-Wert optimal ist. Aminopeptidasen zeigen eine Vorzugshydrolyse von Leucyl-, Arginyl-, Methionyl-, Aspartyl-, Alanyl-, Glutamyl-, Prolyl-, Valyl- und Cysteinyl-Resten; die Substratspezifität ist jedoch im Allgemeinen breit und hängt ferner von den anderen Resten in der Peptidkette ab (Taylor, 1993 a und b). Die meisten Amino-Peptidasen sind Metall-Peptidasen, wenngleich einige bakterielle Enzyme bekanntlich keine Metallionen für die Aktivität verlangen (Taylor, 1993 a und b). Es gibt augenscheinlich keine natürlichen Inhibitoren für Aminopeptidase.
Insekten-Aminopeptidasen weisen üblicherweise pH-Optima im alkalischen Bereich auf und werden im Allgemeinen von Bestatin (Taylor, 1993) und Phenanthrolin (Barrett, 1994) inhibiert.
Die Substratspezifitäten sind breit, wie im Vorstehenden gesagt, wobei jedoch typische Substrate Leu-pNa, Arg-pNA, Met-pNa und Pro-pNA umfassen.
Metall-Aminopeptidasen werden durch Komplexbildner (z. B. EDTA) inhibiert, die entweder das Metallion von der Peptidase entfernen oder einen inaktiven Komplex mit dem Enzym bilden können (Terra und Ferriera, 1994). Die Wirkung eines bestimmten Komplexbildners wird in Abhängigkeit vom Typ der Aminopeptidase sowie von der Struktur des Komplexbildners selbst variieren.
Amino-Peptidasen sind ferner als Teil des Insektenkomplements von Verdauungspeptidasen erkannt worden, und man geht davon aus, dass sie in den Endstadien der Proteinverdauung beteiligt sind (Terra und Ferriera, 1994). Christeller et al. (1990, 1992) haben behauptet, dass Exopeptidasen (einschließlich Amino-Peptidasen) von geringem Nutzen für die Insektenbekämpfung sein werden wegen der geringfügigen Rolle dieser Enzyme in der Verdauung von diätetischem Protein relativ zu Serin- und Cystein-Peptidasen.
Von einer Insektenlarven-Wachstumsverzögerung nach Einwirkung von spezifischen Leucin-Aminopeptidase-(LAP-)Inhibitoren ist bisher nicht berichtet worden. Christeller et al. (1990) haben anhand von Rohextrakten des Darms der Feldgrille aufgezeigt, dass zwar die Exopeptidaselevels, insbesondere LAP, bedeutungsvoll bei diesem Insekt sind, die Exopeptidasen aber nur 16 bis 20% zur Proteinverdauung beitragen. In Christellers Studie wurde ferner gefunden, dass in Gegenwart von zwei effektiven Serinpeptidase-Inhibitoren der Beitrag von Exopeptidasen zur Proteinverdauung stark herabgesetzt wurde. Dies wurde dem Fehlen von Oligopeptid-Kettenenden, die als Substrate für Exopeptidasen wirken könnten, zugeschrieben. Dies deutete weiter auf eine geringfügige Rolle der Aminopeptidasen bei der Insektenbekämpfung hin.
Die obigen Erkenntnisse weisen stark weg von der Verwendung von Exopeptidase-Inhibitoren (in erster Linie Aminopeptidase-Inhibitoren) als Insektenbekämpfungsmittel und weisen insbesondere stark weg von der kombinierten Verwendung von Serinpeptidase-Inhibitoren und Aminopeptidase-Inhibitoren als Insektenbekämpfungsmittel.
Neben ihrer Rolle bei der Verdauung ist Aminopeptidase-Aktivität auch im Häutungsfluid des Schmetterlings Manduca sexta (Jungries, 1979) nachgewiesen worden. Auch hier erscheint jedoch die Rolle der Aminopeptidasen sekundär gegenüber derjenigen der Serin-(trypsinartigen) Peptidasen. Von keinen natürlich vorkommenden, in der Insektenentwicklung wichtigen Inhibitoren für Aminopeptidasen oder Metallpeptidasen ist bisher eine häutungsverzögernde Wirkung berichtet worden. Keiner ist bisher dafür verwendet worden, insektenresistente transgene Pflanzen bereitzustellen.
Theoretisch scheint ein großes Potential darin zu liegen, Peptidase-Inhibitoren zur Bekämpfung von Insekten einzusetzen, welche resistent gegen chemische Insektizide sind. Erstens unterscheidet sich der Wirkungsmechanismus der Peptidase-Inhibition vom Wirkungsmechanismus der Organophosphate und der synthetischen Pyrethroiden. Zweitens erscheint die Aminosäuresequenz der aktiven Zentren der Peptidase-Enzyme hochkonserviert (Taylor, 1993), was auf ein niedriges Mutationspotential hinweist, ohne den sonst damit verbundenen Aktivitätsverlust. Schließlich sollte in dem Falle, dass Insektenresistenz gegenüber einem bestimmten Peptidase-Inhibitor auftritt, diese Resistenz nicht auf andere Peptidase-vermittelten metabolischen Geschehen übertragen werden.
Mit der Verwendung von Peptidase-Inhibitoren für die Insektenbekämpfung sind jedoch beträchtliche Probleme verbunden. Es können hohe Aufwandmengen notwendig werden, was zu einem Produkt führt, welches nicht kosteneffektiv ist. Des Weiteren kann der Peptidase-Inhibitor zwar das Larvenwachstum limitieren, es ist jedoch möglich, dass ein Plateau in der Dosis-Antwort-Kurve erreicht wird, auch bei erhöhten Anwendungsmengen. Peptid-basierte oder Protein-basierte Peptidase-Inhibitoren sind zwar vermutlich nicht-residual in der Umwelt, sind aber möglicherweise nur schwer über längere Zeiträume zu speichern und können ihre Wirksamkeit verlieren, wenn sie in hartem Wasser appliziert werden. Schwierige Fragen, welche die Quelle eines bestimmten Enzyminhibitors involvieren, müssen möglicherweise angesprochen werden. So hat man zum Beispiel abnorme Antworten bemerkt, umfassend eine Wachstumshemmung von Costelytra zealandica durch Trypsin-Inhibitoren aus der Sojabohne, der Kartoffel und der Kuhbohne und eine Wachstumsstimulation durch Trypsin-Inhibitor aus der Limabohne (Dymock et al., 1992).
Beträchtliche Forschungsarbeit hat sich auf biochemische Untersuchungen des Proteinmetabolismus, in erster Linie des Verdauungsmetabolismus, der Insekten konzentriert, unter Verwendung von Insektengeweben, Darmextrakten, semi-gereinigten oder gereinigten Enzymen in vitro.
Ein großer Teil dieser Arbeiten ist auf die Selektion von Enzyminhibitoren für die transgene Modifikation von Pflanzen gerichtet, wobei die Beziehung zwi schen Verdauungsenzymen und Protein- oder Peptid-basierten Inhibitoren untersucht wird (Applebaum, 1985; Christeller et al., 1989, 1990, 1992; Lenz et al., 1991; Teo et al., 1990; Pritchett et al., 1981, Santos und Terra, 1984; Dow, 1986; Sakal et al., 1984, 1989).
Relativ weniger Untersuchungen demonstrieren einen direkten abträglichen Einfluss von Peptidase-Inhibitoren auf Insektenwachstum und/oder -reproduktion. Für Serin- und Cystein-Peptidase-Inhibitoren wurde gezeigt, dass sie das larvale Wachstum und/oder Überleben bei verschiedenen Insekten mindern, einschließlich Callosobruchus maculatus, Leptinotarsa decemlineata, Heliothis spp, Spodoptera exiqua, Costelytra zealandica, Teleogryllus commodus, Diabrotica sp, Manduca sexta, rotbrauner Reismehlkäfer und Speisebohnenkäfer (Gatehouse und Boulter, 1983; Shukle und Murdock, 1983; Shade et al., 1986; Wolfson und Murdoch, 1987; Broadway und Duffey, 1986; Hilder et al., 1987; Dymock et al., 1982; Orr et al., 1994; Burgess et al., 1994; Hines et al., 1990).
Allgemein ist eine Insektenwachstumshemmung mit Inhibitoren der wichtigsten Verdauungsenzyme des Darms erzielt worden, und ein Verfahren zur Selektion geeigneter insektizider Inhibitoren auf Basis dieser Enzyme ist von Christeller et al. (1992) beschrieben worden.
Keine der obengenannten Untersuchungen scheint direkt auf die Herstellung von topikalen Insektenbekämpfungsmitteln durch Interferenz mit dem Proteinmetabolismus abzuzielen. In der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO94/16565 (Czapla) gibt jedoch ein Nebenanspruch die topikale Verwendung von Aprotinin oder eines anderen Serinpeptidase-Inhibitors mit 90% Homologie zu Aprotinin zur Bekämpfung des Europäischen Kornbohrers (ECB) und des "Southern corn rootworm" (SCR) an. Es wird beansprucht, dass Aprotinin für sich allein oder in Kombination mit einem insektiziden Lektin verwendet werden kann. Von Czapla wurde gefunden, dass die Inkorporierung von Aprotinin, wenn es zu 20 mg/dl in der Diät verabreicht wurde, 100% der neonatalen ECB-Larven sowie 60% der neonatalen SCR in einem Labortest abtötete. So hohe Ingestionsraten wären bei einer topikalen Anwendung schwer zu erzielen, und die Behandlungskosten wären kaum wettbewerbsfähig mit che mischen Insektiziden. Czapla fand, dass der Serinpeptidase-Inhibitor SBTI (Kunitz und Bowman-Birk) und der Cysteinpeptidase-Inhibitor Cystatin weniger effektiv waren als Aprotinin.
Eine direkte Verfütterung von SBTI an blutsaugende Insekten ist von Deloach und Spates (1980) untersucht worden. Sie fanden eine erhöhte Mortalität und supprimierten Eischlupf, wenn SBTI in Rindererythrocyten eingekapselt als Köder für Hornfliegen verwendet wurde. Im Blut kommen bekanntlich verschiedene natürliche Peptidase-Inhibitoren vor (in erster Linie Serin-Peptidasen). Ihrer Wirksamkeit, das Tier vor dem Angriff von Insekten zu schützen, sind jedoch Grenzen gesetzt (Sandeman et al., 1990).
Wolfson und Murdock (1987) haben beobachtet, dass es zwar eine umfangreiche Dokumentation über Vorhandensein und Verteilung von Peptidase-Inhibitoren in Pflanzen gibt und dass diese Inhibitoren als auf Insekten-Verdauungspeptidasen gerichtet angesehen werden, dass es aber nur wenige direkte Beweise gibt, die ihre effiziente Wirkung in der Hemmung des Insektenwachstums und der Insektenentwicklung belegen könnten. Diese Autoren haben demonstriert, dass eine Reduzierung des Larvenwachstums beim Colorado Kartoffelkäfer durch Fütterung von E-64 (ein Cysteinpeptidase-Inhibitor) bei Schwellwerten von 50 μg/ml auf Kartoffelblättern erzielt werden konnte. Jedoch wurde bei einer viel höheren Anwendungsmenge (1000 μm/ml) ein Plateau in der Mortalität von 74 bis 85% gefunden, was für den praktischen Einsatz nicht ausreichend ist. SBTIs (Kunitz und Bowman-Birk) waren ineffektiv als Wachstumsverzögerer und es wurde nur eine kleine Antwort auf Pepstatin gefunden.
Ein Forschungs-Paper von Dymock et al. (1992) hat die Wachstumshemmung einer Käferart im Larvenstadium ("New Zealand native grass grub") durch Peptidase-Inhibitoren diskutiert. Im Brennpunkt der Untersuchung stand die genetische Transformation wichtiger Futterpflanzenspezies, da die Raupen sich von Wurzeln ernähren. Bioassays haben eine Wachstumshemmung unter Verwendung von Serinpeptidase-Inhibitoren gezeigt. Einige anomale Antworten auf bestimmte Inhibitoren wurden bemerkt (Inhibition durch SBTI, POT I, POT II, CpTI, Stimulation durch LBTI). Christeller et al. (1989) hatten zuvor Trypsin als die Hauptpeptidase im Darm der obengenannten Raupe gefunden, trotz der Tatsache, dass normalerweise Coleopteren-Darmpeptidasen überwiegend in die Cystein-Kategorie fallen. Allgemein war die zum Erhalt von Mortalität erforderliche Aufwandmenge von Peptidase-Inhibitoren zu hoch, um für die topikale Anwendung noch kosteneffektiv zu sein.
Zusammensetzungen, welche durch Inhibition von Metall-Peptidasen wirken (einschließlich Aminopeptidase oder LAP), sind für die Insektenbekämpfung nicht kommerziell entwickelt worden. In der Tat weist der Stand der Technik weg von der Verwendung von Peptid-basierten Aminopeptidase-Inhibitoren oder Metallpeptidase-Inhibitoren für die Insektenbekämpfung, denn:

(a) effektive Inhibitoren der obengenannten Kategorie, welche für die genetische Transformation von Pflanzen geeignet wären, sind noch nicht identifiziert worden,
(b) die apparente Rolle dieser Enzyme ist geringer relativ zu den vorherrschenden Cystein- und/oder Serin-Peptidaseaktivitäten im Darm von Insekten.

Shenvi (1993) hat die Verwendung von α-Aminoborsäurederivaten als effektive Inhibitoren für Säugetier-Aminopeptidasen diskutiert. Shenvi bemerkt, dass gewisse Zwischenprodukte bei der Synthese von α-Aminoborsäurederivaten insektizide Eigenschaften haben; jedoch hatten diese Zwischenprodukte keine Aminogruppe, und es wird nicht vorgeschlagen, dass sie entweder als Aminopeptidase-Inhibitoren oder Peptidase-Inhibitoren irgendeiner Art wirken.
Der sechszähnige Komplexbildner EDTA wurde von Samuels und Paterson (1995) und Ferreira und Terra (1986) als Inhibitor einer Aminopeptidase aus dem Häutungsfluid und Verdauungsmembranen erkannt. Ein insektizider Effekt von EDTA wird nicht erkannt; jedoch wurden allgemeine Ansprüche auf die insektizide Wirkung von Metall-Komplexbildnern von Tomalia und Wilson (1985, 1986) gemacht. Ein Nachweis, der dies unterstützen würde, wurde nicht erbracht. Die Verwendung von Metall-Komplexbildnern zur Insektenbekämpfung würde erwartungsgemäß abträglich beeinflusst durch die Verwendung von hartem Wasser bei der Spritz- oder Sprüh applikation oder im Falle einer mineralischen oder Bodenkontamination der zu behandelnden Materialien.
Wir haben nun überraschend gefunden, dass Zusammensetzungen, welche einen Aminopeptidase-Inhibitor oder Metallpeptidase-Inhibitor umfassen und welche ferner einen nicht stark komplexbildenden Peptidase-Inhibitor umfassen, dazu befähigt sind, den Schlupf von Insekteneiern und/oder die Entwicklung von Insektenlarven zu verhindern. Für den Fachmann wird erkennbar sein, dass die große Mehrheit von Aminopeptidase-Inhibitoren in der Tat nicht stark komplexbildend ist in dem Sinne, wie dieser Begriff hierin definiert ist.
Es wird klar erkennbar sein, dass die Erfindung über vielfältige Mechanismen auf die Bekämpfung von Insekten Anwendung finden kann. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zum Beispiel zur tatsächlichen Abtötung der Insekten führen oder zur Unterbrechung von Wachstum und Entwicklung der Insekten, so dass die Reife verzögert oder verhindert wird. Eine Verhinderung des Schlupfs von Insekteneiern ist besonders wünschenswert, weil bei einer großen Zahl von ökonomisch wichtigen Insekten der Schaden durch die Fraßaktivitäten ihrer Larven verursacht wird.
Es wird ferner erkennbar sein, dass wegen der breiten Variation der individuellen biochemischen Kapazitäten innerhalb der Mitglieder der Klasse der Insekten die jeweilige Antwort auf bestimmte Inhibitoren und/oder Kombinationen von Inhibitoren von Art zu Art variieren kann. Demnach ist es möglich, dass einige Zusammensetzungen im Bereich der vorliegenden Erfindung bei einigen Insekten eine schlechte oder gar keine Wirkung zeigen, während sie bei anderen eine hohe Wirksamkeit entfalten. Variationen in den Antworten sind auch auf Unterartniveau zu sehen oder in den verschiedenen Stadien des Lebenszyklus bestimmter Insekten oder sogar in den Diäten der Insekten. Für den Fachmann wird es möglich sein, die jeweiligen Inhibitoren den Zielinsekten mit Hilfe normaler Trial-and-Error-Labor- und -Feldversuche anzupassen.
Für den Fachmann wird ferner erkennbar sein, dass die Erfindung auf vielfältige Weise Verwendung finden kann; dazu gehören, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein:

(a) Bekämpfung des Insektenbefalls durch direkte Applikation auf Pflanzen oder Tiere, die für einen solchen Befall anfällig sind;
(b) Reduzierung der Zahl der Insekten durch Anwendung der erfindungsgemäßen Mittel auf die Habitate oder Brutplätze der Insekten;
(c) Bekämpfung – entweder prophylaktisch oder schweregradmindernd – von Infektionen bei Pflanzen oder Tieren, welche durch Insekten übertragen werden; und
(d) Bekämpfung – entweder prophylaktisch oder schweregradmindernd – von Infektionen bei Pflanzen oder Tieren, welche als Folge eines Insektenbefalls auftreten.

Im Sinne der vorliegenden Beschreibung ist der Ausdruck "Peptidase-Inhibitor" als eine beliebige Verbindung zu verstehen, welche eine beliebige Peptidase zu hemmen vermag.
Praktisch kann ein Peptidase-Inhibitor mit Hilfe des folgenden Verfahrens identifiziert werden.

1. Selektion repräsentativer aktiver Peptidasen, welche in einem gereinigten Zustand oder in Zusammensetzungen, welche das aktive Enzym enthalten, vorliegen können.
2. Selektion eines Enzymaktivitäts-Assays für jede der repräsentativen Peptidasen durch Selektion eines geeigneten Substrates für das Enzym und geeigneter Bedingungen für die Reaktion, so dass ein geeigneter quantifizierbaren Endpunkt innerhalb eines geeigneten Zeitraumes erhalten wird.
3. Die Testverbindung wird als ein Peptidase-Inhibitor angesehen, wenn eine Reaktionshemmung von 50% oder mehr in einem der obengenannten Enzymaktivitäts-Assays gefunden wird.

Im Besondern kann ein Metallpeptidase-Inhibitor oder ein Aminopeptidase-Inhibitor auf diese Weise identifiziert werden.
Der Ausdruck "nicht stark komplexbildender Peptidase-Inhibitor" soll einen Peptidase-Inhibitor bedeuten, der in einem kompetitiven Bindungstest Zn²⁺-Ionen weniger stark komplexiert als EDTA. Sowohl EDTA als auch der Inhibitor sollten bei der gleichen Konzentration in der Reaktionsmischung vorliegen, wobei ein geeigneter Wert 0,1 mM betragen kann. Der Fachmann wird in der Lage sein, geeignete Reaktionsbedingungen und Methoden zur Bestimmung der Zn²⁺-Verteilung zu wählen (z. B. unter Einsatz der Mehrkern-Kernspinresonanz (NMR), UV-Spektroskopie, voltametrischer Techniken und der Massenspektroskopie mit weicher Ionisation).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt umfasst die Erfindung eine Zusammensetzung für die Bekämpfung von Insekten, wobei die Zusammensetzung einen Aminopeptidase-Inhibitor oder einen Metallpeptidase-Inhibitor umfasst und wobei die Zusammensetzung ferner einen nicht stark komplexbildenden Peptidase-Inhibitor umfasst.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann eine Aminogruppe oder ein Derivat hiervon umfassen oder einen oder mehrere Aminosäurekomponenten oder Derivate hiervon. Bevorzugt umfasst der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor einen Leucin-, Arginin-, Methionin-, Asparagin-, Alanin-, Glutamyl-, Prolyl-, Valyl- oder Cystein-Baustein oder ein Derivat hiervon. Noch bevorzugter umfasst der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor einen Leucin-Baustein oder ein Derivat hiervon.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann mit einem oder mehreren Metallionen am aktiven Zentrum der Metallpeptidase oder der Aminopeptidase wechselwirken.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann einen Komplexbildner umfassen, bei dem es sich bevorzugt um einen zweizähnigen, dreizähnigen, vierzähnigen oder sechszähnigen Komplexbildner handelt. Bevorzugt ist der Komplexbildner eine Aminocarbonsäure-Komponente oder ein Salz hiervon mit komplexbildenden Eigenschaften, noch bevorzugter Ethylen diamintetraessigsäure oder Nitrilotriessigsäure oder ein Salz oder Derivat hiervon mit komplexbildenden Eigenschaften.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann ein wasserlösliches Übergangsmetallion oder einen Komplex oder ein Derivat hiervon umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Kupfer, Cobalt, Zink, Vanadium, Magnesium, Mangan und Eisen besteht.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann eine Boronsäure-, Phosphoryl- oder Phosphonyl-Baueinheit umfassen.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann irreversibel an eine Aminopeptidase oder eine Metallpeptidase binden.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann einen selektiven Inhibitor umfassen, welcher Trypsin oder Calpain nicht inhibiert und welcher bevorzugt andere Serin- oder Cystein-Peptidasen nicht inhibiert.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor kann ein Enzym inhibieren, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Leucin-Aminopeptidasen, Aminopeptidasen vom Typ A, B, N und M, Arginin-Aminopeptidasen, Methionin-Aminopeptidasen, D-Aminosäure-Aminopeptidasen, Peptidyl-Dipeptidasen, Zink-Aminopeptidasen, N-Formylmethionin-Aminopeptidasen, Dipeptidyl-Aminopeptidasen, Carboxypeptidasen vom Typ A und B, Tripeptidyl-Peptidasen, Dipeptidyl-Peptidasen und Peptidyl-Tripeptidasen besteht.
Bevorzugt ist der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor zur Inhibition einer Leucin-Aminopeptidase, noch bevorzugter zur Inhibition einer Insekten-Leucin-Aminopeptidase befähigt.
Der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor kann einen Serin-Peptidase-Inhibitor, einen Cysteinpeptidase-Inhibitor, einen Aspartylpeptidase-Inhibitor oder einen Aminopeptidase-Inhibitor umfassen. Inhibitoren, welche für die vorliegende Erfindung Anwendung finden können, umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein:

– Trypsin- und Chymotrypsin-Inhibitoren, z. B. Pefabloc;
– Serin- oder Cysteinpeptidase-Inhibitoren aus Leguminosen, Gemüsen, Früchten oder Cerealien;
– Cystatine und E-64;
– Carboxypeptidase-Inhibitoren aus der Kartoffel oder anderen Quellen;
– Eglin C;
– L-Leucinthiol

Trypsin- und Chymotrypsin-Inhibitoren umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein: Kunitz-Trypsin-Inhibitor (SBTI), Bowman-Birk-Trypsin- und Chymtrypsin-Inhibitor, Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen, Trypsin-Inhibitor aus Rinderpankreas, Trypsin-Inhibitor aus Hühnerovomucoid, Trypsin-Inhibitor aus Cucurbit maxima, POT-I- und POT-II-Trypsin-Inhibitor, α-1-Antitrypsin, Arrowhead-Trypsin-Inhibior, Erythrin-Trypsin-Inhibitor und humanen inter-alpha-Trypsin-Inhibitor.
Serin- oder Cystein-Peptidase-Inhibitoren aus Leguminosen, Gemüsen, Früchten oder Cerealien umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Peptidase-Inhibitoren aus roten Bohnen, Kuhbohnen, Spalterbsen, Flügelbohnen, Mungobohnen, Senf, Kürbis, Gemeiner Kümmel, Cajun-Erbsen, Baumwolle, Mais, Weizen, Sorghum, Rapssamen, Hirse, Gerste und Gartenkürbis.
Cystatine umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Oryzacystatin I und II aus Reis, Multicystatin aus der Kartoffel und seine trypsinverdauten Untereinheiten und Cystatin aus Hühnerei.
Immer, wenn im vorliegenden Text auf Peptidase-Inhibitoren mit ihrem Trivialnamen Bezug genommen wird, erstreckt der Bezug sich auch auf Analoga dieser Inhibitoren, d. h. Inhibitoren mit ähnlicher Struktur und/oder ähnlichen inhibierenden Charakteristika (Wechselwirkungen mit dem aktiven Zentrum/den aktiven Zentren des Zielenzyms) zu der/den allgemein anerkannten Substanz/en.
Geeignete Analoga können Teile des benannten Inhibitors, Konjugate desselben oder Substanzen mit mindestens 70% Homologie, bevorzugt mindestens 80% Homologie, meistbevorzugt mindestens 90% Homologie zu der benannten Substanz sein.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann optional ferner ein oder mehrere Additive umfassen, so etwa Dispergiermittel, viskositätsmodifizierende Mittel, Gefrierschutzmittel, Benetzer, Co-Lösemittel, UV-Absorber, Farbstoffe und Träger, welche pharmazeutisch, veterinärmedizinisch, landwirtschaftlich oder gartenbaulich zulässig sind.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung einen Aminopeptidase-Inhibitor, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus L-Leucinthiol, Actinonin, Bestatin, 1,10-Phenanthrolin und EDTA besteht, zusammen mit einem nicht stark komplexbildenden Peptid-Inhibitor, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus SBTI, Pefabloc und Antipain besteht.
Der Aminopeptidase-Inhibitor oder der Metallpeptidase-Inhibitor oder der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor umfasst bevorzugt ein Peptid, ein Polypeptid und/oder ein Protein.
Gemäß einem zweiten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Insekten, welches den Schritt umfasst, die Insekten einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung auszusetzen.
Bevorzugt werden die Insekten bekämpft durch Inhibieren des Schlupfs der Insekteneier und/oder durch Inhibieren der Entwicklung der Insektenlarven durch Aussetzen der Insekteneier oder -larven einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Insekt um eine Spezies, die einer Ordnung zugehört, ausgewählt aus der Gruppe der Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera, Psocoptera, Hymenoptera, Dictyoptera, Isoptera, Thysanoptera, Homoptera, Diptera, Anoplura, Malophaga und Siphonaptera. Noch bevorzugter ist das Insekt ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Myiasisfliegen, knospenfressenden Mottenlarven, Flöhen, Feldgrillen, Schaben, hellbraunen Apfelmotten und Korn- und Mehlvorratsinsekten besteht.
In Einklang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Zielinsekt durch ein beliebiges geeignetes Mittel dem Enzyminhibitor ausgesetzt werden. Für den Fachmann wird erkennbar sein, dass diese Mittel vielfältig variieren können, in Abhängigkeit davon, ob der Inhibitor auf eine Pflanze oder auf ein Tier angewendet werden soll, und in Abhängigkeit von der Natur des Zielinsektes und der Pflanze oder des Tieres. Die Mittel, welche zum direkten Anwenden von Enzyminhibitoren auf die von dem Insekt angegriffenen Pflanzen oder Tiere geeignet sind, können sich erheblich von denjenigen Mitteln unterscheiden, die zum Anwenden des Enzyminhibitors auf die Insektenhabitate oder -brutplätze geeignet sind.
Geeignete Mittel zum Anwenden von Enzyminhibitoren auf Tiere umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, die direkte topikale Applikation, z. B. durch Tauch- oder Sprühmethoden, oder die innere Anwendung, wie Tränken, Implantate, verzögernd freisetzende Bolus-Formulierungen oder Vorrichtungen, welche zur Retention im Rumen geeignet sind, und Insektenköder und Tabletten. Wo die erfindungsgemäßen Agenzien auf den Menschen angewendet werden, umfassen die zur topikalen Applikation geeigneten Formulierungen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Sprays, Aerosole, Cremes und Lotionen, und Formulierungen, welche zur inneren Anwendung geeignet sind, umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Tabletten, Kapseln oder flüssige Formulierungen. In manchen Situationen kann eine parenterale Administration durch Injektion das geeignetste Behandlungsmittel für Mensch oder Tier sein.
Wo der Enzyminhibitor auf Pflanzen angewendet werden soll, umfassen geeignete Mittel, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Sprays, Stäube, Pellets oder Aerosole. Das erfindungsgemäße Verfahren erstreckt sich auch auf den gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Einsatz von zwei oder mehr Metallpeptidase-Inhibitoren oder die Verwendung von einem oder mehreren Metallpeptidase- oder Aminopeptidase-Inhibitoren in Verbindung – gleichzeitig oder aufeinanderfolgend – mit einem oder mehreren Inhibitoren für andere Arten von Enzymen, einem oder mehreren Inhibitoren für andere insektenphysiologische Prozesse oder einem oder mehreren anderen insektiziden Agenzien, gleichgültig, ob die Applikation dieser anderen Inhibitoren topikal, innerlich oder durch transgene Modifikation geschieht.
Einige Inhibitoren, welche für die Erfindung Verwendung finden können, sind von ihrer Natur her Peptide, Polypeptide oder Proteine.
Für bevorzugte, nicht-limitierende Ausführungsbeispiele der Erfindung sind:

(a) die Tiere, welche mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden sollen, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Menschen, Schafen, Rindern, Pferden, Schweinen, Geflügel, Hunden und Katzen besteht;
(b) die Pflanzen, welche mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden sollen, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Baumwolle, Ölsaatkulturpflanzen, Zierpflanzen, Blumen, Obstbäumen, Getreidekulturpflanzen, Rebenkulturpflanzen, Hackfrüchten, Futterpflanzen und Gemüsen besteht;
(c) die zu bekämpfenden Insekten im Falle der Anwendung der Erfindung im Gartenbau und im großenflächigen Anbau: Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera, Isoptera, Thysanoptera oder Homoptera; im Falle von durch Insekten verursachten Infektionen beim Tier: Diptera, Anoplura, Malophaga oder Siphonaptera; oder im Falle von Haus- oder Industrieschädlingen: Isoptera, Dictyoptera und Hymenoptera.

DETAILBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird nun im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-limitierenden Beispiele rein beispielhaft beschrieben.
Die folgenden Beispiele demonstrieren die Insektenwachstumshemmung oder die insektiziden Aktivitäten, welche mit Hilfe der Erfindung erhalten werden. Es versteht sich jedoch, dass auch andere Verfahren und Anwendungen möglich sind. Die Effekte von Inhibitoren für Serin- und Cystein-Peptidasen allein (die nicht in den Bereich der Erfindung fallen) sind mit aufgenommen, um die Variabilität in den Antworten auf Inhibitoren von Art zu Art zu veranschaulichen oder um durch die Verwendung der Erfindung nachfolgend erhaltene additive oder synergetische Vorzüge beispielhaft zu befeuchten.
Beispiel 1 Einfluss von einzelnen Inhibitoren auf Wachstum und Überleben von Larven der Schafschmeißfliege (Lucilia cuprina; Diptera)
Verfahren
Die Larven schlüpften aus Eiern, deren Oberfläche mit 0,5% Natriumhychlorit sterilisiert und über Nacht bei 27°C inkubiert worden war. Die Larven im ersten Stadium (im Folgenden auch Erstlarven genannt) wurden gesammelt und auf 1 ml eines autoklavierten Kulturmediums mit bzw. oder ohne zusätzliche/n Inhibitor/en, wie angegeben, gesetzt. Das Kulturmedium bestand aus 2% Agar, 10% Casein, 2% Hefe und 0,5 Glucose in destilliertem Wasser in einer sterilen Ampulle oder Flasche. Fünf bis fünfzig Larven, je nach vorgesehener Dauer der Kultur, wurden in jede Flasche eingebracht, die sodann mit einem Deckel mit einem feinen Kunststoffnetzeinsatz verschlossen wurde. Diese Kappe gestattete einen freien Luftaustausch in der Flasche.
Die Flaschen wurden dann in einen großen sterilen Behälter eingebracht, der dicht verschlossen wurde, um Kontakt mit der Umgebung zu vermeiden. Der Behälter umfasste Einlass- und Auslassschläuche, die mit einer Quelle für sterile, erwärmte und befeuchtete Luft bzw. einer Vakuumpumpe verbunden waren. Die Vorrichtung, einschließlich der Kulturflaschen, wurde für 24 bis 72 h bei 35°C gehalten. Dies erlaubte ein Wachstum der Larven bis zu den erforderlichen Entwicklungsstadien.
Die Kulturen wurden in einer Sterilluftstromhaube angeordnet und in einer sterilen Umgebung inkubiert, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination durch Bakterien, welche das Larvenwachstum fördern oder behindern könnten und wodurch die Resultate ihre Gültigkeit verlieren würden, auf ein Minimum zu reduzieren. Nach der vorgesehenen Kulturdauer wurden die Flaschen entnommen und die Larven durch Gefrieren abgetötet. Sie wurden sodann getrocknet und gewogen, entweder zusammen oder einzeln.
Das Gewicht von Insektenlarven in Kontrollkulturen (Larven, die gleichzeitig unter den gleichen Umgebungsbedingungen und mit der gleichen Nahrung, aber ohne Inhibitoren aufgezogen wurden) wurde dann mit dem Gewicht der Larven mit Inhibitoren verglichen und die Inhibition (I) in Prozent gemäß der folgenden Formel berechnet:
worin
a = das Gewicht der Larven in Gegenwart des Inhibitors ist und
c = das Gewicht der Kontrolllarven bedeutet.
In diesem Kultursystem ist eine große Zahl von Inhibitoren getestet worden, von denen eine Auswahl in Tabelle 1.1 aufgelistet ist. Die Effekte der Inhibitoren auf Erstlarven-Wachstum und -Überleben sind in Tabelle 1.2 aufgezeigt.
Tabelle 1.1 Peptid-Inhibitoren und diesbezügliche Verbindungen im Test gegen Schmeißfliegenlarven in vitro
Tabelle 1.2 Die Wirkung von verschiedenen Inhibitoren auf Erstlarven-Wachstum und -Überleben
Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass Inhibitoren, welche trypsin-artige Enzyme beeinflussen, wirksam sind, das Larvenwachstum zu verlangsamen, oder – im Falle von TLCK – die Larven bei den höchsten getesteten Konzentrationen abzutöten. E64, ein Cysteinpeptidase-Inhibitor, war unwirksam; die Wirkungen des Calpain-Inhibitors auf das Wachstum und die dazwischenliegende Inhibition durch Leupeptin und APMS (nicht-cysteinspezifische Inhibitoren) legen jedoch nahe, dass Cysteinpeptidasen möglicherweise eine wesentliche Rolle zukommt.
Die Unwirksamkeit der Inhibition von Aspartylpeptidase(n) durch Pepstatin steht in Einklang mit älterer Literatur.
Das überraschende Ergebnis dieses Experiments war der dominierende Einfluss von einigen Aminopeptidase-Inhibitoren auf das Larvenwachstum. Diese Resultate zeigen, dass die Wirksamkeit der Inhibition von larvale/r/n Aminopeptidase/n gegeben war. L-Leucinthiol, EDTA, 1,10-Phenanothrolin, Bestatin, Amastatin, Leuhistin und Actinonin waren wirksame Wachstumsinhibitoren. Die Inhibitoren für Dipeptidylaminopeptidase (Diprotin A) und Methioninaminopeptidase (Ebalacton) waren unwirksam.
Beispiel 2 Einfluss von kombinierten Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben von Larven der Schafschmeißfliege (L. cuprina; Diptera)
(a) Verwendung kombinierter Serin- und Serin:Aminopetidase-Inhibitor-Kombinationen
Die Daten aus den in Beispiel 1 umrissenen Tests ließen vermuten, dass Kombinationen der Inhibitoren, die trypsinartige und/oder Aminopeptidase-Enzyme beeinflussten, additive oder synergistische Effekte haben könnten. Es wurden weitere Versuche durchgeführt, um diese Möglichkeit zu untersuchen, unter Einsatz der im Vorstehenden beschriebenen Methoden. Die Resultate sind in Tabelle 2.1 dargelegt.
Tabelle 2.1 Inhibitor-Kombinationen und ihre Wirkung auf das Erstlarvenwachstum und -überleben in vitro
Aus der Kombination von SBTI mit Leupeptin oder Pefabloc war nur eine geringe Wirkung ersichtlich. Eine moderate Wirkung wurde mit SBTI und EDTA erhalten. Größere Hemmung trat ein, wenn SBTI mit TLCK oder L-Leucinthiol getestet wurde. Die Resultate legen nahe, dass eine multiple Inhibition von trypsinartigen Peptidasen und Aminopeptidasen eine geeignete hemmende Wirkung auf die Larven hat.
(b) Untersuchung der Wirkung der Kombination eines Serinpeptidase-Inhibitors (SBTI) mit einem Aminopeptidase-Inhibitor (L-Leucinthiol) auf die Wachstumshemmung von L. cuprina-Larven
Die Wirkung der Kombination von SBTI- und L-Leucinethiol-Inhibitoren auf das Larvenwachstum wurde über einen Bereich von Konzentrationen untersucht, um die Möglichkeit des Auftretens einer synergistischen Inhibition zu erfor schen. Dieser Versuch wurde beendet, noch bevor eine signifikante Mortalität eintrat. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2.2 gezeigt.
Tabelle 2.2 Inhibierende Wirkung der Kombination von SBTI- und L-Leucinthiol (L-Leu-)Inhibitoren auf das Larvenwachstum
(c) Untersuchung der Wirkung der Kombination von zwei Aminopeptidase-Inhibitoren (EDTA und L-Leucinthiol) auf das Wachstum der Larven von L. cuprina
Die Resultate dieser Versuche sind in Tabelle 2.3 aufgezeigt.
Tabelle 2.3 Kombination von EDTA und L-Leu
Beispiel 3 Einfluss von Peptidase-Inhibitoren auf den Larvenschlupf aus Eiern der Schafschmeißfliege (L. cuprina; Diptera) und Heliothis punctigens
Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um zu ermitteln, ob die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine insektizide Rolle durch Inhibition des Eischlupfs erfüllen konnten.
Eier von L. cuprina wurden auf Leberstücke (0,9 g) abgelegt, die sodann in einzelne Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen platziert wurden. Eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 0,1 ml), welche die Inhibitoren bei bestimmten Konzentrationen enthielt, wurde zu jeder Vertiefung mit 30 frisch abgelegten und sterilisierten Eiern von L. cuprina hinzugegeben. Die Kulturplatte wurde dann bei 35°C für 24 h in einer sterilen Umgebung gehalten; nach Ablauf dieser Zeit wurde der Schlupf in Prozent beurteilt.
Heliothis-Eier wurden auf einem definierten Medium (Casein 3 g, Weizenkeime 3 g, Sucrose 5 g, Agar 2,25 g, Multivitamin-B-Tabletten 5 mg, gelöst in 80 ml PBS mit Penicillin und Streptomycin) in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen (2 Eier/Vertiefung) kultiviert. Der Eischlupf wurde nach dreitägiger Inkubation bei 27°C beurteilt. Die Resultate sind in Tabelle 3.1 dargestellt.
Tabelle 3.1 Die Wirkung von Enzym-Inhibitoren auf die Eischlüpfrate für L. cuprina in vitro
In anfänglichen in vitro-Versuchen schlüpften zehn Heliothis-Eier in einer Mischung von 0,17 mM SBTI und 5 mM Actinonin nicht, während alle zehn Kontrolleier schlüpften.
Beispiel 4 Einfluss der Erfindung auf Wachstum und Überleben des Baumwollknospenwurms (Heliothis punctigens, Lepitdoptera) bei Fütterung der Larven mit einer synthetischen Diät
Eine synthetische Diät wurde wie folgt hergestellt:

Gartenbohnen 468 Gramm (g)

Weizenkeime 100 g

Hefe 70 g

Ascorbinsäure 70 g

Paraben 44 g

Sorbinsäure 2,2 g

Agar 28 g

H₂O 800 ml

Phosphor- und Propionsäure 4 ml

29 ml Propionsäure

21 ml Orthophosphorsäure

270 ml dH₂O

500 ml Gesamtvolumen

1. Die Gartenbohnen wurden 40 Minuten in der Mikrowelle gekocht.
2. Der Agar wurde zu dem heißen Wasser hinzugegeben und auf einer Heizplatte fast bis zum Sieden gerührt.
3. Die Gartenbohnen, die Agarmischung, die Hefe und die Weizenkeime wurden in einem elektrischen Mixer 3 Minuten gemischt.
4. Nachdem die Temperatur auf 60°C gesunken war, wurden die Säuren zugesetzt und mit den Medien vermischt.
5. Die Inhibitorlösungen oder ein gleiches Volumen an Wasser wurden in den angegebenen Konzentrationen in sterilisierte Glasröhrchen gegeben. Das synthetische Medium wurde in jedes Röhrchen gegeben (1,5 ml), wobei eine sterile 10 ml-Spritze verwendet wurde. In die Glasröhrchen wurden Heliothis punctigens-Larven im ersten Stadium gesetzt (1 Larve pro Röhrchen) und die Röhrchen dann verschlossen. Die Röhrchen wurden 10 Tage bei 25°C inkubiert. Die Larven wurden getötet, indem die Glasröhrchen für 24 h bei –70°C gehalten wurden; sodann wurden sie einzeln gewogen. Die Inhibition in Prozent wurde durch Vergleich mit Kontrolllarven berechnet.

Die Resultate sind in Tabelle 4.1 gezeigt.
Tabelle 4.1 Wachstum von Heliothis punctigens-Larven bei Fütterung mit einer synthetischen Diät mit und ohne Inhibitoren
Beispiel 5 Einfluss von Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben von Katzenflöhen (Ctenocephalides felis; Siphonaptera)
Einem fünf Jahre alten Merinoschaf, welches seit 18 Monaten nicht mit einem Mittel gegen Ectoparasiten behandelt worden war, wurde Blut aus der Drosselvene entnommen. Das Blut wurde in einer 100 ml-Kunststoffflasche gesammelt, welche 0,8 ml Heparin enthielt, und bei 4°C gehalten. Die Inhibitoren wurden vorher in sterile 5 ml Kunststoffampullen eingewogen; hierzu wurden 4,5 ml Blut gegeben. Die Proben wurden gemischt und 24 h bei –70°C gehalten, anschließend gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Proben wurden durch ein 63 μm-Edelstahlsieb gesiebt und in sterile 5 ml-Kunststoffampullen gegeben (0,15 g pro Röhrchen). In jede Ampulle wurden vier Floheier gegeben, und jede Ampulle wurde mit einem Blatt Tissuepapier, welches mit Hilfe eines elastischen Bandes befestigt wurde, oben abgedeckt. Die Ampullen wurden bei 25°C und 70 bis 80% r. F. 6 Tage inkubiert. Sodann wurde Vermiculit in jede Ampulle gegeben, um ein Stützmedium für die Verpuppung der Flöhe bereitzustellen, und die Röhrchen wurden bei 25°C und 70 bis 80% r. F. wei tere 10 Tage inkubiert. Es wurden zehn Kontrollampullen und drei Ampullen pro Behandlung getestet.
Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Ampullen 24 h bei –20°C gehalten, um die Flöhe abzutöten. Die Zahl der geschlüpften Eier und das Lebenszyklusstadium wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5.1 aufgezeigt.
Tabelle 5.1 Entwicklung von Floheiern in Trockenblutdiäten (Tag 16)
Beispiel 6 Einfluss von Peptidase-Inhibitoren auf das Überleben von Larven der Schwarzen Feldgrilie (Teleogryllus commodus, Orthoptera) bei Fütterung einer natürlichen Diät

(i) Stammlösungen von Inhibitoren und Kontrolllösungen wurden als wässrige Lösungen oder Suspension hergestellt, wie in Tabelle 6.1 aufgeführt.
(ii) Zur Mortalitätsbeurteilung wurde die Untersuchung mit dem ersten Nymphenstadium begonnen.
(iii) Scheiben aus Kohlblättern (5 Scheiben mit jeweils 8 mm Durchmesser pro Behandlung) wurden mit 100 μl Inhibitor- oder Kontroll-Stammlösungen bestrichen und trocknen gelassen. Die Scheiben wurden einzeln in 40 mm-Petrischalen gegeben, zusammen mit einem feuchten Baumwollbausch als Wasserversorgung und einem Stück flötenartig geformten Kunststoff als Unterschlupf.
(iv) Zehn Nymphen wurde auf jede Scheibe platziert und die Schalen wurden bei 25°C inkubiert.
(v) Die Mortalität wurde täglich beurteilt, wobei tote Individuen entfernt wurden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6.1 dargestellt.
Tabelle 6.1 Effekt von verschiedenen Inhibitoren auf die Mortalität von larvalen Feldgrillen nach 7 Tagen
Beispiel 7 Einfluss von Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben von Schafläusen (Bovicola ovis; Anoplura)
Die Schaflaus ist ein bedeutendes landwirtschaftliches Schadinsekt in Australien und vielen anderen Ländern. Einige Stämme der Insekten entwickeln hohe Resistenzgrade gegenüber Organophosphaten und synthetischen Pyrethroiden. Zweck dieses Versuchs war,

(i) die Beurteilung der Wachstumshemmung oder insektiziden Aktivität der für die Erfindung geeigneten Inhibitoren zu erweitern; und
(ii) die Beurteilung der Wachstumshemmung oder insektiziden Aktivität der Erfindung bei einem Insektenstamm mit bekanntermaßen hohem Insektizidresistenzgrad.

Der Läusestamm war ein unter der Bezeichnung Hartley bekannter Referenzstamm. Der Stamm ist hochresistent gegen synthetische Pyrethroide (Tabelle 7.1, Levot G. W., Aust. Vet. J., 1992, 69, 120).

(i) Die Läuse wurden gesammelt durch Scheren eines kleinen Stücks Wolle von einem stark infizierten Schaf und Bedecken des geschorenen Bereichs für eine Minute mit einem Baumwolltuch. Von dem Tuch wurden die Läuse in einen Behälter gebürstet.
(ii) Wässrige Stammlösungen oder -suspensionen von Inhibitoren wurden auf Wollbüschel appliziert, welche von den 40 mm Vlies, die der Haut am nächsten lagen, genommen wurden. Das Spenderschaf war bekanntermaßen 2 Jahre lang nicht mit Insektizid behandelt worden und seine Wolle hatte eine Stapellänge von 100 mm beim Scheren.
(iii) Sorgfältig darauf bedacht, eine Kreuzkontamination zu vermeiden, behandelte man vierfache Wollproben durch Eintauchen in wässrige Lösungen oder Suspensionen von Inhibitoren, danach wurde abtropfen gelassen und 24 h an der Luft getrocknet.
(iv) Die Wollproben wurden in etikettierte Kunststoffröhrchen mit Verschluss gegeben.
(v) Man ließ die Läuse über Papier von einer Lichtquelle wegkriechen (als Viabilitätstest); sodann wurden jeweils 10 Läuse im adulten, dritten, zweiten und erste Stadium in jedes Röhrchen mit Wolle gesetzt.
(vi) Die Röhrchen wurden bei 35°C und 60 bis 80% r. F. inkubiert und täglich überprüft.
(vii) Für die Beurteilung der Viabilität wurde davon ausgegangen, dass Läuse, die beim Berühren unbeweglich blieben, tot waren.

Die Resultate zeigt Tabelle 7.1
Tabelle 7.1 Zahl der lebenden Läuse, aufgezogen auf inhibitorbehandelter Wolle, nach 24-stündiger Inkubation bei 35°C
Tabelle 7.2 Insektizidresistenzcharakteristika der getesteten Läuse
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung zeigte eine hohe Wirkung auf insektizidresistente Schafläuse.
Beispiel 8 Einfluss von Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben des Kornkäfers Tribolium castaneum; Coleoptera
Die Insekten wurden in gereinigtem, gemahlenem und gesiebtem Vollkornmehl aus biologischem Weizen kultiviert. Die Inhibitoren aus Flaschen mit vorher abgewogenem Material wurden mit dem Mehl trockengemischt und die Inhibitorreste wurden mit einem kleinen Volumen an Wasser aus den Flaschen gespült. Das Spülwasser wurde dem Mehl zugesetzt und die Mischung erneut vermahlen. Das imprägnierte Mehl wurde in eine 20 ml-Ampulle transferiert und unter Schütteln und Umdrehen gründlich gemischt.
T. castaneum-Adulten wurde die Eiablage an dem Mehl erlaubt; die Eier wurden aus dem Mehl herausgesiebt und einzeln mit einem einzigen Haar in Microwell-Röhrchen transferiert, welche eine kleine Menge Mehl enthielten. Jedes Behandlungsniveau wurde dreifach durchführt mit 32 Vertiefungen/Replikat. Die Assays wurde dreifach durchgeführt. Die Kulturen wurden bei 30°C und 55% r. F. inkubiert.
Nach 6 Tagen wurde jedes Replikat von 32 Vertiefungen kombiniert, die Larven wurden gezählt und die Zahlen mit Zahlen aus der Kontrollbehandlung (ohne Inhibitor) verglichen. Die Larven wurde als "klein" beurteilt, wenn sie deutlich kleiner waren als die Referenzlarven, oder als anomal, wenn ungewöhnliche Verhaltensweisen oder Ausbildungen beobachtet wurden (z. B. Krümmung oder gekrümmte Larven).
Die Test-Inhibitoren und Dosisraten waren die gleichen wie die in Beispiel 4 verwendeten.
Ergebnisse
Tag 6

– Eischlupf war nicht konsistent beeinflusst am Tag 6
– Larven wurden als "klein" beurteilt bei Actinonin und EDTA in allen Dosierungen, aber normal bei 1,10-Phenathrolin- und anderen Behandlungen

Beispiel 9 Einfluss von Peptidase-Inhibitoren auf Wachstum und Überleben des Getreidevorratsschädlings Oryzaephylus surinamensis; Coleoptera
Das Bioassay für dieses Insekt war das gleiche wie für T. castaneum beschrieben, ausgenommen, dass die Inkubationen bei 32,5°C und 70% r. F. durchgeführt wurden. Nach 8 Tagen wurden die Insekten aus dem Mehl herausgesiebt und gewogen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9.1 dargestellt.
Tabelle 9.1 Gewichtsminderung in Prozent bei O. surinamensis-Larven
Die Antwort auf die einzelnen Aminopeptidase-Inhibitoren war unterschiedlich. 1,10-Phenanthrolin war ein hochwirksamer Wachstumsinhibitor, EDTA zeigte eine moderate Wirksamkeit und Bestatin war unwirksam.
Die Erfindung wurde zum besseren Verständnis ausführlicher beschrieben; für den Fachmann wird jedoch erkennbar sein, dass verschiedene Modifikationen und Änderungen an den Ausführungsformen und Verfahren, wie sie hierin beschrieben sind, vorgenommen werden können, ohne den Bereich des erfindungsgemäßen Konzeptes zu verlassen, wie in der vorliegenden Beschreibung offenbart.
Hierin zitierte Schriften sind auf den folgenden Seiten aufgelistet.
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Claims

Zusammensetzung für die Bekämpfung von Insekten, umfassend einen Aminopeptidase-Inhibitor und einen nicht stark komplexbildenden Peptidase-Inhibitor, zusammen mit einem pharmazeutisch, veterinärmedizinisch, landwirtschaftlich oder gartenbaulich zulässigen Träger; worin der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor einen Aminopeptidase-Inhibitor umfassen kann und worin ein nicht stark komplexbildender Peptidase-Inhibitor ein Peptidase-Inhibitor ist, welcher Zn²⁺-Ionen weniger stark als EDTA in einem konkurrierenden Bindungstest komplexiert, in dem sowohl EDTA als auch der Inhibitor bei derselben Konzentration in der Reaktionsmischung vorhanden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Aminopeptidase-Inhibitor eine oder mehrere Aminosäurekomponenten oder Derivate hiervon umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Aminopeptidase-Inhibitor eine Leucin-Baueinheit, eine Valin-Baueinheit oder Derivate hiervon umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Aminopeptidase-Inhibitor ein Komplexierungsmittel umfasst oder Komplexierungsaktivität aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin der Aminopeptidase-Inhibitor ein zweizähniges, dreizähniges, vierzähniges oder sechszähniges Komplexierungsmittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, worin das Komplexierungsmittel eine Aminocarbonsäure-Baueinheit oder Nitrilotriessigsäure oder ein Salz oder ein Derivat hiervon mit komplexbildenden Eigenschaften umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin das Komplexierungsmittel Ethylendiamintetraessigsäure oder ein Salz oder Derivat hiervon mit komplexbildender Wirkung umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Aminopeptidase-Inhibitor ein Übergangsmetallion oder einen Komplex oder ein Derivat dieses Ions umfasst, wobei das Ion ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus Kupfer, Kobalt, Zink, Magnesium, Mangan, Vanadium und Eisen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Aminopeptidase-Inhibitor eine Boronsäure-, Phosphoryl- oder Phosphonyl-Baueinheit umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der Aminopeptidase-Inhibitor irreversibel an eine Aminopeptidase bindet.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin der Aminopeptidase-Inhibitor Trypsin oder Calpain nicht inhibiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin der Aminopeptidase-Inhibitor Serin- oder Cysteinpeptidasen nicht inhibiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin der Inhibitor die Aktivität eines Enzymes inhibiert, ausgewählt aus der Gruppe, welche besteht aus Leucin-Aminopeptidasen, Aminopeptidasen vom Typ A, B, N und M, Arginin-Aminopeptidasen, Methionin-Aminopeptidasen, D-Aminosäure-Aminopeptidasen, Peptidyl-Dipeptidasen, Zink-Aminopeptidasen, N-Formyl-Methionin-Aminopeptidasen, Dipeptidyl-Aminopeptidasen, Tripeptidyl-Peptidasen, Dipeptidyl-Peptidasen und Peptidyl-Tripeptidasen.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin der Inhibitor die Aktivität einer Leucin-Aminopeptidase inhibiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin der Inhibitor die Aktivität einer Insekten-Leucin-Aminopeptidase inhibiert.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor einen Serin-Peptidase-Inhibitor, einen Cystein-Peptidase-Inhibitor, einen Aspartyl-Peptidase-Inhibitor oder einen Aminopeptidase-Inhibitor umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus Trypsin- und Chymotrypsin-Inhibitoren.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor Eglin C umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor Pefabloc umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend SBTI und EDTA.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend L-Leucin-thiol und EDTA.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend Pefabloc und EDTA.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend Actinonin und SBTI.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend L-Leucin-thiol und SBTI.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend 1,10-Phenanthrolin und SBTI.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend Bestatin und SBTI.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, umfassend Antipain und EDTA.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, worin der Aminopeptidase-Inhibitor oder der nicht stark komplexbildende Peptidase-Inhibitor ein Peptid, ein Polypeptid oder einen Proteinbaustein umfasst.
Verfahren zum Bekämpfen von Insekten, umfassend den Schritt der Behandlung der Insekten mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 28.
Verfahren nach Anspruch 29, umfassend den Schritt der Behandlung von Insekteneiern oder Insektenlarven mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wodurch das Schlüpfen der Insekteneier und/oder die Entwicklung der Insektenlarven inhibiert ist.
Verfahren nach Anspruch 29 oder Anspruch 30, worin die Insekten einer Ordnung zugehören, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus Lepidoptera, Hemiptera, Dictyoptera, Orthoptera, Coleoptera, Psocoptera, Isoptera, Thysanoptera, Hymenoptera, Homoptera, Diptera, Anoplura, Malophaga und Siphonaptera.
Verfahren nach Anspruch 31, worin das Insekt einer Ordnung zugehört, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus Lepidoptera, Hemiptera, Dictyoptera, Orthoptera, Psocoptera, Isoptera, Thysanoptera, Hymenoptera, Homoptera, Diptera, Anoplura, Malophaga und Siphonaptera.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin das Insekt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Myiasisfliegen, Flöhen, Schaben, hellbraunen Apfelmotten, Grillen, knospenfressenden Mottenlarven, Korn- und Vorratsinsekten.
Verfahren nach Anspruch 33, worin das Insekt ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus Myiasisfliegen, Flöhen, Schaben, hellbraunen Apfelmotten, Grillen und knospenfressenden Mottenlarven.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 33, worin die Zusammensetzung durch lokal verabreichte Mittel angewandt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 35, worin die Zusammensetzungen auf eine Pflanze angewendet werden, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus Baumwolle, Ölsaatkulturpflanzen, Zierpflanzen, Blumen, Obstbäumen, Getreidekulturpflanzen, Rebenkulturpflanzen, Hackfrüchten, Futterpflanzen und Gemüsen.