DE69527289T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Fruchtarbarkeit von Spermatozoenproben - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Beurteilungsverfahren zur Bewertung der Fertilität von Vogel- und Säugerspermatozoen.
Hintergrund der Erfindung
• Assistierte Reproduktionstechniken, wie z. B. künstliche Besamung, sind kommerziell bei Vieh und Pferden seit fast einem Jahrhundert praktiziert worden und bei Geflügel, Menschen und anderen Spezies seit fast einem halben Jahrhundert. Künstliche Besamung erfordert eine Probe von Samen, bestehend aus Spermatozoen zusammen mit Samenplasma, das von den Epithelzellen der Epididymis und Hilfsorganen beigesteuert wird. Samenplasma enthält neben Wasser zahlreiche Proteine und Glycoproteine, Phospholipide, Lipide, Kohlenhydrate und Ionen.
• Es wurde früh erkannt, daß eine Samenprobe eine heterogene Population von Spermien enthält, wovon einige Fertilisierungspotential besitzen und andere nicht. Somit variiert die potentielle Fertilität für ein gegebenes männliches Exemplar von Probe zu Probe und variiert stark zwischen verschiedenen männlichen Exemplaren einer Spezies. Die Voraussage potentieller Fertilität ist eine sich wiederholt stellende Frage in der Humanmedizin und bei der Forschung mit Sperma von Tieren mit wirtschaftlicher Bedeutung. Eine potentielle Auswirkung auf die Fertilität ist ein Merkmal eines jeden Versuchs, Verfahren zur Konservierung von Spermien zu verbessern, oder von Versuchen, die vielen ungelösten Rätsel der Spermienbiologie zu lösen. Unglücklicherweise war bisher eine zuverlässige Bewertung der Fertilität eines einzelnen männlichen Exemplars für Spezies wie Rinder und Hühner kostspielig, für Pferde unpraktisch und kostspielig und für Menschen unmöglich.
• Es ist seit vielen Jahren anerkannt, daß es schwierig ist, die potentielle Fertilität einer gegebenen Samenprobe genau zu messen. Es wurden zahlreiche Vorgehensweisen angewandt, jedoch testet keine einzige Methode alle Attribute der Spermienfunktion, welche zur Fertilität beitragen. Tests, welche den Prozentsatz beweglicher Spermien, die Bewegungscharakteristiken der Spermien oder exponierte Kohlenhydrate oder Membranintegrität bewerten, sind bis zu einem gewissen Grad von Nutzen, jedoch nicht zu einer verlässlichen Voraussage in der Lage. Bewegliche Spermien mit normaler Morphologie sind wahrscheinlicher fertil als unbewegliche Spermien oder Spermien mit einer bizarren Gestalt oder Struktur. Nichtsdestoweniger erwiesen sich weder subjektive noch objektive Messungen der Spermienbeweglichkeit oder Morphologie als sehr aussagekräftig bezüglich der potenziellen Fertilität.
• In diesem Zusammenhang ist ein Überblick über den Bindungsmechanismus zwischen Spermatozoen und Eiern lehrreich. Das primäre Ereignis beim Fertilisierungsprozeß ist die Bindung eines Spermiums oder mehrerer Spermien an die Eihüllen. Bei Säugern wird angenommen, daß ein Spermatozoon über eine Reihe von Ei-bindenden Proteinen, die sich auf der Oberfläche des Spermatozoons befinden, zusammen als Liganden bezeichnet, welche mit geeigneten Vertretern einer Reihe von Spermien-Rezeptoren wechselwirken, die sich auf den Eihüllen des Oozyten, nämlich der Zona pellucida und Oozyten-Plasmamembran, befinden, an den Oozyten bindet. Diese Terminologie für die Lokalisierung bindender Proteine auf den Spermien und Rezeptoren auf dem Ei ist am logischsten, bei Wirbellosen traditionell und bei Säugern anwendbar und wird im folgenden sowohl bezüglich Säuger als auch Vögel gebraucht werden.
• Ei-bindende Proteine von Säugerspermien werden im allgemeinen für Transmembran- Proteine oder -Glycoproteine, möglicherweise mit enzymatischer Aktivität, gehalten, die eine extrazelluläre Domäne aufweisen, welche mit einem spezifischen Spermien-Rezeptor wechselwirkt. Die Konsensus-Vorstellung, die sich entwickelte, ist die einer sequentiellen Bindung: zuerst eine lockere Bindung an die Zona pellucida über ein oder mehrere Molekül(e), das/die auf der Spermien-Plasmamembran lokalisiert ist/sind, dann eine feste Bindung des Spermiums an die Zona pellucida über (ein) Molekül(e), das/die auf der Plasmamembran und/oder der acrosomalen Membran lokalisiert ist/sind, gefolgt von der festen Bindung des Spermiums an die Oozyten-Plasmamembran, gefolgt von Fusion der Spermien- und Ei- Plasmamembranen und Eintritt des gesamten Spermatozoons in den Oozyten. Somit ist die Spezies-spezifische Adhäsion zwischen Spermien und Eiern auf Komplexe zurückzuführen, die zwischen Ei-bindenden Proteinen auf den Spermien und komplementären Spermien- Rezeptoren auf den Eiern gebildet werden. Mindestens ein Spezies-unspezifisches Ei- bindendes Protein muß sich ebenfalls auf der Spermien-Oberfläche befinden.
• Eier besitzen auch Rezeptoren für Spermien-Liganden. Bei Säugern liegt über der Plasmamembran des Eis die Zona pellucida, eine azelluläre Schicht, die um den Oozyten gebildet wird, während er sich noch innerhalb des Ovarialfollikels befindet. Je nach Spezies kann die Zona pellucida den Zugang überzähliger Spermien zur Plasmamembran beschränken. Bei gewöhnlichen Säugern folgt die Befruchtung anscheinend einem ähnlichen Prozeß, bei weichem der hochkonservierten Zona pellucida, die in der Maus mehrere Glycoproteine umfaßt, die als ZP&sub1;, ZP&sub2; und ZP&sub3; bezeichnet werden, eine entscheidende Rolle zukommt. Einer lockeren unspezifischen Bindung eines Spermatozoons an die Zona pellucida folgt eine starke Bindung von Spermien-Liganden an Rezeptoren auf ZP&sub3;, Initiierung der Acrosom-Reaktion und Überführung von Proacrosin in Acrosin (eine Serinprotease), Bindung an ZP&sub2;, enzymatische Verdauung eines Kanals für das Spermatozoon durch die Zona pellucida und Passage des Spermatozoons in den darunterliegenden perivitellinen Raum, wonach andere Spermien-Liganden an Rezeptoren auf der Oozyten-Plasmamembran binden. Es ist unklar, ob Spermienbeweglichkeit für diese Bindungsreaktionen erforderlich ist, aber Beweglichkeit ist sicherlich für die Durchdringung der Zona pellucida erforderlich. Obligatorische Schritte schließen (1) anfängliche lockere Bindung eines Spermatozoons an die Zona pellucida und (2) anschließende feste Bindung über Rezeptoren auf ZP&sub3; ein. In Anbetracht der essentiellen Rolle der Penetration von Spermien durch die Zona pellucida bei der Befruchtung ist es nicht überraschend, daß die Anzahl der in der Zona eingeschlossenen Spermien (als akzessorische Spermien bezeichnet) in Beziehung zum Befruchtungsstatus des darin befindlichen Oozyten steht; je mehr Spermien, desto größer die Wahrscheinlichkeit, daß eine Befruchtung stattgefunden hat.
• Bei Vögeln ist die mütterliche Keimzelle und der Dotter eines Eis nach dem Eisprung von einer mehrschichtigen Eimembran (Vitellin-Membran) umhüllt, die eine abgegrenzte innere Lamina perivitelline und eine äußere siebartige Lamina extravitellina umfaßt. Nach Passage des Eis vom Infundibulum in den Hauptteil des Eileiters wird eine Reihe von Albuminschichten hinzugefügt, gefolgt von Komponenten, die mit der Schale assoziiert sind. Vogelspermien können normalerweise nur während der etwa 15 Minuten, welche zwischen dem Eisprung und der Abscheidung der ersten Albuminschicht vergehen, die Lamina extravitellina durchdringen und an die Lamina perivitelline binden, Schritte, die für die Befruchtung essentiell sind. Akzessorische Spermien können auf oder innerhalb der Eimembran eines befruchteten Eis gefunden werden. Es gab wenig Forschungsaktivitäten hinsichtlich der molekularen Natur der Eimembranen oder Spermien-Ei-Bindung bei Hühnern. Jedoch ist bekannt, daß die Lamina perivitelline hauptsächlich aus drei Glycoproteinen besteht, während die Lamina extravitellina eine Mischung anderer Komponenten ist.
• Es gab bisher zahllose Versuche, die Spermienqualität zu beurteilen, und die Korrelation von Testergebnissen mit bekannten Fertilitätsdaten ist nicht das gleiche wie eine genaue Voraussage der Fertilität in einer unbekannten Probe, was bisher nicht geschehen ist.
• G.J. Wishart (1987), J. Reprod. Fert. 80, 493-498, beschreibt ein Verfahren zur Voraussage der Fruchtbarkeitsperiode von Hühnereiern, basierend auf der quantitativen Bestimmung von Spermatozoen, die an intakte Vitellin-Membranen von Eiern binden. Jedoch soll dieses Verfahren die Fertilität von Eiern vorhersagen, nicht der bei dem Verfahren verwendeten Spermatozoen
• J. P. P. Tyler et al. (1981), J. Reprod. Fert. 63, 499-508, beziehen sich auf ein Verfahren zum Testen der Fertilität von Human-Spermatozoen durch quantitative Bestimmung der Human-Spermatozoen, welche an Zona-freie Hamstereier binden und darin eindringen. Dieses Verfahren beurteilt einen Schritt, der normalerweise stattfinden kann, nachdem die Bindung des Spermiums an die Zons pellucida erfolgt ist, und ist somit selbst kein Maß für die Bindungskapazität.
• Dementsprechend bleibt ein Bedarf für einen einfachen und genauen Test zur Beurteilung des Fertilisationspotentials von Spermatozoen in einer einzigen Probe von einem individuellen Säuger- oder Vogelorganismus. Ein solcher Test ist sowohl bei der menschlichen Gesundheitsfürsorge als auch bei der kommerziellen Tierzüchtung von Nutzen.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zum Testen des potentiellen Fertilisierungsvermögens von Spermatozoen durch Plazieren einer Suspension dieser Spermatozoen auf ein Protein, das aus nativen Vitellin-Membranen extrahiert wurde, die Hühner- oder Puteneiern entnommen wurden, wobei das Protein gewöhnlich zuerst als Schicht auf ein festes Substrat aufgebracht wurde, um die quantitative Bestimmung der Anzahl von Spermien zu ermöglichen, welche an das Protein binden. Typischerweise wird der Vitellin-Membran- Proteinextrakt hergestellt durch Abtrennen von Vitellin-Membranen (Lamina perivitelline plus Lamina extravitellina) von entweder einer Gruppe von Hühnereiern oder einer Gruppe von Puteneiern, Spülen der Membranen frei von Albumin und Dotter und Aufteilen der Membranen auf mechanische Weise durch Ultraschallenergiescherung in kleine Teilchen. Das resultierende aufgeteilte Protein wird solubilisiert, gereinigt, zentrifugiert und konzentriert, um den Proteinextrakt in Lösung zu ergeben. Das extrahierte Protein wird dann als Proteinsubstrat für die Spermatozoen-Bindung eingesetzt, wobei nacheinander der Proteinextrakt mit den Spermatozoen kontaktiert und das Ausmaß der stattfindenden Spermien-Ei-Bindung gemessen wird. Alternativ kann die gewaschene Eimembran vor der Scherung und der Solubilisierung auf ein festes Substrat aufgebracht werden, um die bindende Oberfläche zu ergeben.
• Die Korrelation zwischen Spermien-Ei-Bindung und Fertilisierungspotential der Spermatozoen ist direkt und linear.
Kurzbeschreibung der Figuren
• Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht eines Objektträgers, der mit einer intakten Membran gemäß der Erfindung beschichtet ist, bedeckt von einer Matrize mit Löchern, um Vertiefungen zu bilden, in denen die Spermienfertilität nachgewiesen werden soll.
• Fig. 2 ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse eines Bullensperma-Bindungstests zeigt, der in Beispiel 10 unten beschrieben ist.
• Fig. 3 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse eines Pferdesperma-Bindungstests zeigt, der in Beispiel 11 unten beschrieben ist.
• Fig. 4 ist ein Diagramm, welches die Ergebnisse eines Maussperma-Bindungstests zeigt, der in Beispiel 12 unten beschrieben ist.
• Fig. 5 ist ein Satz von drei Diagrammen, welche die Ergebnisse von Humansperma- Bindungstests zeigen, die in Beispiel 13 unten beschrieben sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zum Testen der Fertilität einer Spermatozoen- Probe durch Kontaktieren von Aliquots der Probe mit einem Protein, das aus nativen Vitellin- Membranen extrahiert wurde, die aus Hühner- oder Puteneiern entnommen wurden, oder mit den Vitellin-Membranen selbst, um eine quantitative Bestimmung der Anzahl an Spermien zu ermöglichen, welche an das Protein binden Typischerweise wird, wenn das Proteinextraktionsverfahren angewandt wird, der Vitellin-Membran-Proteinextrakt vorbereitet durch Abtrennung von Vitellin-Membranen (Lamina perivitelline plus Lamina extravitellina) von entweder einer Gruppe von Hühnereiern oder einer Gruppe von Puteneiern, Spülen der Membranen frei von Albumin und Dotter und Aufteilen der Membran durch Anwendung von mechanischer Ultraschallscherung in kleine Teilchen. Das resultierende Protein wird dann mit Warme in Puffer solubilisiert, mittels Zentrifugation gereinigt und konzentriert (beispielsweise mit einer 10-kD-Ausschluß-Ultrafiltrationsmembran), um den Proteinextrakt in gepufferter Lösung zu ergeben. Das extrahierte Protein wird dann als Proteinsubstrat für die Spermatozoen- Bindung eingesetzt, wobei nacheinander der Proteinextrakt mit dem Spermatozoen kontaktiert und die Anzahl der aufgrund von Spermien-Ei-Bindungsreaktionen gebundenen Spermien bestimmt wird. Die Bestimmung kann eine visuelle Zählung durch Mikroskopie sein oder ein automatisches Äquivalent unter Verwendung von im Handel erhältlicher Software zur Analyse mikroskopischer Bilder oder die Anwendung von im Handel erhältlichen Mikromulden-Plattenlesegeräte, welche die Extinktion oder Fluoreszenz oder angefärbte Spermatozoen quantitativ bestimmen. Die Korrelation zwischen Spermien-Ei-Bindung und Fertilität (Fertilisierungsvermögen) der Spermatozoen in der Probe ist direkt und linear.
• Konkreter wird das vorliegende Verfahren wie folgt durchgeführt.
• Die Vitellin-Membranen werden von Hühner- oder Puteneiern abgetrennt (entweder das eine oder das andere, nicht jedoch beide, entweder frisch unbefruchtet oder bis zu 6 Monate bei 2-5ºC gelagert) und durch wiederholtes Eintauchen und Schütteln in wiederholten Waschlösungen von Reinigungspuffer frei von Albumin und Dotter gespült. Ein typischer Reinigungspuffer enthält 50 mM Natriumphosphat und 145 mM Natriumchlorid, pH 7,2, jedoch können äquivalente Puffer als Ersatz dienen. Im allgemeinen kann in dieser Patentbeschreibung jeder Puffer irgendeinen anderen Puffer ersetzen, solange der Puffer allgemein für die Suspendierung oder das Waschen von biologischen Materialien gemäß durchschnittlicher Sachkunde annehmbar ist. Die gewaschenen Vitellin-Membranen werden entweder sofort eingesetzt oder bis zu mehreren Tagen vor der Verwendung im Reinigungspuffer bei 2-5ºC gelagert. Die Membranen werden dann durch die Anwendung von mechanischer oder Ultraschallenergie in kleine Teilchen aufgeteilt. Das resultierende Material wird solubilisiert, mittels Zentrifugation gereinigt und konzentriert, um einen Eimembran-Proteinextrakt in Lösung zu ergeben.
• Mit "Protein" im Kontext der vorliegenden Erfindung und des in der Eimembran gefundenen Proteins, welches zur Bindung an Spermatozoen in der Lage ist, meint der Anmelder jedes Biomolekül, das eine Aminosäurekette oder Peptidgruppierung enthält, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Lipoproteine und Glycoproteine. Mit anderen Worten, es wurde für den Zweck dieser Erfindung eine breite Definition von Protein gewählt und dies ist so beabsichtigt.
• Die Suspensionen werden vereinigt und das Gesamtvolumen mit zusätzlichem Puffer auf 6 ml/Membran gebracht. Die Suspensionen werden in einem geschlossenen Gefäß bei 73ºC 20 Minuten lang erwärmt, um das Protein zu solubilisieren, auf 4ºC gekühlt und bei 2,7 · 10&sup5; ms&supmin;² (27.000 · g) 15 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstands-Proteinlösung wird abgesaugt und mit Hilfe einer 10-kD-Ausschluß-Ultrafiltrationsmembran konzentriert, um eine Lösung zu ergeben, die etwa 2,5 mg/ml Protein enthält. Andere Verfahren zur Extraktion des Proteins sind möglich und das aktive Proteinmolekül bzw. die aktiven Proteinmoleküle kann/können nach einem beliebigen Verfahren gereinigt werden. Die Lösung kann unmittelbar zur Beschichtung von Objektträgern oder Mikromuldenplattenvertiefungen eingesetzt werden oder für mindestens 3 Monte bei -20ºC gelagert werden.
• Anschließend werden die Vertiefungen in einer Mikromuldenplatte mit dem Proteinextrakt aus Vitellin-Membran (eine Konzentration von 2,5 mg/ml Protein in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, ist typisch für eine Reihe von verwendeten Extrakten) beschichtet, um eine dünne gleichmäßige Schicht zu erhalten. Bei reineren Membranextrakten muß das Substrat mit weniger Material beschichtet werden. Das Protein sollte schnell getrocknet werden, unter Einsatz von geringer Wärme, die unter Vakuum zugeführt wird, obwohl das Protein luftgetrocknet werden kann. Nachdem die Beschichtung trocken ist, kann die beschichtete Platte sofort verwendet werden oder in einer befeuchteten kalten Umgebung gelagert werden.
• Zur Verwendung des wie oben präparierten Objektträgers wird eine Matrize über eine saubere intakte Eimembran gelegt, die auf einem Objektträger plaziert ist. Die Matrize ist einfach ein gewöhnlich flaches Konstrukt mit Löchern darin, so daß sich nach Legen der Matrize auf die Eimembran individuelle Reaktionsvertiefungen ergeben. Die Matrize kann aus irgendeinem Material, z.B Silikongummi, hergestellt werden, welches Spermatozoen nicht bindet und für Spermien nicht toxisch ist. Die Matrize kann mit einem nicht-toxischen Klebstoff (z. B. im Stand der Technik bekannte UV-katalysierte Klebstoffe) an den Objektträger gebunden oder festgeklammert werden und die Objektträger/Matrize-Kombination kann unmittelbar eingesetzt werden oder unter feuchten kalten Bedingungen gelagert werden.
• Um nunmehr Bezug auf Fig. 1 zu nehmen, die vorbereitete Kombination von Eimembran, Objektträger und Matrize ist als Vertiefungsvorrichtung 10 gezeigt, wobei der Objektträger 12 eine Eimembran 14 (oder eine Proteinbeschichtung) darauf aufweist, wobei der Objektträger 12 mit einer peripheren Schicht eines Bindemittels (nicht sichtbar) an eine Matrize 16 mit Löchern 18 darin gebunden ist. Die Erfindung umfaßt beliebige Vertiefungsvorrichtungen, welche die vorliegende Eimembran oder Proteinbeschichtung darauf abgeschieden aufweisen, so daß Fig. 1 nur ein Beispiel darstellt.
• Zur Verwendung werden die Vertiefungen in der Vorrichtung mit Puffer gespült und zum Nachweis der Brauchbarkeit von Spermien wie folgt eingesetzt.
• Spermatozoen in Suspension mit autologem Samenplasma und zugesetztem Puffer, oder zuerst frei von Samenplasma gewaschen, werden tropfenweise den Vertiefungen zugegeben, die von der Matrize und dem Objektträger gebildet werden. Die Inkubation wird durchgeführt, indem die Spermien für etwa 1-3 Stunden bei 37ºC in einer Feuchtigkeitskammer in der Vertiefung belassen werden. Nach der Inkubation wird die Spermiensuspension dekantiert und jede Vertiefung unter mechanischer Bewegung 3 Minuten lang mit Puffer gespült. Ein Verfahren zum einheitlichen Waschen von Membranen ist für reproduzierbare Ergebnisse essentiell.
• Nach dem Spülen werden die gebundenen Spermien mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAP1; 1 ug/ml in PBS-Puffer) angefärbt und unter einem Fluoreszensmikroskop untersucht. Die Anzahl der pro Einheitsfläche der Membran gebundenen Spermien wird dann gezählt. Die Korrelation zwischen der gezählten Anzahl gebundener Spermien und der Fertilität der Probe ist direkt und linear.
• Das vorliegende Verfahren kann erwünschtenfalls mit gewaschenen intakten Hühnerei- oder Puteneimembranen durchgeführt werden, anstatt die Membranen in Lösung vorzubereiten und ein festes Substrat zu beschichten. Die intakten Membranen sind jedoch aufgrund ihrer Fragilität, der Schwierigkeit, sie ohne Blasen oder Falten auf einem festen Träger anzuordnen, und der schwierigeren Sichtbarmachung ihrer faltigen Oberfläche unter dem Mikroskop schwieriger als der Proteinextrakt zu handhaben. Trotz dieser Nachteile ist der Einsatz von Eimembranen als solche jedoch praktikabel und bildet somit einen Teil der vorliegenden Erfindung. In der Tat beziehen sich, soweit die folgenden Beispiele in der Reihenfolge präsentiert werden, in der sie bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, die frühesten Beispiele auf den Einsatz intakter Eimembranen.
• Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken.
Beispiel 1
• Vitellin-Membranen (Lamina perivitelline + Lamina extravitellina) wurden von Hühnereiern abgetrennt (es wurden frische unbefruchtete Hühnereier verwendet, jedoch hätten Eier, die bis zu 6 Monaten bei 2-5ºC gelagert wurden, dafür als Ersatz dienen können) und durch wiederholtes Eintauchen und Schütteln in einer Reihe von Bechergläsern, die geschwenkten Reinigungspuffer (50 mM Natriumphosphat, 145 mM Natriumchlorid; pH 7,2) enthielten, frei von Albumin und Dotter gespült. Die gewaschene Vitellin-Membran wurde sofort eingesetzt, obwohl sie vor der Verwendung mehrere Tage lang bei 2-5ºC in Reinigungspuffer hätte gelagert werden können. Die Membran wurde zwischen der Entnahme aus dem Ei und der Verwendung im Assay nicht austrocknen gelassen.
• Gewaschene Vitellin-Membranen aus Puteneiern wurden ebenfalls auf die gleiche Weise vorbereitet.
• Zur Vorbereitung der Assay-Vorrichtung wurde ein Objektträger für die Verwendung gereinigt und getrocknet. Eine Matrize von Silikongummi, die eine Reihe von Löchern einheitlicher Größe (3-10 mm Durchmesser) enthielt, wurde vorbereitet. Silikongummi wurde gewählt, da er für Spermien nicht toxisch ist, unschwer ausgeschnitten werden kann, um Löcher einer einheitlichen und standardisierten Größe zu enthalten, und eine Dichtung bilden kann, wenn er zwischen benachbarte Oberflächen gelegt wird. Die Matrize wurde mit einer nicht- klebrigen Substanz (Fisher Brand Dricote, im Stand der Technik bekannt, wurde eingesetzt) beschichtet, um die Haftung von Zellen an den Matrizenmaterialien während des Assays zu verhindern.
• Ein Stück Vitellin-Membran wurde über ein 24 · 24-40 mm Deckglas gelegt, wobei darauf geachtet wurde, Falten oder Risse zu vermeiden. Die Silikon-beschichtete Matrize wurde sofort über die Membran gelegt, so daß die Vertiefungen in der Matrize über der Vitellin- Membran lagen. Die Matrize wurde mit Hilfe von Kunststoffklemmen über die Membran geklemmt und die Löcher in der Matrize bildeten Vertiefungen zur tropfenweisen Zugabe von Spermiensuspension oder Kontrollmischungen.
• Die Vertiefungen in der Matrize wurden mit Puffer gespült und geschüttelt, um den Überschuß zu entfernen. Dann wurde ein abgemessenes Aliquot an Spermiensuspension in jede Vertiefung eingebracht. Die Spermiensuspension schloß Spermatozoen, Puffer und autologes Samenplasma ein. Die Spermien wurden in der Vertiefung für 1-3 Stunden bei 37ºC in einer Feuchtigkeitskammer belassen. Nach der Inkubation wurde die Spermiensuspension dekantiert und jede Vertiefung unter mechanischer Bewegung 3 Minuten lang mit Puffer gespült. Ein Verfahren zum einheitlichen Waschen von Membranen war für reproduzierbare Ergebnisse essentiell.
• Nach dem Spülen wurden die gebundenen Spermien mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAP; 1 ug/ml in PBS-Puffer) angefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Anzahl der gebundenen Spermien pro Einheitsfläche der Membran wurde gezählt. Geeignete Kontrollen wurden in parallelen Vertiefungen eingesetzt und schlossen ein: Spermien, die unbeweglich gemacht worden waren, Spermien, die beschädigt worden waren, um an die Membran bindende Liganden zu entfernen, oder eine gemeinsame Inkubation von Spermien mit einem Überschuß von Molekülen, von denen bekannt ist, daß sie die Bindungsreaktion blockieren oder erhöhen.
• Bei der ersten Validierung des allgemeinen Assayverfahrens wurden Objektträger und Matrizen eingesetzt, bei denen jede Vertiefung etwa 20 ul enthielt. Zur Bestätigung, daß die Anzahl der gebundenen Spermien eine Funktion der beweglichen Spermien in der Vertiefung war, wurde ein Dosis-Wirkung-Test durchgeführt; die Vertiefungen enthielten 0,15 bis 10 · 10&sup6; frische Spermien (etwa zu 80% beweglich) oder 10 · 10&sup6; abgetötete Spermien (auf -196ºC 3x blitzgefroren). Nach 3 Stunden Inkubation wurden die ungebundenen Spermien weggewaschen, die gebundenen Zellen angefärbt und die Spermien in einer Fläche von 0,5 mm² wurden bei 156facher Vergrößerung gezählt. Eine Dosis-Wirkung-Kurve wurde erhalten.
Beispiel 2
• Beispiel 1 wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, daß sowohl befruchtete als auch unbefruchtete Eier separat eingesetzt wurden, um das Bindungsvermögen von Spermien an Membranen, die aus unbefruchteten oder befruchteten Eiern ähnlicher Frische gewonnen worden waren, zu vergleichen und zu bewerten. Es wurde festgestellt, daß mehr bewegliche Spermien von unbefruchteten Eiern als von befruchteten Eiern gebunden wurden und daß die Unterscheidung zwischen lebenden und abgetöteten Spermien ebenfalls deutlicher war. Dies bestätigte, daß die in der vorliegenden Erfindung einzusetzenden Vitellin-Membranen vorzugsweise aus unbefruchteten Eiern entnommen werden.
Beispiel 3
• Zur Bestätigung der Relation der in vitro-Ergebnisse zur Fertilität derselben Proben bei Verwendung zur künstlichen Besamung wurde der folgende Test durchgeführt. Ein Volumen Hühnerhahnsperma wurde mit drei Volumina Minnesota A-Puffer, enthaltend 12% Glycerin, gestreckt, auf -196ºC eingefroren und vorsichtig aufgetaut. Glycerin wurde durch Reihenzugabe von Minnesota A-Puffer verdünnt und die Spermien wurden durch Zentrifugation gewonnen. Das Spermienpellet wurde in Minnesota A-Puffer resuspendiert (Standard-Kryokonservierungsverfahren). Frisch gewonnene Spermien (keine Kryokonservierung) wurden in Minnesota A-Puffer verdünnt, um als Kontrollpräparation zu dienen. Aliquots von 100 · 10&sup6; Spermien, jede der beiden Behandlungen repräsentierend, wurden mit Hilfe des hier beschriebenen Assays getestet. Die Fertilität der Spermiensuspensionen wurde auch unter Einsatz von 17-19 Hennen/Gruppe untersucht. Die Ergebnisse illustrieren, daß die Rangfolge der beiden Proben, die mit dem Eimembran-Bindungsassay erhalten wurde, einen wesentlich besseren Indikator des Fertilisierungsvermögens darstellte als entweder der Prozentsatz an beweglichen Spermien oder der Prozentsatz an Spermien mit einer intakten Plasmamembran - siehe Tabelle 1 unten. Tabelle 1 Vergleich von Labor- und Fertilitätsassays frischer und kryokonservierter Hühnerhahnspermien
Beispiel 4
• Zur Feststellung etwaiger Änderungen im Fertilisierungspotential von Hühnerhahnspermien nach Lagerung der Spermien bei 4ºC für 0, 24 oder 48 Stunden wurde der folgende Test durchgeführt. Nach Lagerung der Hühnerhahnspermien für die oben angegebenen Zeitspannen wurden Aliquots der Spermien hinsichtlich Beweglichkeit und Resistenz gegenüber einem hypoosmotischen Schock (beides nach im Stand der Technik bekannten Verfahren) und hinsichtlich der in vitro-Bindung an eine Eimembran wie in Beispiel 1 beschrieben beurteilt. Andere Aliquots wurden zur Besamung von Gruppen von 60, 60 und 14 Hennen mit 75, 75 oder 130 · 10&sup6; Spermien von Spermien, die 0, 24 bzw. 48 Stunden gelagert worden waren, eingesetzt; 356, 350 und 72 Eier wurden beurteilt. Die tatsächlichen Eibefruchtungen, das Ausmaß der Ei-Membran-Bindung von Spermien und der Grad der Spermien- Plasmamembran-Schädigung wurden alle bestimmt, nötigenfalls unter dem Mikroskop, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt. Tabelle 2 Vergleich von Hühnerhahnspermatozoen-Charakteristiken in Laborassays und Fertilitätstests
• Einige wenige der Spermien wiesen eine beschädigte Plasmamembran unabhängig vom Lagerungsintervall auf (bei allen Werten < 12% Schädigung) und auf Grundlage der Spermienbeweglichkeit war die Qualität der 24 oder 48 Stunden gelagerten Proben ähnlich, jedoch denjenigen unterlegen, die bei 0 Stunden vor der Lagerung untersucht wurden (etwa 50 % Reduktion). Der Eimembran-Bindungsassay war der einzige in vitro-Spermienqualitätstest, der einen Unterschied in der potentiellen Fertilität zwischen Spermien, die 24 Stunden gelagert worden waren, und Spermien, die 48 Stunden gelagert worden waren, nachwies: die Fertilität von Proben nahm zwischen 0 und 24 Stunden und weiter zwischen 24 und 48 Stunden ab. Es wurde somit illustriert, daß der erfindungsgemäße Assay bei der Voraussage der Fertilität von sowohl frischen als auch gelagerten Spermienproben von Nutzen ist und für gelagerte Proben sogar einen Fertilitätsverlust mit der Zeit nachweisen kann.
Beispiel 5
• Der folgende Test wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit der vorliegenden Technik zur Bewertung der Fertilität von Truthahnspermatozoen zu bestimmen.
• Membranen von Hühnerhenneneiern wurden zur Verwendung mit frischen (mit einem hohen Prozentsatz beweglicher Spermien), abgetöteten (durch Kühlung bei -196ºC; keine beweglichen Spermien) oder 24 Stunden gelagerten Truthahnspermien vorbereitet. Der Assay wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, jede Vertiefung enthielt 2,5 · 10&sup6; Truthahnspermien in 20 ul Volumen. Die Ergebnisse wurden gemäß Beispiel 1 bestimmt und ergaben die folgenden Werte: frische Spermatozoen (als normalisierter Wert von 100% dargestellt) banden an die Eimembranen, ungefähr 30% dieser Menge banden, wenn gelagerte Spermatozoen hinsichtlich der Bindung an die Eimembranen getestet wurden, und nur etwa 3% der abgetöteten Spermatozoen banden an die Eimembranen. Es war somit unschwer ersichtlich, daß frische Truthahnspermien an die Eimembran gebunden wurden und daß eine solche Bindung für bewegliche Spermien, die nach 24 Stunden Lagerung getestet wurden, deutlich herabgesetzt war. Ferner wurden frische und gelagerte Spermien beide in deutlich größerer Anzahl als abgetötete Spermien gebunden. Dieselben numerischen Ergebnisse wurden erhalten, wenn Eimembranen von Putenhennen als Ersatz für die Hühnereier in einem Paralleltest eingesetzt wurden.
Beispiel 6
• Präparationen, die Hühnerhahn-, Bullen- und Widderspermien enthielten, wurden mit Hühnerei-Membran wie in Beispiel 1 beschrieben inkubiert und dann unter dem Elektronenmikroskop untersucht. Hühnerhahnspermien zeigten eine enge Orientierung zum äußeren Teil der Perivitellin-Membran, wohingegen Bullen- und Widderspermatozoen nicht im selben Ausmaß in die Membran eindrangen, sondern eher in einem unbekannten Material eingebettet waren, das an der äußeren Membran des Hühnereis haftete, wobei die Spermienköpfe parallel ausgerichtet waren. Dieser Versuch illustrierte, daß Spermatozoen aus verschiedenen Spezies an Eimembran binden, wenn sie dem vorliegenden Assay unterworfen werden, und auch, daß die Art der Bindung sich je nach Spezies unterscheiden kann.
Beispiel 7
• Wir verglichen das Vermögen eines Assays unter Verwendung des vorliegenden Proteinextrakts und nativer Eimembran hinsichtlich des Vermögens zwischen Proben von frischen Hühnerhahnspermien (die Proben enthielten einen hohen Prozentsatz von beweglichen Spermien), gewollt abgetöteten Spermien (schnell auf -196ºC ohne Kryokonservierungsmittel eingefroren - keine beweglichen Spermien) und Spermien, die mit zwei verschiedenen herkömmlichen Verfahren kryokonserviert worden waren, zu unterscheiden.
• Der Proteinextrakt wurde wie folgt vorbereitet. Die Vitellin-Membranen von Hühnereiern wurden abgetrennt und durch wiederholtes Eintauchen und Schütteln in wiederholten Waschlösungen von 50 mM Natriumphosphat und 145 mM Natriumchlorid, pH 7,2, frei von Albumin und Dotter gespült. Die gewaschenen Vitellin-Membranen wurden dann durch Anwendung von Ultraschallenergie in kleine Teilchen aufgeteilt. Das resultierende Protein wurde durch Erwärmung in einem geschlossenen Gefäß für 20 Minuten bei 73ºC solubilisiert, gefolgt von Abkühlen auf 4ºC und Zentrifugation bei 2,7 · 10&sup5; ms&supmin;² (27.000 · g) bei 4ºC für 15 Minuten. Die überstehende Proteinlösung wurde abgesaugt und mit Hilfe einer 10-kD-Ausschluß- Ultrafiltrationsmembran konzentriert, um eine Lösung zu ergeben, die etwa 2,5 mg/ml Protein enthielt. Die Lösung wurde auf eine Mikromuldenplatte aufgebracht (110 ul/Vertiefung) und unter Vakuum und Wärme (60ºC) eingedampft.
• Die Spermatozoen in Suspension mit Puffer und Spuren von autologem Samenplasma wurden tropfenweise den Vertiefungen zugegeben, die von der Matrize und dem Objektträger gebildet wurden. Die Inkubation wurde durchgeführt, indem die Spermien etwa 2,5 Stunden lang bei 37ºC in einer Feuchtigkeitskammer in der Vertiefung belassen wurden. Nach der Inkubation wurden die Spermiensuspensionen dekantiert und jede Vertiefung wurde unter mechanischer Bewegung 3 Minuten lang mit Puffer gespült. Nach dem Spülen wurden die gebundenen Spermien mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1 ug/ml in PBS-Puffer) angefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Anzahl der pro Einheitsfläche der Membran gebundenen Spermien wurde gezählt.
• Ein direkter Vergleich offenbarte, daß äquivalente Ergebnisse mit jedem Assay erhalten wurden, wie in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Prozentsatz der von Eimembran bzw. Proteinextrakt gebundenen Zellen
Beispiel 8
• Beispiel 7 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß aus Hühnereiern bzw. aus Puteneiern extrahierte Proteine verglichen wurden. Frische Hühner- und Putenspermien banden beide in ähnlichen Verhältnissen an Proteinextrakte, die entweder von Hühner- oder Puteneiern genommen worden waren, wohingegen < 5% der abgetöteten Spermien an einen der Extrakte banden. Eingefrorene aufgetaute Spermien von jeder Spezies banden an beide Membranen, obwohl die Prozentsätze zwischen den Werten für frische und abgetötete Spermien lagen. Es gab eine Tendenz für einen leicht größeren Prozentsatz der kryokonservierten Hühnerhahnspermien zur Bindung an Putenmembran-Präparationen als an diejenigen von Hühnereiern. Diese Ergebnisse bestätigen, daß das Vermögen dieses allgemeinen Assays, Daten bereitzustellen, bei denen der Prozentsatz an gebundenen Spermien die Fertilität voraussagen kann, nicht die Verwendung von nativen Vitellin-Membranen erfordert, sondern unter Verwendung von Proteinextrakten und, als logischer Erweiterung, reinem/n nativem/n Protein(en) oder dem geeigneten Protein, welches mittels rekombinanter Technologie und Expression in vitro oder in vivo von geeigneten Konstrukten hergestellt wurde, durchgeführt werden kann.
Beispiel 9
• Wir nahmen eine Mikrotiterplatte und plazierten 110 ul des aus Vitellin-Membranen extrahierten Proteins (eine Konzentration von 2,5 mg/ml Protein in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0), auf 37ºC vorgewärmt, in jede Vertiefung und trockneten das Protein unter geringer Wärme und Vakuum. Dann plazierten wir 100 ul Inkubationspuffer zusammen mit einer geeigneten Anzahl von Testspermien in jede Vertiefung und inkubierten die Vertiefungen für 2,5-3,0 Stunden bei 37ºC in einer Feuchtigkeitskammer. Nach der Inkubation dekantierten wir den Inhalt aller Vertiefungen und spülten jede Vertiefung wiederholt mit überschüssigem Inkubationspuffer aus. Wir fixierten die Zellen an die Membran durch Exposition gegenüber einer Mischung von drei Teilen Ethanol und einem Teil Essigsäure und färbten dann die Spermien mit 4,6-Diamidino-2-phenylindol (1 ug/ml in PBS-Puffer) an. Die Anzahl der pro Einheitsfläche gebundenen Spermien wurde durch Zählung unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops quantitativ bestimmt. Die Datenanalyse wurde wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben durchgeführt.
• Beispielsweise waren wir bei der Beurteilung des Vermögens dieser Daten, zwischen Proben von Hühnerhahnspermatozoen, die frischen Samen von männlichen Individuen repräsentierten, zu unterscheiden, in der Lage zu zeigen, daß es bei Proben, die sich im Bindungsvermögen an die Eimembran unterscheiden, wahrscheinlich ist, daß sie sich im Fertilisierungsvermögen unterscheiden. Zehn Spermaproben wurden individuell und als eine gepoolte Probe, die gleiche Teile aller Proben enthielt, auf Bindung getestet. Während die gepoolte Probe einen gleichmäßigen Zellbindungsprozentsatz von etwa 69% ergab, ergaben die individuellen Proben die jeweiligen Ergebnisse von 68%, 58%, 49%, 34%, 95%, 64%, 17%, 78%, 67% und 22%.
Beispiel 10
• Samen stand von zwei Bullen zur Verfügung, die sich trotz der Ähnlichkeit im Prozentsatz von beweglichen und morphologisch normalen Spermien in ihren Samen bekanntermaßen in der Fertilität unterschieden. Aliquots von frischen unbehandelten Samen wurden verdünnt, hinsichtlich des Prozentsatzes beweglicher Spermien beurteilt und Subaliquots, enthaltend 0 bis 7 · 10&sup6; Spermien, wurden in Vertiefungen in einer vorbereiteten Mikrotiterplatte plaziert, die gemäß Beispiel 9 vorbereitet worden war. Etwa lineare Dosis-Wirkung-Kurven wurden für jede Probe erhalten und die Steigungen der Kurven waren verschieden (siehe Fig. 4). Einige wenige abgetötete Spermien banden an die Assay-Platte. Diese Daten demonstrierten, daß das vorliegende Verfahren einen aussagekräftigen Fertilitäts-Assay darstellt.
Beispiel 11
• Eingefrorener Samen stand von zwei Hengsten zur Verfügung. Aliquots dieser kryokonservierten Samenproben wurden aufgetaut und mit TALP-Puffer verdünnt. Die Spermienkonzentration wurde mittels einer Zytometerzählung bestimmt. Subaliquots, enthaltend 0 bis 9 · 10&sup6; Spermien, wurden in Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte plaziert, die gemäß Beispiel 9 vorbereitet worden war. Es wurden etwa lineare Dosis-Wirkung-Kurven für jede Probe erhalten (Fig. 3).
Beispiel 12
• Spermien, die aus der Cauda epididymis von Mäusen isoliert worden waren, wurden in TALP-Puffer eingebracht, die Spermien wurden mittels Zytometerzählung gezählt und Aliquots von 1-10 · 10&sup6; Spermien wurden in Vertiefungen in einer vorbereiteten Mikrotiterplatte gemäß Beispiel 9 plaziert. Es wurde eine etwa lineare Dosis-Wirkung-Kurve erhalten (Fig. 4).
Beispiel 13
• Drei Proben von kryokonserviertem menschlichem Samen standen zur Verfügung, jedoch war die Fertilität der Proben unbekannt. Nach dem Auftauen wurde jede Probe durch schrittweise Zugabe von 3 Volumina TALP-Puffer von Glycerin befreit und in zwei Aliquots aufgeteilt. Eines wurde nicht weiter behandelt (ungewaschen), während das zweite durch sanfte Zentrifugation (2,9 · 10³ ms&supmin;² (300 · g) für 10 Minuten) behandelt wurde, und die Spermien wurden resuspendiert. Der Prozentsatz an beweglichen Spermien in jeder Probe wurde bestimmt. Die Spermienkonzentration wurde mit einem Zytometer bestimmt und Subaliquots, enthaltend 0 bis 7 · 10&sup6; Spermien, wurden in Vertiefungen in einer vorbereiteten Mikrotiterplatte gemäß Beispiel 9 plaziert. Es wurden etwa lineare Dosis-Wirkung-Kurven für jede Probe erhalten und die Steigungen der Kurven waren unterschiedlich (Fig. 5). Sehr wenige abgetötete Spermien, in Aliquots, die schnell auf -196ºC abgekühlt und dann aufgetaut worden waren, banden an die bindende Oberfläche. Somit ist der Assay zur Bestimmung der Brauchbarkeit von menschlichem Sperma geeignet.
• Obwohl die Erfindung oben unter Bezugnahme auf spezielle Techniken und Ergebnisse beschrieben wurde, soll die Erfindung nur in dem Umfang wie in den beigefügten Ansprüchen angegeben beansprucht werden.

Claims (16)

1. Verfahren zur Bestimmung des Fertilitätsgrades einer Spermaprobe, umfassend:

- Kontaktieren des Spermas mit Vitellin-Membranprotein, wobei das Protein aus einem vorher gelegten Vogelei extrahiert ist;

- Inkubation des Spermas und Proteins für einen ausreichenden Zeitraum, damit eine Bindung stattfinden kann;

- Waschen des Proteins, um ungebundenes Sperma im wesentlichen zu entfernen;

- Bestimmung der an das Protein gebundenen Anzahl von Spermien; und

- Korrelation der an das Protein gebundenen Anzahl von Spermien mit einer Anzahl von Kontrollspermien, die an ein im wesentlichen auf identische Weise hergestelltes Protein gebunden sind, wobei eine größere Anzahl von gebundenen Probenspermien im Vergleich zu gebundenen Kontrollspermien einen höheren Fertilitätsgrad der Probenspermien als denjenigen der Kontrollspermien anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Kontaktierens von Sperma mit Vitellin-Membranprotein durchgeführt wird durch

- Isolieren von Protein aus einem vorher gelegten Vogelei durch Auswahl von entweder gelegten Hühnereiern oder gelegten Truthahneiern, Abtrennen der Vitellin- Membranen von den so gewählten Eiern, Waschen der Vitellin-Membranen und Extraktion von Protein aus den Vitellin-Membranen,

Beschichtung eines festen Substrats mit dem Protein,

- Bildung von Vertiefungen, die an die so gebildete Proteinbeschichtung angrenzen; und

- Kontaktieren des Spermas mit der Proteinbeschichtung.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das feste Substrat ein Objektträger ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Schritt der Bestimmung der an das Protein gebundenen Anzahl von Spermien ferner den Schritt der visuellen Überprüfung der Vertiefungen unter dem Mikroskop umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Mikroskopie Fluoreszenzmikroskopie ist.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5, wobei das Vitellin-Membranprotein durch Aufteilung der Vitellin-Membran in kleine Teilchen und Solubilisierung der kleinen Teilchen, um Proteine zu erhalten, die von einer Membran mit einem 10-kD-Ausschluß zurückgehalten werden, extrahiert wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, wobei das Waschen mit einem Reinigungspuffer durchgeführt wird, der 50 mM Natriumphosphat und 145 mM Natriumchlorid, pH 7,2, umfaßt.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 2-7, wobei das feste Substrat durch Eintauchen in, Besprühen mit oder Walzenauftrag einer Lösung, die 2,5 mg/ml Protein in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, enthält, mit dem Protein beschichtet wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 2-8, wobei die Vertiefungen durch Überschichten der Proteinbeschichtung mit einer Matrize, die aus einem Material hergestellt ist, welches Spermatozoen nicht bindet und für Sperma nicht toxisch ist, gebildet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Material, aus dem die Matrize hergestellt ist, Silikongummi ist.

11. Vorrichtung zum Nachweis der potentiellen Fertilität von Sperma, umfassend ein festes Substrat, das mit Protein, welches aus den Vitellin-Membranen von gelegten Hühnereiern oder gelegten Truthahneiern extrahiert wurde, beschichtet ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei das feste Substrat ein Objektträger ist und die Vorrichtung ferner eine Matrize umfaßt, welche über der Proteinbeschichtung liegt, wobei die Matrize Löcher darin aufweist, um Reaktionsvertiefungen zu bilden, die an die Proteinbeschichtung angrenzen.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei das feste Substrat eine oder mehrere vorgeformte Vertiefung(en) aufweist, die mit dem Protein beschichtet ist/sind.

14. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei das feste Substrat ein Objektträger ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 13, wobei das feste Substrat eine Mikrovertiefungsplatte ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 11-15, wobei das Protein eine Größe von mindestens 10 kD aufweist.