DE69525060T2

DE69525060T2 - Entzündungshemmende faktor, methode seiner isolation und verwendung

Info

Publication number: DE69525060T2
Application number: DE69525060T
Authority: DE
Inventors: R. Beck; Peter Fuhrer
Original assignee: Stolle Milk Biologics Inc
Current assignee: Stolle Milk Biologics Inc
Priority date: 1994-10-03
Filing date: 1995-09-08
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2015-09-09
Also published as: MX9702398A; NO971474L; IL115293A0; TW410157B; JP2008133299A; JP4234197B2; NO971474D0; HK1000552A1; WO1996010410A1; DK0787007T3; DE69525060D1; FI971245A0; NO318921B1; CA2201106A1; US5650175A; JPH10509420A; FI120574B; ES2170809T3; KR100424403B1; EP0787007A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen entzündungshemmenden Faktor, Verfahren zu dessen Herstellung in im wesentlichen reiner oder hochreiner Form, und dessen Verwendung in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Entzündung.

Beschreibung des Standes der Technik

Entzündung, wie in Dorland's Medical Dictionary definiert, ist "eine lokalisierte, schützende Reaktion, die durch eine Verletzung oder Zerstörung von Geweben ausgelöst wird, die dazu dient, sowohl das verletzende Agens als auch das verletzte Gewebe zu zerstören, zu verdünnen oder abzuschirmen". Sie ist durch Fenestration des Mikrogefäßsystems, Durchsickern der Blutelemente in die Gewebszwischenräume und Migration von Leukozyten in das entzündete Gewebe gekennzeichnet. Auf makroskopischer Ebene ist dies für gewöhnlich von den vertrauten klinischen Zeichen von Erythema, Ödemen, Empfindlichkeit (Hyperalgesie) und Schmerz begleitet. Während dieser komplexen Reaktion werden lokal chemische Mediatorsubstanzen, wie Histamin, 5-Hydroxytryptamin, verschiedene chemotaktische Faktoren, Bradykinin, Leukotriene und Prostaglandine freigesetzt. Phagozytische Zellen wandern in den Bereich, und zelluläre lysosomale Membrane können aufgebrochen werden, wodurch lytische Enzyme freigesetzt werden. Alle diese Ereignisse können zu der Entzündungsreaktion beitragen.
Eine Entzündung bei Patienten mit rheumatoider Arthritis beinhaltet wahrscheinlich die Kombination eines Antigens (Gammaglobulin) mit einem Antikörper (rheumatoider Faktor) und Komplement, was die örtliche Freisetzung chemotaktischer Faktoren bewirkt, die Leukozyten anziehen. Die Leukozyten phagozytieren die Komplexe von Antigen-Antikörper und Komplement und setzen auch die vielen Enzyme frei, die in ihren Lysosomen enthalten sind. Diese lysosomalen Enzyme verursachen dann eine Verletzung des Knorpelgewebes und anderer Gewebe, und dies erhöht den Grad der Entzündung noch mehr. Es können auch zellvermittelte Reaktionen beteiligt sein. Während dieses Prozesses werden auch Prostaglandine freigesetzt.
Prostaglandine, die wahrscheinlich bei einer Entzündung erzeugt werden, verursachen Erythema und erhöhen den lokalen Blutstrom. Zwei wichtige Wirkungen der Prostaglandine auf die Gefäße weisen andere Mediatorsubstanzen der Entzündung im allgemeinen nicht auf - eine lang anhaltende gefäßerweiternde Wirkung und die Fähigkeit, den gefäßverengenden Wirkungen von Substanzen wie Norepinephrin und Angiotensin entgegenzuwirken.
Eine Reihe von Mediatorsubstanzen der Entzündung erhöhen die vaskuläre Durchlässigkeit (Durchsickern) in den post-kapillaren und Sammelvenolen. Zusätzlich ist die Migration von Leukozyten in einen entzündeten Bereich ein wichtiger Aspekt des Entzündungsprozesses.
Die Arthus-Reaktion ist eine Entzündungsreaktion, die durch die Bildung von Immunkomplexen an subkutanen Stellen hervorgerufen wird, wo ein Antigen mit einem Antikörper zu diesem Antigen einen Komplex bildet. Normalerweise heften sich neutrophile Teilchen an den Fc-Teil des Immunglobulinkomplexes, der sich an der subkutanen Injektionsstelle bildet, wo sie Verdauungsenzyme freisetzen, die eine sichtbare akute Entzündung verursachen. Somit ist die Reaktion vorwiegend durch neutrophile Teilchen vermittelt und Mittel, welche die Entwicklung der Reaktion beeinflussen, bewirken dies über eine Wirkung auf diese Zellen.
Es gibt mehrere Wege, über welche ein Mittel die Migration von neutrophilen Teilchen von den Blutgefäßen zu einer Entzündungsstelle beeinflussen kann. Ein wahrscheinlicher Weg ist die Hemmung der Margination, des reversiblen "Anhaftens" von Entzündungszellen an die Endothelzellauskleidung der Blutgefäßwand. Im normalen Zustand sind etwa 50% der neutrophilen Teilchen reversibel angeheftet, aber während einer akuten Entzündungsreaktion wird die Adhäsion viel stärker und ist ein Schlüsselschritt in dem Prozeß der Migration von neutrophilen Teilchen. Während Prostaglandine kaum direkt an der chemotaktischen Reaktion beteiligt sind, ist ein anderes Stoffwechselprodukt der Arachidonsäure, Leukotrien, eine sehr starke chemotaktische Substanz.
Die entzündungshemmende Reaktion ist jede Reaktion, die durch eine Entzündung wie zuvor definiert gekennzeichnet ist. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Medizin ist allgemein bekannt, daß die Entzündungsreaktion ein starkes körperliches Unbehagen verursacht, d. h., Schmerz und Funktionsverlust, das mit verschiedenen Erkrankungen und Verletzungen verbunden ist. Daher ist es in der Medizin allgemein üblich, pharmakologische Mittel zu verabreichen, welche eine Neutralisierung der Entzündungsreaktion bewirken. Mittel mit diesen Eigenschaften sind als entzündungshemmende Heilmittel klassifiziert. Entzündungshemmende Heilmittel werden für die Behandlung eines breiten Spektrums von Erkrankungen verwendet, und dieselben Heilmittel werden häufig zur Behandlung verschiedener Erkrankungen verwendet. Die Behandlung mit entzündungshemmenden Heilmitteln richtet sich nicht auf die Erkrankung, sondern meistens auf das Symptom, d. h., die Entzündung.
Die entzündungshemmenden, analgetischen und antipyretischen Heilmittel sind eine heterogene Gruppe von Verbindungen, häufig chemisch nicht verwandt, die dennoch gewisse therapeutische Wirkungen und Nebenwirkungen teilen. Corticosteroide stellen die am häufigsten verwendete Klasse von Verbindungen für die Behandlung der entzündungshemmenden Reaktion dar. Proteolytische Enzyme stellen eine weitere Klasse von Verbindungen dar, von welchen angenommen wird, daß sie entzündungshemmende Wirkungen haben. Hormone, welche die Nebennierenrinde direkt oder indirekt veranlassen, Steroide zu erzeugen und abzusondern, stellen eine weitere Klasse von entzündungshemmenden Verbindungen dar. Es wurde eine Reihe von nicht-hormonellen entzündungshemmenden Mitteln beschrieben. Von diesen sind die am häufigsten verwendeten die Salicylate. Acetylsalicylsäure oder Aspirin ist das am häufigsten verschriebene analgetisch-antipyretische und entzündungshemmende Mittel. Beispiele für steroide und nicht-steroide entzündungshemmende Mittel sind in Physicians's Desk Reference", 1987, aufgelistet (siehe S. 207 und 208 bezüglich eines Indexes für solche Präparate).
Die natürlichen und synthetischen Corticosteroidpräparate verursachen eine Reihe schwerer Nebenwirkungen, einschließlich einer Erhöhung des Blutdrucks, der Salz- und Wasserzurückhaltung und einer erhöhten Kalium- und Kalziumausscheidung. Ferner können Corticosteroide die Zeichen einer Infektion maskieren und die Verbreitung infektiöser Mikroorganismen verstärken. Diese Hormone werden nicht als sicher in der Verwendung bei schwangeren Frauen erachtet, und die langfristige Corticosteroidbehandlung war von gastrischer Hyperaktivität und/oder peptischen Ulcera begleitet. Die Behandlung mit diesen Verbindungen kann auch Diabetes mellitus erschweren, wodurch höhere Insulindosen erforderlich sind, und psychotische Störungen hervorrufen. Hormonelle entzündungshemmende Mittel, welche die Produktion endogener Corticosteroide indirekt erhöhen, haben dasselbe Potential für unerwartete, schädigende Nebenwirkungen.
Die nicht-hormonellen entzündungshemmenden Mittel sind synthetische biochemische Verbindungen, die bei hohen Dosen mit einem weiten Spektrum unerwünschter Nebenwirkungen toxisch sein können. Zum Beispiel tragen Salicylate zu den schweren Störungen des Säure-Basen-Gleichgewichts bei, die eine Vergiftung durch diese Klasse von Verbindungen kennzeichnen. Salicylate stimulieren die Atmung direkt und indirekt. Toxische Dosen von Salicylaten bewirken eine zentrale respiratorische Paralyse, wie auch einen Kreislauflcollaps infolge einer vasomotorischen Depression. Die Einnahme von Salicylaten kann zu epigastrischem Schmerz, Ekel und Erbrechen führen. Durch Salicylat ausgelöste Magenblutung ist allgemein bekannt. Salicylate können eine Leberverletzung verursachen und zu einer Verlängerung der Gerinnungszeit führen. Daher sollte Aspirin bei Patienten mit schwerem Leberschaden, Hypoprothombinämie, Vitamin K-Mangel oder Hämophilie vermieden werden, da die Hemmung der Plättchenhämostase durch Salicylate zu einer Blutung führen kann. Eine Salicylatvergiftung ist häufig, und mehr als 10.000 Fälle einer schweren Salicylatvergiftung werden jährlich in den Vereinigten Staaten beobachtet, von welchen einige fatal sind und viele bei Kindern auftreten. Siehe Goodman und Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. Aufl., 1985. Daher besteht trotz der großen Anzahl entzündungshemmender Mittel, die gegenwärtig verfügbar sind, nach wie vor ein Bedarf an einem sicheren, wirksamen, entzündungshemmenden Produkt, das frei von Nebenwirkungen und unerwarteten schädigenden Wirkungen ist.
Wenn ein natürliches Lebensmittelprodukt, wie eines, das zum Beispiel von Milch abgeleitet wird, mit entzündungshemmenden Wirkungen zur Verfügung stünde, wäre es eine leicht verabreichbare, sofort verfügbare, sichere therapeutische Verbindung.
Nach dem Stand der Technik ist bekannt, Milchsorten mit einer Vielzahl therapeutischer Wirkungen zu produzieren. Zum Beispiel hat Beck eine Milch offenbart, die Antikörper gegen Streptococcus mutans enthält, die eine karieshemmende Wirkung hat (U.S. Patent Nr. 4,324,782). Die Milch wird durch Immunisieren einer Kuh mit S. mutans Antigen in zwei Stufen und Gewinnen der therapeutischen Milch von dieser erhalten.
Stolle et al. haben ein Verfahren zur Behandlung von Gefäßerkrankungen oder Lungenerkrankungen, die mit dem Rauchen in Zusammenhang stehen, bei einem Tier offenbart, welches das Verabreichen von Milch, die von einer Kuh stammt, die in einem hyperimmunen Zustand gehalten wird, an das Tier umfaßt (U.S. Patent Nr. 4,636,384). Beck hat ein Verfahren zur Behandlung einer Entzündung bei einem Tier offenbart, das die Verabreichung einer entzündungshemmenden, wirksamen Menge an Milch, die von einer Kuh erhalten wird, die in einem einen entzündungshemmenden Faktor produzierenden Zustand gehalten wird, an das Tier umfaßt (U.S. Patent Nr. 4,284,623). Heinbach, U.S. Patent Nr. 3,128,230, hat eine Milch beschrieben, die durch Impfen einer Kuh mit antigenen Mischungen Globuline von Alpha-, Beta- und Gamma-Komponenten enthält. Peterson et al. (U.S. Patent Nr. 3,376,198), Holm (U.S. Anmeldung (veröffentlicht) Seriennr. 628,987), Tunnah et al. (Britisches Patent Nr. 1,211,876) und Biokema S. A. (Britisches Patent 1,442,283) haben auch antikörperhältige Milcharten beschrieben.
Keine der obengenannten Verweisstellen offenbart jedoch die Identität der Komponente oder Komponenten von therapeutischen Milcharten, welche die gewünschten therapeutischen Wirkungen erzeugen. Zum Beispiel bestehen bei Beck, U.S. Patent Nr. 4,284,623, die als therapeutisches Mittel verwendeten Milchprodukte entweder aus flüssiger Vollmilch, flüssiger fettfreier Molke oder Vollmilchpulvern. Obwohl jedes dieser Milchprodukte entzündungshemmende Eigenschaften aufweist, wurden der Faktor oder die Faktoren, die tatsächlich den therapeutischen Nutzen bringen, noch nicht isoliert oder identifiziert oder bis zur Homogenität gereinigt.
WO-A-92/04035 und WO-A-94/09799 offenbaren beide Verfahren zur Reinigung entzündungshemmender Milchfaktoren, wobei die Milch filtriert wird und das Permeat auf eine Anionenaustauschsäule aufgebracht wird.
Eine besondere Schwierigkeit, hoch gereinigte Präparate von entzündungshemmenden Milchfaktoren (MAIF) zu erhalten, ist das Unvermögen, eng gebundene Salze von dem MAIF durch gegenwärtig verwendete Reinigungsverfahren zu entfernen. Eines der Probleme, mit dem sich diese Erfindung unter anderem beschäftigt, ist die Herstellung von MAIF in großem Maßstab, einschließlich der Entfernung eng gebundener Salze von dem MAIF- Präparat, wodurch ein hochgereinigter MAIF erhalten wird. Ferner gab es früher Probleme, hochreine MAIF-Präparate im präparativen Maßstab zu erhalten, wenn mit großen Volumina von Ausgangsmaterialien begonnen wurde (z. B. 90 Liter Magermilch). Die Erfindung bietet für diese Probleme Lösungen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft einen entzündungshemmenden Faktor, der in Milch vorhanden ist, und verschiedene Verfahren, welche die Verwendung des entzündungshemmenden Faktors, der in Milch vorhanden ist, beinhalten. Somit stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Reinigung eines entzündungshemmenden Faktors aus Magermilch (MAIF) bereit, umfassend:
i) Ultrafiltration der Milch durch ein Filter mit einer Molekulargewicht-Abtrennung von 10.000 Dalton;
ii) Sammeln eines < 10.000 Dalton Permeats aus Schritt (i);
iii) Aufbringen des Permeats auf eine erste Ionenaustauschsäule und Waschen der Säule mit deionisiertem Wasser;
iv) Sammeln des Eluats aus Schritt (iii);
v) Trennen des Eluats aus Schritt (iv) in einer präparativen Größenausschluß- HPLC-Chromatographiesäule und Sammeln des Eluats; und
vi) Durchführen einer organischen Verteilungsextraktion von dem Eluat, das aus der präparativen Größenausschluß-HPLC-Chromatographie erhalten wurde, und Gewinnen des wäßrigen Extraktes aus der Extraktion.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung einen gereinigten entzündungshemmenden Faktor bereit, der aus einem Verfahren nach dem ersten Aspekt der Erfindung erhältlich ist. Die Erfindung stellt auch einen solchen gereinigten entzündungshemmenden Faktor zur Verwendung in der Medizin bereit.
Die Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung eines entzündungshemmenden Milchfaktors zur Verhinderung des Anhaftens neutrophiler Teilchen an das Endothel von Venolen oder zur Lösung von neutrophilen Teilchen, die sich bereits an die Endothelzellauskleidung der Venolenwände geheftet haben. Auf diese Weise wird der Faktor zur Verringerung des Gewebeschadens verwendet, der mit der Entzündungsreaktion verbunden ist.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des entzündungshemmenden Milchfaktors zur Vermeidung von Wechselwirkungen zwischen CD18-Zelloberflächen-Antigenen und anderen Molekülen. Es ist bekannt, daß solche Wechselwirkungen für den Austritt von Zellen aus dem Gefäßsystem notwendig sind, und daß eine solche Emigration zu einem verstärkten Gewebeschaden bei Tieren während der Entzündungsreaktion führt. Von CD18- Antigenen ist auch bekannt, daß sie in der immunologischen Reaktion eines Wirtsorganismus auf fremde Antigene wichtig sind.
Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung des entzündungshemmenden Faktors bei Säugetieren zur Vermeidung der Emigration von Zellen aus dem Gefäßsystem und zur Hemmung der mitogenen Reaktion von Lymphozyten auf fremde Antigene. Somit stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt einen MAIF bereit, der aus dem Verfahren des ersten Aspekts erhalten wird, in der Herstellung eines Mittels zur:
Hemmung der Migration neutrophiler Teilchen;
Hemmung der Entzündungsreaktion;
Hindern neutrophiler Teilchen am Anhaften an Endothelzellen in Säugetieren;
Abtrennung neutrophiler Teilchen, die sich an Endothelzellen in Säugetieren angeheftet haben;
Hemmung der Wechselwirkung zwischen in Säugetieren vorhandenen CD18-Zelloberflächen-Antigenen und Molekülen, die in der Lage sind, an die CD18-Zelloberflächen- Antigene zu binden;
Hemmung der Emigration von Leukozyten aus dem venösen System eines Säugetiers; oder
Unterdrücken der mitogenen Reaktion von Lymphozyten in einem Säugetier-Wirt auf fremde Antigene.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung stellt die Erfindung einen MAIF, der aus dem Verfahren des ersten Aspekts erhalten wird, in der Herstellung eines Mittels für die Behandlung oder Prophylaxe einer Entzündung und entzündlicher Zustände, wie akute und subakute Bursitis, akute unspezifische Tendonitis, systemischer Lupus erythematosus, systemische Dermatomyositis, akute rheumatische Carditis, Pemphigus, bulöse Dermatitis, Herpetiformis, schwere Hautrötungen, multiforme abblätternde Dermatitis, Zirrhose, saisonbedingte dauernde Rhinitis, bronchiales Asthma, ektopische Dermatitis, Serumkrankheit, Hornhautentzündung, Ophthalmicus iritis, diffuse Ureitis, Chorditis, Entzündung des Sehnervs, sympathische Bindehautentzündung, symptomatische Sarcoidosis, Loeffler's Syndrom, Berylliose, hämolytische Anämie, Mastitis, Mastoiditis, Kontaktdermatitis, allergische Konjunktivitis, psoriatische Arthritis, versteifende Spondylitis, akute gichtische Arthritis und Herpes Zoster.
Ebenso wird eine pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, die einen MAIF, der durch das Verfahren des ersten Aspekts erhältlich ist, gemeinsam mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel umfaßt.
Bevorzugte Merkmale der Erfindung sind hierin in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Ein vollständiges Verständnis der Erfindung und vieler ihrer begleitenden Vorteile wird durch die Erklärung mit Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung erhalten, wenn diese in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen betrachtet wird:
Fig. 1. Isolierung des entzündungshemmenden Faktors durch Ionenaustauschchromatographie auf einer DEAE-Cellulose-Säule.
Fig. 2. Fraktionierung des den entzündungshemmenden Faktor enthaltenden Peaks (zweiter) aus der DEAE-Cellulose-Chromatographie (Fig. 1) auf einer Sephadex G-10 Molekularsiebsäule.
Fig. 3. Wirkung von immuner Milch auf Carrageen-induzierte Ödeme in Ratten (Pfotengewicht, % Kontrollpfote, Mittel ± SEM, n = 10).
Fig. 4. Wirkung einer intraperitonealen Verabreichung des entzündungshemmenden Faktors auf Fußballen-Ödeme bei Ratten (ul, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 5. Intraperitoneale Dosis-Wirkungs-Kurve für den entzündungshemmenden Faktor im Rattenpfoten-Ödemtest (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 6. Wirkung des hyperimmunen Milchfaktors gegenüber Placebo (Lactose) bei Fußballenödemen in Ratten (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 7. Wirkung von i.v. und oralem MAIF bei Fußballenödemen in Ratten (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 8. Wirkung einer geringen i.v. Dosierung von MAIF bei Fußballenödemen in Ratten (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 9. Intravenöse Dosis-Wirkungs-Kurve für MAIF im Rattenpfoten-Ödemtest (% Kontrolle, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 10. Lauf 1, Zwillingsherde/Ultrafiltrationsexperimente (% Durchschnitt Kontrollödeme, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 11. Lauf 2, Zwillingsherde/Ultrafiltrationsexperimente (% Durchschnitt Kontrollödeme, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 12. Lauf 3, Zwillingsherde/Ultrafiltrationsexperimente (% Durchschnitt Kontrollödeme, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 13. Wirkung von verschiedenen MAIF-Behandlungen auf die Hemmung von Fußballenödemen in Ratten (ul Fußballenödeme, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 14. Wirkung von MAIF-Fraktionen und von immunem MPK auf die Hemmung von Fußballenödemen in Ratten (ul Fußballenödeme, Mittel ± SD, n = 6).
Fig. 15. Wirkung von fünf verschiedenen Anästhetika auf die Reaktion auf Carrageen im Ratten-Fußballen. Die Ansammlung von Ödemen wurde in ausgewählten Intervallen bei denselben Tieren aufgezeichnet. n = 6 für jeden Datenpunkt.
Fig. 16. Nachweis der biphasischen Eigenschaft der Reaktion auf Carrageen im Ratten-Fußballen. n = 5 für jeden Datenpunkt. Als Anästhetikum wurde Ether verwendet.
Fig. 17(A-B). MAIF, der entweder mit 5 mg pro Ratte (A) oder 40 mg pro Ratte (B) verabreicht wurde, hemmt die entzündliche Reaktion auf Carrageen bei mit Ether narkotisierten Ratten nicht. n = 4 für alle Datenpunkte.
Fig. 18. Hemmung der Carrageen-induzierten Ödemansammlung während der sekundären, phagozytisch-zellvermittelten Reaktion durch 40 mg MAIF, der zum Zeitpunkt der Carrageen-Belastung i.v. injiziert wurde (Zeitpunkt 0). n = 12 für jeden Datenpunkt in der Kontrollgruppe und n = 10 für jeden Datenpunkt in der MAIF-behandelten Gruppe.
Fig. 19. Wirkung von MAIF, der i.v. mit 4 mg pro Ratte zu verschiedenen Zeitpunkten verabreicht wurde, auf die Reaktion auf Carrageen im Ratten-Fußballen. Die Ödeme wurden in allen Fällen 4 Stunden nach der Belastung bewertet. n = 12 für jeden Datenpunkt.
Fig. 20. Wirkung von 20 mg MAIF, der i.v. injiziert wurde, auf die reverse, passive Arthus-Reaktion. * = p < 0,01; ** = p < 0,05.
Fig. 21. Wirkung von abnehmenden MAIF-Dosen auf die Fähigkeit von neutrophilen Teilchen, aus dem Gefäßsystem in subkutan implantierte sterile Tupfer zu wandern. * = p < 0,01.
Fig. 22. Wirkung von MAIF, der bei einer Dosis von 20 mg pro Ratte verabreicht wurde, die Fähigkeit entzündlicher Zellen zu hemmen, sich in subkutan implantierten Tupfern zu sammeln, wenn er zum Zeitpunkt der Implantation oder bis zu 120 Minuten nach der Implantation verabreicht wurde. * = p < 0,01.
Fig. 23. Zeitverlauf der zellulären entzündlichen Infiltration in subkutan implantierte Tupfer in normalen Tieren.
Fig. 24. Wirkung von Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors auf das durch den plättchenaktivierenden Faktor (PAF) herbeigeführte Anheften von neutrophilen Teilchen an Venolen.
Fig. 25. Wirkung von Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors auf die PAF-induzierte Emigration von neutrophilen Teilchen.
Fig. 26. Wirkung von Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors auf den PAF-induzierten Fluß von neutrophilen Teilchen durch Venolen.
Fig. 27. Umkehr der Adhäsion von neutrophilen Teilchen durch Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors. Fig. 27a zeigt die Wirkung des MAIF-Präparates (40 mg/Ratte) in der Verringerung der Anzahl von neutrophilen Teilchen, die als Reaktion auf PAF an Venolen haften. 27b zeigt die Wirkung des MAIF-Präparats (40 mg/Ratte) auf neue Endothelzellen-Adhäsionen von neutrophilen Teilchen.
Fig. 28. Wirkung von Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors auf die Geschwindigkeit von neutrophilen Teilchen in Venolen.
Fig. 29 Wirkung von Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors auf die Geschwindigkeit von roten Blutkörperchen in Venolen.
Fig. 30. Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf den Leukozytenfluß in Venolen.
Fig. 31. Wirkung von 40 mg des MAIF-Präparates, das i.v. verabreicht wurde, auf die Anzahl zirkulierender neutrophiler Teilchen und Lymphozyten in den 24 Stunden nach der Injektion.
Fig. 32. Dosis-Wirkungs-Verhältnis zwischen der i.v. Verabreichung des MAIF- Präparates und den zirkulierenden Leukozytenzahlen (p < 0,01).
Fig. 33(A-E). Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf verschiedene Aspekte der Lymphozytenfunktion. 33a zeigt die Wirkung der früheren Verabreichung des Faktors auf die Reaktion der Wirts-T-Lymphozyten auf fremde Histcompatibilitäts-Antigene. 33b zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn Lymphozyten von MAIF-behandelten Ratten in unbehandelte Ratten injiziert werden. 33C und 33D zeigen die Wirkung der MAIF- Behandlung auf das Milzgewicht und die Milz-Zellenanzahl in Ratten. Fig. 33E zeigt die Wirkung der MAIF-Behandlung auf die Concanavalin A-stimulierte mitogene Reaktion von Lymphozyten.
Fig. 34. Hemmung von infektionsbedingten Ödemen durch 40 mg i.v. injizierten MAIF. Die Mittelwerte der beiden Gruppen waren: Kontrollen, 87 ± 22 ul; MAIF, 45 ± 17 ul; p < 0,01.
Fig. 35. Wirkung von MAIF, der i.v. mit 40 mg pro Ratte verabreicht wurde, auf die bakterielle Replikation und subkutan implantierte, E. coli-infizierte Tupfer.
Fig. 36(A-B). Hemmung der entzündlichen Zellinfiltration in infizierte Tupfer durch MAIF (40 mg pro Ratte, i.v.).
Fig. 37. Wirkung von MAIF (40 mg pro Ratte, i.v.) auf die Hemmung der Zwischenphase (4-16 Stunden) der entzündlichen Flüssigkeitsansammlung in E. coli-infizierten Tupfern.
Fig. 38. Wirkung von 40 mg MAIF, der zum Zeitpunkt der Belastung und 48 Stunden später intravenös verabreicht wurde, auf die Pathogenese einer experimentellen Pyelonephritis. Die gestrichelte Linie in der linken Graphik stellt das mittlere Hintergrund- Nierengewicht dar. * = p < 0,01; ** = p < 0,02.
Fig. 39. Vergleich von standardisiertem hyperimmunen und Kontroll-MAIF. MAIF, der durch Standardverfahren hergestellt wurde, wurde bei Dosen von 0,5, 1,5, 3,5 und 8 mg/120-150 gm weiblichen Ratten auf deren Fähigkeit, die Migration von neutrophilen Teilchen zu Entzündungsstellen zu hemmen, getestet. Der Verweis "handelsüblich" bezieht sich auf Magermilchpulver vom Regal.
Fig. 40. Vergleich von MAIF und anderen Milchkomponenten. Die Aktivität von standardisiertem MAIF, der aus hyperimmuner Milch hergestellt wurde, wurde mit Sialsäure und Orotsäure, bekannten Komponenten der Milch, verglichen, denen entzündungshemmende Aktivität nachgesagt wird.
Fig. 41. Vergleich von standardisiertem MAIF von hyperimmuner Milch und entzündungshemmenden Heilmitteln (Indomethacin und Aspirin).
Fig. 42. Analyse der Zusammensetzung des DEAE-abgeleiteten MAIF durch Größenausschluß-HPLC.
Fig. 43. Analyse der getrockneten Ethylacetatfraktion im Hemmungstest der Migration von neutrophilen Teilchen zeigte eine starke MAIF-Aktivität.
Fig. 44(A-B). Analyse der MAIF-Verbindung auf einer Aminopropyl-schwachen Anionenaustauschsäule vor und nach der Extraktion. "Vor" (Fig. 44A) und "nach" (Fig. 44B) bezieht sich auf Zubereitungen vor und nach der organischen Verteilungschromatographie. Das signifikante Verschwinden der Schulter "A" in dem verschobenen Elutionsmuster von Fig. 44B ist zu beachten.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN

AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Die Erfindung umfaßt die Isolierung und Reinigung eines entzündungshemmenden Faktors aus Milch und die Verwendung dieses Faktors in der Herstellung eines Mittels zur Behandlung entzündungshemmender Störungen. Wenn nicht anders angegeben, gelten folgend Definitionen:
Der Begriff "entzündungshemmender Milchfaktor" soll einen Faktor bezeichnen, der entweder aus hyperimmuner Milch oder normaler Kuhmilch erhalten wird. Mit dem Begriff "im wesentlichen reiner entzündungshemmender Milchfaktor" soll, für den Zweck dieser Erfindung, ein entzündungshemmender Faktor bezeichnet werden, der als einzelner symmetrischer Hauptpeak in HPLC-Chromatographie eluiert, nach der Entfernung von Substanzen mit hohem Molekulargewicht (> 10.000 Dalton) und Isolierung der negativ geladenen Spezies mit geringem Molekulargewicht durch Ionenaustauschchromatographie. Mit dem Begriff "hochgereinigt" oder "hochrein" soll ein entzündungshemmender Faktor bezeichnet werden, der ein Elutionsmuster auf einer Aminopropyl-schwachen Anionenaustauschsäule aufweist, das jenem von Fig. 44B ähnlich aber mit diesem nicht unbedingt identisch ist. Eine besondere Eigenschaft eines solchen Elutionsprofils ist der signifikante Verlust der Schulter A (wie in Fig. 44A erkennbar ist), der in dem verschobenen Profil von Fig. 44B ersichtlich ist. Sowohl normale Milch als auch hyperimmune Milch können durch die hierin beschriebenen Verfahren verarbeitet werden, um den entzündungshemmenden Faktor zu erhalten.
Mit dem Begriff "hyperimmune Milch" soll, für den Zweck dieser Erfindung, Milch bezeichnet werden, die von milchproduzierenden Tieren erhalten wird, die in einem hyperimmunen Zustand gehalten werden, wobei die Einzelheiten der Hyperimmunisierung in der Folge ausführlicher beschrieben sind.
Mit dem Begriff "Molke" soll, für den Zweck dieser Erfindung, Milch bezeichnet werden, von welcher der Rahm entfernt wurde.
Mit dem Begriff "normale Milch" soll, für den Zweck dieser Erfindung, Milch bezeichnet werden, die von milchproduzierenden Tieren durch herkömmliche Mittel und Molkereipraktiken erhalten wird.
Mit dem Begriff "milchproduzierende Tiere" sollen, für den Zweck dieser Erfindung, Säugetiere bezeichnet werden, die Milch in kommerziell brauchbaren Mengen erzeugen, vorzugsweise Kühe, Schafe und Ziegen, insbesondere Milchkühe der Gattung Bos (Rind), insbesondere jene Rassen, welche die höchsten Milcherträge liefern, wie Holstein.
Mit dem Begriff "bakterielles Antigen" soll, für den Zweck dieser Erfindung, eine lyophilisierte Zubereitung aus durch Wärme abgetöteten bakteriellen Zellen bezeichnet werden.
Mit dem Begriff "mikroeingekapselte Form" sollen, für den Zweck dieser Erfindung, polymere Mikropartikel bezeichnet werden, die ein oder mehrere bakterielle Antigene zur Verabreichung an milchproduzierende Tiere einkapseln.
Mit dem Begriff "Entzündung" soll, für den Zweck dieser Erfindung, eine lokalisierte schützende Reaktion bezeichnet werden, die durch eine Verletzung oder Zerstörung von Gewebe ausgelöst wird, die zur Zerstörung, Verdünnung oder Abgrenzung sowohl des verletzenden Agens als auch des verletzten Gewebes dient, gekennzeichnet in der akuten Form durch die klassische Abfolge von Schmerz, Wärme, Röte, Schwellung und Funktionsverlust, und die histologisch eine komplexe Reihe von Ereignissen umfaßt, einschließlich der Erweiterung der Arteriolen, Kapillare und Venolen mit erhöhter Durchlässigkeit und verstärktem Blutstrom, Exsudation von Flüssigkeiten, einschließlich Plasmaproteine, und Leukozytenmigration in den Entzündungsherd.
Mit dem Begriff "behandeln" ist, für den Zweck dieser Erfindung, gemeint, daß die Symptome der Störung und/oder die pathogene Ursache der Störung verbessert oder vollständig beseitig werden.
Mit dem Begriff "verabreichen" ist, für den Zweck dieser Erfindung, jedes Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einer Substanz gemeint, wie oral, intranasal, parenteral (intravenös, intramuskulär oder subkutan) oder rektal. Mit dem Begriff "Tier" wird für den Zweck dieser Erfindung, jedes Lebewesen bezeichnet, das eine Entzündung erleiden kann, einschließlich Menschen, landwirtschaftliche Nutztiere, Haustiere oder Zootiere.
Beispiele für entzündliche Zustände, die durch das isolierte und gereinigte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind Zustände, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus akuter und subakuter Bursitis, akuter unspezifischer Tendonitis, systemischem Lupus erythematosus, systemischer Dermatomyositis, akuter rheumatischer Carditis, Pemphigus, bulöser Dermatitis, Herpetiformis, schwerer Hautrötungen, multiformer abblätternder Dermatitis, Zirrhose, saisonbedingter dauernder Rhinitis, bronchialem Asthma, ektopischer Dermatitis, Serumkrankheit, Hornhautentzündung, Ophthalmicus iritis, diffuser Ureitis, Chorditis, Entzündung des Sehnervs, sympathischer Bindehautentzündung, symptomatischer Sarcoidosis, Loeffler's Syndrom, Berylliose, hämolytischer Anämie, Mastitis, Mastoiditis, Kontaktdermatitis, allergischer Konjunktivitis, psoriatischer Arthritis, versteifender Spondylitis, akuter gichtischer Arthritis und Herpes Zoster. Ferner kann das isolierte und gereinigte Milchprodukt zur Behandlung von Individuen verwendet werden, die möglicherweise entzündlichen Agenzien ausgesetzt sind.
Die Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, daß, wenn ein milchproduzierendes Tier, wie ein Rind, in einen bestimmten Hyperimmunisierungszustand gebracht wird, das Tier Milch erzeugt, die supranormale Werte des äußerst günstigen entzündungshemmenden Faktors aufweist, wobei der Faktor nicht nur die Symptome der Entzündung beim Menschen und anderen Tieren unterdrückt, sondern auch ein prophylaktisches Mittel in Erwartung entzündlicher Agenzien beim Empfänger darstellt. Der Begriff "supranormale Werte" soll Werte über jenen bezeichnen, die in Milch von nicht hyperimmunisierten Tieren vorgefunden werden. Es ist nicht ausreichend, nur eine Immunempfindlichkeit auszulösen, um das Auftreten supranormaler MAIF-Werte in Milch zu verursachen, wie durch die Tatsache gezeigt wird, daß normale Kuhmilch diese supranormalen Werte nicht aufweist, obwohl die Kühe während der normalen Immunisierung gegen Kuhkrankheiten und während der normalen Umweltbelastung gegen verschiedene Agenzien sensibilisiert werden. Die Milch hat nur in spezifischen hyperimmunen Zuständen die gewünschten supranormalen Werte.
Dieser spezielle Zustand kann durch Verabreichen einer anfänglichen Immunisierung erreicht werden, auf die periodische Auffrischungen in ausreichend hohen Dosen des spezifischen Antigens folgen. Die bevorzugte Dosierung der Auffrischung sollte gleich oder größer 50% der Dosierung sein, die zur Erzeugung einer primären Immunisierung des Rindes notwendig ist. Somit gibt es eine Schwellenauffrischungsdosierung, unter welcher die Eigenschaften in der Milch nicht erzeugt werden, obwohl sich die Kuh in einem Zustand befindet, der normalerweise als immun bezeichnet wird. Um den erforderlichen hyperimmunen Zustand zu erreichen, ist es wichtig, die hyperimmune Milch nach einer ersten Reihe von Auffrischungsverabreichungen zu testen. Wenn die günstigen Faktoren in der Milch nicht vorhanden sind, werden zusätzliche Auffrischungen in hoher Dosierung verabreicht, bis die Eigenschaften in der Milch auftreten.
Das Verfahren zur Herstellung der hyperimmunen Milch, die supranormale Werte des entzündungshemmenden Faktors enthält, ist in der gleichzeitig anhängigen U.S. Patentanmeldung, Seriennr. 580,382, eingereicht am 11. September 1990, und auch in U.S. Seriennr. 355,786, eingereicht am 22. Mai 1989 (nun U.S. Patent Nr. 5,106,618, eine aktenkundige Weiterbehandlung von U.S. Seriennr. 069,139, eingereicht am 2. Juli 1987) und in U.S. Seriennr. 910,297, eingereicht am 17. September 1986 (nun U.S. Patent Nr. 4,919,929, eine aktenkundige Weiterbehandlung von U.S. Seriennr. 576,001, eingereicht am 1. Februar 1983) beschrieben. Zusammenfassend umfaßt ein Verfahren zur Herstellung der hyperimmunen Milch, die supranormale Werte des entzündungshemmenden Faktors enthält, die folgenden Schritte: (1) Wahl des Antigens; (2) primäre Immunisierung des Rindes; (3) Testen des Serums zur Bestätigung der Auslösung einer Sensibilisierung; (4) Hyperimmunisierung mit Auffrischungen in geeigneter Dosierung; und wahlweise (5) Testen der Milch auf entzündungshemmende Eigenschaften; (6) Sammeln der Milch von dem hyperimmunen Rind; und (7) Verarbeiten der Milch zur Isolierung des MAIF.
Schritt 1: Es können alle Antigene und Kombinationen von Antigenen verwendet werden. Die Antigene können bakterielle, virale, protozoale, fungale, zelluläre und alle anderen Substanzen sein, auf welche das Immunsystem eines milchproduzierenden Tieres anspricht. Der kritische Punkt in diesem Schritt ist, daß das oder die Antigene imstande sein müssen, nicht nur einen immunen und hyperimmunen Zustand in dem milchproduzierenden Tier herbeizuführen, sondern auch supranormale Werte eines entzündungshemmenden Faktors in der Milch zu erzeugen. Es kann jedes Antigen zur Erzeugung supranormaler Werte eines Faktors verwendet werden. Ein bevorzugter Impfstoff ist eine Mischung aus polyvalenten bakteriellen Antigenen, die als Impfstoff der Serie 100 bezeichnet werden und im folgenden Beispiel 1A ausführlich beschrieben sind.
Schritt 2: Das oder die Antigene können in jedem Verfahren verabreicht werden, das zu einer Sensibilisierung führt. In einem Verfahren wird ein Impfstoff, der aus Antigen besteht, das von 1 · 10&sup6;, 1 · 10²&sup0;, vorzugsweise 10&sup8; bis 10¹&sup0;, insbesondere 2 · 10&sup8; durch Wärme abgetöteten Bakterien besteht, durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Andere Verfahren, wie die intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, rektale Zäpfchen oder orale Verabreichung können jedoch verwendet werden.
Schritt 3: Es muß bestimmt werden, ob das milchproduzierende Tier gegenüber dem Antigen sensibel geworden ist. Es gibt eine Reihe von Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Immunologie bekannt sind, für die Testung auf Sensibilität (Methods in Immunology and Immunochemistry, William, C. A. und Chase, W. M., Academic Press, New York, Bd. 1-5 (1975)). Das bevorzugte Verfahren ist die Verwendung eines polyvalenten Impfstoffes als Antigen, der mehrfache bakteriell Spezies enthält, und das Testen auf die Gegenwart von agglutinierenden Antikörpern im Serum des Tieres vor und nach der Belastung mit dem Impfstoff. Das Auftreten von Milchantikörpern nach der Immunisierung mit dem Impfstoff zeigt die Sensibilität an; an diesem Punkt kann mit Schritt 4 fortgefahren werden.
Schritt 4: Dieser beinhaltet das Herbeiführen und Aufrechterhalten des hyperimmunen Zustandes in dem sensibilisierten Tier. Dies erfolgt durch wiederholte Verabreichung von Auffrischungen in festgesetzten Zeitintervallen desselben polyvalenten Impfstoffes, der zur Erreichung der primären Sensibilität verwendet wurde. Ein zweiwöchiges Auffrischungsintervall ist für polyvalente bakterielle Antigene optimal. Es muß jedoch sichergestellt werden, daß das Tier nicht von einem hyperimmunen Zustand in einen Zustand der Immuntoleranz gegenüber dem Antigen wechselt.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann die Hyperimmunisierung von Rindern durch eine einzige Verabreichung eines mikroeingekapselten Impfstoffes erreicht werden, der wie ausführlich im folgenden Beispiel 1 B beschrieben ist, hergestellt wurde. Der Vorteil der Form der Hyperimmunisierung mit kontrollierter Freisetzung ist, daß die konstante Antigenbelastung garantiert, daß das Tier im hyperimmunen Zustand bleibt.
In einem alternativen Ausführungsbeispiel ist es auch möglich, verschiedene Immunisierungsverfahren zu kombinieren, z. B. die gleichzeitige Verabreichung eines mikroeingekapselten und flüssigen Antigens oder die intramuskuläre Injektion für die primäre Immunisierung, und Auffrischungsdosen durch orale Verabreichung oder parenterale Verabreichung durch Mikroeinkapselungsmittel. Viele verschiedene Kombinationen von primärer und Hyperimmunisierung sind dem Fachmann bekannt.
Schritt 2. Die Milch muß auf entzündungshemmende Aktivitätswerte getestet werden. Dies kann durch jede Forschungstechnik erfolgen, welche die Wirkungen entweder der hyperimmunen Milch oder von Produkten, die von dieser abgeleitet sind, auf die Entzündung testet. Ein Standardtest für entzündungshemmende Heilmittel ist die chemisch herbeigeführte Entzündung der Rattenpfote.
Schritt 6: Dieser beinhaltet das Sammeln und Verarbeiten der Milch. Die Milch kann durch herkömmliche Verfahren gesammelt werden. Die Verarbeitung der Milch zur Isolierung des entzündungshemmenden Faktors ist in der Folge beschrieben.
Das einfachste Verfahren zum Isolieren, Reinigen und Testen des entzündungshemmenden Faktors umfaßt die folgenden Schritte:
1. Entfetten der hyperimmunen Milch zur Erzeugung von Magermilch;
2. Entfernen des Kaseins aus der Magermilch zur Erzeugung von Molke;
3. Entfernen von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 10.000 Dalton aus der Molke durch Ultrafiltration;
4. Fraktionieren des Produktes von Schritt 3 unter Verwendung einer Ionenaustauschsäule zur Isolierung einer negativ geladenen entzündungshemmenden Spezies mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 Dalton;
5. Abtrennen der negativ geladenen entzündungshemmenden Spezies von Schritt 4 durch Molekularsiebchromatographie; und
6. Biologischer Test der entzündungshemmenden Faktorzubereitung aus Schritt 5.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung werden die Fraktionen von der Molekularsiebchromatographie, die biologische Aktivität aufweisen, durch Filtration durch eine Membran weiter gereinigt, die Makromoleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 5000 Dalton zurückhält.
7. Die entzündungshemmende Wirkung des Milchfaktors kann an Ödemen getestet werden, die durch Injektion einer Carrageen-Lösung in die Pfote von Ratten hervorgerufen werden. Der Rattenpfotentest ist der Standard-Tierversuch für entzündungshemmende Heilmittel. Winter, C. A., Risley, G. A., Nuss, A. W., "Carrageenan-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs", Kproc. Soc. Exper. Biol. Med. 3: 544 (1967). Als Alternative kann ein pleuraler Neutrophilmigrations-Hemmtest verwendet werden, wie in Beispiel 24 beschrieben ist. Vinegar et al., "Some Quantitative Characteristics of Carrageenan-induced Pleurisy in the Rat", Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 143: 711-714 (1973); Ammendola, G. et al., "Leukocyte Migration and Lysozomal Enzymes Release in Rat Carrageenan Pleurisy", Agents and Actions 5: 250-255 (1975); Vinegar, R. et al., "Quantitative Studies of the Pathway to Acute Carrageenan Inflammation", Fed. Proc. 35: 2447-2456 (1976). Es können zahlreiche andere Tests verwendet werden. Wetnick, A. S., und Sabin. C., "The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelits in Rats", Jap. J. Pharm. 22: 741 (1972). Der Rattenpfotentest ist jedoch der einfachste und direkteste verfügbare Test und hat sich bei allen entzündungshemmenden Heilmitteln als zufriedenstellend erwiesen. Dieser Test wurde ausführlich in Beck, U.S. Patent 4,284,623, beschrieben, das hierin zum Zwecke der Bezugnahme in dem Ausmaß zitiert wird, in dem er den Rattenpfotentest beschreibt. Kurz, der Test beinhaltet die Injektion einer kleinen Menge Carrageen in den Fußballen von erwachsenen weißen Ratten. Es ist bekannt, daß dies eine Entzündungsreaktion auslöst. Der resultierende Grad der Schwellung kann quantifiziert werden. Proben, die einen entzündungshemmenden Faktor enthalten, werden der Ratte über einen geeigneten Weg verabreicht, vorzugsweise durch intraperitoneale Injektion, und die Blockierung oder Verbesserung des Entzündungsprozesses wird entweder durch volumetrische oder gravimetrische Verfahren quantifiziert.
In Zusammenfassung, der entzündungshemmende Faktor kann von hyperimmunisierter Milch durch ein Verfahren isoliert werden, welches das Entfetten der Milch, Entfernen von Kasein, Entfernen von Makromolekülen von mehr als 10.000 Dalton, und die anschließende Ionenaustausch- und Molekularsiebchromatographie umfaßt. Die biologische Aktivität geeigneter Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors kann mittels eines Dosis-Wirkungs-Versuchs bei Ratten wie hierin beschrieben getestet werden.
In einem zusätzlichen bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird der entzündungshemmende Faktor, der in hyperimmunisierter Milch vorhanden ist, unter Verwendung einer Schrittkombination gereinigt, umfassend: Filtration auf einer Membran, die Moleküle aufgrund ihrer Molekulargewichte trennen kann; Ionenaustauschchromatographie; Molekularsiebchromatographie; und Affinitätschromatographie (Beispiel 15). Der bevorzugte erste Schritt umfaßt das Filtern von hyperimmuner Magermilch, die nach der vorangehenden Beschreibung hergestellt wurde, durch eine Membran, die Moleküle mit Molekulargewichten von etwa 10.000 Dalton oder mehr zurückhält. Das Material, das durch die Membran geht (d. h., das Filtrat oder Permeat) wird gesammelt und in weiteren Reinigungsschritten verwendet. Vorrichtungen und Membrane zur Ausführung solcher Filtrationen sind in der Technik bekannt.
Der bevorzugte Schritt nach der Filtration ist die Ionenaustauschchromatographie auf einem Anionenaustauscher. Austauscher mit Diethylaminoethylgruppen haben sich als wirksam für eine gute Trennung erwiesen, aber es wird angenommen, daß andere Anionenaustauscher ebenso verwendet werden können. Es ist bevorzugt, daß der feste Träger des Ionenaustauschers hohe Flußgeschwindigkeiten aufrechterhalten kann. Für diesen Zweck hat sich Sepharose als geeignet erwiesen.
Der bevorzugte Schritt nach der Ionenaustauschchromatographie ist die Gelfiltrationschromatographie. Für diesen Schritt sollte eine Gelpackung gewählt werden, die Moleküle mit Molekulargewichten von weniger als 10.000 Dalton fraktionieren kann. Die bevorzugte Packung ist Toyopearl HW-40 (Rohm und Haas), aber es können auch andere Packungen, die in der Wissenschaft bekannt sind, verwendet werden. Beispiele für andere Packungen, die verwendet werden können und die im Handel erhältlich sind, sind Packungen auf der Basis von polymerem Kohlenhydrat, z. B. Sephadex G-10 oder G-25 (Pharmacia), oder Packungen auf Polyacrylamidbasis, z. B. Biogel P-2, P-4, P-6, P-10 oder P-30 (Bio- Rad).
Der bevorzugte Schritt nach der Gelfiltrationschromatographie ist die Affinitätschromatographie auf einem Boronataffinitätsträger. Diese Träger haben sich bei der Fraktionierung von Verbindungen mit geringem Molekulargewicht mit cis-Diolgruppen als wirksam erwiesen. Der bevorzugte Träger ist AffiGEl 601 (Bio-Rad). Dies ist ein Boronatderivat des Polyacrylamid-Gelfiltrationsträgers Bio-Gel P-6 (ebenso von Bio-Rad vertrieben).
Die bevorzugte Lagerungsform für Zubereitungen nach den Ionenaustausch-, Gelfiltrations- oder Affinitätschromatographieschritten ist ein lyophilisiertes Pulver. Das Filtrat, das im ersten Reinigungsschritt gesammelt wird, kann bis zur Verwendung gekühlt gelagert werden. Die Aktivität des entzündungshemmenden Faktors, der durch die Reinigung erhalten wird, kann unter Verwendung des zuvor beschriebenen Rattenpfotentests bestimmt werden.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird der entzündungshemmende Faktor, der in der hyperimmunisierten Milch vorhanden ist, analytisch oder präparativ unter Verwendung einer Schrittkombination gereinigt, umfassend: Ultrafiltration mit einer Membran mit einer Molekülgewicht-Abtrennung von 10.000 Dalton, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlußchromatographie auf einer präparativen HPLC-Säule und organische Verteilungsextraktion.
In einem bevorzugten ersten Schritt wird ein großes Volumen (z. B. 90 bis 225 Liter) Magermilch durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Abtrennung von 10.000 Dalton geleitet. Das erhaltene Permeat (< 10K Permeat) wird für weitere Reinigungsschritte gesammelt.
Der bevorzugte Schritt nach der obengenannten Ultrafiltration ist das Aufbringen eines großen Volumens (z. B. 60 bis 150 Liter) des Permeats vom vorangehenden Schritt auf eine Ionenaustauschsäule. Das Eluat kann dann lyophilisiert werden. Für eine gute Trennung hat sich Diethyl-aminoethyl (DAEA)-Sepharose Fast Flow Austauschharz als wirksam erwiesen.
Der bevorzugte Schritt nach der obengenannten Ionenaustauschchromatographie ist das Aufbringen einer großen Menge (z. B. 100 mg) der gereinigten Zubereitung von der Ionenaustauschsäule auf eine präparative HPLC Säule, z. B. eine TSK G2500PW Größenausschlußsäule. Es können noch größere Mengen erhalten werden, indem mehrere Proben von jeweils 100 mg auf der HPLC Säule getrennt und in demselben Satz von Röhrchen gesammelt werden. Die Röhrchen können dann vereint und ihr Inhalt lyophilisiert werden.
Der nächste bevorzugte Schritt ist die organische Verteilungsextraktion, bei welcher z. B. 50-100 mg der lyophilisierten HPLC-Säule-Proben genommen und mit n-Hexan und NH&sub4;OH zur Entfernung neutraler Lipide extrahiert werden, worauf eine Ansäuerung und dann eine Reextraktion mit Ethylacetat folgt. Das Ethylacetatextrakt kann auf eine schwache Anionenaustauschsäule aufgebracht und mit einem dreiteiligen Elutionssystem entwickelt werden. Die Analyse einer Zubereitung auf einer Aminopropyl- schwachen Anionenaustauschsäule vor und nach der organischen Verteilungsextraktion ist in Fig. 44 dargestellt.
Die Ergebnisse von Experimenten, die in Beispiel 16 beschrieben sind, zeigen, daß die Vorbehandlung von Tieren mit Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors die durch den plättchenaktivierenden Faktor (PAF) stimulierte Anheftung von neutrophilen Teilchen an die Endothelzellen verringert, welche die Venolen auskleiden, und die Rate, bei welcher neutrophile Teilchen von Venolen emigrieren, herabsetzt. Zusätzlich hat sich herausgestellt, daß die Verabreichung von Zubereitungen des Faktors nach der Behandlung von Tieren mit PAF die Anzahl von neutrophilen Teilchen verringert, die an Endothelzellen haften. In dem Ausmaß, in dem Patienten oder Tiere Nutzen aus diesen Wirkungen ziehen können, umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors. Dies gilt unabhängig von der bestimmten vorliegenden Erkrankung. Ebenso zeigen die Daten in Beispiel 16, daß der entzündungshemmende Faktor seine Wirkungen auf das Anheften und Emigrieren durch direkte Wechselwirkung mit Zelloberflächen-CD18-Antigenen und Unterbindung einer Wechselwirkung von anderen Molekülen mit diesem Glycoproteinkomplex hervorruft. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung von Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors für diesen Zweck.
Wie in Beispiel 18 dargestellt ist, unterdrückt die Verabreichung einer Zubereitung des entzündungshemmenden Faktors an Tiere die Reaktion des Wirts gegenüber dem Transplantat, aber nicht die jene des Transplantats gegenüber dem Wirt, und verursacht eine Zunahme des Milzgewichts und der Anzahl von Milzlymphozyten. Es zeigte sich, daß die Lymphozytenreaktion auf Concanavalin A durch diese Zubereitung aufgehoben wurde. Diese Daten zeigen, daß der entzündungshemmende Faktor in der Hemmung von gewebezerstörenden infektiösen Prozessen nützlich ist, sowie in Situationen, in welchen die Unterdrückung der Lymphozytenfunktion wünschenswert ist.
Wie in Fig. 43 dargestellt, führt die Entsalzung des MAIF (erhalten durch organische Verteilungsextraktion) zu dramatischen Anstiegen in der Reinigung, was sich darin zeigt, daß eine 10.000-fach geringere MAIF-Dosis notwendig ist, um gleiche Werte der Migrationshemmung von pleuralen Leukozyten der Ratte zu erhalten.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können durch jedes Mittel verabreicht werden, das für eine entzündungshemmende Aktivität sorgt. Zum Beispiel kann die Verabreichung parenteral, subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder oral sein.
Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granula. In solchen festen Dosierungsformen wird die aktive Komponente mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel, wie Sucrose, Lactose oder Stärke, vermischt. Solche Dosierungsformen können auch, wie in der normalen Praxis, zusätzliche Substanzen neben dem inerten Verdünnungsmittel umfassen. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Puffermittel umfassen. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit einem enterischen Überzug hergestellt sein.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch annehmbare Emulsion, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die für gewöhnlich in der Pharmazie verwendet werden. Neben inerten Verdünnungsmitteln können solche Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe, wie Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspensionsmittel und Süßstoffe enthalten.
Zubereitungen gemäß dieser Erfindung zur parenteralen Verabreichung enthalten sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösemittel oder Träger sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat.
Die Dosierung aktiver Inhaltsstoffe in der Zusammensetzung dieser Erfindung kann unterschiedlich sein; es ist jedoch notwendig, daß die Menge des aktiven Inhaltsstoffes so ist, daß eine geeignete Dosierungsform erhalten wird. Die ausgewählte Dosierungsform hängt von der gewünschten therapeutischen Wirkung, dem Verabreichungsweg und der Dauer der Behandlung ab.
Die Verabreichungsdosierung und -frequenz hängen vom Alter und allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten ab, wobei die Möglichkeit von Nebenwirkungen zu berücksichtigen ist. Die Verabreichung hängt auch von der gleichzeitigen Behandlung mit anderen Heilmitteln und der Verträglichkeit des verabreichten Heilmittels bei den Patienten ab.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird diese mit Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele näher beschrieben, die hierin nur zum Zwecke der Erklärung angeführt und in keine Weise als Einschränkung gedacht sind, wenn nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1A

Herstellung des S-100 Impfstoffes

Eine Bakterienkultur, die das in Tabelle 1 dargestellte Bakterienspektrum enthielt, die von der American Type Culture Collection erhalten wurde, wurde mit 15 ml Medium rekonstituiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Sobald ein gutes Wachstum erzielt war, wurde etwa die Hälfte der Bakteriensuspension zum Beimpfen von 1 Liter Nährlösung verwendet, wobei das Inokulat bei 37ºC inkubiert wurde. Die übrige Suspension wurde in sterile Glycolröhrchen überführt und bei -20ºC bis zu sechs Monate gelagert.
Sobald ein gutes Wachstum in der Kultur erkennbar war, wurden die bakteriellen Zellen durch Zentrifugation der Suspension über 20 Minuten zur Entfernung des Mediums geerntet. Das erhaltene Bakterienpellet wurde in steriler Kochsalzlösung resuspendiert und die bakterielle Probe wurde dreimal zentrifugiert, um das Medium von den Zellen zu waschen. Nach dem dritten Waschschritt mit steriler Kochsalzlösung wurde das bei der Zentrifugation erhaltene Bakterienpellet in einer kleinen Menge doppelt destillierten Wassers resuspendiert.
Die medienfreie bakterielle Suspension wurde durch Wärme abgetötet, indem die Suspension über Nacht in einem Glaskolben in ein 80ºC Wasserbad gestellt wurde. Die Lebensfähigkeit der Nährlösungskultur wurde mit einer kleinen Menge wärmeabgetöteter Bakterien getestet. Die Nährlösung wurde mit wärmeabgetöteten Bakterien beimpft, bei 37ºC fünf Tage inkubiert und täglich auf Wachstum überprüft, da die Bakterien zur Verwendung in dem Impfstoff getötet werden müssen.
Die wärmegetöteten Bakterien wurden bis zur Trockenheit lyophilisiert. Die trockenen Bakterien wurden dann mit steriler Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 2,2 · 10&sup8; bakterielle Zellen/ml Kochsalzlösung (1,0 optische Dichteablesung bei 660 nm) gemischt.
Kühe erhielten tägliche Injektionen von 5 ml Proben des polyvalenten flüssigen Impfstoffes. Antikörper- (IgG) Titerwerte für die geimpften Rinder wurden periodisch unter Verwendung eines Enzyme-linked-immunsorbent-Assay für Rinderantikörper gegen das polyvalent Antigen bestimmt.

BEISPIEL 1B

Immunisierungsverfahren

Wärmegetötete Bakterien wurden in der zuvor beschriebenen Weise hergestellt. Die erhaltene polyvalente Antigenprobe (S-100) wurde durch ein herkömmliches Phasentrennverfahren mikroeingekapselt, um ein Mikropartikelprodukt herzustellen, das ein polyvalentes Antigen enthält. Im allgemeinen werden die antigenhältigen, geformten Matrixmaterialien aus Polymeren von biokompatiblem Material gebildet, vorzugsweise biologisch abbaubaren oder biologisch erodierbaren Materialien, vorzugsweise Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymere von Milch- und Glycolsäuren, Polycaptolacton, Copolyoxalate, Proteine, wie Collagen, Fettsäureester von Glycerol, und Celluloseester. Diese Polymere sind in der Wissenschaft allgemein bekannt und zum Beispiel in U.S. 3,773,919; U.S. 3,887,699; U.S. 4,118,470; U.S. 4,076,798 beschrieben, die alle hierin zum Zwecke der Bezugnahme zitiert werden. Das verwendete polymere Matrixmaterial war ein biologisch abbaubares Lactid- Glycolid-Colpolymer.
Wärmegetötete bakterielle Antigene sind in solchen Matrixmaterialien vorzugsweise als Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 1-500 Mikron, vorzugsweise 10-250 Mikron, eingekapselt. Die Einkapselungsverfahren sind herkömmlich und umfassen Phasentrennungsmethoden, Grenzflächenreaktionen und physikalische Methoden. Viele Kombinationen von Matrizen und viele Konzentrationen von ausgesuchten Antigenen können verwendet werden, um optimale Freisetzungsraten von bakteriellen Antigenen aus den Mirkopartikeln in den Wirtskörper zu erhalten. Diese Kombinationen können von den Fachleuten auf diesem Gebiet ohne unnötige Experimente festgelegt werden.
Die Mikropartikel in dem Beispiel hatten einen Durchmesser von weniger als 250 Mikron. Etwa 750 mg Mikropartikel, die 22% (16,5 mg) polyvalentes Antigen enthielten, wurden dann in etwa 3 cc eines Trägers (1 Gew.-% Tween 20 und 2 Gew.-% Carboxymethylcellulose in Wasser) suspendiert.
Eine kleine Rindergruppe wurde aus einer größeren Rinderherde ausgewählt. Fünf dieser zufällig ausgewählten Rinder wurden als Kontrollen ausgewählt. Vier Rindern wurden Mikropartikel, die polyvalentes Antigen enthielten, intramuskulär geimpft. Miropartikelproben wurden mit 2,0 mRad Gammastrahlung sterilisiert. Antikörper- (IgG) Titerwerte wurden periodisch aus den Proben der Kuhmilch bestimmt, die von den geimpften Kühen wie auch von den Kontrollkühlen erhalten wurde.

BEISPIEL 2

Isolierung des MAIF-Faktors aus hyperimmunisierter Milch

Schritt 1: Herstellung des Milchfiltrates

Zwanzig Liter Frischmilch von hyperimmunisierten Kühen wurden durch eine Entrahmungszentrifuge (DeLaval, Modell 102) zur Entfernung des Fettes geleitet. Die erhaltenen sechzehn Liter Magermilch wurden zur Entfernung der Spezies mit hohem Molekulargewicht (mehr als 10.000 Dalton) unter Verwendung eines Hohlfaserdiafiltration/Konzentrators (Amicon DL-10L) ultrafiltriert. Der Konzentrator ist mit zwei 10.000 Dalton Molekulargewicht-Abscheidungspatronen ausgestattet (Amicon, H&sub5;P&sub1;&sub0;&submin;&sub4;&sub3;). Die Magermilch wurde bei einer Pumpengeschwindigkeit von 80 auf der Meßvorrichtung und einem Einlaß- und Auslaßdruck von 0,21 MPa (30 psi) bzw. 0,17 MPa (25) hindurchgeleitet.
Zwölf Liter des Filtrates (< 10.000 Dalton), das aus den Patronen bei einer Strömungsrate von vier Litern pro Stunde lief, wurden für die Lagerung und für die weitere Reinigung gefroren oder lyophilisiert.

Schritt 2: Ionenaustauschchromatographie

Der entzündungshemmende Milchfaktor in dem Filtrat wurde zunächst durch eine Anionenaustauschchromatographiesäule isoliert.
In diesem Verfahren wurde DEAE-Sepharose CL-6B-Gel (Pharmacia) für das Packen einer 5 · 10 cm Glassäule verwendet, die mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser, pH 7,0, äquilibriert war.
Ein Liter Filtrat (< 10.000) wurde auf die Säule aufgebracht und mit sterilem, doppelt destillierten Wasser, pH 7,0, bei einer Strömungsrate von 160 ml pro Stunde eluiert. Zehn Milliliter Fraktionen wurden gesammelt und bei 280 nm in einem LKB Uvicord 4700 Absorptiometer aufgezeichnet, wobei eine optische Dichte auf einem angeschlossenen Schreiber (Pharmacia REC-482) ausgedruckt wurde.
Substanzen außer dem entzündungshemmenden Faktor, die positive und neutrale Ladungen haben, werden nicht an das DEAE-Sepharose-Gel gebunden. Sie werden mit dem Durchfall-Peak (ersten Peak) eluiert. Der entzündungshemmende Faktor, der eine negative Ladung trägt, wird von dem Gel zurückgehalten.
Zum Eluieren des Faktors wurde die Säule mit einem stufenweisen Gradienten unter Verwendung einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung, pH 7,0, eluiert. Ein typisches Profil ist in Fig. 1 dargestellt. Ein Bioassay der einzelnen Fraktionen zeigte, daß der zweite Peak den Faktor enthält. Fraktionen, die in dem zweiten Peak und seiner Schulter enthalten sind, werden zur weiteren Reinigung verwendet. Gewinnungsstudien zeigten, daß 8, 8 Gramm getrocknetes Pulver durch dieses Verfahren erhalten wurden.

Schritt 3: Gelfiltrationschromatographie

Der zweite Peak, der in Schritt 2 erhalten wurde, enthält den entzündungshemmenden Faktor und andere negativ geladene Moleküle; daher war ein zusätzlicher Reinigungsschritt erforderlich. Für eine weitere Reinigung ist die Verwendung einer Gelfiltrationssäule zur Trennung verschiedener Komponenten auf der Basis des Molekulargewichts angebracht.
In diesem Verfahren wurde Sephadex G-10 Harz (Pharmacia) in eine 2,5 · 80 cm Glassäule gepackt und mit sterilem, doppelt destillierten Wasser, pH 7,0, äquilibriert. Zwei Gramm der zweiten Fraktion von Schritt 2 wurden wieder in sterilem, doppelt destillierten Wasser gelöst und auf die Oberseite der Säule aufgebracht. Die Säule wurde bei einer Flußgeschwindigkeit von 30 ml pro Stunde eluiert. Fraktionen (3,3 ml) wurden gesammelt und bei 254 nm und 280 nm (Pharmacia Duo Optical Unit) aufgezeichnet, wobei die optische Dichte auf einem angeschlossenen Schreiber ausgedruckt wurde (Pharmacia REC-482).
Für gewöhnlich zeigten sich im Elutionsprofil 3 Peaks, wie in Fig. 2 dargestellt ist. Der erste und zweite Peak enthielten entzündungshemmende Aktivität.
Der erste Peak ist ein Aggregat, das sich auf der G-10 Säule bildet, die den aktiven Faktor enthält.
Der zweite Peak enthält die nicht-aggregierte Form des Faktors. Sowohl die Aggregatform (Peak 1) als auch die nicht-aggregierte Form (Peak 2) sind im Ratten-Bioassay biologisch aktiv.

BEISPIEL 3

Charakterisierung des entzündungshemmenden Milchfaktors

Das Molekulargewicht der nicht-aggregierten Form des Faktors, der durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt worden war, wurde mit weniger als 10.000 Dalton ermittelt. Dies wurde aus der Tatsache abgeleitet, daß der erste Schritt in der Isolierung des Faktors aus Molke eine Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran war, die den Durchgang von Spezies mit einem Molekulargewicht von > 10.000 Dalton nicht zuläßt.
Der Faktor hat eine negative Ladung. Dies wurde durch Aufbringen des Milchultrafiltrates auf eine DEAE-Cellulose-Ionenaustauschsäule bestimmt. Die entzündungshemmende Aktivität eluierte nicht aus der Säule mit Wasser. Eine Änderung des Elutionsmediums in Natriumchlorid (0,9% pH) verursachte die Elution mehrerer Peaks (Fig. 1). Neutral und positiv geladene Spezies hafteten nicht an dem Ionenaustauschharz, und negativ geladene Spezies werden durch Erhöhung der Salzkonzentration eluiert. Als das Permeat mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton auf die DEAE-Säule aufgebracht wurde, eluierten neutrale Salze und Zucker mit Wasser (Peak 1, Fig. 1). Drei verschiedene Peaks eluierten, als der Puffer in Kochsalzlösung geändert wurde (Peaks 2-4). Der zweite Peak und seine Schulter enthielten entzündungshemmende biologische Aktivität im Rattentest. Es wird daher geschlossen, daß der Faktor eine negative Ladung hat.
Eine weitere chemische Eigenschaft des Faktors ist, daß er ein Aggregat während des Verfahrens der Salzentfernung bildet. Diese Eigenschaft wurde offensichtlich, als ein Permeat mit einem Molekulargewicht von < 10.000 Dalton über eine Sephadex G-10 Säule geleitet wurde, die mit doppelt destilliertem Wasser äquilibriert war, und mit Wasser bei einem pH von 7 eluiert wurde (Fig. 2). Drei Peaks eluierten von der G-10 Säule; der erste Peak eluierte mit dem Mobilvolumen, was auf ein Molekulargewicht gleich oder größer 10.000 Dalton schließen läßt. Dies war unerwartet, da Moleküle mit mehr als 10.000 Dalton zuvor aus dieser Probe durch Ultrafiltration entfernt worden waren. Der zweite Peak eluierte in der für den entzündungshemmenden Faktor erwarteten Position. Sowohl der erste als auch zweite Peak wiesen eine entzündungshemmende biologische Aktivität im Rattenpfotentest auf, während dem dritten Peak Aktivität fehlte. Es war überraschend, sowohl beim ersten als auch zweiten Peak entzündungshemmende biologische Aktivität festzustellen. Das Material, das aus dem ersten Peak der G-10 Säule (Schritt 3) gewonnen wurde, wurde lyophilisiert und auf eine G-100 Säule aufgebracht; ein einziger Peak wurde mit dem Mobilvolumen eluiert, was auf ein Molekulargewicht von 100.000 Dalton oder mehr schließen läßt. Die G-10 Säule von Schritt 3 entfernt Salz, während sie gleichzeitig die Spezies verschiedenen Molekulargewichts trennt. Es wird daher geschlossen, daß während des Durchlaufs über die G-10 Säule und der daraus entstehenden Salzentfernung der entzündungshemmende Faktor ein Aggregat mit hohem Molekulargewicht bildete. Das Ausmaß der Aggregation änderte sich mit der Salzkonzentration.
Die Aggregationseigenschaft läßt auf die Möglichkeit schließen, daß ein breites Spektrum von Spezies verschiedenen Molekulargewichts gebildet werden kann, die entzündungshemmende biologische Aktivität aufgrund der Gegenwart des entzündungshemmenden Faktors haben. Die Entdeckung dieser Eigenschaft läßt auf die Möglichkeit der Erzeugung entzündungshemmender Milchfaktoren mit einem breiten Spektrum verschiedener biochemischer Eigenschaften schließen, abhängig von dem Maß der Aggregation des Endproduktes. Zum Beispiel könnten Formulierungen mit längerer oder kürzerer biologischer Halbwertzeit unter Verwendung von Aggregaten mit größerem oder kleinerem Molekulargewicht erzeugt werden, wobei die Molekulargewichtsverteilung durch die Salzkonzentration während der Verarbeitung kontrolliert wird. Die hierin beschriebene Säulenchromatographiemethode führte zu der Spezies mit dem geringsten erhaltenen Molekulargewicht, die biologische Aktivität aufweist (d. h., Peak 2 von der G-10 Säule in Schritt 3). Diese Beobachtung legt auch die Verwendung anderer Methoden zur Bildung der Aggregate nahe. Zum Beispiel bewirkt eine Verdünnung in Wasser, daß eine Aggregation eintritt. Chemische Mittel, die Salze binden, insbesondere Kalzium, können die Bildung des Aggregates hervorrufen. Aufgrund dieser Entdeckung sind andere Verfahren zur Bildung des Aggregates und Trennung des Faktors für die Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich.

BEISPIEL 4

Test auf biologische Aktivität

Die entzündungshemmende Wirkung des gereinigten entzündungshemmenden Faktors wurde an Ödemen getestet, die durch die Injektion einer Carrageen-Lösung in die Fußballen von Ratten hervorgerufen wurde. Eine lyophilisierte Probe der entzündungshemmenden Milchfaktorzubereitung wurde in dem geeigneten Träger aufgelöst und intraperitoneal an Versuchsratten verabreicht. Das Carrageen wurde dann den Ratten in einer Menge von 0,1 ml einer 0,1% Kochsalzlösung in jeden hinteren Fußballen verabreicht. Die Fußballen wurden vor der Verabreichung der Injektionen und 2,5 Stunden nach den Injektionen unter Verwendung eines Dickenmeßgerätes gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und 3 dargestellt. In diesen Tabellen bezeichnet die Abkürzung MAIF die Zubereitung des entzündungshemmenden Milchfaktors, die unter Verwendung der zuvor in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Verfahren erhalten wurde.
Die nicht-aggregierte Form des Faktors (Peak 2 von der G-10 Säule) von Kontroll- und hyperimmuner Milch bewirkte eine Verringerung in der Entzündung der Rattenpfote bei Dosen zwischen 1 mg und 0,25 mg (Tabelle 2). Sowohl die hyperimmune Milch als auch die normale Milch wiesen eine Aktivität auf; das hyperimmune Material war jedoch wirksamer. Daraus wurde geschlossen, daß der entzündungshemmende Faktor in der Milch von hyperimmunen Kühen in höherer Konzentration vorhanden ist.
Der zweite Peak von der DEAE-Säule zeigte eine Aktivität, sowohl wenn er von hyperimmuner Milch als auch wenn er von normaler Milch isoliert wurde. Die Aktivität ist in der hyperimmunen Milch deutlich höher (Tabelle 3).
Der erste Peak von der G-10 Säule, der die aggregierte Form des Faktors ist, zeigte Aktivität in Rattenpfotentests (Tabelle 2). Die aggregierte Form ist jedoch nicht so wirksam, wie die nicht-aggregierte Form, basierend auf demselben Gewicht.
Aus diesen Studien wird geschlossen, daß der entzündungshemmende Faktor von Natur aus in der Kuhmilch vorhanden ist. Die Hyperimmunisierung der Kühe verursacht eine höhere Konzentration des Faktors in der Milch. Der Faktor ist ein kleines, negativ geladenes Molekül, das von der Milch durch eine Vielzahl von Verfahren abgetrennt werden kann. Der Faktor kann Aggregate mit hohem Molekulargewicht bilden, die in Milch nicht von Natur aus vorkommen, sondern sich während der Verarbeitung bilden.

BEISPIEL 5

Chemische Analyse des entzündungshemmenden Faktors

Proben des entzündungshemmenden Faktors wurden chemisch analysiert. Der Faktor weist keine kristalline Struktur auf, wie durch Röntgenbeugungsstudien bestimmt wurde. Die MAIF-Präparate ergaben eine Elementaranalyse, die mit der Kohlenhydratzusammensetzung übereinstimmte. Die C, H, O-Verhältnisse stimmten mit einem polymeren oder oligomeren Material überein, wobei einige Carbinolgruppen zu Carboxyl oxidiert sind. Der leichte Überschuß an Kalziumäquivalenten gegenüber Chloridionen könnte teilweise als Carboxylatsalze gerechnet werden. Der Rest könnten Natrium- oder Kaliumsalze sein. Das Schmelzverhalten, oder vielmehr das Nicht-Schmelzverhalten, ließ auf salzähnliche Zusammensetzungen und/oder Zusammensetzungen mit höherem Molekulargewicht schließen. Das Material im gegenwärtigen Reinheitszustand enthält offensichtlich eine variable Menge an Kalzium- und Chloridsalzen, wahrscheinlich CaCl&sub2;.
Keine Zubereitung enthielt eine wesentliche Stickstoffmenge, wodurch jede Peptidkomponente in deren Zusammensetzung ausgeschlossen werden kann. Ebenso kann durch das Fehlen von wesentlichem Stickstoff die Gegenwart von Aminozuckern und anderen stickstoffhältigen Materialien, wie verschiedenen komplexen Lipiden, als Hauptkomponente(n) ausgeschlossen werden.
Pyrolytische Massenspektren zeigten signifikante Spuren der 18-Kohlenstoff Fettsäuren. Diese Tatsache, gemeinsam mit Spuren von N und P, lassen auf die Gegenwart eines komplexen Lipids in der Zubereitung schließen.
Infrarotspektroskopie zeigte Absorptionen, die mit Carbinol- und Carboxylatfunktionalitäten übereinstimmten. Ultraviolett-, sichtbare und fluoreszierende Spektroskopie zeigten keine wesentliche Menge an Chromophoren über jene hinaus, die durch Infrarot angezeigt wurden.
Die chemischen Tests stimmten mit einem oligomeren Kohlenhydrat überein, wobei die Carbonylfunktion (Aldehyd oder Keton) fest in den Verbindungen der Untereinheit gebunden ist. Das oligomere Kohlenhydrat enthält auch eine gewisse Nebenkettenoxidation an Carboxylat.
Die MAIF-Zubereitung ist im wesentlichen, aber nicht vollständig rein.

BEISPIEL 6

Rattenpfoten-Ödemtest: Orale Verabreichung

Der Carrageen-Rattenfußballentest wurde zur Testung der Wirksamkeit des entzündungshemmenden Faktors als in vivo entzündungshemmendes Mittel verwendet. Dreißig erwachsene weiße Ratten wurden regellos in drei Gruppen mit zehn Ratten pro Gruppe aufgeteilt. Die Gruppen erhielten in fünf aufeinanderfolgenden täglichen Behandlungen entweder 10 mg Magermilchpulver von hyperimmunisierten Tieren, 10 mg Magermilchpulver von nicht hyperimmunisierten Tieren oder keine Behandlung (nur 20 ml Wasser pro Tag). Die Pulver wurden oral in 20 ml Wasser verabreicht. Am fünften Tag wurden 0,1 ml 1% Carrageen in Kochsalzlösung in die rechte Pfote jeder Ratte injiziert. Es ist bekannt, daß dieses Verfahren eine akute Entzündung (Ödem) auslöst. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Ratten getötet, die Pfoten amputiert und das Gewicht der linken (Kontrolle) und rechten (ödematösen) Pfote verglichen. Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle 4 (angegeben als Gewicht in Gramm) und in Fig. 3 (angegeben als Prozentsatz des Durchschnittsgewichts der Kontrollpfoten) dargestellt.
Die Entzündungsreaktion auf die Carrageen-Injektion war bei den mit immuner Milch behandelten Ratten im Vergleich zu den Kontrollgruppen mit nichtimmuner Milch und Wasser deutlich verringert. Es gab keinen Hinweis auf Nebenwirkungen oder unerwünschte schädigende Wirkungen im allgemeinen Gesundheitszustand der Ratten. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, daß die tägliche Aufnahme von Magermilchpulver von hyperimmunisierten Tieren die Entzündungsreaktion, die durch die Carrageen-Injektion im Fußballen von Ratten hervorgerufen wurde, nahezu vollständig blockierte.

BEISPIEL 7

Quantitative Rattenpfoten-Ödemtests

Es wurde eine Reihe von Versuchen an der hyperimmunen Milchfraktion durchgeführt. Die Versuche sollten die entzündungshemmende Aktivität des entzündungshemmenden Milchfaktors bei intraperitonealer Verabreichung bestätigen und eine Dosis-Wirkungs- Kurve erstellen, alternative Verabreichungswege erforschen und Dosierungsschemata untersuchen, welche die Basis weiterer Untersuchungen bilden könnten.
Peak I von der G-10 Säule, bereitgestellt von Stolle Milk Biologics International, wurde nach den in Patent Nr. 4,956,349 beschriebenen Verfahren hergestellt. Lactose, die von handelsüblichen Quellen erhalten wurde, wurde als Placebo verwendet. Aspirin wurde als positive Kontrolle verwendet. Aspirin wurde in Wasser aufgelöst und oral mittels Magensonde in einem Verhältnis von 200 mg pro Kilogramm verabreicht, eine Dosis, von der bekannt ist, daß sie in dem Test aktiv ist. Es wurde festgestellt, daß eine 2% Lösung von Kappa-Carrageen (Sigma C-1263) die am besten reproduzierbaren Ergebnisse liefert, und diese wurde daher in diesen Experimenten verwendet. Der Fußballentest wurde durch die Verwendung eines isotopisch markierten Humanserumalbumins (¹²&sup5;I-HSA) modifiziert, welches sich in der durch Carrageen herbeigeführten Läsion in direktem Verhältnis zu dem Volumen des Exsudates lokalisiert. Durch die Bestimmung der radioaktiven Gesamtzahl im Fußballen und durch einen Vergleich dieses Wertes mit Zahlen in einem bekannten Plasmavolumen von dem injizierten Tier wird eine direkte Messung des Ödems in Mikroliter Plasmaäquivalenten erhalten. ¹²&sup5;I-HSA wurde intravenös mit einer Dosis von 1,0 Mikrocurie pro Ratte injiziert. Es wurden weibliche Dark Agouti-Ratten verwendet. Die Ratten waren etwa 12 Wochen alt, wogen 160 Gramm bis 200 Gramm und wurden von der hauseigenen Inzuchtkolonie erhalten.
Zur Durchführung des Carrageen-Fußballentests wurden 0,1 ml 2% Carrageen subkutan in jeden hinteren Fußballen einer narkotisierten Ratte injiziert. Dieser Injektion folgte sofort eine Injektion von 1,0 Mikrocurie ¹²&sup5;I-HSA in 0,5 ml Kochsalzlösung in die Schwanzvene. Nach vier Stunden wurde jede Ratte gewogen, Blutproben genommen und die Ratte euthanasiert. Beide Hinterfüße wurden dann entfernt und die Werte der Radioaktivität in jedem Fuß und im 200 ul Plasmastandard in einem automatisierten Gammazähler gemessen. Aus diesen Messungen wurde das Volumen von Ödemen in jedem Fuß berechnet und in Mikroliter angegeben.

VERSUCH 1: Intraperitoneale Dosis-Wirkung

Fig. 4 zeigt die Wirkung der intraperitonealen Verabreichung einer gereinigten MAIF-Zubereitung im Vergleich zu Lactose (KON), Aspirin und keiner Behandlung (KEINE Rx). Alle Behandlungen (Lactose, Aspirin, MAIF) wurden 30 Minuten vor der Carrageen-Injektion verabreicht.
Die Carrageen-Injektion führte zu Ödemen von im Durchschnitt 250 ul (KEINE Rx). Das Ödem wurde durch Aspirin und alle Dosierungen der MAIF-Zubereitung, jedoch nicht durch Lactose gehemmt. Die intraperitoneale Dosis-Wirkungs-Kurve, die mit der MAIF-Zubereitung erhalten wurde, abgeleitet durch die Angabe der Daten als Prozentsatz des Durchschnittskontroll- (keine Behandlung) Ödems, ist in Fig. 5 dargestellt.

VERSUCH 2: Wirkungen verschiedener Verabreichungswege von MAIF

Fig. 6 zeigt die Wirkung der oralen (ORAL), intramuskulären (IM), subkutanen (SUB Q) und intravenösen (IV) Verabreichung von Lactose und einer Zubereitung aus gereinigtem MAIF auf ein Fußballenödem. Ebenso dargestellt sind eine positive Kontrolle (Aspirin) und eine nicht-behandelte Kontrolle (KEINE Rx).
Die Zubereitungen wurden vor der Carrageen-Belastung nach dem folgenden Schema verabreicht: Aspirin, oral, 30 Minuten zuvor; MAIF, subkutan: 1 Stunde zuvor; MAIF, oral: 24, 16 und 1 Stunde zuvor; MAIF, intramuskulär: 30 Minuten zuvor; MAIF, intravenös: zum Zeitpunkt der Belastung (Isotop wurde ebenso injiziert).
Die Ergebnisse zeigen, daß, ausgedrückt in Prozent des Durchschnittskontrollödems in jedem eigenen Test, der entzündungshemmende Faktor die Ödembildung über alle Verabreichungswege hemmte. Vierzig Milligramm der MAIF-Zubereitung, die intravenös verabreicht wurde, beseitigte die Entzündungsreaktion auf Carrageen nahezu vollständig. Diese Ergebnisse zeigen die entzündungshemmende Aktivität von MAIF und lassen angesichts der zuvor angeführten Ergebnisse von Versuch 1 darauf schließen, daß die Reihenfolge der Wirksamkeit für verschiedene Verabreichungswege IV > IP > IM > SUB Q > ORAL ist.

VERSUCH 3: Wirkung der intravenösen und erweiterten oralen Verabreichung auf Ödeme: Dosis-Wirkung

Fig. 7 zeigt die Wirkungen der IV und oralen Verabreichung einer gereinigten Zubereitung des entzündungshemmenden Faktors auf Fußballenödeme in Ratten. Die orale MAIF-Behandlung (40 mg pro Ratte pro Tag) wurde täglich sechs Tage verabreicht und auch eine Stunde vor der Carrageen-Belastung (PO). Die intravenöse Behandlung (5, 10, 20 mg) wurde zum Zeitpunkt der Carrageen-Belastung (IV) gegeben. Ebenso dargestellt ist eine positive Kontrolle (Aspirin) und eine negative Kontrolle (keine Behandlung).
Die in Fig. 7 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß alle drei Dosierungen der MAIF- Zubereitung zu einer entzündungshemmenden Aktivität führten, welche sogar die Aktivität von Aspirin in dem Test überstieg, während die erweiterte orale Verabreichung zu einer deutlichen aber begrenzten Aktivität führte.
Die Studie wurde daher erweitert, um die Wirkungen von weiter verringerten intravenösen Dosierungen des entzündungshemmenden Faktors zu untersuchen. Intravenöse Dosierungen von Lactose-Placebo wurden als Kontrolle eingeschlossen. Die Ergebnisse dieser Studien sind in Fig. 8 dargestellt. Intravenöse Dosierungen von 2,5 und 1 mg der MAIF-Zubereitung (IV) lösten eine entzündungshemmende Aktivität im Bereich der Aktivität aus, die durch Aspirin hervorgerufen wird. 10 ml des intravenösen Lactose-Placebos (10 mg PLAC IV) lösten keine Aktivität in diesem Bereich aus.
Eine intravenöse Dosis-Wirkungs-Kurve wurde durch Kombinieren der Ergebnisse von Versuch 2 und 3 und Darstellen dieser Ergebnisse als Prozent Durchschnittskontrollödem (keine Behandlung) in jedem eigenen Test abgeleitet. Die Kurve ist in Fig. 9 dargestellt.
Folgende Schlüsse können aus den quantitativen Rattenpfoten-Ödemtests gezogen werden: Der Milchfraktions-Peak I von der G-10 Säule, der wie in Patent Nr. 4,956,349 beschrieben extrahiert und gereinigt wurde, zeigt eine beständige entzündungshemmende Aktivität bei einer Testung im Rattenpfoten-Ödemmodell. Eine Dosierung von 4 mg MAIF- Zubereitung pro Ratte, die zum Zeitpunkt der Carrageen-Injektion intravenös verabreicht wurde, ist für eine drastische Hemmung von Ödemen ausreichend und wurde daher als Standard gewählt, mit dem andere Zubereitungen in weiteren Versuchen verglichen werden sollten.

BEISPIEL 8

Entzündungshemmende Eigenschaften von Zubereitungen aus hyperimmuner Milch, die von identischen Zwillingskühen erhalten wurden

Die Wirkung einer Impfung auf die entzündungshemmende Aktivität von Milch wurde durch Testung der biologischen Aktivität verschiedener Milchfraktionen untersucht, die von identischen Zwillingskühen erhalten wurden. Basierend auf den Extraktionsmethoden, die in Patent Nr. 4,956,349 beschrieben sind, wurde ein Extraktionsschema unter Verwendung einer Ultrafiltration erstellt. Die Verarbeitungssequenz ist wie folgt:
Milchproben wurden von immunisierten Zwillingskühen, nicht immunisierten Kontroll-Zwillingskühen und rekonstituiertem Magermilchpulver gewonnen, das zuvor von immunisierten Kühen erhalten wurde. Die Probengruppe bestand aus 45 Paaren identischer Zwillingskühe. Eine Kuh jedes Zwillingspaares wurde zweiwöchentlich mit Stolle S100 gemischtem Bacterin geimpft (in Patent Nr. 4,956,349 beschrieben). Die biologische Aktivität der verschiedenen Fraktionen wurde durch intravenöse Injektion unter Verwendung des zuvor beschriebenen Ratten-Carrageen-Fußballentests getestet.
Die zu testenden Hypothesen waren, daß (a) die Hyperimmunisierung für die zuvor beschriebene entzündungshemmende Aktivität verantwortlich war. (b) MAIF in kommerziellem Maßstab durch Ultrafiltration extrahiert werden konnte, und (c) die Verdünnung des Permeats eine Aggregation des entzündungshemmenden Faktors verursachen würde, so daß dieser durch die 30.000 Molekulargewichts-Ultrafiltrationsmembran zurückgehalten wird.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse eines Zwillingsherden-Ultrafiltrationsversuchs, der zur Testung der biologischen Aktivität verschiedener Fraktionen bestimmt war, die aus der Milch nicht geimpfter Kontrollzwilling und aus rekonstituiertem Milchpulver von immunisierten Kühen hergestellt wurden. Die getesteten Fraktionen waren folgende: Peak I, G-10 Säulenzubereitung, 4 ml (OHIO MAIF STD); R&sub2; Endretentat von nicht geimpften Zwillingen (KONTROLLE ZWILLING R&sub2;); P&sub2; Endpermeat von dem rekonstituierten Milchpulver (REKON s100 P&sub2;); dialysiertes R&sub2; Endretentat von nicht geimpften Zwillingen (KON DIALYSIERT R&sub2;); dialysiertes Endretentat von dem rekonstituierten Milchpulver (S100 DIALYSIERT R&sub2;).
In der R&sub2;-Endretentatfraktion, die von nicht immunisierten Kühen hergestellt wurde, konnte selbst nach der Dialyse keine entzündungshemmende Aktivität nachgewiesen werden. In der Endpermeat P&sub2;-Fraktion, die aus dem rekonstituierten Milchpulver hergestellt wurde, konnte keine entzündungshemmende Aktivität nachgewiesen werden. Die Retentat R&sub2;-Fraktion aus rekonstituiertem Milchpulver wies nach der Dialyse eine entzündungshemmende Aktivität im Bereich der Aktivität des MAIF-Standards auf.
Fig. 11 zeigt die Ergebnisse der Zwillingsherden-Ultrafiltrationsversuche, die zur Testung der biologischen Aktivität verschiedener Milchfraktionen bestimmt waren, die von geimpften und nicht geimpften Zwillingskühen und aus rekonstituiertem Milchpulver von immunisierten Kühen hergestellt wurden. Die getesteten Fraktionen waren folgende: Peak I, G-10 Säulenzubereitung, 4 ml (OHIO MAIF STD); dialysiertes Endretentat R&sub2; von nicht geimpften Zwillingen (KON DIALYSIERT R&sub2;); Endretentat R&sub2; von dem rekonstituierten Milchpulver (REKON s100 R&sub2;); das Endretentat R&sub2; von geimpften Zwillingen (IMMUN ZWILLING R&sub2;); das erste Rententat R&sub1; von dem rekonstituierten Milchpulver (S100 VERDÜNNT R&sub1;).
In dem dialysierten Retentat R&sub2; von nicht geimpften Kontrollzwillingen oder in dem nicht dialysierten Retentat R&sub2; von den geimpften Zwillingen wurde eine geringe entzündungshemmende Aktivität nachgewiesen. Eine gewisse Aktivität ist durch ein Streuungsdiagramm nachweisbar. R&sub2;-Retentat, das ohne Dialyse aus rekonstituiertem Stolle- Milchpulver von immunisierten Kühen hergestellt wurde, war stark entzündungshemmend. Die Zubereitung durch Verdünnung der rekonstituierten Milch vor der Ultrafiltration anstelle der Verdünnung von Molke, die aus der Milch hergestellt wurde, war jedoch nur marginal aktiv. Dieses Ergebnis zeigt, daß die entzündungshemmende Aktivität aus der Molkefraktion wirksamer extrahiert wird.
Fig. 12 zeigt die Ergebnisse von Zwillingsherden-Ultrafiltrationsversuchen, die zur Testung der biologischen Aktivität eines dialysierten Retentats von geimpften Zwillingskühen bestimmt waren. Die getesteten Fraktionen waren folgende: Peak I, G-10 Säulenzubereitung (OHIO MAIF STD); dialysiertes Endretentat R&sub2; von geimpften Zwillingen (IMM DIALYSIERT R&sub2;); dialysiertes Endretentat von der G-10 Zubereitung (DIALYSIERT OHIO MAIF). Die Ergebnisse zeigen, daß die entzündungshemmende Aktivität in der R&sub2;-Fraktion von den immunisierten Zwillingen nach der Dialyse vorhanden war. Dialysierter MAIF war in dem Test aktiver als der nicht-dialysierte MAIF-Standard. Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, daß die Dialyse ein wirksames Mittel zur weiteren Konzentrierung des Milchfaktors ist, der für die entzündungshemmende Aktivität verantwortlich ist.
Die in den obengenannten Fig. 10-12 dargestellten Ergebnisse bekräftigen die folgenden Schlußfolgerungen: (1) entzündungshemmende Aktivität kann aus rekonstituierter Milch von immunisierten Kühen durch Ultrafiltration des verdünnten Permeats extrahiert werden. (2) Entzündungshemmende Aktivität wurde in den obengenannten Zubereitungen nicht nachgewiesen, die aus der Milch nicht-immunisierter Kühe hergestellt wurden. (3) Entzündungshemmende Aktivität wurde in dem Endretentat R&sub2; nach der Ultrafiltration des verdünnten Permeats nachgewiesen, das aus der Milch immunisierter Kühe hergestellt wurde, wobei jedoch eine Dialyse notwendig war, um die Aktivität zu zeigen.

BEISPIEL 9

Stabilität von MAIF, Erwärmen und Proteinasebehandlung von MAIF

Der vorangehende Beweis, daß der entzündungshemmende Milchfaktor chemisch weder ein Protein noch ein Peptid ist, beruhte weitgehend auf chemischen Analysen, die beständig ein annähernd vollständiges Fehlen von Stickstoff zeigten. Für eine weitere Charakterisierung des entzündungshemmenden Faktors wurden mehrere Zubereitungen im Rattenpfoten-Ödemtest unter Verwendung von 4 mg der Peak I, G-10 Säulenzubereitung intravenös als Standard getestet. Die folgenden Behandlungen wurden durchgeführt: Proteinase (Pronase) Behandlung über sechs Stunden; Kontrolle mit sechs Stunden ohne Proteinasebehandlung; unbehandelte positive Kontrolle; Erwärmen bei 100ºC über 30 Minuten.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 13 dargestellt. Die Schlüsse, die aus dieser Studie gezogen wurden, waren, daß die entzündungshemmende Aktivität nicht auf ein Protein oder Peptid zurückzuführen ist, und daß der entzündungshemmende Faktor durch Erwärmen nicht inaktiviert wird. Die Wirksamkeit der Pronasebehandlung wurde durch die Erkenntnis bestätigt, daß eine parallele Pronasebehandlung das Milchprotein vollständig denaturierte.

BEISPIEL 10

Entzündungshemmende Aktivität von weiter gereinigtem MAIF und Molkeproteinkonzentrat von immunisierten Kühen

Das Retentat und Permeat aus der Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon YM5 Membran wurde auf biologische Aktivität unter Verwendung einer intravenösen Verabreichung im Rattepfoten-Ödemtest getestet. In diesem Verfahren wurde der MAIF im Peak 1 der G-10 Säule, der gemäß dem Patent Nr. 4,956,349 hergestellt wurde, durch Ultrafiltration auf einer Amicon YM5 Membran weiter gereinigt. Diese Membran hält Moleküle mit einem Molekulargewicht von 5.000 oder mehr zurück. Molkeproteinkonzentrate (MPK) wurden ebenso aus der Milch von immunisierten Tieren hergestellt und durch die YM5 Membran filtriert. Die folgenden Proben wurden in dem Test unter Verwendung von 4 mg der Peak I, G-10 Säulenzubereitung intravenös als Standard getestet: Permeat von der Amicon YMS Ultrafiltration; Retentat von der Amicon YM5 Ultrafiltration; MPK von immunisierten Kühen, 30 mg pro Ratte; MPK aus der kommerziellen Produktion (nicht immunisierte Kühe), 30 mg pro Ratte.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 14 dargestellt. Aus diesen Ergebnissen geht klar hervor, daß die gesamte Aktivität im Retentat ist, das etwa 0,5% des Gesamtgewichts der Fraktion umfaßte, die auf das YM5 Filter aufgebracht wurde. Die Verringerung des Ödems, die in diesem Versuch beobachtet wurde, wurde nach der Verabreichung von 20-25 Mikrogramm Material erreicht.
Hinsichtlich der Aktivität von MPK, zeigte MPK, das von hyperimmunisierten Tieren hergestellt wurde, eindeutig die entzündungshemmende Aktivität wie erwartet. Interessanterweise zeigte MPK, das von nicht immunisierten Tieren hergestellt wurde, auch entzündungshemmende Aktivität. Das Vorhandensein einer entzündungshemmenden Aktivität in der Milch von nicht immunisierten Kühen ist nicht überraschend, da sie eine natürliche Substanz sein muß. Ihr Nachweis wiederspiegelt die Empfindlichkeit des Bioassays.

BEISPIEL 11

Kontinuierliche Aufzeichnung von durch Carrageen herbeigeführten Fußballenödemen

Es wurde festgestellt, daß 4 mg der MAIF-Zubereitung, zum Zeitpunkt der Carrageen-Injektion intravenös verabreicht, die Ansammlung von Ödemen im Fußballen zwischen 40% und 50% verringerte. Obwohl diese Ergebnisse einen Beweis liefern, daß das Material einen entzündungshemmenden Anteil enthält, gab es kaum einen Hinweis auf die Wirkungsstelle oder das pharmakologische Profil von MAIF. Um solche Daten zu erhalten, mußte ein Verfahren entwickelt werden, daß die kontinuierliche Aufzeichnung von Fußballenödemen während der Reaktion auf Carrageen ermöglicht. Diese wurde erreicht, indem die Rattenpfote in einen demontierten Gammastrahlungsdetektor gehalten wurde. Für dieses Verfahren mußten die Tiere bis zu 4 Stunden narkotisiert werden und da bekannt ist, daß Anästhetika die Entzündungsreaktion unterdrücken, mußte zunächst die Wirkung von Anästhetika auf die durch Carrageen hervorgerufenen Ödeme bestimmt werden. Fünf Mittel, die allgemein zur Narkotisierung von Ratten verwendet werden, wurden daher ausgewertet; diese waren Ether, Chloralhydrat, Innovar-vet, Nembutal und Urethan. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt.
Aus diesen Ergebnissen war klar, daß Ether das Anästhetikum der Wahl ist, wenn die Entzündungsreaktion durch diese Technik bewertet werden sollte. Die Form der bei Verwendung von Ether erhaltenen Kurve zeigte eine biphasische Reaktion. Um die Reaktion genauer darzustellen, wurde ein weiteres Experiment ausgeführt, in dem das Volumen des Ödems zu 12 Zeitpunkten über einen Zeitraum von 5 Stunden gemessen wurde. Die Ergebnisse bestätigten eine biphasische Reaktion. Die frühe Reaktion trat zwischen 0 und 1 Stunde nach der Belastung auf und die Reaktion der späten Phase zwischen 1,5 und 2 Stunden (Fig. 16).
Die beiden Phasen, die auch von anderen Forschern beobachtet wurden, wurde als nicht-phagozytische Entzündungsreaktion ("non-phagocytic inflammatory response" - NPIR) bzw. phagozytische Entzündungsreaktion ("phagocytic inflammatory response" - PIR) bezeichnet.
Die NPIR wird als Reaktion auf eine Verletzung durch lösliche Mediatoren wie Histamin und Bradykinin ausgelöst, während die PIR von der Beteiligung neutrophiler Teichen abhängt. Das Protokoll war daher die Verabreichung von MAIF und die kontinuierliche Aufzeichnung der Ödemansammlung in dem Bemühen festzustellen, ob die entzündungshemmenden Eigenschaften des Mittels ein Ergebnis einer Wirkung der frühen nicht-zellulären (NPIR) oder der späten zellulären (PIR) Phase waren. 5 mg oder 40 mg der MAIF-Zubereitung wurden intravenös zum Zeitpunkt der Carrageen-Belastung verabreicht und die Ansammlung des Ödems in regelmäßigen Abständen über einen Zeitraum von vier Stunden aufgezeichnet. Keine Dosis beeinflußte die Ödemansammlung in einer der Phasen (Fig. 17).
Dieses Ergebnis war überraschend, da viele frühere Analysen, in welchen die Wirkung von gereinigten MAIF-Zubereitungen auf durch Carrageen herbeigeführte Ödeme 4 Stunden nach der Belastung bestimmt wurde, eine deutliche entzündungshemmende Aktivität in den Fraktionen gezeigt hatten. Es ist daher wahrscheinlich, daß der ständige Ethereinfluß die aktive entzündungshemmende Komponente von MAIF in vivo hemmte oder inaktivierte.
Frühere Studien zeigten, daß die kurzfristige Etherbelastung die Aktivität des entzündungshemmenden Faktors nicht beeinflußte. Daher wurde ein Versuch durchgeführt, in dem die Wirkung von MAIF auf die progressive Ödemansammlung an nur vier Zeitpunkten, 0, 1, 3 und 4 Stunden, bestimmt wurde, wodurch die Etherbelastung der Tiere begrenzt wurde. Der Zeitpunkt von 1 Stunde wurde gewählt, um den Einfluß auf die frühe nicht-phagozytische Entzündungsreaktion zu bewerten, während die Messung nach 3 und 4 Stunden gewählt wurde, um die Wirkung auf die spätere phagozytische Entzündungsreaktion zu quantifizieren. In diesem Versuch führte die mit 40 mg verabreichte MAIF-Zubereitung zu einer Verringerung der Ödemansammlung in der sekundären, durch phagozytische Zellen vermittelten Phase, hatte aber keine signifikante Wirkung auf die primäre, vom löslichen Mediator gesteuerte Phase (Fig. 18).
Die folgenden Schlüsse können aus dieser Versuchsreihe gezogen werden:
1. Ether ist das bevorzugte Anästhetikum zur Verwendung in Versuchen, in welchen die Entzündungsreaktion auf Carrageen ständig aufgezeichnet werden soll.
2. Eine anhaltende Ethernarkose hemmt die in vivo entzündungshemmende Aktivität des entzündungshemmenden Faktors im Carrageen-Fußballentest.
3. MAIF lindert die Entzündung durch Hemmung der späten, durch phagozytische Zellen vermittelten Phase der Entzündungsreaktion auf Carrageen.

BEISPIEL 12

Zeitverlauf der Wirkung von MAIF auf durch Carrageen herbeigeführte Fußballenödeme

Eine weitere Reihe von Experimenten wurde ausgeführt, in welchen das Mittel zu gewählten Zeitpunkten vor oder nach der Carrageen-Injektion und nicht zum Zeitpunkt der Belastung verabreicht wurde. Der Zweck der Studie war, folgende Information zu erhalten:
(a) den effektivsten Zeitpunkt zur Verabreichung von MAIF im Verhältnis zu dem Entzündungsstimulus.
(b) die biologische Halbwertzeit des entzündungshemmenden Teils.
(c) die Punkte in der durch MAIF beeinflußten Entwicklung der Entzündungsreaktion.
Die Studie wurde in drei Teilen ausgeführt. Eine MAIF-Zubereitung wurde intravenös bei einer Dosis von 4 mg/Ratte an einem von 11 Zeitpunkten verabreicht, die von 150 Minuten vor bis 150 Minuten nach der Injektion von Carrageen reichten. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 19 und Tabelle 5 dargestellt.
Eine signifikante Hemmung des Ödems wurde zu allen untersuchten Zeitpunkten beobachtet; der Wert der Hemmung war jedoch an den äußeren Extremen (± 150 min) geringer. Eine interessante zyklische Reaktion auf die MAIF-Verabreichung wurde in jenen Gruppen beobachtet, die näher beim Belastungspunkt behandelt wurden. Die Tatsache, daß MAIF effektiver war, wenn er 30 Minuten nach der Belastung verabreicht wurde, als bei einer Verabreichung 15 Minuten nach der Belastung, bestätigt das Konzept, daß die sekundäre, durch phagozytische Zellen vermittelte Phase der Reaktion durch das Mittel gehemmt wird. Die MAIF-Zubereitung hemmte die Reaktion auf Carrageen stark, wenn sie 15 Minuten vor oder zum Zeitpunkt der Belastung verabreicht wurde. Es ist ferner offensichtlich, daß das Mittel im Serum eine relativ lange Halbwertzeit hat (1-2 h) und seine Wirksamkeit mit dem Zeitpunkt der Belastung und der dynamischen Eigenschaft der Entzündungsreaktion zusammenhängt.
Es wird daher vermutet, daß die entzündungshemmende Wirkung auf eine Wirkung auf entzündliche Zellen, wahrscheinlich die neutrophilen Teilchen, zurückzuführen ist.

BEISPIEL 13

Wirkung von MAIF auf die reverse passive Arthus-Reaktion

Die Möglichkeit, daß der entzündungshemmende Faktor die Beteiligung von neutrophilen Teilchen beeinflussen könnte, wurde durch die Fähigkeit des Materials, die reverse passive Arthus-Reaktion (RPA) zu modulieren, untersucht. Diese durch den Immunkomplex ausgelöste Reaktion ist vorwiegend neutrophil-vermittelt und Mittel, welche die Entwicklung der Reaktion beeinflussen, machen dies über eine Wirkung auf diese Zellen. Zur Auslösung der RPA wurde Ratten intradermal ein Kaninchen-Antikörper gegen Ovalbumin und intravenös natives Ovalbumin injiziert. Ovalbumin/Ovalbumin-Antikörper- Immunkomplexe bilden sich in und um die dermalen Blutgefäßwände, neutrophile Teilchen des Wirts binden an den Fc-Teil des Antikörpers und eine starke Entzündungsreaktion wird ausgelöst. Es sollte festgehalten werden, daß, obwohl die Reaktion durch Immunkomplexe ausgelöst wird, sie unabhängig vom Immunsystem des Wirtes abläuft.
Drei Parameter werden zur Quantifizierung der RPA verwendet. Dies sind (1) Ödem -gemessen unter Verwendung der Ansammlung von ¹²&sup5;I-HSA, (2) Blutung - bewertet durch in vivo Vormarkierung von RBK mit &sup5;&sup9;FE und (3) die Ansammlung von neutrophilen Teilchen - gemessen durch Bestimmung der Gewebewerte des neutrophilen-spezifischen Enzyms Myeloperoxidase (MPO). Diese Tests sind den Durchschnittsfachleuten bekannt.
Achtzehn Ratten wurden in drei Gruppen von sechs unterteilt. Kaninchen-Anti- Ovalbumin (40 ul) wurde intradermal an vier Stellen am Rücken jedes Tieres injiziert und 2 mg Ovalbumin wurden unmittelbar danach intravenös injiziert. Eine Gruppe von Tieren erhielt keine andere Behandlung und diente als Kontrolle. Der zweiten Gruppe wurde 20 mg einer Lactose-Zubereitung intravenös injiziert, während der letzten Gruppe 20 mg einer gereinigten MAIF-Zubereitung intravenös injiziert wurden. Sowohl Lactose als auch die MAIF-Zubereitung wurden mit dem Ovalbumin verabreicht. Die Stärke der Reaktion wurde 3,5 Sunden nach der Belastung bewertet. Wenn die MAIF-Zubereitung intravenös in einer Dosis von 20 mg/Ratte vor dem Auslösen der RPA-Reaktion verabreicht wurde, gab es eine äußerst signifikante Hemmung der drei Parameter, die zur Messung der Reaktion verwendet wurden (Tabelle 6, Fig. 20). Das Lactose-Kontrollmaterial bewirkte auch eine mäßige und marginal signifikante Unterdrückung der Ansammlung neutrophiler Teilung und Blutung. Dies zeigt, daß in normaler Milch eine geringe Menge entzündungshemmender Aktivität vorhanden ist.
Da die neutrophilen Teilchen der primäre Mediator der RPA sind, lieferten diese Ergebnisse einen zusätzlichen Beweis, daß MAIF die Entzündungsreaktion über eine Wirkung auf die Neutrophilenfunktion hemmen konnte.

BEISPIEL 14

Wirkung von MAIF auf die Migration neutrophiler Teilchen

Für eine wirksame Beteilung an einer Entzündungsreaktion müssen die neutrophilen Teilchen zunächst aus dem Gefäßsystem zu der Entzündungsstelle migrieren. Zur Bestimmung, ob der entzündungshemmende Faktor die Migration der neutrophilen Teilchen beeinflußt, wurde ein Entzündungsmodell verwendet, welches die subkutane Implantation steriler Polyurethantupfer vorsieht. Die Tupfer werden in Intervallen nach der Implantation entfernt, und durch Abwiegen der Tupfer und anschließendes Extrahieren und Zählen der Zellen im Infiltrat können sowohl die flüssige als auch zelluläre Phase der Reaktion quantifiziert werden. 24 Stunden nach der Implantation sind > 95% der im Tupfer vorgefundenen Zellen neutrophile Teilchen.
Es wurden zwei Versuche durchgeführt. Im ersten wurden die Tiere mit 5, 10, 20 oder 40 mg einer gereinigten MAIF-Zubereitung zum Zeitpunkt der Tupferimplantation behandelt. Die Tupfer wurden 24 Stunden nach der Implantation entfernt. Jede Gruppe bestand aus 5 bis 8 Ratten und jedem Tier wurden zwei Tupfer implantiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 21 dargestellt.
20 oder 40 mg der MAIF-Zubereitung, die zum Zeitpunkt der Tupferimplantation intravenös verabreicht wurde, hatten eine deutliche Wirkung auf die Migrationsfähigkeit der Entzündungszellen. Ebenso wurde eine weniger deutliche, aber gleichermaßen signifikante Hemmung der Flüssigkeitsansammlung beobachtet. Die beiden geringeren MAIF-Dosen hatten keine nachweisbare Wirkung in diesem Entzündungsmodell.
Es wurde ein zweiter Versuch durchgeführt, der das zeitliche Verhältnis zwischen der entzündlichen Belastung (Tupferimplantation) und der MAIF-Verabreichung darstellen sollte. In dieser Studie wurden 20 mg der MAIF-Zubereitung intravenös 30, 60 oder 120 Minuten nach der Tupferimplantation verabreicht. Eine vierte, Kontrollgruppe blieb unbehandelt. In jeder Gruppe waren fünf Tiere. Jedem Tier wurden zwei Tupfer implantiert und diese nach 24 Stunden entfernt. Die Ergebnisse sind in Fig. 22 dargestellt. In dieser Graphik sind die Ergebnisse enthalten, die von einer Probegruppe von Ratten erhalten wurden, die 20 mg der MAIF-Zubereitung zum Zeitpunkt der Implantation erhielten (siehe Fig. 21).
Ergebnisse von dem Zeitverlauf der Wirkung von MAIF auf durch Carrageen herbeigeführte Fußballenödeme zeigen, daß MAIF vergleichsweise unwirksam ist, wenn er 60 Minuten oder später nach der Belastung verabreicht wird. Es muß festgehalten werden, daß zwar 20 mg der MAIF-Zubereitung zur Unterdrückung der Entzündung notwendig waren, die mit der Tupferimplantation zusammenhing, aber 4 mg ausreichten, um die durch Carrageen herbeigeführten Ödeme zu hemmen. Ohne sich auf diese Interpretation festlegen zu wollen, könnte diese Verschiedenheit mit dem unterschiedlichen Provokationsausmaß zusammenhängen, den die beiden Reize für den Wirt darstellen. Das Tupferimplantat ist ein relativ gutartiger Stimulus, der eine langsame Entzündungsreaktion herbeiführt und die meisten Zellen sammeln sich zwischen 8 und 16 Stunden nach der Implantation an (Fig. 23). Andererseits ist die subkutane Injektion von Carrageen ein sehr starker Stimulus, der eine entsprechend starke Reaktion in einem verhältnismäßig kurzen Zeitraum auslöst (Fig. 16).

BEISPIEL 15

Alternatives Verfahren zur Reinigung des entzündungshemmenden Faktors aus Milch (Zubereitung "AIF")

Das folgende Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Reinigung des entzündungshemmenden Faktors aus Milch in seiner nicht-aggregierten Form mit niedrigstem Molekulargewicht. Die Zubereitung, die in den beschriebenen Reinigungsschritten erhalten wird, wurde als "AIF" bezeichnet, um sie von der Zubereitung zu unterscheiden, die unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens erhalten wird. In dem vorliegenden Beispiel und in dem folgenden Beispiel (d. h., Beispiel 16) wird der aktive Faktor in den Zubereitungen einfach als "entzündungshemmender Faktor" bezeichnet. Alle Reinigungsschritte wurden so durchgeführt, daß eine mögliche Kontamination mit Bakterien oder Pyrogenen minimiert wurde. Zur Herstellung der Lösungen wurde steriles Wasser verwendet, und alle Glasgeräte wurden entpyrogenisiert.

Schritt 1: < 10.000 Molekulargewicht ("MG") Ultrafiltration

Frische S100 immune Magermilch (siehe Beispiel 1 für eine Beschreibung der Verfahren, die zum Erhalten der immunen Milch verwendet werden) wurde durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Abtrennung von 10.000 MG (Filtron) bei einem Druck von 0,21 MPa (30 psi) gepumpt. Das Permeat wurde in entpyrogenisierten Flaschen gesammelt, die auf Eis gehalten wurden. Die Permeate wurden sterilfiltriert und bis zur Verwendung gekühlt. Das < 10.000 MG Permeat enthält den entzündungshemmenden Faktor wie auch Peptide geringen Molekulargewichts, Oligosaccharide und eine große Menge Lactose. Entzündungshemmende Aktivität in dem Permeat tritt in einer nicht-aggregierten Form mit geringem Molekulargewicht auf.

Schritt 2 DEAE-Sepharose-Chromatographie

Die anfängliche Fraktionierung der entzündungshemmenden Aktivität wurde auf DEAE-Sepharose durchgeführt. Eine 5 · 50 cm Säule, die einen Liter DEAE-Sepharose enthielt, wurde mit Permeatpuffer äquilibriert. Permeatpuffer ist eine sterile, endotoxinfreie Lösung, welche die diffusionsfähigen Ionen enthält, die in Sammelmilch in den richtigen Konzentrationen vorgefunden werden. Permeatpuffer enthält CaCl&sub2;, MgCl&sub2;, NaCl, NaCitrat und NaH&sub2;PO&sub4;. Für gewöhnlich wurden etwa acht Liter des < 10.000 MG Permeats auf die DEAE-Sepharose Säule bei einer Flußgeschwindigkeit von etwa 500 ml pro Stunde gepumpt. Das Säuleneluat wurde bei 280 nm aufgezeichnet. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, bis die Extinktion bei 280 auf die Basislinie zurückkehrte (für gewöhnlich waren etwa 6 bis 8 Liter destilliertes Wasser notwendig). Die entzündungshemmende Aktivität war an die Säule gebunden und eluierte mit etwa 4 Liter 0,5 M Ammoniumacetat in Wasser, pH 7,4. Das Eluat wurde bis zur Trockenheit lyophilisiert und gewogen. Das Gewicht de aus acht Liter Permeat gewonnenen Materials lag für gewöhnlich zwischen 15 und 20 Gramm. Da sich Ammoniumacetat während der Lyophilisierung vollständig verflüchtigte, stellt das Restgewicht das Gewicht des gebundenen Materials dar. Die entzündungshemmende Aktivität wurde im Maus-Neutrophilenmigrationshemmungstest getestet.

Schritt 3: H-40 Chromatographie

Das Material, das von der DEAE-Sepharose-Säule eluierte wurde auf einer Größenausschlußsäule weiter fraktioniert, um den Faktor, der für die entzündungshemmende Aktivität verantwortlich ist, von den anderen Komponenten mit geringem Molekulargewicht abzutrennen. Acht Gramm der DEAE-Probe wurden in 50 ml destilliertem Wasser aufgelöst und auf eine 2,5 · 150 cm Säule aufgebracht, die 736 ml Toyopearl HW-40 (Rohm und Haas), äquilibriert in Wasser, enthielt. Die Säule wurde in destilliertem Wasser bei einer Flußgeschwindigkeit von 40 ml pro Stunde entwickelt und das Eluat wurde bei 280 nm aufgezeichnet. Die Fraktionen wurden gesammelt und auf entzündungshemmende Aktivität im Maus-Neutrophilenmigrationshemmungstest getestet. Die Fraktionen, die eine Aktivität und eine minimale Extinktion bei 280 nm zeigten, wurden gepoolt und lyophilisiert. Etwa 80 mg des Materials, das entzündungshemmende Aktivität enthielt, wurde aus acht Litern Permeat gewonnen.

Schritt 4: AffiGel 601 Chromatographie

Der letzte Reinigungsschritt beinhaltete die Affinitätschromatographie des aktiven Faktors in einer Säule, die mit einem von Boronat abgeleiteten Medium auf Polyacrylamidbasis (AffiGel 601, Bio-Rad) gepackt war, das eine Affinität für coplanar benachbarte cis - Hydroxylgruppen hat. Vierzig mg des HW-abgeleiteten Materials mit geringem Molekulargewicht wurden in 10 ml 0,25 M Ammoniumacetat äquilibriert, pH 7,0, und auf die AffiGel-Säule aufgebracht, die ebenfalls in 0,25 Ammoniumacetat äquilibriert war. Das Eluat wurde bei 280 nm aufgezeichnet. Die Säule wurde mit 400 ml 0,25 M Ammoniumacetat bei einer Strömungsrate von 50 ml pro Stunde gewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm auf den Hintergrund abnahm. Die AffiGel-Säule wurden dann mit 1600 ml 0,1 M Ameisensäure, pH 2,8, eluiert. Das Eluat wurde auf Aktivität im Maus- Neutrophilenmigrationshemmungstest getestet und bis zur Trockenheit lyophilisiert. Etwa 8 bis 10 mg gebundenes Material, das entzündungshemmende Aktivität enthielt, wurde aus 8 Litern Permeat gewonnen.
Die durch dieses Verfahren erhaltene Zubereitung wurde als "AIF" bezeichnet. Die Zubereitung war in bezug auf den entzündungshemmenden Faktor im wesentlichen gereinigt, ist aber nicht homogen. Die Zubereitung weist eine entzündungshemmende Aktivität im Maus-Neutrophilenmigrationshemmungstest, im Rattenpfoten-Ödemtest, im Rattenohr- Schwellungstest auf und blockiert die Bindung neutrophiler Teilchen an das Ratten-Mesenteriumvenolenendothel (durch intravitale Mikroskopie sichtbar gemacht). Ausgehend von vergleichenden Analysen im Maus-Neutrophilenmigrationshemmungstest ist AlF etwa 55.000-fach stärker gereinigt als das ursprüngliche < 10.000 MG Magermilch-Permeat.

BEISPIEL 16

Wirkung der Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors auf die Adhäsion von neutrophilen Teilchen an Endothelzellen und auf die Emigration von neutrophilen Teilchen aus dem Gefäßsystem

Die Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die Adhäsion von neutrophilen Teilchen an Endothelzellen und auf die Emigration von neutrophilen Teilchen aus dem Gefäßsystem wurde untersucht. Es wurden zwei verschiedene Zubereitungen des entzündungshemmenden Faktors verwendet. Eine Zubereitung wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Reinigungsverfahrens hergestellt. Für den Zweck des vorliegenden Beispiels wird diese Zubereitung einfach als "MAIF" bezeichnet. Die andere Zubereitung des entzündungshemmenden Faktors wurde unter Verwendung des in Beispiel 15 beschriebenen Reinigungsverfahrens hergestellt und wird sowohl in jenem als auch diesem Beispiel als "AIF" bezeichnet. Es ist offensichtlich, daß sowohl MAIF als auch AlF den entzündungshemmenden Faktor in verschiedenen Reinheitsstufen enthalten.

Chemikalien:

Humanserumalbumin, Trypsin, plättchenaktivierender Faktor (PAF), Phorbolmyristatacetat (PMA), Propidiumiodid und Histopaque wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, erhalten. Humane Neutrophilelastase wurde von Calbiochem gekauft. Ein monoklonaler Maus-Antihuman-CD18-Antikörper (IgG&sub1;-Unterklasse; FITC-Konjugat) und ein Maus-Anti-Keyhole-Limpet-Hemocyanin (IgG&sub1;-Unterklasse; FITC Konjugat), das als negativer Kontrollantikörper verwendet wurde, wurden von Becton Dickinson Systems Inc., Mountain View, CA, gekauft. Simply CellularTM Mikrokügelchen wurden von Flow Zytometry Standards Corp., Research Triangle Park, NC, gekauft. Andere Reagenzien waren von bester im Handel erhältlicher Güte und wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

In-vivo Verfahren:

Intravitale mikroskopische Untersuchung. 24 männliche Wistar-Ratten (180-250 g) wurden auf einer gereinigten Labordiät gehalten und 24 Stunden vor dem chirurgischen Eingriff fasten gelassen. Die Tiere wurden anfänglich mit Pentobarbital narkotisiert (12 mg/100 g Körpergewicht). Eine rechte Halsschlagader und Jugularvene wurden zur Messung des systemischen arteriellen Drucks (Statham P23A Druckwandler und ein physiologischer Grass-Schreiber) bzw. der Heilmittelverabreichung kanüliert. Ein abdominaler Medianschnitt wurde ausgeführt und die Tiere wurden in eine Rückenlage gebracht. Ein Segment des mittleren Jejunums wurde durch den abdominalen Schnitt nach außen verlegt und das ganze freiliegende Gewebe wurde mit kochsalzlösunggetränktem Gaze bedeckt, um eine Dehydrierung des Gewebes zu verhindern. Das Mesenterium wurde sorgfältig über ein optisch klares Schaugestell gelegt, das eine Durchleuchtung eines 2 cm² Gewebesegmentes ermöglichte. Die Temperatur des Gestells wurde mit einem Konstanttemperatur-Zirkulator (Fisher Scientific, Modell 80) bei 37ºC gehalten. Die rektale und Mesenterialtemperatur wurden unter Verwendung eines Elektrothermometers aufgezeichnet. Das Mesenterium wurde mit erwärmter Bicarbonat- gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) übergossen. Ein intravitales Mikroskop (Nikon Optiphot-2, Japan) mit einer X25 Objektivlinse (Leitz Wetzlar L25/0,35, Deutschland) und X10 Okular wurde zur Beobachtung der Mesenterialmikrozirkulation verwendet. Eine Videokamera, die an dem Mikroskop befestigt war, projizierte das Bild auf einen Farbmonitor und die Bilder wurden für eine Wiedergabeanalyse unter Verwendung eines Videokassettenrecorders aufgezeichnet. Einzelne unverzweigte Venolen mit einem Durchmesser im Bereich von 25 bis 40 um wurden für die Studie ausgewählt. Der Venolendurchmesser wurde unter Verwendung eines Videokalibers direkt gemessen. Die Anzahl anhaftender und emigrierter neutrophiler Teilchen wurde nicht direkt während des Abspielens des Videobandes gemessen. Ein neutrophiles Teilchen wurde als an dem Venolenendothel haftend bezeichnet, wenn es 30 Sekunden oder länger stationär blieb. Rollende neutrophile Teilchen wurden als jene weißen Blutkörperchen definiert, die sich mit einer Geschwindigkeit von weniger als jener der Erythrozyten in demselben Gefäß bewegten. Die Leukozytenrollgeschwindigkeit wurde durch die Zeit bestimmt, die ein Leukozyt benötigt, um eine bestimmte Strecke entlang der Länge der Venole zu queren.
Versuchsprotokoll. Sobald alle hämodynamischen Parameter im stationären Zustand waren, wurden Bilder vom Mensenterium über 5 Minuten aufgezeichnet. Das Mesenterium wurde dann 60 Minuten mit 100 nm PAF in Gegenwart von entweder 40 oder 5 mg/Ratte der MAIF-Zubereitung (i.v.) superfundiert. Messungen der obengenannten Parameter wurden wieder nach 30 und 60 min der PAF-Superfusion vorgenommen. In zwei Versuchsgruppen wurden die Mesenterialzubereitungen wieder dem PAF wie zuvor beschrieben ausgesetzt, erhielten aber nach 30 Minuten entweder 40 oder 5 mg/Ratte der MAIF-Zubereitung. In drei weiteren Versuchen wurde die AIF-Zubereitung entweder als Vorbehandlung oder als Nachbehandlung verabreicht.

In vitro Verfahren

Isolierung von neutrophilen Teilchen. Neutrophile Teilchen von gesunden Spendern wurden durch Dextran-Sedimentation, auf die eine hypotonische Lyse und Histopaque- Zentrifugation folgte, gereinigt. Mit Ausnahme des Dextran-Sedimentationsschrittes, der bei Raumtemperatur ausgeführt wurde, wurden die Zellen während des gesamten Isolierungsverfahrens bei 4ºC gehalten. Die Zellzubereitungen enthielten 95% neutrophile Teilchen und mehr als 99% dieser waren lebensfähig, wie unter Verwendung von Trypan Blue bestimmt wurde. Nach der Isolierung wurden die neutrophilen Teilchen mit einer Endkonzentration von 2X 10&sup6; Zellen/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Teilmengen der Zellen wurden dann bei 37ºC 20 Minuten mit unterschiedlichen Konzentrationen der MAIF- oder AIF-Zubereitung inkubiert. Nach dem Waschen wurden die neutrophilen Teilchen im Dunkeln bei 4ºC über 30 Minuten mit sättigenden Konzentrationen von fluorescein-konjugierten Maus-Antihuman-CD18-, Human-CD11b-, EGG-beschichteten Mikrokügelchen (Simply CellularTM Mikrokügelchen) oder des murinen negativen Kontrollantikörpers inkubiert.
Immunofluoreszenzfärbung und FACS Analyse. Die direkte Immunofluoreszenz als Maß der CD18 Oberflächenexpression wurde durch Analyse auf einem FACScan (Becton Dickinson Systems Inc., Mountain View, CA) unter Verwendung der Kanalzahl (Log- Maßstab), der die mittlere Fluoreszenzstärke von 10.000 Zellen darstellt, gemessen. Die logarithmischen Kanalzahlen wurden unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik allgemein bekannt sind, in lineare Werte umgewandelt. Die spezifische mittlere Fluoreszenzstärke für Zellen, die durch CD18 Antikörper gefärbt waren, wurde nach dem Subtrahieren der mittleren Fluoreszenzstärke der Zellen berechnet, die dem negativen Kontrollantikörper ausgesetzt waren. Nicht lebensfähige Zellen wurden unter Verwendung von Propidiumiodid ausgemustert.
Superoxid-Test. Die Superoxidproduktion von isolierten neutrophilen Teilchen wurde nach der PMA und N-Formyl-Met-Leu-Phe ("fMLP") Stimulierung in Gegenwart verschiedener MAIF-Konzentrationen gemessen. Die Verringerung von Zytochrom C durch aktivierte neutrophile Teilchen wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers (Hitachi U2000) bei 550 nm gemessen. Kurz gesagt, die Probe wurde in zwei Küvetten gegeben und eine Küvette wurde als Referenz verwendet. Die letztere enthielt Superoxiddismutase (Superoxid-Antioxidans). Die neutrophilen Teilchen wurden bei 37ºC 5 min in Gegenwart verschiedener MAIF-Konzentrationen äquilibrieren gelassen und die Zellen wurden dann entweder mit PMA oder fMLP stimuliert. Die Superoxidproduktion wurde 3 min gemessen.
Proteasefreisetzung. ¹²&sup5;I-markiertes Albumin wurde auf Vertiefungen geschichtet und über Nacht trocknen gelassen. Ungebundenes Albumin wurde gewaschen und dann wurden PMA-stimulierte neutrophile Teilchen in den Vertiefungen eine Stunde mit oder ohne verschiedene MAIF-Konzentrationen inkubiert. Die freie Radioaktivität in dem Überstand der Vertiefungen wurde durch die Gesamtradioaktivität in jeder Vertiefung dividiert, um den Wert der Proteolyse zu bestimmen.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse sind in den Fig. 24-30 und in den Tabellen 7-9 zusammengefaßt. Fig. 24 zeigt, daß die PAF-Superfusion das Anhaften von neutrophilen Teilchen an postkapillare Venolen um etwa das 6-Fache in einem Zeitraum von 60 Minuten erhöhte. 40 mg/Ratte der MAIF-Zubereitung verringerten das durch PAF herbeigeführte Anhaften von neutrophilen Teilchen um mehr als 90% nach 30 Minuten und um mehr als 80 % nach 60 Minuten. Interessanterweise schien die MAIF-Vorbehandlung auch die Anzahl anhaftender neutrophiler Teilchen vor der PAF-Belastung zu verringern. Die geringere MAIF-Konzentration (5 mg pro Ratte) war weniger wirksam und verringerte die Leukozytenadhäsion um 50% nach 60 min. Es zeigt sich, daß die AlF-Zubereitung bei einer Konzentration von 0,01 mg/Ratte die Leukozytenadhäsion um etwa 50% nach 60 min verringerte. Bei einer zehnfachen höheren AIF-Konzentration wurde ein sehr starker Anstieg in der Leukozytenadhäsion beobachtet (Daten nicht dargestellt). Die Adhäsion war so dramatisch, daß das Videoband nicht analysiert werden konnte. Fig. 25 zeigt die Wirkung von MAIF und AIF auf die Emigration neutrophiler Teilchen. Es zeigte sich, daß MAIF in einer Konzentration von 40 mg pro Ratte und 5 mg pro Ratte und AIF in einer Konzentration von 0,01 mg pro Ratte den Anstieg in der Emigration neutrophiler Teilchen im Verlauf der PAF-Belastung vollständig hemmten. Der Fluß der neutrophilen Teilchen schien sich in der MAIF-behandelten Gruppe im Vergleich zu der unbehandelten Gruppe (Fig. 26) nicht signifikant zu ändern. Wenn AIF verabreicht wurde, wurden zunächst mehr als gewöhnlich neutrophile Teilchen beim Rollen beobachtet, wobei aber die Anzahl im Laufe der Zeit abnahm.
In einer zweiten Reihe von Experimenten wurden die verschiedenen entzündungshemmenden Mittel verabreicht, nachdem die neutrophilen Teilchen sich bereits angeheftet hatten (Fig. 27). In dieser Versuchsreihe wurde die Leukozytenadhäsion durch eine MAIF- Dosis von 40 mg/Ratte, aber nicht durch eine Dosis von 5 mg/Ratte umgekehrt. AlF mit einer Dosis von 0,01 mg pro Ratte kehrte die Adhäsion neutrophiler Teilchen um etwa 25% um. Zur weiteren Bewertung der Wirkung der höheren MAIF-Konzentration (40 mg/Ratte), wurde die Anzahl anhaftender neutrophiler Teilchen zu Beginn des Aufzeichnungsverfahrens und die Anzahl neuer neutrophiler Teilchen, die sich innerhalb von 5 min in jeder Zeitperiode anhefteten, untersucht. Fig. 27a zeigt, daß 10 min nach der MAIF-Verabreichung weniger neutrophile Teilchen angeheftet waren, was darauf hinweist, daß der entzündungshemmende Faktor tatsächlich anhaftende neutrophile Teilchen "abgelöst" hatte. Ferner zeigt Fig. 27b deutlich, daß der MAIF neue Endothelzellenadhäsionen von neutrophilen Teilchen blockierte. Die Geschwindigkeit, mit welcher neutrophile Teilchen entlang der Venolenlänge rollten, änderte sich weder zwischen den Gruppen noch im Laufe der Zeit, mit der Ausnahme, daß AIF die Rollgeschwindigkeit der neutrophilen Teilchen erhöht haben könnte (Fig. 28). Diese Wirkung war angesichts der Tatsache, daß die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen unverändert blieb, ziemlich interessant (Fig. 29). Die Ergebnisse lassen darauf schließen, daß eine einfache Erhöhung in den hydrodynamischen Kräften den Anstieg in der Rollgeschwindigkeit der neutrophilen Teilchen nicht erklären konnte. Der Fluß der neutrophilen Teilchen war ebenso durch den MAIF unbeeinflußt, aber erneut durch AIF verringert (Fig. 30).
In vitro Daten zeigen, daß der entzündungshemmende Faktor die Aktivierung der neutrophilen Teilchen an sich nicht beeinflußt. Der Superoxid-Radikalfänger, Superoxid- Dismutase, blockierte die Zytochrom c-Reduktion durch PMA und fMLP-stimulierte neutrophile Teilchen vollständig, was darauf schließen läßt, daß dies ein Superoxid-vermittelter Prozeß ist. MAIF in extrem hohen Konzentrationen beeinflußte die Zytochrom c-Reduktion nur minimal, was darauf schließen läßt, daß MAIF Superoxid nicht direkt desoxidiert (Tabelle 7). Die Proteasefreisetzung war von MAIF unbeeinflußt (Daten nicht dargestellt).
Es zeigte sich, daß die Bindung des monoklonalen Anti-CD18-Antikörpers mit MAIF oder AIF verringert werden konnte (Tabelle 8). Dies trat beim CD11b Antikörper nicht ein. Die Bindung des CD18-Antikörpers an IgG beschichtete Mikrokügelchen war ebenso nicht durch die MAIF- oder AIF-Zubereitungen beeinflußt, was darauf schließen läßt, daß der entzündungshemmende Faktor die Fähigkeit des monoklonalen Anti-CD18-Antikörpers, an Substrat zu binden, nicht beeinflußte, sondern wahrscheinlich auf den Liganden CD18 wirkte. Dasselbe Muster wurde bei stimulierten neutrophilen Teilchen beobachtet (Tabelle 9). Es sollte festgehalten werden, daß die Bindung an CD18 zwischen den Tagen variierte, da jeden Tag andere Zellen verwendet wurden. Daher kann kein direkter Vergleich zwischen den Ergebnissen in Tabelle 8 mit jenen in Tabelle 9 gemacht werden.

Besprechung:

Die Daten in dem vorangehenden Beispiel lassen darauf schließen, daß der entzündungshemmende Faktor eine Adhäsion der neutrophilen Teilchen und deren Emigration in Venolen dosisabhängig verhindert. Wichtiger jedoch ist, daß der entzündungshemmende Faktor innerhalb einer kurzen Zeitperiode (10 min) die Adhäsion neutrophiler Teilchen an diese Gefäße reversieren konnte. Die einzigen anderen Mittel, die anhaftende neutrophile Teilchen von dem Endothel mit einer solchen Wirksamkeit lösen konnten, sind monoklonale Antikörper, die gegen den CD11/CD18 Glycoproteinkomplex an dem neutrophilen Teilchen gerichtet sind. MAIF schien keine Wirkung auf den Blutstrom durch die einzelnen Gefäße oder auf den systemischen Blutdruck zu haben, was darauf schließen läßt, daß hämodynamische Faktoren wie die Scherbelastung nicht für die Umkehr der Leukozytenadhäsion verantwortlich gemacht werden konnten. Obwohl die Leukozytenrollbewegung eine Voraussetzung für die Leukozytenadhäsion zu sein scheint, beeinflußte MAIF die Leukozytenrollgeschwindigkeit oder den Leukozytenfluß nicht. Letztgenanntes Ergebnis läßt darauf schließen, daß der entzündungshemmende Faktor die Anzahl von neutrophilen Teilchen nicht beeinflußte, die durch das Gefäß rollten und daß daher die Reduktion in anhaftenden Leukozyten nicht ein Ergebnis von weniger Leukozyten war, die mit dem Endothel in Wechselwirkung traten. Die Tatsache, daß die Leukozytenrollgeschwindigkeit wie auch der Leukozytenfluß unverändert blieben, läßt darauf schließen, daß die Adhäsionsmoleküle auf neutrophilen Teilchen und Endothel, die für die Leukozytenrollbewegung verantwortlich sind (IL-Selectin, P-Selectin) nicht durch den entzündungshemmenden Faktor in der MAIF- Zubereitung beeinflußt wurden.
Es wurde berichtet, daß die Leukozyten ihre eigene Adhäsion durch Freisetzung von Superoxid wie auch Proteasen regulieren könnten. Es war daher denkbar, daß die fehlende Leukozytenadhäsion in Gegenwart von MAIF und AIF auf die Fähigkeit dieser Zubereitungen zurückzuführen war, die Freisetzung von Superoxid oder Proteasen zu blockieren. Diese Möglichkeit ist angesichts der Tatsache, daß MAIF eine geringe Auswirkung auf die Freisetzung von Superoxid oder Protease hat und weder mit den freigesetzten Proteasen noch mit dem durch Desoxidationsmittel freigesetztem Superoxid in Wechselwirkung trat, nicht haltbar. Ferner schien der MAIF die Lebensfähigkeit der neutrophilen Teilchen nicht zu beeinflussen, wie durch Propiumiodid bewertet wurde, was eine direkt zytotoxische Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die neutrophilen Teilchen unwahrscheinlich macht.
Damit ein neutrophiles Teilchen anhaftet und emigriert, muß es einen intakten CD11/CD18 Glycoproteinkomplex haben. Die Immunoneutralisierung des Adhäsionskomplexes beeinträchtigt die Fähigkeit der neutrophilen Teilchen, sich permanent an das Endothel zu heften und in das umgebenden Gewebe zu emigrieren, vollständig. Da die Adhäsion neutrophiler Teilchen und deren Emigration ein ratenbegrenzender Schritt in der Gewebeverletzung ist, die mit einer Reihe entzündlicher Zustände zusammenhängt, würde ein Mittel, daß diese Prozesse störte, auch wahrscheinlich die Entzündungsreaktion blockieren. In der vorliegenden Studie kehrte sowohl MAIF als auch AIF die Adhäsion neutrophiler Teilchen dramatisch um und blockierte die Emigration neutrophiler Teilchen, die durch PAF hervorgerufen wird. Aufgrund der Ähnlichkeit zwischen der durch AIF-, MAIF- und monoklonalem Anti-CD18-Antikörper hervorgerufenen Umkehr der Adhäsion neutrophiler Teilchen schien es möglich, daß der entzündungshemmende Faktor innerhalb von AIF und MAIF seine Wirkung durch direkte Wechselwirkung mit dem CD18-Glycoproteinkomplex ausübte. Die oben angeführten in vitro Daten unterstützen diese Ansicht, da sowohl AIF als auch MAIF die Fähigkeit eines Anti-CD18 Antikörpers zur Bindung an den CD18 Glyoproteinkomplex hemmten. Im Gegensatz dazu beeinflußte weder AIF noch MAIF die Bindung von CD11b an seinen entsprechenden monoklonalen Antikörper. Schließlich beeinträchtigten die AIF- und MAIF-Zubereitungen die Fähigkeit des monoklonalen Anti-CD18 Antikörpers nicht, an IgG-beschichteten Mikrokügelchen zu binden. Daher kann geschlossen werden, daß der entzündungshemmende Faktor direkt mit dem CD18 Komplex interagiert und eine Bindung von CD18 an verschiedene Liganden, einschließlich Endothelzellen-Adhäsionsmoleküle, verhindert.

BEISPIEL 17

Wirkung von MAIF auf zirkulierende Leukozyten

Mehrere pharmakologische Mittel können die Migration neutrophiler Teilchen hemmen. Während einige, wie Cyclophosphamide, zytoreduktiv sind und durch Hemmung der Hämopoiese im Knochenmark wirken, haben andere Mittel, wie Steroide und die nichtsteroiden entzündungshemmenden Heilmittel spezifische Wirkstellen und führen nicht zur Leukozytose. Es war daher wichtig, die Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die Anzahl und Verhältnisse zirkulierender weißer Blutkörperchen zu bestimmen.
Es wurden zwei Versuche durchgeführt. Im ersten wurde die MAIF-Zubereitung intravenös mit einer Dosis von 40 mg/Ratte einer Gruppe von 6 Tieren verabreicht und einer Kontrollgruppe wurde Kochsalzlösung injiziert. Blutproben wurden am Basisniveau, 1, 4 und 24 Stunden nach der Behandlung genommen. Die Ergebnisse sind in Fig. 31 zusammengefaßt.
Die MAIF-Verabreichung führte zu einem Anstieg in der Anzahl zirkulierender neutrophiler Teilchen, maximal nach 4 Stunden, und zu einer entsprechenden Abnahme in der Anzahl peripherer Blutlymphozyten. Eine weitere Dosis-Wirkungs-Studie wurde durchgeführt, in welcher einer Gruppe von Ratten Kochsalzlösung 5, 10 oder 20 mg der MAIF-Zubereitung intravenös injiziert wurde. Blut von jeder Ratte war 7 Tage zuvor entnommen worden, um Basislinienwerte zu erhalten, und wurde erneut 4 Stunden nach der MAIF-Injektion entnommen. Die Ergebnisse sind in Fig. 32 dargestellt. In der Graphik sind die Ergebnisse enthalten, die von der Probe erhalten wurden, die 4 Stunden nach der Verabreichung von 40 mg der MAIF-Zubereitung erhalten wurden (siehe Fig. 31).
Alle MAIF-Dosen führten zu einem Anstieg in der Anzahl zirkulierender neutrophiler Teilchen und einer Abnahme in der Anzahl der Lymphozyten. Während die Wirkung auf Lymphozyten linear mit der Dosis in Zusammenhang stand, wies der Anstieg in der Anzahl neutrophiler Teilchen die Form einer Kurve auf, wobei die größte Wirkung bei jenen Tieren beobachtet wurde, die 10 mg erhalten hatten.
Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, daß der entzündungshemmende Faktor die Entzündung moduliert, indem er die Adhäsion neutrophiler Teilchen an Endothelzellen beeinflußt.
Es wurden auch Daten erhalten, die sich auf die Wirkung von drei anderen zellgerichteten, entzündungshemmenden/immunomodulatorischen Mittel auf die zirkulierenden Leukozyten in der Ratte beziehen. Das steroide Heilmittel, Methylprednisolon, bewirkt eine Veränderung in dem Verhältnis von Lymphozyten zu neutrophilen Teilchen analog jener, die bei MAIF beobachtet wird. Das zeitliche Verhältnis zwischen der Verabreichung des Heilmittels und der Wirkung ist etwas anders. Das abstoßungsverhindernde/entzündungshemmende Mittel Cyclosporin A bewirkt auch einen Anstieg in der Anzahl zirkulierender neutrophiler Teilchen, aber die Anzahl von Lymphozyten wird, abhängig von der Dosis, entweder erhöht oder nicht beeinflußt. Im Gegensatz dazu verarmt das zytotoxische Heilmittel Cyclophosphamid sowohl die zirkulierenden Lymphozyten als auch neutrophilen Teilchen. Die Wirkungen des entzündungshemmenden Faktors schienen der Wirkung von Methylprednisolon ziemlich parallel zu sein.

BEISPIEL 18

Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die Lymphozytenfunktion

Die Fähigkeit des entzündungshemmenden Faktors, eine reversible Abnahme in der Anzahl zirkulierender Lymphozyten herbeizuführen (Beispiel 17) veranlaßte eine nähere Untersuchung der Wirkung des Faktors auf die Lymphozytenfunktion. Zur Bestimmung der Wirkung des Faktors auf die T-Lymphozytenfunktion wurden Transplantat-Wirt (GvH) und Wirt-Transplantat (HvG) Analysen durchgeführt.
In der HvG Analyse erhielten elterliche Dark Agouti Ratten ("DA") eine i.v. Injektion von 20 mg der MAIF-Zubereitung 48, 24 und 3 Stunden bevor Lymphozyten von ihren F1 hybriden Nachkommen (DA x Hooded Oxford Ratten) in ihre Fußballen injiziert wurden. Somit wurde die Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die Fähigkeit von T-Lymphozyten von einem intakten Wirt (DA), auf fremde Histokompatibilitätsantigene der F1 Lymphozyten zu reagieren, gemessen. Das Protokoll erzeugte eine äußerst signifikante Verringerung (30%) in der Reaktion, wie durch eine Abnahme im poplitealen Lymphknotengewicht bewiesen wurde (Fig. 33A).
In der GvH Reaktion wurden elterliche (DA) Lymphozyten von MAIF-behandelten elterlichen Ratten (DA) erhalten und in die Fußballen ihrer F1 (DA x Hooded Oxford) Nachkommen injiziert. Dieser Test maß die in vivo Reaktionsfähigkeit von T-Lymphozyten, die von dem bewerteten Wirt, d. h. von MAIF-behandelten Ratten, entfernt wurden. Das MAIF-Dosierungsschema hatte keine Wirkung auf die GvH-Reaktion (Fig. 33B).
Während der vorangehenden Experimente wurde ein offensichtlicher Anstieg in der Anzahl von Milz-Lymphozyten bei den mit MAIF-behandelten Tieren beobachtet. Weitere Versuche zeigten einen signifikanten Anstieg sowohl im Milzgewicht als auch in der Anzahl von Milzzellen (Fig. 33C und 33D). Der Anstieg in der Anzahl von Milzzellen war etwa gleich der Abnahme in der Anzahl zirkulierender Zellen, die früher berichtet wurde. Schließlich wurde die Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die Fähigkeit isolierter Milzlymphozyten, auf das Mitogen Concanavalin A zu reagieren, bestimmt. Es zeigte sich, daß die Verabreichung der MAIF-Zubereitung die mitogene Reaktion kultivierter Lymphozyten auf dieses Lectin nahe vollständig beseitigte (Fig. 33E).

BEISPIEL 19

Unterdrückung einer durch Infektion hervorgerufenen Entzündung durch den entzündungshemmenden Faktor

Es wurden Versuche durchgeführt, um zu bestimmen, ob Veränderungen in den Serumwerten von Akute-Phase-Reaktanten (APR) zur Quantifizierung der entzündungshemmenden Aktivität des entzündungshemmenden Faktors verwendet werden könnten. Die APRs sind eine Gruppe von Proteinen, die als Reaktion auf einen Entzündungsreiz synthetisiert werden. Eines davon, Alpha-2-Macroglobulin, ist bei Mensch und Ratten gleich, und es steht eine Methodologie zur Messung dieser Entzündungskomponente zur Verfügung. Zwei intravenöse Injektionen der MAIF-Zubereitung (0 und 24 Stunden) verringerten die Peakreaktion (48 Stunden) von Alpha-2-Macroglobulin nicht. Dieses Ergebnis zeigt, daß der Faktor die spätere Entzündungsreaktion nicht beeinflußt.

BEISPIEL 20

In vitro und in vivo Bewertung des von Milch abgeleiteten entzündungshemmenden Faktors (Rindereuter-Macrophagentest, Infektionsmodelle bei Mäusen)

Die Inkubation von Rindereuter-Macrophagen mit der hyperimmunen Milchfraktion verstärkte den Grad der Phagozytose nicht nachweisbar, erhöhte aber die Fähigkeit von Macrophagen, phagozytierten Staphylococcus aureus zu töten. Mäusen, welchen intraperitoneal 10 mg der MAIF-Zubereitung pro Kilogramm injiziert wurde, zeigten eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber einer intraperitonealen Belastung mit letalem Staphylococcus aureus.
In einem intrazisternalen Staphylococcus aureus mastitis Belastungsmodell zeigten MAIF-injizierte Mäuse auch eine deutlich geringere Euterentzündung und Involution und eine erhöhte Clearance des infektiösen Organismus. Eine quantitative histologische Analyse des Eutergewebes von MAIF-behandelten Mäusen zeigte deutlich mehr Hohlraum, weniger interalveolares Bindegewebe, und eine geringere leukozytische Infiltration im Vergleich zu Kontrollmäusen. Euterdrüsen von behandelten Mäusen enthielten auch weniger koloniebildende Einheiten als jene von Kontrollmäusen. Der entzündungshemmende Faktor scheint seine Wirkung auf das nicht-spezifische Abwehrsystem durch eine Modulierung der Leukozytenfunktion auszuüben.

BEISPIEL 21

Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die Pathogenese einer experimentellen Infektion

Die häufigsten entzündlichen Agenzien, mit welchen der Mensch in Berührung kommt, sind mikrobiell und es ist wichtig, die Wirkung jedes Agens zu bestimmen, das die Wirtsabwehr einer Infektion moduliert. Die Gewebeschädigung, die viele infektiöse Erkrankungen begleitet, wird eigentlich durch die Reaktion des Wirtes auf die Infektion und nicht durch den eindringenden Organismus verursacht. Während die Fähigkeit, die Entzündungsreaktion auf eine Infektion zu modulieren eine nützliche klinische Technik sein könnte, muß festgehalten werden, daß die Hemmung der Wirtsreaktion während der Infektion nachteilig sein kann. Dies gilt insbesondere im Falle einer Hemmung neutrophiler Teilchen. Studien mit Mitteln, welche die Beteiligung von neutrophilen Teilchen in den frühen Phasen einer Infektion zügeln, haben gezeigt, daß die Entzündung und der Gewebeschaden zwar anfänglich unterdrückt sein mögen, aber die erhöhte Bakterienbelastung, die infolge der verringerten zellulären Reaktion eintritt, möglicherweise zu einer Verstärkung des Gewebeschadens führt. Daher ist es wichtig, das Potential des entzündungshemmenden Milchfaktors zur Modulierung einer Infektion zu bestimmen, um (1) festzustellen, ob das Mittel den durch die Infektion herbeigeführten Gewebeschaden verringern kann; und (2) zu bewerten, ob eine beobachtete Unterdrückung der Wirtsreaktion von einer Zunahme in der Schwere der Infektion begleitet ist.
Die Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die Ödembildung nach der intradermalen Injektion von E. coli 075 wurde bestimmt. Zwei Gruppen von 8 Tieren wurden verwendet. Eine Gruppe war unbehandelt und diente als Kontrolle, während den Individuen in der zweiten Gruppe 40 mg der MAIF-Zubereitung in 0,5 ml Kochsalzlösung intravenös injiziert wurden. Unmittelbar nach der Verabreichung des MAIF wurden 100 ul einer Übernacht-Kultur von E. coli 075 intradermal an zwei Hautstellen auf dem rasierten Rücken der Ratten injiziert, worauf eine intradermale Injektion von 100 ul Kochsalzlösung an zwei weiteren Stellen folgte. Zur Schätzung des Ödemvolumens in der infizierten Haut, wurden, 0,1 uCi ¹²&sup5;I-HSA intravenös zum Zeitpunkt der Belastung injiziert. Sechs Stunden später wurden die Tiere narkotisiert, eine Blutprobe genommen, die Haut am Rücken entfernt und die infizierten und Kochsalzlösung-injizierten Stellen herausgestanzt. Das Ödemvolumen wurde berechnet, indem Gewebezählungen mit Plasmazählungen, wie beschrieben, in Zusammenhang gebracht wurden. Um das Ödemvolumen zu erhalten, das sich infolge der Gegenwart von E. coli ansammelt, wurde das Ödem/Plasmavolumen der Kochsalzlösunginjizierten Stellen subtrahiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 34 dargestellt.
Die MAIF-Verabreichung führte zu einer 48% Hemmung der Ödembildung. Dieser Versuch zeigte, daß der entzündungshemmende Faktor die lokale Entzündungsreaktion auf eine Infektion modulieren konnte.
Zur Untersuchung des Verhältnisses zwischen der Verabreichung des entzündungshemmenden Faktors, der Bakterienreplikation, der Flüssigkeitsansammlung und der Entzündungszellinfiltration wurde ein anderes Infektionsmodell verwendet. Polyurethantupfer, die wie zuvor beschrieben hergestellt und implantiert wurden, wurden mit einer quantifizierten Probe von E. coli 075 zum Zeitpunkt der Implantation infiziert. Die Tupfer wurden in zeitliche festgelegten Intervallen entfernt, zur Bestimmung des Volumens des Flüssigkeitsexsudates gewogen, und dann in Medien ausgedrückt, um die Bakterien und Zellen aus dem Tupfer freizusetzen. Bakterien- und Zellzahlen wurden unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, geschätzt. Der folgende Versuch wurde unter Verwendung dieses Modells durchgeführt. 90 Tiere wurden in zwei Gruppen von 45 geteilt. Eine dieser Gruppen war unbehandelt und diente als Kontrolle. Der zweiten Gruppe wurden 40 mg der MAIF-Zubereitung intravenös injiziert. Die Tupfer wurden dann subkutan implantiert und jeder Tupfer wurde zum Zeitpunkt der Implantation mit 105 E. coli 065 beimpft. Gruppen von 6-8 Tieren wurden anschließend in Intervallen getötet und der bakteriologische Status und die Größe des entzündlichen Infiltrates in den Tupfern bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 35-57 dargestellt.
Die Rate der Bakterienreplikation war bei den MAIF-behandelten Tieren viel höher als bei den Kontrollen und es gab einen 10-, 1000- und 10.000-fachen Unterschied in den Bakterienzahlen nach 4, 8 bzw. 16 Stunden. Danach nahmen die Bakterienzahlen ab, obwohl weiterhin ein großer Unterschied nach 96 Stunden bestand (Fig. 35).
Die frühe Reaktion auf eine Infektion ist die kritische Determinante im Ergebnis einer infektiösen Episode. In diesem Versuch war das zelluläre Infiltrat nach 2,4 und 8 h in jenen Tieren, die MAIF erhalten hatten, 27%, 35% bzw. 46% des Kontrollinfiltrates (Fig. 36B). Die Zellen, die sich in den ersten 24 h nach der Belastung ansammelten, waren > 90% neutrophile Teilchen, und die Hemmung dieser zellulären Komponente während dieser Phase könnte für den raschen Anstieg in den Bakterienzahlen verantwortlich sein. Die Flüssigkeitsansammlung nach 2 Stunden war durch die MAIF-Verabreichung nicht beeinflußt, war aber 4, 8 und 16 Stunden nach der Belastung signifikant geringer. Dies stimmt mit den früheren Erkenntnissen überein, daß der entzündungshemmende Faktor die primäre, nicht zelluläre Phase der Ödembildung im Carrageen-Fußballenmodell nicht hemmt. In früheren Studien, unter Verwendung der immunmodulatorischen Mittel Cyclosporin A und Methylprednisolon, wurde eine ähnliche Verbindung zwischen der Hemmung des akuten zellulären entzündlichen Infiltrates und der Förderung der Bakterienreplikation dargestellt. In diesen Versuchen förderte die erhöhte Bakterienbelastung jedoch eine Wirtsreaktion zwischen 24 und 48 Stunden nach der Belastung, im Zuge derer es zu einem massiven Zustrom von neutrophilen Teilchen kam. Wenn Gewebe beteiligt war, führt die verstärkte Entzündungsreaktion zu einer deutlichen Erhöhung des Gewebeschadens und der Narbenbildung. Interessanterweise unterdrückte die MAIF-Verabreichung zwar die frühe Entzündungsreaktion und war mit einer 10.000-fachen Erhöhung der Bakterienzahlen verbunden, aber es kam zu keinem massiven Zustrom von neutrophilen Teilchen 24-48 Stunden nach der Belastung.

BEISPIEL 22

Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die experimentelle Pyelonephritis

Ein Mittel, das eine Entzündung bei einer Infektion hemmen kann, ohne Folgeerscheinung eines verstärkten Gewebeschadens, hätte ein beachtliches Potential. Ein klinisch relevantes Modell einer Infektionskrankheit könnte eine Versuchsbasis zur Ermittlung eines solchen Potentials bieten.
Pyelonephritis ist eine Infektionserkrankung, die eine örtliche Entzündung, eine Gewebezerstörung und eine Narbenbildung als wesentliche histologische Merkmale aufweist. Ein gut charakterisiertes Modell der Erkrankung steht zur Verfügung, das die zentralen pathologischen Merkmale der Erkrankung beim Menschen reproduziert. Pyelonephritis wird bei der Ratte durch direkte Beimpfung der chirurgisch freigelegten Niere mit einer bestimmten Zahl von E. coli 075 herbeigeführt. Nach der Belastung steigt die Bakterienzahl rasch und erreicht 3 bis 4 Tage später einen Höchstwert. Bei normalen Tieren nimmt der Infektionswert in den folgenden 5 bis 6 Tagen ab und erreicht etwa 10 Tage nach der Belastung ein Plateau. Nach 21 Tagen haben sich die Läsionen aufgelöst und sind als Herde vertieften Narbengewebes vorhanden. Zur Bewertung der Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf dieses Infektionsmodell wurde Pyelonephritis in beiden Nieren von 26 Tieren herbeigeführt. Eine Hälfte dieser Tiere wurde zum Zeitpunkt der Belastung und nochmals 48 Stunden später mit einer intravenösen Dosis von 40 mg/Ratte der MAIF- Zubereitung behandelt. Sieben Tiere von jeder Gruppe wurden 4 Tage nach dem Auslösen der Pyelonephritis getötet und die zwei verbleibenden Gruppen von sechs Tieren nach 21 Tagen. Die Nieren wurden aseptisch entfernt und gewogen, um das relative Volumen des Flüssigkeitsexsudats zu bestimmen. Das Ausmaß der Oberflächenläsionsgröße wurde durch direkte Sichtbarmachung geschätzt, und die Niere wurde homogenisiert, um die Bakterienzahlen zählen zu können. Die Ergebnisse sind in Fig. 38 dargestellt.
Vier Tage nach der Belastung wurde die Entzündungsreaktion, wie durch die Hemmung der Flüssigkeitsansammlung und die Größe der Läsionen an der Oberfläche der Niere gezeigt wird, durch die Verabreichung von MAIF unterdrückt. Wie zuvor in den Studien, die infizierte, subkutan implantierte Tupfer beinhalteten, beobachtet wurde, führte die frühe Unterdrückung der Entzündung zu einem logarithmischen Anstieg in der Zahl der Bakterien bei MAIF-behandelten Tieren. Nach 21 Tagen gab es keinen Unterschied in der Pathologie der Erkrankung, gemessen durch das Nierengewicht, die Bakterienzahlen oder die Größe der Nierenoberflächenläsionen. Während somit die Hemmung der frühen Entzündungsreaktion mit MAIF nicht zu einer Verringerung der Gewebezerstörung in der chronischen (21 Tage) Phase der Pyelonephritis führte, förderte sie auch nicht die Entwicklung pathologischer Läsionen, wie dies bei anderen entzündungshemmenden und immunomodulatorischen Mitteln der Fall war.

BEISPIEL 23

Zusammenfassung der Versuchsdaten

Es wurde ein Verfahren entwickelt, welches eine kontinuierliche Aufzeichnung der Ansammlung von Ödemen im Carrageen-injizierten Fußballen ermöglichte.
Die frühe, nicht-phagozytische Phase der Entzündungsreaktion wurde durch den entzündungshemmenden Faktor nicht beeinflußt, während die spätere, zellgesteuerte Phase der Reaktion deutlich gehemmt war. Weitere Experimente, in welchen MAIF in Intervallen vor oder nach der Carraageen-Injektion verabreicht wurde, lieferten einen zusätzlichen Beweis, daß MAIF seine entzündungshemmende Wirkung durch Modulieren der sekundären, neutrophilenvermittelten Entzündungsreaktion ausübte.
Es zeigte sich, daß der entzündungshemmende Faktor eine Halbwertzeit von 1-2 Stunden nach einer i.v. Injektion hat und die Entwicklung der Entzündung unterdrückt werden konnte, wenn der Faktor 30 Minuten nach der Belastung verabreicht wurde. Dieses Ergebnis ist für die mögliche therapeutische Verwendung des entzündungshemmenden Faktors relevant.
Das neutrophile Teilchen ist die Hauptzelle, die an der akuten Entzündungsreaktion beteiligt ist. Während der Arthus-Reaktion wurde eine > 80% Verringerung in der Ansammlung neutrophiler Teilchen nach einer MAIF-Verabreichung beobachtet, die ihrerseits mit einer äußerst signifikanten Hemmung der sekundären Merkmale der Entzündungsreaktion zusammenhing, nämlich der Ödeme und Blutung. Dieses Ergebnis wies ebenso auf die neutrophilen Teilchen als Ziel in der MAIF-induzierten Hemmung der Entzündung.
Einer der Schlüsselschritte in der Entwicklung einer Entzündung ist die Migration neutrophiler Teilchen aus dem Gefäßsystem in das Gewebe. Es zeigte sich, daß die intravenöse Verabreichung des entzündungshemmenden Faktors zu einer starken und dosisabhängigen Hemmung der Migration neutrophiler Teilchen führte. Bei einer Untersuchung der Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf die peripheren Blutleukozyten wurde ein deutlicher Anstieg in der Zahl zirkulierender neutrophiler Teilchen beobachtet, der von einer entsprechenden Abnahme in der Zahl der Lymphozyten begleitet war. Die Wirkung war ebenso dosisabhängig, aber im Falle des Anstiegs in der Anzahl neutrophiler Teilchen nicht linear.
Es zeigte sich, daß die Verabreichung des entzündungshemmenden Milchfaktors sowohl die Adhäsion neutrophiler Teilchen an das Endothel blockierte als auch die Lösung jener neutrophilen Teilchen förderte, die zum Zeitpunkt der Verabreichung anhafteten. Diese Wirkung ist wahrscheinlich das Ergebnis der Fähigkeit des entzündungshemmenden Faktors, die Wechselwirkung zwischen den Zelloberflächen-CD18-Antigenen und anderen Molekülen zu blockieren. Die Hemmung der CD18-Bindung durch den Faktor scheint spezifisch zu sein, da der Faktor die Bindung des monoklonalen Anti-CD18-Antikörpers an Zellen verhinderte, aber nicht ebenso die Bindung des monoklonalen Anti-CD11b- Antikörpers verhinderte.
Das Blockieren der intermolekularen Wechselwirkungen, an welchen das CD18- Zelloberflächenantigen beteiligt ist, kann auch die Beobachtung erklären, daß der Faktor imstande war, die Fähigkeit von Wirtlymphozyten, auf fremde Histokompatibilitätsantigene zu reagieren, zu hemmen. In anderen Versuchen zeigte sich, daß der entzündungshemmende Faktor die Concanavalin-induzierte mitogene Reaktion in Lymphozyten blockiert.
Schließlich unterdrückte der Faktor die frühe zelluläre Reaktion auf eine Infektion, eine Wirkung, die zu einer logarithmischen Zunahme der Bakterienzahl in einem Modell einer subkutanen Infektion führte. Diese Verstärkung der Infektion führte zu keinem Rebound der Entzündungsreaktion, wie bei anderen Mitteln beobachtet wird, die eine akute Entzündung bei einer Infektion unterdrücken. Ein zweiter Versuch, in dem ein klinisch relevantes Infektionsmodell, Pyelonephritis, verwendet wurde, zeigte auch eine suppressive Wirkung auf die Entzündung, die mit einer Erhöhung der Bakterienzahl verbunden war. Auch hier wurde keine Rebound-Wirkung beobachtet und es gab keinen Unterschied im Ausmaß des Gewebeschadens, der in den MAIF-behandelten und Kontrollgruppen auftrat.
Die folgenden Schlüsse können aus dieser Versuchsreihe gezogen werden:
1. Der entzündungshemmende Faktor, i.v. verabreicht, unterdrückt die sekundäre, neutrophilenvermittelte Phase der durch Carrageen ausgelösten Entzündungsreaktion.
2. Bei einer Bewertung im Carrageen-Fußballentest hatte der entzündungshemmende Faktor eine biologische Halbwertzeit von 1-2 Stunden und ist wirksam, selbst wenn er nach dem Herbeiführen einer Entzündung verabreicht wird. Anschließende Experimente zeigen, daß die wirksame Halbwertzeit sowohl von der Dosis als auch von dem verwendeten Entzündungsstimulus abhängig ist.
3. Der entzündungshemmende Faktor hemmt die Emigration neutrophiler Teilchen in vivo.
4. Die Verabreichung des entzündungshemmenden Faktors führt zu einem Anstieg in der Anzahl zirkulierender neutrophiler Teilchen und einer entsprechenden Abnahme in der Lymphozytenzahl.
5. Der entzündungshemmende Faktor hemmt die Abwehr des Wirtes gegen eine Infektion, wahrscheinlich über eine Wirkung auf die Emigration neutrophiler Teilchen.
6. Der entzündungshemmende Faktor blockiert die Wechselwirkungen zwischen Zelloberflächen-CD18-Antigenen und anderen Molekülen.
7. Der entzündungshemmende Faktor blockiert die Adhäsion neutrophiler Teilchen am Endothel.
8. Der entzündungshemmende Faktor fördert die Lösung anhaftender neutrophiler Teilchen vom Endothel.
9. Der entzündungshemmende Faktor blockiert die Fähigkeit von Wirtlymphozyten, auf fremde Histokompatibilitätsantigene anzusprechen.
10. Der entzündungshemmende Faktor blockiert die mitogene Reaktion von Lymphozyten.
Die in diesen Studien erhaltenen Versuchsdaten zeigen deutlich, daß der entzündungshemmende Milchfaktor eine deutliche Wirkung sowohl auf neutrophile Teilchen als auch Lymphozyten hat. Die beobachteten Wirkungen können das Ergebnis einer direkten Wirkung des entzündungshemmenden Faktors auf Zellen an sich sein, oder das Ergebnis der Unterdrückung (oder Stimulierung) eines anderen zellulären oder löslichen Mediators, der die biologischen Aktivitäten von Zellen indirekt verändert. Es ist auch allgemein anerkannt, daß die meisten pharmakologischen Mittel mehrfache Wirkungen haben, und es ist möglich, daß sich herausstellt, daß der entzündungshemmenden Faktor eine Reihe von anderen, bisher nicht identifizierten biologischen Prozessen beeinflußt.

BEISPIEL 24

Verfahren zum Erhalten eines hochgereinigten MAIF

Standardverfahren zur Herstellung von MAIF, ähnlich den zuvor in dieser Anmeldung beschriebenen, erzeugen ein gewisses Maß an Reinheit des MAIF aus Magermilch. Das folgende Protokoll ergab jedoch eine höher gereinigte MAIF-Zubereitung als zuvor erhältlich war.
Materialien. Chemikalen waren alle von Reagensgüte. Wasser, das für präparative Verfahren in großem Maßstab verwendet wurde, war steriles Wasser zu Injektionszwecken.
Standardisierte MAIF-Zubereitung. Für einen Vergleich der MAIF-Aktivitäten in verschiedenen Milchchargen von hyperimmunen Kühen oder von Kontrollkühen, wurde eine standardisierte Prozedur, die eine Ultrafiltration und Ionenaustausehchromatographie umfaßt, zur Herstellung einer teilweise gereinigten, hoch aktiven Probe verwendet. Ein passendes Volumen (3 bis 100 Liter) frischer, kalter Magermilch wurde einer Ultrafiltration durch die Minisette-Einheit (Omega-Membran) bei 0,21 MPa (30 psi) unterzogen, bis das Volumen des gesammelten Filtrates gleich 2/3 des Ausgangsvolumens der Milch war. Ein passendes Volumen eines standardisierten < 10.000 Dalton (< 10 K Dalton) Permeats (250 ml, 500 ml usw.) wurde auf eine DEAE-Säule aufgebracht, die 26,7% des Permeatvolumens betrug. Die Säule wurde mit einem Volumen entionisiertem Wasser zweimal jenem des Permeats gewaschen und mit einem Volumen von 0,15 M NaCl gleich 58,3% des Permeatvolumens eluiert. Die MAIF-Aktivität in den standardisierten DEAE-Zubereitungen wurde im Neutrophilenmigrationshemmtest (siehe unten) bestimmt und als Prozent Hemmung der Migration neutrophiler Teilchen definiert, die durch eine Dosis von 3 mg/120 - 150 g Ratte herbeigeführt wurde.

Hochgereinigte MAZF-Zubereitung

Ultrafiltration. 90 Liter frische, kalte (4ºC), nicht-pasteurisierte Magermilch von hyperimmunisierten Kühen wurde durch ein 25ºC in-line Erwärmungsbad gepumpt und dann durch eine Minisette (Filtron) Ultrafiltrationskassette geleitet, die eine Omega- (Modell #OS010C01) Membran mit einer Molekulargewicht-Abtrennung von < 10 K Dalton enthielt.
Der Einlaßdruck wurde bei 0,21 MPa (30 psi) gehalten. Das erhaltene Permeat (< 10K Permeat) wurde auf Eis gesammelt, bis ein Volumen von 60 Litern erhalten wurde. Das < 10K Permeat wurde unmittelbar zur weiteren Reinigung durch eine Ionenaustauschchromatographie verwendet oder wurde gefroren und bei -20ºC gelagert oder wurde lyophilisiert.
Ionenaustauschchromatographie. 60 Liter kaltes, frisches < 10K Permeat wurde direkt auf eine 37 cm · 15 cm Säule (Pharmacia, Modell KS 370/15), die 16 Liter Diethyl- Aminoethyl (DEAE)-Sepharose Fast Flow Ionenaustauschharz (Pharmacia #17-0709-05) enthielt, bei einer Flußgeschwindigkeit von 4,8 Liter/h unter Verwendung einer peristaltischen Niederdruckpumpe aufgebracht. Der Säulenablauf wurde bei 280 und 254 nm mit einem Pharmacia Dual Path UV Monitor (Modell 19-24217-01) aufgezeichnet. Die beladene Säule wurde mit 120 Litern sterilem entionisierten Wasser zur Elution ungebundenen Materials gewaschen, bis die 280 nm Extinktion des Ablaufs zur Basislinie zurückkehrte. Gebundene Komponenten wurden mit 35 Litern 0,15 M NaCl eluiert. Das Säuleneluat wurde lyophilisiert und in Braunglasfläschchen im Dunkeln gelagert. Die MAIF-Aktivität in den Säuleneluaten wurde im Neutrophilenmigrationshemmtest (siehe unten) bestimmt.
Größenausschlußchromatographie. Teilweise gereinigte DEAE-Zubereitungen von MAIF wurden auf einer präparativen TSK G2500PW (21,5 · 600 mm) Größenausschluß- HPLC-Chromatographiesäule (TosoHaas, Montgomeryville, PA), die mit 0,15 M NH&sub4;OAc äquilibriert war, auf einem Hewlett-Packard Modell 1090 HPLC mit einer automatischen Einspritzvorrichtung und einem Diodenarraydetektor getrennt. Lyophilisierter DEAE-MAIF (100 mg) wurde in 0,25 ml 0,25 M NH&sub4;OAc aufgelöst und auf die Säule aufgespritzt. Die Säule wurde mit 0,15 M NH&sub4;OAc bei einer Flußgeschwindigkeit von 5 ml/min eluiert. Der Ablauf wurde bei 220 und 280 nm aufgezeichnet, die Diodenarraydaten wurden jedoch für alle Wellenlängen zwischen 190 und 600 nm gespeichert. Fraktionen (9 ml) wurden auf einem LKB ultrorac Fraktionensammler gesammelt. Zur Herstellung großer Mengen an einem LKB ultorac Fraktionssammler gesammelt. Zur Herstellung großer Mengen an MAIF wurden mehrere Proben von jeweils 100 mg auf der TSK Säule getrennt und in demselben Röhrchensatz gesammelt. Die Röhrchen, die den aktiven Faktor enthielten, wurden gepoolt, lyophilisiert und gewogen.
Organische Verteilungsextraktion. MAIF wurde selektiv von gebundenen Salzen durch ein organisches Verteilungsextraktionsverfahren isoliert, in dem die halbgereinigte TSK-MAIF Probe in destilliertem Wasser aufgelöst, alkalisiert, zur Entfernung neutraler Lipide mit n-Hexan extrahiert, angesäuert und dann mit Ethylacetat extrahiert wurde. 50 bis 100 mg des TSK-MAIF wurden in 2 ml entionisiertem Wasser in einem gewogenen Extraktionsgefäß aufgelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 4 Tropfen 0,02 N NH&sub4;OH auf 8,0 eingestellt. Zwei Milliliter n-Hexan wurden zugegeben und die Mischung heftig geschüttelt. Die obere Phase, die aus Hexan bestand, wurde entfernt, getrocknet und gewogen. Die übrige wässerige Lösung wurde mit 100 Tropfen Zitronensäure auf pH 3,5 angesäuert. Fünf Milliliter Ethylacetat wurden hinzugefügt und die Mischung heftig geschüttelt und bei 1000 U/min zur Trennung der Schichten zentrifugiert. Die Ethylacetatschicht wurde in ein gewogenes Gefäß überführt. Diese Extraktion wurde mit einem zweiten 5 ml Volumen Ethylacetat wiederholt. Die Ethylacetatschichten wurden vereint, unter Stickstoff getrocknet und gewogen.
Schwache Anionenaustauschchromatographie. Eine Aminopropyl-Supelcosil (Supelco) HPLC-Säule wurde zur Trennung schwach ionischer, negativ geladener MAIF- Komponenten verwendet, die durch das Ethylacetatextraktionsverfahren von gebundenen Salzen befreit worden waren. Die aminogebundene Säule, die als schwacher Anionenaustauscher mit wässerigen Puffern dient, wurde mit 78% ACN/H&sub2;O äquilibriert. Eine 50 mg TSK-MAIF Probe wurde in 25% ACN/3 mM NH&sub4;OAc aufgelöst und auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde bei einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einem dreiteiligen Elutionssystem, das aus 78% ACN/H&sub2;O bis 69% ACN/3 mM NH&sub4;OAC bestand von 0-15 min eluiert, worauf 69% ACN/3 mM NH&sub4;OAC bis 65% ACN/3 mM NH&sub4;OAC von 15-30 min folgte. Das Säuleneluat wurde bei 220 und 280 nm aufgezeichnet. Ausgewählte Fraktionen wurden auf MAIF-Aktivität im Neutrophilenmigrationshemmtest (siehe unten) getestet.
Neutrophilenmigrationshemmtest. Die entzündungshemmende Aktivität des MAIF wurde in einem pleuralen Neutrophilenmigrationshemmtest bestimmt. Weiblichen, weißen Laborratten, die 120 bis 150 g wogen, wurde 1.0 ml 1% Kappa-Carrageen in PBS intrapleural injiziert, um eine Migration neutrophiler Teilchen in die Pleurahöhle auszulösen. Den Ratten wurden sofort intraperitoneal 0,5 ml Dosen von MAIF-Proben in PBS injiziert. PBS wurde als Kontrolle verwendet. Nach vier Stunden wurden die Ratten getötet, Pleura- Exsudat gesammelt und die emigrierten neutrophilen Teilchen gezählt.

ERGEBNISSE

Standardisierung präparativer Verfahren. Reproduzierbare Methoden, welche die Ultrafiltration und DEAE-Säulenverfahren beinhalten, und Analysen vergleichbarer Proben im Ratten- Neutrophilenmigrationshemmtest wurden für die Herstellung hochaktiver MAIF- Zubereitungen erstellt. Die Verwendung standardisierter Reinigungsverfahren ermöglichte eine Quantifizierung der MAIF-Aktivität in spezifischen Milchprodukten und in Herstellungschargen im großtechnischen Maßstab. Zur Auswertung der standardisierten Methode wurde MAIF aus hyperimmuner Milch, aus Kontrollmilch, die von nicht immunisierten Kühen erhalten wurde, und aus einem handelsüblichen Milchpulver hergestellt und blind im Neutrophilenmigrationshemmtest getestet. Die MAIF-Proben wurden in Dosen von 0,5, 1,5, 3,5 und 8 mg/120-150 g Ratten auf ihre Fähigkeit getestet, die Migration neutrophiler Teilchen zu den Entzündungsstellen zu hemmen (Fig. 39). MAIF von hyperimmuner Milch erzeugte eine maximale Hemmung neutrophiler Teilchen von mehr als 70% bei der 3 mg Dosis. Frische Kontrollmilch und handelsübliche Kontrollmilch erzeugten jeweils nur 18% Hemmung bei der 3 mg Dosis. Die Aktivität des standardisierten MAIF, der aus hyperimmuner Milch hergestellt wurde, wurde mit Sialsäure und Orotsäure verglichen, bekannten Komponenten von Milch, von welchen angenommen wird, daß sie entzündungshemmende Aktivität besitzen (Fig. 40), und mit zwei entzündungshemmenden Heilmitteln (Fig. 41). Weder die Sialsäure noch die Orotsäure zeigten eine hemmende Aktivität auf die Migration neutrophiler Teilchen bei Ratten in den getesteten Dosen. Indomethacin wies eine 35% Hemmungsaktivität bei einer Dosis von 0,5 mg/120-150 g Ratte auf, wobei aber die Hemmung auf 30% bei 3 mg/120-150 g Ratte fiel und bei höheren Dosen ständig abnahm. Aspirin, in Dosen für Ratten, die den Dosen für Menschen äquivalent waren, zeigte eine geringere als 10% Hemmung und erreichte den höchsten Hemmungswert nur bei Dosen von etwa dem 100-Fachen der dem Menschen äquivalenten Ratten-Dosis.
MAIF Reinigung durch präparative HPLC. Die Verwendung der DEAE-Ionenaustauschchromatographie zur Herstellung von MAIF führte zu einer 25-fachen Reinigung der entzündungshemmenden Aktivität in bezug auf das < 10K Permeat. Die Analyse der Zusammensetzung des DEAE-abgeleiteten MAIF durch Größenausschluß-HPLC (Fig. 42) zeigte die Gegenwart von zwei Hauptkomponenten bei 17 und 25 Minuten und sechs oder mehr kleineren Komponenten, die zwischen 30 und 60 Minuten eluierten. Die Analyse gepoolter Fraktionen im Neutrophilenmigrationshemmtest zeigte, daß die Hauptkonzentration der MAIF-Aktivität im 25 Minuten Peak auftrat. Diese Ergebnisse zeigen, daß ein präparativer Größentrennungsschritt die Herstellung einer höher gereinigten MAIF-Zubereitung ermöglichte. Versuche, vergleichbare Ergebnisse auf einem präparativen Flüssigchromatographiemedium zu erreichen, lieferten keine angemessenen Trennungen. Eine präparative HPLC TSK2500PW Säule, eluiert mit 0.5 M NH&sub4;OAc, lieferte eine ausgezeichnete Trennung des 25 Minuten MAIF-Peaks. DEAE-MAIF wurde auf der HPLC Säule in 100 mg Läufen getrennt und der gepoolte 25 Minuten Peak wurde lyophilisiert. Der 0,15 M NH&sub4;OAc Elutionspuffer wurde gewählt, da alle Puffersalze während der Lyophilisierung von den isolierten MAIF Proben vollständig entfernbar wären. Als jedoch wiederholte 100 mg Läufe von DEAE-MAIF durch präparative HPLC fraktioniert wurden, wiesen die gewonnenen Gewichte des 25 Minuten Peaks nur eine 10% Gewichtsverringerung auf. Die Elementaranalyse des MAIF-Peak zeigte, daß mehr als 40% des Gewichts Salz zugeschrieben werden konnte. Mehrere Salze, einschließlich Natriumchlorid, Natriumacetat und Magnesiumchlorid, wurden getestet, um ihre Elutionsposition auf der TSK 2500PW Säule zu bestimmen. Jedes Salz eluierte zwischen 35 und 40 Minuten. Dieses Ergebnis zeigte, daß Salz spezifisch durch die MAIF-Verbindung gebunden war, die bei 25 Minuten eluierte.
Beseitigung des kontaminierenden Salzes. Zur Befreiung der MAIF-Verbindung von gebundenen Salzen wurde ein organisches Verteilungsextraktionsverfahren verwendet, in dem die HPLC-gereinigte MAIF-Zubereitung alkalisiert wurde, um negativ geladene Gruppen freizulegen, und mit Hexan extrahiert wurde, um hexanlösliche Kontaminanten zu entfernen. Die wässerige Phase wurde dann angesäuert, um negative Ladungen zu protonieren, in Ethylacetat extrahiert und gewogen. Der extrahierte Rückstand wies eine Gewichtsverringerung von mehr als 96% auf. Die Analyse der getrockneten Ethylacetatfraktion im Neutrophilenmigrationshemmtest zeigte eine starke MAIF Aktivität und erforderte eine bis zu 10.000-fach verringerte Dosis des hochgereinigten MAIF, um denselben Wert der Neutrophilenmigrationshemmung zu erhalten, wie MAIF vor der organischen Verteilungsextraktion erreichte (Fig. 43). Die Analyse der MAIF-Verbindung auf einer Aminopropylschwachen Anionenaustauschsäule vor und nach der Extraktion zeigte eine signifikante Verschiebung in der Elutionsposition der übrigen Komponenten und einen Verlust einer Schulter in dem Profil (Fig. 44). Diese Ergebnisse zeigten, daß die Verteilungsextraktionsmethode zu der Entfernung der kontaminierenden gebundenen Salze führte und die Herstellung einer höhergereinigten MAIF-Zubereitung als zuvor erhältlich war ermöglicht.
Die standardisierte MAIF-Methode erzeugt eine hochaktive, teilweise gereinigte Form von MAIF in Mengen, die für die Durchführung von Zusammensetzungs- und Strukturstudien ausreichend sind. MAIF, der durch diese Methode hergestellt wird, weist eine hohe Aktivität im Vergleich zu MAIF von Kontrollmilch oder zu postulierten oder bekannten entzündungshemmenden Heilmitteln auf. Die Verwendung der präparativen TSK HPLC zum Fraktionieren von MAIF ist in der Herstellung eines reineren MAIF effektiv, wobei aber Salze unerwartet an der MAIF-Verbindung gebunden bleiben. Die organische Verteilungsextraktion der MAIF-Verbindung in Ethylacetat ermöglicht die Entfernung der kontaminierenden Salze, wodurch eine Herstellung in großem Maßstab des hochgereinigten MAIF möglich ist.
Nachdem diese Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird für den Fachmann offensichtlich, daß viele Änderungen und Modifizierungen durchgeführt werden können, ohne deren Umfang zu beeinträchtigen. Solche Änderungen und Modifizierungen sind auch in Betracht gezogene Aspekte der Erfindung.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung eines entzündungshemmenden Faktors aus Magermilch (MAIF), das folgende Schritte umfasst:

i) Ultrafiltration der Milch durch ein Filter mit einer Molekülgewicht-Abtrennung von 10.000 Dalton;

ii) Sammeln eines < 10.000 Dalton Permeats aus Schritt (i);

iii) Aufbringen des Permeats auf eine erste Ionenaustauschsäule und Waschen der säule mit deionisiertem Wasser;

iv) Sammeln des Eluats aus Schritt (iii);

v) Trennen des Eluats aus Schritt (iv) in einer präparativen Größenausschluss-HPLC- Chromatographiesäule und Sammeln des Eluats; und

vi) Durchführung einer organischen Verteilungsextraktion von dem Eluat, das aus der präparativen Größenausschluss-HPLC-Chromatographie erhalten wurde und Gewinnen des wässrigen Extraktes aus der Extraktion.

2. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiters den Schritt einer schwachen Anionen-austauschchromatographie des wässrigen Extraktes umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Harz in der ersten Ionenaustauschsäule ein Schnell-Durchfluss-Diethyl-Aminoethyl (DEAE)-Sepharose-Ionenaustauschharz ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die präparative Größenausschluss-HPLC-Säule eine TSK G2500PW Größenausschlusssäule ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei, in Schritt (vi), die organische Verteilungsextraktion weiters umfasst:

i) Extraktion mit Hexan und NH&sub4;OH;

ii) Rückextraktion der wässrigen Phase aus Schritt (i) mit Ethylacetat; und

iii) Sammeln des Ethylacetat-Extrakts.

6. Verfahren nach Anspruch 5, welches weiters umfasst:

i) Aufbringen des Ethylacetat-Extrakts auf eine schwache Anionenaustauschsäule; und

ii) Entwickeln der Säule mit einem dreiteiligen Elutionssystem.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Ultrafiltrationsschritt mit etwa 90 bis 225 Liter Magermilch beginnt und der Ionenaustauschschritt mit etwa 60 bis 150 Liter des Permeats beginnt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei man die HPLC-Größenausschlusschromatographie mit 100 mg MAIF aus einem DEAE-Ionenaustauschschritt beginnt.

9. Gereinigter entzündungshemmender Faktor, der aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich ist.

10. Gereinigter entzündungshemmender Faktor zur Verwendung in der Medizin, der aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich ist.

11. Verwendung von MAIF, das aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Mittels zur:

Hemmung der neutrophilen Migration;

Hemmung der Entzündungsreaktion;

Hemmung neutrophiler Teilchen vom Anhaften an Endothelzellen in Säugetieren;

Abtrennung neutrophiler Teilchen, die sich an Endothelzellen in Säugetieren angeheftet haben;

Hemmung der Wechselwirkung zwischen in Säugetieren vorhandenen CD18-Zelloberflächen-Antigenen und Molekülen, die in der Lage sind, an die CD18-Zelloberflächen- Antigene zu binden;

Hemmung des Abwanderns von Leukocyten aus dem venösen System von Säugetieren; oder

Unterdrückung der mitogenen Antwort von Lymphocyten in einem Säugetier-Wirt auf fremde Antigene.

12. Verwendung nach Anspruch 11 zur Herstellung eines Mittels zur Abtrennung von neutrophilen Teilchen, die sich an Endothelzellen in Säugetieren angeheftet haben, wobei die neutrophilen Teilchen sich als Antwort auf den Thrombocyten-Aktivierungsfaktor an die Endothelzellen geheftet haben.

13. Verwendung nach Anspruch 11 zur Herstellung eines Mittels zur Hemmung der Abwanderung von Leukocyten aus dem venösen System von Säugetieren, wobei die Leukocyten neutrophile Teilchen sind.

14. Verwendung nach Anspruch 11 zur Herstellung eines Mittels zur Unterdrückung der mitogenen Antwort von Lymphocyten in einem Säugetier-Wirt auf fremde Antigene, wobei die Antigene auf der Zelloberfläche sind.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Zellen Leukozyten oder Lymphocyten sind.

16. Verwendung von MAIF, die aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhältlich sind, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer Entzündung und entzündlichen Zuständen wie akute und subakute Bursitis, akute unspezifische Tendonitis, systemische Lupus Erythematosus, systemische Dermatomyositis, akute rheumatische Carditis, Pemphigus, bulöse Dermatitis, Herpetiformis, schwere Verbrennungen, multiforme abblätternde Dermatitis, Zirrhose, saisonbedingte dauernde Rhinitis, bronchiales Asthma, ektopische Dermatitis, Serum Sickness, Hornhautentzündung, Ophthalmicus Iritis, diffuse Ureitis, Chorditis, Entzündung des Sehnervs, sympathische Bindehautentzündung, symptomatische Sarcoidosis, Loeffler's Syndrom, Berylliose, hämolytische Anämie, Mastitis, Mastoiditis, Kontaktdermatitis, allergische Konjunktivitis, psoriatische Arthritis, versteifende Spondylitis, akute gichtische Arthritis und Herpes Zoster.

17. Pharmazeutische Formulierung welche MAIF, das aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhalten werden kann, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel.