DE69520569T2

DE69520569T2 - Mittel für die behandlung von störungen des blutgerinnungsprozess

Info

Publication number: DE69520569T2
Application number: DE69520569T
Authority: DE
Inventors: Koenraad Mertens; Aart Van Mourik; Jacobus Voorberg
Original assignee: Stichting Sanquin Bloedvoorziening
Current assignee: Stichting Sanquin Bloedvoorziening
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 2001-10-04
Anticipated expiration: 2015-04-22
Also published as: WO1995029259A1; ES2157326T3; JP3810080B2; CA2188463C; DK0756638T3; AU697205B2; CA2188463A1; JPH09512425A; US6083905A; EP0756638B1; ATE200225T1; GR3036000T3; AU2319495A; EP0756638A1; DE69520569D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Behandlung (genetischer) Krankheiten, die zu Störungen in der Blutgerinnungskaskade führen, welche in Blutungsstörungen resultieren können.
Die Aufrechterhaltung einer normalen Hämostase erfordert ein genaues Gleichgewicht der Pro- und Anti-Koagulans-Mechanismen, die bei der Blutgerinnung involviert sind. Eine Dysfunktion eines der Proteine kann zu Blutungsneigungen oder thrombotischen Reaktionen führen. Ein molekularer Defekt in einem der Pro-Koagulans-Proteine ist im Allgemeinen mit Blutungsneigungen assoziiert, die durch Substitutionsbehandlung überwunden werden können. Dies wird am Besten durch die Blutungskrankhkeit Hämophilie A veranschaulicht, die mit einem funktionellen Fehlen von Faktor VIII, einem essentiellen Cofaktor bei der Umwandlung von Faktor X in Faktor Xa durch aktivierten Faktor IX, assoziiert ist (Kane und Davie, 1988, Blood, Bd. 71, 539-555). Die Diagnose einer Blutungsneigung wird durch einfache Labortests durchgeführt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Außerdem wurden spezifischere Assays entwickelt, die chromogene Substrate in Verbindung mit gereinigten Blutgerinnungsfaktoren verwenden, die eingesetzt werden, um die genauen Level an verschiedenen Pro-Koagulans- Proteinen zu überwachen. Derzeit stehen adäquate Diagnosetechniken zur Verfügung, um die Hauptdefizientien, die bei Patienten mit Blutungsneigung beobachtet werden, zu überwachen.
Der Anti-Koagulans-Weg, der letztlich in der Inaktivierung der Pro-Koagulans- Cofaktoren V und VIII durch APC resultiert, wurde in beachtlichem Detail beschrieben (Esmon, C. T. 1993, Thromb. Haemost., Bd. 70, 29-35). Protein 5 wurde als Cofaktor mit der Inaktivierung sowohl von Faktor V wie auch Faktor VIII in Verbindung gebracht, obgleich der Effekt von Protein S auf die katalytische Spaltungseffizienz sowohl von Faktor V wie von Faktor VIII relativ gering ist (Koedam et al., 1988, J. Clin. Invest., Bd. 82, 1236-1243; Kalafatis und Mann., 1993, J. Biol. Chem., Bd. 268, 27246-27257). Ein funktionelles Fehlen eines der Proteine, die in den Anti-Koagulans-Weg involviert sind, ist im Allgemeinen mit Thrombose verbunden. Es wurde festgestellt, dass molekulare Defekte in mehreren Proteinen, die in den Anti- Koagulans-Weg involviert sind, mit thrombotischen Reaktionen verbunden sind. Eine homozygote Protein-C-Defizienz steht klar mit schweren thrombotischen Reaktionen in Verbindung, welche durch eine Substitutionsbehandlung korrigiert werden kann (Dreyfus et al., 1991, N. Eng. J. Med., Bd. 325, 1565-1568). Eine heterozygote Protein-C-Defizienz kann auch als erhöhtes Thromboserisiko angesehen werden (Bertina et al., 1982, Thromb. Haemost., Bd. 48, 1-5), obgleich zumindest in einigen Fällen zusätzliche Faktoren involviert zu sein scheinen (Miletich et al., 1987, N. Eng. J. Med., Bd. 317, 991-996). Ähnlich wie Protein-C-DeFzienz ist Protein-S- Defizienz mit einem erhöhten Thromboserisiko verbunden (Comp et al., 1980, J. Clin. Invest., Bd. 74, 2082-2088). Relativ seltene genetische Defekte bei Anti-Thrombin III, Fibrinogen und Plasminogen wurden ebenfalls mit Thrombose in Verbindung gebracht. Summa summarum bedeutet das, dass verschiedene Defizientien an Proteinen, die am Anti-Koagulans-Weg beteiligt sind, mit einem erhöhten Thromboserisiko in Verbindung gebracht wurden. Allerdings bieten die oben ausgeführten Defizientien bei nicht mehr als 10 bis 30% der Patienten, die an einer thromboembolischen Krankheit leiden, eine Erklälrung, während der Rest der Fälle ungeklärt bleibt (Heijboer et al., 1990, N. Eng. J. Med. 22, 1512-1516). Neuere Fortschritte haben den prozentualen Anteil an ungeklärten Thrombosen auf 40 bis 60% gesenkt. Dahlbäck und Mitarbeiter haben bei einem Patienten, der an multiplen thrombotischen Vorfällen litt, eine Resistenz gegenüber APC beobachtet (Dahlbäck et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90, 1004- 1008). Ein Assay, der auf der Verlängerung der Gerinnungszeit durch APC, gemessen in der partiellen Thromboplastinzeit (APTT), basiert, wurde verwendet, um den Defekt zu analysieren. Es wurde keine Verlängerung der APTT bei Zusatz von APC beobachtet, was einen Defekt im Anti-Koagulans-Weg anzeigt. Andere Gruppen haben das Auftreten von APC-Resistenz bei Patienten, die an einer Thrombose der tiefen Vene litten, bestätigt, und umfangreichere durchgeführte Untersuchungen zeigen, dass 20 bis 40% der Patienten, die an thrombotischen Episoden leiden, eine Resistenz gegenüber APC zeigen (Griffin et al., 1992, Blood, Bd. 82, 1989- 1993; Koster et al., 1993, Lancet, Bd. 342, 1503-1506).
Der Phänotyp APC-Resistenz ist nicht auf Patienten beschränkt, die an Venenthrombose leiden. Verschiedene Untersuchungen haben dokumentiert, dass APC-Resistenz bei etwa 2 bis 5% der normalen Bevölkerung vorliegt. Die molekulare Basis der APC-Resistenz blieb für einige Zeit unklar. Eine jüngere Untersuchung zeigte, dass der Phänotyp APC-Resistenz durch Zusatz von gereinigtem Faktor V zu dem Plasma betroffener Individuen überwunden werden kann (Dahlbäck und Hildebrand, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91, 1396-1400). Obgleich diese Beobachtung eine Bindung der APC-Resistenz an Faktor V nahelegt, wurde für das Auftreten der Resistenz gegenüber APC im molekularen Level keine ausreichende Erklärung gegeben.
Wenn der Grund oder die Gründe für diese Resistenz identifiziert werden könnten, würde dies zu einem besseren Verständnis thrombolytischer Erkrankungen wie auch zu besseren Nachweisverfahren für solche Erkrankungen und möglicherweise zu neuen und besseren Wegen der Behandlung oder Prophylaxe dieser Erkrankungen und anderer Erkrankungen in der Blutgerinnungskaskade führen.
Die vorliegende Erfindung identifiziert einen wahrscheinlichen Grund für diese Resistenz.
Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen Blutgerinnungsfaktor V umfasst, der resistent gegen aktiviertes Protein C ist.
Bisher wurde keine Aufmerksamkeit auf das Auftreten von Mutationen an den Spaltstellen für APC in Faktor VIII und Faktor V, die mit der Inaktivierung dieser Pro-Koagulans- Proteine wechselwirken, berichtet. Untersuchungen, die gereinigte Proteine verwenden, haben gezeigt, dass eine Inaktivierung von Faktor VIII durch Spaltung an der Peptidbindung Arg&sup5;&sup6;²- Gly&sup5;&sup6;³ wie auch an der Peptidbindung Arg³³&sup6;-Met³³&sup7; auftritt. Eine Inaktivierung von Faktor VIII durch APC entspricht einer Spaltung an Position Arg&sup5;&sup6;² (Fay et al., 1991, J. Biol. Chem., Bd. 266, 20139-20145). Eine Inaktivierung von Faktor V durch APC wurde im Detail für Rinder- Faktor V beschrieben (Kalafatis und Mann, 1993, J. Biol. Chem., Bd. 268, 27246-27257). Eine proteolytische Inaktivierung von Rinder-Faktor V durch APC erfolgt an den Peptidbindungen Arg³&sup0;&sup6;-Gln³&sup0;&sup7;, Arg&sup5;&sup0;&sup5;-Gly&sup5;&sup0;&sup6; und Arg&sup6;&sup6;²-Gln&sup6;&sup6;³ der schweren Kette. Die leichte Kette von Rinder-Faktor V wird an der Peptidbindung Arg¹&sup7;&sup5;²-Arg¹&sup7;&sup5;³ oder Arg¹&sup7;&sup5;³-Ala¹&sup7;&sup5;&sup4; gespalten, obgleich es unklar ist, ob eine Spaltung an dieser Stelle mit einem Aktivitätsverlust assoziiert ist (Kalafatis und Mann, 1993, J. Biol. Chem., Bd. 268, 27246-27257). Ein Vergleich der Sequenzen von humanem Faktor V und Rinder-Faktor V zeigt eine beachtliche Homologie zwischen den beiden Proteinen (Guinto et al., 1992, J. Biol. Chem., Bd. 267, 2971-2978). Auf der Basis dieser Homologie wurden APC-Spaltstellen für humanen Faktor V definiert (Fig. 2; siehe Tabelle I). Ähnlich wie bei Faktor VIII führt eine Mutation an der APC-Spaltstelle von Faktor V zu einer verlängerten Pro-Koagulans-Aktivität.
Eine Anzahl der APC-Spaltstellen, die sowohl in Faktor V als auch in Faktor VIII vorhanden sind, wurden beschrieben und werden aus der Literatur abgeleitet, allerdings beinhaltet die vorliegende Erfindung auch neue Spaltstellen für APC in dem Cofaktorprotein Faktor V. Die genetische Analyse der Spaltstellen für APC in dem Cofaktorprotein V umfasst eine selektive Amplifikation von Faktor-V-DNA-Sequenzen, die eine Spaltstelle für aktiviertes Protein C beherbergen, und ein Durchmustern des amplifizierten Fragments auf das Auftreten von Mutationen. Eine Mutation an einer APC-Spaltstelle ist als Deletion oder Substitution eines Basenpaares oder mehrerer Basenpaare in einem der Codons, die die APC-Spaltstellen von Faktor V bilden oder umgeben. Faktor V-Sequenzen können selektiv durch RNA- Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Ausgangsmaterial zur Amplifikation von Faktor V-Sequenzen, die eine Spaltstelle für aktiviertes Protein C beherbergen, umfassen RNA, cDNA, die durch reverse Transkriptaseaktivität von RNA abgeleitet ist, oder genomische DNA. Genomische DNA und RNA stammen von Gewebe- oder Blutzellen von Patienten und werden nach Verfahren, die auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, isoliert. Der Nachweis einer Mutation an den Spaltstellen für APC in Faktor V kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, die die folgenden umfassen, aber nicht auf diese beschränkt sind:
1. Selektive Hybridisierung: ein Oligonukleotidprimer wird aufgebaut, der zwischen RNA, cDNA oder genomischer DNA, die eine Mutation einer Spaltstelle für APC enthält, und RNA, cDNA oder genomischer DNA, die keine Mutation an einer Spaltstelle für APC enthält, selektiert. Dieser Oligonukleotidprimer kann eine oder mehrere Fehlpaarungen bezüglich der Wildtyp-Faktor-V- und -VIII-Sequenz enthalten. Die Wildtyp-Faktor-V-Sequenz und die Wildtyp-Faktor-VIII-Sequenz sind so definiert, wie es in der Literatur angegeben ist, wobei Polymorphismen eingeschlossen sind. Die Detektion der gebildeten Hybride kann nach einer der vielen Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet zur Verfügung stehen, durchgeführt werden, wobei diese Verfahren die folgenden einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind: die Verwendung von markierten Hybridisierungssonden, wobei die Markierungen direkt oder indirekt sein können, eine direkte Markierung bedeutet Markierungen wie Goldsole, radioaktive Isotope, fluoreszierende Substanzen und dergleichen, und indirekte Markierungen schließen Enzyme ein; oder Ligand-Antiligand-Wechselwirkungen, wie z. B. Avidin oder Streptavidin mit Biotin oder die Verwendung von Antikörper-erkennender Duplex usw.
2. Fehlpaarungs-PCR: ein beliebiger Oligonukleotidprimer, der in Verbindung mit einem weiteren Oligonukleotidprimer selektiv ein Fragment aus RNA, cDNA oder genomischer DNA, das eine Mutation enthält, amplifiziert und ein Fragment aus RNA, cDNA oder genomischer DNA, das keine Mutation an den Spaltstellen enthält, nicht amplifiziert. Auch Oligonukleotidprimer, die von Fachleuten auf diesem Gebiet konstruiert wurden, die selektiv ein Fragment aus RNA, cDNA oder genomischer DNA, das keine Mutation an den Spaltstellen enthält, selektiv amplifiziert und ein Fragment aus RNA, cDNA oder genomischer DNA, das eine Mutation trägt, nicht amplifiziert, ist eingeschlossen. Diese Oligonukleotidprimer können eine oder mehrere Fehlpaarungen bezüglich der Wildtyp-Faktor-V- und -Faktor-VIII-Sequenz enthalten.
3. PCR-Amplifikation mit anschließender Restriktionsanalyse: dieses Verfahren beinhaltet die Amplifikation eines Fragments, das einen Teil der DNA-Sequenz von Faktor V und Faktor VIII, das diese Spaltstellen enthält, beherbergt, gefolgt von einem Abbau mit Restriktionsenzymen, die DNA-Sequenzen erkennen, die entweder in DNA-Sequenzen, welche von Patienten stammen, die eine Mutation an diesen Spaltstellen tragen, vorliegen oder die in der nativen Faktor-V- und -VIII-Sequenz vorliegen. In Tabelle 11 wurden Oligonukleotidprimer definiert, die verwendet werden können, um Mutationen der Spaltstelle für APC an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V und an der Aminosäureposition Arg³³&sup6; und Arg&sup5;&sup6;² von Faktor VIII zu zeigen. Ähnliche Strategien können für das Auftreten von Mutationen an der Aminosäureposition Arg³&sup0;&sup6;, Arg&sup6;&sup7;&sup9; und Arg¹&sup7;&sup6;&sup5; von Faktor V und anderen Spaltstellen für APC konstruiert werden.
4. Sequenzanalyse: dieses Verfahren beinhaltet eine direkte Analyse der DNA-Sequenz, die diese Spaltstellen umgibt und bildet. Dieses Verfahren beinhaltet ein beliebiges Protokoll, das derzeit einem Fachmann zur Verfügung steht oder verfügbar sein wird, um eine direkte Bestimmung der DNA- oder RNA-Sequenz durchzuführen, die für diese Spaltstellen codiert.
Weitere Verfahren, die zwischen RNA, cDNA oder genomischer DNA, die eine Mutation an den Spaltstellen für APC enthält, und RNA, cDNA oder genomischer DNA, die keine Mutation an einer Spaltstelle für APC enthält, unterscheiden, können von einem durchschnittlichen Fachmann bestimmt werden.
Beispiel 1 liefert Details über die Detektion von Mutationen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V und veranschaulicht die allgemeine Anwendung dieser Verfahren für die Detektion von Mutationen an Spaltstellen für APC.
Das Wissen, dass die Mutantenfaktoren existieren, kann therapeutisch ausgenutzt werden. Da die Mutationen oder besser die Mutationsstellen, die zu APC-Resistenz führen, nun identifiziert wurden, ist es möglich geworden, diese Mutanten als therapeutische Mittel auf dem Gebiet der Blutungskrankheiten zu verwenden.
Die Behandlung von Blutungskrankheiten wird normalerweise durch eine Substitutionsbehandlung mit Präparaten, die aus (teilweise) gereinigten Gerinnungsfaktoren bestehen, durchgeführt. Die gängigste Blutungskrankheit ist Hämophilie A, die ein Resultat des funktionellen Fehlens von Faktor VIII ist. Die Behandlung von Patienten, die an Hämophilie A leiden, hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen. Anfangs wurde Kryopräzipitat, das Faktor VIII enthält, zur Behandlung von Hämophilie-A-Patienten verwendet. Konzentrate mittlerer Reinheit, die durch partielle Reinigung von Faktor VIII aus Kryopräzipitat erhalten werden, stellen eine Verbesserung der Therapie dar. Eine weitere Verbesserung wird durch die Verwendung von monoclonalen Antikörpern, die auf Faktor VIII und von Willebrand-Faktor gerichtet sind, bereitgestellt, wobei Faktor-VIII-Präparationen erhalten werden, die fast ausschließlich aus Faktor VIII bestehen (Hoyer, L. W., 1994, N. Eng. J. Med., Bd. 330, 38-47). In jüngerer Zeit wurde rekombinanter Faktor VIII, erhalten aus Tierzellen, in den die Faktor-VIII-cDNA eingeführt worden war, für die Behandlung verfügbar.
Rekombinante DNA-Technologie stellt die Gelegenheit bereit, unbegrenzte Mengen an Faktor VIII zu produzieren. Außerdem ermöglicht die rekombinante DNA-Technologie es uns, die funktionellen Eigenschaften von Faktor VIII zu optimieren, wodurch eine Behandlung von Patienten, die an Hämophilie A leiden, verbessert wird. Wir können nun von Faktor V abgeleitete Proteine bereitstellen, die gegenüber APC resistenter sind als Wildtyp-Faktor-V.
Trotz der Tatsache, dass in den letzten 20 Jahren ein beachtlicher Fortschritt in der Behandlung von Patienten mit Hämophilie A erzielt wurde, bleibt eines der Hauptprobleme, die mit der Faktor-VIII-Substitutionsbehandlung assoziiert sind, ungelöst. Bei etwa 5 bis 20% der Hämophilie-A-Patienten, die mit Faktor VIII behandelt werden, entwickeln sich Antikörper, die die Faktor-VIII-Aktivität inhibieren (Ehrenforth et al., 1992, Lancet, Bd. 339, 594-598). Diese sogenannten Faktor-VIII-Inhibitoren treten bei 5- bis 20tägigem Faktor-VIII-Ausgesetztsein auf und können ernste klinische Komplikationen hervorrufen (Aledort, L. 1994, Am. J. of Haemat., Bd. 47, 208-217). Eine Untersuchung des Auftretens von Faktor-ViII-Inhibitoren bei Patienten, die mit unterschiedlichen Faktor-VIII-enthaltenden pharmazeutischen Präparaten behandelt wurden, zeigt keine starken Unterschiede. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine Entwicklung von Faktor-VIII-Inhibitoren normalerweise nicht mit den verabreichten Faktor-VIII- Präparaten in Beziehung steht. Es wurden verschiedene Protokolle zur Behandlung von Inhibitoren bei Hämophilie-A-Patienten eingeführt. Niedrige oder mäßige Inhibitorkonzentrationen werden normalerweise durch Verabreichung von Faktor VIII in hohen Dosen behandelt (Hoyer, L. W. 1994, N. Eng. J. Med., Bd. 330, 38-47). Außerdem wurden einige Hämophilie-A- Patienten, die einen Inhibitor entwickelt hatten, erfolgreich mit Faktor VIII, der aus Schweineplasma isoliert worden war, behandelt (Hay et al., 1990, Blood, Bd. 76, 882-886). Die zuletzt genannte Behandlung ist mit dem Risiko einer Inhibitorentwicklung gegen Schweine-Faktor VIII verbunden und tatsächlich wurde dies für mehrere Hämophilie-A-Patienten beschrieben, die mit Präparaten, die Schweine-Faktor VIII enthielten, behandelt worden waren. Eine extrakorporale Adsorption von hemmenden Antikörpern gegen Faktor VIII durch Protein-A- Sepharose wurde bei Hämophilie-A-Patienten mit hohen Konzentrationen an Faktor VIII- Inhibitoren angewendet (Nilsson et al., 1988, N. Eng. J. Med., Bd. 318, 947-950). Diese Behandlung erfordert eine spezielle Vorrichtung, und es wurde berichtet, dass sie bei 9 von 11 Patienten mit einer hohen Konzentration an Faktor VIII-Inhibitoren erfolgreich ist. Die unterschiedlichen Behandlungen, die oben beschrieben wurden, wurden mit schwankendem Erfolg durchgeführt, und es wird klar, dass zusätzliche Behandlungsverfahren für die Behandlung von Hämophilie-A-Patienten mit Inhibitoren nützlich sein können.
Eine allgemein eingeführte Alternative für die Behandlung von Hämophilie-A-Patienten mit einem Inhibitor wird durch eine Verabreichung von sogenanten "Faktor VIII- Umgehungsagentien" (= "Factor VIII bypassing agents") bereitgestellt. Anfangs wurden Prothrombinkomplex-Konzentrate (PCC) und aktivierte Prothrombinkomplex-Konzentrate (APCC) bei Hämophilie-A-Patienten mit einem Inhibitor verwendet (Lusher et al., 1980, N. Eng. J. Med, Bd. 303, 421-425; Sjamsoedin et al., 1981, N. Eng. J. Med., Bd. 305, 717-721). Eine Behandlung mit PCC wurde als nur teilweise wirksam angesehen und war mit Myokardinfarkt und disseminierter intravaskulärer Gerinnung bei einigen der behandelten Patienten verbunden. APCC wird im Vergleich zu PCC als wirksamer angesehen, obgleich eine Verabreichung von aktivierten Gerinnungsfaktoren, die in PCC vorliegen, zu einer Erhöhung der Thrombogenität führen kann, was durch die erhöhten Fibrinogenpeptid-A-Level, die bei mit APCC behandelten Patienten beobachtet werden, deutlich wird. Aktivierter Faktor VII wurde zur Behandlung von Hämophilie-A-Patienten mit Inhibitoren eingesetzt (Hedner, U. und W. Kisiel, 1983, J. Clin. Invest. 71, 1836-1841; Hedner et al., 1988, Lancet, 309, 1193). Außerdem wurden sowohl Gewebsthrombokinäse wie auch ein Gemisch aus Faktor Xa und Phospholipiden erfolgreich in Hundemodellen der Faktor VIII-Defizienz eingesetzt (OBrien et al., 1988, J. Clin. Invest., Bd. 82, 206-211; Giles et al., 1988, Brit. J. Haematol., Bd. 69, 491-497). Derzeit ist die Wirksamkeit von Faktor VIIa-Gewebsthrombokinase und einer Kombination von Faktor Xa und Phospholipiden als "Faktor-VIII-Umgehungsagens" nicht klar. Darüber hinaus ergeben sowohl PCC wie auch APCC in etwa 30 bis 50% der Fälle keine adäquate Behandlung. Damit besteht ein klarer Bedarf an zusätzlichen pharmazeutischen Präparaten, die als Faktor-VIII- Umgehungsagens eingesetzt werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt Faktor-VIII-Umgehungsagentien bereit, die auf den Proteinen basieren, die als Risikofaktor mit Thrombose in Verbindung stehen. Diese Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Faktor-V-Proteine, die an einer Spaltstelle für APC so modifiziert sind, dass sie eine APC-Resistenz dieser Proteine induzieren, oder Fragmente oder Derivate solcher Proteine, die vergleichbare biologische Aktivität (in der Art, nicht speziell in der Menge) haben.
Assays, wie sie vorher in dieser Anmeldung beschrieben wurden, können zur Identifizierung von Material verwendet werden, das Cofaktor-Moleküle von Faktor V, die an den Spaltstellen für APC modifiziert wurden, enthält. Nach Identifizierung eines solchen Plasmas, das von Patienten mit diesen mutierten Proteinen stammt, können Präparate produziert werden, die feste Mengen der Hyperkoagulans-Cofaktorproteine enthalten. Alternativ können Proteine, die an ihren APC-Spaltstellen modifiziert sind, durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden, die eine Expression der modifizierten Proteine in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen und/oder transgenen Tieren beinhaltet. Auch eine therapeutische Verwendung eines Faktor-V-Proteins, das an der APC-Spaltstelle von Arg&sup5;&sup0;&sup6; oder einer anderen APC- Spaltstelle modifiziert ist, durch Verfahren, die Gentherapieprotokolle beinhalten, die die Verwendung eines retroviralen Vektors umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, ist eingeschlossen. Eine Reinigung dieser Proteine kann durch monoclonale Antikörper-Technologie, Plasma-Fraktionierungsverfahren oder jedes andere Verfahren, das den Fachleuten auf diesem Gebiet zur Verfügung steht, erfolgen. Ferner können diese pharmazeutisch verwendbaren Proteine, die aus Faktor-V-Proteinen, die an ihrer APC-Spaltstelle modifiziert sind, bestehen, aus einem Proteingemisch, das auch nicht-modifizierten Faktor V enthält, gereinigt werden. Eine Reinigung kann auch monoclonale Antikörper, die Faktor V, der an einer oder mehreren der Spaltstellen für APC modifiziert wurde, spezifisch erkennen oder eine Reinigung durch andere Verfahren, die den Fachleuten auf diesem Gebiet zur Verfügung stehen, involvieren.
Faktor-V-Proteine, die an der Aminosäureposition Arg³&sup0;&sup6; und/oder Arg&sup5;&sup0;&sup6; und/oder Arg&sup6;&sup7;&sup9; modifiziert sind. Der Arginin-Rest, der der APC-Spaltstelle vorausgeht, kann in Gln, Ile oder einen beliebigen anderen Aminosäurerest geändert werden. Eine therapeutische Verwendung von Faktor V, der die Aminosäuresubstitution Arg&sup5;&sup0;&sup6;-Gln oder andere Modifikationen von APC-Spaltstellen enthält, wird für dir die Behandlung von Hämophilie-A-Patienten mit Inhibitoren nützlich sein. Basierend auf der Fähigkeit von Faktor V, der die Aminosäuresubstitution Arg&sup5;&sup0;&sup6;- Gln enthält, eine Thrombusbildung zu fördern, wie es bei Patienten mit Venenthrombose beobachtet wurde, wird dieses Protein als "Faktor-VIII-Umgehungsagens" nützlich sein. In Anbetracht der begrenzten Wirksamkeit und der hohen Kosten der derzeitigen Behandlung von Hämophilie-A-Patienten mit Inhibitoren, werden sich pharmazeutische Präparate, die diesen Faktor V enthalten, als wirksamer erweisen. Das therapeutische Präparat kann aus gereinigtem Faktor V, der die Aminosäuresubstitution Arg&sup5;&sup0;&sup6;-Gln enthält, bestehen. Alternativ kann dieser modifizierte Faktor V eine Komponente eines therapeutischen Präparats sein. Dieses Präparat kann ein beliebiges therapeutisches Präparat sein, das von Plasma abgeleitet ist, z. B. Prothrombinkomplex-Konzentrat (PCC) oder aktiviertes Prothrombinkomplex-Konzentrat (APCC) sein.
Summarisch stellt die vorliegende Erfindung therapeutische Mittel für die Behandlung von Blutungskrankheiten bereit, in denen der mutierte Faktor V, der APC-Resistenz hat, wegen seiner Hyper-Pro-Koagulations-Aktivität verwendet werden kann. Es wird klar sein, dass die Erfindung sich auf Derivate und/oder Fragmente solcher therapeutischer Mittel erstreckt, ganz gleich wie sie erhalten wurden. Der Fachmann auf diesem Gebiet weiß, wie die einem Patienten zu verabreichende Dosis des therapeutischen Mittels bestimmt wird, wobei die Dosis von zahlreichen Faktoren, wie Grad der Erkrankung, Körpergewicht des zu behandelnden Patienten, spezifische Aktivität des gewählten therapeutischen Mittels, usw. abhängt. Wenn die Dosis dem betreffenden Arzt nicht direkt klar ist, kann die Dosis nach verschiedenen fachbekannten Methoden, insbesondere durch sogenannte Dosisfindungsuntersuchungen bestimmt werden, welche eine Verabreichung an Tiere, wie z. B. an Nagetiere und später an (gesunde) Freiwillige bei steigenden Dosen des gewählten therapeutischen Mittels umfassen. Im Allgemeinen wird die Dosis, die einem Menschen verabreicht wird, zwischen 1 und 500, bevorzugter 5 bis 50 Einheiten pro kg Körpergewicht pro Tag liegen.
Pharmazeutische Formulierungen, in denen die erfindungsgemäßen Mittel verabreicht werden können, sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Die Mittel sind proteinartige Materialien, daher werden Formulierungen, die bekanntermaßen für Proteine geeignet sind, für die erfindungsgemäßen Mittel geeignet sein.
Sie können allein oder zusammen mit anderen therapeutischen Mitteln gegeben werden. Sie können sogar zusammen mit normalem Faktor V gegeben werden, um die Menge an gegebener Koagulansaktivität empfindlich auszugleichen.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen detaillierter erläutert werden.

BEISPIEL 1: Identifizierung von Mutationen an der Spaltstelle für aktiviertes Protein C an der Aminosäureposition Arg von Faktor V in Patienten, die an Venen- Thromboembolie leiden.

27 Patienten mit (rekurrierenden) idiopathischen Thromboembolie-Episoden, die durch Kontrastvenographie und/oder Lungenangiographie bestätigt worden waren, wurden auf das Auftreten von Mutationen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V untersucht. Keiner der untersuchten Patienten hatte eine erworbene oder inhärente Defizienz an Antithrombin III, Protein C, Protein S oder Plasminogen. Eine Routineuntersuchung von Blutgerinnung und Fibrinolyse zeigte keine Abnormalität. Periphere Blutlymphozyten wurden durch Ficoll-Paque- Dichtegradientenzentrifugation aus But isoliert. RNA wurde aus den peripheren Blutlymphozyten unter Anwendung des -B-Verfahrens isoliert (WAK Chemie, Bad Homburg v. d. H., Deutschland) und cDNA wurde im Wesentlichen wie früher beschrieben hergestellt (Cuypers, et al., 1992, J. Clin. Microbiol., Bd. 30, 3220-3224). Patienten wurden auf das Vorliegen von Mutationen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V untersucht, wobei die folgenden OIigonukleotid-Primer verwendet wurden: 5' TGTAAGAGCAGATCCCTGGACTCG 3' (Primer 506-1; Sense; Nukleotid 1576-1600 von humanem Faktor V, Nukleotid 1 entspricht dem ersten Nukleotid des Startcodons von Faktor V); 5' CATCACGTTTCACCTCATCAGG 3' (Primer 506-2; Antisense; Nukleotid 1708-1730 von humanem Faktor V). Oligonukleotid- Primer 506-1 enthält zwei Fehlpaarungen bezüglich der nativen Faktor-V-Sequenz, die unterstrichen sind. Die zwei Fehlpaarungen führen zusammen mit dem angrenzenden CGA-Codon, das für Arg&sup5;&sup0;&sup6; codiert, eine Restriktionsstelle für das Restriktionsenzym NruI bei Amplifikation mit Oligonukleotid-Primern 506-1 und 506-2 ein (siehe Tabelle II). Eine Amplifkation von cDNA, die aus mehreren Patienten isoliert wurde, die an Venen-Thromboembolie leiden, durch PCR, die Oligonukleotid-Primer 506-1 und 506-2 verwendet, führte zu einem Fragment mit 154 Basenpaaren (bp), das für den Teil von Faktor V codiert, der die APC-Spaltstelle an der Aminosäureposition Arg enthält. Das Auftreten von Mutationen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; wurde durch Abbau der amplifizierten Fragmente durch Restriktionsenzym NruI überwacht.
In Fig. 3, Bande 2, ist ein amplifiziertes Fragment gezeigt, das durch NruI abgebaut werden kann, was zu einem Fragment mit 130 bp führt. Da NruI fähig ist, das amplifizierte PCR-Fragment abzubauen, ist in diesem Individuum (Individuum A) keine Mutation an der Aminosäure Arg vorhanden. In Fig. 3, Bande 4, ist ein amplifiziertes Fragment gezeigt, das partiell durch NruI abgebaut ist, was das Vorliegen einer Mutation an der Aminösäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; in einem der Allele von Faktor V dieses Individuums (Individuum B) anzeigt. Um das Vorliegen einer Mutation an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; in Individuum B zu bestätigen, wurde die folgende Strategie angewendet. Es wurden Oligonukleotid-Primer aufgebaut, um einen größeren Teil der Faktor V-cDNA zu amplifizieren; S' ATCAGAGCAGTTCAAC- CAGGG 3' (Primer 506-5; Sense, Nukleotid 1414-1435 von humanem Faktor V) und 5' CAT- CACGTTTCACCTCATCAGG 3' (Primer 506-2; Antisense; Nukleotid 1708-1730 von humanem Faktor V). Die Amplifikation durch PCR mit den Primern 506-2 und 506-5 führte zu einem Fragment mit 316 Basenpaaren (bp), das für den Teil von Faktor V codiert, der die APC- Spaltstelle an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; enthält. Das Auftreten von Mutationen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; wurde durch direkte Sequenzierung des amplifizierten Fragments (Fig. 4) überwacht. In Individuum B ist deutlich eine Mutation innerhalb des Codons Arg&sup5;&sup0;&sup6; vorhanden, da am zweiten Basenpaar dieses Codons sowohl ein "G" als auch ein "A" beobachtet werden, was in einer Substitution von Arg&sup5;&sup0;&sup6; (CGA) für ein Gln (CAA) in einem der Allele des Gens für Faktor V in Individuum B resultiert. Für ein Individuum A wurde auch eine direkte Sequenzierung angewendet, die kein abnormes Restriktionsmuster bei Abbau des 154 bp- Fragments, das aus einer Amplifikation mit den Oligonukleotid-Primern 506-1 und 506-2 resultiert, zeigt (siehe Fig. 3; Bahn 2). Eine direkte Sequenzierung von Individuum A zeigte keine Mutationen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V (Fig. 4; linke Darstellung). Diese Resultate zeigen klar, dass die verschiedenen Assays, die hier angewendet werden, fähig sind, Mutationen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von humanem Faktor V nachzuweisen.
Als nächstes wurden alle 27 Patienten mit dokumentierter idiopathischer (rekurrierender) Thromboembolie bezüglich des Auftretens von Punktmutationen innerhalb der für aktiviertes Protein C (APC) empfindlichen Regionen von Blutgerinnungsfaktor V untersucht. Bei Anwendung einer Amplifikation mit Oligonukleotid-Primern 506-1 und 506-2 mit anschließendem Abbau durch NruI wie auch direkte Sequenzierung von amplifizierten Fragmenten zeigten 10 dieser Patienten eine einzelne G- zu -A-Transition und schienen für die Arg&sup5;&sup0;&sup6;- zu -Gln&sup5;&sup0;&sup6;- Mutation heterozygot zu sein. Die beschriebenen Verfahren sind geeignet, um den molekularen Defekt in etwa 35% der Patienten, die an einer thromboembolischen Krankheit leiden, festzustellen.
Wie in dem vorstehenden Absatz beschrieben wurde, wurde festgestellt, dass 10 Individuen für die Arg&sup5;&sup0;&sup6; -zu-Gln-Mutation heterozygot sind. Eine Sequenzanalyse zeigte, dass in allen untersuchten Fällen eine einzelne Nukleotid-"G"-zu-"A"-Substitution vorlag.
Es wurde ein Assay entwickelt, um das Vorhandensein dieser einzelnen Basenpaarsubstitutionen nachzuweisen, und zwar auf der Basis der in Tabelle III angegeben Oligonukleotid- Primer. Genomische DNA aller untersuchten Patienten wurde unter Anwendung von Standardverfahren isoliert. Eine Amplifikation durch PCR mit Oligonukleotid-Primern 506-5 und 506-6 lieferte bei untersuchten Patienten ein Fragment mit 206 bp. Eine PCR-Amplifikation mit den Oligonukleotid-Primern 506-5 und 506-7 lieferte bei allen untersuchten Patienten ein 206-bp- Fragment. Schließlich lieferte die PCR-Amplifikation mit den Oligonukleotid-Primern 506-5 und 506-8, die für die Arg&sup5;&sup0;&sup6;-zu-Gln-Substitution spezifisch sind, lediglich bei den 10 Patienten, die für die Arg&sup5;&sup0;&sup6;-zu-Gln-Substitution heterozygot sind, ein Fragment mit 206 bp. Kein Produkt wurde beobachtet, wenn eine PCR-Amplifikation mit diesen Oligonukleotid-Primern bei Patienten durchgeführt wurde, die die Arg&sup5;&sup0;&sup6;-zu-Gln-Mutation nicht tragen.
Es wurden mehrere Verfahren beschrieben, die zur Diagnose von Mutationen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V geeignet sind. Die Anwendbarkeit dieser Verfahren auf Patienten, die an einer thromboembolischen Krankheit leiden, zeigt die Verwendbarkeit dieser Assays bei der Diagnose einer thromboembolischen Krankheit.

BEISPIEL 2: Thrombin-Erzeugung in Plasma, das Faktor V mit oder ohne Mutation an der Spaltstelle für aktiviertes Protein C enthält.

Die Verwendbarkeit der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ist nicht auf die Diagnose bei Patienten, die an einer thromboembolischen Krankheit leiden, beschränkt, sondern umfasst auch die Beurteilung des Pro-Koagulans(Gerinnungsfaktorvorstufen)-Potentials von Plasma gesunder Blutspender. Zur Bestimmung des Gleichgewichts zwischen Pro-Koagulans- und Anti-Koagulans-Weg wurde ein einfaches Testverfahren entwickelt. Dies basierte auf der Erzeugung des Pro-Koagulans-Thrombins in Gegenwart eines Überschusses des Anti-Koagulans aktivierten Proteins C. Dieser Assay wurde wie folgt durchgeführt: zuerst wurden 50 ul citriertes, Thrombozyten-armes Plasma in ein Kunststoff-Teströhrchen gegeben, das 350 ul eines Verdünnungspuffers aus 50 mM Tris (pH 7,3) und 0,1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) enthielt. Dann wurden 400 ul APTT-Reagens (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden) als Phospholipidquelle und kolloidales Siliciumdioxid zur Aktivierung des Gerinnungssystems zugesetzt. Nach 5-minütiger Inkubation dieses Gemisches bei 37ºC Wurden 400 ul eines vorgewärmten Gemisches des Tris/Albumin-Verdünnungspuffers, der 25 mM CaCl&sub2; und 1 ug/ml gereinigtes humanes aktiviertes Protein C enthielt, zugesetzt (Kisiel, 1979, J. Clin. Invest., Bd. 64, 761-769). In regelmäßigen Intervallen wurden 45 ul- Proben entnommen. Diese wurden unverzüglich mit 5 ul 0,25 M EDTA vermischt, um eine weitere Thrombinbildung zu stoppen. Anschließend wurden die Proben in Tris/Albumin-Puffer 5- bis 20fach verdünnt und mit einer wässrigen Lösung (1,0 mM Endkonzentration) des chromogenen Substrats S2238 (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden) vermischt. Die Absorption bei 405 nm wurde dann spektralphotometrisch überwacht. Der Assay wurde mit gereinigtem humanem Thrombin (Mertens et al., 1985, Thromb. Haemostasis, Bd. 54, 654-660) geeicht, um Raten des Absorptionsanstiegs in molare Thrombinkonzentrationen umzuwandeln. Fig. 5 zeigt die Thrombinbildung in diesem Assay unter Verwendung von Plasmaproben 3 verschiedener Blutspender, deren Faktor-V-Genotyp als Arg&sup5;&sup0;&sup6;/Arg&sup5;&sup0;&sup6;, Arg&sup5;&sup0;&sup6;/Gln&sup5;&sup0;&sup6; und Gln&sup5;&sup0;&sup6;/Gln&sup5;&sup0;&sup6; durch die in Beispiel I beschriebene PCR-Technik festgestellt worden war. Wie aus Fig. 5 klar wird, war die Thrombinbildung in diesem Assaysystem vollständig vom Vorhandensein der Arg-zu- Gln-Mutation an der Aminosäureposition 506 von Faktor V abhängig. Darüber hinaus war das Ausmaß der Thrombinbildung zwischen Plasma von Spendern, die für diese Mutation homozygot und heterozygot waren, deutlich unterschiedlich. Diese Daten demonstrieren, dass Faktor V, der eine Mutation an der Spaltstelle für aktiviertes Protein C trägt, ein ungewöhnlich kräftiges Pro-Koagulans ist, das wesentlich zu dem Gesamt-Pro-Koagulans-Potential von humanem Plasma beiträgt.

BEISPIEL 3: Herstellung einer Faktor-V-enthaltenden Fraktion aus humanem Blutplasma

In gängigen Plasma-Fraktionierungsschemata wurden keine spezifischen Schritte durchgeführt, um Fraktionen herzustellen, die bewußt an Faktor V angereichert sind. Verfahren zur Reinigung von Faktor V aus Plasma sowohl durch herkömmliche Präzipitations- wie auch chromatographische Techniken (Suzuki et al., 1982, J. Biol. Chem., Bd. 257, 6556-6564) und durch Immunaffinitätschromatographie (Katzmann et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78, 162-166) wurden gut eingeführt. In industriellem Maßstab allerdings ist die Anwendbarkeit dieser Verfahren begrenzt, da sie Faktor V auf Kosten dringend benötigter Produkte, wie z. B. Faktor VIII und Immunglobuline, produzieren würden.
Da die Faktor VIII-Isolierung vorzugsweise mit normalen Plasma-Fraktionierungsschemata kompatibel sein sollte, wurden verschiedene normale Plasmafraktionen als potentielle Quellen für Faktor VIII beurteilt. Es wurden Fraktionen auf Faktor-V-Aktivität unter Anwendung des klassischen einstufigen Gerinnungs-Assays analysiert (Biggs, 1976, Human blood coagulation, haemostasis and thrombosis, 2. Ausgabe, Blackwell, Oxford, S. 310-364), wobei im Handel erhältliches Plasma mit Faktor-V-Defizienz (Baxter, Düdingen, Schweiz) und humanes Gewebethrombopastin (Thromborel®-S. Behring, Marburg, Deutschland) verwendet wurde. Das untersuchte Fraktionierungsverfahren umfasste Kryopräzipitations- und Anionen- Austauschschritte vor der üblichen Ethanolfraktionierung für Albumin und Immunoglobulin (Brummelhuis, in: Methods of plasma protein fractionation (J. M. Curling, Hrsg.), 1980, Academic Press, London, S. 117-128). Eine Analyse von sechs verschiedenen Fraktionierungsläufen zeigte, dass im ersten Schritt etwa 80% der anfänglichen Faktor-V-Aktivität im Kryoüberstandplasma wieder gewonnen wurde. Im zweiten Schritt wurde nachgewiesen, dass eine wesentliche Menge (mindestens 50%) der Faktor-V-Aktivität an dem Anionenaustauscherharz DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Uppsala, Schweden), das für die Herstellung von Prothrombinkomplex-Konzentrat (PCC) verwendet wurde, adsorbiert wurde. Nach Waschen und Elution, die wie beschrieben durchgeführt wurden (Brummelhuis, wie oben) wurde festgestellt, dass das resultierende PCC schwankende Konzentrationen (zwischen 5 und 20%) der anfänglichen Faktor V-Aktivität enthielt. Experimente in kleinem Maßstab, die 10 ml-Portionen von Kryoüberstandsplasma verwendeten, zeigten, dass Faktor-V-Ausbeuten verbessert werden könnten, indem (1) die Menge an DEAE-Sephadex auf mindestens 1,5 g pro kg Kryoüberstandsplasma erhöht werden, (2) die Jonenstärke während der Adsorptionsstufe durch Verdünnen des Kryoüberstandsplasmas verringert wird, (3) die Jonenstärke der Waschbedingungen vor einer Elution verringert wird oder (4) eine Kombination dieser Verbesserungen durchgeführt wird.
Durch Anwendung eines verbesserten Verfahrens für die Herstellung von PCC schien es machbar, bis zu 30% des anfänglichen Faktors V in dieser Plasmafraktion zu erhalten. Eine Untersuchung der Reinheit dieser Fraktion durch Prüfung der Faktor-V-Aktivität und des Proteingehalts (Bradford, 1976, Anal. Biochem., Bd. 72, 248-254) zeigte eine spezifische Aktivität von 0,4 Einheiten/mg, die mit einer 25fachen Reinigung übereinstimmt. Somit stellt ein verbessertes Verfahren zur PCC-Herstellung einen Zugang zu einer mit Faktor V angereicherten Plasmafraktion bereit, ohne dass dadurch die Herstellung von Faktor VIII, Albumin oder Immunoglobulinprodukten gestört wird. Dieser partiell gereinigte Faktor V kann dann als Ausgangsmaterial zur weiteren Reinigung durch die oben angeführten herkömmlichen Verfahren oder Immunaffinitätsverfahren zu dem gewünschten Reinheitsgrad dienen.

BEISPIEL 4: Thrombinerzeugung in Faktor-V-enthaltenden Fraktionen, die aus Ausgangsplasma, ausgewählt nach Arg oder Gln an der Faktor-V-Position 506 hergestellt wurden

Für die Herstellung von partiell gereinigtem Faktor V wurde Blut in Citrat-enthaltenden Standardantikoagulantien gesammelt. Zellen wurden durch Zentrifugation (15 min bei 5000 g) gesammelt, und das überstehende Plasma wurde gefroren und bei unter -30ºC bis zur Verwendung gelagert. Einzelne Plasmaproben wurden nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgemustert und entsprechend dem Phänotyp, wie er aus den Thrombinerzeugungsprofilen deutlich wird (siehe Fig. 5) in die drei Kategorien eingeteilt. In allen Fällen wurden periphere Blutlymphozyten derselben Spender isoliert, um den Genotyp durch PCR-Analyse wie in Beispiel 1 beschrieben zu bestätigen. Plasma wurde dann bei 4ºC aufgetaut, und das Kryopräzipitat wurde durch Zentrifugation (5 min bei 2000 g) gesammelt. Kryoüberstandsplasma desselben Phänotyps wurde gesammelt, und es wurde DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in einer Menge von 1,5 g Trockengewicht pro kg Plasma zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt und in eine Säule übergeführt, um das Anionenaustauscherharz zu sammeln. Die Säule wurde unter Verwendung eines Puffers aus 10 mM Trinatriumcitxat (pH 7,0), der 154 mM NaCl enthielt, gewaschen, und die mit Faktor V angereicherte PCC-Fraktion wurde mit demselben Puffer, der 0,7 M NaCl enthielt, eluiert. Dieser Prozess lieferte drei unterschiedliche PCC-Fraktionen, die den Faktor V der Typen Arg&sup5;&sup0;&sup6;, Gln&sup5;&sup0;&sup6; oder aus den heterozygoten Spendern ein Gemisch dieser beiden enthielt.
Zur Beurteilung des Thrombinerzeugungspotentials der drei PCC-Fraktionen wurde PCC mit einem Puffer, der 50 mM Tris (pH 7,3) und 0,1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin enthielt, auf eine Faktor-V-Aktivität von zwischen 0,2 und 0,3 Einheiten/ml verdünnt. Dann wurde die Thrombinproduktion nach demselben Verfahren, wie es detailliert in Beispiel 2 beschrieben ist, beurteilt, wobei 400 ul verdünntes PCC, 400 ul APTT-Reagens und 400 ul Tris- Albumin-Puffer, der 25 mM Calciumchlorid, 1 ug/ml gereinigtes humanes aktiviertes Protein C und 1/2000-verdünntes Thromboplastinreagens (TromborelR, Behring, Marburg, Deutschland) enthielt, zur weiteren Aktivierung des Gerinnungssystems verwendet wurden. Zur quantitativen Bestimmung von Thrombin unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens wurden in regelmäßigen Intervallen Proben entnommen und die Thrombinbildungsprofile erstellt (siehe Fig. 6). Wie aus Fig. 6 zu ersehen ist, war die Thrombinbildung stark vom Vorliegen der Arg-zu-Gln-Mutation an der Aminosäureposition 506 von Faktor V abhängig. Darüber hinaus war das Ausmaß der Thrombinbildung zwischen PCC von Donoren, die für die Mutation homozygot oder heterozygot sind, deutlich unterschiedlich.
Diese Daten beweisen, dass der kräftige Pro-Koagulans-Effekt von Faktor V, der eine Mutation an einer Spaltstelle für aktiviertes Protein C trägt, nicht auf Vollplasma beschränkt ist, sondern in gleicher Weise in Faktor V angereichten Plasmafraktionen, wie z. B. PCC, festgestellt wird. Ein Durchmustern des Ausgangsplasmas nach diesen Mutationen als erster Schritt bei der Herstellung von Faktor-V-enthaltenden Plasmafraktionen führt somit zu pharmazeutischen Präparaten, die sich bezüglich der Thrombinbildung in Gegenwart von aktiviertem Protein C stark unterscheiden. Wie aus Fig. 6 klar wird, ist diese Feststellung bei der Verringerung des Pro-Koagulans-Potentials von PCC, das das derzeit bekannte thrombogene Potential von PCC verringert, oder bei der Verstärkung seines Pro-Koagulans-Potentials vorteilhaft, was zur Verbesserung der Wirksamkeit von PCC bei der Behandlung von Patienten mit Inhibitorantikörpern gegen Faktor VIII oder andere Gerinnungsfaktoren wünschenswert ist.

BEISPIEL 5: Faktor V mit einer Mutation an der Spaltstelle für aktiviertes Protein C zeigt Faktor-VIII-Inhibitorumgehungsaktivität

Von einem Patienten mit schwerer Hämophilie A und einem Inhibitor gegen Faktor VIII wurde Plasma gesammelt. Sein Antifaktor-VIII-Titer wurde unter Verwendung des sogenannten "Bethesda-Assays" (Kasper et al., 1975, Thromb. Diath. Haemorrh., Bd. 34, 869-872) bestimmt und festgestellt, dass er 40 Bethesda-Einheiten war. Dieser hohe Titer ist als solcher für die normale Substitutionsbehandlung mit Faktor VIII untragbar. 100 ul des Patientenplasmas wurden mit partiell gereinigtem Faktor V zu einer Endkonzentration von 0,5 Einheiten/ml ergänzt. Dieser Faktor V war aus Plasma gereinigt worden, welches auf das Vorliegen der Arg-zu-Gln- Mutation an der Aminosäureposition 506 selektiert worden war, wie es detailliert in Beispiel 4 beschrieben ist. Das Gemisch wurde dann unter Verwendung eines Puffers, der 50 mM Tris (pH 7,3) und 0,1% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin enthielt, auf 400 ul verdünnt. Dann wurde die Thrombinbildung durch dasselbe Verfahren, wie detailliert in Beispiel 2 beschrieben ist, bestätigt, wobei 400 ul APTT-Reagens und 400 ul Tris-Albumin-Puffer, der 25 mM und 1/8000 verdünntes Thromboplastinreagens enthielt, verwendet wurden (siehe Beispiel 4). In regelmäßigen Intervallen wurden Proben für die quantitative Bestimmung von Thrombin entnommen; wobei das Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben ist, angewendet wurde; es wurden die Thrombinbildungsprofile erstellt (siehe Fig. 7). Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, wurde in Abwesenheit von zugesetztem Faktor V oder nach Zusatz von Faktor V mit Arg an der Aminosäureposition 506 nur eine geringe Thrombinbildung nachgewiesen. In Anwesenheit von Faktor V mit der Arg-zu-Gln-Mutation an der Aminosäureposition 506 schien allerdings die Thrombinbildung gleich der in normalem nicht-Hämophilie-Plasma zu sein. Dies beweist, dass ein pharmazeutisches Präparat, das die Faktor-V-Arg506→Gln-Variante umfasst, Faktor-VIII-Umgehungsaktivität zeigt und somit bei der Korrektur eines Gerinnungsdefektes Nutzen bringt.

BEISPIEL 6: Aufbau eines Faktor-VIII-Moleküls mit einer Mutation an einer Spaltstelle für aktiviertes Protein C

Wie in den Beispielen 2 und 4 gezeigt ist, können Cofaktormoleküle mit einer Mutation an der Spaltstelle für aktiviertes Protein C in Plasma von normalen, gesunden Blutspendern auftreten, und die Cofaktorvariante kann in selektiver Weise durch Durchmustern von Spenderplasma vor einer Reinigung erhalten werden. Der Zugang zu solchen Varianten kann entsprechend ihrem Vorherrschen bei den normalen Spendern beschränkt sein. Diese Beschränkung kann überwunden werden, indem solche Varianten durch DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden. Ein Beispiel für diese Strategie wird durch die folgende Beschreibung bereitgestellt, die den Aufbau und die Expression einer Faktor-VIII-cDNA, die eine Substitution an der Spaltstelle Arg&sup5;&sup6;² für aktiviertes Protein C enthielt, erläutert. Diese Beschreibung ist für den Fachmann auf dem Gebiet zur Erzeugung ähnlicher Substitutionen an anderen Spaltstellen in dem Cofaktormolekül Faktor VIII (siehe Fig. 1) oder Faktor V (siehe Fig. 2) beispielhaft.
Früher wurde von den genannten Erfinder das Plasmid pCLB-BPVdB695 beschrieben, das für eine Form der Faktor-VIII-cDNA mit deletierter B-Domäne codiert, beschrieben (Mertens et al., Br. J. Haematol., Bd. 85, 133-142). Die genannten Erfinder haben die Polymerasekettenreaktion angewendet, um eine Faktor-VIII-cDNA herzustellen, in der Arg&sup5;&sup6;² anstelle von Ile eingesetzt war. Ein 1206 bp-Fragment wurde unter Verwendung von Plasmid pCLB- BPVdB695 als Matrize amplifiziert, wobei die folgenden Oligonukleotid-Primer verwendet wurden: F8-5475 5' CTGGTAAAAGACTTGAAT 3' (Nukleotid 547-565 der Faktor-ViIIcDNA); Sense und F8-1732AS 5' CTGGTTTCCATTTTGATCTAC 3' (Nukleotid 1732-1753 der Faktor-VIII-cDNa; Antisense-Fehlpaarungen sind unterstrichen). Außerdem wurde ein 306 bp-Fragment unter Verwendung von Plasmid pCLB-BPVdB695 als Matrize mit den folgenden Oligonukleotid-Primern amplifiziert: F8-1732S 5' GTAGATCAAAATGGAAACCAG 3' (Nukleotid 1732-1753 von Faktor VIII; Sense-Fehlpaarungen sind unterstrichen) und F8- 2020AS 5' GTGTTTGAAGGTATATCC 3' (Nukleotid 2020-2038 von Faktor VIII); Antisense- Reaktionsbedingungen waren: 2' 90ºC, 20' 50ºC, 3' 72ºC; 37mal 45" 90ºC, 90" 50ºC, 3' 72ºC; 5' 65ºC in Gegenwart von 1 mM dNTPs, 10mal Pfu-Polymerase-Reaktionspuffer, 50 pMol Primer H1 und H2 und 2,5 E Pfu-Polymerase (Stratagene, Cambridge, GB). Das 306 bp- Fragment und das 1206 bp-Fragment wurden durch Gelelektrophorese mit niedrigschmelzender Agarose und anschließender Phenolextraktion gereinigt. Die gereinigten Fragmente waren Matrize für die Amplifikation eines 1491 bp-Fragments, die die Oligonukleotid-Primer F8-5475 und F8-2020AS bei den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen verwendete. Das resultierende 1491 bp-Fragment wurde mit ApalI (Position 853) und KpnI (Position 1811) abgebaut, und das resultierende ApalI-KpnI wurde verwendet, um das entsprechende Apal 1 -Kpnl- Fragment von pCLB-BPVdB695 zu ersetzen. Das resultierende Plasmid wurde pCLB- BPVdB695RI562 genannt, und die Sequenz des ApalI-Kpnl-Fragments, das die Arg506→Ile- Mutation enthielt, wurde durch Oligonukleotid-Sequenzierung bestätigt.
C127-Zellen wurden in Iscove-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 100 E/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin gehalten. Subkonfluente Einzelschichten aus C127-Zellen wurden unter Verwendung von Calciumphosphat einer Transfektion unterzogen, und zwar im Wesentlichen so, wie es in der Literatur beschrieben ist (Graham und Van der Eb, 1973, Virology Bd. 52, 456-467). Plasmid pCLB-BPVdB695RI562 (20 ug) wurde mit pGKhyg (1 ug; Ten Riele et al., 1990, Nature Bd. 348, 649-651) einer Cotransfektion unterworfen. Nach der Transfektion und Selektion von Zellen, die einer Transfektion unterzogen worden waren, mit 200 ug/ml Hygromycin wurden einzelne Clone isoliert und in selelctivem Medium vermehrt. Die Sekretion von Faktor VIII wurde durch Messung der Fähigkeit von Faktor VIII als Cofaktor für die Faktor-IXa-abhängige Umwandlung von Faktor Xa unter Verwendung eines chromogenen Substrats für Faktor Xa zu fungieren, überwacht (Coatest Faktor VIII, Chromogenix, Mölndal, Schweden). Das Faktor-VIII-Antigen wurde unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern, die vorher charakterisiert worden waren, bestimmt (Lenting et al., 1994, J. Biol. Chem. Bd. 269, 7150-7155). Als feste Phase wurde monoclonaler Antikörper CLB- CAg12, der gegen die Faktor-VIII-leichte Kette gerichtet war, verwendet, während der mit Peroxidase markierte monoclonale Antikörper CLB-CAg 117, der ebenfalls gegen die Faktor-VIIIleichte Kette gerichtet war, verwendet wurde, um die Menge an gebundenem Faktor-VIII quantitativ zu bestimmen. Normales Plasma aus einem Pool von 40 gesunden Spendern wurde als Standard eingesetzt. Clone, die von Zellen, welche einer Transfektion mit pCLB- BPVdB695RI562 unterzogen worden waren, abgeleitet wurden und die beachtliche Mengen an Faktor VIII produzierten, wurden bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert. Ein Clon, der von Zellen stammte, die einer Transfektion mit pCLB-BPVdB695RI562 unterzogen worden waren, wurde bis zur Konfluenz wachsen gelassen, und anschließend wurden Cofaktor- Aktivität und Antigen wie oben beschrieben bestimmt. Das an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup6;² modifizierte Faktor-VIII-Protein zeigte eine Cofaktor-Aktivität von 56 mE/ml. Die Antigenkonzentration wurde anschließend mit 72 mE/ml bestimmt.
Unsere Daten zeigen, dass Cofaktormoleküle, die an ihren Spaltstellen für aktiviertes Protein C modifiziert sind, in eukaryontischen Zellen exprimiert werden können. Diese Cofaktor-Variantenmoleküle können am zweckdienlichsten durch Immunaffinitätschromatographie- Verfahren, wie sie früher eingeführt wurden (Mertens et al., 1993, Br. J. Haematol. Bd. 85, 133-142), gereinigt werden. Im Anschluss an eine Reinigung können die modifizierten Cofaktor-Proteine zu einem therapeutischen Präparat zur Bekämpfung von hämostatischen Krankheiten formuliert werden.

BEISPIEL 7: Aufbau eines Faktor-V-Moleküls mit einer Mutation an einer Spaltstelle für aktiviertes Protein C

Wie in Beispiel 1 gezeigt wurde, kann ein Cofaktor-Molekül mit einer Mutation an einer Spaltstelle für aktiviertes Protein C in Plasma von Patienten, die an einer thromboembolischen Krankheit leiden, wie auch bei normalen gesunden Blutspendern auftreten. In Beispiel 4 wird gezeigt, dass ein derartiger modifizierter Cofaktor, der aus Plasma erhalten wird, verglichen mit dem modifizierten Molekül, eine erhöhte Thrombinbildung zeigt. Ferner wird in Beispiel 5 gezeigt, dass ein Faktor V-Molekül, das die Substitution Arg506→Gln trägt, fähig ist, als "Faktor- VIII-Umgehungsagens" zu fungieren. Der Zugang zu solchen Varianten kann entsprechend ihrem Vorherrschen bei normalen Spendern beschränkt sein. Diese Beschränkung kann durch Herstellung solcher Varianten durch DNA-Rekombinationstechnik überwunden werden. Ein Beispiel für diese Strategie wird durch die folgende Beschreibung geliefert, welche den Aufbau einer Faktor-V-cDNA, die eine Substitution an der Spaltstelle Arg&sup5;&sup0;&sup6; für aktiviertes Protein C enthält, beschreibt. Diese Beschreibung ist für den Fachmann zur Schaffung ähnlicher Substitutionen an anderen Spaltstellen in dem Cofaktor-Molekül Faktor V beispielhaft. Faktor-V-cDNA wird im Wesentlichen wie es in Literatur beschrieben ist, isoliert (Jenny et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84, 4846-4850). Das 5'-Ende der Faktor-V-cDNA wird durch die Verwendung eines doppelsträngigen synthetischen Linkers (5' AATGTCGACAAAGCCACCATG 3', Sense; 5' GTGGCTTTGTCGACATT 3', Antisense), modifiziert, der in die Nspl-Stelle, welche mit dem Initiationscodon von Faktor V überlappt, insertiert. Das 3-Ende der Faktor-V-cDNA wird wie folgt modifiziert: Oligonukleotid-Primer FV-7 (5' AATGCGGCCGCGGGGTTTTT- GAATGTTCA 3'-Nukleotid 6679-6697; Antisense) wird in Verbindung mit Oligonukleotid- Primer FV-8 (5' GTGGCTAGATATATTAGGATC 3'-Nukleotid 6109-6130; Sense) verwendet, um ein 588 bp-Fragment zu amplifizieren. Die Reaktionsbedingungen sind: 2 min 90ºC, 20 min 55ºC, 3 min 72ºC; 37mal 45 s 90ºC, 90 s 55ºC, 3 min 72ºC; 5 min 65ºC in Gegenwart von 1 mM dNTPs, 10mal Pfu-Polymerasereaktionspuffer, 50 pMol Primer FV-7 und FV-8 und 2,5 E Pfu-Polymerase (Stratagene, Cambridge, GB). Das resultierende Fragment wird mit XhoI und Notl (Nukleotid 6137-6697 von Faktor V) abgebaut, und das resultierende Fragment wird in einer Ligation zusammen mit Sphl-XhoI-Fragment (Nukleotid 5134-6137 von Faktor V), einem SaII-SphI-Fragment (Nukleotid 1-5134), das das modifizierte 5'-Ende der Faktor-V-cDNA enthält, und den Vektor pBPV, der mit Xhol und Notl (Pharmacia-LKB, Uppsala, Schweden) verdaut ist, verwendet. Das resultierende Konstrukt wird pCLB-PBVFV genannt.
Um eine Faktor-V-cDNA, die eine Mutation an der APC-Spaltstelle bei Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V enthält, wird Oligonukleotid-Primer 506-11 (5' CTGTATTCCTTGCCTGTCCAG 3' Nukleotid 1591-1612; Antisense) in Verbindung mit Oligonukleotid-Primer FV-2 (5' TTGCAAGCTGGGATGCAGGCT 3'; Nukleotid 946-967; Sense) verwendet, um ein 666 bp- Fragment zu amplifizieren. Die Reaktionsbedingungen sind: 2 min 90ºC, 20 min 55ºC, 3 min 72ºC; 37mal 45 s 90ºC, 90 s 55ºC, 3 min 72ºC; 5 min 65ºC in Gegenwart von 1 mM dNTPs, 10mal Pfu-Polymerasereaktionspuffer, 50 pMol Primer 506-11 und FV-2 und 2,5 E Pfu- Polymerase (Strategene, Cambridge, GB). In gleiche Weise werden Oligonukleotid-Primer 506- 12 (5' CTGGACAGGCAAGGAATACAG 3'; Nukleotid 1591-1612; Sense) und Oligonukleotid-Primer 506-2 (5' CATCACGTTTCACCTCATCAGG 3'; Nukleotid 17ß8-1730; Antisense) verwendet, um 139 bp-Fragment unter Anwendung der oben beschriebenen Reaktionsbedingungen zu amplifizieren. Sowohl das 139 bp-Fragment wie auch das 666 bp-Fragment werden eingesetzt, um ein 784 bp-Fragment unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer 505-2 und FV-2 zu amplifizieren. Das resultierende Fragment wird mit KpnI (Nukleotidposition 1674) und PstI (Nukleotidposition 1068) abgebaut, und das Faktor-V-Fragment, das die Arg506→Gln- Mutation enthält, wird verwendet, um das entsprechende Fragment des Plasmids pCLB-BPV- FV zu ersetzen. Das resultierende Plasmid wird pCLB-BPVFVRQ506 genannt, und die Sequenz des PstI-KpnI-Fragments, die die Arg506→Gln-Mutation enthielt, wird durch Oligonukleotidsequenzierung verifiziert.
Unsere Daten zeigen, dass Faktor-V-Moleküle, die an ihren Spaltstellen für aktiviertes Protein C modifiziert sind, aufgebaut werden können und in einen eukaryontischen Expressionsvektor cloniert werden können. Diese Cofaktorvariantenmoleküle werden am zweckdienlichsten nach beschriebenen Verfahren (Kane et al., 1990, Biochemistry, Bd. 29, 6762-6768) exprimiert. Eine Reinigung der modifizierten Proteine wird vorzugsweise durch Immunaffinitätschromatographieverfahren, wie sie vorher bereits für Faktor V eingeführt worden waren, gereinigt (Katzmann et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78, 162-166).

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Aktivierungs- und Inaktivierungsstellen für Thrombin bzw. APC in Faktor VIII. Über dem Streifen sind die Spaltstellen für Thrombin in Faktor VIII gezeigt. Es wurde gezeigt, dass Mutationen an der Aminosäureposition Arg³&sup7;² und Arg¹&sup6;&sup8;&sup9;, die die Pro- Koagulans-Funktion dieses Proteins stören, zu Hämophilie A führen. Unterhalb des Streifens sind die Spaltstellen von APC an Position Arg³³&sup6; und Arg&sup5;&sup6;² angezeigt. Mutationen an dieser Stelle können die Pro-Koagulans-Aktivität von Faktor VIII leicht verlängern, was zu Thrombophilie führt.
Fig. 2 zeigt die Aktivierungs- und Inaktivierungsstellen für Thrombin bzw. APC in Faktor V. Oberhalb des Streifens sind die Spaltstellen für Thrombin angegeben. Bis jetzt wurden noch keine Mutationen an diesen Aminosäurepositionen von Faktor V beschrieben. Unterhalb des Streifens wurden die Spaltstellen für APC an der Aminosäureposition Arg³&sup0;&sup6;, Arg&sup5;&sup0;&sup6;, Arg&sup6;&sup7;&sup9; und Arg¹&sup7;&sup6;&sup5; angezeigt. Mutationen an diesen Stellen können die Pro-Koagulans-Aktivität von Faktor V verlängern, was zu Thrombophilie führt.
Fig. 3 stellt eine Analyse eines Patienten dar, der keine Mutation an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V trägt (Individuum A) und eines Patienten, der die Mutation trägt (Individuum B). Bahn 1 : 154 bp-Fragment, amplifiziert mit Oligonukleotid-Primer 506-1 und 506-2, abgeleitet von cDNA von Individuum A. Bahn 2: dasselbe Fragment von Individuum A mit anschließendem Abbau mit NruI. Bahn 3 : 154 bp-Fragment, amplifiziert mit Oligonukleotid-Primer 506-1 und 506-2, abgeleitet von cDNA von Individuum B. Bahn 4: dasselbe Fragment von Individuum B mit anschließendem Abbau mit NruI. Bahn 5 : 100 bp-Leiter (ladder).
Fig. 4 zeigt eine Sequenzanalyse von Patienten-Faktor-V-cDNA. Faktor-V-cDNA, die von Individuum B stammt, das für die Arg&sup5;&sup0;&sup6;-zu-Gln-Mutation heterozygot ist, ist auf der rechten Seite dargestellt. Heterozygotie wird durch das Auftreten sowohl eines "G" als auch eines "A" im zweiten Basenpaar von Codon Arg&sup5;&sup0;&sup6; (CGA/CAA) von Faktor V erzielt (was durch den Pfeil angezeigt ist). Im linken Bild ist eine Sequenzanalyse von Individuum A gezeigt, das die Mutation nicht trägt. Der Pfeil zeigt das einzelne "G" an, das im zweiten Basenpaar von Codon Arg&sup5;&sup0;&sup6; (CGA/CGA) beobachtet wird.
Fig. 5 zeigt die Bildung von Thrombin in Plasma, das Faktor V mit oder ohne Mutation an der Spaltstelle für aktiviertes Protein C in der Aminosäureposition 506 enthält. Plasma wurde von drei verschiedenen Spendern mit dem Faktor-V-Genotyp Arg&sup5;&sup0;&sup6;/Arg&sup5;&sup0;&sup6;, Arg&sup5;&sup0;&sup6;/Gln&sup5;&sup0;&sup6; und Gln&sup5;&sup0;&sup6;/Gln&sup5;&sup0;&sup6; erhalten.
Fig. 6 zeigt die Bildung von Thrombin in partiell gereinigtem Faktor V, hergestellt als Prothrombinkomplex-Konzentrat aus Plasma von Spendern, die nach dem Faktor-V-Genotyp Arg&sup5;&sup0;&sup6;/Arg&sup5;&sup0;&sup6;, Arg&sup5;&sup0;&sup6;/Gln&sup5;&sup0;&sup6; und Gln&sup5;&sup0;&sup6;/Glns&sup5;&sup0;&sup6; ausgewählt wurden.
Fig. 7 zeigt die Bildung von Thrombin im Plasma eines Patienten mit schwerer Hämophilie A und einem hohen Titer für Inhibitor gegen Faktor VIII. Die Thrombinbildung ist durch das Vorhandensein von exogenem Faktor V vollständig normalisiert, vorausgesetzt, dass dieser die Arg&sup5;&sup0;&sup6;-zu Gln-Mutation an der Spaltstelle für aktiviertes Protein C trägt.

Tabelle I: Spaltstellen für APC in Faktor VIII und Faktor V.

Die Spaltstellen in humanem Faktor VIII wurden durch Aminosäuresequenzierung des Spaltproduktes von APC-abgebautem Faktor VIII identifiziert. Die Spaltstellen in humanem Faktor V basieren auf Homologie mit Rinder-Faktor V. Zur Bestimmung der genauen Spaltstellen wurde eine Aminosäuresequenzierung von proteolytischen Fragmenten, gebildet durch Abbau von Rinder-Faktor V durch APC, verwendet. Aminosäure 1 von Faktor V und VIII entspricht der ersten Aminosäure, die auf das Signalpeptid folgt. Nukleotid 1 von Faktor V und VIII entspricht dem ersten Nukleotid des Startcodons.
humaner Faktor VIII (Aminosäuresequenz Ser³²&sup8;-Asp³&sup4;&sup5;; Nukleotide 1039-1090):
Ser-Cys-Pro-Glu-Glu-Pro-Gln-Leu-Arg 4- Met-Lys-Asn-Asn-Glu-Glu-Ala-Glu AGC TGT CCA GAG GAA CCC CAA CTA CGA ATG AAA AAT AAT GAA GAA GCG GAA
humaner Faktor VIII (Aminosäuresequenz Cys&sup5;&sup5;&sup4;-Arg&sup5;&sup7;¹; Nukleotide 1717-1768):
Cys-Tyr-Lys-Glu-Ser-Val-Asp-Gln-Arg 4- Gly-Asn-Gln-Ile-Met-Ser-Asp-Lys TGC TAC AAA GAA TCT GTA GAT CAA AGA GGA AAC CAG ATA ATG TCA GAC AAG
humaner Faktor V (Aminosäuresequenz Ile²&sup9;&sup8;-Gln³¹&sup5;; Nukleotide 976-1027):
Ile-Lys-Asn-Cys-Pro-Lys-Lys-Thr-Arg ↓ Asn-Leu-Lys-Lys-Ile-Thr-Arg-Glu ATT AAA AAC TGC CCA AAG AAA ACC AGG AAT CTT AAG AAA ATA ACT CGT GAG
humaner Faktor V (Aminosäuresequenz Cys&sup4;&sup9;&sup8;-Glu&sup5;¹&sup5;; Nukleotide 1576-1627):
Cys-Lys-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg ↓ Gly-Ile-Gln-Arg-Ala-Ala-Asp-Ile TGT AAG AGC AGA TCC CTG GAC AGG CGA GGA ATA CAG AGG GCA GCA GAC ATC
humaner Faktor V (Aminosäuresequenz Pro&sup6;&sup7;¹-Glu&sup6;&sup8;&sup8;; Nukleotide 2095-2146)
Pro-Glu-Ser-Thr-Val-Met-Ala-Thr-Arg ↓ Lys-Met-His-Asp-Arg-Leu-Glu-Pro CCA GAA TCT ACA GTC ATG GCT ACA CGG AAA ATG CAT GAT CGT TTA GAA CCT
humaner Faktor V (Aminosäuresequenz Glu¹&sup7;&sup5;&sup7;-Ser1&sup7;&sup7;&sup4;; Nukleotide 5353-5404)
Glu-Lys-Lys-Ser-Arg-Ser-Ser-Trp-Arg ↓ Leu-Thr-Ser-Ser-Glu-Met-Lys-Lys GAA AAG AAG TCC CGA AGT TCT TGG AGA CTC ACA TCC TCA GAA ATG AAA AAA
Tabelle II: Liste von Oligonukleotid-Primern, die zum Nachweis von Mutationen an APC-Spaltstellen an der Aminosäureposition Arg&sup5;&sup0;&sup6; von Faktor V und Arg³³&sup6; und Arg&sup5;&sup6;² von Faktor VIII verwendet wurden. Fehlpaarungen in den Oligonukleotidprimern bezüglich der Wildtyp-Sequenz von Faktor V und VIII sind unterstrichen. Nach PCR-Amplifikation der bezeichneten Primer mit einem geeigneten Oligonukleotid-Primer, der von der Wildtyp-Faktor-V- und -VIII-Sequenz abgeleitet ist, wird ein Fragment gebildet, das eine Restriktionsstelle trägt. Das Vorliegen einer Mutation an einem besonderen Codon zerstört diese Restriktionsstelle und kann somit verwendet werden, um Mutationen an Spaltstellen für APC zu überwachen.
humaner Faktor VIII (Aminosäuresequenz Ser³²&sup8;-Asp³&sup4;&sup5;; Nukleotide 1039-1090):
Ser-Cys-Pro-Glu-Glu-Pro-Gln-Leu-Arg ↓ Met-Lys-Asn-Asn-Glu-Glu-Ala-Glu AGC TGT CCA GAG GAA CCC CAA CTA CGA ATG AAA AAT AAT GAA GAA GCG GAA
Oligonukleotid-Primer 336-1 (Sense; Nukleotid 1039-1064):
AGC TGT CCA GAG GAA CCC CTT C
Restriktionsstelle: TaqI T CGA
Oligonukleotid-Primer 336-2 (Sense: Nukleotid 1039-1063):
AGC TGT CCA GAG GAA CCC CAA GTA
Restriktionsstelle: RsaI GTA C
Oligonukleotid-Primer 336-3 (Antisense; Nukleotid 1180-1201):
AGT TTT AGG ATG CTT CTT GGC
humaner Faktor VIII (Aminosäuresequenz Cys&sup5;&sup5;&sup4; -Arg&sup5;&sup7;¹; Nukleotide 1717-1768):
Cys-Tyr-Lys-Glu-Ser-Val-Asp-Gln-Arg 4- Gly-Asn-Gln-Ile-Met-Ser-Asp-Lys TGC TAC AAA GAA TCT GTA GAT CAA AGA GGA AAC CAG ATA ATG TCA GAC AAG
Oligonukleotid-Primer 562-5 (Sense; Nukleotide 1717-1741)
TGC TAC AAA GAA TCT GTA GAT CGA
Restriktionsstelle: MboII GA AGA
Oligonukleotid-Primer 562-6 (Antisense; Nukleotide 2020-2038)
GTG TTT GAA GGT ATA TCC
humaner Faktor V (Aminosäuresequenz Cys&sup4;&sup9;&sup8;-Glu&sup5;¹&sup5;; Nukleotide 1576-1627):
Cys-Lys-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg 4- Gly-Ile-Gln-Arg-Ala-Ala-Asp-Ile TGT AAG AGC AGA TCC CTG GAC AGG CGA GGA ATA CAG AGG GCA GCA GAC ATC
Oligonukleotid-Primer 506-1 (Sense; Nukleotide 1576-1600).
TGT AAG AGC AGA TCC CTG GAC TCG
Restriktionstelle NruI TCG CGA
Oligonukleotid-Primer 506-2 (Antisense: Nukleotide 1708-1730)
C ATC ACG TTT CAC CTC ATC AGG
Tabelle III: Oligonukleotid-Primer, die sowohl von Faktor-V-cDNA als auch von genomischen Sequenzen abgeleitet sind, um die Arg&sup5;&sup0;&sup6;-zu-Gln-Substitution zu diagnostizieren. Der Teil des Primers, von der Nukleotid 1 bis 8 von Intron 10 des Faktor-V-Gens abgeleitet ist, ist in Auge fallend angezeigt. Oligonukleotid-Primer 506-8 enthält eine "C"-zu-"T"-Substitution bezüglich des Oligonukleotid-Primers 506-7, was der Arg&sup5;&sup0;&sup6;-zu-Gln-Substitution entspricht, die im Text beschrieben ist (unterstrichen).
Primer 506-5 5' ATCAGAGCAGTTCAACCAGGG 3'
(Sense; Nukleotid 1414-1435-Faktor V-cDNA)
Primer 506-6 5' AAAAGTACCTGTATTCCT 3'
(Antisense; Nukleotid 1602-1612 von Faktor V-cDNA und Nukleotid 1-8 von Intron 10 des Faktor V-Gens)
Primer 506-7 5' AAAAGTACCTGTATTCCTC 3'
(Antisense; Nukleotid 1601-1612 der Faktor V-cDNA und Nukleotid 1-8 von Intron 10 des Faktor V-Gens)
Primer 506-8 5' AAAAGTACCTGTATTCCTT 3'
(Antisense; Nukleotid 1602-1612 der Faktor V-cDNA und Nukleotid 1-8 von Intron 10 des Faktor V-Gens)

Claims

1, Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Blutgerinnungsfaktor V umfasst, der resistent gegen aktiviertes Protein C ist.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Faktor V eine Mutation in wenigstens einer der Spaltungsstellen für aktiviertes Protein C trägt.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei die Faktor-V-Mutation eine Substitutionsmutation eines Argininrests auf wenigstens einer Position ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Resten 306, 506, 679 und 1765 besteht.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei sich die Mutation auf der Position 306 befindet.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei sich die Mutation auf der Position 506 befindet.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei sich die Mutation auf der Position 306 und auf der Position 506 befindet.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Faktor V erhältlich ist aus rekombinanten eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen und/oder transgenen Tieren, die Faktor V exprimieren, der resistent gegen aktiviertes Protein C ist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei der Faktor V erhältlich ist aus Plasma von Individuen, die eine Resistenz gegen aktiviertes Protein C aufweisen.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die weiterhin wenigstens einen zusätzlichen Gerinnungsfaktor umfasst.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, die ein von Plasma abgeleitetes Präparat, wie Prothrombinkomplex-Konzentrat oder aktivierter-Prothrombinkomplex-Konzentrat, umfasst,

11. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 für die Behandlung von Störungen in der Blutgerinnungskaskade.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, wobei die Störung in der Blutgerinnungskaskade auf eine Gerinnungsfaktordefizienz zurückzuführen ist.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei die Störung durch die Gegenwart von Inhibitoren oder Antikörpern gegen den Gerinnungsfaktor erschwert ist.

14. Verwendung eines Blutgerinnungsfaktors V, der resistent gegen aktiviertes Protein C ist, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Störungen in der Blutgerinnungskaskade.

15. Blutgerinnungsfaktor V, der resistent gegen aktiviertes Protein C ist, zur Verwendung bei der Behandlung von Störungen in der Blutgerinnungskaskade.