DE69520056T2

DE69520056T2 - Verbindungen zur Hemmung von Thrombin

Info

Publication number: DE69520056T2
Application number: DE69520056T
Authority: DE
Inventors: Daniel Jon Sall; Robert Theodore Shuman; Gerald Floyd Smith; Michael Robert Wiley
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1994-03-04
Filing date: 1995-03-03
Publication date: 2001-06-21
Anticipated expiration: 2015-03-04
Also published as: JPH07278091A; EP0673936A1; DE69520056D1; ES2154318T3; CA2143534A1; EP0673936B1; US5484772A

Description

Die Erfindung betrifft Thrombinhibibitoren, die brauchbare Antikoagulan6en in Säugern sind. Insbesondere betrifft sie L-Argirunaldehydderivate mit hoher Antikoagulanswirkung, Antithrombosewirkung und Thrombinselektivität.
Der Vorgang der Blutgerinnung, die Thrombose, wird durch eine komplexe proteolytische Kaskade ausgelöst, die zur Bildung von Thrombin führt. Thrombin entfernt proteolytisch die Aktivierungspeptide von den Aa und Bβ-Ketten von Fibrinogen, das in Blutplasma löslich ist, was die Bildung von unlöslichem Fibrin auslöst. Die Antikoagulation wird derzeit durch die Verabreichung von Heparinen und Kumarinen erreicht.
Die parenterale pharmakologische Kontrolle der Koagulation und der Thrombose basiert auf der Hemmung von Thrombin durch die Verwendung der Heparine. Heparine wirken indirekt auf Thrombin durch die Beschleunigung der hemmenden Wirkung von endogenem Antithrombin III (der hauptsächliche physiologische Inhibitor von Thrombin). Da die Antithrombin III Spiegel im Plasma variieren können und da oberflächengebundenes Thrombin gegenüber diesem indirekten Mechanismus resistent zu sein scheint, können Heparine eine uneffektive Behandlung darstellen. Da man glaubt, daß Gerinnungstests mit Wirksamkeit und Sicherheit zusammenhängen, müssen die Heparinspiegel mit Gerinnungstests überwacht werden (insbesondere mit dem aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest (APTT)). Kumarine verhindern die Bildung von Thrombin durch die Blockierung der posttranslationalen gamma-Carboxylierung bei der Synthese von Prothrombin und anderen Proteinen dieses Typs. Aufgrund ihres Wirkmechanismus kann die Wirkung von Kumarinen sich nur langsam entwickeln, nämlich 6-24 Stunden nach der Verabreichung. Ferner sind sie keine selektiven Antikoagulantien. Kumarine erfordern ebenfalls die Überwachung mit Gerinnungstests (insbesondere dem Prothrombinzeittest (PT)).
In letzter Zeit nahm das Interesse an kleinen synthetischen Peptiden, die durch proteolytische Enzyme auf ähnliche Weise zu der von natürlichen Substraten erkannt werden, zu. Tripeptidaldehyde, wie D-Phe-Pro-Arg-H, Boc-D-Phe-Pro-Arg-H und D-MePhe-Pro-Arg-H, Bajusz et al., J. Med. Chem., 33, 1729-1735 (1990) zeigen eine starke direkte Hemmung von Thrombin. Viele Forscher haben Analoga mit der Absicht synthetisiert, pharmazeutische Mittel zu entwickeln, beispielsweise Shuman et al., J. Med. Chem., 36, 314-319 (1993), wie auch EP 0 479 489 A und EP 0 542 525 A. Peptidderivate, die Thrombin hemmen, sind beschrieben in WO 93 11152 A, WO 93 15756 A, EP 0 606 003 A und US 5 250 660 A.
Obwohl die Heparine und Kumarine wirksame Antikoagulantien sind und bis jetzt aus den bekannten Tripeptidaldehyden kein Arzneimittel hervorging und trotz der anhaltenden Versprechungen dieser Verbindungsklasse existiert ein Bedarf für Antikoagulantien, die selektiv auf Thrombin wirken und unabhängig von Antithrombin III sind, eine schnelle Hemmwirkung nach der Verabreichung hervorrufen, und nicht mit der Lyse von Blutgerinnseln wechselwirken, wie dies zur Erhaltung der Hämostase erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen, wie sie im folgenden definiert sind, starke selektive Thrombininhibitoren sind.
Demnach ist es ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung, neue L-Argininaldehydderivate bereitzustellen, die starke Thrombininhibitoren sind, welche als Antikoagulantien brauchbar sind.
Andere Ziele, Merkmale und Vorteile werden für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen ersichtlich.
Die vorliegende Erfindung liefert eine thrombinhemmende Verbindung der Formel
worin
R¹ für Wasserstoff steht,
X für Prolinyl oder Azetidinyl-2-carbonyl steht,
Y für folgende Gruppe steht
worin R³ für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht,
Z¹ für eine Bindung oder -CH&sub2;- steht,
R&sup4; für unsubstituiertes oder monosubstituiertes Phenyl steht, und
Z für -NHR² steht, worin
R² für -(C=O)R&sup5; steht, worin R&sup5; für eine neun- oder zehngliedrige unsubstituierte oder monosubstituierte fusionierte bicyclische heterocyclische Gruppe mit einem Stickstoffatom steht, oder
R² für eine Gruppe -SO&sub2;R&sup6; steht, worin R&sup6; für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht, oder
R³ und Z unter Bildung einer Azetidinylgruppe oder eines fünf oder sechsgliedrigen unsubstituierten ungesättigten heterocyclischen Rings mit ein oder zwei Stickstoffatomen zusammengenommen werden, und worin ferner jedes Aryl oder jeder Heterocyclus unsubstituiert ist oder mit einem Substituenten monosubstituiert ist, der eine stabile Struktur ergibt, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub4; Alkyl, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, Amino (-NH&sub2;), Mono(C&sub1;-C&sub4;-alkyl)amino, Mercapto und (C&sub1;-C&sub4; Alkyl)thio, (-S(O)pC&sub1;-C&sub4; Alkyl), -NHS(O)pC&sub1;-C&sub4; Alkyl), NHC(O)C&sub1;-C&sub4; Alkyl, -S(O)pNH&sub2;, -S(O)pNH(C&sub1;-C&sub4; Alkyl) und -S(O)pN(C&sub1;-C&sub4; Alkyl)&sub2;, worin p für 0, 1 oder 2 steht,
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon oder ein pharmazeutisch annehmbares Solvat der Verbindung oder des Salzes hiervon.
Zusätzlich zu den Verbindungen der Formel I liefert die vorliegende Erfindung pharmazeutische Formulierungen, die eine Verbindung der Formel I zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthalten.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Hemmung der Koagulation in Säugern, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer koagulationshemmenden Dosis einer Verbindung der Formel I an einen Säuger, der dessen bedarf
Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Hemmung von Thrombin, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer thrombinhemmenden Dosis einer Verbindung der Formel I an einen Säuger, der dessen bedarf.
Ferner liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von thromboembolischen Störungen, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer wirksamen Dosis einer Verbindung der Formel I an einen behandlungsbedürftigen Säuger.
Die Erfindung betrifft neue Thrombininhibitoren, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen als Wirkstoffe enthalten und die Verwendung der Verbindungen als Antikoagulantien zur Prophylaxe und Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen, wie venöse Thrombose, Lungenembolie, arterielle Thrombose, insbesondere Myokardischämie, Myokardinfarkt und zerebrale Thrombose, allgemeine hyperkoagulierende Zustände und lokale hyperkoagulierende Zustände, wie nach Angioplastie und Koronarbypassoperationen, und allgemeine Gewebsverletzung, da sie zum entzündlichen Prozeß führt.
Der Ausdruck "Alkyl" selbst oder als Teil eines anderen Substituenten steht für einen gerad- oder verzweigtketfigen Alkylrest mit der angegebenen Anzahl an Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Isobutyl und sek-Butyl.
Der Ausdruck "Alkoxy" steht für einen gerad- oder verzweigtkettigen Alkylrest mit der angegebenen Anzahl an Kohlenstoffatomen, der an das Ausgangsmolekül durch einen Sauerstoffrest gebunden ist. Der Ausdruck "Halogen" steht für Chlor, Fluor, Brom oder Iod.
Der Ausdruck "Di(C&sub1;-C&sub4; Alkyl)amino" steht für eine Gruppe -N(C&sub1;-C&sub4; Alkyl)&sub2;, worin jede Alkylgruppe unabhängig die angegebene Anzahl an Kohlenstoffatomen aufweist.
Der Ausdruck "Perfluoralkyl" steht für einen gerad- oder verzweigtkettigen Alkylrest, der die angegebene Anzahl an Kohlenstoffatomen aufweist, wobei jede freie Valenz durch ein Fluoratom ersetzt ist, wie Trifluormethyl und Pentafluorethyl.
Der Ausdruck "fünf oder sechsgliedriger heterocyclischer Ring" steht für jeden fünf oder sechsgliedrigen Ring, der eine stabile Struktur bildet, die ein oder zwei Stickstoffatome, ein Schwefelatom, ein Sauerstoffatom, ein Stickstoff und ein Schwefelatom oder ein Stickstoffatom und ein Sauerstoffatom enthält. Der fünfgliedrige Ring weist eine oder zwei Doppelbindungen auf und der sechsgliedrige Ring weist zwei oder drei Doppelbindungen auf. Solche heterocyclischen Systeme umfassen Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Pyranyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Oxazinyl oder Thiazinyl.
Der Ausdruck "neun- oder zehngliedriger heterocyclischer Ring" steht für jede fusionierte bicyclisehe heterocyclische Gruppe, worin jeder der obigen fünf oder sechsgliedrigen Ringe an einen Benzolring, an einen Cyclohexanring oder einen anderen sechsgliedrigen heterocyclischen Ring wie oben definiert fusioniert ist, die eine stabile Struktur bildet. Diese heterocyclischen Systeme umfassen Indolyl, Benzothienyl, Benzofuryl, Benzoxazolyl, Benzoisoxazolyl, Benzopyrazolyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Benzimidazolyl und Benzothiazolyl,
Der Ausdruck "neun- oder zehngliedrige bicyclische Kohlenwasserstoffgruppe" steht für eine fusionierte bicyclische Gruppe
worin Q für -CH&sub2;-, -CH=CH- oder -CH&sub2;-CH&sub2;- steht,
Z wie oben fit Formel I definiert und gezeigt ist und die unterbrochenen Linien das Vorkommen oder Fehlen eines ungesättigten Zustands im Ring anzeigen.
Repräsentative Beispiele dieser fusionierten bicyclischen Gruppen sind unter anderem Indanyl, Dihydronaphthyl und Tetrahydronaphthyl.
Die Gruppen
werden jeweils als Prolinyl und Azetidin-2-carbonyl bezeichnet und jeweils als Pro und Azt abgekürzt.
In der Darstellung der Formel I ist die Carbonylfunktionalität von · an die in Formel I gezeigte Aminogruppe gebunden.
Man erkennt, daß viele der obigen Heterocyclen in tautomeren Formen existieren können. Alle solchen Formen liegen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung.
Alle der obigen Aryle, Heterocyclen und bicyclischen Kohlenwasserstoffe sind unsubstituiert oder substituiert mit einem oder zwei Substituenten, die eine stabile Struktur ergeben, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub4; Alkyl, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, Amino (-NH&sub2;), Mono(C&sub1;-C&sub4; Alkyl)amino, Mercapto, C&sub1;-C&sub4; Alkylthio (-S(O)P(C&sub1;-C&sub4; Alkyl)), -NHS(O)p(C&sub1;-C&sub4; Alkyl), -NHC(O)C&sub1;-C&sub4; Alkyl, -S(O)pNH&sub2;, -S(O)pNH(C&sub1;-C&sub4; Alkyl) und º-S(O)pN(C&sub1;-C&sub4; Alkyl)&sub2;, worin p für 0, 1 oder 2 steht.
Die Sterne in Formel I und der Substituent · bezeichnen ein chirales Zentrum, das (L) ist.
Zusätzlich existieren Diastereomere am Y Substituenten und in Abhängigkeit von den Substitutionen an diesem Y Substituenten können weitere Diastereomere existieren. Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Gemische aus zwei oder mehr Diastereomeren, wie auch jedes einzelne Isomer.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Verbindungen der oben definierten Formel I, worin
Z für -NHR² steht, worin
R² für -C(C=O)R&sup5; oder -S(O)n-R&sup5; steht,
R³ für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht,
R&sup4; für unsubstituiertes oder substituiertes Aryl steht, worin Aryl für Phenyl oder Naphthyl steht,
R&sup5; für C&sub1;-C&sub4; Alkyl, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, einen fünf oder sechsgliedrigen unsubstituierten oder substituierten heterocyclischen Ring mit ein oder zwei Stickstoffatomen oder eine neun- oder zehngliedrige unsubstituierte oder substituierte fusionierte bicyclische heterocyclische Gruppe mit ein oder zwei Stickstoffatomen steht,
n für 1 oder 2 steht, oder
Z und R³ unter Bildung einer Azetidinylgruppe oder eines fünf- oder sechsgliedrigen unsubstituierten oder substituierten heterocyclischen Rings mit ein oder zwei Stickstoffatomen oder einer neun- oder zehngliedrigen unsubstituierten oder substituierten fusionierten bicyclischen heterocyclischen Gruppe mit ein oder zwei Stickstoffatomen zusammengenommen werden,
und worin X, Z¹ und R¹ wie oben für Formel I definiert sind
und pharmazeutisch annehmbare Salze und Solvate hiervon.
Zuerst sind eine bevorzugte Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindungen die Verbindungen der oben definierten Formel I, worin
R¹ für Wasserstoff steht,
Z für -NHR² steht, worin
R² für -C(C=O)R&sup5; steht,
R³ für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht,
Z¹ für -CH&sub2;- steht,
R&sup4; für unsubstituiertes oder monosubstituiertes Phenyl steht,
R&sup5; für C&sub1;-C&sub4; Alkoxy oder eine neun- oder zehngliedrige unsubstituierte oder monosubstituierte fusionierte bicyclische heterocyclische Gruppe mit einem Stickstoffatom steht, und · wie oben für Formel I definiert ist,
und pharmazeutisch annehmbare Salze und Solvate hiervon.
Eine zweite besonders bevorzugte Gruppe an erfindungsgemäßen Verbindungen sind die Verbindungen der Formel I, worin
R¹ für Wasserstoff steht,
Z für -NHR² steht, worin
R² für -SO&sub2;R&sup5; steht,
R³ für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht,
R&sup4; für unsubstituiertes oder monosubstituiertes Phenyl steht,
R&sup5; für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht, und
X und Z¹ wie oben für Formel I definiert sind und
pharmazeutisch annehmbare Salze und Solvate hiervon.
Eine dritte Gruppe besonders bevorzugter erfindungsgemäßer Verbindungen sind die Verbindungen der Formel I, worin
R¹ für Wasserstoff steht,
Z für -NHR² steht,
R² für unsubstituiertes oder monosubstituiertes Phenyl steht,
R³ und Z unter Bildung einer Azetidinylgruppe oder eines fünf oder sechsgliedrigen unsubstituierten heterocyclischen Rings mit ein oder zwei Stickstoffatomen zusammengenommen werden, und
X wie oben für Formel I definiert ist und
pharmazeutisch annehmbare Salze und Solvate hiervon.
Wie oben erwähnt, umfaßt die Erfindung pharmazeutisch annehmbare Salze der durch die obige Formel I definierten Verbindungen. Eine bestimmte erfindungsgemäße Verbindung kann eine oder mehrere ausreichend basische funktionelle Gruppen aufweisen und demnach mit jeder von mehreren nicht toxischen anorganischen und organischen Säuren unter Bildung eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes reagieren. Säuren, die herkömmlich zur Bildung von Säureadditionssalzen verwendet werden, sind anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, und dergleichen und organische Säuren wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Essigsäure und dergleichen. Beispiele für solche pharmazeutisch annehmbaren Salze sind daher Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caproat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4- dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Laktat, γ-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, Mandelat und dergleichen. Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze sind solche, die mit Mineralsäuren gebildet werden wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure.
Wie oben erwähnt umfaßt die vorliegende Erfindung Solvate der Verbindungen der Formel I und die pharmazeutisch annehmbaren Salze hiervon. Eine bestimmte erfindungsgemäße Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon kann mit Wasser oder herkömmlichen organischen Lösemitteln Solvate bilden. Solche Solvate sind im Schutzumfang der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten.
Eine Verbindung der Formel I wird durch die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Entfernung der Schutzgruppe(n) P einer entsprechenden Verbindung der Formel II hergestellt
worin P an der Guanidinogruppe für eine Aminoschutzgruppe steht und PY für einen Rest Y steht, der eine unabhängig ausgewählte Schutzgruppe P für eine Verbindung der Formel I aufweisen kann, worin Y einen basischen NH Rest umfasst, wonach das Salz mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure gebildet wird, wenn ein Salz der Verbindung der Formel I erforderlich ist. Beispielsweise kann eine Verbindung der Formel II, worin die Aminoschutzgruppe(n) Benzyloxycarbonyl ist, durch Hydrogenolyse bei Atmosphärendruck über einen Palladium auf Kohle Katalysator in verdünnter ethanolischer Chlorwasserstoffsäure in das Hydrochlorid der entsprechenden Verbindung der Formel I umgewandelt werden. Eine Verbindung der Formel II wird auch durch die Formel PY(C=O)-X-Arg(P)-H dargestelt, worin · für Pro (Prolinyl) oder Azt (Azetidinyl-2-carbonyl) steht.
Die Verbindungen der Formel I werden dwch bekannte Verfahren der Peptidkupplung hergestellt. Gemäß einem solchen Verfahren wird die Säure PY-COOH, worin Y dieselbe Bedeutung hat wie dies in Formel I definiert ist und P für eine Aminoschutzgruppe steht, mit einem carboxygeschützten Prolin (oder Azetidin-2-carboxylester) unter Bildung des Dipeptids gekuppelt. Die carboxyschützende Estergruppe des Prolinrests wird dann entfernt (Abspaltung oder Esterspaltung) und die freie Säureform des Dipeptids wird mit der Lactamform des Arginins gekuppelt. Die obige Reaktionssequenz wird durch das folgende Schema 1 erläutert.
worin P für eine Aminoschutzgruppe steht.
Das gekuppelte Arg(P) Lactamprodukt (c) wird mit einem Hydridreduktionsmittel, vorzugsweise Lithiumaluminiumhydrid oder Lithiumtritertbutoxyaluminiumhydrid in einem inerten Lösemittel oder Lösemittelgeniisch umgesetzt, um den Lactamring zu reduzieren und das Tripeptid in der Argininaldehydform bereitzustellen, das durch die folgende Formel dargestellt ist
PY(C=O)-Pro-Arg(P)-H
worin (P) für Aminoschutzgruppen steht.
Die Schutzgruppen werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren entfernt, wie Hydrierung über einem Metallkatalysator.
Die Lactamform des Arginins erhält man durch intramolekulare Kupplung des aminogeschützten Arginins [Arg-OH]. Beispielsweise wird Boc-Arg-(Cbz)OH, das durch folgende Formel dargestellt ist
worin Boc für t-Butyloxycarbonyl steht und Cbz für Benzyloxycarbonyl steht, zuerst mit einem Chlorformiatester, beispielsweise Ethylchlorformiat bis Isobutylchlorformiat, in eine aktive Esterform umgewandelt, wie ein aktives gemischtes Anhydrid. Die Esterbildung wird in Gegenwart eines tertiären Amins ausgeführt, wie N- Methylmorpholin. Der Zusatz einer weiteren oder anderen tertiären Aminbase, wie Triethylamin oder Diisopropylethylamin, bewirkt die interne Acylierung unter Bildung der Lactamform des diaminogeschützten Arginins, wie dies im folgenden gezeigt ist.
Vor der Verwendung zur Kupplung mit PY(C=O)-Pro-OH, wie dies im obigen Schema gezeigt ist, wird die Boc Schutzgruppe oder eine andere Aminoschutzgruppe selektiv mit Trifluoressigsäure oder HCl unter Bildung der erforderlichen freien Aminogruppe entfernt.
Die Kupplung einer PYCOOH Verbindung mit einem Prolinester wird, wenn Y wie oben für die Formel I definiert ist, ausgeführt, indem man zuerst die Aminogruppe der Aminosäure schützt. Herkömmliche Aminoschutzgruppen, die gewöhnlich zum vorübergehenden Schutz oder Blockade der Aminogruppe verwendet werden, werden verwendet.
Die Aminoschutzgruppe bezieht sich auf Substituenten der Aminogruppe, die allgemein verwendet werden zum Blockieren oder zum Schutz der Aminofunktion während andere funktionelle Gruppen der Verbindung umgesetzt werden. Beispiele für solche Aminoschutzgruppen beinhalten die Formyl-, Trityl-, Phthalimid-, Trichloracetyl- Chloracetyl-, Bromacetyl- und Iodacetylgruppen, Urethan-artige blockierende Gruppen wie Benzyloxycarbonyl, t- Butoxycarbonyl, 4-Phenylbenzyloxycarbonyl, 2-Methylbenzyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, 4-Fluorbenzyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzyloxycarbonyl, 3-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 4-Brombenzyloxycarbonyl, 3-Brombenzyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 4-Cyanobenzyloxycarbonyl, 2-(4-Xenyl)isopropoxycarbonyl, 1,1-Diphenyleth-1-yloxycarbonyl, 1,1-Diphenylprop- 1-yloxycarbonyl, 2-Phenylprop-2-yloxycarbonyl, 2-(p-Toluyl)-prop-2-yloxycarbonyl, Cyclopentanyloxycarbonyl, 1-Methylcyclopentanyloxycarbonyl, Cyclohexanyloxycarbonyl, 1-Methylcyclohexanyloxycarbonyl, 2-Methylcyclohexanyloxycarbonyl, 2-(4-Toluylsulfonyl)ethoxycarbonyl, 2-(Methylsulfonyl)ethoxycarbonyl, 2-(Triphenylphosphino)ethoxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl ("FMOC"), 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 1-(Trimethylsilylmethyl)prop-1-enyloxycarbonyl, 5-Benzisoxalylmethoxycarbonyl, 4-Acetoxybenzyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 2-Ethinyl-2-propoxycarbonyl, Cyclopropylmethoxycarbonyl, 4-(Decyloxy)benzyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, 1-Piperidyloxycarbonyl und dergleichen, die Benzoylmethylsulfonylgruppe, die 2-Nitrophenylsulfenylgruppe, die Diphenylphosphinoxidgruppe und ähnliche Aminoschutzgruppen. Die Art der verwendeten Aminoschutzgruppe ist nicht entscheidend, solange die derivatisierte Aminogruppe unter den Bedingungen der folgenden Reaktion(en) an anderen Positionen des Moleküls stabil ist und im geeigneten Augenblick entfernt werden kann, ohne den Rest des Moleküls zu zerstören. Bevorzugte Aminoschutzgruppen sind die Benzyloxycarbonyl-, Allyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl- und Tritylgruppen. Ähnliche Aminoschutzgruppen, die in der Cephalosporin-, Penicillin- und Peptidtechnik verwendet werden, werden ebenfalls durch die obigen Ausdrücke umfaßt. Weitere Beispiele für Gruppen die mit den obigen Ausdrücken gemeint sind, werden beschrieben von J. W. Barton, "Protective Groups in Organic Chemistry", Herausgeber J. G. W. McOmie, Plenum Press, New York, N. Y., 1973, Kapitel 2 und T. W. Greene "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons New York, N. Y., 1981, Kapitel 7. Der verwandte Ausdruck "geschütztes Amino" definiert eine Aminogruppe, die mit einer oben diskutierten Aminoschutzgruppe substituiert ist.
Bei der Durchführung der Kupplungsreaktion verwendet man eine Esterschutzgruppe für Prolin, die durch Bedingungen entfernbar ist unter denen die Aminoschutzgruppe intakt bleibt. Die Aminoschutzgruppe der acylierenden Säure PY-COOH bleibt daher an ihrem Platz zum Schutz der Aminogruppe während dem anschließenden Kuppeln mit der Argininlactamverbindung unter Bildung von (c).
Die carboxyschützende Estergruppe, wie sie in der Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf eines der Esterderivate der Carboxygruppe, die herkömmlich zur Blockierung oder zum Schutz der Carboxyfunktion verwendet werden, während Reaktionen an anderen funktionellen Gruppen der Verbindung durchgeführt werden. Beispiele ihr solche Carboxyschutzgruppen beinhalten C&sub1;-C&sub3; Alkyl, Benzyl, 4-Nitrobenzyl, 4-Methoxybenzyl, 3,4- Dimethoxybenzyl, 2,4-Dimethoxybenzyl, 2,4,6-Trimethoxybenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl, Pentamethylbenzyl, 3,4- Methylen-dioxybenzyl, Benzhydryl, 4,4'-Dimethoxybenzhydryl, 2,2',4,4'-Tetramethoxybenzhydiyl, t-Butyl, t-Amyl, Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl, 4,4',4"-Trimethoxytrityl, 2-Phenylprop-2-yl, Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, Phenacyl, 2,2,2-Trichlorethyl, 2-(Trimethylsilyl)ethyl, 2-(Di(n-butyl)methylsilyl)ethyl, p-Toluolsulfonylethyl, 4-Nitrobenzylsulfonylethyl, Allyl, Cinnamyl, 1-(Trimethylsilylmethyl)prop-1-en-3-yl und ähnliche Reste. Die Art der verwendeten Carboxyschutzgruppe ist nicht entscheidend, solange die derivatisierte Carbonsäure unter den Bedingungen der anschließenden Reaktion(en) an anderen Positionen des Moleküls stabil ist und zur geeigneten Zeit ohne Zerstörung des Molekülrests entfernt werden kann. Insbesondere ist es wichtig, das carboxygeschützte Molekül keinen starken nukleophilen Basen oder reduktiven Bedingungen zu unterziehen, die hochaktivierte Metallkatalysatoren verwenden, wie Raney Nickel. (Solche harschen Entfernungsbedingungen sind ebenfalls zu vermeiden, wenn die später diskutierten Aminoschutzgruppen entfernt werden). Bevorzugte Schutzgruppen sind C&sub1;- C&sub3; Alkyl und Benzyl. Weitere Beispiele dieser Gruppen findet man in E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", Herausgeber J. G. W. McOmie, Plenum Press, New York, N. Y., 1973, Kapitel 5, und T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley und Sons, New York, N. Y., 1981, Kapitel 5.
Die Verbindungen der Formel I, worin · für Azetidinyl (oder Prolinyl) steht, werden auf analoge Weise durch bekannte Verfahren der Peptidkupplung hergestellt. Gemäß einem solchen Verfahren wird die cyclische Lactamform von Arginin (e) hergestellt und mit einer aminogeschützten Azetidin-2-carbonsäure (d) unter Bildung des Dipeptids (f) gekuppelt, wie dies im folgenden gezeigt ist
worin P für eine Aminoschutzgruppe steht, wie die Benzyloxycarbonylgruppe (Cbz), t-Butoxycarbonyl (Boc), p- Toluolsulfonyl und dergleichen. Vorzugsweise ist die verwendete Aminoschutzgruppe durch Hydrierung oder Behandlung mit milder Säure (beispielsweise Trifluoressigsäure) oder einer starken Säure (beispielsweise HCl) entfernbar. Beispiele für andere geeignete Aminoschutzgruppen werden bereitgestellt in "Protective Groups in Organic Synthesis", zweite Ausgabe von T. W. Greene und Peter G. M. Wuts, Kapitel 7, Seite 309-405 (1991), Herausgeber John Wiley & Sons, Inc. Die Boc Gruppe oder eine andere geeignete Schutzgruppe wird vom Stickstoff des Azetidinrings entfernt, der dann mit der gewünschten Aminoacylgruppe unter Bildung des im folgenden gezeigten Tripeptids acyliert wird.
Obwohl dies für die erfindungsgemäßen Verbindungen erläutert und beschrieben ist, worin · für Azetidinyl-2-carbonyl steht, erkennt der Fachmann, daß diese Verfahren auch zur Bildung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können, worin · für Prolinyl steht.
Das gekuppelte Arg(P) Lactamprodukt (g) wird mit einem Hydridreduktionsnüttel, vorzugsweise Lithiumaluminiumhydrid oder Lithiumtritertbutoxyaluminiumhydrid, in einem inerten Lösemittel oder Lösemittelgemisch unter Reduktion des Lactams und Bereitstellung des Tripeptids in der Argininaldehydform reduziert, das durch die folgende Formel dargestellt wird
PY(C=O)-Azt-Arg(P)-H
worin P für eine Aminoschutzgruppe steht. Die Schutzgruppen werden durch Verfahren entfernt, die dem Fachmann bekannt sind, wie die Hydrieruug über einem Metallkatalysator. Die Schutzgruppen können von der Y-Gruppe und von der Arginalgruppe in Abhängigkeit der verwendeten Schutzgruppen gleichzeitig oder nacheinander entfernt werden.
Alternativ dazu werden die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Kuppeln der PY-COOH Säure mit carboxygeschützter 2-Azetidincarbonsäure hergestellt. Die Carboxygruppe wird wie das Dipeptid einer Schutzgruppenabspaltung unterzogen und dann mit dem wie oben beschrieben hergestellten aminogeschützten Arginin in der Lactamform gekuppelt. Das Tripeptid wird dann unter Bildung des aminogeschützten Arginaltripeptids reduziert, wie dies oben beschrieben ist.
Die Kupplung einer PYCOOH Verbindung wird ausgeführt, indem man zuerst die Aminogruppe der Aminosäure schützt. Man nimmt herkömmliche Aminoschutzgruppen, die gewöhnlich zum vorrübergehenden Schutz oder zur vorrübergehenden Blockierung der Aminogruppe verwendet werden. Beispiele für solche Schutzgruppen sind oben beschrieben.
Die oben beschriebenen Kupplungsreaktionen werden im Kalten durchgeführt, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa -20ºC und etwa 15ºC. Die Kupplungsreaktionen werden in einem inerten organischen Lösemittel durchgeführt, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Chloroform und ähnlichen herkömmlichen Lösemitteln oder einem Gemisch solcher Lösemittel. Im allgemeinen werden wasserfreie Bedingungen verwendet, wenn bei der Kupplungsreaktion ein aktiver Ester der acylierenden Säure verwendet wird.
Die Verbindungen der Formel I, worin die Zwischenprodukte für den Y Substituenten (α,α-disubstituierte Aminosäuren der Formel Y-COOH) nicht im Handel erhältlich sind, können leicht durch die im folgenden im Schema 2 erläuterten Verfahren hergestellt werden. Ein geeigneter α-Aminosäureester wird mit einem Benzophenonimin kondensiert und die entstehenden Imine werden mit einer starken Base deprotoniert, wie Kalium-t-butoxid oder Lithium(bis(trimethylsilyl)amid. Die entstehenden Carbonionen werden dann mit einem geeigneten Elektrophil behandelt, wie primären Alkylhalogeniden, allylischen Alkylhalogeniden oder benzylischen Alkylhalogeniden. Das Imin kann dann durch die Behandlung mit einer wäßrigen Säure (von etwa 1 N bis etwa 3 N anorganische Säure, vorzugsweise HCl) entfernt werden und das entstehende Aminosäurederivat kann auf die wie oben beschriebenen Verbindungen der Formel I übertragen werden. Schema 2
In Schema 2 sind Z¹, R&sup4; und R³ wie für Formel I definiert, L steht für eine gute Abgangsgruppe, vorzugsweise Halogen und "Ester" steht für eine geeignete Carboxyschutzgruppe, vorzugsweise C&sub1;-C&sub4; Alkyl. Die Verbindung (1) wird weiter mittels herkömmlicher synthetischer Verfahren unter Bildung des gewünschten Z Substituenten umgesetzt, wie er für Formel I definiert ist. Solche Verfahren umfassen die Blockierung der Aminogruppe mit einer geeigneten Schutzgruppe, die Schutzgruppenentfernung von der Carboxygruppe und die anschließende Durchführung der Kupplung unter Bildung der erfindungsgemäßen Verbindungen, wie sie oben beschrieben sind.
Ein α-Aminosäureester, der N-substituiert ist (wie AZT) (das heißt die Verbindungen der Formel I, worin Z für -NHR² steht und mit R³ zusammengenommen wird) können direkt mittels einer starken Base (wie Lithiumdiisopropylamid, LDA) und einem Elektrophil R&sup4;-Z¹-L α-substituiert werden, worin R&sup4; und Z¹ wie für Formel I definiert sind und L für eine gute Abgangsgruppe steht, vorzugsweise Halogen, vorausgesetzt es wird eine Stickstoffschutzgruppe (P) verwendet, die gegenüber den basischen Reaktionsbedingungen stabil ist.
Beide obigen Verfahren zur α-Substitution eines α-Aminosäureesters ergeben ein Enantiomerengemisch, das getrennt oder als razemisches Gemisch weitergeführt werden kann.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von geeigneten α-substituierten α-Aminosäuren (Substituent Y der Formel 1) ist die Streckersynthese. Im allgemeinen werden α-Aminonitrile durch die Behandlung eines Aldehyds oder Ketons mit NaCN und NH&sub4;Cl hergestellt. Weitere Details, die dieses Syntheseverfahren und Varianten hiervon betreffen, befinden sich in March, Advanced Organic Chemistry, 3. Ausgabe, Herausgeber John Wiley & Sons, Inc. (1985), Seiten 855-856.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden am besten in Form der Säureadditionssalze isoliert. Salze der Verbindungen der Formel I, wie die, die mit den oben erwähnten Säuren gebildet werden, sind als pharmazeutisch annehmbare Salze zur Verabreichung der antithrombotischen Mittel und zur Herstellung von Formulierungen dieser Mittel brauchbar. Es können andere Säureadditionssalze hergestellt und zur Isolierung und Reinigung der Peptide verwendet werden. Beispielsweise können so die Salze verwendet werden, die mit den Sulfonsäuren gebildet werden, wie Methansulfonsäure, n-Butansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und Naphthalinsulfonsäure.
Das bevorzugte Verfahren zur Isolierung und Reinigung der durch die Formel I dargestellten Verbindungen unter gleichzeitiger Bildung der gewünschten stabilen Salzform ist in US-A 5 250 660 beschrieben. Gemäß dem Verfahren werden stabile Sulfate oder Hydrochloride durch präparative Reinigung über eine C&sub1;&sub8; Umkehrphasenchromatographie bereitgestellt, worin die wäßrige Komponente Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure bei PH 2,5 und Acetonitril als organische Komponente enthält. Der pH des sauren Eluenden wird zwischen etwa pH 4 und etwa pH 6 mit einem basischen Anionenaustauscherharz in der Hydroxylform eingestellt, beispielsweise Bio-Rad AG- 1 · 8. Nach dem Einstellen des pH wird die Lösung des Tripeptidsulfat- oder -hydrochloridsalzes unter Bildung des gereinigten Salzes in Form des trockenen Pulvers lyophilisiert. In einem Beispiel des Verfahrens wird das rohe EtOCO-D-Phe(αMe)-Pro-ArgH · HCl in Wasser gelöst und die Lösung wird auf eine Vydac C&sub1;&sub8; RPHPLC 5 cm · 50 cm Säule aufgetragen. Ein Gradient (10 ml/min) von 2-20 Prozent B (A = 0,05 Prozent HCl, B = Acetonitril) über 280 Minuten, gefolgt von isokratische 20% B über 400 Minuten wird verwendet. Es werden mehrere Fraktionen gesammelt und die, die das Produkt enthalten, wie dies durch analytische RP-HPLC bestimmt wird, werden vereinigt. Der PH der vereinigten Fraktionen wird auf pH 4,5 mit AG-1 · 8 Harz (Bio-Rad, 3300 Ragatta Blvd., Richmond, CA 94804) in Hydroxidform eingestellt. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat wird unter Bildung des reinen D-, L-, L-Tripeptids in Form des Hydrochloridsalzes lyophilisiert.
Die optisch aktiven Isomere der Diastereomere am Y Substituenten werden ebenfalls als Teil der Erfindung betrachtet. Solche optisch aktiven Isomere können aus ihren jeweiligen optisch aktiven Vorläufern durch oben beschriebene Verfahren oder durch Auflösen der razemischen Gemische hergestellt werden. Diese Auflösung kann durch eine Derivatisierung mit einem chiralen Reagenz gefolgt von einer Chromatographie oder wiederholter Kristallisation ausgeführt werden. Die Entfernung des chiralen Hilffstoffs durch Standardverfahren ergibt im wesentlichen optisch reine Isomere der erfindungsgemäßen Verbindungen oder ihrer Vorläufer. Weitere Details, die die Trennungen betreffen, können in Jaques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions, John Wiley & Sons, 1981 erhalten werden.
Die als Ausgangsmaterialien bei der Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendeten Verbindungen sind gut bekannt und werden in dem Ausmaß, in dem sie nicht im Handel erhältlich sind, leicht durch Standardverfahren synthetisiert, die herkömmlich vom Fachmann verwendet werden.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Beschreibung der Erfindung und sollen den Schutzumfang hiervon nicht beschränken.
Die Rf Werte in den folgenden Beispielen werden, falls nichts anderes angegeben ist, durch Silicageldünnschichtchromatographie mittels Kieselgel 60F-254 (Merck, Darmstadt) in den folgenden Lösemittelsystemen bestimmt:
(A) Chloroform - Methanol - Essigsäure 135 : 15 : 1, V : V : V
(B) Ethylacetat - Essigsäure - absolutes Ethanol 90 : 10 : 10, V : V : V
(C) Chloroform - Methanol - Essigsäure, 90 : 30 : 5, V : V : V
(D) Ethylacetat
Die in den Beispielen verwendeten analytischen HPLC Methoden sind folgende:
Methode 1: Waters 600 E mittels einer Vydac CI8 Umkehrphasensäule mit 0,46 cm · 10 cm. Das Chromatogramm wird auf einem LDC bei 214 nm mittels eines Gradienten von A = Wasser, das 0,1% TFA (V:V) enthält und B = Acetonitril, das 0,1 Prozent TFA (V: V) enthält, verfolgt.
Methode 2: Pharmacia FPLC mittels einer Vydac C18 Umkehrphasensäule mit einer Größe von 0,46 cm · 10,0 cm. Die Aufzeichnung wird auf einem Pharmacia UV-M bei 214 nm mittels eines Gradienten von entweder A = Wasser, das 0,1% TFA (V : V) enthält oder B = Acetonitril, das 0,1 Prozent TFA (V : V) enthält, verfolgt.
Methode 3: Hitachi L-6200 mittels einer Vydac C&sub1;&sub8; Umkehrphasensäule mit 0,46 cm · 10 cm. Die Proben werden mittels eines Gradienten eluiert, der sich aus A (0,1% wäßrige TFA (V : V)) und B (0,1% TFA in Acetonitril (V : V)) zusammensetzt. Das Chromatogramm wird bei 214 nm mittels eines L-4000 UV Detektors verfolgt.
Die hierin verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
Aminosäuren: Arg = Arginin, Pro = Prolin, Azt = Azetidin-2-carbonsäure.
Boc = t-Butyloxycarbonyl (t-Butoxycarbonyl)
Bzl oder Bn = Benzyl
Cbz = Benzyloxycarbonyl
DCC = Dicyclohexylcarbodiimid
DMF = Dimethylformamid
DMSO = Dimethylsulfoxid
EtOAc = Ethylacetat
Et&sub2;O = Diethylether
EtOH = Ethanol
FAB-MS = Massenspektrum durch schnellen Atombeschuß
FD-MD = Felddesorptionsmassenspektrum
HOBT = 1-Hydroxybenzotriazolhydrat
HPLC = Hochleistungsflüssigchromatographie
IR = Infrarotspektrum
LAH = Lithiumaluminiumhydrid
NMR = Kernmagnetresonanz
NMI = N-Methylindol-2-carbonyl
Phg = Phenylglycin
RPHPLC = Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie
TFA = Trifluoressigsäure
THF = Tetrahydrofuran
TLC = Dünnschichtchromatographie
OPFF = Pentafluorphenoxy
PFF = Pentafluorphenyl
Falls nichts anderes angegeben ist, werden die pH Einstellungen und die Aufarbeitung mit wäßrigen Säure- oder Basenlösungen durchgeführt. Die RPHPLC wird mittels 0,05% wäßriger HCl (V : V) (in den Beispielen als "A" bezeichnet) und Acetonitril (in den Beispielen als "B" bezeichnet) ausgeführt. Gemische aus A und B sind V : V. Wenn ¹H NMR angegeben ist, wurde das durch die Umsetzung erhaltene Produkt durch Protonen NMR charakterisiert, um zu bestätigen, daß die beschriebene Verbindung erhalten wurde.

Beispiel 1

Herstellung von 1-Methylindol-2-carbonyl-D-(α-methyl)phenylglycinyl-Azt-Arg-H-hydrochlorid

A) Boc-Arg(Cbz)-OH

Zu einer Lösung aus Boc-Arg(HCl)-OH (82,1 g, 250 mmol) in 5 N NaOH (240 ml), die auf -5ºC gekühlt ist, wird tropfenweise Benzylchlorformiat (143 ml, 1,0 mol) (4 Äqu.) über 55 Minuten zugegeben, während der pH mit 5 N Natriumhydroxid (250 ml) auf 13,2-13,5 gehalten wird. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und mit Et&sub2;O (2 x 500 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit 3 N H&sub2;SO&sub4; (560 ml) auf pH 3,0 angesäuert und mit EtOAc (550 ml) extrahiert. Die organische Phase wird abgetrennt und die wäßrige Phase wird mit einer zusätzlichen Menge EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung (66,1 g, 65% Ausbeute) zur Trockne eingedampft.
TLC Rf (C) 0,43
FD-M5 408 (M&spplus;)
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 1,42 (s, 9H, 1,61-1,91 (m, 4H), 3,23-3,41 (m, 2H), 4,17 (d, 1H), 5,21 (s, 2H), 5,62 (d, 1H), 7,30- 7,42 (m, 6H), 8,27 (m, 1H).

B) Boc-Arg(Cbz)-Lactam

Zu einer Lösung aus Boc-Arg(Cbz)-OH (A) (66,0 g, 0,162 mol) in trockenem THF (230 ml), die auf -10ºC gekühlt ist, wird N-Methylmorpholin (18,7 ml, 1,05 Äqu.) gefolgt von Isobutylchlorformiat (22,5 ml, 1,05 Äqu.) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 5 Minuten bei -10ºC gerührt und Triethylamin (23,5 ml, 1,05 Äqu.) wird zugegeben. Nachdem die Reaktion für 1 Stunde bei -10ºC und für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt wurde, wird die Reaktion in 1 l Eiswasser gegossen. Der entstehende Niederschlag wird filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wird unter Bildung der Titelverbindung als weißer Feststoff (38,05 g, 60% Ausbeute) aus EtOAc umkristallisiert.
TLC Rf (A) 0,77
FD-MS 391 (MH&spplus;)
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 1,48 (s, 9H), 1,78-1,98 (m, 2H), 2,50 (m, 1H), 3,41 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,90 (m, 1H), 5,16 (s, 2H), 5,27 (m, 1H), 7,28-7,45 (m, 6H), 9,41 (m, 1H), 9,68 (m, 1H).

C) HCl · Arg(Cbz)-Lactam

Eine gesättigte HCl (g) Lösung in EtOAc (7,2 l) wird tropfenweise über 30 Minuten zu einer Lösung von Boc-Arg(Cbz)-Lactam (B) (641 g, 1,64 mol) gegeben, das in CH&sub2;Cl&sub2; (3 l) bei -10ºC gelöst wurde. Die Reaktion kann 1 Stunde bei -10ºC rühren und wird langsam auf Raumtemperatur erwärmt (3 Stunden). Man gibt Diethylether (12 l) zu und filtriert den Niederschlag, wäscht mit Diethylether und trocknet im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung (580 g).
TLC Rf (C) 0,29,
FD-MS 291 (MH&spplus;).

D) Methyl-Nα-diphenylmethylen-DL-phenylglycinat

Zu einer Lösung aus Benzophenonimin (53,8 g, 297 mmol) in Methylenchlorid (500 ml) wird bei Raumtemperatur DL-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid (59,9 g, 297 mmol) gegeben und die Reaktioon wird für 48 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird dreimal mit Wasser (200 ml) gewaschen und die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung eines klaren Öls konzentriert. Das Öl wird aus Pentan unter Bildung der Titelverbindung (98,5 g, 100% Ausbeute) umkristallisiert.
FAB-MS 330 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub1;&sub9;NO&sub2;
C 80,22 H 5,81 N 4,25
Gefunden: C 80,50 H 5,93 N 4,14

E) Methyl-Nα-diphenylmethylen-DL-(α-methyl)phenylglycinat

Eine Lösung aus Methyl-Nα-diphenylmethylen-DL-phenylglycinat (D) 14,8 g, 44,8 mmol) in wasserfreiem THF (200 ml) wird tropfenweise zu einem Gemisch aus 18-Kronen-6 (11,8 g, 44,8 mmol), Kaliumhydrid (11,2 g, 67,3 mmol), THF (100 ml) unter einer inerten Atmosphäre gegeben. Zur Reaktion wird tropfenweise eine Lösung Methyliodid (6,0 ml, 89,7 mmol) in THF (20 ml) gegeben. Die Reaktion wird für weitere 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Reaktion wird tropfenweise eine Lösung gegeben, die D, HOAc (7,0 ml), Wasser (25 ml) und THF (30 ml) enthält. Die Reaktion wird mit Ethylacetat und Wasser verdünnt, die organische Phase wird abgetrennt, dreimal mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum unter Bildung eines Öls konzentriert, das aus Hexan unter Bildung der Titelverbindung (10,2 g, 66% Ausbeute) kristallisiert wird.
FAB-MS 344 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub1;NO&sub2;
C 80,44 H 6,15 N 4,08
Gefunden: C 80,40 H 6,26 N 4,03

F) DL-(α-Methyl)phenylglycin

Eine Lösung aus Methyl-Nα-diphenylmethylen-DL-(α-methyl)phenylglycinat (E) (72,4 g, 211 mmol) in 5 N HCl (400 ml) wird am Rückfluß gekocht (24 Stunden). Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert und der pH des Filtrats wird mit verdünnter NH&sub4;OH Lösung auf 5,8 eingestellt. Die wäßrige Lösung wird im Vakuum konzentriert, bis die Kristallisation beginnt. Die Reaktion wird über Nacht bei 5ºC gelagert und der Niederschlag wird filtriert und im Vakuum unter Bildung der Titelverbindung (22 g, 63% Ausbeute) getrocknet.
FAB-MS 166 (MH&spplus;)

G) D-(α-Methyl)phenylglycin

Eine Lösung aus DL-(α-Methyl)phenylglycin (F) (87 g, 431,4 mmol) in Wasser wird mit 5 N NaOH auf pH 6,0 eingestellt. Der Niederschlag wird filtriert und unter Bildung von 82 g eines weißen Feststoffs getrocknet. Der Feststoff (82 g) wird in 96% Amiesensäure (750 ml) suspendiert und Essigsäureanhydrid (200 ml, 431,4 mmol) wird langsam zum Reaktionsgemisch gegeben. Die Reaktion kann für 30 Minuten bei Raumtemperatur rühren und die Lösung wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das Öl wird in EtOAc (1500 ml) gelöst, dreimal mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und aus EtOAc/Hexan unter Bildung eines weißen Feststoffs aus Nα-Formyl-DL-(α-methyl)phenylglycin (77,9 g, 93%) kristallisiert. Das Nα- Formyl-DL-(α-methyl)phenylglycin (77,3 g, 400 mmol) wird in EtOAc (450 ml) und EtOH (50 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wird Chinin (68,18 g, 210 mmol) und Diethylether (1000 ml) gegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur stehengelassen (24 Stunden). Das entstehende kristalline Material wird filtriert und die Mutterlaugen werden im Vakuum zu einem weißen Feststoff konzentriert. Der weiße Feststoff wird in EtOAc suspendiert, mit 1,5 N Citronensäure und Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum zu einem weißen Feststoff aus Nα-Formyl-D-(α-methyl)phenylglycin (26,3 g, 67% Ausbeute) konzentriert, [α]D = 61º (c = 0,5 / MeOH). Das Nα-Formyl-D-(α-methyl)phenylglycin (25 g, 124 mmol) wird in 2 N HCl (130 ml) suspendiert und die Reaktion wird am Rückfluß gekocht (2 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt und die wäßrige Lösung wird im Vakuum konzentriert, bis die Kristallisation beginnt. Das Präzipitat wird gesammelt und im Vakuum unter Bildung der reinen Titelverbindung (18,6 g, 74% Ausbeute) getrocknet.

H) 1-Methylindol-2-carbonyl-D-(α-methyl)phenylglycin

Zu einer Lösung aus D-(α-Methyl)phenylglycin (G) (2,01 g, 10 mmol) in Wasser werden 2 N NaOH zur Einstellung des pH auf 6,5 gegeben und die Lösung wird gefriergetrocknet. Der Feststoff wird in DMF (30 ml), Bis(trimethylsilyl)acetamid (3,7 ml, 15 mmol) suspendiert und 1-Methylindol-2-carboxypentafluorphenylester (3,41 g, 10 mmol) wird zur Reaktion gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 60ºC gerührt (24 Stunden) und im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Der Rückstand wird in Wasser (100 ml) und Diethylether (50 ml) gelöst und der pH wird mit 2 N NaOH auf 9,0 eingestellt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt, EtOAc (150 ml) wird zugegeben und die Lösung wird mit 5 N HCl auf 2,8 angesäuert. Die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der Titelverbindung (2,27 g, 70% Ausbeute) konzentriert.
FAB-MS 323 (MH&spplus;)

I) 1-Methylindol-2-carbonyl-D-(α-methyl)phenylglycinyl-Azt-OH

Zu einer Lösung aus 1-Methylindol-2-carbonyl-D-(α-methyl)phenylglycin (II) (2,2 g, 6,9 mmol) in EtOAc (25 ml) wird 2,4,5-Trichlorphenol (1,65 g, 8,3 mmol) und DCC (1,72 g, 8,3 mmol) gegeben und auf 0ºC gekühlt. Die Reaktion wird für eine Stunde bei 0ºC und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende Niederschlag wird durch Filtration entfernt und die Mutterlauge wird im Vakuum zu einem Öl konzentriert. Das entstehende Öl wird in Pyridin (35 ml) gelöst und L-Azetidin-2-carbonsäure (0,7 g, 6,9 mmol) und Triethylamin (0,97 ml, 6,9 mmol) werden zum Reaktionsgemisch gegeben. Nachdem die Reaktion bei Raumtemperatur gerührt wurde (24 Stunden), wird das Pyridin im Vakuum bis auf ein Öl entfernt. Der Rückstand wird in Wasser (100 ml) und Diethylether (50 ml) verdünnt und der pH der Lösung wird mit 2 N NaOH auf 9,0 eingestellt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt, EtOAc (150 ml) wird zugegeben und der pH der Lösung wird mit 3 N HCl auf 3,0 eingestellt. Die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und das Filtrat wird im Vakuum zu einem amorphen Feststoff der rohen Titelverbindung (2,3 g) eingedampft. Der rohe Feststoff (2,3 g) wird durch eine Chromatographie auf Silicagel mittels einer Stufengradientenelution (CHCl&sub3; 100 bis CHCl&sub3; - MeOH 70 : 30) unter Bildung der reinen Titelverbindung als amorpher Feststoff (0,81 g, 29% Ausbeute) gereinigt.
FD-MS 406 (MH&spplus;)

J) 1-Methylindol-2-carbonyl-D-(α-methylphenylglycinyl-Azt-Arg(Cbz)-lactam

In Kolben 1 wird 1-Methylindol-2-carbonyl-D-(α-methyl)phenylglycinyl-Azt-OH (I) (0,51 g, 1,5 mmol) in DMF (10 ml) gelöst, auf -15ºC gekühlt und N-Methylmorpholin (0,17 ml, 1,55 mmol) wird gefolgt von Isobutylchlorformiat (0,19 ml, 1,41 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei -15ºC für 2 Minuten gerührt. In Kolben 2 wird HCl · Arg(Z)-Lactam (C) (0,46 g, 1,41 mmol) in DMF (10 ml) gelöst, auf 0ºC gekühlt und Diisopropylethylamin (0,27 ml, 1,55 mmol) wird zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 0ºC für 2 Minuten gerührt.
Der Inhalt von Kolben 2 wird zu Kolben 1 gegeben und das Reaktionsgemisch wird für 4 Stunden (-15ºC) gefolgt von 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine 1 N NaHCO&sub3; Lösung (2 ml) wird zugegeben und das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird mit EtOAc (100 ml) und Wasser (50 ml) gelöst. Die organische Phase wird abgetrennt und nacheinander mit 1 N NaHCO&sub3;, Wasser und 0,1 N HCl gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und zu einem amorphen Feststoff der Titelverbindung (0,88 g, 92% Ausbeute) im Vakuum eingedampft.
TLC Rf (A) 0,74
FAB-M5 678 (MH)&spplus;

K) 1-Methylindol-2-carbonyl-D-(α-methyl)phenylglycinyl-Azt-Arg-H · HCl

Zu einer gerührten, gekühlten (-70ºC) Lösung von 1-Methylindol-2-carbonyl-D-(α-methyl)phenylglycinyl- Azt-Arg(Cbz)-lactam (J) (0,81 g, 1,19 mmol) unter einer Stickstoffatmosphäre in wasserfreiem THF (50 ml) wird 1 M Lithiumaluminiumhydrid in THF (1,2 ml, 1,2 mmol) gegeben. Die Reaktion wird für 30 Minuten bei -70ºC gerührt. Eine Lösung aus 5 ml THF und 5 ml einer 0,5 N H&sub2;SO&sub4; wird tropfenweise zur Reaktion gegeben. Die Reaktion wird mit EtOAc (100 ml) und Wasser (50 ml) verdünnt. Die organische Phase wird abgetrennt, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung eines amorphen Feststoffs (0,76 g) zur Trockne konzentriert. Der Feststoff wird in Ethanol (100 ml), Wasser (25 ml) und 1 N HCl (1,67 ml, 1,67 mmol) gelöst und in Gegenwart von 5% Pd/C Katalysator (0,5 g) bei Umgebungstemperatur und Umgebungsdruck hydriert. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird der Katalysator durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum auf 100 ml konzentriert und gefriergetrocknet. Der weiße Feststoff wird in Wasser gelöst, durch ein Millipore 0,5 um Filter filtriert und unter Bildung der reinen Titelverbindung gefriergetrocknet (0,445 g, 64% Ausbeute).
FAB-MS 546 (MH&spplus;)
[α]D = 42,9º (c = 0,5 / 0,01 N HCl) Beispiel 2 Herstellung von D-Prolinyl-(α-benzyl)-L-prolinyl-L-argininaldehyddihydrochloriddihydrat

A) N-Cbz-Pro-OMe

Zu einer Lösung von N-Cbz-Prolin (140 g, 562 mmol) in Methanol (850 ml) wird p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (5 g, 26 mmol) gegeben. Die Lösung wird bis zum Rückfluß erhitzt und das Rühren wird dür 12 Stunden fortgesetzt. Der Heizmantel wird entfernt und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Lösemittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Der Rückstand wird in Ethylacetat (500 ml) gelöst und zweimal mit gesättigtem wäßrigem NaHCO&sub3; (300 ml) und zweimal mit Kochsalzlösung (200 ml) gewaschen, mit MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und unter Bildung eines farblosen Öls (129 g, 88% Ausbeute) konzentriert.
FD-MS m/e 263 (M&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub7;NO&sub4;
C 63,87 H 6,51 N 5,32
Gefunden: C 64,03 H 6,56 N 5,28

B) N-Cbz-D,L-Pro-(α-benzyl)-OMe

Zu einer 0,5 M Lösung aus Kaliumhexamethyldisilazid (200 ml, 100 mmol) in Toluol bei -78ºC und unter N&sub2; wird eine Lösung aus N-Cbz-Pro-OMe in Tetrahydrofuran (150 ml) über einen Zugabetrichter über 1 h gegeben. Zu diesem Gemisch wird dann eine Lösung aus Benzylbromid (11,9 ml, 100 mmol) in Tetrahydrofuran (50 ml) über einen weiteren Zugabetrichter über 15 Minuten gegeben. Das Kältebad wird nach dem Rühren für 20 Stunden entfernt und 1 N Citronensäure (100 ml) wird zugegeben. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von etwa 100 ml im Vakuum konzentriert und dann zwischen Ethylacetat (300 ml) und Wasser (200 ml) aufgeteilt. Die organische Phase wird dann mit 1 N Citronensäure (200 ml), zweimal mit gesättigtem wäßrigem NaHCO&sub3; und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen, mit MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum unter Bildung eines bernsteinfarbenen Öls konzentriert. Das Öl wird dann über Silicagel chromatographiert, wobei mit einem Gradienten von Hexan über 20% Ethylacetat / Hexan eluiert wird. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen, wie dies durch TLC entschieden wird, werden vereinigt und unter Bildung eines farblosen Öls (26,9 g, 76% Ausbeute) konzentriert.
¹H NMR

C) N-Cbz-D,L-Pro-(α-benzyl)-OH

Zu einer Lösung aus N-Cbz-D,L-Pro-(α-benzyl)-OMe (26,9 g, 76 mmol) in p-Dioxan (200 ml) wird eine Lösung aus LiOH · H&sub2;O (12,8 g, 304 mmol) in Wasser (100 ml) gegeben. Die Lösung wird bis zum Rückfluß erhitzt und das Rühren wird für 12 h fortgesetzt. Der Heizmantel wird dann entfernt und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden die Lösemittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst (300 ml) und mit Diethylether (200 ml) gewaschen. Die wäßrige Phase wird dann mit 1 N Citronensäure angesäuert und dann dreimal mit Diethylether (300 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte werden mit MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und unter Bildung eines weißen Feststoffs (23,9 g, 92% Ausbeute) konzentriert.
¹H NMR
FD-MS m/e 340 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub1;NO&sub4;
C 70,78 H 6,24 N 4,13
Gefunden: C 71,00 H 6,38 N 4,17

D) N-Cbz-D-Pro-(α-benzyl)-Pro-OMe

Zu einer Lösung aus N-Cbz-D-Pro-(α-benzyl)-OH (23 g, 68 mmol), Pro-OMe · HCl (14 g, 85 mmol), 1- Hydroxybenzotriazol (11,4 g, 85 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (35,4 ml, 203 mmol) in Dichlormethan (400 ml) wird 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (16,2 g, 85 mmol) gegeben. Nach dem Rühren für 12 h wird das Lösemittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Ethylacetat (500 ml) gelöst und zweimal mit 1 N Citronensäure (200 ml), zweimal mit wäßrigem NaHCO&sub3; und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Das Ethylacetat wird durch Rotationsverdampfung unter Bildung eines gelben Öls entfernt. Das Öl wird chromatographiert, wobei mit einem Lösemittelgradienten von Hexan bis 30% Ethylacetat / Hexan eluiert wird. Die Fraktionen, die nur das Diastereomer mit dem höheren Rf enthalten (TLC, Rf 0,38, 10 : 1 Chloroform Methanol) werden vereinigt und unter Bildung eines weißen kristallinen Feststoffs (10,5 g, 34%) konzentriert. Anschließend wird die Struktur und die Stereochemie dieses Diastereomers als N-Cbz-D-Pro-(α-benzyl)-Pro-OMe durch Einzelkristallröntgenstreuungsanalyse bestätigt.
¹H NMR
FD-MS m/e 450 (M&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub0;N&sub2;O&sub5;
C 69,31 H 6,71 N 6,22
Gefunden: C 69,18 H 6,73 N 6,25

E) N-Cbz-D-Pro-(α-benzyl)-Pro-OH

Zu einer Lösung N-Cbz-D-Pro-(α-benzyl)-Pro-OMe (8 g, 17,8 mmol) in p-Dioxan (200 ml) wird eine Lösung aus LiOH · H&sub2;O (3 g, 71 mmol) in Wasser (100 ml) unter starkem Rühren gegeben. Nach 12 h wird die Lösung im Vakuum auf ein Volumen von 50 ml konzentriert, mit Wasser (100 ml) verdünnt und zweimal mit Diethylether (150 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit 5 N wäßriger HCl auf pH 2 eingestellt und der entstehende Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen und unter Bildung eines weißen Feststoffs (4,2 g, 54% Ausbeute) getrocknet. Die vereinigte wäßrige Phase wird zweimal mit Ethylacetat (250 ml) extrahiert und die entstehende organische Phase wird dann mit Kochsalzlösung (200 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und unter Bildung von weiteren 3,2 g (41% Ausbeute) desselben Produkts (95% kombinierte Ausbeute) konzentriert.
¹H NMR
FD-MS m/e 437 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub5;H&sub2;&sub8;N&sub2;O&sub5;
C 68,79 H 6,47 N 6,42
Gefunden: C 68,51 H 6,51 N 6,45

F) D-Pro-(α-benzyl)-Pro-Arg-H · 2 HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die im Beispiel I - J und 1 - K beschrieben sind, und unter Verwendung von LiAl(O-t-Bu)&sub3;H bei -23ºC anstelle von LAH bei -78ºC, werden 1,3 g D-Pro-(α- enzyl)-Pro-Arg-H · 2 HCl Dihydrat aus N-Cbz-D-Pro-(α-benzyl)-Pro-OH hergestellt. Eine Reinigung durch RPHPLC ist nicht erforderlich.
¹H NMR
FAB-MS m/e 443 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub4;N&sub6;O&sub3; · 2,5 HCl · 2 H&sub2;O
C 48,49 H 7,16 N 14,75
Gefunden: C 48,84 H 7,05 N 14,48 Beispiel 3 Herstellung von Proliny((α-benzyl)-L-prolinyl-L-argininaldehyddihydrochlorid

A) N-Cbz-Pro(α-benzyl)-Pro-OMe

N-Cbz-Pro-(α-benzyl)-Pro-OMe wird in Beispiel 2 D hergestellt. Nach der Silicagelchromatographie des gelben Öls werden die Fraktionen, die das Material mit dem kleineren Rf enthalten (TLC, Rf 0,31, 10 : 1 Chloroform: Methanol) vereinigt und unter Bildung eines weißen Schaums (9,6 g, 31% Ausbeute) konzentriert, der durch Schlußfolgerung N-Cbz-Pro-(α-benzyl)-Pro-OMe ist.
¹H NMR
FD-MS m/e 450 (M&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub0;N&sub2;O&sub5;
C 69,31 H 6,71 N 6,22
Gefunden: C 69,25 H 6,93 N 6,16

B) Pro(α-benzyl)-Pro-Arg-H · 2 HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 2-E und 2-F beschrieben sind, werden 2,0 g Pro(α-benzyl)-Pro-Arg-H · 2 HCl Dihydrat aus N-Cbz-Pro-(α-benzyl)-Pro-OMe hergestellt. Eine Reinigung durch RPHPLC ist nicht erforderlich.
¹H NMR
FAB-MS m/e 443 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet fur C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub4;N&sub6;O&sub3; · 3 HCl · 2,5 H&sub2;O
C 46,28 H 7,09 N 14,08
Gefunden: C 46,67 H 7,13 N 13,75 Beispiel 4 Herstellung von Azetidinyl(α-benzyl)-L-prolinyl-L-argininaldehyddihydrochlorid

Azt-(α-benzyl)-Pro-Arg-H · 2 HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 1-A und 2 beschrieben sind, werden 1,5 g Azt(α-benzyl)-Pro-Arg-H · 2 HCl aus Azetidin-2-carbonsäure hergestellt. Eine Reinigung durch RPHPLC ist nicht erforderlich.
¹H NMR
FAB-MS m/e 429 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub2;N&sub6;O&sub3; · 2,5 HCl · 2 H&sub2;O
C 47,55 H 6,98 N 15,12
Gefunden: C 47,21 H 6,62 N 14,83 Beispiel 5 Herstellung von N-Ethoxycarbonyl-D-phenylalanyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

A) EtOCO-D,L-Phe(α-Me)-OH

Zu einer gerührten Suspension aus D,L-Phe(αMe)-OH (7,5 g, 42 mmol) in Tetrahydrofuran (250 ml) wird N,O-Bis-(trimethylsilyl)acetamid (12,8 g, 62,8 mmol) gegeben. Nach dem Klären wird die Lösung auf 0ºC gekühlt und N,N-Diisopropylethylamin (5,4 g, 42 mmol) wird gefolgt von Ethylchlorformiat (4,5 g, 42 mmol) zugegeben. Nach 2 h wird Wasser (100 ml) zugegeben und dann wird das organische Lösemittel im Vakuum entfernt. Die wäßrige Phase wird mit 1 N NaOH verdünnt und zweimal mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Phase wird dann mit konzentrierter HCl auf pH 2 angesäuert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung von 10,3 g (98% Ausbeute) eines weißen Feststoffs konzentriert.
¹H NMR

B) EtOCO-D,L-Phe(α-Me)-Pro-OBzl

Zu einer gerührten Lösung aus EtOCO-D,L-Phe(α-Me)-OH (10,3 g, 41 mmol), HOBT (5,5 g, 41 mmol), Pro-OBzl · HCl (9,9 g, 41 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (15,9 g, 123 mmol) in Dimethylformamid (200 ml) werden bei 0ºC 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid · HCl (8,6 g, 45 mmol) gegeben. Nach dem Rühren für 16 h werden die Lösemittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wird in Ethylacetat (500 ml) gelöst. Die organische Phase wird dreimal mit 0,1 N HCl, dreimal mit gesättigtem wäßrigen NaHCO&sub3; und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird dann getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;, filtriert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird über Silicagel chromatographiert und mit 1 : 1 Ethylacetat : Hexan eluiert und die das Produkt enthaltenden Fraktionen (wie dies durch TLC entschieden wird) werden vereinigt und im Vakuum unter Bildung von 13,5 g (75% Ausbeute) eines weißen Schaums konzentriert:
¹H NMR
FD-MS m/e 438 (M&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub0;N&sub2;O&sub5;
C 68,47 H 6,90 N 6,39
Gefunden: C 68,20 H 7,09 N 6,28

C) EtOCO-D,L-Phe(αMe)-Pro-OH

Zu einer gerührten Lösung aus EtOCO-D,L-Phe(αMe)-Pro-OBzl (13,2 g, 30 mmol) in p-Dioxan (250 ml) wird eine Lösung aus LiOH · H&sub2;O (6,3 g, 151 mmol) in Wasser (125 ml) gegeben. Nach dem Rühren für 2,5 h wird das Lösemittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit Wasser verdünnt und dreimal mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Phase wird dann mit konzentrierter HCl auf pH 2 gebracht und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethyiacetatextrakte werden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung von 10,7 g eines weißen Feststoffs konzentriert.
¹H NMR
FD-MS m/e 349 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub4;N&sub2;O&sub5;
C 62,05 H 6,94 N 8,04
Gefunden: C 62,29 H 6,98 N 8,12

D) Boc-Arg(Cbz)-OH

Boc-Arg(HCl)-OH (82,1 g, 250 mmol) wird in 5 N NaOH (240 ml) in einem Dreihalskolben gelöst. Das Reaktionsgemisch wird auf -5ºC abgekühlt und der pH wird mit 5 N Natriumhydroxid (250 ml) auf 13,2-13,5 gehalten, während Benzylchlorformiat (143 ml, 1,0 mol) tropfenweise zugegeben wird (55 Minuten). Das Reaktionsgemisch wird für eine weitere Stunde bei -5ºC gerührt und mit Wasser (100 ml) und Diethylether (500 ml) verdünnt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und zweimal mit Diethylether (500 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit 3 N H&sub2;SO&sub4; (560 ml) auf pH 3,0 angesäuert und mit Ethylacetat (550 ml) extrahiert. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und einmal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatphasen werden mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und im Vakuum unter Bildung von 66,1 g eines weißen Feststoffs (65% Ausbeute) konzentriert.
¹H NMR
FD-MS 408 (M&spplus;)

E) Boc-Arg(Cbz)-Lactam

Boc-Arg(Cbz)-OH (66,0 g, 0,162 mol) wird in Tetrahydrofuran (230 ml) gelöst und auf -10ºC gekühlt. Zu dieser Lösung wird N-Methylmorpholin (18,7 ml, 0,17 mol) gefolgt von Isobutylchlorformiat (22,5 ml, 0,17 mol) gegeben. Nach einem Rühren für 5 Minuten bei -10ºC wird Triethylamin (23,5 ml, 0,17 mol) zugegeben. Nach einer weiteren Stunde bei -10ºC kann sich das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen und das Rühren wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird in 1 l Eiswasser gegossen und der entstehende Niederschlag wird filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wird unter Bildung von 38 g eines weißen Feststoffs (60% Ausbeute) aus Ethylacetat kristallisiert.
¹H NMR
FD-MS 391 (MH&spplus;)

F) 2 HCl · Arg(Cbz)-Lactam

Eine gesättigte HCl (g) Lösung in Ethylacetat (7,2 l) wird tropfenweise über 30 Minuten zu einer Lösung von Boc-Arg(Cbz)-Lactam (641 g, 1,64 mol) gegeben, das in Dichlormethan (3 l) bei -10ºC gelöst wurde. Nach 1 h bei -10ºC wird das Kältebad entfernt und die Lösung kann sich über 3 h auf Raumtemperatur erwärmen. Man gibt Diethylether (121) zu und filtriert den entstehenden Niederschlag, wäscht mit Diethylether und trocknet im Vakuum unter Bildung von 580 g (97% Ausbeute).
FD-MS 291 (MH&spplus;).

G) EtOCO-D-Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)-lactam

In Kolben 1 wird EtOCO-D,L-Phe(αMe)-Pro-OH (6 g, 17,2 mmol) in Dimethylformamid (100 ml) gelöst, auf -15ºC gekühlt und N-Methylmorpholin (1,7 g, 17,2 mmol) wird gefolgt von Isobutylchlorformiat (2,4 g, 17,2 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei -15ºC für 10 Minuten gerührt.
In Kolben 2 wird HCl · Arg(Cbz)-Lactam (6,3 g, 17,2 mmol) in Dimethylformamid (100 ml) gelöst, auf 0ºC gekühlt und N,N-Diisopropylethylamin (4,5 g, 34,5 mmol) wird zugegeben.
Der Inhalt von Kolben 2 wird in einer Portion zu Kolben 1 gegeben und das Reaktionsgemisch kann sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen (24 h). Dann wird gesättigtes wäßriges NaHCO&sub3; (100 ml) zugegeben und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird zwischen Ethylacetat und Wasser aufgeteilt und die Phasen werden getrennt. Die organische Phase wird zweimal mit 0,01 N HCl, zweimal mit gesättigtem NaHCO&sub3; und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Filtrat wird im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird über Silicagel chromatographiert, wobei mit Ethylacetat eluiert wird, das die Trennung der zwei diastereomeren Produkte ergibt. Die Fraktionen, die reines EtOCO-D-Phe(αMe)-Pro- Arg(Cbz)-lactam enthalten (TLC Rf = 0,57, 4 : 1 Ethylacetat : Acetonitril) werden vereinigt und im Vakuum unter Bildung von 1,3 g eines weißen Schaums konzentriert. Die Fraktionen, die reines EtOCO-Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)- lactam enthalten (TLC Rf = 0,44, 4 : 1 Ethylacetat : Acetonitril) werden vereinigt und im Vakuum unter Bildung von 1,7 g eines weißen Schaums konzentriert. Fraktionen, die ein Gemisch der zwei Diastereomere enthalten, werden vereinigt und im Vakuum unter Bildung von 3,3 g eines weißen Schaums konzentriert. Das Gemisch wird erneut chromatographiert und die reinen Fraktionen jedes Diastereomers werden mit denen aus der ersten Chromatographie vereinigt und im Vakuum unter Bildung einer Gesamtmenge von 2,1 g (20%) an EtOCO-D-Phe(αMe)-Pro- Arg(Cbz)-lactam und 3,7 g (35%) EtOCO-Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)-lactam konzentriert. Die Struktur der diastereomeren Tripeptide wird aus Schlußfolgerungen aus der biologischen Aktivität der entsprechenden Argininaldehyde vorläufig zugeordnet.
¹H NMR
FD-M5 m/e 621 (M&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub3;&sub2;H&sub4;&sub0;N&sub6;O&sub7;
C 61,92 H 6,50 N 13,54
Gefunden: C 61,74 H 6,51 N 13,33

H) EtOCO-D-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl

Zu einer gerührten Lösung aus EtOCO-D-Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)-lactam (2 g, 3,2 mmol) in Tetrahydrofuran (50 ml) wird bei -23ºC langsam eine Lösung aus 1 N LiAl(O-t-Bu)&sub3;H (4,8 ml, 4,8 mmol) in Tetrahydrofuran gegeben. Nach 2,5 h wird das Reaktionsgemisch in eine gerührte Lösung aus kalter 1 N HCl (50 ml) gegossen. Die Lösung wird dann mit Wasser (100 ml) verdünnt, mit 1 : 1 Tetrahydrofuran: Hexan (200 ml) gewaschen und zweimal mit Ethylacetat und einmal mit n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat- und n-Butanolextrakte werden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand wird dann in Ethanol (75 ml) gelöst und dann wird Wasser (25 ml) und 1 N HCl (10 ml) zugegeben. Zu dieser gerührten Lösung wird dann 5% Pd auf Kohle gegeben (1 g). Dann wird H&sub2; für 1,5 h durch die Lösung geblasen und die Lösung wird mit N&sub2; geflutet und über ein Kissen aus Diatomäenerde filtriert. Das Ethanol wird im Vakuum bei 35ºC entfernt und dann wird der Rückstand in Wasser rückgelöst (25 ml). Der pH der wäßrigen Lösung wird dann mit Bio Rad Ionenaustauscherharz (basische Form) auf 4,7 eingestellt, filtriert und unter Bildung von 1,15 g eines weißen Pulvers lyophilisiert. Das Produkt wird dann durch RPHPLC (98/2 (A : B), 40 min. Stufe auf 80/20 (A : B), 280 min. halten bis 400 min) unter Bildung von 0,49 g (29%) an reinem EtOCO-D- Phe-(αMe)-Pro-Arg-H · HCl Dihydrat gereinigt.
¹H NMR
FAB-MS m/e 489 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub6;N&sub6;O&sub5; · HCl
C 54,91 H 7,10 N 16,01 Cl 6,75
Gefunden: C 54,89 H 7,12 N 15,81 Cl 6,87 Beispiel 6 Herstellung von N-Ethylsulfonyl-D-phenylalanyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

A) EtSO&sub2;-D,L-Phe(αMe)-OH

Zu einer gerührten Suspension aus D,L-Phe(αMe)-OH (9 g, 50 mmol) in Tetrahydrofuran (250 ml) wird N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (15,3 g, 75 mmol) gegeben. Nach der Klärung wird die Lösung auf -78ºC gekühlt und N,N-Diisopropylethylamin (6,5 g, 50 mmol) wird gefolgt von Ethansulfonylchlorid (7,1 g, 55 mmol) zugegeben. Das Gemisch kann sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 16 h wird Wasser (100 ml) zugegeben und das organische Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Die wäßrige Phase wird mit 1 N NaOH verdünnt und zweimal mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Phase wird dann mit konzentrierter HCl auf pH 3 angesäuert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung von 4,9 g (36%) eines weißen Schaums konzentriert.
¹H NMR
FD-MS m/e 271 (M&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub7;NO&sub4;S
C 53,12 H 6,32 N 5,16
Gefunden: C 53,36 H 6,16 N 5,08

B) EtSO&sub2;-D-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die zu denen in Beispiel 5-B, 5-C, 5-G und 5-H äquivalent sind, werden 1,1 g EtSO&sub2;-D- Phe[αMe]-Pro-Arg-H · HCl hergestellt. Die diastereomeren Peptide werden bei der Lactamstufe (siehe Beispiel 5- G) durch Silicagelchromatographie (EtSO&sub2;-D-Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)-lactam, TLC Rf = 0,75, 4 : 1 Ethylacetat : Acetonitril) getrennt. EtSO&sub2;-D-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl wird durch RPHPLC (98/2 (MB), 40 min bis zu 80/20 (A/B), 280 min. halten bis 400 min) gereinigt.
¹H NMR
FAB-MS m/e 509 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub6;N&sub6;O&sub5;S · HCl
C 50,68 H 6,84 N 15,42
Gefunden: C 50,59 H 6,67 N 15,35 Beispiel 7 Herstellung von N-Ethoxycarbonylphenylalanyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

EtOCO-Phe(α-Me)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 5-H beschrieben sind, werden 0,78 g (42%) EtOCO-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl aus EtOCO-Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)-lactam hergestellt (zur Herstellung von EtOCO-Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)-lactam siehe Beispiel 5-G). EtOCO-Phe(aMe)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat wird durch RPHPLC (95/5 (MB), 40 min bis 80/20 (MB), 280 min. halten bis 400 min) gereinigt.
¹H NMR
FAB-MS m/e 489 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub6;N&sub6;O&sub5; · 1,1 HCl · 0,5 H&sub2;O
C 53,61 H 7,14 N 15,63 Cl 7,25
Gefunden: C 54,01 H 6,70 N 15,12 Cl 7,18 Beispiel 8 Herstellung von N-(1-Methylindolyl-2-carbonyl)-D-phenylalanyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehyddihydrochlorid

A) NMI-OPFF

Zu einer Lösung aus N-Methylindol-2-carbonsäure (25 g, 143 mmol) und Pentafluorphenol (35,3 g, 192 mmol) in Tetrahydrofuran (250 ml) wird 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid · HCl (30,5 g, 159 mmol) gegeben. Nach dem Rühren für 5 h wird die Lösung mit Dichlormethan (200 ml) und Hexan (300 ml) verdünnt. Die organische Phase wird einmal mit 1 N NaHSO&sub4; (100 ml), dreimal mit 1 N K&sub2;CO&sub3; (100 ml) und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung eines braunen Feststoffs konzentriert, der aus Hexan unter Bildung von 38 g (78% Ausbeute) eines nicht ganz weißen Feststoffs umkristallisiert wird.
¹H NMR
FD-MS m/e 341 (M&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub1;&sub6;H&sub8;NO&sub2;F&sub5;
C 56,32 H 2,36 N 4,10
Gefunden: C 56,53 H 2,37 N 4,20

B) NMI-D,L-Phe(αMe)-OH

Zu einer gerührten Suspension aus D,L-Phe(aMe)-OH (2,5 g, 14 mmol) in Dimethylformamid (50 ml) wird N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (4,3 g, 21 mmol) gegeben. Nach dem Klären der Lösung wird NMI-OPFF (5 g, 14,7 mmol) zugegeben und die Reaktion wird auf 65ºC erhitzt. Nach 16 h wird der Heizmantel entfernt und Wasser (20 ml) wird zugegeben. Die Lösemittel werden im Vakuum entfernt und der Rückstand wird in 1 N NaOH gelöst und dreimal mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Phase wird dann mit 5 N HCl auf pH 3 angesäuert und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung eines gelben Öls konzentriert, das über Silicagel chromatographiert und mit 70% Ethylacetat : Hexan (0,5% Essigsäure) eluiert wird. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen, wie dies durch TLC entschieden wird, werden vereinigt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in Toluol gelöst und im Vakuum unter Bildung von 4 g (85% Ausbeute) eines weißen Feststoffs dreimal (zur Entfernung der Essigsäure) konzentriert.
¹H NMR
FD-MS m/e 336 (M&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub0;N&sub2;O&sub3;
C 71,41 H 5,99 N 8,33
Gefunden: C 71,66 H 6,15 N 8,05

C) NMI-D-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 5-B, 5-C, 5-G und 5-H beschrieben sind, werden 1,4 g NMI-D-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl hergestellt. Die diastereomeren Peptide werden bei der Lactamstufe (siehe Beispiel 5-G) durch Silicagelchromatographie getrennt (NMI-D-Phe(ocMe)-Pro- Arg(Cbz)-lactam TLC Rf = 0,35, Ethylacetat). NMI-D-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl wird durch RPHPLC gereinigt (95/5 (A/B) bis 70/30 (A/B), 180 min. halten bis 400 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 574 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub9;N&sub7;O&sub4; · HCl
C 61,02 H 6,61 N 16,07 Cl 5,81
Gefunden: C 61,30 H 6,40 N 15,98 Cl 6,09 Beispiel 9 Herstellung von 1-(Ethylsulfonylamino)cyclohexoyl-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

1-(Ethylsulfonylamino)cyclohexoyl-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 6 beschrieben sind, werden 0,95 g 1-(Ethylsulfonylamino)cyclohexoyl-Pro-Arg-H · HCl Hydrat aus 1-Aminocyclohexan-1-carbonsäure hergestellt. 1-(Ethylsulfonylamino)cyclohexoyl-Pro-Arg-H · HCl Hydrat wird durch RPHPLC gereinigt (98/2 (A/B) bis 80/20 (MB), 240 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 473 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub6;N&sub6;O&sub5;S · HCl · H&sub2;O
C 45,58 H 7,46 N 15,94 Cl 6,73
Gefunden: C 45,49 H 7,37 N 15,65 Cl 6,54 Beispiel 10 Herstellung von 1-(1-Methylindolyl-2-carbonylamino)cyclohexoyl-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid N-Methylindolyl-2-carbonyl

1-(N-Methylindolyl-2-carbonylamino)cyclohexoyl-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 8 beschrieben sind, werden 1,9 g 1-(N-Methylindolyl-2-carbonylamino)cyclohexoyl-Pro-Arg-H · HCl Hydrat aus 1-Aminocyclohexan-1- carbonsäure hergestellt. Eine Reinigung durch RPHPLC ist nicht erforderlich.
¹H NMR
FAB-MS m/e 538 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub9;N&sub7;O&sub4; · 2 HCl · 1,5 H&sub2;O
C 52,75 H 6,96 N 15,38
Gefunden: C 53,11 H 7,03 N 15,17 Beispiel 11 Herstellung von N-Ethylsulfonyl-L-phenyalanyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

N-EtSO&sub2;-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 6 beschrieben sind, werden 0,73 g EtSO&sub2;-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl Dihydrat aus EtSO&sub2;-Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)-lactam hergestellt (TLC Rf = 0,66, 4 : 1 Ethylacetat: Acetonitril). EtSO&sub2;-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl Dihydrat wird durch RPHPLC gereinigt (98/2 (A/B) bis 85/15 (A/B), 180 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 509 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub6;N&sub6;O&sub5;S · HCl · 2 H&sub2;O
C 47,54 H 7,11 N 14,46 Cl 6,10
Gefunden: C 47,80 H 6,65 N 14,23 Cl 6,67 Beispiel 12 Herstellung von N-(1-Methylindolyl-2-carbonyl)phenylalanyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

N-Methylindolyl-2-carbonyl-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 8 beschrieben sind, werden 0,29 g N-Methylindolyl-2-carbonyi-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat aus N-Methylindolyl-2-carbonyl- Phe(αMe)-Pro-Arg(Cbz)-lactam hergestellt (TLC Rf = 0,30, Ethylacetat). NMI-Phe(αMe)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat wird durch RPHPLC gereinigt (95/5 (MB) bis 70/30 (A/B), 180 min, halten bis 400 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 574 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub9;N&sub7;O&sub4; · 1,1 HCl · 1,5 H&sub2;O
C 58,10 H 6,78 N 15,30 Cl 6,09
Gefunden: C 58,25 H 6,55 N 15,00 Cl 6,25 Beispiel 13 Herstellung von N-Ethoxycarbonyl-D-phenylalanyl(α-ethyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid
A) N-(Diphenylmethylen)Phe-OMe
Zu einer gerührten Suspension aus Phe-OMe · HCl (89,3 g, 414 mmol) in Dichlormethan (500 ml) wird eine Lösung aus Benzophenonimin (75 g, 414 mmol) in Dichlormethan (400 ml) gegeben. Nach dem Rühren für 16 h wird die Lösung filtriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird aus Diethylether unter Bildung von 107 g (75% Ausbeute) eines weißen Feststoffs umkristallisiert.
¹H NMR
FD-MS m/e 343 (M&spplus;)

B) N-(Diphenylmethylen)-Phe(αEt)-OMe

Zu einer gerührten Lösung aus Kalium-t-butoxid (9 g, 80 mmol) in Tetrahydrofuran (500 ml) bei -78ºC wird eine Lösung aus N-(Diphenylmethylen)Phe-OMe (25 g, 73 mmol) in Tetrahydrofuran (250 ml) gegeben. Nach 10 Minuten wird eine Lösung aus Ethyliodid (12,5 g, 80 mmol) in Tetrahydrofuran (200 ml) zugegeben. Das Kältebad wird dann entfernt und die Lösung kann für 16 Stunden rühren. Die Lösung wird dann filtriert und das Lösemittel wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Diethylether gelöst und zweimal mit Wasser und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen und dann getrocknet, (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird über Silicagel chromatographiert, wobei mit einem Stufengradienten von 5% Ethylacetat : Hexan bis % Ethylacetat : Hexan eluiert wird. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen, wie dies durch TLC entschieden wird, werden vereinigt und im Vakuum unter Bildung von 18,1 g (70% Ausbeute) eines dicken gelben Öls konzentriert.
¹H NMR
FD-MS m/e 371 (M&spplus;)

C) D,L-Phe(αEt)-OMe

Zu einer gerührten Lösung aus N-(Diphenylmethylen)-Phe(αEt)-OMe (17,6 g, 47,4 mmol) in Methanol (200 ml) wird 5 N HCl (15 ml, 75 mmol) gegeben. Nach 3 h wird das Lösemittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wird in Wasser gelöst und dreimal mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Phase wird dann mit festem NaHCO&sub3; auf pH 10 eingestellt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden dann getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung von 8,75 g (89% Ausbeute) an klarem, farblosem Öl konzentriert.
¹H NMR
FD-MS m/e 208 (MH&spplus;)

D) D,L-Phe(αEt)-OH

Zu einer gerührten Lösung aus D,L-Phe(αEt)-OMe (24 g, 116 mmol) in Tetrahydrofuran (200 ml) wird 5 N NaOH (24 ml, 120 mmol) gefolgt von Wasser (50 ml) und Methanol (50 ml) gegeben und die Lösung wird bis zum Rückfluß erhitzt. Nach 16 h wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und die Lösemittel werden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und dreimal mit Diethylether gewaschen. Der pH wird mit 5 N HCl auf 6 eingestellt und die Lösung wird auf ein Volumen von etwa 50 ml im Vakuum konzentriert. Der Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen und unter Bildung von 17,5 g (78% Ausbeute) eines weißen Feststoffs getrocknet.
¹H NMR
FD-MS m/e 194 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub5;NO&sub2;
C 68,37 H 7,82 N 7,25
Gefunden: C 68,58 H 7,65 N 7,41

E) EtOCO-D-Phe(αEt)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die zu denen im wesentlichen äquivalent sind, die in Beispiel 5 beschrieben sind, werden 2,65 g EtOCO-D-Phe(αEt)-Pro-Arg-H · HCl Ethanolat aus D,L-Phe(αEt)-OH hergestellt. Eine Reinigung des EtO- CO-D-Phe(αEt)-Pro-Arg-H · HCl Ethanolats durch RPHPLC ist nicht erforderlich. Die diastereomeren Peptide werden auf der Dipeptidesterstufe (siehe Beispiel 5-B) durch Silicagelchromatographie (EtOCO-D-Phe(αEt)-Pro- OBzl, TLC Rf = 0,66, 50% Ethylacetat : Hexan) getrennt.
¹H NMR
FAB-MS m/e 503 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub8;N&sub6;O&sub5; · 1,1 HCl · 0,5 EtOH
C 55,20 H 7,50 N 14,85 Cl 6,89
Gefunden: C 55,19 H 7,13 N 14,55 Cl 6,79 Beispiel 14 Herstellung von N-Ethoxycarbonylyhenylalanyl(α-ethyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

EtOCO-Phe(αEt)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 13 beschrieben sind, werden 2,15 g EtOCO-Phe(αEt)-Pro-Arg-H · HCl Ethanolat aus EtOCO-Phe(αEt)-Pro-OBzl hergestellt (TLC Rf = 0,77, 50 % Ethylacetat: Hexan). Eine Reinigung des EtOCO-Phe(αEt)-Pro-Arg-H · HCl Ethanolats durch RPHPLC ist nicht erforderlich.
¹H NMR
FAB-MS m/e 503 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub8;N&sub6;O&sub5; · 2 HCl · 0,5 EtOH
C 52,17 H 7,24 N 14,04
Gefunden: C 52,33 H 6,96 N 13,99 Beispiel 15 Herstellung von N-Ethoxycarbonyl-D-phenylalanyl(α-n-propyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

A) D,L-Phe(α-n-Pr)-OMe

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 13-A und 13-B beschrieben sind, werden 10,1 g (63%) D,L-Phe-(α-n-Pr)-OMe aus N-(Diphenylmethylen)-Phe-OMe und n-Propyliodid hergestellt.
¹H NMR
FD-M5 m/e 222 (MH&spplus;)

B) EtOCO-D,L-Phe(α-n-Pr)-OH

Zu einer gerührten Lösung aus D,L-Phe(α-n-Pr)-OMe (9 g, 41 mmol) in Tetrahydrofuran (250 ml) wird bei 0ºC N,N-Diisopropylethylamin (5,3 g, 41 mmol) gefolgt von Ethylchlorformiat (4,4 g, 41 mmol) gegeben. Nach 3,5 h wird das Lösemittel im Vakuum entfernt und der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst. Die organische Phase wird zweimal mit gesättigtem wäßrigem NaHCO&sub3; und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen und dann getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum konzentriert.
Der Rückstand wird in Tetrahydrofuran (120 ml) gelöst und zu dieser Lösung wird unter starkem Rühren 5 N NaOH (11 ml, 55 mmol) gefolgt von Methanol (30 ml) gegeben. Die Lösung wird auf 55ºC erhitzt und für 48 h gerührt. Die Lösung wird dann auf Raumtemperatur abgekühlt und die Lösemittel werden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und zweimal mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Phase wird mit konzentrierter HCl auf pH 3 eingestellt und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Ethylacetatextrakte werden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und im Vakuum unter Bildung von 10,3 g (91%) eines gelben Feststoffs konzentriert.
¹H NMR
FD-MS m/e 279 (M&spplus;)

C) EtOCO-D-Phe(α-n-Pr)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 5-B, 5-C, 5-G und 5-H beschrieben sind, werden 0,69 g EtOCO-D-Phe(α-n-Pr)-Pro-Arg-H · HCl hergestellt. Die diastereomeren Peptide werden bei der Dipeptidesterstufe (siehe Beispiel 5-B) durch Silicagelchromatographie getrennt (EtOCO-D-Phe(αn-Pr)-Pro-OBzl, TLC Rf = 0,77, 50% Ethylacetat : Hexan). EtOCO-D-Phe(α-n-Pr)-Pro-Arg-H · HCl wird durch RPHPLC gereinigt (98/2 (A/B), 60 min bis 80/20 (A/B), 300 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 517 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub0;N&sub6;O&sub5; · HCl
C 56,46 H 7,47 N 15,19
Gefunden: C 56,22 H 7,41 N 15,11 Beispiel 16 Herstellung von N-Ethoxycarbonylphenylalanyl(α-n-propyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

EtOCO-Phe(α-n-Pr)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 15 beschrieben sind, werden 0,34 g EtOCO-Phe(α-n-Pr)-Pro-Arg-H · HCl aus EtOCO-Phe(α-n-Pr)-Pro-OBzI, TLC Rf = 0,67, 50% Ethylacetat : Hexan) hergestellt. EtOCO-Phe(α-n-Pr)-Pro-Arg-H · HCl wird durch RPHPLC gereinigt (98/2 (MB), 60 min bis 80/20 (MB), 300 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 517 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub0;N&sub6;O&sub5; · HCl
C 56,46 H 7,47 N 15,19
Gefunden: C 56,75 H 7,55 N 15,47 Beispiel 17 Herstellung von N-Ethoxycarbonyl-D-phenylalanyl(α-n-butyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid
Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 15 beschrieben sind, werden 2,2 g EtOCO-D-Phe(α-n-Bu)-Pro-Arg-H · HCl ausgehend von N-(Diphenylmethylen)-Phe-OMe und n- Butyliodid hergestellt. Die diastereomeren Peptide werden bei der Dipeptidesterstufe (siehe Beispiel 5-B) durch Silicagelchromatographie getrennt (EtOCO-D-Phe(α-n-Bu)-Pro-OBzl, TLC Rf = 0,86, 50% Ethylacetat : Hexan). EtOCO-D-Phe(α-n-Bu)-Pro-Arg-H · HCl wird durch RPHPLC gereinigt (98/2 (A/B), 60 min bis 85/15 (A/B), 300 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 531 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub2;N&sub6;O&sub5; · HCl
C 57,18 H 7,64 N 14,82
Gefunden: C 57,32 H 7,74 N 14,95 Beispiel 18 Herstellung von N-Ethoxycarbonylphenylalanyl(α-n-butyl)-L-prolinyl-L-argininaldehyd

EtOCO-Phe(α-n-Bu)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 17 beschrieben sind, werden 1,47 g EtOCO-Phe(α-n-Bu)-Pro-Arg-H · HCl aus EtOCO-Phe(α-n-Bu)-Pro-OBzl (TLC Rf = 0,74, 50% Ethylacetat : Hexan) hergestellt. EtOCO-Phe(α-n-Bu)-Pro-Arg-H · HCl wird durch RPHPLC gereinigt (98/2 (A/B), 60 min bis 85/15 (A/B), 300 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 531 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub2;N&sub6;O&sub5; · HCl
C 57,18 H 7,64 N 14,82
Gefunden: C 56,92 H 7,59 N 14,76 Beispiel 19 Herstellung von N-Ethylsulfonyl-(D,L)-phenylglycinyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid
EtSO&sub2;-D,L-Phg(ocMe)-Pro-Arg-H · HCl
Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 15 beschrieben sind, werden 0,21 g EtSO&sub2;-D,L-Phg(αMe)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat ausgehend von D,L-Phg-OMe · HCl und mittels Et- SO&sub2;CI anstelle von EtOCOCl und CH&sub3;I anstelle von n-Propyliodid hergestellt. EtSO&sub2;-D,L-Phg(αMe)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat wird durch RPHPLC gereinigt (98/2 (AB), 30 min bis 80/20 (AB), 240 min). Die Diastereomere konnten während dieser Synthese nicht getrennt werden und daher wird das Produkt als Isomerengemisch hergestellt und getestet.
¹H NMR
FAB-MS m/e 495 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub4;N&sub6;O&sub5;S · 1,2 HCl · H&sub2;O
C 47,49 H 6,74 N 15,10
Gefunden: C 47,50 H 6,44 N 14,91 Beispiel 20 Herstellung von N-Ethoxycarbonylglycinyl(α,α-di-n-butyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

EtOCO-Gly-(α,α-di-n-Bu)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 15 beschrieben sind, werden 1,4 g EtOCO-Gly-(α,α-di-n-Bu)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat ausgehend von N-(Diphenylmethylen)Gly-OEt und zwei Äquivalenten n-Butyliodid hergestellt. Die Reduktion des Zwischenprodukts EtOCO-Gly-(α,α-di-n-Bu)-Pro- Arg(Cbz)-lactam wird durch ein Verfahren erreicht, das zu dem in Beispiel 5-G ähnlich ist, außer daß Lithiumaluminiumhydrid als Reduktionsmittel bei -78ºC verwendet wird. EtOCO-Gly-(α,α-di-n-Bu)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat wird durch RPHPLC gereinigt (98/2 (A/B), 60 min bis 80/20 (A/B), 320 min).
¹H NMR
FAB-MS m/e 497 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub4;H&sub4;&sub4;N&sub6;O&sub5; · 1,2 HCl · H&sub2;O
C 51,62 H 8,52 N 15,05 Cl 7,62
Gefunden: C 51,82 H 7,91 N 14,69 Cl 7,75 Beispiel 21 Herstellung von N-Methylsulfonyl-D-phenylalanyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

MeSO&sub2;-D-Phe(α-Me)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 6 beschrieben sind, werden 0,16 g MeSO&sub2;-D-Phe(α-Me)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat mittels MeSO&sub2;Cl anstelle von EtSO&sub2;Cl hergestellt. Die diastereomeren Peptide werden bei der Tripeptidargininaldehydstufe durch RPHPLC getrennt (98/2 (A/B), 80 min bis 85/15 (A/B), 320 min). Die Stereochemie wird vorläufig auf der Grundlage der Thrombin-hemmenden Wirkung von Beispiel 21 und Beispiel 22 zugeordnet.
¹H NMR
FAB-MS m/e 495 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub4;N&sub6;O&sub5;S · 1,1 HCl · H&sub2;O
C 47,81 H 6,77 N 15,20 Cl 7,06
Gefunden: C 47,73 H 6,45 N 15,25 Cl 7,12 Beispiel 22 Herstellung von N-Methylsulfonylphenylalanyl(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehydhydrochlorid

MeSO&sub2;-Phe(α-Me)-Pro-Arg-H · HCl

Durch Verfahren, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in Beispiel 6 beschrieben sind, werden 0,16 g MeSO&sub2;-Phe(α-Me)-Pro-Arg-H · HCl Hydrat mittels MeSO&sub2;Cl anstelle von EtSO&sub2;Cl hergestellt. Die diastereomeren Peptide werden bei der Tripeptidargininaldehydstufe durch RPHPLC getrennt (98/2 (A/B), 80 min bis 85/15 (A/B), 320 min). Die Stereochemie wird vorläufig auf der Grundlage der Thrombin-hemmenden Wirkung von Beispiel 21 und Beispiel 22 zugeordnet.
¹H NMR
FAB-MS m/e 495 (MH&spplus;)
Elementaranalyse berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub4;N&sub6;O&sub5;S · 1,1 HCl · H&sub2;O
C 47,81 H 6,77 N 15,20 Cl 7,06
Gefunden: C 47,81 H 6,38 N 14,96 Cl 7,06
Die erfindungsgemäßen Verbindungen dürften ohne deutliche Beeinflussung der natürlichen Gerinnselauflösungsfähigkeit des Körpers (die Verbindungen weisen eine geringe hemmende Wirkung auf die Fibrinolyse auf) Thrombin selektiv gegenüber anderen Proteinasen und Nichtenzymproteinen hemmen, die in der Blutgerinnung beteiligt sind. Ferner dürfte eine solche Selektivität die Verwendung mit thrombolytischen Mitteln erlauben, ohne die Thrombolyse und Fibrinolyse wesentlich zu beeinträchtigen. Ferner dürften die erfindungsgemäßen Verbindungen oral aktiv sein.
Die Erfindung liefert in einem ihrer Aspekte ein Verfahren zur Hemmung von Thrombin in Säugern, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer wirksamen (Thrombin-hemmenden) Dosis einer Verbindung der Formel I an einen behandlungsbedürftigen Säuger.
Die Erfindung liefert in einem anderen ihrer Aspekte ein Verfahren zur Hemmung der Koagulation bei Säugern, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer wirksamen (gerinnungshemmenden) Dosis einer Verbindung der Formel I an einen behandlungsbedürftigen Säuger.
Die Behandlung der Thrombinhemmung, Gerinnungshemmung und thromboembolischen Störung, die durch das vorliegende Verfahren beschrieben wird, umfaßt die medizinisch-therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung, wie dies geeignet ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Behandlung von Zuständen bei einem Menschen oder einem Tier, bei denen die Hemmung von Thrombin erforderlich ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen dürften bei Tieren, einschließlich dem Menschen, zur Behandlung oder Prophylaxe von Thrombose und Hyperkoagulabilität in Blut und Geweben brauchbar sein. Krankheitszustände, bei denen die Verbindungen eine potentielle Brauchbarkeit aufweisen, sind bei der Behandlung oder Prophylaxe von Thrombose und Hyperkoagulabilität in Blut und Geweben gegeben. Krankheitszustände, bei denen die Verbindungen eine potentielle Brauchbarkeit bei der Behandlung und/oder Prophylaxe haben, sind unter anderem venöse Thrombose und pulmonale Embolie, arterielle Thrombose, wie myokardiale Ischämie, Myokardinfarkt, instabile Angina, auf Thrombosen beruhender Schlaganfall und periphere arterielle Thrombose. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Behandlung oder Prophylaxe von arteriosklerotischen Erkrankungen, wie koronarer arterieller Erkrankung, cerebraler arterieller Erkrankung und peripherer arterieller Erkrankung. Ferner dürften die Verbindungen zusammen mit Thrombolytika beim Myokardinfarkt brauchbar sein. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Behandlung oder Prophylaxe einer Reokklusion nach einer Thrombolyse, einer perkutanen transluminalen Angioplastle (PTCA) und koronaren Bypassoperationen. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Prävention der Rethrombose nach einer Mikrooperation. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Antikoagulationsbehandlung in Zusammenhang mit künstlichen Organen und Herzklappen. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Antikoagulationsbehandlung bei einer Hämodialyse und disseminierter intravaskulärer Koagulation. Eine weitere erwartete Brauchbarkeit ist beim Waschen von Kathetern und mechanischen Vorrichtungen, die in Patienten in vivo verwendet wurden und als ein Antikoagulans zur Konservierung von Blut, Plasma und anderen Blutprodukten in vitro. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei anderen Krankheiten, bei denen die Blutgerinnung ein fundamentaler beitragender Prozeß oder eine Quelle einer sekundären Pathologie sein könnte, wie bei Krebs, einschließlich Metastasierung, entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Arthritis, und Diabetes. Die Antikoagulationsverbindung wird oral, parenteral, beispielsweise durch intravenöse Infusion (iv), intramuskuläre Injektion (im) oder subkutan (sc) verabreicht.
Die bestimmte Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten Verbindung zur Erlangung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkungen wird natürlich durch die bestimmten, den Fall umgebenden Umstände bestimmt, beispielsweise der verabreichten Verbindung, der Verabreichungsgeschwindigkeit, des Verabreichungswegs und des zu behandelnden Zustands.
Eine typische Tagesdosis für jede der obigen Anwendungen liegt zwischen etwa 0,01 mg/kg und etwa 1000 mg/kg. Der Dosisplan kann variieren, beispielsweise kann zur prophylaktischen Verwendung eine einzelne Tagesdosis verabreicht werden oder es können mehrere Dosen, wie drei- oder fünfmal täglich, geeignet sein. Bei kritischen Gesundheitszuständen wird eine erfindungsgemäße Verbindung durch i. v. Infusion mit einer Geschwindigkeit zwischen etwa 0,01 mg/kg/h und etwa 20 mg/kg/h und vorzugsweise zwischen etwa 0,1 mg/kg/h und etwa 5 mg/kg/h verabreicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird auch zusammen mit einem gerinnselauflösenden Mittel, beispielsweise Gewebsplasminogenaktivator (tPA), modifiziertem tPA, Streptokinase oder Urokinase durchgeführt. In Fällen, bei denen eine Gerinnselbildung aufgetreten ist und eine Arterie oder Vene entweder teilweise oder völlig blockiert ist, wird gewöhnlich ein gerinnselauflösendes Mittel verwendet. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vor oder zusammen mit dem Lysemittel oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, und wird ferner vorzugsweise zusammen mit Aspirin verabreicht, um das Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zusammen mit einem Blutplättchenglykoproteinrezeptor (IIb/IIIa) Antagonisten durchgeführt werden, der die Blutplättchenaggregation hemmt. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vorher oder zusammen mit dem IIb/IIIa Antagonisten oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, um das Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zusammen mit Aspirin durchgeführt werden. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vorher oder zusammen mit Aspirin oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, um das Auftreten oder das Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden. Wie oben erwähnt, wird vorzugsweise eine erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit einem gerinnselauflösenden Mittel und Aspirin verabreicht.
Die Erfindung liefert auch pharmazeutische Formulierungen zur Verwendung im oben beschriebenen therapeutischen Verfahren. Erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierungen umfassen eine wirksame Thrombinhemmende Menge einer Verbindung der Formel I zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel. Zur oralen Verabreichung wird die antithrombotische Verbindung in Gelatinekapseln oder Tabletten formuliert, die Hilfsstoffe enthalten können, wie Bindemittel, Gleitmittel, Zerfallshilfsmittel und dergleichen. Zur parenteralen Verabreichung wird das Antithrombotikum in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel formuliert, beispielsweise physiologische Kochsalzlösung (0,9 Prozent), 5 Prozent Glucose, Ringerlösung und dergleichen.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann in Einheitsdosierungsformulierungen formuliert werden, die eine Dosis zwischen etwa 0,1 mg und etwa 1000 mg umfassen. Vorzugsweise liegt die Verbindung in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes vor, wie beispielsweise dem Sulfatsalz, Acetatsalz oder Phosphatsalz. Ein Beispiel für eine Einheitsdosierungsformulierung umfaßt 5 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung als pharmazeutisch annehmbares Salz in einer sterilen 10 ml Glasampulle. Ein weiteres Beispiel für eine Einheitsdosierungsformulierung umfaßt etwa 10 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung als pharmazeutisch annehmbares Salz in 20 ml isotonischer Kochsalzlösung, die in einer sterilen Ampulle enthalten sind.
Die Verbindungen können auf eine Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung, die eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Solvats hiervon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff hierfür enthält.
Der Wirkstoff umfaßt in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung. Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist gemeint, daß der Träger, das Verdünnungsmittel oder der Hilfsstoff mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel sein muß und für den Empfänger hiervon nicht schädlich sein darf. Die vorliegenden pharmazeutischen Formulierungen werden durch gut bekannte Verfahren und mit leicht verfügbaren Inhaltsstoffen hergestellt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können unter Verwendung von in der Technik gut bekannten Verfahren so formuliert werden, daß sie eine schnelle, anhaltende oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs nach der Verabreichung an den Patienten bereitstellen. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff gewöhnlich mit einem Träger gemischt oder mit einem Träger verdünnt oder in einem Träger eingeschlossen, der in Form einer Kapsel, eines Sachets, eines Papiers oder eines anderen Behälters vorliegen kann. Wenn der Träger als Verdünnungsmittel dient, kann dies ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel, Hilfsstoff oder Medium für den Wirkstoff dient. Daher können die Zusammensetzungen vorliegen in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Lonzetten, Sachets, Cachets, Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupen, Aerosolen (als Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Weich- und Hartgelatinekapseln, Zäpfchen, sterilen injizierbaren Lösungen, sterilen verpackten Pulvern und dergleichen.
Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd. "Wirkstoff" meint natürlich eine Verbindung gemäß Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat hiervon.

Formulierung 1

Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung folgender Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge

(mg/Kapsel)
Wirkstoff 250
Stärke, getrocknet 200
Magnesiumstearat 10
Gesamt 460 mg

Formulierung 2

Eine Tablette wird unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge

(mg/Kapsel)
Wirkstoff 250
mikrokristalline Cellulose 400
pyrogen hergestelltes Siliciumdioxid 10
Stearinsäure 5
Gesamt 665 mg
Die Bestandteile werden vermischt und unter Bildung von Tabletten gepreßt, wobei jede 665 mg wiegt.

Formulierung 3

Eine Aerosollösung, die die folgenden Bestandteile enthält, wird hergestellt:
Gewicht
Wirkstoff 0,25
Ethanol 25,75
Propellant 22 (Chlordifluormethan) 70,00
Gesamt 100,00
Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf -30ºC abgekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschließend am Behälter angebracht.

Formulierung 4

Tabletten, die jeweils 60 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Wirkstoff 60 mg
Stärke 45 mg
Mikrokristalline Cellulose 35 mg
Polyvinylpyrrolidon (als 10% Lösung in Wasser) 4 mg
Natriumcarboxymethylstärke 4,5 mg
Magnesiumstearat 0,5 mg
Talkum 1 mg
Gesamt 150 mg
Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Nr. 45 Mesh U. S. Sieb gegeben und sorgfältig vermischt. Die wäßrige Lösung, die Polyvinylpyrrolidon enthält, wird mit dem entstehenden Pulver vermischt und das Gemisch wird anschließend durch ein Nr. 14 Mesh U. S. Sieb gegeben. Die so hergestellten Granula werden bei 50ºC getrocknet und durch ein Nr. 18 Mesh U. S. Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylstärke, das Magnesiumstearat und das Talkum werden, nachdem sie vorher durch ein Nr. 60 Mesh U. S. Sieb gegeben wurden, zu den Granula gegeben und nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepreßt, die jeweils 150 mg wiegen.

Formulierung 5

Kapseln, die jeweils 80 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Wirkstoff 80 mg
Stärke 59 mg
Mikrokristalline Cellulose 59 mg
Magnesiumstearat 2 mg
Gesamt 200 mg
Der Wirkstoff, die Cellulose, die Stärke und das Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 45 Mesh U. S. Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln in 200 mg Mengen abgefüllt.

Formulierung 6

Zäpfchen, die jeweils 225 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Wirkstoff 225 mg
Gesättigte Fettsäureglyceride 2 000 mg
Gesamt 2 225 mg
Der Wirkstoff wird durch ein Nr. 60 Mesh U. S. Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt.

Formulierung 7

Suspensionen, die jeweils 50 mg des Wirkstoffs pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt:
Wirkstoff 50 mg
Natriumcarboxymethylcellulose 50 mg
Sirup 1,25 ml
Benzoesäurelösung 0,10 ml
Geschmacksstoff q. v.
Farbstoff q. v.
Gereinigtes Wasser auf gesamt 5 ml
Der Wirkstoff wird dwch ein Nr. 45 Mesh U. S. Sieb gegeben und mit Natriumcarboxymethylcellulose und Sirup vermischt, um eine glatte Paste zu erhalten. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacksstoff und der Farbstoff werden mit einem Anteil Wasser vermischt, und unter Rühren zugegeben. Anschließend wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen zu erhalten.

Formulierung 8

Eine intravenöse Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden:
Wirkstoff 100 mg
Isotonische Kochsalzlösung 1 000 ml
Die Lösung der obigen Inhaltsstoffe wird im allgemeinen einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute intravenös verabreicht.
Die dwch die Erfindung bereitgestellten Verbindungen (Formel I) hemmen selektiv die Wirkung von Thrombin bei Säugern.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, ein effektiver und oral wirksamer Thrombininhibitor zu sein, wird in einem oder mehreren der folgenden Tests evaluiert.
Die Hemmung von Thrombin wird dwch die in vitro Hemmung der Amidaseaktivität von Thrombin gezeigt, wie dies in einem Test gemessen wird, worin Thrombin das chromogene Substrat N-Benzoyl-L-Phenylalanyl- L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilid, N-Benzoyl-L-Phe-L-Val-L-Arg-p-nitroanilid hydrolysiert.
Der Test wird in 50 ul Puffer (0,03 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4) mit 25 ul humaner Thrombinlösung (gereinigtes Humanthrombin, Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana mit 8 NIH Einheiten /ml) und 25 ul der Testverbindung in einem Lösemittel (50% wäßriges Methanol (V : V)) durchgeführt. Dann werden 150 ul einer wäßrigen Lösung des chromogenen Substrats (mit 0,25 mg/ml) zugegeben und die Hydrolyseraten des Substrats gemessen, indem man die Reaktionen bei 405 nm dwch die Freisetzung des p-Nitroanilids verfolgt. Es werden Standardkurven durch die Auftragung der freien Thrombinkonzentration gegen die Hydrolyserate erstellt. Die mit den Testverbindungen beobachteten Hydrolyseraten werden dann in "freie Thrombinwerte" in den jeweiligen Tests dwch die Verwendung der Standardkurven umgewandelt. Das gebundene Thrombin (an die Testverbindung gebunden) wird dwch Subtraktion der Menge an freiem Thrombin, die in jedem Test beobachtet wird, von der bekannten Anfangsmenge an Thrombin, die in jedem Test beobachtet wird, errechnet. Die Menge an freiem Inhibitor in jedem Test wird dwch Subtraktion Anzahl der Mole an gebundenem Thrombin von der Anzahl der Mole an zugegebenem Inhibitor (Testverbindung) errechnet.
Der Kass Wert ist die hypothetische Gleichgewichtskonstante für die Reaktion zwischen Thrombin und der Testverbindung (I).
Thrombin + I Thrombin - I
Kass = [Thrombin I]/[(Thrombin) · (I)]
Kass wird für einen Konzentrationsbereich der Testverbindungen errechnet und der Mittelwert wird in Einheiten Liter pro Mol angegeben.
Indem man im wesentlichen die oben für Humanthrombin beschriebenen Verfahren befolgt und andere Serinproteasen des humanen Blutgerinnungssystems und Serinproteasen des fibrinolytischen Systems mit den geeigneten chromogenen Substraten verwendet, wie sie unten angegeben sind, wird die Selektivität der erfindungsgemäßen Verbindung in Bezug auf die Koagulationsfaktorserinproteasen und die fibrinolytischen Serinproteasen, wie auch die im wesentlichen fehlende Beeinträchtigung der Gerinnselfibrinolyse in Humanplasma ermittelt.
Die Humanfaktoren X, Xa, IXa, XIa und XIIa werden von Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana bezogen, humane Urokinase von Leo Pharmaceudcals, Denmark und rekombinantes aktiviertes Protein C (aPC) wird von Eli Lilly und Co. im wesentlichen gemäß US 4 981 952 A hergestellt. Chromogene Substrate: N- Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (für Faktor Xa), N-Cbz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid (für den Faktor IXa Test als Substrat für den Faktor Xa), Pyroglutamyl Pro-Arg-p-nitroanilid (für Faktor XIa und für aPC), H-D-Pro- Phe-Arg-p-nitroanilid (für Faktor XIIa) und Pyroglutamyl-Gly-Arg-p-nitroanilid (für Urokinase) werden von Kabi- Vitrum, Stockholm, Schweden oder von Midwest Biotech, Fishers, Indiana bezogen. Rindertrypsin wird von Worthington Biochemicals, Freehold, New Jersey, und Humanplasmakallikrein von Kabi Vitrum, Stockholm, Schweden bezogen. Das chromogene Substrat H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid für Plasmakallikrein wird von Kabi Vitrum, Stockholm, Schweden bezogen. N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-rutroanilid, das Substrat für Humanthrombin und für Trypsin, wird gemäß den oben für die erfindungsgemäßen Verbindungen beschriebenen Verfahren mittels bekannter Methoden der Peptidkupplung aus im Handel erhältlichen Reaktanden synthetisiert oder von Midwest Biotech, Fishers, Indiana bezogen.
Das Humanplasmin wird von Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana bezogen, nt-PA wird als einkettige Aktivitätsreferenz von American Diagnostica, Greenwich, Conneticut bezogen, modifiziertes t-PA6 (mt-PA6) wird bei Eli Lilly und Company durch das in der Technik bekannte Verfahren hergestellt (siehe Burck et al., J. Biol. Chem., 265, 5120-5177 (1990)). Das chromogene Substrat für Plasmin H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid und das Substrat für den Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid werden von Kabi Vitrum Stockholm, Schweden bezogen.
In den oben beschriebenen chromogenen Substraten werden die Dreibuchstabensymbole Ile, Glu, Gly, Pro, Arg, Phe, Val, Leu und Lys verwendet, um jeweils die entsprechende Aminosäuregruppe Isoleucin, Glutaminsäure, Glycin, Prolin, Arginin, Phenylalanin, Valin, Leucin und Lysin zu bezeichnen.
Die folgende Tabelle 1, führt die mit der angegebenen Verbindung, die durch die Formel I dargestellt wird, erhaltenen Kass Werte auf Tabelle 1
Thrombininhibitoren sollten vorzugsweise die durch Urokinase, Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) und Streptokinase ausgelöste Fibrinolyse schonen. Dies wäre für die therapeutische Verwendung solcher Mittel als Zusatz zu einer thrombolytischen Therapie mit Streptokinase, t-PA oder Urokinase wichtig und für die Verwendung solcher Mittel als endogene Fibrinolyse-sparende (in Hinblick auf t-PA und Urokinase) antithrombotische Mittel. Zusätzlich zur fehlenden Beeinflussung mit der Amidaseaktivität der fibrinolytischen Proteasen, kann ein Sparen am fibrinolytischen System durch die Verwendung von humanen Plasmagerinnseln und ihrer Lyse durch die jeweiligen fibrinolytischen Plasminogenaktivatoren untersucht werden.

Materialien

Hundeplasma wird von bewußt gemischt gekreuzten Jagdhunden (beider Geschlechts Hazelton-LRE, Kalamazoo, Michigan, USA) durch eine Venenpunktion in 3,8 Prozent Citrat erhalten. Das Fibrinogen wird aus frischem Hundeplasma präpariert und das humane Fibrinogen wird von humanem nicht abgelaufenem ACD Blut bei der Fraktion I-2 gemäß bekannter Verfahren und Spezifikationen präpariert. Smith, Biochem. J., 185, 1-11 (1980) und Smith et al., Biochemistry, 11, 2958-2967, (1972). Humanes Fibrinogen (98 Prozent rein / plasminfrei) stammt von American Diagnostica, Greenwich, Connecticut. Die radioaktive Markierung von Fibrinogen I-2 Präparationen wird wie vorher beschrieben durchgeführt. Smith et al., Biochemistry, 11, 2958-2967 (1972). Die Urokinase wird von Leo Pharmaceuticals, Denmark mit 2200 Ploug Einheiten/Gläschen bezogen. Die Streptokinase wird von Hoechst-Roussel Pharmaceuticals, Somerville, New Jersey bezogen.

Verfahren - Wirkungen auf die Lyse der humanen Plasmagerinnsel durch t-PA

Humane Plasmagerinnsel werden in Mikroteströhrchen durch die Zugabe von 50 ul Thrombin (73 NIH Einheiten/ml) zu 100 ul humanem Plasma gebildet, das 0,0229 uCi 125-Iod-markiertes Fibrinogen enthält. Die Gerinnselauflösung wird durch die Überschichtung der Gerinnsel mit 50 ul Urokinase oder Streptokinase (50, 100 oder 1000 Einheiten/ml) und einer Inkubation für 20 Stunden bei Raumtemperatur untersucht. Nach der Inkubation werden die Röhrchen in einer Beckman Microfuge zentrifugiert. 25 ul Überstand werden in ein Volumen von 1,0 ml 0,03 M Tris/0, 15 M NaCl Puffer für die Gammazählung gegeben. Zählkontrollen mit 100% Lyse werden durch das Weglassen von Thrombin (und den Ersatz durch Puffer) erhalten. Die Thrombininhibitoren werden auf die mögliche Wechselwirkung mit der Fibrinolyse getestet, indem man die Verbindungen in die Überschichtungslösungen in Konzentrationen von 1, 5 und 10 ug/ml einarbeitet. Grobe Annäherungen der HKso Werte werden durch lineare Extrapolationen von Datenpunkten zu einem Wert abgeschätzt, der 50 Prozent Lyse für diese bestimmte Konzentration des fibrinolytischen Mittels darstellen würde.

Antikoagulationsaktivität

Materialien

Hundeplasma und Rattenplasma werden von bewußt gemischt gekreuzten Jagdhunden (beider Geschlechts Hazelton-LRE, Kalamazoo, Michigan, USA) oder von anaesthesierten männlichen Sprague-Dawley Ratten (Harlan Sprague-Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana, USA) durch eine Venenpunktion in 3,8 Prozent Citrat erhalten. Das Fibrinogen wird von humanem nicht abgelaufenem ACD Blut bei der Fraktion I-2 gemäß vorheriger Verfahren und Spezifikationen präpariert. Smith, Biochem. J., 185, 1-11 (1980) und Smith et al., Biochemistry, 11, 2958-2967, (1972). Humanes Fibrinogen wird 98 Prozent rein / plasminfrei von American Diagnostica, Greenwich, Connecticut bezogen. Die Koagulationsreagentien ACTIN, Thromboplastin und humanes Plasma werden von Baxter Healthcare Corp., Dade Division, Miami, Florida erhalten. Rinderthrombin von Parke-Davis (Ann Arbour, Michigan) wird für Koagulationstests im Plasma verwendet.

Verfahren

Antikoagulationsbestimmungen

Die Koagulationstestverfahren laufen wie vorher beschrieben. Smith et al., Thrombosis Research, 50, 163-174 (1988). Ein CoA-Screener-Koagulationsgerät (American LABor, Inc.) wird für alle Koagulationstestmessungen verwendet. Die Prothrombinzeit (PT) wird durch die Zugabe von 0,05 ml Kochsalzlösung und 0,05 ml Thromboplastin-C Reagenz zu 0,05 ml Testplasma gemessen. Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) wird durch die Inkubation von 0,05 ml Testplasma mit 0,05 ml Actinreagenz für 120 Sekunden gefolgt von 0,05 ml CaCl&sub2; (0,02 M) gemessen. Die Thrombinzeit (TT) wird dwch die Zugabe von 0,05 ml Kochsalzlösung und 0,05 ml Thrombin (10 NIH Einheiten/ml) zu 0,05 ml Testplasma gemessen. Die Verbindungen der Formel I werden zu Human- oder Tierplasma über einen weiten Konzentrationsbereich gegeben, um die Verlängerungswirkungen auf die APTT, PT und TT Tests zu bestimmen. Es werden lineare Extrapolationen durchgeführt, um die Konzentrationen zu bestimmen, die zur Verdoppelung der Gerinnungszeit für jeden Test erforderlich sind. Tabelle 2 Antikoagulation von humanem Plasma 2 · Gerinnuugszeit (ng/ml)

Tiere

Männliche Sprague Dawley Ratten (350-425 g, Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN) werden mit Xylazin (20 mg/kg, s. c.) und Ketamin (120 mg/kg, s. c.) anaesthesiert und auf einem mit Wasser geheizten Kissen gehalten (37ºC). Die Jugularvene wird kanüliert, um Infusionen zu ermöglichen.

Arterio-venöses Shuntmodell

Die linke Jugularvene und die rechte Arteria carotis werden mit 20 cm langen Polyethylen PE 60 Schläuchen kanüliert. Ein 6 cm langer zentraler Abschnitt eines größeren Schlauchs (PE 190) wird mit einem Baumwollfaden (5 cm) im Lumen zwischen den längeren Abschnitten per Reibung befestigt, um den arteriovenösen Shuntkreislauf zu vervollständigen. Das Blut zirkuliert für 15 Minuten durch den Shunt bevor der Faden sorgfältig entfernt und gewogen wird. Das Gewicht eines nassen Fadens wird vom Gesamtgewicht des Fadens und des Thrombus abgezogen (siehe J. R. Smith, Br. 1 Pharmacol., 77: 29, 1982).

FeCl&sub3; Modell einer arteriellen Verletzung

Die Carotisarterien werden über eine ventrale cervikale Inzision entlang der Mittellinie isoliert. Ein Thermoelement wird unter jede Arterie plaziert und die Gefäßtemperatur wird kontinuierlich auf einem Bandschreiber aufgezeichnet. Ein Cuff eines Schlauchs (0,058a · 0,077 OD · 4 mm, Baxter Med. Grade Silicone), der längs aufgeschnitten ist, wird um jede Carotis direkt über dem Thermoelement plaziert. FeCl&sub3; Hexahydrat wird in Wasser gelöst und die Konzentration (20 Prozent) wird als tatsächliches Gewicht des isolierten FeCl&sub3; angegeben. Um die Arterie zu verletzen und eine Thrombose zu induzieren werden 2,85 ul in den Cuff pipettiert, um die Arterie über der Thermoelementsonde zu benetzen. Die arterielle Okklusion wird durch einen rapiden Temperaturabfall angezeigt. Die Zeit bis zur Okklusion wird in Minuten angegeben und stellt die vergangene Zeit zwischen der Verabreichung des FeCl&sub3; und des rapiden Abfalls der Gefäßtemperatur dar (siehe K. D. Kurz, Thromb. Res. 60: 269, 1990)

Modell für die spontane Thrombolyse

In vitro Daten legen nahe, daß die Peptidthrombininhibitoren Thrombin und in höheren Konzentrationen andere Serinproteasen hemmen, wie Plasmin und den Gewebsplasminogenaktivator. Um zu ermitteln, ob die Verbindungen die Fibrinolyse in vivo hemmen, wird die Geschwindigkeit der spontanen Thrombolyse durch die Implantation eines markierten Gesamtblutgerinnsels in die pulmonale Zirkulation bestimmt. Rattenblut (1 ml) wird schnell mit Rinderthrombin (4 IE, Parke Davis) und ¹²&sup5;I Humanfibrinogen (5 uCi, ICN) gemischt, unmittelbar in einen Silastikschlauch gezogen und bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert. Der gereifte Thrombus wird aus dem Schlauch herausgenommen, in 1 cm Segmente geschnitten, 3x in normaler Kochsalzlösung gewaschen und jedes Segment wird in einem Gammazähler ausgezählt. Ein Segment mit einer bekannten Aktivität wird in den Katheter gesaugt, der anschließend in die Jugularvene implantiert wird. Die Katheterspitze wird in die Nähe des rechten Vorhofs vorgeschoben und das Gerinnsel befreit, um in den Lungenkreislauf zu flotieren. Eine Stunde nach der Implantation werden das Herz und die Lungen entnommen und getrennt ausgezählt. Die Thrombolyse wird als Prozentsatz ausgedrückt, wobei folgendes gilt:
% Thrombolyse = (injizierte cpm - Lungen cpm) · 100/injizierte cpm
Die fibrinolytische Auflösung des implantierten Gerinnsels tritt zeitabhängig auf (siehe J. P. Clozel, Cardiovas. Pharmacol., 12: 520, 1988).

Koagulationsparameter

Die Plasmathrombinzeit (TT) und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) werden mit einem Fibrometer gemessen. Das Blut wird aus einem Jugularkatheter entnommen und in Spritzen gesammelt, die Natriumcitrat enthalten (3,8 Prozent, 1 Teil auf 9 Teile Blut). Um TT zu messen, wird Rattenplasma (0,1 ml) mit Kochsalzlösung (0,1 ml) und Rinderthrombin (0,1 ml, 30 E/ml in Tris-Puffer, Parke Davis) bei 37ºC gemischt. Für die APTT werden Plasma (0,1 ml) und APTT Lösung (0,1 ml Organon Teknika) für 5 Minuten inkubiert (37ºC) und CaCl&sub2; (0,1 ml, 0,025 M) wird zum Starten der Koagulation zugegeben. Die Tests werden doppelt ausgeführt und gemittelt.

Index der Bioverfigbarkeit

Ein Maß der Bioaktivität, die Plasmathrombinzeit (TT), dient als Stellvertreter für den Test der Ursprungsverbindung mit der Annahme, daß die Zunahme der TT nur von der Thrombinhemmung durch die Ursprungsverbindung kommt. Der Zeitverlauf der Wirkung des Thrombininhibitors auf TT wird nach einer i. v. Bolusverabreichung an anaesthesierten Ratten und nach einer oralen Verabreichung an gefasteten Ratten bei Bewußtsein bestimmt. Aufgrund von Beschränkungen im Blutvolumen und der Anzahl an Meßpunkten, die zur Bestimmung des Zeitverlaufs vom Zeitpunkt der Behandlung bis zum Zeitpunkt, wenn die Reaktion zu Werten vor der Behandlung zurückkehrt, erforderlich sind, werden zwei Rattenpopulationen verwendet. Jede Probenpopulation stellt alternierende aufeinanderfolgende Zeitpunkte dar. Die mittlere TT über den Zeitverlauf wird zur Berechnung der Fläche unter der Kurve verwendet (AUC). Der Index der Bioverfügbarkeit wird durch die unten gezeigte Formel errechnet und wird als prozentuale relative Aktivität ausgedrückt.
Die Fläche unter der Kurve (AUC) des Plasma TT Zeitverlaufs wird bestimmt und die Dosis eingestellt. Dieser Index der Bioverfigbarkeit wird "% Relative Aktivität" genannt und wird folgendermaßen errechnet

Verbindungen

Die Lösungen der Verbindungen werden täglich frisch in normaler Kochsalzlösung hergestellt und werden als Bolus injiziert oder 15 Minuten vor und während der experimentellen Pertubation infundiert, die im arteriovenösen Shuntmodell 15 min und im FeCl&sub3; Modell der arteriellen Verletzung und im spontanen Thrombolysemodell 60 min beträgt. Das Bolusinjektionsvolumen beträgt 1 ml/kg für i. v. und 5 ml/kg für p. o. und das Infusionsvolumen beträgt 3 ml/h.

Statistiken

Die Ergebnisse werden als Mittel ± SEM ausgedrückt. Es wird eine Einwegsanalyse der Varianz verwendet, um statistisch signifikante Unterschiede festzustellen und dann wird der Dunnett's Test angewendet, um zu bestimmen, welche Mittel unterschiedlich sind. Die Signifikanzgrenze für die Zurückweisung der Nullhypothese von gleichen Mittelwerten ist P < 0,05.

Tiere

Männliche Hunde (Beagles, 18 Monate - 2 Jahre, 12-13 kg, Marshall Farms, North Rose, New York 14516) läßt man über Nacht fasten und füttert sie mit zertifizierter Prescription Diet von Purina (Purina Mills, St. Louis, Missouri) 240 Minuten nach der Dosisverabreichung. Wasser ist frei verfügbar. Die Raumtemperatur wird zwischen 66- 74ºF gehalten, die Luftfeuchtigkeit beträgt 45-50 Prozent relative Luftfeuchte und es wird von 6 Uhr bis 18 Uhr beleuchtet.

Pharmakokinetisches Modell

Die Testverbindung wird unmittelbar vor der Dosierung formuliert, indem man sie in steriler 0,9 prozentiger Kochsalzlösung in einer 5 mg/ml Präparation auflöst. Den Hunden wird eine einzelne 2 mg/kg Dosis der Testverbindung durch orale Verabreichung gegeben. Blutproben (4,5 ml) werden aus der Vena cephalica 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4 und 6 Stunden nach der Dosisverabreichung entnommen. Proben werden in citratisierten Vacutainerröhrchen gesammelt und vor der Reduzierung auf das Plasma durch Zentrifugation auf Eis gehalten. Die Plasmaproben werden mit Dinitrophenylhydrazin derivatisiert und durch HPLC (Zorbax SB-C8 Säule) analysiert und mit Methanol / 500 mM Natriumacetat, das auf pH 7 mit Phosphorsäure (60 : 40 V/V) eingestellt ist, eluiert. Dis Plasmakonzentration der Testverbindung wird aufgezeichnet und zur Berechnung der pharmakokinetischen Parameter verwendet: Eliminationsgeschwindigkeitskonstante, Ke, totale Clearance, Clt, Verteilungsvolumen, VD, Zeit der maximalen Plasmakonzentration der Testverbindung, Tmax, maximale Konzentration der Testverbindung von Tmax, Cmax, Plasmahalbwertszeit, t0,5, die Fläche unter der Kurve, A. U. C, und den Teil der Testverbindung, der absorbiert wurde, F.

Hundemodell der Koronararterienthrombose

Die operative Vorbereitung und instrumentelle Ausstattung der Hunde erfolgt, wie dies in Jackson et al., Circulation, 82, 930-940 (1990) beschrieben wurde. Gemischt-gekreuzte Jagdhunde (6-7 Monate alt, beider Geschlechts, Hazelton-LRE, Kalamazoo, MI, USA) werden mit Natriumpentobarbital (30 mg/kg intravenös, i. v.) anaesthesiert, intubiert und mit Raumluil beatmet. Das Differenzvolumen und die Atemgeschwindigkeit werden eingestellt, um die PO&sub2;, PCO&sub2; und pH Werte des Bluts innerhalb der normalen Grenzen zu halten. Subdermale Nadelelektroden werden zur Aufzeichnung eines Leit II EKG eingeführt.
Die linke Jugularvene und die Arteria carotis communis werden durch einen mediolateralen Halsschnitt auf der linken Seite isoliert. Der arterielle Blutdruck (ABP) wird kontinuierlich mit einem vorkalibrierten Millarwandler (Modell MPC-500, Millar Instruments, Houston, TX, USA) gemessen, der in die Arteria carotis eingeführt wurde. Die Jugularvene wird zur Blutprobenentnahme während des Experiments kanüliert. Zusätzlich werden die femoralen Venen beider Hinterbeine zur Verabreichung der Testverbindung kanüliert.
Es wird eine Thorakotomie auf der linken Seite im fünfien intercostalen Raum durchgeführt und das Herz wird in einem perikardialen Drahtgestell aufgehängt. Es wird ein 1 bis 2 cm Segment der linken circumflexen Koronararterie (LCX) proximal zur ersten diagonalen ventrilhnlären Hauptverzweigung isoliert. Eine Anodenelektrode, die mit einer 26 Gauge Nadel versehen wurde (Teflon-beschichtet, silberbeschichteter 30 Gauge Kupferdraht), mit einer Länge von 3-4 mm wird in die LCX eingeführt und mit der Intimaoberfläche der Arterie in Kontakt gebracht (wird am Ende des Experiments bestätigt). Der stimulierende Kreislauf wird durch die Plazierung einer Kathode an einer subkutanen Stelle (s. c.) vervollständigt. Ein einstellbarer Plastikverschluß wird um die LCX über die Region der Elektrode plaziert. Eine vorkalibrierte elektromagnetische Flußsonde (Carolina Medical Electronics, King, NC, USA) wird um die LCX proximal zur Anode zum Messen des koronaren Blutflusses (CBF) plaziert. Der Verschluß wird zur Herstellung einer 40-50 prozentigen Hemmung der hyperämischen Blutflußreaktion eingestellt, die nach 10 Sekunden mechanischer Okklusion der LCX beobachtet wird. Alle hämodynamischen und EKG Messungen werden mit einem Datenaufnahmesystem (Modell M3000, Modular Instruments, Malvern, PA, USA) aufgezeichnet und analysiert.

Thrombusbildung und Verabreichungplan der Verbindung

Eine elektrolytische Verletzung der Intima der LCX wird durch Anlegen eines Gleichstroms (DC) von 100 uA an die Anode hergestellt. Der Strom wird für 60 Minuten aufrechterhalten und dann abgebrochen, ob das Gefäß verschlossen ist oder nicht. Die Thrombusbildung läuft spontan bis die LCX total verschlossen ist (bestimmt als Null CBF und Anstieg im S-T Segment). Die Verabreichung der Verbindung wird begonnen, nachdem der verschließende Thrombus lili eine Stunde reifen konnte. Eine 2 Stunden dauernde Infusion der erfindungsgemäßen Verbindungen in Dosen von 0,5 und 1 mg/kg/Stunde wird gleichzeitig mit einer Infusion eines thrombolytischen Mittels begonnen (beispielsweise Gewebsplasminogenaktivator, Streptokinase, APSAC). Die Reperfusion wird für 3 Stunden nach einer Verabreichung der Testverbindung verfolgt. Eine Reokklusion der Koronararterien nach einer erfolgreichen Thrombolyse, die für mehr als 30 Minuten anhält, wird als Null CBF definiert.

Hämatologie und Bestimmung der Zielblutungszeit

Bestimmungen der gesamten Blutzellen, des Hämoglobins und der Hämotokritwerte werden in einer 40 ul Probe citratisierten (3,8 Prozent) Bluts (1 Teil Citrat: 9 Teile Blut) mit einem Hämatologieanalysegerät bestimmt (Cell- Dyn 900, Sequoia-Tunner, Mount View, CA, USA) Zahnfleischzielblutungszeiten werden mit einer Simplate II Blutungszeitvorrichtung bestimmt (Organon Teknika Durham, N. C., USA). Die Vorrichtung wird verwendet, um zwei horizontale Schnitte in das Zahnfleisch entweder des oberen oder des unteren Kiefers des Hundes zu machen. Jeder Schnitt ist 3 mm breit und 2 mm tief. Die Schnitte werden gemacht und es wird eine Stoppuhr zur Bestimmung verwendet, wie lange die Blutung dauert. Es wird ein Baumwolltupfer verwendet, um das Blut aufzusaugen, wenn es aus dem Schnitt sickert. Die Zielblutungszeit ist die Zeit vom Schnitt bis zur Beendigung der Blutung. Die Blutungszeiten werden direkt vor der Verabreichung der Testverbindung (0 min), 60 min bei der Infusion, bei Beendigung der Verabreichung der Testverbindung (120 min) und am Ende des Experiments bestimmt.
Alle Daten werden durch Einwegsanalyse der Varianz (ANOVA) gefolgt von einem Student-Neuman- Kuels post hoc T Test analysiert, um die Signifikanzgrenze zu bestimmen. Wiederholungs ANOVA Messungen werden zur Bestimmung der signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten während der Experimente verwendet. Die Werte sind per Definition mindestens ab der Grenze von p < 0,05 statistisch unterschiedlich. Alle Werte sind Mittelwerte t SEM. Alle Untersuchungen werden gemäß den Richtlinien der American Physiological Society durchgeführt. Weitere Details, die die Verfahren betreffen, sind in Jackson et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 21, 587-599 (1993) beschrieben.

Claims

1. Verbindung der Formel

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon oder ein pharmazeutisch annehmbares Solvat der Verbindung

oder des Salzes hiervon

worin

R¹ für Wasserstoff steht,

X für Prolinyl oder Azetidinyl-2-carbonyl steht,

Y für folgende Gruppe steht

worin R³ für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht,

Z¹ für eine Bindung oder -CH&sub2;- steht,

R&sup4; für unsubstituiertes oder monosubstituiertes Phenyl steht, und

Z für -NHR² steht, worin

R² für -(C=O)R&sup5; steht, worin R&sup5; für eine neun- oder zehngliedrige unsubstituierte oder monosubstituierte fusionierte bicyclische heterocyclische Gruppe mit einem Stickstoffatom steht, oder

R² für eine Gruppe -SO&sub2;R&sup6; steht, worin R&sup6; für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht. oder

R³ und Z unter Bildung einer Azetidinylgruppe oder eines fünf oder sechsgliedrigen unsubstituierten gesättigten heterocyclischen Rings mit ein oder zwei Stickstoffatomen zusammengenommen werden,

und worin ferner jedes Aryl oder jeder Heterocyclus unsubstituiert ist oder mit einem Substituenten monosubstituiert ist, der eine stabile Struktur ergibt, unabhängig ausgewählt aus Halogen, Hydroxyl, C&sub1;-C&sub4; Alkyl, C&sub1;-C&sub4; Alkoxy, Amino (-NH&sub2;), Mono(C&sub1;-C&sub4;-alkyl)amino, Mercapto und (C&sub1;-C&sub4; Alkyl)thio, (-S(O)pC&sub1;-C&sub4; Alkyl), -NHS(O)pC&sub1;-C&sub4; Alkyl), NHC(O)C&sub1;-C&sub4; Alkyl, -S(O)pNH&sub2;, -S(O)pNH(C&sub1;-C&sub4; Alkyl) und -S(O)pN(C&sub1;-C&sub4; Alkyl)&sub2;, worin p für 0, 1 oder 2 steht.

2. Verbindung oder Salz oder Solvat hiervon nach Anspruch 1, worin

R¹ für Wasserstoff steht,

Z für -NHR² steht, worin

R² für -(C=O)R&sup5; steht,

R³ für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht,

Z¹ für -CH&sub2;- steht,

R&sup4; für unsubstituiertes oder monosubstituiertes Phenyl steht,

R&sup5; für C&sub1;-C&sub4; Alkoxy oder eine neun- oder zehngliedrige unsubstituierte oder monosubstituierte fusionierte bicyclische heterocyclische Gruppe mit einem Stickstoffatom steht,

und pharmazeutisch annehmbare Salze und Solvate hiervon.

3. Verbindung oder Salz oder Solvat hiervon nach Anspruch 1, worin

R¹ für Wasserstoff steht,

Z für -NHR² steht, worin

R² für -SO&sub2;R&sup6; steht,

R³ für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht,

R&sup4; für unsubstituiertes oder monosubstituiertes Phenyl steht, und

R&sup6; für C&sub1;-C&sub4; Alkyl steht.

4. Verbindung oder Salz oder Solvat hiervon nach Anspruch 1, worin

R¹ für Wasserstoff steht,

Z für -NHR² steht,

R&sup4; für unsubstituiertes oder monosubstituiertes Phenyl steht, und

R³ und Z unter Bildung einer Azetidinylgruppe oder eines fünf- oder sechsgliedrigen unsubstituierten gesättigten heterocyclischen Rings mit ein oder zwei Stickstoffatomen zusammengenommen werden.

5. Verbindung oder Salz oder Solvat hiervon nach einem der Ansprüche 1-4, worin

Alkyl selbst oder als Teil eines anderen Substituenten für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Isobutyl oder sek-Butyl steht, und

Halogen für Chlor, Fluor, Brom oder Iod steht,

ein neun- oder zehngliedriger heterocyclischer Ring für Indolyl, Chinolinyl oder Isochinolinyl steht,

6. Verbindung oder Salz oder Solvat hiervon nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 1-Methylindolyl-2-carbonyl- D-(α-methyl)phenylglycinyl-L-azetidinyl-2-carbonyl-L-argininaldehyd ist.

7. Verbindung oder Salz oder Solvat hiervon nach Anspruch 3, wobei die Verbindung N-Ethylsulfonyl-(D,L)- phenylglycinyl-(α-methyl)-L-prolinyl-L-argininaldehyd ist.

8. Verbindung oder Salz oder Solvat hiervon nach Anspruch 4, wobei die Verbindung Prolinyl-(α-benzyl)-L- prolinyl-L-argininaldehyd ist.

9. Verbindung oder Salz oder Solvat hiervon nach Anspruch 4, wobei die Verbindung Azetidinyl-(α-benzyl)-Lprolinyl-L-argininaldehyd ist.

10. Pharmazeutische Formulierung, die zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat hiervon nach einem der Ansprüche 1-9 enthält.