DE69434148T2

DE69434148T2 - Alkoholdehydrogenase, dafür kodierende DNA, Herstellung und Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Alkoholen

Info

Publication number: DE69434148T2
Application number: DE69434148T
Authority: DE
Inventors: Tomoko Tsukuba-shi Kojima; Hiroaki Tsukuba-shi Yamamoto; Naoki Tsukuba-shi Kawada; Akinobu Arai-shi Matsuyama
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1993-09-24
Filing date: 1994-09-26
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2014-09-27
Also published as: JP3574682B2; EP0645453A3; EP0645453B1; DE69434148D1; US5763236A; US6255092B1; EP0645453A2; JPH07231785A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer neuen sekundären Alkoholdehydrogenase (Dehydrogenase für sekundäre Alkohole), die für die Herstellung von einem Alkohol, einem Aldehyd und einem Keton, insbesondere für die Herstellung eines optisch aktiven Alkohols, nützlich ist, ein Verfahren für die Herstellung des Enzyms, ein DNA-Segment, das für das Enzym codiert, ein Mikroorganismus transformiert mit der DNA und ein Verfahren zum Herstellen von einem Alkohol, einem Aldehyd und einem Keton, insbesondere von einem optisch aktiven Alkohol unter Verwendung des Enzyms.
Stand der Technik
Von den sekundären Alkolholdehydrogenasen mikrobieller Herkunft, die Nikotinamidadenindinukleotidphosphat erfordern (hiernach als NADP+ abgekürzt), ist diejenige, die von Thermoanaerobium brockii abgeleitet ist, gut dokumentiert (J. Am. Chem. Soc. 108, 162–169 (1986)). Zusätzlich wurde von den sekundären Alkoholdehydrogenasen, die Nikotinamidadindinukleotid (hiernach als NAD+ abgekürzt) erfordern, die folgenden vorgestellt, abgeleitet von Pichia sp. NRRL-Y-11328 (Eur. J. Biochem. 101, 401–406 (1979)), Pseudomonas sp. SPD6 (Bioorg. Chem. 19, 398–417 (1991)), Pseudomonas fluorescence NRRL B-1244 (Tokkai Sho, 59-17982), Pseudomonas maltophilia MB11L (FEMS Microbiol. Lett. 93, 49–56 (1992)), Pseudomonas sp. PED (J. Org. Chem. 57, 1526–1532 (1992)), Pseudomonas sp. ATCC 21439 (Eur. J. Biochem. 119, 359–364 (1981)), Candida boidinii SAHM (Biochim. Biophys. Acta 716, 298–307 (1992)), Mycobactericum vaccae JOB-5 (J. Gen. Microbiol. 131, 2901–2907 (1985)), Rhodococcus rhodochrous PNKb1 (Arch. Microbiol. 153, 163–168 (1990)), Comamonas terrigena (Biochim. Biophys. Acta 661, 74–86 (1981)), und Arthrobacter sp. SBA (Tokkai Sho 51-57882).
Jedoch ist die stereochemische Substratspezifität dieser sekundären Alkoholdehydrogenasen für die praktische Anwendung nicht befriedigend. Beispielsweise wurde in Bezug auf 2-Butanol – eines der am häufigsten erwähnten Substrate für die sekundäre Alkolholdehydrogenase – von keinem Enzym berichtet, welches (S)-2-Butanol stereospezifisch zu 2-Butanon oxidieren wird. (Die Enzyme, die von Pseudomonas sp. ATCC 21439, Pseudomonas sp. SPD6, Comamonas terrigena, Candida boidinii SAHM oder Pichia sp. NRRL-Y-11328 abgeleitet sind, oxidieren das (R)-Isomer vorzugsweise, während das Enzym, das von Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244 abgeleitet ist, keine bestimmte definierte stereochemische Substratspezifität aufzeigt, und die Spezifizät der Enzyme, die von Mycobacterium vaccae JOB-5, Rhodococcus rhodochrous PNKb1, Pseudomonas sp. PED oder Pseudomonas maltophilia MB11L abgeleitet sind, ist nicht bekannt.) Desweiteren, obwohl die primäre Alkoholdehydrogenase (SADH-1), abgeleitet von Bäckerhefe (Saccaromyces cerevisiae), dafür bekannt ist, 2-Butanol mit S-Konfiguration bevorzugt zu oxidieren, ist die relative Aktivität, so niedrig wie etwa 1% der Aktivität für Ethanol, für die praktische Verwendung nicht geeignet (Arch. Biochem. Biophys. 126, 933–944 (1968), J. Biol. Chem. 268, 7792–7798 (1993)).
WO-A-93-18138 offenbart eine ketonische Esterreduktase mit einem Molekulargewicht von etwa 67 kD isoliert aus Candida parapsilosis. Das Enzym verwendet NADH als ein Coenzym und hat ein breites Substratspektrum. Es reduziert Aldehyde und Ketone um bevorzugt die korrespondierenden primären und sekundären (S)-Alkohole zu bilden, welche in der umgekehrten Umsetzung oxidiert werden, um Aldehyde und Ketone zu bilden.
Es gab einen großen Bedarf für ein weiteres Enzym, das hochspezifisch für sekundäre Alkohole ist, insbesondere eine sekundäre Alkoholdehydrogenase, welche bevorzugt (S)-2-Butanol oxidieren wird.
Es gab auch einen hohen Bedarf für das Klonieren von DNA, die für das Enzym codiert, da es dadurch möglich sein wird, das Enzym in einem großen Maßstab durch Techniken des genetischen Engineerings unter Verwendung des geklonten Gens dieses Enzyms zu produzieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Während des breit angelegten Screenens von Mikroorganismen mit der Fähigkeit, vorzugsweise (S)-2-Butanol zu oxidieren, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckt, daß der Mikroorganismus, der zu dem Genus Candida gehört, insbesondere Candida parapsilosis, die Aktivität aufwies, vorzugsweise (S)-2-Butanol zu oxidieren, sie haben das Enzym zum Oxidieren von (S)-2-Butanol aus Zellen von Kulturen dieses Mikroorganismus aufgereinigt, und sie haben dessen enzymatische Eigenschaften studiert und herausgefunden, daß das Enzym die Fähigkeit hat, (S)-2-Butanol mit einer hohen stereochemischen Spezifität zu oxidieren und ebenso verschiedene andere sekundäre Alkohole stereospezifisch zu oxidieren. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Enzym mit den folgenden physiochemischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen, wie in 1) bis 9) definiert:
1) Funktionen
Das Enzym oxidiert Alkohol mit NAD+ als Coenzym, um das entsprechende Keton oder den entsprechenden Aldehyd zu produzieren und reduziert ebenso Ketone oder Aldehyde mit NADH als Coenzym, um den entsprechenden Alkohol zu produzieren.
2) Substratspezifität
Das Enzym verwendet alipathische Alkohole einschließlich derjenigen mit einer aromatischen Substitution als sein zu oxidierendes Substrat, hat eine relativ höhere Aktivität gegenüber sekundären Alkoholen als gegenüber primären Alkoholen und oxidiert bevorzugt 2-Butanol mit der S-Konfiguration. Das Enzym verwendet ebenso Aldehyde oder alipathische Ketone mit einer aromatischen Substitution.
3) Molekulargewicht
Das anscheinende Molekulargewicht des Enzyms wird auf ungefähr 40.000 durch SDS-PAGE eingeschätzt. Physikochemische ebenso wie enzymatische Eigenschaften des Enzyms der vorliegenden Erfindung sind wie folgt:
4) Optimaler pH-Wert und pH-Bereich für die Enzymstabilität
Der optimale pH-Wert für die Oxidation von (S)-2-Butanol rangiert von 8,5 bis 9,5, und derjenige für die Reduktion von 2-Butanon rangiert von 5,5 bis 6,5. Das Enzym ist in dem pH-Bereich von 8,0 bis 10,0 relativ stabil.
5) Optimaler Temperaturbereich für die enzymatische Reaktion
Das Enzym zeigt die hohe Aktivität bei der Temperatur im Bereich von 25–55°C, wobei 50°C als optimal für die enzymatische Reaktion angesehen werden.
6) Thermische Inaktivierung
Das Enzym behält mehr als 90% der ursprünglichen Aktivität sogar nach der Hitzebehandlung bei 40°C für 10 Min. bei.
7) Inhibierung und Stabilisierung
Die Aktivität des Enzyms wird durch SH-Reagenzien inhibiert, so wie p-Mercuribenzoesäure, Quecksilberchlorid, Zinkchlorid und N-Ethylmaleimid, und ebenso durch Reduktionsmittel, einschließlich 2-Mercaptoethanol und Dithiothreitol. Die Enzymaktivität wird durch o-Phenanthrolin inhibiert, aber nicht durch Ethylendiamintetraessigsäure.
8) Aufreinigung
Das Enzym kann bis zu einer einzelnen Proteinbande auf der Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektophorese (hiernach abgekürzt als SDS-PAGE) durch Kombinieren der konventionellen Aufreinigungsverfahren für normale Proteine, umfassend beispielsweise Protaminsulfatpräzipitation nach dem Zerstören der mikrobiellen Zellen, Ammoniumsulfatfraktionierung des zentrifugierten Überstandes, gefolgt durch eine Kombination einer anionen Austauschchromatographie, einer hydrophoben Chromatographie und einer Gelfiltration aufgereinigt werden.
9) Isoelektrischer Punkt
Auch wenn das Enzym verschiedene Banden nach dem isoelektrischen Fokussieren zeigt, ist der isoelektrische Punkt der Hauptproteinbande bei einem pH von 6,7 angeordnet.
Die Aktivität aller sekundärer Alkoholdehydrogenasen einschließlich des Enzyms, das in den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Beschreibung beschrieben ist, wurde wie folgt überprüft: (S)-2-Butanol (50 μmol) und das Enzym wurden in einer Umsetzungsmischung enthaltend Tris-HCl (50 μmol, pH 9,0) und NAD+ (2,5 μmol) bei 30°C inkubiert, und die Geschwindigkeit der NADH-Bildung wurde bei 340 nm beobachtet. Eine Einheit des Enzyms wurde definiert als die Enzymmenge, die erforderlich ist, um die Bildung eines μmols NADH pro Minute unter den Assaybedingungen zu katalysieren.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein DNA-Segment zur Verfügung zu stellen, das für die sekundäre Alkoholdehydrogenase codiert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben das auf gereinigte Enzym mit Lysylendopeptidase verdaut, die verdauten Fragmente durch Umkehrphasenchromatographie aufgereinigt und einen Teil der Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Proteinsequenzierers bestimmt. PCR (Polymerasekettenreaktion) wurde unter Verwendung von Primern ausgeführt, die basierend auf der Aminosäuresequenz, die oben bestimmt wurde, synthetisiert wurden, und der chromosomalen DNA von Candida parapsilosis als Template. Ein Teil des Gens, das für die sekundäre Alkoholdehydrogenase codiert, wurde amplifiziert und dessen Basensequenz (Kernsequenz) wurde bestimmt. Dann, um die Basensequenz in der flankierenden Region der DNA-Sequenz, die oben bestimmt wurde (Kernsequenz) zu bestimmen, wurde die chromosomale DNA von Candida parapsilosis mit HaeII verdaut, einem Restriktionsenzym ohne einen Restriktionsort in der Kernzsequenz. Die Template-DNA, die für die Umkehr-PCR verwendet wurde (Nucleic Acids, Res. 16, 8186 (1988)), wurde durch Autorezyklisierung von DNA-Fragmenten hergestellt, die oben erhalten unter Verwendung von T4-DNA-Ligase wurden. Basierend auf der Kernsequenz wurden Primer hergestellt, die als Initiierungsort für die DNA-Synthese dienten, wobei sich die DNA von der Kernsequenz aus ausdehnte, und die flankierenden Bereiche der Kernsequenz wurden durch Umkehr-PCR amplifiziert. Durch Ergründen der erhaltenen DNA-Sequenz wurde bestätigt, daß der gesamte codierende Bereich der sekundären Alkoholdehydrogenase in der autorezirkularisierten DNA beinhaltet war, wie gezeigt in 6, 7 und 8. Weiterhin wurde bestätigt, daß das Produkt der Expression des klonierten Gens in Escherichia coli Wirtszellen eine enzymatische Aktivität aufweist, die ähnlich zu der der sekundären Alkoholdehydrogenase ist, die von Candida parapsilosis abgeleitet ist.
DNA, die für die sekundäre Alkoholdehydrogenase der vorliegenden Erfindung codiert, beinhaltet die Basensequenz, die für das Protein codiert, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die im wesentlichen ähnlich zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 ist, und die in den 6, 7 und 8 gezeigt ist. "Im wesentlichen" bedeutet in diesem Fall, daß die Aminosäuresequenz, die in den 6, 7 und 8 gezeigt ist, durch Deletion, Insertion oder Substitution von gewissen Aminosäuren modifiziert sein kann, so lange, wie resultierende Proteine die sekundäre Alkoholdehydrogenaseaktivität beibehalten. Natürlich beinhaltet die DNA der vorliegenden Erfindung die DNA, die aus 1008 Basen besteht, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 1 und in 6, 7 und 8, aber nicht auf diese beschränkt ist. Eine DNA-Modifizierung, welche zu einer Deletion, Insertion oder Substitution in der Aminosäuresequenz führt, für die die DNA codiert, wird geeigneterweise durch ein konventionelles Verfahren erzielt, so wie die ortsspezifische Mutation unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden. Ferner kann DNA mit einer zufälligen Mutation durch Ausführen einer PCR unter Verwendung von DNA erhalten werden, die aus 1008 Basen besteht, wie in den 6, 7 und 8 gezeigt ist, oder durch geeignetes Modifizieren der DNA als Template in der Gegenwart von Mn²⁺ (normalerweise 0,5–10 mM) oder einer abgesenkten Konzentration gewisser Nukleotide. Natürlich umfassen die so erhaltenen DNAs gemäß der vorliegenden Erfindung DNA, die für das Protein mit der sekundären Alkoholdehydrogenaseaktivität codiert.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen, welcher stabil mit dem DNA-Molekül transformiert ist, das für das Protein mit eine Aminosäuresequenz codiert, die im wesentlichen ähnlich zu der ist, die in den 6, 7 und 8 gezeigt ist, und die in der Lage ist, die sekundäre Alkoholdehydrogenase zu produzieren.
Jeder Mikroorganismus, der mit dem DNA-Segment transformiert werden kann, das für ein Peptid mit der sekundären Alkoholdehydrogenaseaktivität codiert und welcher in der Lage ist, diese Aktivität zu exprimieren, wird ein Gegenstand der Transformation der vorliegenden Erfindung sein. Tatsächlich umfaßt dieser Mikroorganismus Bakterien, Hefen und Pilze, deren Wirt-/Vektorsystem gut entwickelt ist. Bakterien beinhalten Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Brevibacterium, Corynebacterium, Streptococcus und Lactobacillus. Hefen beinhalten Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Hansenula, Pichia und Candida. Pilze beinhalten Neurospora, Aspergillus, Cephalosporium und Trichoderma.
Eine Prozedur oder ein Verfahren zum Herstellen eines Transformanten kann gemäß der konventionellen Technik ausgeführt werden, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie, Biotechnologie und dem genetischen Engineering verwendet wird.
Um das Gen der vorliegenden Erfindung in einem Mikroorganismus zu exprimieren, ist es erforderlich, das Gen in den Plasmidvektor oder den Phagenvektor zu inserieren, der stabil in dem Mikroorganismus vorhanden ist. Zum Exprimieren der DNA der vorliegenden Erfindung in Mikroorganismen ist es ebenso erforderlich, die genetische Information, die in dem Gen beinhaltet ist, zu transkribieren und zu translatieren. Dies kann durch das Einfügen eines Promoters und eines Terminators erreicht werden, der Kontrolleinheit für die Transkription und Translation, in den Upstream- bzw. den Downstream-Bereich des 5'-Endes der DNA der vorliegenden Erfindung. Zu diesem Zweck ist es wichtig, einen Promoter und einen Terminator zu verwenden, welcher dafür bekannt ist, in dem Mikroorganismus zu funktionieren, der als Wirtszelle verwendet werden soll. Promotoren und Terminatoren, die mit verschiedenen Mikroorganismen verwendbar sind, sind detailliert in "Biseibutsugaku Kisokoza (Basic Microbiology), Vol. 8, Genetic Technology, Kyoritsu Shuppan (1990)" beschrieben, insbesondere diejenigen, die in Hefe verwendbar sind in "Adv. Biochem. Eng. 43, 75–102 (1990)" oder "Yeast 8, 423–488 (1992)". Beispielsweise beinhalten mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Escherichia, insbesondere mit Escherichia coli, den Plasmid der pBR- und der pUC-Serie, und geeignete Promotoren für die Verwendung beinhalten den lac-Promoter (β-Galactosidase), das trp-Operon (Tryptophanoperon), und den tac-Promoter (lac-trp-Promoter), und λ-Phagen PL- oder PR-abgeleitete Promotoren. Desweiteren beinhalten mögliche Terminatoren für die Verwendung trpA- oder Phagen-abgeleitete rrnB-ribosomale Terminatoren.
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Bacillus beinhalten die Plasmide der pUB110-Serie oder der pC194-Serie, welche direkt in das Chromosom inseriert werden können. Außerdem beinhalten mögliche Promotoren oder Terminatoren für die Verwendung mit dieser Spezies apr (Alkalinprotease), npr (neutrale Protease) und amy (α-Amylase) Promotoren.
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Pseudonomas, insbesondere mit Pseudonomas putida und Pseudonomas cepacia beinhalten das neu entwickelte Wirtsvektorsystem, so wie pKT240, einen Vektor mit einem breiten Wirtszellenspektrum abgeleitet vom TOL-Plasmid, das an der Toluolzersetzung teilnimmt (der Vektor beinhaltet ebenso das Gen, das für die autonome Replikation erforderlich ist, abgeleitet von RSF1010 und anderen), und mögliche Promotoren und Terminatoren beinhalten das Lipasegen (JPH5-284973).
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Brevibacterium, insbesondere mit Brevibacterium lactofermentum beinhalten pAJ43, und mögliche Promotoren und Terminatoren für die Verwendung sind die gleichen wie diejenigen, die mit Escherichia verwendet werden.
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Corynebacterium, insbesondere mit Corynebacterium glutamicum beinhalten pCS11 (JPS57-183799) und pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)).
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Streptococcus beinhalten jene wie pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)) und pGK1 (Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)).
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Lactobacillus sind diejenigen, die für die Verwendung mit Streptococcus entwickelt wurden, so wie pAMβ1 (J. Bacteriol. 137, 614 (1979)), und mögliche Promotoren für die Verwendung sind diejenigen für die Verwendung mit Escherichia.
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Saccharomyces, insbesondere Saccharomyces cerevisiae beinhalten diejenigen der Serie YRp, YEp, YCp und YIp.
Der Integrationsvektor, (z. B. in EP537456) zusammengesetzt durch die Verwendung von homologer Rekombination aus ribosomaler DNA mit einer multiplen Kopie in dem Chromosom, ist nützlich für die Insertion einer multiplen Kopie und für die stabile Generhaltung. Zusätzlich sind Plasmidvektoren, die ADH (Alkoholdehydrogenase), GAPDH (Glyceraldehyd 3-Phosphatdehydrogenase), PHO (Säurephosphatase), GAL (β-Galactosidas), PGK (Phosphoglyceratkinase) und ENO (Enolase) tragen, ebenso nützlich als Promoter oder Terminator mit dieser Art.
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung mit Kluyveromyces, insbesondere Kluyveromyces lactis beinhalten 2 μm Serienplasmide abgeleitet von Saccaromyces cerevisiae, pKD1 Serienplasmide (J. Bacteriol. 145, 382–390 (1981)), pGK11-abgeleitete Plasmide, die zur Killeraktivität in Bezug stehen, Plasmide der KARS-Serie mit dem autonomen Replikationsgen von Kluyveromyces und den Integrationsvektor (z. B. in EP537456), welcher in das Gen durch homologe Replikation mit ribosomaler DNA integrieren kann. Vektoren, in die das Gen, das für ADH oder PGK codiert, eingefügt wurde, sind ebenso als Promoter oder Terminator verwendbar.
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung in Schizosaccaromyces beinhalten diejenigen mit der Einfügung von a) ARS (Gen in Bezug auf die autonome Replikation) abgeleitet von Schizosaccharomyces pombe, b) den selektiven Marker abgeleitet von Saccharomyces cerevisae und komplementär zur Auxotropie (Mol. Cell Biol. 6, 80 (1986)), und c) ADH-Promoter abgeleitet von Saccharomyces pombe (EMBO J. 6, 729, (1987)).
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung in Zygosaccharomyces beinhalten pSB3 abgeleitet von Zygosaccharomyces rouxii (Nuclei Acids Res. 13, 4267 (1985)), PHO5-Promoter abgeleitet von Saccharomyces cerevisiae, und GAP-Zr (tragend das Gen für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) Promoter abgeleitet von Zygosaccharomyces rouxii (Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)).
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung in Hansensula beinhalten das Wirtsvektorsystem, das in Hasenula polymorpha entwickelt wurde, umfassend HARS1 und HARS2, die autonome Replikationssequenz von Hansenula polymorpha, welche wiederum relativ unstabil sind. Daher ist der Integrationsvektor, der die multiplen Kopien im Chromosom trägt, nützlich (Yeast 7, 431–448 (1991)). Promotoren für Methanol-induzierbare AOX (Alkoholdehydrogenase) oder FDG (Formatdehydrogenase) sind ebenso nützlich.
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung in Pichia beinhalten das Wirtsvektorsystem, das in Pichia pastoris entwickelt wurde unter Verwendung des Gens, das an der autonomen Replikation in Pichia teilnimmt (Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)) und den potenten Promoter für AOX induzierbar durch die Hochkonzentrationskultur in der Gegenwart von Methanol (Nucleic Acid Res. 15, 3859 (1987)).
Als mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung in Candida wurde das Wirtsvektorsystem in Candida maltosa, Candida albicans und Candida tropicalis entwickelt. In Candida maltosa wurde der Plasmidvektor mit der Insertion der klonierten ARS (autonome Replikationssequenz), abgeleitet von Candida maltosa (Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)), für die Verwendung entwickelt.
Mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung in Aspergillus, einem der am gründlichsten studierten Pilze, beinhalten den Vektor, der durch die Integration des Gens in den Plasmid oder in das Chromosom und den Promoter für die extrazelluläre Protease oder Amylase (Trends in Biotechnology 7, 283–287 (1989)) konstruiert wurde.
Als mögliche Plasmidvektoren für die Verwendung in Trichoderma wurde das Wirtsvektorsystem in Trichoderma reesei entwickelt, und der Promoter für die extrazelluläre Cellulase ist für die Vektorkonstruktion nützlich (Biotechnology 7, 596–603).
Ein Verfahren zum Herstellen des Enzyms der vorliegenden Erfindung umfaßt das Kultivieren der Zellen, die zu dem Genus Candida oder deren Mutanten gehören, mit der Fähigkeit zur Produktion des Enzyms mit den folgenden Eigenschaften 1) bis 3) oder rekombinanter Zellen, die mit der Fähigkeit zur Produktion des Enzyms durch Inserieren des Gens, das für das Enzym codiert, in einem fremden Mikroorganismuswirt ausgestattet sind.
1) Funktion
Das Enzym oxidiert Alkohol mit NAD+ als Coenzym und produziert korrespondierende Ketone oder Aldehyde. Ebenso reduziert das Enzym Ketone oder Aldehyde mit NADH als Coenzym und produziert den korrespondierenden Alkohol.
2) Substratspezifität
Das Enzym verwendet alipathische Alkohole mit aromatischer Substitution als Substrat für den Oxidationsreaktion, zeigt eine höhere Aktivität gegenüber sekundären Alkoholen, verglichen mit primären Alkoholen und oxidiert (S)-2-Butanol bevorzugt. Aldehyde oder Ketone mit aromatischer Substitution sind die Substrate für die Reduktionsreaktion des Enzyms.
3) Molekulargewicht
Das anscheinende Molekulargewicht des Enzyms wird auf etwa 40.000 durch SDS-PAGE eingeschätzt.
Desweiteren kann das Enzym der vorliegenden Erfindung oder der Mikroorganismus, der das Enzym enthält (einschließlich vom mutierten Stämmen und rekombinanten Mikroorganismen) oder das bearbeitete Produkt daraus verwendet werden, um mit dem racemischen aliphatischen Alkolhol mit einer möglichen aromatischen Substitution, so wie 2-Butanol, 2-Octanol, Phenylethanol, 1,3-Butanediol und Ethyl β-Hydroxy-n-butylat umgesetzt zu werden, wobei nur eines der optisch aktiven Isomere oxidiert wird (z. B. (S)-Isomer in dem Fall von 2-Butanol, 2-Octanol, Phenylethanol, 1,3-Butanediol und Ethyl β-Hydroxy-n-butylat) und wodurch das andere optisch aktive Isomer (R-Isomer im Falle von 2-Butanol, 2-Octanol, Phenylethanol, 1,3-Butanediol und Ethyl β-Hydroxy-n-butylat) hergestellt wird. Bei dieser Oxidationsreaktion wird das Coenzym NAD+ zu NADH reduziert.
Das so produzierte NADH kann zu NAD+ beispielsweise durch die mikrobielle Fähigkeit, NADH zu NAD+ umzuwandeln, umgewandelt (regeneriert) werden.
NAD+ kann dadurch regeneriert werden, daß das Enzym mit der Aktivität, NADH zu NAD+ zu oxidieren, so wie Glutamatdehydrogenase, Glukosedehydrogenase, NADH-Dehydrogenase und NADH-Oxidase oder Mikroorganismen, die diese Enzyme enthalten oder bearbeitete Produkt daraus zu dem Reaktionssystem hinzugesetzt werden. Wenn man aus der Substratspezifität des Enzyms der vorliegenden Erfindung einen Nutzen zieht, kann eine simultane Regeneration von NAD+ mit dem Enzym alleine durch Hinzufügen von preiswerten Substraten für die Reduktionsreaktion des Enzyms, so wie Aceton oder 2-Butanon zu dem Reaktionssystem, erreicht werden.
Auch kann ein optisch aktiver Alkohol durch die Behandlung der entsprechenden ketonischen Verbindung mit der sekundären Alkoholdehydrogenase der vorliegenden Erfindung oder mit Mikroorganismen, die das Enzym produzieren (einschließlich dessen Mutantenstämmen oder rekombinanten Zellen) oder den bearbeiteten Produkten daraus produziert werden; beispielsweise (S)-2-Butanol aus 2-Butanon, (S)-Octanol aus 2-Octanon, (S)-1-Phenylethanol aus Acetophenon, (S)-1,3-Butanediol aus 4-Hydroxy-2-butanon, (S)-β-Hydroxy-n-butylsäureester aus Acetoessigsäureester. Durch diese Reduktionsreaktion wird das Coenzym NADH oxidiert, um NAD+ zu bilden.
Das so produzierte NAD+ kann zu NADH beispielsweise durch die Aktivität von Mikroorganismen, NAD+ zu NADH umzuwandeln, umgewandelt (regeneriert) werden. Die NAD+-reduzierende Aktivität kann durch das Hinzufügen von Glucose, Ethanol oder Format zu dem Umsetzungssystem verstärkt werden. NAD+ kann ebenso durch das Hinzufügen des Enzyms, das in der Lage ist, NAD+ zu NADH zu reduzieren, so wie Formatdehydrogenase, Malatdehydrogenase und Glucosedehydrogenase oder durch das Hinzufügen von Mikroorganismen, die diese Enzyme enthalten oder der bearbeiteten Produkte daraus zu dem Umsetzungssystem reduziert werden. Wenn man einen Vorteil aus der Substratspezifität des Enzyms zieht, kann die simultane Regeneration von NADH mit dem Enzym alleine dadurch erzielt werden, daß das Substrat der oxidativen Reaktion des Enzyms, so wie Isopropanol oder Ethanol, zu dem Umsetzungssystem hinzugefügt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt das Elektrophorese-Muster der aufgereinigten sekundären Alkoholdehydrogenase auf einem Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel.
2 zeigt die Wirkung von pH-Werten auf die (S)-2-Butanol oxidierende Wirkung der sekundären Alkoholdehydrogenase, ausgedrückt relativ zu der maximalen Aktivität (100%) bei optimalem pH-Wert.
3 zeigt die Wirkung von pH-Werten auf die 2-Butanon-reduzierende Aktivität der sekundären Alkoholdehydrogenase, ausgedrückt relativ zu der maximalen Aktivität (100%) bei optimalem pH.
4 zeigt die Wirkung von pH-Werten auf die verbleibende Aktivität der sekundären Alkoholdehydrogenase nach der Behandlung des Enzyms bei 30°C für 30 Minuten, ausgedrückt relativ zu der initialen Aktivität (100%).
5 zeigt die Wirkung des Erhitzens auf unterschiedliche Temperaturen für 10 Minuten auf die verbleibende Aktivität der sekundären Alkoholdehydrogenase, ausgedrückt relativ zu der initialen Aktivität (100%).
6 zeigt die Basensequenz der DNA, die für die sekundäre Alkoholdehydrogenase kodiert, die abgeleitete Aminosäuresequenz von dieser Basensequenz und die PCR-Bereiche und die reversen PCR-Primer in der Sequenz.
7 zeigt die Basensequenz der DNA, die für die sekundäre Alkoholdehydrogenase kodiert, die Aminosäuresequenz, die von der Basensequenz abgeleitet ist und die PCR-Bereiche und die reversen PCR-Primer bei der Sequenz (Fortführung von 6).
8 zeigt die Basensequenz der DNA, die für die sekundäre Alkoholdehydrogenase kodiert, die Aminosäuresequenz, die von der Basensequenz abgeleitet ist, und die PCR-Bereiche und die reversen PCR-Primer bei dieser Sequenz (Fortführung von 7).
9 zeigt die Basen- und Aminosäuresequenz der gemischten PCR-Primer (CpN und CpT10). Mehrere Basen, die derselben Position in der Figur zugewiesen sind, zeigen an, dass der Primer eine Mischung aus Primern ist, mit mehreren Codons für die entsprechende Aminosäure.
10 zeigt die Konstruktion des Plasmids pCPA6R.
11 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pKK-CPA1.
Bevorzugte Ausführungsformen
In dem folgenden Abschnitt beschreiben bevorzugte Ausführungsformen die vorliegende Erfindung detaillierter. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Beispiele, die hier angegeben werden, beschränkt.
Beispiel 1 (Aufreinigung der sekundären Alkoholdehydrogenase)
Der Candida parapsilosis IFO 1396 Stamm wurde in einem YM-Medium enthaltend Glukose (10 g), Bactopepton (5 g), Hefeextrakt (3 g) und Malzextrakt (3 g) pro Liter bei pH 6,0 wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Die so erhaltenen nassen Zellen wurden in einem Hochdruckzelldisintegrator zerstört und zentrifugiert, um Zellrückstand zu entfernen. Zu dem zellfreien Extrakt wurde Protaminsulfat hinzugefügt, um Nukleinsäuren und Mikrosome zu entfernen. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand zu einer 70%-igen Sättigung mit Ammoniumsulfat gebracht, und das Präzipitat wurde gesammelt, einer Anionenaustauschchromatographie auf Q-Sepharose FF ausgesetzt, mit einem Dichtegradienten von NaCl eluiert, und die Peakfraktion, die die sekundäre Alkoholdehydrogenaseaktivität enthielt, wurde gesammelt. Die aktive Fraktion wurde dann einer hydrophoben Chromatographie auf einer Säule aus Phenylsepharose ausgesetzt, die mit einem Puffer equilibriert wurde, der 1,62 M Ammoniumsulfat enthielt, und die aktive Fraktion wurde durch Reduzieren der Ammoniumsulfatkonzentration auf 0 M eluiert (die Enzymaktivität wurde in einem Assay, wie hiervor beschrieben, überprüft). Nachdem die aktive Fraktion zu einer Red-Sepharose-Affinitätssäule hinzugefügt wurde, wurde die nicht zurückbehaltende Fraktion einer Superdex 200 Gelfiltration ausgesetzt. Die zurückgewonnene aktive Fraktion wurde einer Anionenaustauschchormatographie auf einer Mono-Q-Säule ausgesetzt und mit einem Dichtegradienten aus NaCl eluiert. Nur aktive Fraktionen, die eine einzelne Bande in dem Reinheitstest auf SDS-Page ergaben, wurden gesammelt.
Auf einer Polyacrylamidgelelektorphorese (nativ-Page) ergab die aufgereinigte sekundäre Alkoholdehydrogenase eine Haupt- und mehrere daran angrenzende schwache Nebenprotein-Banden. Nach dem Aktivitätsfärben zeigten alle Proteinbanden die sekundäre Alkoholdehydrogenaseaktivität, und auf SDS-Page migrierte diese Enzympräparation als eine einzelne Proteinbande.
Das anscheinende Molekulargewicht des aufgereinigten Enzyms wurde durch SDS-Page auf etwa 40000 eingeschätzt (1).
Tabelle 1 fasst das Verfahren zusammen, das in einer Aufreinigung des Enzyms mit einer spezifischen Aktivität von 1370 Einheiten pro mg resultierte.
Tabelle 1
Beispiel 2 (pH-Optimum der sekundären Alkoholdehydrogenase)
Die Wirkung des pHs auf die (S)-2-Butanol-oxidierende Aktivität und auf die 2-Butanon-reduzierende Aktivität (überprüft unter den Bedingungen für (S)-2-Butanol-oxidierenden Aktivitätsassay in der Gegenwart von NADH (0,4 μmol anstelle von NAD⁺, folgend der Oxidationsgeschwindigkeit von NADH bei 340 nm) wurde unter unterschiedlichen pH-Werten unter Verwendung von Kaliumphosphat (KPB), Tris-HCl und Briton-Robinson-Puffer überprüft. Die Enzymaktivität wird relativ zu der maximalen Aktivität (100%) in den 2 und 3 gezeigt. Das pH-Optimum für die Oxidation von (S)-2-Butanol war 8,5 bis 9,5, während das pH-Optimum für die Reduktion von 2-Butanon 5,5 bis 6,5 war.
Beispiel 3 (optimale Umsetzungstemperatur für die sekundäre Alkoholdehydrogenase)
Die sekundäre Alkoholdehydrogenaseaktivität wurde unter den Standardassaybedingungen bei unterschiedlichen Temperaturen, wie in Tabelle 2 gezeigt, überprüft. Die optimale Umsetzungstemperatur des Enzyms beträgt 50°C.
Tabelle 2
Beispiel 4 (pH-Stabilität der sekundären Alkoholdehydrogenase)
Nachdem das aufgereinigte Enzym in Tris-HCl (pH 8,0 bis 9,0) und Briton-Robinson-Puffer (pH 5,0 bis 12,0) bei 30°C für 30 Minuten inkubiert wurde, wurde die verbleibende Aktivität überprüft. Das Enzym war am stabilsten bei einem pH-Bereich von 8 bis 10,0 (4).
Beispiel 5 (Thermostabilität der sekundären Alkoholdehydrogenase)
Nachdem das aufgereinigte Enzym bei pH 8,0 und bei 30°C bis 70°C für 10 Minuten inkubiert wurde, wurde die verbleibende Aktivität überprüft. Sogar nach der Inkubation bei 40°C für 10 Minuten wurden mehr als 90% der ursprünglichen Enzymaktivität beibehalten (5).
Beispiel 5 (Substratspezifität der sekundären Alkoholdehydrogenase)
Die oxidierenden und die reduzierenden Aktivitäten des Enzyms mit unterschiedlichen Alkoholen und Aldehyden als Substrat, respektive, sind in den Tabellen 3 und 4, respektive, zusammengefasst, verglichen mit der (S)-2-Butanol-oxidierenden Aktivität (100%) und der 2-Butanon-reduzierenden Aktivität (100%), respektive.
Tabelle 3
Tabelle 4
Beispiel 7 (Inhibitor der sekundären Alkoholdehydrogenase)
Nachdem das Enzym bei 30°C für 30 Minuten in der Gegenwart von verschiedenen Reagenzien inhibiert wurde, wurde die verbleibende Aktivität überprüft und als Prozentsatz relativ zu der des oben behandelten Enzyms (100) ausgedrückt (Tabelle 5).
Tabelle 5
Die enzymatische Aktivität wurde durch Dithiothreitol (DTT), Iodacetamid, p-Chlormercuribenzoesäure, Quecksilberchlorid, Zinkchlorid, Metallchelatoren (bei hoher Konzentration) und 2-Mercaptoethanol bemerkenswert inhibiert.
Beispiel 8 (Analyse der teilweisen Aminosäuresequenz der sekundären Alkoholdehydrogenase)
Das aufgereinigte Enzym (0,152 mg) in 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) enthaltend 4 M Harnstoff wurde mit Lysylendopeptidase (0,53 μg) bei 30°C für 6 Stunden verdaut. Die so erhaltenen Peptidfragmente wurden durch eine Umkehrphasen HPLC (auf einer TSK ODS-120T-Säule, TOSO) fraktioniert und mit einem Acetonitrildichtegradienten in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Die Aminosäuresequenz der fraktionierten Peptide wurde durch einen Proteinsequenzierer 477A (ABI) bestimmt, und ist in den 6, 7 und 8 (unterstrichen) gezeigt.
Beispiel 9 (PCR-Klonieren eines Gens, das für sekundäre Alkoholdehydrogenase kodiert)
Ein DNA-Fragment der Sequenz, die von der Aminosäuresequenz in der Nähe des N-Terminus abgeleitet ist, wurde unter in-Erwägung-Ziehung von dessen Degeneriertheit als ein gemischter PCR-Primer (CpN) synthetisiert. Eine weitere DNA-Sequenz, die komplementär zu dieser war, die von der Aminosäuresequenz in der Nähe des C-Terminus abgeleitet war, wurde als ein weiterer gemischter PCR-Primer synthetisiert (CpT10). Diese Basensequenzen sind in 9 gezeigt. Die DNA-Synthese wurde mit einem ABI-DNA-Synthetisierer 381 A ausgeführt.
Beispiel 10 (Herstellung von chromosomaler DNA aus Candida parapsilosis)
Candida parapsilosis IFO 1396 wurde in einem YEPD-Medium (100 ml) (1% Hefeextrakt, 2% Polypepton und 2% Glukose) wachsen gelassen und zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthaltend 25 mM Sorbitol suspendiert und wurden erneut zentrifugiert. Zu den zurückgewonnenen Zellen, suspendiert in 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,5, 10 ml) enthaltend 1 M Sorbitol, 0,1 M 2-Mercaptoethanol, wurde Chymolyase (0,4 ml) hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 30°C inkubiert, um Protoplasten zu erhalten. Nachdem die Bildung von Protoplasten unter dem Mikroskop bestätigt wurde, wurde die Mischung zentrifugiert. Zu den zurückgewonnenen Zellen, resuspendiert in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4, 12 ml) enthaltend 20 mM EDTA, wurde 10% SDS (Natriumdodecylsulfat, 1,2 ml) hinzugefügt, gründlich gemischt, und bei 65°C 80 Minuten inkubiert. Dann, nach dem Hinzufügen von 5 M Kaliumacetat (pH 5,0, 3,6 ml), wurde die Mischung auf Eis 60 Minuten lang belassen, um das denaturierte Protein zu präzipitieren.
Nach dem Entfernen des denaturierten Proteins durch die Zentrifugation wurde ein gleiches Volumen von Isopropanol zu dem zurückgewonnenen Überstand hinzugefügt, und es wurde vorsichtig gemischt. Die präzipitierte DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, getrocknet, in 10 mM Tris-HCL (pH 7,4) enthaltend 1 mM EDTA gelöst. Zu dieser Mischung wurde RNase (1 mg/ml, 0,75 ml) hinzugefügt, und es wurde bei 37°C für eine Stunde inkubiert, um kontaminierende RNA abzubauen. Dann, nach der anschließenden Extraktion mit Phenol, Phenol/Chloroform, und Phenol wurde die DNA durch Ethanolpräzipitation zurückgewonnen und als Template für die PCR verwendet, die in Beispiel 11 beschrieben ist.
Beispiel 11 (Klonieren des sekundären Alkoholdehydrogenasegens durch PCR)
Unter Verwendung der chromosomalen DNA von Candida parapsilosis (50 ng), hergestellt in Beispiel 10, als Template, wurde PCR zur Amplifikation in einem PCR-Puffer [10 mM Tris-HCl (ph 8,3), 50 mM KCL, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,01% Gelatin, und 2 Einheiten TagDNA-Polymerase (Roche)] mit einem Satz der gemischten PCR-Primer (CpN und CpT10, 100 pmol jeweils), synthetisiert in Beispiel 9, durchgeführt. Nach 30 Zyklen der Hitzedenaturierung (94°C, 30 Sekunden), des Annealens (45°C, 30 Sekunden) und der Extension (40°C, 2 Minuten) wurde die PCR-Mischung auf 4°C abgekühlt, und die Amplifikation der DNA wurde durch Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte bestätigt.
Beispiel 12 (Subklonieren der DNA amplifiziert durch PCR)
Die DNA, amplifiziert durch PCR in Beispiel 11, wurde in pUC18 mit einem SureClone Ligation Kit (Pharmacia) subkloniert. Die Basensequenz des Konstruktes, bestimmt mit einem ABI-DNA-Sequenzierer 373A schien aus 971 Basen zu bestehen, einschließlich der Sequenz der PCR-Primer, CpN und CpT10, welche die DNA-Sequenz zwischen ihnen, wie in den 6, 7 und 8 gezeigt, einschlossen. Diese Sequenz wird hiernach als „Kernsequenz" bezeichnet.
Beispiel 13 (Klonieren von Basensequenzen, die die Kernsequenz umgeben, durch reverse PCR)
Die Basensequenz, die komplementär zu einem Bereich in der Nähe der 5'-Seite der Kernsequenz ist, CAATTGACCCGCTTTGGGC (CPA-MUN) und diejenige zu einem Bereich in der Nähe der 3'-Seite, TTCGAATCTTGGGATGTTTTTG (CPA-NSP) wurden als reverse PCR-Primer synthetisiert. Bereiche dieser Primer in dem DNA-Molekül, das für die sekundäre Alkoholdehydrogenase kodiert, sind in den 6, 7 und 8 gezeigt.
Chromosomale DNA von Candida parapsilosis wurde mit einem Restriktionsenzym HaeII verdaut, und der Verdau wurde durch die T4-DNA-Ligase selbstzirkularisiert, um als Template bei der reversen PCR verwendet zu werden.
Die PCR wurde in dem PCR-Puffer ausgeführt, (beschrieben in Beispiel 11), enthaltend das Autorezirkularisierungsprodukt (50 ng) und einen Satz der synthetischen Primer, CPN-MUN und CPA-NSP (jeweils 20 pmol). Nach 30 Zyklen der Hitzedenaturierung (94°C, 30 Sekunden), dem Annealen (50°C, 30 Sekunden) und der Extensionsumsetzung (70°C, 2 Minuten) wurde das amplifizierte DNA-Fragment in pUC18 mit einem SureClone Ligations Kit (Pharmacia) subkloniert, und dann wurde die gesamte Basensequenz mit einem ABI-DNA-Sequenzierer, wie in Beispiel 12 beschreiben, bestimmt.
Beispiel 14 (Synthese des Gens, das für eine sekundäre Alkoholdehydrogenase kodiert, durch PCR)
Der Restriktionsort wurde durch PCR mit entsprechenden Primern in das DNA-Molekül eingeführt, das für das Enzym kodiert. Unter Verwendung der DNA, hergestellt in Beispiel 10 als das Template, wurde PCR zur Amplifikation eines DNA-Fragmentes von etwa 1030 Basenpaaren mit einem 5'-Primer [CPA-ATG] (5'-TCGCGAATTCAATGTCAATTCCATCAAGCCAG-3') mit einem EcoRI-Restriktionsort und einem 3'-Primer [CPA-TAG] (5'AGATCTTACTATGGATTAAAAACAACTCTA-3') mit einem BglII-Restriktionsort ausgeführt. Die DNA wurde mit einem ABI-DNA-Synthetisierer 381A in Beispiel 11 synthetisiert.
Beispiel 15 (Subklonieren von DNA, die durch PCR amplifiziert wurde)
Das PCR-Fragment, amplifiziert wie in Beispiel 14 beschrieben, wurde in den Dmal-Ort von pUC18 mit Multikonierungsorten mit dem SureClone Ligationskit (Pharmacia) (10) subkloniert. In das konstruierte Plasmid (designiert als pCPA6R) wurde der Laktosepromotor in gegenläufiger Richtung inseriert (eingeschlossen in dem Bereich, bezeichnet als „lac z" in 10.
Beispiel 16 (Konstruktion des Plasmids pKK-CPA1, Gen für die Expression von sekundärer Alkoholdehydrogenase)
Das Gen der sekundären Alkoholdehydrogenase wurde in den Expressionsvektor pKK223-3 (Pharmacia) durch das folgende Verfahren subkloniert, und das Konstrukt wurde als pKK-CPA1 bezeichnet. Das Plasmid pCPA6R wurde mit EcoICRI (Promega) verdaut, verbunden mit dem HindIII-Linker (Takara) und dann mit EcoRI (Takara) und HindIII (Takara) gespalten, um das DNA-Fragment zu extrahieren, das für die sekundäre Alkoholdehydrogenase kodiert. Dann wurde das DNA-Fragment mit dem gespaltenen Produkt des Expressionsvektors, pKK223-3 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII, verbunden, um den Genexpressionsvektor für die sekundäre Alkoholdehydrogenase, pKK-CPAI (11), zu konstruieren.
Beispiel 17 (Herstellung der sekundären Alkoholdehydrogenase)
Kompetente Escherichia coli JM109 wurden hergestellt und mit dem Expressionsvektor pKK-CPAI transformiert, um einen Stamm zu produzieren, der sekundäre Alkoholdehydrogenase produziert. Dieser Stamm wurde in einem LB-Medium (bestehend aus 1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt und 1,0% NaCl, pH 7,2) enthaltend Ampicillion (0,1 mg/ml) bei 30°C für 3 Stunden wachsen gelassen. Nach der Hinzufügung von Isopropylthiogalactosid (IPTG) bis zu einer 1 mM Konzentration, wurde die Kultur für weitere 5 Stunden inkubiert, dann wurde die Kultur zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln.
Beispiel 18 (Aktivitätsbewertung der transformierten Zellen durch enzymatische Umsetzung)
Die Zellen, hergestellt gemäß Beispiel 17, wurden in 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) enthaltend 0,01% 2-Mercaptoethanol suspendiert und sonifiziert, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten. Die Enzymlösung wurde zu einer Umsetzungsmischung hinzugegeben, bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM (S)-1,3-Butandiol und 2,5 mM NAD⁺, und die Geschwindigkeit der NAD⁺-Reduktion wurde bei 340 nm verfolgt. Die Resultate der (S)-1,3-Butandiol-oxidierenden Aktivität, die somit überprüft wurde, sind in Tabelle 6 gezeigt. Als Kontrolle sind die Ergebnisse von ähnlichen Aktivitätstests der Escherichia coli-Wirtszellen gezeigt, welche nicht mit dem Expressionsplasmid pKK-CPA1 transformiert wurden, ebenso in Tabelle 6.
Tabelle 6
Beispiel 19 (Produktion von (R)-1,3-Butandiol durch rekombinante bakterielle Zellen)
Zu den Zellen, hergestellt gemäß Beispiel 17, wurde racemisches 1,3-Butandiol und CaCO₃ bis zu einer finalen Konzentration von 5% und 0,8% hinzugefügt, und die Mischung wurde in Teströhrchen mit 21 mm Durchmesser bei 30°C für 17 Stunden unter Schütteln (250 RPM) inkubiert. Die Zellkonzentration zu Beginn der Umsetzung wurde auf A₆₅₀ = 20 angepasst. Nach der Umsetzung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand (500 μl) wurde mit NaCl gesättigt, und dann wurde das verbleibende 1,3-Butandiol mit Ethylacetat (2 ml) extrahiert. Nach der Entfernung des Lösungsmittels aus dem Extrakt wurde der Rückstand durch die Hinzufügung von Acetylchlorid (100 μl) acetyliert. Acetyliertes 1,3-Butandiol wurde in n-Hexan (1 ml) gelöst, und die optische Reinheit wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie auf einer optisch auflösenden Säule [Chiralcel OB (Daicel Chem. Ind.); Lösungsmittel, n-Hexan/2-Propanol = 19/1; Wellenlänge, 220 nm; Elusionsgeschwindigkeit, 1,0 ml/min; Temperatur, 40°C] (Retentionszeit: (S)-Isomer; 15 Minuten; (R)-Isomer, 19,3 min) überprüft.
Weiterhin, nachdem der oben beschriebene Überstand entsprechend mit destilliertem Wasser verdünnt wurde, wurde die Konzentration von 1,3-Butandiol darin durch Gaschromatographie bestimmt [Säule (3 mm Durchmesser × 2,1 m Länge), Thermon 3000 5%/Chromosorb W 80–100 Mesh (Shinwakako); Temperatur, 130°C]. Die optische Reinheit und die Ausbeute von 1,3-Butandiol wurden in Tabelle 7 zusammengefasst. Als Kontrolle wurden die Resultate von einem ähnlichen Test mit den Escherichia coli-Wirtszellen, welche nicht mit dem Expressionsplasmid pKK- CPA1 transformiert wurden, ebenso in Tabelle 7 aufgeführt. Die Ausbeute in Tabelle 7 ist „das molare Verhältnis des verbleibenden 1,3-Butandiols nach der Umsetzung zu dem initialen racemischen 1,3-Butandiol, das hinzugefügt wurde".
Tabelle 7
Durch die vorliegende Erfindung wurde es möglich, eine neue sekundäre Alkoholdehydrogenase mit stereochemischer Spezifität, die DNA, die für das Enzym kodiert, und Mikroorganismen, die mit DNA transformiert wurden, die für das Enzym kodiert, zu erhalten.
Unter Verwendung des Enzyms, des Mikroorganismus (einschließlich dessen Mutanten und Transformanten), die das Enzym produzieren, oder der verarbeiteten Produkte daraus wurde es möglich, einen optisch aktiven Alkohol aus einem racemischen Alkohol oder einem asymmetrischen Keton zu produzieren.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein Enzym, das in der Lage ist, Aldehyde oder Ketone durch die Oxidation der aliphatischen Alkohole einschließlich derjenigen mit aromatischen Substitutionen mit NAD⁺ als Coenzym zu produzieren und Alkohole durch die Reduktion von Aldehyden und aliphatischen Ketonen einschließlich derjenigen mit aromatischen Substitutionen mit NADH als Coenzym zu produzieren, wobei das Enzym eine höhere Aktivität für die Oxidation von sekundären Alkoholen als für die Oxidation von primären Alkoholen hat und (S)-2-Butanol bevorzugt oxidiert, wobei das Enzym die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 hat oder eine Aminosäuresequenz hat, die dieser ähnelt, welche durch die Substitution, Insertion oder Deletion gewisser Aminosäuren modifiziert wurde.
Ein isoliertes DNA-Segment, das für ein Enzym gemäß Anspruch 1 codiert.
Ein Vektor umfassend eine DNA gemäß Anspruch 2.
Ein Mikroorganismus, der stabil mit einer DNA gemäß Anspruch 2 transformiert ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms gemäß Anspruch 1 umfassend das Kultivieren eines Mikroorganismus wie definiert in Anspruch 4 und das Isolieren des Enzyms aus der Kultur.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Alkohols umfassend das Umsetzen eines Ketons oder eines Aldehyds mit einem Enzym gemäß Anspruch 1 oder mit einem Mikroorganismus, der dieses Enzym produziert oder einem daraus hergestellten Produkt und das Reduzieren des Ketons oder Aldehyds zu einem Alkohol.
Ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Alkohols umfassend das Umsetzen eines asymmetrischen Ketons mit einem Enzym gemäß Anspruch 1 oder mit einem Mikroorganismus, der dieses Enzym produziert oder einem daraus hergestellten Produkt und das Reduzieren des Ketons zu einem optisch aktiven Alkohol.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Ketons oder eines Aldehyds umfassend das Umsetzen eines Alkohols mit einem Enzym gemäß Anspruch 1 oder mit einem Mikroorganismus, der dieses Enzym produziert oder einem daraus hergestellten Produkt und das Oxidieren des Alkohols zu einem Keton oder einem Aldehyd.
Ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Alkohols umfassend das Umsetzen eines racemischen Alkohols mit einem Enzym gemäß Anspruch 1 oder mit einem Mikroorganismus, der dieses Enzym produziert oder einem daraus hergestellten Produkt und das bevorzugte Oxidieren von einem der optisch aktiven Isomere, um den verbleibenden optisch aktiven Alkohol zu isolieren.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, umfassend das Verwenden eines Enzyms, das von einem Mikroorganismus wie definiert in Anspruch 4 abgeleitet ist oder eines Mikroorganismus wie definiert in Anspruch 4, der das Enzym produziert oder eines daraus hergestellten Produktes.