DE69432493T2

DE69432493T2 - Immunostimulierender Träger für Impfstoffe

Info

Publication number: DE69432493T2
Application number: DE69432493T
Authority: DE
Inventors: Ravshan I. Ataullakhanov; Emma K. Daugalievea; Rakhim M. Khaitov; Arkady V. Nekrasov; Rem V. Petrov
Original assignee: Petrovax LLC
Current assignee: Npo Petrovax Pharm Moskau Ru LLC
Priority date: 1993-09-10
Filing date: 1994-09-12
Publication date: 2003-10-30
Anticipated expiration: 2014-09-13
Also published as: KR100296970B1; EP1108738A3; EP1108738B1; ATE236948T1; PT789586E; KR100270980B1; EP0789586A4; HUT74663A; EP0789586A1; SI1108738T1; DE69432493D1; JPH09502444A; DE69427653T2; EP1108738A2; CZ73796A3; PT1108738E; CA2171462C; JP3138476B2; DK1108738T3; ES2160129T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft einen immunstimulierenden Träger für Impfstoffe.

Hintergrund der Erfindung

Helmintheninfektionen sind eine bedeutende Ursache von Morbidität und Todesfällen bei Populationen von sowohl domestizierten Tieren als auch Menschen. Allgemein gesprochen, werden als Helminthen parasitische und nicht-parasitische Spezies bezeichnet, die zu den Stämmen Platyhelminthen (beispielsweise Leberegel, Bandwürmer und andere Plattwürmer) und Nemathelminthen (z. B. Rundwürmer und deren Verwandte) gehören. Im folgenden wird erläutert, wie Helmintheninfektionen verlaufen. Eine Helminthenspezies dringt in den Körper eines Wirts in Form von Eiern oder invasiven Larven ein, beispielsweise als Ergebnis der Aufnahme von Nahrung, welche die Eier oder Larven enthält, durch den Wirtsorganismus. Die Helminthen entwickeln sich dann, bewegen sich langsam durch verschiedene Gewebe, Blut und/oder Lymphflüssigkeit. Schließlich erreichen sie ihr "bevorzugtes" Organ und wachsen und reifen. Schlussendlich wird das von ihnen befallene Organ geschädigt.
Kontrollmaßnahmen beruhen großteils auf Verbesserungen der Hygiene, einer Verringerung der Vektorpopulationen und auf Chemotherapie. Die Kontrollmaßnahmen, die sich auf Hygiene und Verringerung der Vektorpopulation konzentrieren, haben sich als problematisch erwiesen, insbesondere in Entwicklungsländern, wo diese Infektionen überwiegen und wo derartige Kontrollmaßnahmen schwierig durchführbar sind. Die derzeitigen chemotherapeutischen Medikationen haben alle Nachteile wie hohe Toxizität, die Notwendigkeit einer wiederholten Behandlung und immunsuppressive Nebenwirkungen. Ferner führt die Anwendung dieser Präparate oft dazu, dass die Parasiten Resistenz gegen die chemotherapeutische Medikation entwickeln. In der Tat hat praktisch jedes Land Fälle von antihelminthischer Resistenz dokumentiert. Aus diesen Gründen sowie wegen der Kosten einer wiederholten Verabreichung von chemotherapeutischen Verbindungen ist eine Verbindung, welche diese Nachteile nicht aufweist, sehr gesucht.
Da in infizierten Populationen eine große Vielzahl von Helminthenspezies vorhanden ist, wäre es wünschenswert eine Vakzine mit einem breiten Spektrum an prophylaktischer Aktivität herzustellen. Bisher war die Induktion einer starken Schutzimmunität des Wirts nach erfolgter Infektion durch Helminthen ungebräuchlich. Die lange co-evolutionäre Erfahrung dieser Parasiten mit ihren Wirten hat die Wirt-Parasit-Beziehung zu einem Anpassungsgrad getrieben, der chronische oder persistente Zustände zur Folge hat und keine akuten Infektionen, die typischerweise starke spezifische Immunität ergeben. Aus diesem Grund standen im Gegensatz zur Situation bei den meisten mikrobiellen Tierkrankheiten nur wenige Vakzine für die Helminthenbekämpfung zur Verfügung, und die Vorhandenen hatten erhebliche Nachteile.
Von den bekannten Methoden zur Herstellung von Helminthenvakzinen haben inaktivierte und lebende Vakzine den Nachteil, dass sie arbeitsintensiv und nur schwach immunogen sind und Nebenwirkungen wie lokale Entzündungen, allergische Reaktionen und Fieber induzieren. Ferner verursacht oft die in der Vakzine verwendete attenuierte Form eine ähnliche Krankheit wie sie von den virulenten (Wild)-Formendes Parasiten induziert wird. Außerdem verursachen die in diesen Impfstoffpräparaten verwendeten makromolekularen Trägerproteine eine Anzahl von immunpathologischen Nebenwirkungen in dem geimpften Organismus.
Die andere verfügbare Klasse von Vakzinen umfasst gentechnologisch hergestellte Antigene. Jedoch sind auch diese nur schwach immunogen.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die verfügbaren Arten von Vakzinen im allgemeinen ineffektiv sind und eine enge Spezifizität aufweisen, da sie gegen einen einzigen Parasiten gerichtet sind.

Berichtete Entwicklungen

Eine detaillierte Beschreibung von Helminthen, in deren Lebenszyklen eine Gewebewanderung eine wichtige Rolle spielt, sowie eine Erörterung der pathologischen Zustände, welche diese verursachen, ist beispielsweise in E. J. Soulsby, Helminth, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals, 7. Auflage, Lea und Febiger, Philadelphia (1982), und in G. M. Urquhart, "Veterinary Parasitology", Longman Scientific and Technical, Vereinigtes Königreich (1987), zu finden.
Alle Parasiten lösen Immunreaktionen aus, sie sind jedoch aus vielen Gründen in der Lage, der Immunreaktion des Wirts ein bewegliches und manchmal unsichtbares Ziel zu bieten, in einem solchen Maß, dass die normalen Kontrollmechanismen versagen und oft eine immunologische Schädigung anstatt Immunität eintritt. Dies veranlasst wiederum häufig den Wirt dazu, seine unwirksame und oft kontraproduktive Immunreaktion abzuschalten, was dadurch zu starken pathologischen Veränderungen und Immunsuppression führt.
Die strukturelle und antigene Vielfalt der parasitischen Helminthen spiegelt sich in der Heterogenität der spezifischen Immunreaktionen, welche sie auslösen, wieder. Parasitische Helminthen entgehen oft dem Immunsystem durch Maskierung und Abstoßung ihrer Oberflächenantigene und durch Variation ihrer Antigene während ihres Aufenthalts in Wirbeltierwirten. Diese Fähigkeit zur Maskierung, Abstoßung und Variation von Oberflächenantigenen ist ein Hauptgrund für die Schwierigkeiten, auf die man bisher bei der Herstellung wirksamer Vakzine gegen Helmintheninfektion stieß.
Ein Überblick moderner Vakzine, die bei der Behandlung parasitischer Erkrankungen eingesetzt werden, wird in J. H. L. Playfair et al., The Lancet 335 (1990): 1263-1266, gegeben, während eine allgemeinere Erörterung der Art der immunologischen Reaktion von Wirten auf parasitische Helminthen in dem Artikel von S. Lloyd und E. J. L. Soulsby in "Parasitology in Focus: Facts and Trends", Hrsg. H. Mehlhorn, Springer-Verlag (1988), S. 619-650, zu finden ist. Wie in dem Überblicksartikel von Playfair et al. angegeben und wie hier oben erwähnt, besteht aufgrund der Tatsache, dass existierende Maßnahmen zur Helminthenbekämpfung in großem Maßstab teuer und schwierig durchzuführen sind, ein starker Bedarf für Vakzine, welche zur Verringerung der Intensität und Verbreitung einer Helmintheninfektion in Wirtspopulationen in der Lage sind.
Vor der vorliegenden Erfindung würde es aufgrund der oben genannten Schwierigkeiten, auf die man bei der Herstellung wirksamer Antihelminthen-Vakzine sogar gegen spezielle Spezies stieß, als unwahrscheinlich betrachtet, dass ein Antigen allein einen adäquaten Schutz gegen ein breites Spektrum von Helmintheninfektionen bieten könnte. Hinsichtlich eines Gesamtüberblicks der medizinischen und wissenschaftlichen Herausforderungen, die Helminthen darstellen, siehe A. A. F. Mahmoud, Science 246 (1989): 1015-1021. (Siehe auch ferner die Einträge "Parasites, Escape from Immunity", von D. J. Mclaren und "Parasites, Immunity to" von F. E. G. Cox, in der Encyclopedia of Immunology, Hrsg. I. A. Roitt und P. J. Delves, Academic Press, 1992).

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine Verbindung, die zum Schutz eines Wirbeltiers gegen Infektion durch Helminthen geeignet ist, Hyaluronidase in kovalenter Kopplung mit einem immunstimulierenden Träger. In bevorzugter Form wird die Verbindung der vorliegenden Erfindung dem Wirbeltier in Form einer Vakzine verabreicht und der immunstimulierende Träger, an den die Hyaluronidase kovalent gekoppelt ist, umfasst ein Copolymer von Ethylenpiperazin-N-oxid und N-Ethylacetylethylenpiperaziniumbromid (hier im folgenden als "Synpol" bezeichnet).
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf dem Befund, dass das Enzym Hyaluronidase von Larven von Helminthenspezies produziert wird, um die Gewebebarrieren im Körper eines Wirtsorganismus, den sie infiziert haben, zu durchdringen. In der Praxis ist die vorliegende Erfindung in der Lage, eine Immunreaktion gegen Hyaluronidase, wie von den Helminthen produziert, auszulösen, wodurch die Fähigkeit der Helminthen zur Durchdringung von Gewebebarrieren und dadurch zur Infektion eines Lebewesens drastisch reduziert, wenn nicht sogar eliminiert wird.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Schutz eines Wirbeltiers gegen Infektion durch Helminthen, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, umfassend Hyaluronidase, kovalent gekoppelt an einen immunstimulierenden Träger, vorzugsweise Synpol, an ein Wirbeltier umfasst. In bevorzugter Form wird die Verbindung dem Wirbeltier in Form eines Vakzins verabreicht, welches, in Mischung mit der Verbindung, Synpol umfasst. Beispiele von Wirbeltieren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen den Menschen, Rinder, Schafe, Schweine, Hunde, Pferde, Katzen, Ziegen, Büffel, Camelidae und Geflügel ein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches die Umsetzung von Hyaluronidase und eines immunstimulierenden Trägers unter zeitlichen Bedingungen und Temperaturbedingungen, um Hyaluronidase und den immunogenen Träger kovalent zu koppeln, umfasst.
Es wird davon ausgegangen, dass die vorliegende Erfindung eine Vielfalt von Vorteilen gegenüber Verfahren des Standes der Technik zum Schutz von Wirbeltieren gegen Helmintheninfektionen bietet. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung bietet Schutz gegen Infektion durch diejenigen Helminthenspezies, welche Hyaluronidase einsetzen, um deren Wanderung innerhalb des Körpers eines Wirtsorganismus zu erleichtern, Dementsprechend ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung gegen ein breites Spektrum von Helminthenspezies wirksam. Dies ist ein signifikanter Vorteil gegenüber Vakzinen im Stand der Technik, welche oft darauf beschränkt sind, einen Wirt vor nur einer speziellen Helminthenspezies zu schützen.
Ein weiterer Vorteil, den die Vakzine der vorliegenden Erfindung bieten, besteht darin, dass sie stark immunogen sind. Antihelminthen-Vakzine des Standes der Technik sind oft nur schwach immunogen und induzieren unerwünschte Nebenwirkungen, wie z. B. lokale Entzündung, allergische Reaktion und Fieber. Darüber hinaus werden bei Vakzinen des Standes der Technik oft makromolekulare Trägerproteine verwendet, welche eine Reihe von immunpathologischen Nebenwirkungen bei dem geimpften Organismus verursachen.
Diese und die verschiedenen anderen Nachteile der Antihelminthen-Vakzine des Standes der Technik wurden durch die Bereitstellung der Verbindung der vorliegenden Erfindung insofern behoben, als sie in der Lage ist, eine starke immunogene Reaktion ohne die Nebenwirkungen, die oft bei Antihelminthen-Vakzinpräparationen des Standes der Technik beobachtet werden, auszulösen. Darüber hinaus scheinen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Entwicklung oder Fruchtbarkeit nicht zu beeinflussen.
Das Vermögen der Vakzine der vorliegenden Erfindung, eine starke immunogene Reaktion auszulösen und ein breites Spektrum von Schutz gegen eine Vielfalt von Helminthenspezies bereitzustellen, bietet Vorteile, die bisher auf dem Gebiet der Antihelminthen-Vakzine nicht beobachtet wurden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 erläutert die allgemeine Formel für Synpol.
Fig. 2 stellt die Strukturformel von wie in Beispiel 1 beschrieben hergestelltem Synpol dar.
Fig. 3 stellt die Strukturformel von wie in Beispiel 2 beschrieben hergestelltem Synpol dar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Materials, welches das Reaktionsprodukt von Hyaluronidase und eines immunstimulierenden Trägers umfasst.
Hyaluronidase, wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Familie von Enzymen, welche natürlich vorkommende Polysaccharide, insbesondere Hyaluronsäure und Glycosaminoglykane, wie z. B. Chondroitinsulfate (4-, 6-, D und E), hydrolysieren. Diese polymeren Substanzen sind essentielle Komponenten der halbfesten gelähnlichen Struktur der extrazellulären Matrix. Hyaluronidase spaltet diese polymeren Substanzen und ist deshalb zur Zerstörung von extrazellulären Matrices in der Lage. Eine große Vielfalt von Helminthenspezies produzieren und verwenden Hyaluronidase, um die vorgenannten Komponenten der extrazellulären Matrices des Wirtsorganismus zu hydrolysieren und dadurch den Helminthen zu erlauben, Gewebebarrieren zu durchdringen und innerhalb des Körpers eines Wirtsorganismus zu wandern, bis sie ein bevorzugtes Organ erreichen, wo sie wachsen und reifen.
Die Hyaluronidase-Familie schließt verwandte Enzyme ein, welche Substrate des vorgenannten Typs hydrolysieren. Diese können nach ihrer Spezifität für verschiedene Verknüpfungen innerhalb der Struktur von Hyaluronsäure-Polymermolekülen gruppiert werden. Insbesondere können die Hyaluronidasen in drei Hauptgruppen eingeteilt werden: Hyaluronoglucosaminidasen, Hyaluronoglucuronidasen und Glucuronatlyasen (B. Fiszer-Szafarz, Analytical Biochemistry, Bd. 143, S. 76 (1984)).
Native Hyaluronidase allein zeigt eine extrem schwache Immunogenizität und induziert selbst nach wiederholten Injektionen keine sichtbare Anti-Hyaluronidase- Antikörperproduktion.
Hyaluronidase wurde aus einer Vielfalt von Quellen, einschließlich Schlangen- und Bienengiften, Speichel von Blutegel, den acrosomalen Granula von Spermatozoen, den lysosomalen Granula verschiedener Zellen, und aus bakteriellen Toxinen isoliert. Beispielhafte Quellen von Hyaluronidase, welche bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, schließen Testikel von Rindern und Schafen, Helminthen, Blutegel, Bienen- und Schlangengifte und Bakterien ein.
Bakterielle Quellen von Hyaluronidase schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, die folgenden: Streptococcus millery (P. F. Unsworth, J. Clin. Pathology (London) 1989, 42(5), 506-510); Streptococcus pyogenes (W. L. Hynes und J. J. Ferretti, Infection and Immunity, 1989, 57(2), 533-539); Streptococcus equisimilis (R. Sting et al., Med. Sci. Res., 1989, Bd. 17, Nr. 17, S. 723-725); Clostridium difficicle (S. V. Seddon et al., J. Med. Microbiol., 1990, Bd. 31, Nr. 3, S. 169-174); Stroptococcus uberis (P. Schaufuss et al., Zentralbl. Bakferiol. FRG, 1989, Bd. 271, Nr. 1, S. 46-53); und Streptococcus dysgalactiae (A. Hamai et al., Agric. Biol. Chem., 1989, Bd. 53, Nr. 8, S. 2163-2168). Darüber hinaus wurde Hefen der Gattung Candida ebenfalls befunden, Hyaluronidase zu enthalten. M. T. Shimizu, Rev. Microbiol., 1988, Bd. 19, Nr. 4, S. 442-445).
In einer gegebenen Spezies kann Hyaluronidase im allgemeinen sowohl in monomeren als auch oligomeren Formen gefunden werden, wobei beispielsweise oft Dimere und Tetramere derselben Untereinheit vorliegen. Die Aminosäuresequenz für die vom Streptococcus pyogenes-Bakteriophagen produzierte Hyaluronidase wurde bestimmt (W. L. Hynes et al., Infection and Immunity 57 (1989): 533-539) und Bienengift-Hyaluronidase wurde kürzlich sequenziert (M. Gmachl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3569-3573 (1993)). Es wird angenommen, dass die Sequenzierung und Klonierung der für Hyaluronidase kodierenden Gene die Grundlage für die Produktion von Hyaluronidase auf Basis rekombinanter DNA zur Verwendung beim Einsatz der vorliegenden Erfindung bilden wird.
Eine Vielfalt von im Handel erhältlichen Präparationen von Hyaluronidase können eingesetzt werden, um die Verbindung der vorliegenden Erfindung herzustellen, einschließlich beispielsweise einer Rinder-Präparation von Hyaluronidase, die von REANAL CO. (Katalog Nr. 0705) vertrieben wird. Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) der aus dieser Quelle erhaltenen Hyaluronidase zeigt die Anwesenheit einer Hauptproteinbande mit einem ungefähren Molekulargewicht von 63 Kilodalton (kD) an. Es kann auch ein aus Schaftestikeln erhaltenes Material, vertrieben von Sigma Chemical Co. (Katalog Nr. H2126), eingesetzt werden. Polyacrylamidgelelektrophorese der aus dieser Quelle erhaltenen Hyaluronidase offenbart eine Hauptproteinbande mit einem ungefähren Molekulargewicht von etwa 39 kD. Hyaluronidase kann auch von Serva (Katalog Nr. 25119 und Katalog Nr. 25121) erhalten werden.
Obwohl sich die aus verschiedenen kommerziellen Quellen erhaltenen Hyaluronidase-Präparationen bezüglich der vorliegenden dominierenden Proteinspezies unterscheiden, wie mittels PAGE nachgewiesen, wurde festgestellt, dass die verschiedenen kommerziellen Präparationen von Hyaluronidase alle enzymatisch aktiv sind und auch miteinander immunologisch kreuzreagieren können. Darüber hinaus enthalten praktisch alle untersuchten Präparationen mindestens Spuren einer Proteinspezies mit einem Molekulargewicht von etwa 60-69 kD und die Möglichkeit lässt sich nicht ausschließen, dass die kürzeren Polypeptidketten, welche unter den bei dem PAGE-Verfahren angewandten reduzierenden Bedingungen vorliegen, unter physiologischen Bedingungen zu Oligomeren von etwa 60-90 kD vereinigt werden.
Es wird angenommen, dass Verbindungen der vorliegenden Erfindung, bei denen sowohl aus Widder- als auch aus Stiertestikeln isolierte Hyaluronidase verwendet wird, eine Kombination von besonders wünschenswerter Immunogenizität, Kosteneffizienz und Bequemlichkeit bieten können. Reinigungsverfahren für solche Hyaluronidasen sind ziemlich gut entwickelt und schließen die üblicherweise eingesetzten Schritte von Extraktion, Präzipitation, Zentrifugation, Ultrafiltration, Ionenaustausch und Gelchromatographie ein. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, bei denen aus Schaf- oder Rindertestikeln isolierte Hyaluronidase verwendet wird, lösen eine Immunreaktion gegen Helminthen- Hyaluronidase aus. Die Verwendung von Hyaluronidase, die aus Schaf- oder Rindertestikeln isoliert wurde, ist auch erheblich kosteneffizienter als die Isolierung von Hyaluronidase aus Helminthenlarven. Hyaluronidase aus Testikeln wurde befunden, Hyaluronsäure zu spalten, und ist auch in der Lage, Chondroitinsulfate zu erkennen (Bartolucci et al., Int. J. Tissue React., 13(6) (1991), S. 311).
Dementsprechend werden besonders bevorzugte Ausführungsformen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt unter Verwendung von Hyaluronidase, die aus den Testikeln von Widdern oder Stieren erhalten wurde. Diesbezüglich wurde festgestellt, dass eine von Sigma Chemical Co. vertriebene Hyaluronidase, die von Schafen oder Rindern stammt, zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
Es wurde festgestellt, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, bei denen Hyaluronidase verwendet wird, die aus einer anderen Quelle als dem Lebewesen stammt, welches die Behandlung der vorliegenden Erfindung erhält, oft stärker immunogen sind als Verbindungen, bei denen Hyaluronidase verwendet wird, die aus der behandelten Spezies isoliert wurde. Beispielsweise neigt aus Schafen isolierte Hyaluronidase dazu, eine stärkere Immunreaktion bei Rindern auszulösen als aus Rindern isolierte Hyaluronidase. Hinsichtlich Kosteneffizienz und Bequemlichkeit bei der Behandlung von Schafen und Rindern sollte in Betracht gezogen werden, eine Verbindung zu verwenden, welche aus einer Mischung von sowohl Widder- als auch Stier-Hyaluronidasen hergestellt ist.
Verbindungen im Rahmen des Umfangs der vorliegenden Erfindung umfassen das Reaktionsprodukt von Hyaluronidase, wie oben beschrieben, und eines immunstimulierenden Trägers. "Immunstimulierender Träger", wie der Begriff hier verwendet: wird, bezieht sich auf eine Verbindung, welche in Kombination mit einem gegebenen Antigen einen hochimmunogenen Komplex (Antigen-Immunstimulans) ergibt, der sogar schwach reagierende Individuen wirksam gegen ein gegebenes Antigen immunisieren kann. Beispiele von immunstimulierenden Trägern, welche bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden in der folgenden Publikation beschrieben, die eine Erörterung der Verwendung synthetischer Polyionen als Immunstimulantien einschließt: Khaitov, R., Annals New York Academy of Sciences, 685, 788-802, 23. Juni 1993. In diesem Artikel wird auf Polyoxidonium verwiesen, welches zu Synpol, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, äquivalent ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der immunstimulierende Träger, welcher mit Hyaluronidase umgesetzt wird, Synpol. Der Begriff "Synpol", wie hier verwendet, bezieht sich auf Copolymere von Ethylenpiperazin-N-oxid und N-Ethylacetylethylenpiperaziniumbromid, entsprechend den in Fig. 1 unten dargestellten Formeln, wobei n = 200-2000; q = (0,2-0,35)n; z = (0,4-0,65)n; m = 0-0,4)n.
Synpol ist im Gegensatz zu den meisten anderen Trägern und Adjuvantien nicht-immunogen. Es wird angenommen, dass Synpol keine erkennbaren antigenen Determinanten aufweist und dementsprechend keine Immunreaktion auslöst, wodurch unerwünschte Nebenwirkungen vermieden werden, die bei den meisten anderen Adjuvantien und Trägern, die in Vakzin-Präparationen eingesetzt werden, beobachtet werden.
Zur bequemen Unterscheidung der verschiedenen Synpolspezies voneinander wird der Begriff "Synpol" in Kombination und sequentiell mit Werten für jeden der vorgenannten Buchstaben "n", "q'", "z" und "m" verwendet. Beispielsweise wird Ethylenpiperazin-N-oxid und N-Acetylethylenpiperaziniumbromid mit n = 1000, q = 0,35, z = 0,60, m = 0,05 als "Synpol 1000-35/60" bezeichnet.
Ein Beispiel eines speziellen Synpolspezies-Copolymers, das erfolgreich als immunstimulierender Träger in den Vakzin-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, wird hier als "Synpol 1000-20/50" bezeichnet werden. Synpol mit einem Molekulargewicht von mindestens etwa 15 kD oder größer ist bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wobei Synpol mit einem Molekulargewicht von größer als mindestens etwa 30 kD besonders bevorzugt ist.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann nach einem beliebigen geeigneten Verfahren hergestellt werden, welches die chemische Verknüpfung von Hyaluronidase mit dem immunstimulierenden Träger bewirkt, beispielsweise durch kovalente Kopplung von Hyaluronidase an den immunstimulierenden Träger. Solche kovalenten Bindungen können direkt zwischen reaktiven Gruppen auf der Hyaluronidase und auf dem immunstimulierenden Träger gebildet werden oder sie können über eine oder mehrere Verknüpfungsgruppe(n) gebildet werden. Wie in den hier im folgenden ausgeführten Beispielen zu sehen sein wird, beinhaltet ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Reaktionsprodukts von Hyaluronidase und dem bevorzugten immunstimulierenden Träger der vorliegenden Erfindung, d. h. Synpol, die Anwendung des Azid-Verfahrens. Dieses Verfahren beinhaltet die Überführung der Säure- oder Esterform von Synpol mit Hilfe von Hydrazin in das Hydrazid und dessen anschließende Kombination mit Hyaluronidase unter Bedingungen, welche ein Reaktionsprodukt ergeben, in dem Hyaluronidase kovalent an Synpol gekoppelt ist. Alternativ und wie ebenfalls in den folgenden Beispielen erläutert, beinhaltet ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Reaktionsprodukts von Hyaluronidase und Synpol die Bildung eines Succinimidethers von Synpol. Der Succinimidether wird dann mit Hyaluronidase unter Bedingungen kombiniert, welche eine Verbindung zur Verwendung bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung ergeben.
Es wird angenommen, dass die Verbindung der vorliegenden Erfindung am häufigsten zum Schutz von Wirbeltieren gegen eine Infektion durch Helminthen eingesetzt werden wird. Für diesen Zweck ist es bevorzugt, dass das Produkt der Reaktion einer Hyaluronidase und eines immunstimulierenden Trägers in Form einer Vakzine verwendet wird. "Vakzin", wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Zusammensetzung, welche die Verbindung der vorliegenden Erfindung enthält und welche in einer Form vorliegt, die einem Wirbeltier verabreicht werden kann. Typischerweise umfasst die Vakzine eine herkömmliche Salzlösung oder ein gepuffertes wässriges Lösungsmedium, worin die Verbindung der vorliegenden Erfindung suspendiert oder gelöst ist. In dieser Form kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung bequem eingesetzt werden, um eine Helmintheninfektion zu verhüten, zu lindern oder anderweitig zu behandeln.
In bevorzugter Form umfasst das Vakzin der vorliegenden Erfindung zusätzlich ein Adjuvans, welches entweder in einem kleineren oder einem größeren Anteil, bezogen auf die Verbindung der vorliegenden Erfindung, vorliegen kann. Der Begriff "Adjuvans", wie hier verwendet, bezieht sich auf nicht-spezifische Stimulantien der Immunreaktion, welche in Kombination mit dem Vakzin der vorliegenden Erfindung eine erhöhte Immunreaktion ergeben. Eine Vielfalt von Adjuvantien kann eingesetzt werden. Beispiele schließen vollständiges und unvollständiges Freunds-Adjuvans, Aluminiumhydroxid und modifiziertes Muramyldipeptid ein. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird Synpol als Adjuvans in Mischung mit der Verbindung der vorliegenden Erfindung eingesetzt.
Wie hier oben erwähnt, sollen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um Wirbeltierspezies gegen Helmintheninfektionen zu schützen.
Beispiele von Wirbeltieren, welche gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, schließen den Menschen und verschiedene domestizierte Tiere, einschließlich beispielsweise Rinder, Schafe, Schweine, Hunde, Pferde, Katzen und Ziegen sowie anderer Equidae, Büffel, Camelidae und Geflügel, ein. Insbesondere steht zu erwarten, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Verhinderung und Behandlung von parasitischen Helmintheninfektionen bei Lebewesen, die Helminthenspezies ausgesetzt sind, welche Hyaluronidase verwenden, wirksam sein werden.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann parenteral durch intramuskuläre, subkutane oder intradermale Verabreichung verabreicht werden. Die bevorzugte Verabreichungsroute für einen gegebenen Organismus kann durch Konsultation des Abschnitts Beispiele der Anmeldung festgestellt werden. Bevorzugte Dosisbereiche können je nach dem gegebenen Tier, welches behandelt wird, und der vorherrschendsten Helminthenspezies in einer gegebenen Umgebung variieren, im allgemeinen wurde jedoch eine Vakzindosis von etwa 0,05 mg Protein/kg Gewicht des Lebewesens als wirksam befunden. Weitere Anleitung hinsichtlich effektiver Dosisbereiche lässt sich durch Konsultation des folgenden Abschnitts Beispiele finden.
Es wurde festgestellt, dass die milden Bedingungen, welche vorzugsweise zur kovalenten Kopplung von Hyaluronidase an Synpol eingesetzt werden können, die antigenen Epitope von Hyaluronidase nicht in signifikanter Weise beeinflussen; dementsprechend wird eine hochimmunogene Verbindung erhalten. Enzymgekoppelte Festphasen-Immunoassays (ELISA) haben gezeigt, dass Anti- Hyaluronidase-Antikörper die Epitope von Hyaluronidase, welche an Synpol konjugiert wurden, erkennen können, und demonstrieren, dass diese Epitope erhalten bleiben.
Es wurde auch festgestellt, dass die enzymatische Stelle der Hyaluronidase nach der kovalenten Kopplung von Hyaluronidase an Synpol erhalten bleibt. Insbesondere wurde beobachtet, dass die Substratabbaurate von Hyaluronidase allein im wesentlichen identisch ist mit der Substratabbaurate von Hyaluronidase, welche kovalent an Synpol gekoppelt wurde. Darüber hinaus ist Hyaluronidase an Synpol gekoppelt signifikant stabiler als das native Enzym. Dies wurde mit Hilfe von Hyaluronidaseenzym-Inaktivierungstests, einschließlich Thermostabilitätsversuche und Beständigkeit gegen Heparin-vermittelte Inhibierung, demonstriert.
Die erhöhte Stabilität von Hyaluronidase, welche sich durch deren Konjugation an Synpol ergibt, bietet ein breites Spektrum anderer Einsatzmöglichkeiten für die Verbindung der vorliegenden Erfindung. Über ihr Vermögen zur Inhibierung von Helmintheninfektionen hinaus steht zu erwarten, dass die Verbindung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, um eine Immunreaktion gegen andere Pathogene oder Organismen auszulösen, beispielsweise diejenigen Pathogene oder Organismen, welche Hyaluronidase verwenden, um Gewebe zu verdauen, wie z. B. bestimmte Bakterien und deren Toxine. Ferner kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um die Wirkung von Hyaluronidase enthaltenden Giften (z. B. Bienen- und Schlangengiften) zu blockieren oder deren Ausbreitung zu begrenzen.
Die vorliegende Erfindung umfasst in ihrem Umfang auch Verfahren zur Verwendung von kovalent an Synpol gekoppelter Hyaluronidase, um Fibrose bei Wirbeltieren durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die Hyaluronidase kovalent an Synpol gebunden umfasst, zu behandeln.
Darüber hinaus kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Kosmetik als aktiver Bestandteil in Cremes und anderen Produkten eingesetzt werden, die verwendet werden, um die Haut glatter und weicher zu machen. Diesbezüglich sollte angemerkt werden, dass Materialien, die menschliches Sperma enthalten, als Hautpflegeprodukte in Russland eingesetzt wurden. Die Verwendung eines solchen Produkts ist jedoch aufgrund der Instabilität der Hyaluronidase stark beschränkt. Nachdem die Verbindung der vorliegenden Erfindung stabil, löslich und nicht-toxisch ist, hat sie unmittelbare Anwendungen auf diesem Gebiet und in der Tat wurden Untersuchungen bezüglich ihrer Einsatzmöglichkeiten in dieser Hinsicht durchgeführt. Die vorliegenden Erfindung umfasst in ihrem Umfang auch die Verwendung von Hyaluronidase, die kovalent an Synpol gebunden ist, als Ausbreitungsfaktor zur Erhöhung der Wirksamkeit von Medikationen. Sie kann auch eingesetzt werden, um bei der medizinischen Verwendung die Diffusion zu verbessern und die Absorption zu beschleunigen, beispielsweise als Bestandteil in einer antibiotischen Lösung zur Behandlung von Rinder-Mastitis bei der veterinärmedizinischen Verwendung. In der Vergangenheit wurde unstabilisierte Hyaluronidase in diesen Kontexten verwendet (vgl. zum Beispiel The Merck Index, 8. Auflage) und dementsprechend steht zu erwarten, dass die stabilisierte Form von Hyaluronidase, welche durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, signifikante Vorteile gegenüber Zusammensetzungen bieten wird, welche die native Form von Hyaluronidase verwenden.
Die vorliegende Erfindung umfasst in ihrem Umfang auch die Verwendung von kovalent an Synpol gebundener Hyaluronidase in den folgenden therapeutischen Kontexten, wo freie (unstabilisierte) Hyaluronidase befunden wurde, vorteilhafte Wirkungen aufzuweisen: Myocard-Infarkte (vg. E. J. Flint et al., The Lancet, 17. April (1982), S. 871-874, und auch D. Maclean et al., Science, Bd. 194, S. 199-200 (1976)); Verbesserung der Retina-Funktion (vg. B. S. Winkler et al., Arch. Ophthalmol. 103 (1985), S. 1743-1746); in Kombination mit Zytostatika bei der Behandlung von Krebstumoren (G. Baumgartner et al., J. Exp. Clin. Cancer. Res. 4 (1985), S. 3, und W. Scheithauer et al., Anticancer Res., Bd. 8, S. 391-395 (1988)); bei der Behandlung von tuberkulöser spinaler Arachnoiditis (vg. M. Gourie-Devi et al., J Neurol. Sci., Bd. 102, S. 105-111 (1991)); zur Behandlung von verkapselten Gehirnabszessen bei Hochrisiko-Patienten (vgl. A. Pasaoglu, Acta Neurochir., Bd. 100, S. 79-83 (1989)). Darüber hinaus wurde Hyaluronidase beispielsweise in vitro zur Depolymerisation von Hyaluronsäure in einem zellfreien System eingesetzt oder zur Stimulation von Hyaluronsäuresynthetase in z. B. Zellkulturverfahren (L. H. Philipson et al., Biochemistry 24 (1985), S. 7899-7906): Der Umfang der vorliegenden Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung der Verbindung, welche Hyaluronidase kovalent an Synpol gebunden umfasst, in diesen Zusammenhängen.
Außerdem umfasst die Erfindung innerhalb ihres Bereichs Synpol Antigen- Konjugat-Vakzine, bei denen das Antigen Proteine umfasst, welche Hyaluronidase ähnlich sind, beispielsweise Vakzine, die als Antigen andere Enzyme umfassen, welche von Pathogenen verwendet werden, um Gewebe zu verdauen/zersetzen (einschließlich Kollagenasen und Proteinasen verschiedener Spezifizitäten).
Die Erfindung umfasst innerhalb ihres Bereichs auch die Verwendung von Synpol, das mit einem Allergen gekoppelt ist, um allergische Reaktionen innerhalb eines Wirts gegen ein bestimmtes Allergen zu beseitigen. Intensive Untersuchungen haben gezeigt, dass die Verabreichung eines derartigen Antigen-Synpol-Konjugats bevorzugt die Produktion von nicht-allergenen Antikörper-Isotypen gegen das betreffende Allergen induziert Diese normalen nicht-pathogenen Isotypen konkurrieren mit den vorher bereits existierenden allergenen (z. B. IgE- Immunglobulinen) und beseitigen spezifisch die Allergie. Diese Methode der spezifischen Desensibilisierung konnte klar aufgezeigt werden und ist derzeit im ersten Stadium von klinischen Versuchen.
Die Erfindung umfasst innerhalb ihres Bereichs auch die Verwendung von Synpol, gekoppelt an die folgenden Antigene, um die Immunogenität der gekoppelten Antigene zu erhöhen, wodurch die Induktion einer effektiven prophylaktischen Immunantwort gefördert wird: β-Einheit von Cholera-Toxin, Hämagglutinin aus der Hülle von Typ A und B-Influenzaviren, p.90-Toxin von B. anthacis, Vi-Antigen aus Salmonella, Porinprotein aus der Zellwand von E. coli und Salmonellen, synthetische Fragment des gp160 env-Proteins von HIV-1, F(ab)2-Fragmente von Immunglobulinen (um eine Anti-Idiotyp-Antwort zu induzieren).

BEISPIELE

Die ersten beiden Beispiele erläutern die Herstellung von zwei Synpolspezies, wie in den Beispielen identifiziert.

BEISPIEL 1 - Herstellung von Synpol 1000-20/50

Ein dreistufiges Verfahren Wurde eingesetzt, um ein Copolymer von Ethylenpiperazin-N-oxid und N-Acetylethylenpiperaziniumbromid zu synthetisieren.
(1) Das Anfangspolymer, 1,4-Ethylenpiperazin, wurde im ersten Schritt synthetisiert. Für diesen Zweck wurde die Radikalkettenpolymerisation von 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan nach dem folgenden Protokoll durchgeführt.
10 g des vorher sublimierten Monomers und 0,05 g Ammoniumbromid wurden in einer 10-ml-Glasampulle versiegelt. Ein Vakuum eines Restdrucks von 5 · 10&supmin;³ mm Hg wurde in der Ampulle mit Hilfe einer Vakuumpumpe erzeugt. Die Ampulle wurde 25 h lang 200ºC in einem Thermostat ausgesetzt. Die Polymerausbeute betrug etwa 100%, MG 120.000 (bestimmt durch LALLS - Kleinwinkellaserlichtstreuung).
(2) Der zweite Schritt wurde durchgeführt, um das N-Oxid von Poly-1,4- ethylenpiperazin herzustellen.
5 g Poly-1,4-ethylenpiperazin (MG 120.000, n = 1000) wurden in 250 ml 1%iger Essigsäurelösung gelöst. Dann wurden 4 ml 30%iges H&sub2;O&sub2; zugegeben und die Oxidation dauerte 36 h. Nach Ultrafiltration und Lyophilisierung wurde das N-Oxid von Poly-1,4-ethylenpiperazin (MG 110.000, z = 0,5 n) erhalten.
(3) Die Alkylierung des obigen Poly-N-oxids wurde während des dritten Schritts durchgeführt.
Poly-1,4-ethylenpiperazin-N-oxid, während des zweiten Schritts hergestellt, wurde in 125 ml Methanol gelöst und 16,5 g Bromessigsäure wurden zugegeben. Die Alkylierungsreaktion wurde 10 h lang bei 25ºC durchgeführt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Niederschlag in Wasser gelöst, 24 h lang gegen Wasser dialysiert und mittels Lyophilisierung getrocknet. Schließlich wurde das Copolymer von Ethylenpiperazin-N-oxid und N-Acetylethylenpiperaziniumbromid der folgenden Formel erhalten (siehe Fig. 2).
Die Ausbeute betrug 95%. Das Oxidationsverhältnis wurde nach dem chromometrischen (oder titanometrischen) Titrationsverfahren und durch das Verhältnis der integrierten Intensitäten von Banden des PMR-Spektrums im Bereich 2,5-4,5 m.d. bestimmt. Das chromometrische oder titanometrische Titrationsverfahren bezieht sich auf das Verfahren zur quantitativen Bestimmung von N-Oxidgruppen, reduziert durch Salze von zweiwertigem Chrom oder dreiwertigem Titan (Brooks, R. T. und P. D. Sternglanz, Anal. Chem., 1959, Bd. 31, N4, S. 561- 565). Das Oxidationsverhältnis betrug z = 0,5 n. Das Alkylierungsverhältnis würde durch IR-Spektren (1735 cm-Bande) und PMR-Spektren (Bereich von 2,5-4,5 m.d.) bestimmt und ergab q = 0,2 n.

BEISPIEL 2 - Herstellung von Synpol 200-36/65

Ein Copolymer von Ethylenpiperazin-N-oxid und N-Acetylethylenpiperaziniumbromid mit MG 25.000 (n = 200, q = 0,35 n, z = 0,65 n) wurde mit Hilfe eines dreistufigen Verfahrens, ähnlich dem von Beispiel 1, synthetisiert.
(1) Im ersten Schritt wurden 10 g des vorher sublimierten Monomers und 0,11 g Ammoniumbromid in einer 10-ml-Glasampulle versiegelt. Dann wurde ein Vakuum (5 · 10&supmin;³ mm Hg) in der Ampulle mit Hilfe einer Vakuumpumpe erzeugt und die Ampulle 15 h lang bei 200ºC gehalten. Die Ausbeute an Poly-1,4-ethylenpiperazin betrug etwa 100%, MG 80.000 (gemessen durch LALLS).
(2) Im zweiten Schritt wurde die N-Oxidation von Poly-1,4-ethylenpiperazin wie folgt durchgeführt.
5 g Poly-1,4-ethylenpiperazin, im ersten Schritt erhalten, wurden in 250 ml 1%iger Essigsäurelösung gelöst. Dann wurden 4,6 ml 30%iges H&sub2;O&sub2; bei 2-4ºC unter sanfter mechanischer Bewegung zugegeben. Die Oxidation dauerte 48 h. Dann wurde nach Ultrafiltrationsreinigung und Lyophilisierung das N-Oxid von Poly- 1,4-ethylenpiperazin (MG 50.000, z = 0,65 n) gewonnen.
(3) Die im Schritt (2) oben hergestellte Menge an Poly-1,4-ethylenpiperazin-N-oxid wurde in 125 ml Methanol gelöst und dann wurden 16,5 g Bromessigsäure zugegeben. Die Reaktion der Alkylierung wurde bei 30ºC 24 h lang durchgeführt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft und der resultierende erhaltene Niederschlag wurde in Wasser gelöst, 24 h lang gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Es wurde ein Copolymer von Ethylenpiperazin-N-oxid und N-Acetylethylenpiperaziniumbromid mit der folgenden Formel (siehe Fig. 3) hergestellt.
Die Ausbeute betrug 95%. Das Oxidations- und Alkylierungsverhältnis, beide wie in Beispiel 1 bestimmt, betrug z = 0,65 n bzw. q = 0,35 n.
Die Konjugation von Synpol an Hyaluronidase sowie die Eigenschaften und Verwendung der Konjugate sind in WO-A-95107100 beschrieben.

Claims

1. Polymer, welches ein Copolymer von Ethylenpiperazin-N-oxid und N- (Carboxymethyl)ethylen-piperazinium ist.

2. Polymer mit der Formel wie in Fig. 1 gezeigt.

3. Polymer mit der Formel wie in Fig. 2 gezeigt.

4. Polymer mit der Formel wie in Fig. 3 gezeigt.

5. Polymer nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 mit einem Molekulargewicht von mindestens 15 kD.

6. Polymer nach Anspruch 5 mit einem Molekulargewicht von mindestens 30 kD.

7. Polymer nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 für die therapeutische Verwendung als immunstimulierendes Mittel.

8. Polymer nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 für die therapeutische Verwendung als immunstimulierendes Adjuvans.

9. Polymer nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 für die therapeutische Verwendung als immunstimulierender Träger.

10. Kombination eines Antigens und eines Polymers nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6.

11. Konjugat eines Antigens und eines Polymer nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6.

12. Impfstoff-Zusammensetzung umfassend eine Kombination nach Anspruch 10 oder ein Konjugat nach Anspruch 11.

13. Verwendung eines Polymers, einer Kombination, eines Konjugats oder eines Impfstoffs nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung für die Stimulation einer Immunreaktion.