DE69430799T2

DE69430799T2 - Wasserdispersible therapeutische carotenoid verbindungen

Info

Publication number: DE69430799T2
Application number: DE69430799T
Authority: DE
Inventors: Lance Elliott Schlipalius
Original assignee: Cognis Australia Pty Ltd
Current assignee: Cognis Australia Pty Ltd
Priority date: 1993-03-22
Filing date: 1994-03-22
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2014-03-23
Also published as: US5773026A; EP0689427A4; AU696956B2; EP0689427B1; EP0689427A1; ES2178651T3; WO1994021232A1; DE69430799D1; AU6370594A; ATE218855T1; JPH08510995A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf im Wesentlichen nichttoxische wasserdispergierbare therapeutische Zubereitungen, die ein im Wesentlichen wasserunlösliches therapeutisches Mittel enthalten, das aus Carotinoidzusammensetzungen ausgewählt ist, die Tieren einschließlich des Menschen durch Injektion oder intravenös in die Organe, den Blutstrom oder die Lymphe verabreicht werden können.
Einige chemische Verbindungen von physiologischer therapeutischer Bedeutung haben wenig oder keine Wasserlöslichkeit. Die Wasserunlöslichkeit dieser Zusammensetzungen beschränkt die Mittel, mit denen diese Verbindungen dem Körper verabreicht werden können. So sind in WO 90/08544 zum Beispiel ω-3- Fettsäuren zur Verwendung als Wirkstoff für intraperitoneale Anwendungen als Emulsion zubereitet, die einen Emulgator und gegebenenfalls Komponenten, die aus mittelkettigen Triglyceriden, Tocopherol, Ascorbinsäure oder physiologisch annehmbaren Estern davon bestehen, sowie üblicherweise verwendete Additive und Hilfssubstanzen enthält.
Die Löslichkeit von Ibudilast in Wasser ist nicht größer als 0,015% (w/v). In der Australischen Patentanmeldung Nr. 37822/89 wurde diese Verbindung in hoher Konzentration in einer neuen Lipidmikrosphäre zubereitet, die für die Behandlung von cerebrovaskulären Störungen und Bronchialasthma geeignet ist.
Zu der Gruppe von Verbindungen, die als physiologisch wichtig angesehen werden, gehören die Carotinoide, Tocopherole und andere Moleküle auf Lipidbasis, die für verschiedene gesundheitliche oder therapeutische Zwecke verwendet werden.
Im Europäischen Patent 0 479 066 wurde beta-Carotin, das nach dem dort beschriebenen Verfahren gegen Rekristallisation stabilisiert wurde, verwendet, um die Fruchtbarkeit von landwirtschaftlichen Nutztieren zu verbessern. Die Stabilisierung des beta-Carotins wurde unter Verwendung von Geräten und Verfahren erreicht, die eine genaue Steuerung der Isomerisierungsreaktion ermöglichten.
WO 93/04598 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Carotinoidzusammensetzung, ohne dass synthetische oder unnatürliche Bestandteile notwendig sind, so dass das Carotinoidprodukt vollständig aus natürlich vorkommenden Komponenten besteht und als Additiv oder Farbstoff in Lebensmitteln, Getränken oder anderen verzehrbaren Produkten verwendet werden kann. Natürlich vorkommende Substanzen und der Ausschluss synthetischer Bestandteile gefallen dem Verbraucher, so dass die Nachfrage nach dem Produkt verbessert wird.
Es gibt die Hypothese, dass Carotinoide und insbesondere beta-Carotin möglicherweise die Gefahr von Brust-, Lungen-, Dickdarm-, Prostata- und Gebärmutterhalskrebs, Herzkrankheiten und Schlaganfall reduzieren und die Makula-Degeneration verzögern können. In dieser Hinsicht besteht eine Hypothese darin, dass beta-Carotin in Säugern in Vitamin A und Vitamin-A-Analoga oder Retinoide umgewandelt wird (siehe Moon R. C.: Comparative aspects of carotenoids and retinoids as chemopreventive agents for cancer; J. Nutr. 119: 127-134, 1989). Wegen dieser Provitamin-A-Wirkung und der Fähigkeit, oxidative Schäden zu verhindern, sind Carotinoide und insbesondere beta-Carotin zu interessanten Verbindungen in chemopräventivischen Studien geworden. Zum Beispiel werden Antioxidantien unter anderem dazu verwendet, freie Radikale zu löschen, die Nebenprodukte des normalen Stoffwechsels in Zellen sind.
Beta-Carotin wird auch bei der Behandlung von erythropoetischer Protoporphyrie (EPP) verwendet. EPP ist eine genetische Krankheit, die einen Defekt im Metabolismus von Porphyrinverbindungen verursacht. Sie führt zu einer schnellen Blasenbildung auf der Haut bei Bestrahlung mit Sonnenlicht.
Wenn man die Verwendung dieser Zusammensetzungen auf Lipidbasis für die Anwendung beim Menschen in Betracht zieht, treten wegen ihrer lipophilen Natur, wegen der sie in Wasser nicht in geeigneten Mengen löslich sind, sofort Schwierigkeiten auf. Vermutlich werden diese Produkte im Blutstrom als Lipoproteine geringer Dichte transportiert.
Die Hauptmethode, mit der diese therapeutischen Zusammensetzungen in den Körper eingeführt werden, ist zur Zeit die orale Methode. Diese Methode ist jedoch häufig unbefriedigend, da die geringe Resorption dieser Zusammensetzungen im Verdauungskanal die im Blut erreichbaren Konzentrationen beschränkt. Weiterhin gibt es eine erhebliche Verzögerung, bevor ein erforderliches Niveau dieser Zusammensetzungen im Blutstrom eines speziellen Organs erreicht ist. Zuweilen kann das erforderliche Niveau nicht erreicht werden, da bestimmte Individuen Carotinoide, insbesondere beta-Carotin, nicht sehr gut resorbieren. Es gibt bei der Fähigkeit menschlicher Individuen zum Resorbieren von beta-Carotin einen Unterschied von etwa dem Faktor zehn. Es wurden über 500 Carotinoide isoliert, aber bei nur ungefähr 15 wurde gezeigt, dass sie im Blutstrom vorkommen.
Ärzte möchten Verbindungen oft durch Injektion oder durch intravenösen Tropf und nicht durch orale Einnahme verabreichen. Wegen der praktischen Unlöslichkeit dieser therapeutischen Zusammensetzungen in Wasser ist es jedoch sehr schwierig, die entweder durch Injektion oder Intravenös zu verabreichen. Folglich muss die Verbindung in einer wässrigen Grundlage dispergierbar gemacht werden, so dass sie für die Zellen des Körpers verfügbar ist. In dieser Hinsicht muss die Grundlage zum Beispiel mit dem Blutstrom oder der Lymphe verträglich sein, und das Material muss in einer biologisch sterilen Form hergestellt werden. Die Grundlage darf selbst für die menschlichen Zellen nicht toxisch sein.
Zur Zeit wurden mehrere in-vitro-Studien durchgeführt, um die Wirkung von beta-Carotin auf normale und transformierte Zelltypen zu bestimmen, wobei man Lösungsmittel verwendete, um das beta-Carotin in Lösung zu bringen, wie Tetrahydrofuran, Butanol, Chloroform, Hexan, Dimethylsulfoxid, Ethanol oder in einer Liposomenmicelle. WO 89/06977 offenbart die Verkapselung von Retinoiden in Liposomen, um die Verfügbarkeit des Retinoids an einer Zielstelle zu erhöhen und dadurch die Notwendigkeit von Zelloberflächenrezeptoren zu umgehen. Die Verkapselung des Retinoids in den Liposomen unterstützt auch die Reduktion der Toxizität.
Frühere Liposomenpräparate haben in Zelllinienkulturen Toxizität gezeigt und waren in ihrer Anwendbarkeit beschränkt. (Siehe Bertram J. S., Pung A., Churley M., et al.: Diverse carotenoids protect against chemically induced neoplastic transformation, Carcinogenesis 12: 671-678, 1991; Hazuka M. B., Prasad- Edwards J., Newman F., et al.: Beta-carotene induces morphological differentiation and decreases adenylate cyclase activity in melanoma cells in culture. J. Am. Coll. Nutr. 9: 143-149, 1990: Schultz T. D., Chew B. P., Seaman W. R., et al.: Inhibitory effect of conjugated dienoic derivatives of linoleic acid and betacarotene on the in vitro growth of human cancer cells. Canc. Letters 63: 125- 133, 1992; Schwartz J. L., Shklar G.: The selective cytotoxic effect of carotenoids and α-tocopherol on human cancer cell lines in vitro, J. Oral Maxillofax. Surg. 50: 367-373. 1992; Schwartz J. L., Tanaka J., Khandekar V., et al.: Beta- Carotene and/or Vitamin E as modulators or alkylating agents in SCC-25 human squamous carcinoma cells. Canc. Chemother. Pharmacol. 29: 207-213, 1992; Zhang L.-Z., Cooney R. V., Bertram J. S.: Carotenoids enhance gap junctional communication and inhibit lipid peroxidation in C3H/10T1/2 cells: relationship to their cancer chemopreventative action, Carcinogenesis 12: 2109-2114, 1991; and Zhang L.-X., Cooney R. V., Bertram J. S.: Carotenoids up-regulate connexin 43 gene expression independent of their provitamin A or antioxidant properties. Canc. Res. 52: 5707-5712, 1992). Es hat sich jedoch gezeigt, dass diese Lösungsmittel eine toxische Wirkung haben, die dosisabhängig ist. Diese Lösungsmittel sind außerdem für die Zwecke von intravenösen oder injizierbaren Präparaten mit menschlichem Blut oder Lymphe unverträglich.
Dementsprechend wurden Untersuchungen durchgeführt, um eine im Wesentlichen nichttoxische wasserdispergierbare therapeutische Zubereitung zu entwickeln, die ein im Wesentlichen wasserunlösliches therapeutisches Mittel enthält, das Tieren einschließlich des Menschen durch Injektion oder Intravenös in die Organe, den Blutstrom oder die Lymphe verabreicht werden kann.
Die Erfindung stellt allgemein eine therapeutische Zusammensetzung bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zusammensetzung als Injektionspharmakon zubereitet ist und folgendes umfasst:
(a) wenigstens 30 Gew.-% einer wasserlöslichen oder -dispergierbaren Komponente;
(b) eine Emulgatorkomponente, die aus Mono- und Diglyceridstrukturen pflanzlicher und tierischer Herkunft, Lecithinen und Phospholipiden ausgewählt ist;
(c) ein wasserunlösliches therapeutisches Mittel in einem geeigneten Trägermedium, wobei das wasserunlösliche therapeutische Mittel eine Carotinoidzusammensetzung umfasst, die beta-Carotin enthält, und das als Träger für das wasserunlösliche therapeutische Mittel verwendete Trägermedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fettsäuren und Triglyceridlipiden und nichtverseifbaren Lipidpräparaten, Erdölkohlenwasserstoffen einschließlich Octadecan und Kombinationen der obigen Verbindungen besteht.
In einer bevorzugten Form der Erfindung ist die wasserlösliche oder -dispergierbare Komponente aus Zuckeralkoholen, Zuckern, Aminosäuren, Wasser, Vitaminen, Blutserum oder -plasma, Lymphe, Puffern und Kombinationen und Polymeren dieser Materialien sowie Injektionsgrundlagen, die in der Industrie wohlbekannt sind, wie Mineralsalzpräparaten und Dextroselösungen, oder Kombinationen dieser Komponenten ausgewählt.
Ganz besonders bevorzugt liegt die wasserlösliche oder -dispergierbare Komponente im Bereich von 30 bis 90 Gew.-%. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Zuckeralkohol um Glycerin, und in noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das Glycerin im Bereich von 30 bis 90 Gew.-%.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Glycerid der Emulgatorkomponente um Glycerylmonooleat. In noch einer weiteren bevorzugten Form der Erfindung liegt der Emulgator im Bereich von 0,2 bis 20 Gew.-% und besonders bevorzugt 1,0 bis 10 Gew.-%.
Die Carotinoidzusammensetzung enthält beta-Carotin. Noch eine weitere bevorzugte Form der wasserunlöslichen Carotinoidzusammensetzung enthält 2 bis 50 Gew.-% beta-Carotin in Sojaöl. Besonders bevorzugt enthält die Carotinoidzusammensetzung 20 bis 40 Gew.-% und am meisten bevorzugt 30 Gew.-% beta- Carotin in Sojaöl.
Vorzugsweise ist das beta-Carotin ein Gemisch von cis-beta-Carotin und all- trans-beta-Carotin. Typischerweise liegt der cis-beta-Carotin-Gehalt des beta- Carotins im Bereich von 50 bis 90%, besonders bevorzugt 70 bis 85%. Besonders bevorzugt ist das beta-Carotin vorwiegend 9-cis-beta-Carotin in einem bevorzugten Bereich von 60% bis 90%. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform liegt das wasserunlösliche therapeutische Mittel im Bereich von 0,1 bis 10 Gew.-% (und besonders bevorzugt 1 bis 5 Gew.-%) der therapeutischen Zubereitung.
In noch einer weiteren bevorzugten Form der Erfindung ist das als Träger für das wasserunlösliche therapeutische Mittel verwendete Trägermedium aus der Gruppe ausgewählt, die aus Fettsäuren und Triglyceridlipiden und nichtverseifbaren Lipidpräparaten, bestimmten geeigneten Erdölkohlenwasserstoffen einschließlich Octadecan und Kombinationen der obigen Verbindungen besteht.
In noch einer weiteren bevorzugten Form der Erfindung sind die Triglyceridlipide aus der Gruppe ausgewählt, die aus Fetten und/oder Öfen besteht, die aus pflanzlichen Quellen stammen, wie Samenölen einschließlich Sojaöl, Baumwollsaatöl und Sonnenblumenöl, und aus tierischen Quellen stammen, einschließlich Fisch und Rind. Besonders bevorzugt liegt das Trägermedium im Bereich von 0,1 bis 40 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 1 bis 20 Gew.-%.
in einer ganz besonders bevorzugten Form der Erfindung ist das Konzentrationsniveau der therapeutischen Zubereitung mit einer Verdünnungslösung verdünnt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wässrigen Puffern, normalen intravenösen Präparaten (einschließlich isotonischer Kochsalzlösung oder 5%iger Dextroselösung) und Blutserum sowie Kombinationen davon besteht.
Weitere Aspekte der Erfindung umfassen:
die Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments, das einem Patienten zur Therapie durch Injektion verabreicht wird, wobei die Zusammensetzung folgendes umfasst:
(a) wenigstens 30 Gew.-% einer wasserlöslichen oder -dispergierbaren Komponente;
(b) eine Emulgatorkomponente; und
(c) ein wasserunlösliches therapeutisches Mittel in einem geeigneten Trägermedium, wobei das wasserunlösliche therapeutische Mittel eine Carotinoidzusammensetzung umfasst und das als Träger für das wasserunlösliche therapeutische Mittel verwendete Trägermedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fettsäuren und Triglyceridlipiden und nichtverseifbaren Lipidpräparaten, Erdölkohlenwasserstoffen einschließlich Octadecan und Kombinationen der obigen Verbindungen besteht;
eine Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zusammensetzung ein im Wesentlichen nichttoxisches Therapeutikum ist, das als Injektionspharmakon zubereitet ist und folgendes umfasst:
(a) wenigstens 30 Gew.-% einer wasserlöslichen oder -dispergierbaren Komponente;
(b) eine Emulgatorkomponente; und
(c) ein wasserunlösliches therapeutisches Mittel in einem geeigneten Trägermedium, wobei das wasserunlösliche therapeutische Mittel eine Carotinoidzusammensetzung umfasst und das als Träger für das wasserunlösliche therapeutische Mittel verwendete Trägermedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fettsäuren und Triglyceridlipiden und nichtverseifbaren Lipidpräparaten, Erdölkohlenwasserstoffen einschließlich Octadecan und Kombinationen der obigen Verbindungen besteht;
eine Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zusammensetzung ein im Wesentlichen nichttoxisches Therapeutikum ist, das als Injektionspharmakon zubereitet ist, das in Organe, den Blutstrom oder die Lymphe eines Patienten verabreicht wird, wobei die zubereitete Zusammensetzung folgendes umfasst:
(a) wenigstens 30 Gew.-% einer wasserlöslichen oder -dispergierbaren Komponente;
(b) eine Emulgatorkomponente; und
(c) ein wasserunlösliches therapeutisches Mittel in einem geeigneten Trägermedium, wobei das wasserunlösliche therapeutische Mittel eine Carotinoidzusammensetzung umfasst und das als Träger für das wasserunlösliche therapeutische Mittel verwendete Trägermedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fettsäuren und Triglyceridlipiden und nichtverseifbaren Lipidpräparaten, Erdölkohlenwasserstoffen einschließlich Octadecan und Kombinationen der obigen Verbindungen besteht; und
eine Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zusammensetzung als Injektionspharmakon zubereitet ist und folgendes umfasst:
(a) eine wasserlösliche oder -dispergierbare Komponente; die Glycerin im Bereich von 30 bis 90 Gew.-% umfasst;
(b) einen Emulgator; und
(c) ein wasserunlösliches therapeutisches Mittel in einem geeigneten Trägermedium, wobei das wasserunlösliche therapeutische Mittel eine Carotinoidzusammensetzung umfasst und das als Träger für das wasserunlösliche therapeutische Mittel verwendete Trägermedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fettsäuren und Triglyceridlipiden und nichtverseifbaren Lipidpräparaten, Erdölkohlenwasserstoffen einschließlich Octadecan und Kombinationen der obigen Verbindungen besteht.
Fig. 1 zeigt Graphiken, die die Wirkung von Trägern auf die DNA-Synthese bei einem humanen metastasierenden Melanom und bei neonatalen Melanocyten zeigen. Zusammenfassend gesagt, wurden der Melanomzellstamm c81-46a und die Melanocyten 72 Stunden lang mit Sojaölextrakt, Tetrahydrofuran und einem 3 : 1-Gemisch von Dimethylsulfoxid : Ethanol inkubiert. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 6 Näpfen +/- der prozentuale Standardfehler im Vergleich zur Kontrolle.
Fig. 2 ist eine Graphik, die die Wirkung von beta-Carotin auf die DNA-Synthese bei einem humanen metastasierenden Melanom und bei neonatalen Melanocyten zeigt. Zusammenfassend gesagt, wurden die Melanomzellstämme c83-2c, c81- 46c, c81-46a, c81-61 und die Melanocyten (MC) 72 Stunden lang mit beta- Carotin inkubiert. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 6 Näpfen +/- der prozentuale Standardfehler im Vergleich zur Kontrolle. Konzentration des Verdünnungsmittels (SOY) = 0,05%.
Fig. 3 ist eine Graphik, die die Wirkung von beta-Carotin auf die Proliferation bei einem humanen metastasierenden Melanom und bei neonatalen Melanocyten zeigt. Zusammenfassend gesagt, wurden die Melanomzellstämme c83-2c, c81- 46c, c81-46a und die Melanocyten (MC) 72 Stunden lang mit beta-Carotin inkubiert, und die Lebensfähigkeit wurde anhand des Ausschlusses von Trypanblau bewertet. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 3 Näpfen +/- der prozentuale Standardfehler im Vergleich zur Kontrolle. Konzentration des Verdünnungsmittels (SOY) = 0,05%.
Fig. 4 ist eine Graphik, die die Wirkung von beta-Carotin auf die DNA-Synthese bei humanen Tumor- und normalen Zelllinien zeigt. Zusammenfassend gesagt, wurden A431, epidermoides Carcinom,. WiDr, Colon-Adenocarcinom, WI-38, fetale Lungenfibroblasten, und Lu-CSF-1, Lungen-Adenocarcinom, 72 Stunden lang mit beta-Carotin inkubiert. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 6 Näpfen +/- der prozentuale Standardfehler im Vergleich zur Kontrolle. Konzentration des Verdünnungsmittels (SOY) = 0,05%.
Fig. 5 ist eine Graphik, die die Wirkung von beta-Carotin auf die DNA-Synthese bei einem humanen metastasierenden Melanom und bei neonatalen Melanocyten zeigt. Zusammenfassend gesagt, wurden der Melanomzellstamm c81-46a und die Melanocyten 72 Stunden lang mit 9-cis-beta-Carotin inkubiert. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 6 Näpfen +/- der prozentuale Standardfehler im Vergleich zur Kontrolle. Konzentration des Verdünnungsmittels (SOY) = 0,05%.
Die Fig. 1, 2 und 4 beziehen sich auf den "prozentualen Einbau von tritiiertem Thymidin", der ein Maß für die DNA-Syntheseaktivität ist.
Einzelheiten der Experimente, die in Bezug auf die Erfindung durchgeführt wurden, sind wie folgt.

Materialien

(a) Zellkulturen

Um die Löslichkeit und Ungiftigkeit der Erfindung in Experimenten zu zeigen, die die Behandlung von Melanomen und Melanocyten betreffen, war es notwendig, zuerst Melanocyten und Melanomstämme zu isolieren und zu kultivieren.
Das zum Isolieren und Kultivieren von Melanocyten verwendete Verfahren ist eine Kombination der Verfahren, die von Eisinger und Marko (siehe Eisinger M., Marko O.: Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 2018- 2022, 1982) sowie Halaban und Alfano (siehe Halaban R., Alfano F. D.: Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro 20: 45-47, 1984) entwickelt wurden.
Kurz gesagt, Vorhautproben von neugeborenen Säuglingen wurden gesammelt, und die Melanocyten wurden isoliert und in einen T-75-Kolben übergeführt. Primäre neonatale Melanocyten wurden in MCDB-153-Medium (Irvine Sci.) kultiviert, wie es von Halaban beschrieben (siehe Halaban R., Ghosh S., Baud A.: bFGF is the putative natural growth factor for normal human melanocytes. In Vitro Cell Develop. Biol. 23: 47-52, 1987) und von Kath modifiziert wurde (siehe Kath R., Rodecsk U., Menssen H. D. et al.: Tumor progression in the human melanocytic system: Anticancer Res. 9: 865-872, 1987). Eine Kontamination mit Fibroblasten wurde unterdrückt, indem man 2 Tage lang Geneticin (250 Mikrogramm/ml) in das Medium gab. Die Melanomzellstämme (c81-46a, c81-46c, c81-61, c83-2c) wurden in F-10 (Fisher Sci.) mit 5% fetalem Kälberserum, 5% neonatalem Kälberserum (Gemini Sci.), Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (0,1 Milligramm/ml) (Sigma) kultiviert. Die für die Melanomzellstämme verwendete Anzahl der Passagen war kleiner als 8, und bei den Melanocyten war sie kleiner als 5. Die Melanomzellstämme wurden schon früher charakterisiert (siehe Bregman M. D., Meyskens F. L.: Inhibition of human malignant melanoma colony-forming cells in vitro by prostaglandin A1, Canc. Res. 43: 1642-1645, 1983; Thomson S. P., Meyskens F. L.: Methods of measurement of self-renewal capacity of clonogenic cells from biopsies of metastatic human malignant melanoma. Canc. Res: 42: 4606-4613, 1982; und Yohem K. H., Slymen D. J., Bregman M. D., et al.: Radiation survival of murine and human melanoma cells utilizing two assay systems; monolayer and soft agar. Br. J. Canc. 57: 64-69, 1987). Mehrere andere Tumorzelllinien wurden ebenfalls getestet, nämlich A-431 (ein humanes epidermoides Carcinom), WiDr (ein humanes Colon-Adenocarcinoma), W1-38 (normale humane fetale Lungenfibroblasten) (alle von der American Type Culture Collection erhalten) und Lu-CSF-1 (ein humanes Lungen- Adenocarcinom) (zur Verfügung gestellt von der University of California in Irvine). Diese vier Zelllinien wurden in DMEM-Medium (Fisher Sci.), 5% fetales Kälberserum, 5% neonatales Kälberserum, Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (0,1 Milligramm/ml) kultiviert.

(b) Chemikalien

Die folgenden Chemikalien wurden beim Testen einer Form der Erfindung bei der Behandlung von Melanomen und Melanocyten verwendet.
Das beta-Carotin wurde aus der Alge Dunaliella salina isoliert und stellte 85-90% der Gesamtcarotinoide dar, wobei die Hälfte des Restes aus Oxycarotinoiden (Lutein und Zeaxanthin) und die andere Hälfte aus alpha-Carotin bestand. Gamma-Carotin ist normalerweise durch HPLC (High pressure liquid chromatography) nicht nachweisbar. Das Sojaöl wurde aus Sojabohnen isoliert. Eine kristalline Suspension von beta-Carotin und Sojaöl wurde hergestellt. Diese resultierende Phase wurde dann in die beschriebene Zusammensetzung einemulgiert. Dann wurde sie durch Hitze oder Filtration sterilisiert. Vor dem Testen an den Zelllinien wurde jede Ampulle der Zusammensetzung nochmals in kryogene Ampullen (Costar) aufgeteilt, wobei für jedes Experiment eine frische Ampulle verwendet wurde. Während der gesamten Verfahren wurde das beta- Carotin vor direktem Licht geschützt.
Tetrahydrofuran und Ethanol (Fisher Sci.) der höchsten verfügbaren Qualität wurden verwendet. Dimethylsulfoxid wurde von Sigma bezogen.
Die Einzelheiten der emulgierten beta-Carotin-Zusammensetzung sind wie folgt:
Gew.-%
(i) beta-Carotin 2,4% und
(ii) SOY, d. h.: Sojaöl 6,8% Glycerylmonooleat 7,2% Glycerin 66,7% Wasser 16,9%
Die obige Zusammensetzung kann nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden. Eine kristalline Suspension von beta-Carotin in Sojaöl wird erhitzt, und Glycerylmonooleat wird hinzugefügt. Diese Ölphase wird in der Glycerin-Wasser- Phase durch Mischen mit hoher Scherung dispergiert, und anschließend wird bei 60-70ºC homogenisiert. Typischerweise wird ein Horriogenisierungsdruck von 8000 bis 10 000 psi verwendet, doch variiert dieser Druck je nach der verwendeten Maschine. Das resultierende Produkt wird dann durch Verarbeitung in der Hitze sterilisiert. Typischerweise erfolgt die Verarbeitung in der Hitze durch 15 Minuten Autoklavieren bei 121ºC in einer Verpackung zur Entnahme (3-ml- Glasampulle). Gegebenenfalls werden 0,3% Tocopherole als Antioxidantien hinzugefügt, um Toxizität zu überwinden, die sich im Laufe der Zeit entwickeln kann.

(c) Experimentelle Bedingungen

Im folgenden sind die experimentellen Bedingungen beschrieben, die bei der Verwendung einer Form der Erfindung bei der Behandlung von Melanomen und Melanocyten verwendet wurden.
Der Einbau von tritiiertem Thymidin in DNA wurde in folgender Weise gemessen. Zellen wurden auf einer 96-Napf-Platte (Falcon) ausgesät und bis zu einer Konfluenz von 50% wachsen gelassen (24 Stunden), und danach wurde frisches Medium allein, frisches Medium mit beta-Carotin oder frisches Medium mit einem Träger (Trägerkonzentration = 0,05%) hinzugefügt und 72 Stunden lang inkubiert. Die DNA-Synthese wurde durch Markierung mit [Methyl-3H]-Thymidin (2,5 uCi/ml, 20 Ci/mmol, Dupont-New England Nuclear) gemessen, das während der letzten 15 Stunden des Behandlungszeitraums zu dem Medium gegeben wurde. Nach der Inkubation wurden die Zellen unter Verwendung eines PhD Cell Harvester (Cambridge Research Inc.) geerntet. Die eingebaute Radioaktivität wurde mit dem Flüssigszintillationszähler (LS5000TD, Beckman Instruments) mit einer Effizienz von 62,7% bestimmt. Die Daten sind als prozentualer Einbau von tritiiertem Thymidin im Vergleich zur Kontrolle dargestellt. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 6 Näpfen +/- der prozentuale Standardfehler.
Die Zellproliferation wurde wie folgt bestimmt. Die Zellen wurden in 6-Napf- Platten (Falcon) ausgesät und bis zu einer Konfluenz von 50% wachsen gelassen (24 Stunden). Frisches Medium und die entsprechende Verbindung wurden hinzugefügt, und dann wurden die Zellen 72 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 0,25% Trypsin geerntet und gewaschen. Die Zellen wurden mit einem Coulter Counter (Coulter Instruments) gezählt, und die Lebensfähigkeit wurde anhand des Ausschlusses von Trypanblau bestimmt. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von 3 Näpfen +/- der prozentuale Standardfehler.

Ergebnisse

Fig. 1 belegt die relative Ungiftigkeit des SOY-Trägers im Vergleich zur dosisabhängigen toxischen Wirkung von Tetrahydrofuran ("THF") und eines 3 : 1- gemischs von Dimethylsulfoxid/Ethanol ("DMSO/ETOH") auf normale Melanocyten und einen metastasierenden Melanomstamm c81-46, gemessen anhand des Einbaus von Thymidin.
THF, DMSO/ETOH und SOY wurden 72 Stunden lang mit den Zellen in einer Konzentration von 0,005%, 0,05% und 0,5% inkubiert.
Wie in Fig. 1 gezeigt ist, beeinflusste SOY bei keiner Konzentration des Verdünnungsmittels den Einbau von Thymidin in die Melanomzellen. THF hatte nur eine geringfügige Wirkung auf die Melanomzellen, während DMSO/ETOH bei der höchsten Konzentration den Einbau um 40% senkte.
Fig. 2 zeigt, dass das therapeutische Mittel beta-Carotin im SOY-Träger in normale Melanocyten und in vier metastasierende Melanomzellstämme eingebaut wurde, wie anhand des Thymidineinbaus in diese Zellen gezeigt wird. Bei einer Konzentration von 0,1 Mikrogramm/ml hatte beta-Carotin eine leichte inhibitorische Wirkung auf das Wachstum der Melanomzellen, wobei c81-61 mit einer 20%igen Abnahme der DNA-Synthese am empfindlichsten war. Die Melanome zeigten jedoch eine differentielle Reaktion auf beta-Carotin bei 1,0 Mikrogramm/ml, die im Bereich von keiner Hemmung bis zu über 40% lag. Bei der höchsten beta-Carotin-Konzentration (10 Mikrogramm/ml) wurden normale Melanocyten und zwei der Melanome (c81-61, C81-46c) zu mehr als 95% gehemmt.
Außerdem wurde beta-Carotin effektiv in die Melanocyten und vier metastasierende Melanomzellstämme eingebaut, wie die Lebensfähigkeit dieser Zellen zeigt, die anhand des Ausschlusses von Trypanblau gemessen wird (Fig. 3). Beta-Carotin reduzierte bei 1,0 Mikrogramm/ml die Lebensfähigkeit um 20%, während bei 10 Mikrogramm/ml keine lebensfähigen Melanocyten nachgewiesen wurden.
Die Reaktion anderer Tumortypen auf beta-Carotin wurde ebenfalls bewertet (Fig. 4). Die humane epidermoide Carcinomzelllinie A-431 wurde durch beta- Carotin selbst bei 10 Mikrogramm/ml nicht beeinflusst. Die Colon-Zelllinie, die normalen Lungenfibroblasten und die Lungen-Adenocarcinom-Zelllinie wurden minimal gehemmt (10-20%), was noch einmal den Einbau des beta-Carotins zeigt.
Fig. 5 zeigt die Wirkung von 9-cis-beta-carotih im SOY-Träger auf normale Melanocyten und auf einen metastasierenden Melanomzellstamm. Bei einer Konzentration von 1,0 Mikrogramm/ml wurden sowohl die normalen Melanocyten als auch das C81-46a zu ungefähr 50% gehemmt. Bei der höheren Konzentration von 9-cis-beta-Carotin (10,0 Mikrogramm/ml) wurde der metastasierende Melanomzellstamm zu 90% gehemmt, während die Melanocyten geringfügig weniger gehemmt wurden als bei 1,0 Mikrogramm/ml.
Ohne dass wir uns auf eine bestimmte Theorie festlegen möchten, scheint es, dass das in den Beispielen gezeigte Gemisch eine superfeine Emulsion ist.
Die nützlichen Eigenschaften bestimmter therapeutischer Mittel auf Lipidbasis waren in der Vergangenheit durch die Unfähigkeit beschränkt, diese Mittel durch Injektion oder intravenös in Tiere einschließlich des Menschen einzuführen. Während diese Mittel in bestimmten Lösungsmitteln (zum Beispiel THF) im Wesentlichen aufgelöst werden können, sind diese nicht mit dem Blut oder der Lymphe von Tieren verträglich und sind cytotoxisch.
Als neuer Träger für therapeutische Mittel auf Lipidbasis ermöglicht SOY die Verabreichung dieser therapeutischen Mittel an Tiere und den Einbau in Zellen als im Wesentlichen nichttoxische wasserdispergierbare Zusammensetzungen. Fig. 1 zeigt die weitgehende Ungiftigkeit des SOY-Trägers, und die Fig. 2 bis 4 zeigen, dass die im Wesentlichen nichttoxische wasserdispergierbare Zusammensetzung, die das im Wesentlichen unlösliche therapeutische Mittel enthält, in einige der Zellen eingebaut wurde, was anhand des Einbaus von tritiiertem Thymidin und des Ausschlusses von Trypanblau gezeigt wird.

Claims

1. Therapeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung als Injektionspharmakon zubereitet ist und folgendes umfasst:

(a) wenigstens 30 Gew.-% einer wasserlöslichen oder -dispergierbaren Komponente;

(b) eine Emulgatorkomponente, die aus Mono- und Diglyceridstrukturen pflanzlicher und tierischer Herkunft, Lecithinen und Phospholipiden ausgewählt ist;

(c) ein wasserunlösliches therapeutisches Mittel in einem geeigneten Trägermedium, wobei das wässerunlösliche therapeutische Mittel eine Carotinoidzusammensetzung umfasst, die beta-Carotin enthält, und das als Träger für das wasserunlösliche therapeutische Mittel verwendete Trägermedium aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fettsäuren und Triglyceridlipiden und nichtverseifbaren Lipidpräparaten, Erdölkohlenwasserstoffen einschließlich Octadecan und Kombinationen der obigen Verbindungen besteht.

2. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die wasserlösliche oder -dispergierbare Komponente aus Zuckeralkoholen, Zuckern, Aminosäuren, Wasser, Vitaminen, Blutserum oder -plasma, Lymphe, Puffern und Kombinationen und Polymeren dieser Materialien, und Injektionsgrundlagen, wie Mineralsalzpräparaten und Dextroselösungen, oder Kombinationen dieser Komponenten ausgewählt ist.

3. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die wasserlösliche oder -dispergierbare Komponente im Bereich von 30 bis 90 Gew.-% liegt.

4. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei es sich bei der wasserlöslichen oder -dispergierbaren Komponente um Glycerin handelt.

5. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei das Glycerin im Bereich von 30 bis 90 Gew.-% liegt.

6. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Glycerid der Emulgatorkomponente Glycerylmonooleat ist.

7. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Emulgator im Bereich von 0,2 bis 20 Gew.-% liegt.

8. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei der Emulgator im Bereich von 1,0 bis 10 Gew.-% liegt.

9. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Carotinoidzusammensetzung wenigstens 85 Gew.-% beta- Carotin enthält.

10. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Carotinoidzusammensetzung 85 bis 90 Gew.-% beta-Carotin enthält.

11. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Carotinoidzusammensetzung 10 bis 15 Gew.-% Oxycarotinoide und alpha-Carotin enthält.

12. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das beta-Carotin cis-beta-Carotin und alltrans-beta-Carotin umfasst.

13. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei der Gehalt des beta-Carotins an cis-beta-Carotin im Bereich von 50 bis 90% liegt.

14. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, wobei der Gehalt des beta-Carotins an cis-beta-Carotin im Bereich von 70 bis 85% liegt.

15. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei es sich bei dem cis-beta-Carotin vorwiegend um 9-cis-beta-Carotin handelt.

16. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei das cis-beta-Carotin zu 60 bis 90% aus 9-cis-beta-Carotin besteht.

17. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das wasserunlösliche therapeutische Mittel im Bereich von 0,1 bis 10 Gew.-% der Zubereitung liegt.

18. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das wasserunlösliche therapeutische Mittel im Bereich von 1 bis 5 Gew.-% der Zubereitung liegt.

19. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Trigiyceridlipide aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Fetten und/oder Ölen besteht, die aus pflanzlichen Quellen stammen, einschließlich Samenölen, wie Sojaöl, Baumwollsaatöl und Sonnenblumenöl, und aus tierischen Quellen stammen, einschließlich Fisch und Rind.

20. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das Trägermedium im Bereich von 0,1 bis 40 Gew.-% liegt.

21. Therapeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, wobei das Trägermedium im Bereich von 1 bis 20 Gew.-% liegt.

22. Therapeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Zubereitung weiterhin mit Verdünnungsmitteln verdünnt ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wässrigen Puffern, normalen intravenösen Präparaten (einschließlich isotonischer Kochsalzlösung oder 5%iger Dextroselösung) und Blutserum sowie Kombinationen davon besteht.