DE69428006T2

DE69428006T2 - Verfahren zur Gewinnung von Carbocalcitonin

Info

Publication number: DE69428006T2
Application number: DE69428006T
Authority: DE
Inventors: David Andreau Martinez; Marcos Canas Poblet; Gemma Jodas Farres; Berta Ponsati Obiols
Original assignee: Lipotec SA
Current assignee: Bcn Peptides Sa Es
Priority date: 1993-02-03
Filing date: 1994-01-24
Publication date: 2002-04-18
Anticipated expiration: 2014-01-25
Also published as: JPH072744A; EP0618219B1; DE69428006D1; ES2055665A1; ES2055665B1; EP0618219A1; US5739272A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lachs- und Aal-Carbocalcitonin und aller ihrer pharmazeutisch verwendbaren durch Säurezusatz gebildeten Salze oder von Komplexen davon in fester Phase.

ERFINDUNGSBEREICH

Carbocalcitonine sind unnatürliche Peptide und stellen Analoge der Calcitonine mit einer jedoch sehr viel höheren Aktivität dar. Wie die Calcitonine sind sie auf Grund ihrer Eigenschaft, den Kalziumgehalt des Blutes zu regulieren, Gegenstand zahlreicher therapeutischer Applikationen für die Behandlung von Hypercalcemia, Osteopherose oder der Paget-Krankheit. Diese Verbindungen weisen gegenüber natürlichen Calcitoninen in einem Impfstoff, der Leber oder den Nieren eine sehr viel höhere Stabilität auf und sind auf Grund fehlender Disulfidbrücken, die bei Calcitoninen zu finden sind, unempfindlicher bei Reinigungsverfahren sowie bei der Lagerung. Aus der Literatur sind zahlreiche synthetische Vorgehensweisen zur Herstellung von Calcitoninen bekannt (siehe beispielsweise: EP 0 518 295, WO-A- 92/19643, EP-A-0 232 650 sowie Experentia 32 (9), 1104-1106).
Natürlich vorkommende Calcitonine, beispielsweise Aal-, Lachs- oder menschliches Calcitonin, sind aus 32 Aminosäuren bestehende Polypeptide mit L-Cystein als ersten und siebten Baustein, dessen Seitenketten unter Ausbildung einer Disulfidbrücke miteinander verbunden sind. Carbocalcitonine weisen an den genannten Positionen kein L- Cystein auf. Stattdessen wird die siebte Position von einer L-α- Aminosuberinsäure (Asu) mit der Formel
besetzt, dessen ω-Carboxylgruppe mit der endständigen Aminogruppe unter Ausbildung einer zyklischen Struktur verbunden ist.
Zum selektiven Schließen des Ringes zwischen der Asu-Seitenkette und dem abschließenden Aminogruppenende, wodurch Nebenreaktionen verhindert werden, ist es erforderlich, die Asu-Seitenkette mit einer zum Rest sowie zur Peptid-Harzverbindung orthogonalen Gruppe zu schützen. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Erhalt eines neuen Derivats der Aminosuberinsäure mit einer durch eine Allylgruppe geschützten Seitenkette sowie einer mittels Fmoc geschützten Aminogruppe.
Diese Schutzgruppe wird mittels Palladiumkatalyse beseitigt und ist vollständig orthogonal zu den anderen Schutzgruppen sowie zu der Peptid-Harzbindung (Green T. W. Protective Group in Organic Synthesis, Wily; New York, 1981, S. 169).
Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren (Diagramm 1) zum Erhalt von Carbocalcitonin mit folgender Strukturformel:
wobei AA&sub2;&sub5; für Asp oder Asn, AA&sub2;&sub6; für Val oder Thr und AA&sub2;&sub8; für Ala oder Ser steht.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Carbocalcitonin bereit, das auf die Festphasensynthese unter Verwendung der Fmoc/tBu-Schutzgruppenmethode (mit passend funktionalisierten Trägern) und in Kombination mit einer konvergierenden Strategie gemäß dem folgenden Diagramm 1 basiert: Diagramm 1
mit-®:
Bezug nehmend auf Diagramm 1 besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus der Kondensation des Fragments 1, eines dem Carbonsäureamid-Ende der Carboxylcalcitoninsequenz entsprechenden Docosapeptids, das auf übliche Weise geschützt und an Harz verankert ist, mit Fragment 2, einem dem Amino-Ende der Carboxylcalcitoninsequenz entsprechenden Nonapeptid, wobei der Ringschluss zwischen den Asu&sup9;- und Ser¹-Bausteinen zum Erhalt des Fragments 6 bereits vollzogen wurde. Eine andere Möglichkeit besteht in der Verknüpfung des ebenfalls zyklischen Fragments 3 mit Fragment 1, wodurch Fragment 7 erhalten wird. Alle gemachten Ausführungen beziehen sich auf das Diagramm 1.
Nach der Herstellung des vollständigen Peptid-Skeletts (Fragment 6 oder 7) wird das bereits in zyklischer Form vorliegende Peptid durch eine Säurebehandlung vom Harz abgelöst und von sämtlichen Schutzgruppen befreit. Nach anschließender Reinigung erhält man chemisch reines Carbocalcitonin.
Insbesondere die zu den Fragmenten 6 oder 7 führende Kondensation des Fragments 1 mit Fragment 2 oder 3 (Diagramm 1) wird mit Hilfe üblicher und bereits beschriebener Verfahren der Festphasensynthese durchgeführt. Nach vollständiger Kondensation wird das Peptid-Harz einem Verfahren unterworfen, bei dem unter Verwendung von Trifluoressigsäure und in Gegenwart von Carbokationenfängern gleichzeitig die Schutzgruppen von den Seitenketten entfernt und das Harz abgespalten wird. Das erhaltene Rohprodukt wird mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie 1(HPLC) und Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Zum Erhalt von ungebundenem Carbocalcitonin werden homogene Fraktionen ausgewählt, vereinigt und gefriergetrocknet.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren gemäß dem folgenden Diagramm 2 durchgeführt: Diagramm 2
wobei R wie zuvor definiert ist.
Gemäß Diagramm 2 kann der Ringschluss auch nach der Kondensation vollzogen werden. Hierfür kommen zwei Möglichkeiten in Betracht: Kondensieren des dem Docopeptid entsprechenden Fragments 1 mit Fragment 4 zum Erhalt des Fragments 9 oder mit Fragment 5 zum Erhalt des Fragments 10, wie in Diagramm 2 gezeigt ist. Abweichend hierzu kann Fragment 10 mittels linearer Synthese hergestellt werden, also durch die Aneinanderreihung eines Aminosäurebausteins an den anderen bis zur kompletten Sequenz, wie in Diagramm 3 gezeigt ist.
Nach Erhalt des den Fragmenten 9 oder 10 entsprechenden Skeletts werden die Schutzgruppen der Amino-Endung des Harzes (Beseitigung der Fmoc-Gruppe) und der Asu-Seitenkette (Beseitigung der Allylgruppe) entfernt. Der Ringschluss am Harz führt zu den Fragmenten 6 oder 7 Anschließend wird in beiden Fällen das Peptidharz zur Schutzgruppenentfernung und zum Freisetzen des Peptids vom Harz bei Anwesenheit von Carbokationenfängern mit Trifluoressigsäure behandelt. Nach der Reinigung erhält man ungebundenes Carbocalcitonin.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung und wie zuvor erwähnt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhalt der besagten Fragmente 1, 2, 3, 4, 5 sowie der Peptidharze als Vorgänger der Fragmente 2, 3, 4, 5 bereit, die alle in den oberen Diagrammen 1 und 2 zur erfindungsgemäßen Herstellung von Carbocalcitonin verwendet wurden.
Die Fragmente 1, 3 und 5 werden ausgehend von Paramethylbenzhydrilaminharz (pMBHA) durch das Einfügen eines inneren Standards sowie einer Brückengruppe (Halter) zwischen das Harz und den Aminosäuren der jeweiligen Sequenzen bereitgestellt.
Zur Herstellung des Fragments 1 und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass das abschließende Carbonsäureende von Carbocalcitonin ein Carbonsäureamid ist, ist die eingeführte Brückengruppe oder der Halter [1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxy-formamid]methyl-3,5-dimethoxyphenoxy-valeriansäure (Fmoc-PAL) (Albericio ei al. J. Qrg. Chem. (1990), 55, 3730) oder alternativ p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9- yl)methoxy-formamid]-2,4-d imethoxybenzylj-phenoxyessigsäure (Fmoc-AM) (Atherton et al. J. Am. Chem. Soc., (1975), 97, 6584). An das Einfügen der Brückengruppe schließt sich unter fortwährender Verwendung von Fmoc als Schutzgruppe für das Aminoende eine lineare Synthese, Baustein auf Baustein, bis zur Einfügung der 22 Aminosäuren an. Für die Seitenketten Lys, Ser, Thr, Tyr, Arg, Glu, His, Gln, Asn und Asp wurden die in dem nachfolgenden Diagramm 3 verdeutlichten Schutzgruppen verwendet: Diagramm 3
wobei R wie zuvor definiert ist.
Zur Herstellung der Fragmente 2 und 4 und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass das abschließende Carboxyende eine Carbonsäuregruppe sein muß, wird [4-(hydroxymethyl)phenoxymethylcopoly(styrol-1%divinylbenzol] (Wang-Harz) (Lit. S.: Wang. JACS 1973, 95, 1328) als Harz verwendet.
Zur Herstellung der Fragmente 3 und 5 und wieder unter Berücksichtigung der Tatsache, dass das abschließende Carboxyende eine Carbonsäuregruppe sein muß, ist die eingeführte Brückengruppe oder der eingeführte Halter 4(4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)- buttersäure, bekannt als Rinikerhalter (Riniker handle) (HMPB) (Flörsheimer et al.). An das Einfügen der Brückengruppe schließt sich in beiden Fällen unter fortwährender Verwendung von Fmoc als Schutzgruppe für das Aminoende und tBu für die Seitenketten Ser, Thr eine lineare Synthese, Baustein auf Baustein, bis zur neunten Aminosäuren an, wie in dem nachfolgenden Diagramm 4 verdeutlicht ist: Diagramm 4
Gemäß dem vorhergehenden Diagramm und den Diagrammen 1 und 2 kann der Ringschluss des Nonapeptids vor oder im Anschluss an seine Einfügung an das aus 22 Aminosäuren bestehende Fragment (Fragment 1) vollzogen werden. Dazu müssen die Schutzgruppen der Asu-Seitenketten entfernt werden. Dies wird - wie bereits erwähnt - mittels einer Pd-Katalyse bewerkstelligt. Weiterhin muss die Schutzgruppe des abschließenden Amino-Endes entfernt werden, wobei die Fmoc-Gruppe mit Piperidin/DMF beseitigt wird. Der Ringschluss wird mit Amid-Bindungen ausbildenden Standardverfahren und insbesondere mit DIPCDI durchgeführt.
Noch einmal Bezug nehmend auf Diagramm 4 können die gleichen, oben beschriebenen Schritte auch mit einem Nonapeptid durchgeführt werden, dessen Schutzgruppen teilweise entfernt wurden, d. h. ohne die tBu-Gruppen (Fragmente 2 und 4), wobei mit Wang-Harz wie in dem Diagramm gezeigt gearbeitet wird.
Die in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
AcOH: Essigsäure
AcOEt: Ethylacetat (Essigsäureethylester)
Al: Allyll
Ala: L-Afanin
AM: p-[(R,S)]-2,4-Dimethoxybenzyl]-phenoxyessigsäure
Arg: L-Arginin
Asn: L-Asparagin
Asp: L-Asparaginsäure
Asu: L-α-Aminosuberinsäure
Boc: t-Butoxycarbonyl
DCM: Dichlormethan
DMF: N,N'-Dimethylformamid
DIEA: N,N'-Diisopropylethylamin
DIPCDI: Diisopropylcarbodiimid
DMAP: Dimiethylaminopyridin
DMF: N,N' Dimethylformamid
EDT: 1,2-EEtharichthiol
Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Fmoc OSu: 9-Fluorenyllrnethoxycarbonyl N-Hydroxysuccinimidester
Gln: L-Glutamin
Glu: L-Glutaminsäure
Gly: L-Glycin
HBTU: 2-(1 H-Benzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluronidhexafluorophosphat
His: L-Histidin
HMPB: 4(4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)-buttersäure
HOBT: N-Hydroxybenzotriazol
HPLC: Flüssigchromatographie unter Hochdruck (high pressure liquid chromatography)
Ile: L-isoleucin
Leu: L-Leucin
Lys: L-Lysin
MeOH: Methanol
PAL: Aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxy-vaferiansäure
pMBHA: para-Methylbenzhydrilamin
Pmc: 2,2,5,7,8-F'entamethylchroman-6-sulphonyl Pro: L-Prolin
PyBOP: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pirrodolin-phosphonid hexafluorophosphat
Ser: L-Serin
tBu: tert-Butyl
TFA: Trifluoressigsäure
THF: Tetrahydrofuran
Thr: L-Threonin
TLC: Dünnfilmchromatographie
Tos: Tosyl
Trt: Trityl
Tyr: L-Tyrosin
Val: L-Valin
Die Erfindung wird nachfolgend anhand nicht beschränkender Beispiele verdeutlicht, bei denen AA&sub2;&sub5; = Asp oder Asn, AA&sub2;&sub6; = Val oder Thr, AA&sub2;&sub8; = Ala oder Ser(tBu) ist.

Beispiel 1

Schutz der Seitenketten der Aminosuberinsäure (Asu). Herstellen von ω-Allylester der L-α-Aminosuberinsäure.
1,134 g (6 mmol) einer L-α-Aminosuberinsäure werden in 30 ml Allylalkohol gelöst (zuvor über einem 3A-Sieb getrocknet). 1,9 ml (15 mmol) Chlortrimethylsilan werden der Suspension unter einer Stickstoffatmosphäre tröpfchenweise zugesetzt und die erhaltene Lösung 20 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttlet, wobei der Reaktionsfortgang mittels TCL (AcOEt/AcOH 99/1) überprüft wird. 200 ml eines kalten Diethylethers werden beigemengt und der auftretende Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt. Er wird anschließend wieder in Ether gelöst, woraufhin sich der gleiche Vorgang zweimal wiederholt. Man erhält 915 g eines weißen, dem Hypochlorid des Produkts entsprechenden Feststoffs. Die Lösung wird gekühlt (+4ºC) und der auftretende Niederschlag ebenfalls zentrifugiert und mit Ether gewaschen, um zusätzliche 135 mg des Produktes zu erhalten. Die Gesamtausbeute beträgt 66%.
¹H NMR (CD&sub3;OD, 200 MHz) δ: 5,93 (ddt, 1H, -CH=CH&sub2;), 5,4-5,15 (m, 2H, -CH=CH&sub2;), 4,58 (d, 2H, J = 5,5 Hz, COO-CH&sub2;), 3,97 (t, 1 H, J = 6 Hz, CH-COOH), 2,33 (t, 211, J = 7,32 Hz, CH&sub2;-COO), 2,05-1,3 (m, 8H, CH- CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;).

Beispiel 2

Schutz der α-Aminogruppe der L-α-aminosuberinsäure. Herstellen von Fmoc-Asu (OAI)-OH

1,05 g (3,9 mmol) Asu(OaI)-HCL werden in 25 ml einer wässerigen Na&sub2;CO&sub3;-Lösung gelöst, wobei sichergestellt wird, dass der pH den Wert 10 nicht überschreitet. Die erhaltene Lösung wird auf 0ºC abgekühlt und eine Suspenson von 1,31 g (3,9 mmol) Fmoc-OSu in 6,5 m( Aceton tröpfchenweise zugesetzt. Die Suspension wird eine Stunde lang gleichmäßig geschüttelt und bei der gleichen Temperatur gehalten. Nach dem Ablauf dieser Zeitdauer wird sie zum Erreichen der Raumtemperatur sich selbst überlassen. Die Reaktion wird mit TLC (CHCl&sub3;/MeOH/AcOH 90/8/2) überprüft. Nach drei Stunden ist die Suspension verschwunden und eine transparente Lösung wird beobachtet. Die Lösung wird auf eine Mischung aus Wasser und Eis geschüttet und mit Diethylether gewaschen (4 · 30 ml). Die wässerige Phase wird auf 0ºC gefühlt und auf einen pH = 5,5 unter Verwendung einer verdünnten HCl-Lösung angesäuert, wobei die Ausfällung von Fmoc-Asu(OAI)-C)H beobachtet wird. Die Suspension wird mit AcOEt (4 · 100 ml) extrahiert, wobei jede Extraktion erneut angesäuert wird, um einen pH von 5,5 aufrecht zu erhalten. Die vereinigten organischen Phasen werden über MgSO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel bei geringem Druck beseitigt. Dabei erhält man ein Öl, aus dem sich unter Kristallisation das Produkt in Form eines weißen, krümeligen Feststoffs (1,39 g179% Ausbeute) ergibt.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 200 MHz) δ: 8,07 (breit), 7,8-7,2 (m, 8H), 5,9 (ddt, 1H, -CH=CH&sub2;), 5,4 (d, 1 H, J = 9,7 Hz CH (Fmoc)), 5,35-5,15 (m, 2H, -CH=CH&sub2;), 4,58 (d, 2H, CH&sub2;-COO-CH,), 4,43 (dd, 2H, CH&sub2; (Fmoc)), 4,21 (t, 1H, CH-COOH), 2,34 (t, 2H, J = 7,6 Hz, CH&sub2;-COO-), 2-1,2 (m, 8H, CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-COO-).

Beispiel 3

Einfügen eines inneren Standards. Herstellen von BocIIe-pMBHA.

1,658 g (6,9 mmol) BocIIe werden 4 g eines p-Methylbenzhydrilamin- Harzes von 0,69 mmol/g Harz als innerer Standard mittels eines nachfolgend beschriebenen Syntheseprogrammes zugefügt:
Das Auftreten freier Amine ist zu überprüfen. Liegen solche vor, muss der Ankopplungsprozess wiederholt werden.

Beispiel 5

Einfügen der ersten Aminosäure. Herstellen von Fmoc Gly-Riniker- Halter-IIe-pMBHA.

Das Einfügen der ersten Aminosäure, in diesem Fall Glycin, beinhaltet die Bildung einer esterartigen Bindung zwischen dem Halter und dem Fmoc Gly-Derivat. Für diese Art des Einfügens wird das Harz mit 4,1 g (5 Äquivalenten) Fmoc Gly in Anwesenheit von 168 mg (0,5 Äquivalenten) DMAP und 2,094 ml (5 Äquivalenten) DIPCDI in DMF 90" zur Reaktion gebracht. Sobald die Reaktion vollständig abgelaufen ist, wird das Harz fünfmal mit DMF gewaschen. Die Aminosäurenanalyse einer Säurehydrolyse des Harzes ergibt das Verhältnis zwischen der Ile-Aminosäure (innerer Standard) und ersten Aminosäure Gly. Auf diese Weise wird die normalerweise zwischen 0,35 und 0,69 mmol/g variierende, wirkliche Funktionalisierung des Harzes bestimmt.

Beispiel 6

Einfügen der ersten Aminosäure an Wang-Harz. Herstellen von Fmoc- Gly-Wang-Harz.

Dies erfordert die gleichen Schritte wie diejenigen des Beispiels 5 mit der Ausnahme, dass die Aminosäureanalyse auf Grund der Abwesenheit des inneren Standards nicht durchgeführt wird.

Beispiel 7

Einfügen der restlichen Aminosäuren. Herstellen von

Beispiel 4

Einfügen des Riniker-Halters. Herstellen von 4(4-Hydroxymethyl-3- methoxyphenoxy)-buttersäureamid-IIe-pMBHA.

Anschließend erfolgt das Einfügen von 4(4-Hydroxymethyl-3- methoxyphenoxy)-buttersäure, die auch als Riniker-Halter (HMPB) bekannt ist. Dies wird durch Umsetzen von 4 g des Harzes (fNH2 = 0,69 mmol/g des Harzes), das zuvor mit dem inneren Standard funktionalisiert wurde, mit 1 g (4,14 mmol, 1,5 Equivalente) 4(4- Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)-buttersäure, 0,62 g (4,14 mmol, 1,5 Equivalente) HOBt und 641 ul (4,14 mmol, 1,5 Equivalente) unter Verwendung von DMF als Lösungsmittel durchgeführt. Die Reaktionszeit beträgt 90'. Nach Ablauf dieser Zeit wird das Harz fünfmal mit DCM gewaschen, wobei das sogenannte Kaiser-Verfahren zum Einsatz gebracht wird-:

FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly- Riniker-Halter-IIe-pMBHA

oder

FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly- Wang-Harz

Das Einfügen der restlichen Aminosäuren wird durch das nachfolgend beschriebene Syntheseprogramm durchgeführt:
Überprüfung mit Ninhydrin, falls + zurück zu 5, falls - zurück zu Schritt 1 und mit der nächsten Aminosäure fortfahren.
Zur Auswertung der synthetischen Reinheit des vollständig von Schutzgruppen befreiten 1-9 Peptids werden 20 mg des H-Ser(tBu)- Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly-Riniker-Halter-IlepMBHA mit 900 ul TFA, 50 ul Thioanisol, 30 ul EDT und 20 ul Anisol zwei Stunden lang in einem mit einer Filterplatte ausgerüsteten Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur behandelt. Das Filtrat wird in einer Röhre mit kaltem, trockenem Diethylether gesammelt. Der Niederschlag des freien Peptids stellt sich ein, wobei die Schwebeteilchen nach dem Zentrifugieren dekantiert werden. Zur Beseitigung von Zusatzstoffen (EDT, Thioanisol, Anisol) wird das Pellet noch einmal in kaltem trockenem Ether resuspendiert. Dieser Vorgang wird fünfmal wiederholt. Anschließend wird das Pellet getrocknet und in 1 ml einer 10%igen Essigsäurelösung gelöst. 40 ul der Peptid-Lösung werden einer HPLC mit einem Gradienten von 5-85% B mit A: 0,045% TFA in H&sub2;O und B: 0,035% TFA in CH&sub3;CN, Vydac C18 5 um, 25 · 0,46 cm zugeführt. Eine Aminosäurenanalyse einer dreistündigen Hydrolyse des Peptid-Harzes bei 150ºC mit einer HCL/Propansäuremischung ergibt die folgende Zusammensetzung: Asp 1,01 (1), Thr 0,8 (1), Ser 1,8 (2), Gly 1,2 ('1), IIe 1,5-1 (1), Leu 1,99 (2), Val 0,89 (1), Asu(OAI) 0,95 (1).

Beispiel 8

Entfernung der Schutzgruppen von der α-Aminogruppe des endständigen Aminobausteins (Ser) und von der Seitenkette des Asu- Bausteins. Herstellen von

H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-Gly-HMPB-IIepHBHA

oder

H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu-Val-Leu-Gly-Wang- Harz

An die vollständige Synthese des von Schutzgruppen komplett befreien Peptids schließt sich die Schutzgruppenentfernung von der Aminogruppe des endständigen Bausteins an (geschützt mit Fmoc). Diese Schutzgruppenentfernung wird durch eine zweimalige, 1 und 5 Minuten lange Behandlung des mit DMF gewaschenen Harzes mit einer 20%-Lösung von Piperidin/DMF durchgeführt. Das Harz wird mit DMF, DCM gewaschen und bei geringem Druck getrocknet.
Anschließend werden die Schutzgruppen der Asu-Seitenkette entfernt. 200 mg des Peptid-Harzes werden unter Heliumatmosphäre in einen mit einer Filterplatte versehenen Reaktor gegeben. Ferner wird eine separate Lösung unter Heilumatmosphäre vorbereitet, die 7 mg Pd (PPh&sub3;)4, 250 nng PPh&sub3; und 200 ul Morpholin, alles gelöst in 3 ml THF, enthält, das zuvor durch Einblasen von Helium entgast wurde. Diese Lösung wird dem Peptid-Harz zugesetzt und die Mischung 60 Stunden unter periodischem Schütteln unter Helium gehalten. Nach Ablauf dieser Zeit wird das Peptid-Harz gefiltert und sorgfältig mit THF, DMF und DCM gewaschen. Schließlich wird es getrocknet. Zur Bewertung des Grades der Entfernung der Allyl-Gruppe werden 20 mg des Peptid-Harzes mit 950 ul TFA, 30 ul DCM und 20 ul Anisol zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einem mit Filterplatte versehenen Reaktor behandelt. Das Filtrat wird in einem Rohr mit getrockenetem kaltem Ether aufgefangen. Der Niederschlag des ungebundenen Peptids wird beobachtet, wobei nach dem Zentrifugieren Schwebeteilchen dekantiert werden. Das Pellet wird noch einmal in kaltem getrockneten Ether resuspendiert. Dieser Vorgang wird fünfmal wiederholt. Anschließend wird das Pellet getrocknet und dann in 1 ml einer 10%igen Essigsäure-Lösung gelöst. 40 ug der Peptid- Lösung werden einer HPLC mit einem Gradienten von 5-85% B mit A: 0,045% TFA in H&sub2;O und B: 0,035% TFA in CH&sub3;CN in einer Vydac- Säule C18 5 um, 25 · 0,46 cm zugeführt. Die Schutzgruppenentfernung variiert um 90%.

Beispiel 9

Ringschluss des 1-9 Peptids am Harz. Herstellen von
oder
Der Ring des 1-9-Fragments wird mit der abschließenden Amino- Gruppe und der Säuregruppe der Seitenkette des Asu-Bausteins gebildet. Dies wird ebenfalls in einem mit Filterplatte versehenen Reaktor durchgeführt 60 mg des Peptid-Harzes, 16,2 pl DIPCDI (6 Äquivalente) und 15,6 ml HOBt (6 Äquivalente) in DMF gelöst, werden zugesetzt. Die Reaktion wird unter Anwendung des Kaiser-Tests überprüft. Nach 21 Stunden wird das Harz gefiltert und mit DMF und DCM gewaschen. Zur Bestimmung des Reinheitsgrades des Peptids wird das gleiche im Zusammenhang mit der Schutzgruppenentfernung des Peptids in Beispiel 8 beschriebene Verfahren durchgeführt.

Beispiel 10

Freisetzen des zyklischen 1-9-Fragments vom Harz. Herstellen von
oder
Das Peptid-Harz H-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(Tbu)-Asu-Val-Leu- Gly-Riniker-Halter-IIe-pMBHA wird mit einer 1%igen Lösung TFA in DCM vier oder fünfmal 15 Minuten lang behandelt. Den Filtraten Pyridin wird bis zu ihrer Neutralisation zugesetzt und DCM bei geringem Druck entfernt. Der erhaltene weiße Feststoff wird mehrfach mit Wasser gewaschen und anschließend getrocknet.
Abweichend hierzu wird das Peptid-Harz H-Ser(tBu)-Asn-Leu- Ser(tBu)-Thr(Tbu)-Asu-Val-Leu-Gly-Wang-Harz mit einer TFA/DCM/Anisol in den Verhältnissen 95 : 3 : 2 enthaltenen Lösung zwei Stunden lang in einem mit einer Filterplatte versehenen Reaktor behandelt. Nach Ablauf dieser Zeit wird die saure Lösung auf kalten getrockneten Ether geschüttet und der auftretende Feststoff durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Feststoff wird zwei- oder mehrmals mit Ether gewaschen und anschließend getrocknet.

Beispiel 11

Freisetzen des vollständig oder teilweise geschützten Nonapeptids vom Harz. Herstellen von:

FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly- OH

oder

FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly-OH

Ein dem vorhergehenden Beispiel entsprechendes Verfahren wird für beide Harze durchgeführt.

Beispiel 12

Einfügen des Fmoc-AM-Halters an Boc-IIe-pMBHa. Herstellen von:

p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxy-formamid]-2,4- dimethoxybenzyl]-phenoxyacetamid-IIe-pMBHA

Es folgt nun das Einfügen von p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9- yl)methoxy-formamid]-2,4-d imethoxybenzyl]-phenoxyessigsäure (Fmoc-AM). Dies wird durch Umsetzen von 4 g zuvor mit dem inneren Standard (gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll) funktionalisierten Harz (0,69 mmol/g des Harzes) mit 2,23 g (4,14 mmol, 1,5 Äquivalente) der p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxy-formamid]- 2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxyessigsäure (Fmoc-AM), 0,62 g (4,14 mmol, 1,5 Äquivalente) HOBt und 641 ul (4,14 mmol, 1,5 Äquivalente) unter Verwendung von DMF als Lösungsmittel durchgeführt. Die Reaktionszeit beträgt 90'. Nach Ablauf dieser Zeit wird das Harz fünfmal mit DCM gewaschen. Der Kaiser-Test wird zur Überprüfung auf freie Amine verwendet. Liegen solche vor, ist das Ankopplungsverfahren zu wiederholen.

Beispiel 13

Einfügen des Fmoc-PAL-Halters an Boc-IIe-pMBHa. Herstellen von:

[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxy-formamid]methyl-3,5-dimethoxyphenoxy-valeriamido-IIe-pMBHA

Es folgt nun das Einfügen von [1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamid]methyl-3,5-dimethoxyphenoxy-valeriansäure (Fmoc-PAL). Dies wird durch Umsetzen von 4 g zuvor mit dem inneren Standard (gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll) funktionalisierten Harz (0,69 mmol/g des Harzes) mit 1,89 g (4,14 mmol, 1,5 Äquivalente) der [1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxy-formamid]methyl-3,5-dimethoxyphenoxy-valeriansäure, 0,62 g (4,14 mmol, 1,5 Äquivalente) HOBt und 641 ul (4,14 mmol, 1,5 Äquivalente) unter Verwendung von DMF als Lösungsmittel durchgeführt. Die Reaktionszeit beträgt 90'. Nach Ablauf dieser Zeit wird das Harz fünfmal mit DCM gewaschen. Der Kaiser-Test wird zur Überprüfung auf freie Amine verwendet Liegen solche vor, ist das Ankopplungsverfahren zu wiederholen.

Beispiel 14

Einfügen der restlichen Aminosäuren. Herstellen von

FmocLys(Boc)-Leu-Se r(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)- Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'&sub2;&sub5;- AA'&sub2;&sub6;-Gly-AA'&sub2;&sub8;-Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-IIe-pMBHA

Das Einfügen der restlichen Aminosäuren wird durch das Befolgen eines Syntheseprogramms wie das Nachfolgende durchgeführt:
Überprüfen mit Ninhydrin, falls + zurück zu Schritt S, falls - fortfahren mit Schritt 1 und der nächsten Aminosäure.
Zur Bestimmung des synthetischen Reinheitsgrades des vollständig von Schutzgruppen befreiten 10-31-Peptids werden 20 mg von FmocLys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu- Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'&sub2;&sub5;-AA'&sub2;&sub6;-Gly-AA'&sub2;&sub8;- Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-IIe-pMBHA mit 900 ul TFA, 50 ul Thioanisol, 30 ul EDT und 20 ul Anisol zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einem mit einer Filterplatte versehenen Reaktor behandelt. Das Filtrat wird in einem Rohr mit kalten getrockeneten Diethylether aufgefangen. Der Niederschlag des ungebundenen Peptids wird beobachtet. Nach dem Zentrifigurieren werden die Schwebeteilchen dekantiert. Zur Beseitigung von Spülmitteln (EDT, Thioanisol, Anisol) wird das Pellet noch einmal in kaltem getrockeneten Ether resuspendiert. Dieser Vorgang wird fünfmal wiederholt. Anschließend wird das Pellet getrocknet und dann in 1 ml einer 10%igen Essigsäurelösung gelöst. 40 ul der Peptid-Lösung werden einer HPLC mit einem Gradienten von 5-85% B mit A: 0,045% TFA in H&sub2;O und B: 0,035% TFA in CH&sub3;CN, Vydac C18 5 um, 25 · 0,46 cm zugeführt. Eine Aminosäurenanalyse einer dreistündigen Hydrolyse des Peptid-Harzes bei 150ºC mit einer HCL/Propansäuremischung ergibt die folgende Zusammensetzung: Asp 1,06 (1), Thr 2,8 (1) oder 4,0 (3 oder 4), Ser 0,96 oder 2,0 (1 oder 2), Glu 3,01 (3), Gly 2,2 (2), Pro 1,98 (2), IIe 0,9 (1), Leu 3,0 (3), Tyr 0,8 (1), His 0,92 (1), Lys 1,8 (2), Arg 1,03 (1), Ala 1,1 oder 0 (1 oder 0), Val 0,97 oder 0 (1 oder 0).

Beispiel 15

Einfügen des geschützten oder ungeschützten und zyklischen Nonapeptids an das Peptid-Harz des geschützten 10-31-Fragments 1. Herstellen von
oder
2,03 g des 10-31 Peptid-Harzes werden drei Minuten lang mit Piperidin/DMF behandelt. Dieser Vorgang wird zwei- oder mehrmals wiederholt und das Harz fünfmal eine Minute lang mit DMF gewaschen. 315 mg (2,5 Äquivalente) HBTU (oder alternativ die mmol-Äquivalente von PyBOP, 431 mg) und 124 mg (2,5 Äquivalente) HOBT, gelöst in DMF, werden dem Harz zugeführt und bilden mit dem Harz eine Phase aus, die so homogen wie möglich ist. 2,5 Äquivalente eines vollständig geschützten zyklischen 1-9 Peptids oder vollständig von Schutzgruppen befreiten zyklischen 1-9 Peptids (741 mg) werden in einer möglichst geringen Menge DMF gelöst und dem Harz zugeführt. Schließlich werden 293 ul (5 Äquivalente) DIEA zugesetzt. Das Harz wird gut geschüttelt bis es homogen wird. Die Reaktion nimmt eine orange Farbe an. Nach 1,5 Stunden zeigt der Kaiser-Test eines einzigen aliquoten Teils des Harzes ein negatives Ergebnis an, so dass die Angliederungsreaktion als vollständig betrachtet werden kann. Das Harz wird mehrmals mit DMF gewaschen und gefiltert.

Beispiel 16

Lineare Synthese des Fragments 10. Herstellen von

FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly- Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu- Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'&sub2;&sub5;-AA'&sub2;&sub6;-Gly- AA'&sub2;&sub8;-Gly-Thr(tBu)-Pro-AM-IIe-pMBHA

Es folgt nun das Einfügen aller Aminosäuren an das Peptid-Harz das gemäß den Beispielen 12 und 13 hergestellt wurde, mit anderen Worten an AM-IIe-pMBHA oder PAL-IIe-pMBHA. Dieses Einfügen sowie die Bestimmung der synthetischen Reinheit des Endprodukts wird auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 14 angedeutet durchgeführt. Eine Aminosäurenanalyse einer dreistündigen Hydrolyse des Peptid-Harzes bei 150ºC mit einer HCL/Propansäuremischung ergibt die folgende Zusammensetzung: Asp 2,08 (2), Thr 3,76 oder 4,2 (4 oder 5), Ser 2,84 oder 3,62 (3 oder 4), Glu 3,01 (3), Gly 3,3 (3), Pro 1,98 (2), IIe 0,9 (1), Leu 4,95 (5), Tyr 0,8 (1), His 0,92 (1), Lys 1,8 (2), Arg 1,03 (1), Ala 1,1 oder 0 (1 oder 0), Val 1,95 oder 0,9 (2 oder 1), Asu(OAI) 0,96 (1).

Beispiel 17

Einfügen des geschützten oder ungeschützten Nonapeptids ohne Ringschluss an das Peptid-Harz mit dem geschützten 10-31 Fragments 1. Herstellen von:

FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly- Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu- Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'&sub2;&sub5;-AA'&sub2;&sub6;-Gly- AA'&sub2;&sub8;-Gly-Thr(tBGu)-Pro-AM-IIe-pMBHA

oder

FmocSer-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu- Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)- Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'&sub2;&sub5;-AA'&sub2;&sub6;-Gly-AA'&sub2;&sub8;-Gly- Thr(tBu)-Pro-AM-IIe-pMBHA

Wende das in dem vorhergehenden Beispiel beschriebene Verfahren an.

Beispiel 18

Entfernung der Schutzgruppe von der endständigen O-Amino-Gruppe und der Seitenkette des Asu Bausteins mit anschließendem Ringschluss des 1-31 Peptids. Herstellen von:
oder
Zur Schutzgruppenentfernung wird das gleiche wie in Beispiel 8 beschriebene Verfahren und für den Ringschluss das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren angewendet.

Beispiel 19

Aufbrechen des Harzes und Schutzgruppenentfernung von einer der Formen des 1-31 Peptids. Herstellen von:
Das getrocknete 1-31 Peptid-Harz wird mit TFA/DCM/Anisol (95 : 3 : 2) zwei Stunden lang bei Raumtemperatur behandelt. Anschließend wird es auf 100 ml kalten und getrockneten Diethylether geschüttet. Der erhaltene weiße Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Feststoff wird noch einmal in die Diethylether resuspendiert und noch einmal zentrifugiert. Dieser Vorgang wird weitere fünf Mal wiederholt. Der in 10%iger AcOH gelöste Festkörper wird mittels eines HPLC-Ansatzes mit einem Gradienten von 5-65% B, mit A: 0,05% TFA in H&sub2;O und B: 0,035% TFA in CH&sub3;CN, Vydac-Säule C 18 15-20 um, 25 · 1 cm, gereinigt.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Carbocalcitonin und seiner pharmazeutisch verwendbaren durch Säurezusatz erhältlichen Salze oder zugehörigen Komplexe durch Synthese in fester Phase auf einem Polymerträger und unter Mitwirkung von Schutzgruppen wie Fmoc 1 tBu kombiniert mit einer konvergierenden Strategie, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kondensieren eines Fragments 1, das aus dem Dokosapeptid besteht, welches dem Carbonsäureamid-Ende der Carbocalcitonin-Sequenz entspricht, und das in Harz verankert und auf übliche Weise geschützt ist:

Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(tBu)-Leu-His(Trt)- Lys(Etoc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)- Thr(tBu)-AA&sub2;&sub5;-AA&sub2;&sub6;-Gly-AA&sub2;&sub5;-Gly-Thr-Pro-®

Fragment 1

mit -®:

1) mit einem Fragment 2, das aus dem dem Amino-Ende der Carbocalcitonin-Sequenz entsprechenden Nonapeptid besteht: und einen herkömmlich gebildeten Ring aufweist, wobei Schutzgruppen für die Ser- und Thr-Seitenketten fehlen

Fragment 2

oder alternativ

ii) mit einem Fragment 3, das ebenfalls aus dem dem Amino-Ende der Carbocalcitonin-Sequenz entsprechenden Nonapeptid besteht und einen gebildeten Ring aufweist, wobei jedoch die Seitenketten der Bausteine Ser und Thr mit der Gruppe tBu geschützt sind

Fragment 3

(b) Aussetzen des aus den Ankopplungs- und Ringschlussreaktionen oder umgekehrt erhaltenen PeptidHarzes insbesondere der Fragmente 6 oder 7:

Fragment 6 --- X = H

Fragment 7 --- X = tBu

einer Säurebehandlung zur Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten sowie zur Abspaltung vom Harz zum Erhalt eines Peptids, welches nach der Reinigung zu chemisch reinem Carbocalcitonin führt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Schritt (a) alternativ das Fragment 1 mit einem Fragment 4,

Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAI)-Val-Leu-Gly-OH,

Fragment 4,

einem Vorläufer des Fragments 2, kondensiert wird, um das einem Fragment 9 entsprechende Peptid-Harz

FmocSerAsn-Leu-Ser-Thr-Asu(OAI)-Val-Leu-Giy-Lys(Boc)- Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu- Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)-Thr(tBu)-AA'&sub2;&sub5;-AA'&sub2;&sub6;- Gly-AA'&sub2;&sub8;-Gly-Thr(tBu)-Pro-®

Fragment 9

zu erhalten, welches einer Reaktion zum Ringschluss und zur Schutzgruppenentfernung unterworfen wird, um das Fragment 6 zu erhalten, welches wiederum der Behandlung zur Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung vom Harz α unterzogen und anschließend gereinigt wird, um chemisch reines Carbocalcitonin zu erhalten.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Schritt a) alternativ das Fragment 1 mit einem Vorläufer von Fragment 2, der einem Fragment 5:

FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAI)-Val- Leu-Gly-OH

Fragment 5

entspricht, kondensiert wird, um das einem Fragment 10:

FmocSer(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asu(OAI)-Val- Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln-Glu(OtBu)-Leu- His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pmc)- Thr(tBu)-AA'&sub2;&sub5;-AA'&sub2;&sub6;-Gly-AA'&sub2;&sub8;-Gly-Thr-Pro-®

Fragment 10

entsprechende Peptid-Harz zu erhalten, welches einer Reaktion zum Ringschluss und zur Schutzgruppenentfernung unterworfen wird, um das Fragment 7 zu erhalten, welches wiederum der Behandlung zur Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung vom Harz unterzogen und anschließend gereinigt wird, um chemisch reines Carbocalcitonin zu erhalten.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment 1 ausgehend von pMBHA-Harz durch Einfügen des inneren Standards (IIe oder Ala) und die Brückengruppe oder -verbindung (AM oder PAL) zwischen dem Harz und der Aminosäurensequenz mit anschließender linearer Synthese, Baustein für Baustein, bis die 22 Aminosäuren eingefügt worden sind, erhalten wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass während der linearen Synthese des aus 22 Aminosäuren bestehenden Fragments die Gruppe Fmoc in allen Fällen für die Amino-Endung verwendet wird und für die Seitenketten Lys, Ser, Thr, Tyr, Arg, Glu, His, Gln, und Asp die Schutzgruppen verwendet werden, die für die besagten Seitenketten in der Formel des oben angegebenen Fragmentes 1 verdeutlicht sind.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fragmente 2, 3, 4 und 5 ausgehend von pMBHA-Harz durch Einfügen des inneren Standards und der Brückengruppe (Riniker oder Wang) zwischen dem Harz und der Aminosäurensequenz mit anschließender linearer Synthese, Baustein für Baustein, bis die 9 Aminosäuren eingefügt worden sind, erhalten werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass während der linearen Synthese des aus Aminosäuren bestehenden Fragmentes 9 die Gruppe Fmoc in allen Fällen für die Amino-Endung verwendet wird und für die Seitenketten Lys, Ser, Thr, C; ys, und Asn die Schutzgruppen verwendet werden, die für die besagten Seitenketten in den oben angegebenen Formeln der Fragmente 2, 3, 4, 5 und 6 verdeutlicht sind.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 und 3 zur Bildung von Carbocalcitoninen, bei dem eine zyklische Struktur zwischen der Carbonsäurenseitenkette von Asu und einer Amino- Funktionalität einer anderen Aminosäure gebildet wird, mit den Schritten

a) Einfügen von Fmoc-Asu(ω-allyl)-OH in ein Polypeptid,

b) Einfügen von wenigstens einer weiteren zusätzlichen Aminosäure in das Polypeptid von Schritt a),

c) Entfernen der ω-allyl-Gruppe von der Carbonsäurenseitenkette von Asu und

d) Ringbildung des Polypeptides, wobei die zyklische Struktur zwischen der Carbonsäurenseitenkette von Asu und einer Aminofunktionalität einer anderen Aminosäure zur Bildung von Carbocalcitonin ausgebildet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Carbocalcitonine aus der aus Lachs-, Aal-, menschlichen, Schweine- und Rinder-Carbocalcitoninen bestehenden Gruppe und einem anderen Proteinen oder Peptid ausgewählt werden, bei dem ein Ring zwischen der Asu-Seitenkette und einem anderen Bestandteil ausgebildet wird.