DE69427185T2

DE69427185T2 - Phase-Stift Kolloide zur Verwendung als Ultraschallkontrastmittel

Info

Publication number: DE69427185T2
Application number: DE69427185T
Authority: DE
Inventors: C. Quay
Original assignee: Sonus Pharmaceuticals Inc
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1993-01-25
Filing date: 1994-01-19
Publication date: 2001-12-06
Anticipated expiration: 2014-01-20
Also published as: PL309986A1; US5876696A; WO1994016739A1; EP0680341B1; ES2158892T3; NO952819L; US5707607A; CN1068230C; CA2154590A1; FI953546A0; NZ262237A; CA2154590C; US5558853A; FI953546L; JPH08508977A; CN1119831A; PL176116B1; JP3621413B2; HU9502163D0; DE69427185D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Kontrastmedien für die Ultraschall-Bilduntersuchung, stabile biokompatible kolloidale Dispersionen zur Verwendung bei Ultraschall-Bilduntersuchungen, Verfahren zur Herstellung lagerfähiger stabiler Kontrastmittel und die Verwendung von Perfluorkohlenstoffen zur Herstellung von diagnostischen Ultraschall- Kontrastmitteln.
Die vorliegende Erfindung betrifft Kontrastmittel für die biomedizinische Verwendung, die wäßrige kolloidale Dispersionen umfassen. Spezieller richtet sich die vorliegende Erfindung auf Flüssig-Flüssig-Emulsionen, bei denen die dispergierte Flüssigkeit einem Temperatur- oder Druck-aktivierten Phasen-Shift von einer dispergiere Flüssigkeit zu einer dispergierten gasförmigen Form unterliegt, die im Hinblick auf die Reflexion von Ultraschallenergie in einer Weise wirksam ist, die diagnostisch von Nutzen ist.
Es wurden schon verschiedene Kontrastmittel zur Verwendung beim diagnostischen Ultraschall, einschließlich der Echokardiographie, beschrieben. Einen Überblick über das Thema wird gefunden in Ophir und Parker, Ultrasound in Med. & Bio. (1989), 15: 319-333. Die akustische Rückstreuung, die durch diese Mittel erzeugt wird, d. h. die Eigenschaft, die typischerweise mit dem Kontrasteffekt assoziiert wird, kann einzigartigen Eigenschaften zugeschrieben werden, die diese als Feststoffe, Flüssigkeiten oder Gase aufweisen. Während Feststoffe und Flüssigkeiten Schall in einem ähnlichen Ausmaß reflektieren, ist bekannt, daß Gase wirksamer sind und die bevorzugten Medien für die Entwicklung von Ultraschall- Kontrastmitteln darstellen.
Bekannte flüssige Mittel für Ultraschall schließen ein Emulsionen und wäßrige Lösungen. Im Hinblick auf diese führen die Autoren der obigen Zusammenfassung aus: "Die Idee einer Verwendung von flüssigen Emulsionen von bestimmten Lipiden in wäßrigen Trägern wurde getestet von Fink et al. (1985). Leider war in diesen Versuchen keine Verstärkung der Rückstreuung beobachtbar".
Bekannte feste Mittel schließen Collagen-Mikrosphären ein. Die schlechte akustische Rückstreuung der Feststoff- Flüssigkeits-Grenzfläche verhindert ihre breite Verwendung.
Bekannte gasförmige Mittel schließen ein Mikroblasen, die durch die Zugabe von verschiedenen amphiphilen Materialien zu den wäßrigen Medien, durch Materialien, die die Viskosität erhöhen, stabilisiert werden, sowie gasförmige Vorläufer, entweder als Feststoffteilchen oder Liposomen. Liposomen können jedoch nur wasserlösliche Gase enthalten und sind daher im Hinblick auf die Stabilität der Mikroblasen, die sie bilden können beschränkt, da eine der charakteristischen physikalischen Eigenschaften von vielen der Chemikalien, die besonders stabile Mikroblasen bilden, eine Unmischbarkeit mit Wasser ist. Die Feststoffteilchen müssen unmittelbar vor ihrer Verwendung rekonstituiert werden, was eine intensive Vorbereitung erfordert, und sie müssen schnell verwendet werden, da die Mikroblasen rasch verschwinden, nachdem die Teilchen vollständig aufgelöst wurden. WO 93/05819 (zitiert im Hinblick auf Artikel 54(3) und (4) EPC) betrifft Verfahren zur Bestimmung der relativen Nützlichkeit von Gasen als Ultraschallkontrastmittel, und identifiziert besonders nützliche Gase für diesen Zweck.
Es wurde eine Untersuchung ermittelt, bei der die Injektion einer Flüssigkeit, die bei einer Temperatur unterhalb der Körpertemperatur des zu untersuchenden Organismus siedet, verwendet wurde, um das Ultraschall-Doppler-Signal zu verstärken (Ziskin MC, Bonakdarpour A, Weinstein DP, Lych PR.: Contrast Agents For Diagnostic Ultrasound. Investigative Radiology 7: 500-505, 1972). Bei dieser Untersuchung wurde eine Anzahl von Lösungen oder Flüssigkeiten intraarteriell in Hunde injiziert, und das Dopplersignal wurde 5 cm unterhalb der Injektionsstelle nachgewiesen. Diese Untersuchung berichtet, daß "Ether, der den größten Kontrasteffekt aller Mittel erzeugte, die wir untersuchten, eine Flüssigkeit ist, die bei der Körpertemperatur heftig siedet und daher als eine sehr aktive Quelle für Blasen wirkt". Die Untersuchung führt ferner aus, daß "Ether jedoch eine toxische Substanz ist, wenn sie in großen Mengen injiziert wird. Injektionen von 20 ml erwiesen sich in unseren Versuchen als tödlich". Dieses Papier diskutiert keine Methoden zur Stabilisierung irgendwelcher Materialien, die für eine spätere Verwendung als Ultraschallkontrastmittel geeignet sind. Nicht-kolloidaler Ether ist für eine intravenöse Verabreichung, wo der größte Bedarf nach einem nützlichen Kontrastmittel existiert, zu toxisch.
Im Hinblick auf die Biokompatibilität von Emulsionen, die Fluorkohlenstoffe enthalten, bestehen starke Sicherheitsbedenken. Beispielsweise geben Clark et al. (Clark L. C, Becattini F., Kaplan S.: Can fluorcarbon emulsions be used as artificial blood? Triangle 11: 115-122, 1972) an, wenn sie von der Wahl von Fluorkohlenstoffen sprechen, daß "ihre Dampfdrucke von 0 bis etwa 0,085 MPa (Null bis etwa 640 Torr) reichen. Diejenigen mit Dampfdrucken über 0,053 mPa (400 Torr) können, selbstverständlich, nicht verwendet werden, da sie sieden würden, wenn man sie in den Blutstrom infundieren würde." Später geben sie in dem gleichen Artikel an: "Wenn ein Fluorkohlenstoff mit einem Dampfdruck von mehr als 6650 Pa (50 Torr) intravenös verabreicht wird, kommt es in wenigen Stunden zum Tod, und wenn der Brustkorb geöffnet wird, kollabieren die Lungen nicht." Der gleiche Autor, L. C. Clark, kommt exakt 20 Jahre später zu ähnlichen Schlüssen: "Wenn man keine praktischen Verfahren finden kann, HNCL (hyperinflated noncollapsible lungs; übermäßig aufgeblähte nicht-kollabierende Lungen) zu verhindern oder dagegen Gegenmaßnahmen zu ergreifen, und wenn HNCL auch bei anderen Spezies auftritt, dann können nur Fluorkohlenstoffe, die oberhalb 150ºC sieden, als sicher angesehen werden"; Clark C. L., Hoffmann R. E., Davis S. L.: Response of the rabbit lung as a criterion of safety for fluorcarbon breathing and blood substitutes, Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 20: 1085- 1099, 1992.
Die Stabilität von Flüssig-Flüssig-Emulsionen stellt ein anderes Problem dar. Bezüglich der Stabilität von Emulsionen und der Möglichkeit, Stabilität aufgrund der Löslichkeit vorauszusagen, existiert ein Fundus an Wissen; die entsprechende Theorie wird "Ostwald-Reifungstheorie" genannt (Kabalnov A. S., Shchukin E. D.; Ostwald Ripening Theory: Applications To Fluorocarbon Emulsion Stability, Advances in Colloid and Interface Science, 38: 69-97, 1992). In diesem Artikel wird einfach angegeben, daß je löslicher die flüssige dispergierte Phase einer Emulsion in der kontinuierlichen Phase ist, desto weniger stabil ist die Emulsion. Die gleichen Autoren testeten die Stabilität einer Dodecafluorpentan-Emulsion bei 25ºC (Kabalnov A. S., Makarov K. N., Shcherbakova O. V.: Solubility of fluorocarbons in water as a key parameter determining fluorocarbon emulsion stability. J. Fluorine Chemistry 50: 271-284, 1990). Sie stellten fest, daß ihre Emulsion eine Ostwald-Reifungsgeschwindigkeit von 1,4 · 10&supmin;¹&sup8; cm³/s aufweist. Wenn man diese Geschwindigkeitskonstante in brauchbare Angaben umrechnet, erhält man, daß die Dodecanfluorpentan-Emulsion von Kabalnow et al., die eine Ausgangsgröße von 211 nm aufwies, eine Wachstumsgeschwindigkeit des mittleren Teilchendurchmessers von 11 nm/s oder 660 nm/min zeigen würde. Bei einer derartigen Geschwindigkeit des Teilchenwachstums hätte eine derartige Emulsion eine Lagerfähigkeit von weniger als 1 min und wäre daher als kommerzielles Produkt nicht verwendbar.
Es besteht daher ein Bedarf nach einer wirksamem Ultraschall- Kontrastzusammensetzung mit einer erhöhten Lagerfähigkeit, die relativ einfach herzustellen ist und die biologisch verträglich ist und bequem zu verwenden ist.
Die Kontrastmedien für die Ultraschall-Bilduntersuchung gemäß der vorliegenden Erfindung werden in den Ansprüchen 1 bis 14 und 20 beschrieben.
Eine stabile biologisch verträgliche Dispersion zur Verwendung bei der Ultraschall-Bilduntersuchung gemäß der vorliegenden Erfindung wird in den Ansprüchen 15 und 16 beschrieben.
Die Ansprüche 17 und 18 beschreiben Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen Kontrastmittels, und Anspruch 19 betrifft die Verwendung eines Perfluorkohlenstoffs zur Herstellung eines diagnostischen Ultraschall-Kontrastmittels.
Um die obigen Anforderungen zu erfüllen, richtet sich die vorliegende Erfindung auf Kontrastmedien in Form stabiler kolloidaler Dispersionen vom Flüssig-Flüssig-Typ. Die Kolloide bestehen aus einer dispergierten Flüssigkeitsphase, die einen Siedepunkt unterhalb der Körpertemperatur des Organismus, bei dem eine Ultraschall-Kontrast-Untersuchung gewünscht wird, typischerweise von etwa 37 bis 40ºC, sieden. Diese Emulsionen sind vorzugsweise aus einer dispergierten Flüssigkeitsphase zusammengesetzt, die einen Siedepunkt zwischen -20 und 37ºC aufweist.
Vorzugsweise ist die dispergierte Flüssigkeitsphase ausgewählt aus der Gruppe von Chemikalien, die besteht aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen, organischen Halogeniden oder Ethern oder Kombinationen davon, die sechs oder weniger Kohlenstoffatome und eine Obergrenze für das Molekulargewicht von etwa 300 aufweisen. Unter den organischen Halogeniden sind die Fluor-haltigen Chemikalien bevorzugt, da sie stabile Emulsionen bilden und relativ nicht-toxisch sind. Besonders bevorzugt sind n-Pentan, Isopentan, Neopentan, Cyclopentan, Butan, Cyclobutan, Decafluorbutan, Dodecafluorpentan, Dodecafluorneopentan, Perfluorcyclopentan und Mischungen davon. Vorzugsweise enthält die kolloidale Dispersion die dispergierte Phase in einer Konzentration von 0,05 bis 5,0% (G/V). Optimal beträgt der Konzentrationsbereich 0,5 bis 3,5% (G/V).
Die kolloidale Dispersion kann durch die Zugabe verschiedener amphiphiler Materialien stabilisiert werden, einschließlich anionischer, nichtionischer, kationischer und zwitterionischer Tenside, die typischerweise die Grenzilächenspannung zwischen der dispergierten Flüssigkeit und Wasser auf unterhalb 26 mN/m (Dyn/cm) absenken. Optimal sind diese Materialien nichtionische, synthetische Tensidmischungen, die ein Fluor-haltiges Tensid enthalten, beispielsweise eines aus der Reihe der Zonyl-Marken, sowie ein nichtionisches Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Glycol-Blockcopolymer.
Die flüssige kontinuierliche Phase der kolloidalen Dispersion umfaßt ein wäßriges Medium. Dieses Medium kann verschiedene Additive enthalten, um die Stabilisierung der dispergierten Phase zu unterstützen oder um die Formulierung biologisch verträglich zu machen. Annehmbare Additive schließen ein Säuerungsmittel, Alkalisierungsmittel, antimikrobielle Konservierungsmittel, Antioxidantien, Puffermittel, Chelatisierungsmittel, Suspendiermittel und/oder Viskositätserhöhende Mittel, einschließlich Trijodbenzol-Derivate wie Iohexol oder lopamidol, und Mittel zur Beeinflussung der Osmolarität. Vorzugsweise werden Mittel zur Steuerung des pH, der Osmolarität und zur Erhöhung der Viskosität verwendet. Optimal wird eine Osmolarität von wenigstens 250 mOsm mit einem Mittel erreicht, das auch die Viskosität erhöht, beispielsweise mit Sorbit oder Saccharose.
Die kolloidalen Dispersionen werden typischerweise dadurch gebildet, daß man eine Suspension der dispergierten Phase in der kontinuierlichen Phase durch die Einwirkung von mechanischer, manueller oder akustischer Energie zerkleinert. Eine Kondensation der dispergierten Phase in der kontinuierlichen Phase ist ebenfalls brauchbar. Die bevorzugte Ausführungsform besteht in der Anwendung einer Hochdruck-Zerkleinerung.
Die Erfindung betrifft Mittel, die den Kontrast in einem Ultraschallbild verstärken, das zur Verwendung in der medizinischen oder tiermedizinischen Diagnose erzeugt wird. Diese Mittel werden von biokompatiblen kolloidalen Dispersionen gebildet, bei denen die dispergierte Phase unter den Bedingungen des Herstellungsverfahrens eine Flüssigkeit ist, jedoch zum Zeitpunkt oder etwa zum Zeitpunkt der Verabreichung an den zu untersuchenden Organismus einem Phasen-Shift unterliegt und zu einem dispergierten Gas oder Kugelschaum wird.
Um ein klares und konsistentes Verständnis der vorliegenden Erfindung und der Ansprüche zu ermöglichen, einschließlich der Breite, die derartigen Begriffen zugemessen wird, werden im Hinblick auf die vorliegende Erfindung die folgenden Definitionen gegeben:
Kolloidale Dispersion: Ein System mit wenigstens einer Substanz als Flüssigkeit oder Gas (die dispergierte Phase), die unmischbar ist und feinzerteilt und gleichmäßig verteilt innerhalb wenigstens einer zweiten Substanz, die das Dispersionsmedium oder die kontinuierliche flüssige Phase bildet, vorliegt.
Biokompatibel: In der Lage, innerhalb oder an einem lebenden Organismus auf eine annehmbare Weise Funktionen zu erfüllen, ohne übermäßige Toxizität oder physiologische oder pharmakologische Effekte.
Flüssigkeit: Der Aggregatzustand der Materie, in dem eine Substanz oder Substanzen eine charakteristische Bereitschaft zu fließen, eine geringe oder keine Tendenz, sich zu verteilen, und eine relativ hohe Inkompressibilität zeigen.
Gas: Derjenige Aggregatzustand der Materie einer Substanz oder von Substanzen, der sich von dem festen oder dem flüssigen Zustand durch eine sehr niedrige Dichte und Viskosität, einer relativ hohe Expansion und Kontraktion bei Veränderungen der Temperatur und des Drucks und die spontane Tendenz, sich gleichmäßig innerhalb irgendeines Behälters zu verteilen, unterscheidet.
Phasen-Shift: Eine Veränderung des Zustands zwischen Flüssigkeit und Gas aufgrund von Veränderungen der Temperatur und/oder des Drucks.
Kugelschaum: Eine der beiden Formen von Schäumen gemäß der Klassifikation von Manegold (Manegold, E. "Schaum, Straßenbau, Chemie und Technik", Heidelberg, 1953). Genauer besteht der Kugelschaum oder sphärische Schaum aus weit beabstandeten sphärischen Blasen und unterscheidet sich von den Polyeder-Schäumen, die aus Blasen bestehen, die eine angenäherte Polyeder-Form aufweisen, und bei denen dünne lamellare Filme mit einer sehr geringen Krümmung die dispergierte Phase trennen.
Niedrigsiedende Flüssigkeit: Eine Flüssigkeit mit einem Siedepunkt, unter Standarddruckbedingungen, von unter 40ºC. Niedrigsiedende Flüssigkeiten, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Kohlenwasserstoffe, organische Halogenide, sowie Ether, wobei in jedem der Fälle das Molekül 6 Kohlenstoffatome oder weniger aufweist.
Aliphatische Kohlenwasserstoffe: Die Gruppe von organischen Verbindungen der Alkane, Alkene, Alkine, Cycloalkane und Cycloalkene. Von diesen sind nur Verbindungen mit Siedepunkten unter etwa 40ºC (wie beispielsweise diejenigen mit 6 oder weniger Kohlenstoffatomen) Teil der vorliegenden Erfindung, d. h. solche, die in der Lage sind, nach der Verabreichung an einen Patienten einem Übergang von der flüssigen in die Gasphase zu unterliegen. Aliphatische Kohlenwasserstoffe, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenigen ein, die aus der chemischen Gruppe, ausgewählt sind: Isobutan, Isobutylen, 1-Buten, 1,3-Butadien, n-Butan, 2-Buten{trans}, 2-Buten{cis}; Vinylacetylen, 1-Butin, Neopentan, Butadün, 1,2-Butadien, Cyclobutan, 3-Methyl-1-buten, 1,1-Dimethylcyclopropan, 4-Methyl- 1,3-dioxolan-2-on, 4-Phenyl-3-buten-2-on{trans}, 1,5-Heptadün, 1,4-Pentadien, 2-Butin, 2-Methylbutan, 1,2-Dimethylcyclopropan{trans, dl}, 3-Methyl-1-butin, 1-Penten, 2-Methyl-1-buten, 2-Methyl-1,3-butadien, 2-Methyl- 1-buten-3-in; Isopren, Ethylcyclopropan, n-Pentan, Methylcyclobutan, 2-Penten{trans}, 2-Penten{cis}, 1,2-Dimethylcyclopropan{cis} sowie 1-Nonen-3-in.
Organische Halogenide: Die Gruppe von solchen Verbindungen, die wenigstens ein Kohlenstoff- oder Schwefelatom und wenigstens ein Halogenatom, d. h. Chlor, Brom, Fluor oder Jod, enthalten. Von diesen sind nur diejenigen Mitglieder der Gruppe Teil der vorliegenden Erfindung, die Siedepunkte unterhalb von etwa 40ºC aufweisen (wie beispielsweise diejenigen mit 6 oder weniger Kohlenstoffatomen), die in der Lage sind, im Zusammenhang mit der Verabreichung an einen Organismus mit einer Körpertemperatur von bis zu 40ºC einem Phasenübergang zu unterliegen. Beispiele für derartige organische Halogenide schließen ein: Tetrafluormethan, Chlortrifluormethan, Hexafluorethan, Perfluorethan, Fluormethan, Tetrafluorethylen, Schwefelhexafluorid, Bromtrifluormethan, Difluormethan und ähnliche Verbindungen.
Ether: Die Klasse organischer Verbindungen, bei denen zwei Kohlenwasserstoff-Gruppen oder Derivate davon durch ein Sauerstoffatom miteinander verbunden sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Beispiel einiger, jedoch in unbedingt aller, Ether, die verwendet werden können: Methylether, Ethylmethylether, Methylvinylether, Methylisopropylether, 1,2-Epoxypropylether, Diethylether, Ethylvinylether und Vinylether.
Fluor-haltige Verbindungen: Eine Verbindung, die wenigstens ein Fluoratom enthält. Einige nützliche Fluor-haltige Verbindungen sind oben als organische Halogenide aufgeführt. Siehe auch die nachfolgenden Beispiele.
Die kolloidalen Dispersionen der vorliegenden Erfindung können Emulsionen oder Mikroemulsionen sein.
Emulsion: Eine kolloidale Dispersion einer nicht-mischbaren Flüssigkeit, die in einer anderen Flüssigkeit in der Form von Tröpfchen dispergiert ist, deren Durchmesser, im allgemeinen, zwischen 100 und 3000 nm liegen, und die typischerweise optisch opak ist, es sei denn, die dispergierte und die kontinuierliche Phase weisen gleiche Brechungsindices auf. Derartige Systeme besitzen eine begrenzte Stabilität, die im allgemeinen durch die Anwendung oder das relevante Bezugssystem definiert wird, die durch Zusatz von amphiphilen Materialien oder Viskositäts-steigernden Mitteln erhöht werden kann.
Mikroemulsion: Eine stabile flüssige monophasische und optisch isotrope kolloidale Dispersion von Wasser und mit Wasser nicht-mischbaren Flüssigkeiten, die durch amphiphile Materialien stabilisiert ist, wobei die Dispersionen feststellbare Lichtstreuungseigenschaften aufweisen (was bedeutet, daß sie optisch klar oder milchig erscheinen können, jedoch rötlich oder gelblich sind, wenn das hindurchtretende Licht beobachtet wird), wobei die Durchmesser der Teilchen im allgemeinen zwischen 5 und etwa 140 nm liegen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die kolloidale Dispersion eines oder mehrere amphiphile Materialien, um die Stabilität der Formulierungen zu verbessern.
Amphiphiles Material: Eine Substanz, die stark an einer Grenzfläche adsorbiert wird und die normalerweise eine drastische Verminderung der Grenzflächenspannung erzeugt, bei kleinen Veränderungen der Hauptphasenkonzentration. Beispiele schließen ein synthetische Tenside, natürlich vorkommende Materialien wie biokompatible Proteine, Lipide, Sterine, Alginate, Cellulose-Derivate und feinverteilte organische oder anorganische teilchenförmige Feststoffe.
Organische teilchenförmige Feststoffe: Sie schließen ein Zucker, Proteine, Aminosäuren, Lipide, Nukleinsäuren und andere.
Anorganische teilchenförmige Feststoffe: Sie schließen ein Aluminiumoxide, Carbonate, Bicarbonate, Silicate, Alumosilicate, Phosphate und andere.
Grenzfläche: Der Bereich oder die Grenze der physikalischen Welt, die zwischen zwei verschiedenen und identifizierbaren Materie-Phasen liegt, hierin beschränkt auf Flüssig-Flüssig, Flüssig-Fest, Fest-Gas und Flüssig-Gas.
Grenzflächenspannung: Die Kraft pro Längeneinheit, die an der Grenzfläche zwischen zwei verschiedenen und identifizierbaren Materiephasen existiert.
Stabilität: Die verstrichene Zeit seit der erstmaligen Herstellung und Verpackung, während der eine kolloidale Dispersion weiterhin alle chemischen und physikalischen Anforderungen bezüglich Identität, Stärke, Qualität und Reinheit erfüllt, die gemäß den Prinzipien einer GMP (Good Manufacturing Practice) festgesetzt wurden, wie von den rechtlichen staatlichen Regulierungsstellen festgesetzt.
Tenside: Die Gruppe amphiphiler Materialien, die durch chemische Verfahren hergestellt oder durch Reinigung aus natürlichen Quellen oder Verfahren erhalten wurden. Diese können anionisch, kationisch, nichtionisch und zwitterionisch sein, wie dem Fachmann gutbekannt ist. Derartige Materialien werden beschrieben in: Emulsions: Theory and Practice, Paul Becher, Robert E. Krieger Publishing, Malabar, Florida, 1965.
Die kontinuierliche Phase der kolloidalen Dispersion der vorliegenden Erfindung ist ein wäßriges Medium.
Wäßriges Medium: Eine wasserhaltige Flüssigkeit, die pharmazeutisch annehmbare Zusätze enthalten kann, wie beispielsweise ansäuernde Mittel, alkalisierende Mittel, antimikrobielle Konservierungsmittel, Antioxidantien, Puffermittel, Chelatisierungsmittel, Komplex-bildende Mittel, Solubilisierungsmittel, Feuchthaltemittel, Lösungsmittel, Suspendier- und/oder Viskositätserhöhende Mittel, tonisierende Mittel, Benetzungsmittel oder andere biokompatible Materialien. Eine tabellarische Aufstellung von Bestandteilen, die durch die obigen Kategorien aufgelistet werden, können gefunden werden in U.S. Pharmacopeia National Formulary, 1990, S. 1857-1859, die durch Bezugnahme in diese Beschreibung aufgenommen wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung von wenigstens einem amphiphilen Material aus der Gruppe vor, die besteht aus biokompatiblen Proteinen, Fluor-haltigen Tensiden, nichtionischen Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Glycol-Blockcopolymeren und Tensiden. Nichtionische Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Glycol-Blockcopolymere: Die Tenside, die von BASF Performance Chemicals, Parsippany, New Jersey unter der Handelsbezeichnung Pluronic erhältlich sind und die aus der Gruppe von Tensiden besteht, die mit dem CTFA-Namen Poloxamer 108, 188, 217, 237, 238, 288, 338, 407, 101, 105, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 212, 231, 282, 331, 401, 402, 185, 215, 234, 235, 284, 333, 334, 335 und 403 bezeichnet werden.
Fluor-haltiges Tensid: Ein Tensid, das eines oder mehrere Fluor-Moleküle enthält. Einige, jedoch nicht unbedingt alle Fluor-haltigen Tenside, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, können aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus: Telomer B enthaltenden fluorierten Tensiden, die von Du Pont, Wilmington, DE unter dem Handelsnamen Zonyl erhältlich sind (einschließlich Zonyl FSA, FSP, FSE, UR, FSJ, FSN, FSO, FSC, FSK und TBS), den fluorchemischen Tensiden von 3M Industrial Chemical Products Division, St. Paul, MN unter dem Handelsnamen Fluorad (einschließlich FC-95, FC-98, FC-143, FC-170C, FC-171, FC- 430, FC-99, FC-100, FC-120, FC-129, FC-135, FC-431, FC-740), die Perfluoralkylpoly(oxyethylen)-Tenside, die von Mathis et al. beschrieben wurden (J. Am. Chem. soc. 106, 6162-6171 (1984)), den Perfluoralkylpoly(oxyethylen)-Tensiden, die beschrieben werden von Mathis et al., (J. Am. Chem. Soc. 106, 6162-6171 (1984)), den Fluoralkylthio-etherpoly(oxyethylen)- Tensiden, die beschrieben werden von Serratrice et al. (J. Chim. Phys. 87, 1969-1980 (1990)), den perfluoralkylierten polyhydroxylierten Tensiden von Zarif et al. (J. Am. Oil Chem. Soc. 66, 1515-1523 (1989), durch Bezugnahme in diese Beschreibung aufgenommen), den Fluor-Tensiden, die von Atochem North America, Philadelphia, PA unter dem Handelsnamen Forafac erhältlich sind.
Biokompatible Proteine: Die Gruppe von Proteinen, die, unabhängig von ihrer Herkunft und ob sie durch Extraktion aus einer Tier, einer Pflanze oder einem mikrobiologischen Gewebe erhalten wurden oder mittels rekombinanter Biotechnologie erhalten wurden, in der Lage sind, ihre Funktion im Hinblick auf eine Stabilisierung der kolloidalen Dispersionen der vorliegenden Erfindung auf annehmbare Weise zu erfüllen, ohne unangemessene Toxizität oder physiologische oder pharmakologische Wirkungen. Einige annehmbare biokompatible Proteine können aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus Albumin, alpha-1-Antitrypsin, alpha-Fetoprotein, Aminotransferasen, Amylase, C-reaktivem Protein, carcinoembryonischem Antigen, Ceruloplasmin, Komplement, Creatinphosphokinase, Ferritin, Fibrinogen, Fibrin, Transpeptidase, Gastrin, Serumglobulinen, Hämoglobin, Myoglobin, Immunoglobulinen, Lactat-Dehydrogenase, Lipase, Lipoproteinen, saurer Phosphatase, alkalischer Phosphatase, alpha-1-Serumprotein- Fraktion, alpha-2-Serumprotein-Fraktion, beta-Protein- Fraktion, gamma-Protein-Fraktion, gamma-Glutamyl-Transferase und anderen Proteinen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der kolloidalen Dispersionen der vorliegenden Offenbarung ist die Zerkleinerung. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung ist die Kondensation.
Zerkleinerung: Das Verfahren der Bildung einer kolloidalen Dispersion durch Vermischen der flüssigen dispergierten und kontinuierlichen Phasen, und anschließend das Bewirken einer Verminderung der Teilchengröße der dispergierten Phase von größeren Teilchen bis zu der erforderlichen Größe, indem man mechanische Energie verwendet, die durch manuelles Mischen, mechanisch oder die Wirkung von Ultraschall erzeugt wird. Ein geeignetes Mischen kann erreicht werden in einem Mikrofluidic Model 110 Microfluidizer-Geräte, wie beschrieben in US-A-4 533 254. Eine annehmbare Alternative ist der Rannie High Pressure Laboratory Homogeniser, Modell Mini-Lab, Typ 8,30H oder eine äquivalente Vorrichtung.
Kondensation: Das Verfahren zur Bildung einer kolloidalen Dispersion, bei dem man mit der dispergierten Phase als Gas beginnt, dieses mit der flüssigen kontinuierlichen Phase in Kontakt bringt und dann eine Zunahme der Größe der Teilchen der dispergierten Phase von einem molekularem Ensemble bis zu der erforderlichen Form bewirkt, im allgemeinen dadurch, daß man einen Phasenübergang des dispergierten Gases zu einer Flüssigkeit induziert, indem man die Auswirkungen von Veränderungen der Systemtemperatur, des Systemdrucks oder von beiden nutzt.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele noch besser verstanden:

Beispiel 1

Daß es kritisch ist, daß die niedrig siedende Flüssigkeit als feinverteilte Dispersion vorliegt, statt als einfache Flüssigkeit, wie von Ziskin et al. (vgl. oben) beschrieben wurde, wurde dadurch bestimmt, daß man die akustische Rückstreuung in den beiden Zuständen maß.
Es wurden zwei Lösungen hergestellt, um die Verabreichung an einen Organismus von entweder einer kolloidalen Dispersion einer niedrigsiegenden Flüssigkeit oder der reinen Flüssigkeit zu simulieren. Diese wurden bei 5,0 MHz mit einem Hewlett Packard Model 77020-Ultraschall-Scanner gescannt, und die erhaltenen Bilder auf einem Sony Es VHS-Band aufgezeichnet. Die Analogbilder von dem Band wurden dann unter Verwendung des Software-Pakets Global Lab Image Software (Data Translation, Marlboro, MA) in digitale Form umgewandelt. Die Grauskala-Intensität innerhalb eines 4900 Pixel (70 · 70 Pixel großen) Abschnitts von Interesse wurde dann gemessen vor und nach der Injektion der kolloidalen Dispersion von Beispiel 19 oder einer Menge an reinem Dodecafluorpentan in einen 1000 ml Wasserbecher, der auf eine Gleichgewichtstemperatur von 37ºC gebracht worden war.
Die Messungen wurden bei einer Grauskala von 2 bis 254 durchgeführt. Die Bildintensität vor der Injektion eines 0,1 ml Aliquots der Emulsion von Beispiel 19 weiter unten (die 3,4 umol Dodecafluorpentan enthielt) betrug 4,27. Die Injektion von 0,1 ml dieser Emulsion erzeugte eine Intensitätsveränderung auf 236 5 Sekunden nach der Injektion, und auf 182 52 Sekunden nach der Injektion.
Der gleiche Versuch wurde mit einer 0,2 ml Injektion von reinem Dodecafluorpentan durchgeführt. Dieses entspricht 1111 umol Dodecafluorpentan, d. h. über 300-mal die Menge im obigen Experiment. Die Bildintensität vor der Injektion betrug 4,9; diese stieg auf 7,7 5 Sekunden nach der Injektion an und betrug 5,0 52 Sekunden nach der Injektion.
Ein Vergleich dieser beiden Versuche (Intensität/Quantität) zeigt, daß die kolloidale Dispersion 27 000-fach wirksamer ist im Hinblick auf die Rückstreuung des Ultraschallstrahls als einfach eine Verabreichung einer Flüssigkeit, die ebenfalls einem Flüssigkeit-Gas-Phasenübergang unterliegt.

Beispiel 2

Die Auswahl einer geeigneten Chemikalie für die flüssige dispergierte Phase wird teilweise von der Körpertemperatur des mittels Ultraschall zu untersuchenden Organismus bestimmt. Da beispielsweise die Körpertemperatur des Menschen 37ºC beträgt, sind Flüssigkeiten, die einem Flüssigkeits-Gas- Phasenübergang, d. h. einem Sieden, bei oder unterhalb 37ºC unterliegen, besonders nützlich in den kolloidalen Dispersionen der Erfindung. In ähnlicher Weise kann die nachfolgende Tabelle als Richtschnur für die Auswahl der flüssigen dispergierten Phase verwendet werden, und zwar in Abhängigkeit davon, welcher Organismus studiert werden soll:

Organismus Rektaltemperatur (Grad Fahrenheit)

Schwein (Sus scorfa) 101,5-102,5
Schaf (Ovis sp.) 101-103
Kaninchen (Oryctolaqus cuniculus) 102-103,5
Ratte (Rattus norvegicus) 99,5-100,6
Affe (Macaca mulatta) 101-102
Maus (Mus musculus) 98-101
Ziege (Capra hircus) 101-103
Meerschweinchen (Cavia porcellus) 102-104
Hamster (Mesocricetus sp.) 101-103
Mensch (Homo sapiens) 98,6-100,4
Pferd (Equus sp.) 101-102,5
Hund (Canin familiaris) 101-102
Pavian (Papio) 98-100
Katze (Felis catus) 101-102
Rind (Bos taurus) 101,5-102,5
Schimpanse (Pan) 96-100

Beispiel 3

Eine kolloidale Dispersion wurde dadurch hergestellt, daß man, unter Verwendung des Verfahrens und der Kriterien von Beispiel 45 weiter unten, ein organisches Halogenid feinzerteilt.
Genauer wurde eine 100 ml-Menge einer Formulierung hergestellt, die enthielt: Poloxamer 488, 2,5 Vol.-%; das fluorhaltige Tensid Zonyl FSN 2,5 Vol.-%, Natriumperfluoroctanoat, pH 7,0, 0,1 (G/V); Natriumchlorid, 0,9% (G/V), und Dodecafluorpentan, 2,0 Vol.-%. Nach einem Mischen bei niedriger Scherung wurden diese in einem Microfluidizer Modell 110Y bei 4ºC in acht Durchgängen feinverteilt. Die milchige Emulsion wurde in gleichen Teilen auf Serumampullen aufgeteilt und verschlossen.
Innerhalb von 72 h wurden die Teilchengröße und die Teilchenverteilung bei 19ºC unter Verwendung des Nicomp-Modell 370 (Nicomp Particle Sizing, Santa Barbara, CA) bestimmt. Der mittlere Durchmesser der Gausschen Analyse der Emulsion betrug 90,1 nm (zahlengemittelt) mit einer Standardabweichung von 48%. Der gewichtsgemittelte mittlere Durchmesser betrug 316 nm.

Beispiel 4

Die Teilchengröße und die Teilchenverteilung wurden auf verschiedenen Stufen oder bei unterschiedlichen Bedingungen während der Formulierung einer Emulsion bestimmt.
Eine 20 ml-Menge einer Emulsion wurde formuliert, die Natriumperfluoroctanoat, pH 7,2, 2,5%ig (G/V) und Dodecafluorpentan, 2% (GV) enthielt. Diese Bestandteile wurden Wasser zugesetzt, und die Suspension auf 4ºC abgekühlt. Zum "Vormischen" der Lösung vor der endgültigen Feinzerkleinerung wurde das Emulsiflex-1 000-Gerät (Avestin, Inc., Ottawa, Kanada) verwendet.
Im Anschluß an 20 Durchgänge der Lösung zwischen zwei 10 ml- Spritzen wurde die weiße, milchige Suspension in den Nicomp 370 gegeben, um die Teilchengröße zu bestimmen. Diese Vormischungs-Suspension hatte eine mittlere Teilchengröße (zahlengemittelt) von 452 nm und (volumengemittelt) von 2398 nm.
Die endgültige Emulsion wurde dann dadurch gebildet, daß man eine Feinzerteilung in acht Durchgängen mit dem Emulsiflex- 1 000 (Avestin, Inc. Ottawa, Kanada) durchführte, der manuell bei einem Druck von bis zu 7 MPa arbeitete. Die Emulsionsteilchen waren sehr viel kleiner, mit einem zahlengemittelten mittleren Durchmesser von 201 nm und einem volumengemittelten mittleren Durchmesser von 434 nm.
Ein aseptisches Abfüllen des Materials wurde dadurch erreicht, daß man das Material durch einen 0,45 um (Micron) sterilen Filter hindurchließ (Gelman Acrodisc, Ann Arbor, MI). Die endgültige sterile kolloidale Dispersion wies einen zahlengemittelten mittleren Durchmesser von 160 nm auf.

Beispiel 5

Die Messung der mittleren Teilchengröße einer Emulsion unmittelbar nach der Feinverteilung ist ein nützlicher Test für die endgültige Stabilität der Formulierung. Die folgenden Emulsionen illustrieren diesen Punkt:
Eine 2%ige (V/V) Dodecafluorpentan-Emulsion wurde formuliert, die 2% Pluronic P-123 und 2,6% Zonyl FSO enthielt, nach dem Verfahren des nachfolgenden Beispiels 19. Der mittlere Teilchendurchmesser betrug 151 nm, mit einer 35%igen Standardabweichung. Diese Emulsion war wenigstens 6 Wochen stabil, und zwar nach Beurteilung des physikalischen Aussehens und der Teilchengröße.
Zu der gleichen Formulierung wurden 0,25% Natriumperfluoroctanoat zugegeben. Obwohl spekuliert worden war, daß das eine weitere Stabilisierung der Formulierung bewirken könnte, da diese Zugabe die Grenzflächenspannung vermindert, kann die hohe anionische Ladungsdichte, die dieses Tensid an der Emulsions-Grenzfläche erzeugen könnte, in Wirklichkeit die Erzeugung kleiner Teilchen verhindern. Tatsächlich ergaben die sofortigen Teilchengrößenmessungen eine mittlere Teilchengröße von 1060 nm mit einer Standardabweichung von 106%. Diese Emulsion verschlechterte sich in wenigen Tagen.

Beispiel 6

Die Teilchengrößenverteilung einer Emulsion kann durch Zentrifugieren gemessen werden. Eine Probe der Emulsion des Beispiels 19 weiter unten wurde in den Horiba CAPA-700 Particle-Analyser (Horiba Instruments, Irvine, CA) gegeben. Die Teilchengrößenverteilung auf der Basis der Annahme, daß die Teilchen eine Dichte von 1,66 g/cm³ aufweisen, war wie folgt:

Teilchengrößenverteilung (um) Vol.-%

0,0 - 0,5 12
0,5 - 1,0 26
1,0 - 1,5 22
1,5 - 2,0 15
2,0 - 2,5 7
2,5 - 3,0 0

Beispiel 7

Die Langzeitstabilität der Emulsionen der vorliegenden Erfindung wurde bestimmt. Die in Beispiel 19 weiter unten beschriebene Emulsion wurde unter Verwendung des Nicomp 370 bei 19ºC eingegeben, und die Teilchengröße wurde in Intervallen bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle enthalten.

Zeit Mittlerer Teilchendurchmesser (Tage) (nm)

5 194
13 216
19 245
27 258
33 289
41 283
47 306
61 335
89 305
Diese Emulsion wuchs anfangs rasch von 194 auf 289 nm innerhalb des ersten Monats. Danach hat das Wachstum jedoch im wesentlichen aufgehört. Die Extrapolation der Kurve einer graphischen Darstellung von Durchmesser gegen Zeit stützt eine wenigstens einjährige Stabilität für diese Emulsion.

Beispiel 8

Die Emulsion aus Beispiel 42 weiter unten wurde verwendet, um die Bilderzeugungsfähigkeiten dieser kolloidalen Dispersionen, die auf verschiedenen Wegen verabreicht wurden, zu testen. Ein etwa 20 kg Mischlingshund wird mit Natriumbarbiturat betäubt und für die Ultraschalluntersuchung nach dem Verfahren vorbereitet, das in Beispiel 38 beschrieben wird.
Eine intravenöse Injektion von 0,2 ml/kg lieferte ein starkes Kontrastsignal in den rechten und linken Herzkammern innerhalb der ersten Minute im Anschluß an die Injektion. Dosen von 0,5 ml/kg erzeugten ein starkes Dopplersignal in allen untersuchten Organen, einschließlich des Gefäßsystems, der Leber, der Nieren, des Herzens und der Gefäße des zentralen Nervensystems.
Eine 0,5 ml-Injektion entweder auf intradermalem, intrakutanem oder intramuskularem Weg erzeugte einen lokalen Kontrast, der die Untersuchung des Muskelskelettsystems erlaubte.
Eine 1000 ml-Lösung, hergestellt durch Verdünnen von 50 ml der Emulsion von Beispiel 42 in 950 ml einer Salzlösung wurde oral verabreicht, was zu einer wirksamen intragastrischen und intraduodenalen Intraluminal-Verabreichung führte. Das Lumen des gastrointestinalen Systems wurde verstärkt und lieferte eine bessere Bilddarstellung der Leber, der Milz und der inneren Fortpflanzungsorgane.
Ein 10 ml-Volumen der Emulsion von Beispiel 42 wurde auf intracystischem Wege verabreicht, was eine verbesserte Visualisierung der Harnblase ermöglicht.
Die obigen spezifischen Beispiele können dazu verwendet werden, mit den kolloidalen Dispersionen der vorliegenden Erfindung einen nützlichen Ultraschallkontrast auf zusätzlichen Verabreichungswegen zu erzeugen. Genauer gesagt könnten die Emulsionen u. a. auf irgendeinem der folgenden Wege verabreicht werden: intraabdominal, intraarterial, intraartikular, intrakapsular, intracervical, intercranial, intraduktal, intradural, intraläsional, intralokular, intralumbar, intramural, intraocular, intraoperativ, intraparietal, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonär, intraspinal, intrathorakisch, intratracheal, intratympanisch, intrauterin und intraventrikulär. Verfahren zur Verabreichung auf diesen Wegen können gefunden in einem Standard- Radiologietext, beispielsweise "Pharmaceuticals in Medical Imaging", herausgegeben von DP Swanson, HM Chilton, JH Thrall, MacMillian Publishing Co., Inc., 1990.
Zusätzlich zu den oben angegebenen Organen oder den untersuchten Organsystemen könnte man die Lungen, die Brust, die Prostata und endokrine Systeme auf bekannte Weise untersuchen. Die Arten der medizinischen Zustände, die einer Untersuchung mit den erfindungsgemäßen Mitteln zugänglich sind, sind zahlreich. Sie schließen ein metabolische, traumatische, kongenitale, neoplastische oder infektiöse Erkrankungen. Eine Beschreibung der Verwendung der Ultraschall- Bilduntersuchung bei diesen Krankheitszuständen kann gefunden werden in dem Text "Diagnostic Ultrasound", herausgegeben von cm Rumack, SR Wilson, JW Charboneau, Mosby Year Book, Boston, 1991.

Beispiel 9

Die kolloidalen Dispersionen der vorliegenden Erfindung können einen Kontrasteffekt im Ultraschallsignal bei Konzentrationen im Bereich von 0,00001% (G/V) bis 166% (G/V) erzeugen.
Wenn eine 1%ige Emulsion (wie beispielsweise die Emulsion aus Beispiel 42) 10-fach verdünnt wird (indem man 1 ml zu 9 ml Puffer hinzugibt), und eine 0,1 ml Teilmenge zu 1000 ml Wasser bei 37ºC zusetzt und die Ultraschallintensität mißt, so gibt es eine erhebliche Erhöhung der Rückstreuung. Genauer nimmt die Signalintensität, gemessen mit dem in Beispiel 1 beschriebenen System, von 2,7 bis 9,8 innerhalb der ersten Minute im Anschluß an die obige Zugabe zu. Bei einer größeren Verdünnung wird die Rückstreuung vom Hintergrund ununterscheidbar. Somit ist die untere Grenze für die Konzentration des Materials der dispergierten Phase 0,00001%.
Wenn 5 ml Dodecafluorpentan zu 5 ml Wasser zugesetzt werden, das die Tensid-Mischung enthält, die im nachfolgenden Beispiel 25 beschrieben wird, und die Suspension dann 5 min nach dem Verfahren von Beispiel 4 fein zerkleinert wird, wird eine 166%ige (G/V) Emulsion gebildet. Diese kann sofort an einen Organismus verabreicht werden, beispielsweise oral, um einen hervorragenden Ultraschall-Kontrast zu liefern. Diese Menge stellt das obere Ende für die Konzentration des Materials der dispergierten Phase dar, da höhere Konzentrationen Formulierungen liefern, die dazu neigen, instabil zu sein.

Beispiel 10 (nicht gemäß den Ansprüchen)

Zur Stabilisierung der kolloidalen Dispersionen in der vorliegenden Erfindung können Proteine verwendet werden. Unter Verwendung von Hochintensitäts-Ultraschall kann man wäßrige Suspensionen von Protein-Mikrosphären synthetisieren, die mit nicht-wäßrigen Flüssigkeiten gefüllt sind (d. h. Mikrokapseln). Diese unterscheiden sich von Ultraschall-Kontrastmitteln gemäß US-A 4 718 433 und 4 774 958, die nur Gase enthalten, und folgen den Verfahren, die beschrieben werden von Suslick und Grinstaff (Suslick KS, Grinstaff MW: Protein microencapsulation of nonaqueous liquids. J. Amer. Chem. Soc. 112: 7807-7809, 1990). Diese Schrift beschreibt nur die Verwendung von hochsiedenden nicht-wäßrigen Flüssigkeiten (die als Ultraschallkontrastmittel ungeeignet sind) und offenbart keinerlei Verwendung von entweder niedrigsiedenden Flüssigkeiten im allgemeinen, oder von organischen Halogeniden insbesondere, als nicht-wäßrige Flüssigkeiten.
Proteinische Mikrosphären können mit einer Hochintensitäts- Ultraschallsonde (Heat Systems, W375, 20 kHz, 0,5 in. Ti- Horn) aus humanem Serumalbumin oder Hämoglobin synthetisiert werden. Typischerweise werden 5% Pentan oder 3% Diethylether und 5% Albumin 3 min bei einer akustischen Energie von etwa 150 W/cm² bei 23ºC und einem pH von 7,0 beschallt. Die resultierende Dispersion weist eine Gaussche Verteilung und einen mittleren Teilchendurchmesser von etwa 2,3 um auf. Sie behält ihre Teilchengröße für bis zu 2 Monaten bei 4ºC.
Zusätzlich zu Albumin oder Hämoglobin können die folgenden Proteine verwendet werden: alpha-1-Antitrypsin, alpha-Fetoprotein, Aminotransferasen, Amylase, C-reaktives Protein, carbinoembryones Antigen, Ceruloplasmin, Komplement, Creatinphosphokinase, Ferritin, Fibrinogen, Fibrin, Transpeptidase, Gastrin, Serumglobuline, Myoglobin, Immunglobuline, Lactatdehydrogenase, Lipase, Lipoproteine, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, alpha-1-Serumproteinfraktion, alpha- 2-Serumproteinfraktion, beta-Proteinfraktion, gamma-Proteinfraktion, gamma-Glutamyltransferase.
Zusätzlich zu Pentan oder Diethylether können andere aliphatische Kohlenwasserstoffe, organische Halogenide und Ether so verwendet werden, wie oben für Pentan beschrieben wurde.

Beispiel 11

Das Verhältnis der Größe der Teilchen der kolloidalen Dispersion als Emulsion oder Mikroemulsion und der Größe der beim Phasen-Shift gebildeten Mikroblasen kann bestimmt werden.
Eine Teilmenge der Emulsion des nachfolgenden Beispiels 27 wurde in den Nicomp 370 gegeben, der bei 19ºC betrieben wurde, und die mittlere Teilchengröße der flüssigen Emulsion wurde zu 231,7 nm bestimmt. Die Temperatursteuerung des Instruments wurde auf 37ºC eingestellt, und nach dem Temperaturausgleich, der etwa 5 min dauerte, wurde die Teilchengröße noch einmal bestimmt. Die gebildete Dispersion von Mikrobläschen wies eine mittlere Teilchengröße von 1701,5 nm auf, d. h. eine Zunahme der Größe um das 7,34-fache.
Man kann auch die erwartete Veränderung der Dispersionsgröße errechnen, wenn man die relativen Dichten der dispergierten Flüssigkeit als Gas und als Flüssigkeit weiß. Beispielsweise enthält das Gas Data Book, von W. Braker und A. Mossman, Matheson, derartige Daten. Wenn man Octafluorcyclobutan prüft, findet man, daß 1 l der Flüssigkeit 188 l Gas bei einem Druck von 760 mmHg und 15ºC liefert. Da das Volumen eines Kugelkörpers zum Durchmesser eines solchen Kugelkörpers nach der dritten Wurzel des Volumens in Beziehung steht, liefert der Phasenübergang für ein Teilchen einer Octafluorbutan-Emulsion einen 5,7-fachen Anstieg des Durchmessers.

Beispiel 12

Die Sicherheit der Emulsionen der vorliegenden Erfindung wird auf dramatische Weise im Minischwein demonstriert.
Ultraschallkontrastmittel der Marke Albunex, die in der Entwicklung sind und Gegenstand von US-A-4 718 433 und 4 774 958 sind, zeigt schwere hämodynamische Wirkungen in dem Schwein (Ostensen J., Hede R., Myreng Y., Ege T. Holz E.). Intravenöse Injektion von Albunex-Mikrosphären bewirkt eine Thromboxan-vermittelte Lungen-Überspannung in Schweinen, jedoch nicht in Affen oder Kaninchen (Acta Physiol Scand 144: 307-315, 1992). Bei Dosen so niedrig wie nur 0,001 bis 0,5 ml/kg kommt es zu einer Hypotension. Ein Schwein starb nach einer langsamen Infusion von 0,05 ml/kg.
Ein Experiment wurde an einem 30 kg-Minischwein unter Halothan-Anästhesie durchgeführt, wobei man das Arbeitsprotokoll der obigen Literaturstelle anwandte. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle enthalten:
Alle Dosen lieferten einen guten Herzkontrast. Die Dosen oberhalb von 0,4 ml/kg lieferten außerdem eine Doppler-Verstärkung der Leber.
Es ist der Schluß möglich, daß Injektionen einer erfindungsgemäßen Emulsion, die das 40-fache der lethalen Dosis von Albumin-Microspheres betrugen, bei dem Mini-Schwein minimale vorübergehende Wirkungen hatten. Die Schwellendosis für einen Effekt mit Albunex ist 0,001 ml/kg der Albumin-Micospheres oder das 2000-fache unterhalb der Schwellendosis für einen Effekt der kolloidalen Dispersionen der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 13

Die Auswahl von amphiphilen Materialien mit der geeigneten hydrophil-lipophilen Balance (HLB)-Zahl für die ausgewählte dispergierte Phase ist wichtig für die Stabilität der kolloidalen Dispersion. Eine Art, die HLB-Zahl zu messen, besteht darin, die Grenzflächenspannung von verschiedenen Tensidmischungen zu messen (eine gute allgemeine Übersicht über das HLB-Verfahren kann gefunden werden in: Emulsions: Theory and Practice, Paul Becher, wie oben angegeben, Seiten 232-252).
Es wurden Mischungen von Pluronic P-123 und Pluronic F-127 gebildet, die eine 1%ige Lösung (V/V) lieferten, mit abgestuften HLB-Zahlen und unter Bestimmung der Grenzflächen- Spannung (interfacial tension; IFT) der Lösung gegen Dodecafluorpentan bei 4ºC, unter Verwendung eines Kruss Drop Volume Tensitometers DVT-10, Kruss USA, Charlotte, NC. Die Ergbenisse sind in der folgenden Tabelle enthalten: Verhältnis zwischen HLB und Grenzflächenspannung
Die obigen Ergebnisse zeigen bei einer graphischen Darstellung einen HLB für Dodecafluorpentan von etwa 14. Die Verwendung von amphiphilen Materialien wie beispielsweise anionischen, nichtionischen, kationischen oder zwitterionischen Tensiden mit einer HLB-Zahl von 14 liefert die größte Stabilität für Emulsionen der obigen flüssigen dispergierten Phase.

Beispiel 14

Die Grenzflächenspannung zwischen der flüssigen dispergierten Phase und der flüssigen kontinuierlichen Phase kann verwendet werden, um Formulierungen zu entwickeln, da diese Eigenschaft einen signifikanten Einfluß auf die Stabilität der kolloidalen Dispersion aufweist.
Die Ostwald-Reifungstheorie sagt eine starke Abhängigkeit der Teilchengrößenstabilität von der Grenzflächenspannung voraus (zusammengefaßt von Kabalnov AS, Shchukin ED; Ostwald ripening theory: Applications to fluorocarbon emulsion stability, Advances in Colloid and Interface Science, 38: 69- 97, 1992).
Die Theorie sagt voraus, daß Stabilität und Grenzflächenspannung in einem umgekehrten Verhältnis zueinander stehen. Wenn man beispielsweise amphiphile Materialien zusetzen kann, die eine 5-fache Erniedrigung der Grenzflächenspannung liefern, erhält man eine 5-fache Zunahme der Stabilität. Grenzflächenspannungen von verschiedenen amphiphilen Materialien in wäßrigen Lösungen (alle ausgedrückt als V/V- Lösungen) gegen Dodecafluorpentan wurden bei 4ºC gemessen, und aus jeder Formulierung wurden, wie in Beispiel 13 beschrieben, Emulsionen erzeugt.
Pluronic P-123, 1%, und Dodecafluorpentan wiesen eine Grenzflächenspannung von 27,1 mN/m (Dyn/cm) auf und bildeten keine stabile Emulsion.
Pluronic F-127, 1%, und Dodecafluorpentan wiesen eine Grenzflächenspannung von 26,4 mN/m (Dyn/cm) auf und bildeten keine stabile Emulsion.
Zonyl FSO, 1%, und Dodecafluorpentan wiesen eine Grenzflächenspannung von 5,8 mN/m (Dyn/cm) auf und bildeten eine stabile Emulsion.
Pluronic P-123, 0,33%, Pluronic F-127, 0,33% und Zonyl FSN, 0,33% und Dodecafluorpentan wiesen eine Grenzflächenspannung von 14,1 mN/m (Dyn/cm) auf und bildeten eine stabile Emulsion.
Pluronic P-123, 1%, Zonyl FSO, 1,0%, Natriumchlorid 1%, und Natriumperfluoroctanoat, 0,5% und Dodecafluorpentan hatten eine Grenzflächenspannung von 2,71 mN/m (Dyn/cm) und bildeten eine stabile Emulsion.
Somit waren amphiphile Materialien mit Grenzflächenspannungen unterhalb 26 mN/m (Dyn/cm) erforderlich, um stabile Emulsionen zu bilden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit anderen organischen Halogeniden oder mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen oder Ethern erhalten.

Beispiel 15

Die Viskosität der flüssigen kontinuierlichen Phase kann verwendet werden, um Formulierungen zu entwickeln, da diese Eigenschaft einen signifikanten Einfluß auf die Stabilität der kolloidalen Dispersion aufweist.
Die Ostwald-Reifungstheorie sagt eine starke Abhängigkeit von Teilchengrößenstabilität und -viskosität voraus (vgl. Kabalnov AS, et al. in Beispiel 14). Die Theorie sagt voraus, daß Stabilität und Viskosität direkt proportional zueinander sind, Wenn man beispielsweise Viskogene (viskositätserhöhende Mittel) zusetzen kann, die eine 5-fache Zunahme der Viskosität liefern, erhält man im allgemeinen eine 5-fache Erhöhung der Stabilität.
Beispiele für Viskogene schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Carboxymethylcellulose, Sorbit, Iohexol, andere jodierte Röntgenkontrastmaterialien, Dextrose, Polyethylenglycole. Die Emulsion von Beispiel 38 weiter unten wurde mit und ohne 5% Polyethylenglycol (PEG) 200 hergestellt, das eine Viskosität von 1,1 cP lieferte, und die Stabilität wurde notiert. Die Emulsion, die 5% PEG 200 enthielt, wies eine größere Stabilität auf.

Beispiel 16

Die Ultraschall-Rückstreuung von Dispersionen der Emulsionen der folgenden Beispiel 44 und 18 wurden mit einem Hewlett Packard Model 77020-Ultraschall-Scanner gemessen, um die relative Fähigkeit der Phasen-Shift-Kolloide der vorliegenden Erfindung zu bestimmen, die Flüssig-Flüssig-Emulsion- Dispersionen bei Raumtemperatur sind, die jedoch Mikrobläschen im Anschluß an eine Verabreichung werden, gegenüber entweder stabilen Emulsionen, wie sie beschrieben werden von Long und anderen (US-A-4 767 610, 4 987 154 und JP-A- 2196730), Davis und anderen (EP-A-245019) und JP-A-1609986 und JP-A-63060943, oder mit echten Luft-Mikrobläschen, wie beschrieben wird in EP-A-467031, EP-A-458745, WO-A-9115244, US-A-5088499, US-A-5123414, US-A-4844882, US-A-4832941, US-A- 4466442 und US-A-4276885.
Die Luft-Mikrobläschen wurden auf die folgende Weise erzeugt. 0,5 ml Luft werden in eine 10 ml-Spritze eingeführt, und 10 ml einer 1%igen (V/V)-Lösung von Pluronic F-68 in die andere 10 ml-Spritze, die mit der ersten Spritze über einen Dreiwege-Hahn verbunden ist. Die Flüssigkeit und die Luft werden schnell zwischen den beiden Spritzen hin und her transportiert. Nach etwa 5 Durchgängen haben sich Luft und Flüssigkeit vermischt, und die Lösung hat ein milchiges, weißes Aussehen. Das Mischen wird für insgesamt 20 Durchgänge fortgesetzt. Eine 1,0 ml-Probe der Gas-Dispersion, zugesetzt zu 250 ml Wasser, lieferte ein Ultraschallbild mit einer Intensität, die ähnlich der von Lebergewebe war (4+-Stärke). Überraschenderweise nahm die Intensität der Ultraschall-Rückstreuung, die von den Luft-Mikrobläschen erzeugt wurde, rasch ab, so daß innerhalb von 5 min die Rückstreuung zur Grundlinie zurückgekehrt war. Dieser Mangel an Beständigkeit schränkt die diagnostische Nützlichkeit von Luft-Mikrobläschen ein.
Andererseits lieferten 1,0 bis 10,0 ml einer Perfluorhexan- Emulsion in 250 ml Wasser bei 37ºC ein Ultraschallbild ähnlich dem von fließendem Blut (0-1+ Stärke), was zeigte, daß diese Formulierungen Ultraschall nur bei extrem hohen Dosierungen erzeugten, was deren allgemeine Nützlichkeit einschränkt.
Eine 1,0 ml-Probe der Dodecafluorpentan-Emulsion, verdünnt in 250 ml Wasser von 37ºC, lieferte ein Ultraschallbild mit einer Intensität der Mikrobläschen-Lösungen (4+-Stärke), die über 10 min anhielt, einem Zeitraum, der ausreicht, um diagnostisch nützlich zu sein.
Es sei angemerkt, daß alle drei Versuchslösungen visuell wolkige Lösungen mit einer nahezu gleichen scheinbaren Trübe waren. Diese Experimente zeigen, daß die Ultraschallkontrastmittel der vorliegenden Erfindung eine größere Beständigkeit und/oder Potenz aufweisen als die Ultraschallkontrastmittel des Standes der Technik in einem diagnostisch nützlichen Ausmaß.

Beispiel 17

Eine 1,0 ml-Probe des Kontrastmittels von Beispiel 19 wurde aus einer Ampulle mit einer 1,0 ml Spritze aufgezogen, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgerüstet war, und etwa 0,2 ml wurden auf einen Glas-Träger gegeben. Eine Glas-Deckplatte wurde auf der Flüssigkeit angeordnet, und die Probe wurde auf den Objektträger eines Lichtmikroskops gegeben, das mit einem Augenstück-Mikrometer, einer Temperatur-kontrollierten Kammer, einer 35 ml-Kamera und einer Panasonic-Videokamera ausgerüstet war.
Die Emulsion wurde unter Öl bei 20ºC untersucht. Bei dieser Temperatur bestand die Emulsion aus 0,2 bis 0,3 um (Mikron)- Teilchen, die einer raschen Brownschen Bewegung unterlagen.
Die Temperatursteuerung wurde auf 37ºC verändert, und die Emulsion wurde beobachtet und Bilder aufgezeichnet. Als die Temperatur anstieg, nahmen die Teilchen individuell plötzlich an Größe zu, bis bei 37ºC die Emulsion eine Ansammlung von 1 bis 3 um (Micron) Blasen darstellte. Die Blasen, im Gegensatz zu der flüssigen Emulsion, waren leicht deformierbar. Sie schienen jedoch nicht zu koaleszieren. Nach 40 min des Versuchs blieb die Ansammlung von Mikroblasen intakt und stabil.

Beispiel 18

Daß es kritisch ist, daß ein gewisser Teil der flüssigen dispergierten Phase bei der Körpertemperatur des einer Bilduntersuchung unterzogenen Organismus, wobei in diesem Falle eine Beispielstemperatur von 37ºC gewählt wird, einen Phasenübergang von flüssig zu gasförmig erfährt, um eine Nützlichkeit als Ultraschall-Kontrastmittel aufzuweisen, wurde dadurch getestet, daß man eine Reihe von Emulsionen, jede mit einer unterschiedlichen flüssigen dispergierten Phase, einer Ultraschall-Bilderzeugung bei 37ºC unterwarf.
Die folgenden Emulsionen wurden formuliert oder aus bestimmten Quellen erhalten, und 1,0 ml Teilmengen wurden in 1000 ml Wasser bei 37ºC angeordnet. Die mit 1-Jodperfluoroctan gebildete Emulsion wurde nach den Verfahren formuliert, die von Long und anderen beschrieben wurden (US-A-4 767 610, 4 987 154 und JP-A-2196730). Die Emulsion mit Perfluordecalin wurde entsprechend der Offenbarung in JP-A-1609986 und JP-A- 63060943 formuliert. Die Emulsion mit Triolean wurde entsprechend den Verfahren formuliert, die von Davis und anderen beschrieben wurden (EP-A-245019). Der Inhalt eines jeden dieser Patente wird hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen. Ultraschallbilder wurden von der Lösung vor und nach der Zugabe erhalten, und die Ergebnisse als prozentuale Verstärkung mal die Zeitdauer, für die die Verstärkung beobachtet wurde, ausgedrückt.
Wie oben angegeben sind die bevorzugten Formulierungen die Emulsionen, die bei oder unterhalb 37ºC einen vollständigen Phasen-Shift zeigen. Die Flüssigkeiten mit hohem Dampfdruck, Perfluorhexan und Perfluoroctan, die bei Umgebungstemperatur Dampfdrücke über 2660 Pa (20 Torr) aufweisen, lieferten einen gewissen Kontrast, und zwar im Vergleich mit einer gerührten Salzlösung oder Perfluordecalin, das einen Dampfdruck bei Umgebungstemperatur unterhalb von 2660 Pa (20 Torr) aufweist. Das kann auf einen gewissen Vorteil im Hinblick auf die Verwendung dieser Verbindungen als Ultraschall-Kontrastmittel hinweisen, wobei jedoch der Mechanismus der Verstärkung durch diese Materialien nicht vollständig verstanden wird, und relativ zu denjenigen Materialien, die bei etwa 40ºC oder darunter sieden, sind sie nicht als praktisch nützlich anzusehen.

Beispiel 19

Die Ultraschallkontrastmittel der vorliegenden Erfindung können mit der folgenden Ausrüstung und den folgenden Stufen hergestellt werden: Microfluidizer, Modell 110Y, im Wechselwirkungskammerdruck 96,53 mPA (14 000 Psi); Druckbehälter, 316-Stahl, 5 l und 12 l Größen, Filter, Celluloseacetat, 0,22 um (Micron); Filterhalter, 142 mm. Es wurden die folgenden Lösungen hergestellt: 25% (G/V) Sorbit, 12 l; 2,5% (G/V) Natriumperfluoroctanoat (PCR, Inc., Gainsville, FL); 60 g Pluronic P-123, 60 Zonyl FSO, 7 ml 2,5% Natriumperfluoroctanoat-Lösung, 1 l, behandelt mit Ultraschall, um die Auflösung zu unterstützen (Tensid-Vorratslösung). Der Microfluidizer wurde zuerst mit der Sorbit-Lösung beschickt. Die Wechselwirkungskammer, die Rohrverbindungen und die Kühlspule werden während des Feinzerkleinerungsverfahrens mit Eisschnitzeln bedeckt. In einen 5 l-Druckbehälter mit Rührstab in einem Eisbad werden nacheinander zugesetzt: 500 ml Sorbit-Lösung; 500 ml Tensid-Vorratslösung; 800 ml Wasser; 200 g Dodecafluorpentan. Der Behälter wird für 45 min unter Stickstoff unter einem Druck von 0,068 MPa (10 Psi) gesetzt. Die Suspension wird 45 min bei 96,53 MPa (14 000 Psi) durch den Microfluidizer geleitet. Die Emulsion wird in einen Behälter überführt, die 8 l 25%iges Sorbit bei 4ºC enthält und gut gemischt. Die Emulsion wird in 100 ml-Ampullen unter positivem Druck überführt, wobei das Material bei dem Verfahren durch ein 0,22 um (Micron)-Filter geleitet wird. Bringe einen Deckel auf und verschließe die Ampullen. Die amphiphilen Materialien dieses Beispiels, die fluorhaltige Tenside und nichtionische Polyoxypropylen-Polyoxyethylen- Glykol-Copolymere enthielten, lieferten eine Formulierung mit einer annehmbaren Stabilität.

Beispiel 20

Eine 0,4 ml-Portion n-Pentan (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) wurde bei 4ºC zu 2,0 ml Wasser zugegeben. Es bildeten sich zwei klare getrennte Phasen. Es wurde NaCl zugesetzt (0,4 ml einer 10%igen G/V-Lösung), um eine Gesamtmenge von 2,8 ml zu erhalten. Es wurden etwa 135 mg Phosphatidyllecithin (Sigma Chemical, St. Louis, MO) unter Rühren zugesetzt, und die erhaltene Aufschlämmung unter heftiger Verwirbelung durch Rühren vermischt. Beim Stehen trennte sich die milchigweiße Lösung innerhalb von 5 min in zwei Phasen. In 0,1 ml Teilmengen wurde unter Mischen Ethanol bis zu einer Gesamtmenge von 1,74 ml zugegeben. Es trat keine Veränderung des Aussehens der zweiphasigen Mischung auf. Die Formulierung dieses Beispiels zeigte in vitro gute Ultraschall-Rückstreuungs-Eigenschaften und demonstriert die Verwendung von aliphatischen Kohlenwasserstoffen mit 6 oder weniger Kohlenstoffatomen und insgesamt 17 Atomen.

Beispiel 21

Indem man 1,80 ml Wasser, 0,2 ml 10% NaCl, 0,1 ml Ethanol und 100 mg Lecithin zusammengab, wurde eine milchige Suspension gebildet. Es wurde eine 0,1 ml-Portion Dodecafluorpentan (PCR, Gainsville, FL) zugesetzt und im Anschluß an das Mischen wurden zwei Phasen erhalten. Es wurde eine 0,1 ml-Portion n-Pentan zugesetzt, und danach wurden 0,2 ml Dodecafluorpentan-Teilmengen zugesetzt, um die Gesamtmenge des Dodecafluorpentans auf 20 Vol.-% zu bringen. Die erhaltene Suspension wurde gemischt, und es wurden drei Phasen erhalten, zwei milchige Phasen und eine kleine klare Phase. Es wurde zusätzliches NaCl zugesetzt, um die Lösung auf 7% zu bringen, und es wurde eine 1 ml-Teilmenge Ethanol zugesetzt, ohne daß es zu einer Veränderung des Charakters der Suspension kam. Die Formulierung dieses Beispiels zeigte in vitro gute Ultraschall-Rückstreuungs-Eigenschaften und demonstriert die Verwendung von Mischungen aus einem Kohlenwasserstoff und einem Fluorkohlenstoff.

Beispiel 22

Zu einer 2,0 ml-Portion Dodecafluorpentan wurden 330 mg Lecithin zugegeben. Im Anschluß an das Mischen wurden 1,0 ml Wasser zugesetzt, und die Suspension weiter gemischt. Es bildete sich eine milchige kolloidale Dispersion. Die gebildete milchige kolloidale Dispersion zeigt die Verwendung eines einzigen Tensids als amphiphiles Material, in diesem Falle eines natürlich vorkommenden zwitterionischen Tensids. Nützliche Kontrastmittel würden ebenfalls gebildet, indem man den Anteil an Dodecafluorpentan in der Formulierung durch einen Ether ersetzt, und insbesondere wurde gefunden, daß Diethylether ein nützliches Kontrastsignal liefert. Es ist zu erwarten, daß verwandte Verbindungen wie Methylether und Vinylether ebenfalls nützlich sind.

Beispiel 23

Eine 0,46 g-Portion Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde zu 0,72 ml Wasser und 8,00 ml Dodecan zugegeben. Eine 1,47 ml- Teilmenge von Pentanol wurde langsam zugesetzt. Anfangs enthielt die Suspension weißes "faseriges" SDS in einer klaren Flüssigkeit. Eine 1,0 ml Zugabe von Pentanol und ein leichtes Mischen führte zu einer wesentlichen Auflösung des SDS. Eine 0,5 ml-Zugabe von Pentanol unter Mischen führte innerhalb von 10 bis 15 min bei Raumtemperatur zu einer klaren monophasischen Mikroemulsion. Diese Formulierung lieferte eine eher schlechte akustische Rückstreuung, was zeigt, daß eine kolloidale Dispersion, die als dispergierte Phase eine Flüssigkeit mit einem Siedepunkt von mehr als etwa 40ºC enthält, hier beispielhaft vertreten durch Dodecan (Siedepunkt 216ºC) als Ultraschall-Kontrastmittel im Sinne der Bedeutung der vorliegenden Erfindung ungeeignet ist.

Beispiel 24

Die Zusammensetzung der Mikroemulsion aus Wasser, Pentanol, Dodecan, Natriumdodecylsulfat von Beispiel 23 wurde variiert, um die Zusammensetzungsgrenzen der Mikroemulsion zu bestimmen. Die folgenden Mischungen wurden bei Raumtemperatur hergestellt, und das Aussehen nach 30 min Rühren wurde notiert: Volumen an Zugabe (ml)
Die 5-9-Mikroemulsion wurde beim Erwärmen (mehr als etwa 45ºC) milchig und beim Abkühlen auf Raumtemperatur wieder klar, mit einem bläulichen Stich. Die reversible Veränderung des Aussehens konnte für wenigstens 6 Temperatur-Shift-Zyklen wiederholt werden.

Beispiel 25

Eine 0,51 ml-Portion Octylamin (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) wurde zu 1,0 ml Wasser zugesetzt, wobei sich eine klare Lösung bildete. Es wurde ein 1,0 ml-Portion Octan zugesetzt, und die klare Lösung wurde milchig. Es wurde eine 0,49 ml-Portion Octancarbonsäure zugesetzt, und die Lösung wurde ein Gel. Eine 0,17 ml Teilmenge einer 3,6 M KOH-Lösung löste das Gel auf und lieferte eine klare Mikroemulsion. Fünf Zugaben von Wasser in 0,1 ml Teilmengen unter Mischen lieferten weiterhin eine klare Mikroemulsion. Die sechste Zugabe verwandelte die klare Emulsion in eine milchige kolloidale Dispersion. Dieses Beispiel demonstriert die Formulierung einer einen aliphatischen Kohlenwasserstoffenthaltenden Emulsion mit einem amphiphilen Material, das kationische Tenside umfaßt.

Beispiel 26

Eine 1,0 ml Portion Dodecafluorheptanol (PCR) wurde zu 1,0 ml Dodecafluorpentan zugesetzt und lieferte eine klare homogene Lösung. Die gleiche Menge an Octafluorpentanol in Dodecafluorpentan lieferte zwei klare nicht-mischbare Phasen. Die Zugabe von 2,0 bis 4,0 ml Wasser zu dem Dodecafluorheptanol- Dodecafluorpentan lieferte zwei nicht-mischbare Phasen. Beim Abkühlen auf 4ºC veränderten sich die beiden klaren Phasen zu drei klaren Phasen.

Beispiel 27

Eine Lösung von 10 Vol.-% Fluorad FC-430 (3M Chemical, St. Paul, MN) in Wasser wurde dadurch hergestellt, daß man 10 ml FC-430 zu 100 ml Wasser bei Raumtemperatur zugab und mischte. Zu 5 ml dieser Lösung wurden 1,0 ml Dodecafluorpentan und 1,0 ml Octafluorpentanol zugesetzt, um eine Emulsion zu erhalten.

Beispiel 28

Eine 2,0 ml-Portion einer 10 Vol.-% FC-430-Lösung wurde zu 2,0 ml Dodecafluorpentan zugesetzt, und es resultierten zwei Phasen. Die Zugabe von 0,3 ml Dodecafluorheptanol lieferte eine milchige weiße Emulsion.

Beispiel 29

Eine 1 ml-Portion von 1,26 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AmP)-Perfluoroctanoat wurde zu 1,0 ml Dodecafluorpentan und 1 ml 25% Pluronic F68 zugesetzt und lieferte zwei Phasen von milchigen Flüssigkeiten. Eine Zugabe von 0,05 ml Dodecafluorheptanol lieferte eine einphasige kolloidale Dispersion.

Beispiel 30

Eine 2,0 ml-Portion einer 15 Vol.-%igen Pluronic F68-Lösung wurde schrittweise zu 2,0 ml Dodecafluorpentan und 0,2 ml Dodecafluorheptanol auf Eis zugesetzt. Die Mischung wurde mit einer 5 ml-Glasspritze aufgenommen, die mit einem Dreiwegehahn und einer zweiten 5 ml-Glasspritze verbunden war, und zwischen den Spritzen unter Druck hin- und herbefördert, um eine dicke weiße Emulsion zu liefern.

Beispiel 31

Durch aufeinanderfolgende Zugabe bei 4ºC wurde die folgende Mischung gebildet: 2,0 ml 15% Pluronic F68, 2,0 ml Dodecafluorpentan, 2,0 ml 0,2M AMP-Perfluoroctanoat, 0,1 ml Dodecafluorheptanol. Die Mischung wurde in eine 5 ml-Glasspritze aufgenommen, die mit einem Dreiwegehahn und einer zweiten 5 ml Glasspritze verbunden war, und energisch zwischen den Spritzen hin- und herbefördert, um eine dicke weiße Emulsion zu erhalten.

Beispiel 32

Durch aufeinanderfolgende Zugabe bei 4ºC wurde die folgende Mischung gebildet: 2,0 ml 15% Pluronic F68, 0,42 g D-Sorbit (Sigma) gelöst in 0,5 ml H&sub2;O, 0,2 ml Dodecafluorheptanol und 2,0 ml Dodecafluorpentan. Die Mischung wurde in eine 5 ml- Glasspritze aufgenommen, die mit einem Dreiwegehahn und einer zweiten 5 ml Glasspritze verbunden war, und energisch zwischen den Spritzen hin- und herbefördert, wobei eine dicke weiße Emulsion erhalten wurde.

Beispiel 33

Durch aufeinanderfolgende Zugabe bei 4ºC wurde die folgende Mischung gebildet: 2,0 ml 15 Vol.-% Pluronic F-68, 0,40 ml 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-(Tris)perfluoroctanoat, pH 7,2, 2,0 ml Dodecafluorpentan. Die Mischung wurde in eine 5 ml-Glasspritze aufgenommen, die mit einem Dreiwegehahn und einer zweiten 5 ml Glasspritze verbunden war, und energisch zwischen den Spritzen hin- und hergefordert, wobei eine weiße kolloidale Dispersion erhalten wurde.

Beispiel 34

Durch aufeinanderfolgende Zugabe bei 4ºC wurde die folgende Mischung gebildet: 60 ml 25% Pluronic F68, 24 ml 1,1,7-H-Dodecafluorheptanol, 75,8 g Dodecafluorpentan. Die Mischung wurde feinverteilt, indem man sie ansatzweise unter Verwendung von 30 cm³-Spritzen, einem Dreiwegehahn und 40 manuellen Durchgängen vermischte. Die Mischung wurde nacheinander zweimal 1 : 10 mit einer Lösung verdünnt, die zusammengesetzt war aus 8,0 ml 25% Pluronic F68, 2,0 ml 50% D-Sorbit, 1,0 ml pH 7,2, 0,1 M Tris-Perfluoroctanoat, und weiter durch Spritzendurchgänge zerkleinert. Diese Formulierung wurde an Mäuse verabreicht, die 20 bis 30 g wogen, und zwar intravenös durch eine Schwanzveneninjektion, und 7 Tage beobachtet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle enthalten.
Dosierung (ml/kg) Beobachtungen
20 Überleben
25 angegriffen aber Überleben
30 angegriffen aber überleben
40 kein Überleben
Diese biokompatible kolloidale Dispersion war wenigstens zwei Wochen nach ihrer Formulierung stabil.

Beispiel 35

Es wurde die folgende Formulierung hergestellt: 1,0 ml 25% Polyethylenglycol 3550, 1,0 ml 50% Sorbit, 3,0 ml 15% (G/V) Pluronic F-68, 3,0 ml 20% (G/V) Fluortensid FC 430, 0,4 ml 0,1 M Tris-Perfluoroctanoat und 1,0% (V/V) Dodecafluorpentan. Die Mischung wurde in einem Wasserbad-Ultraschallmischer durch die Einwirkung von akustischer Energie bei 4ºC 10 min fein zerteilt und lieferte eine milchige kolloidale Dispersion.

Beispiel 36

Eine Reihe von Lösungen von wäßrigen Medien, die jeweils unterschiedliche Anteile an amphiphilen Materialien enthielten wurden gebildet und als Basis für eine Formulierung getestet.
Lösung A: Eine klare Lösung, die 6,0 ml einer 25%-Lösung von Pluronic F-68, 6,0 ml einer 50% Lösung von PEG 3350, 0,6 ml 0,1 M Tris-Perfluoroctanoat und 2,4 ml H&sub2;O enthielt.
Lösung B: Eine klare Lösung, die 1,18 ml einer 25%-Lösung von Pluronic F68, 6,0 ml einer 50%-Lösung von PEG 3350, 0,12 ml Tris-Perfluoroctanoat und 7,7 ml H&sub2;O enthielt.
Lösung C: Eine trübe Lösung, die einen gelierten Niederschlag enthielt, wurde dadurch erhalten, daß man 6,0 ml 50% PEG 3350, 0,75 ml Tris-Perfluoroctanoat und 1,5 ml H&sub2;O mischte. Diese Lösung ist nicht für eine intravaskuläre Verabreichung biokompatibel, ist jedoch biokompatibel für eine orale, intraperitoneale, rektale oder intrauterine Verabreichung.
Lösung D: Durch Vermischen von 6,0 ml 25% (G/V) Pluronic F-68, 6,0 ml 50% (G/V) PEG 3350, 0,6 ml 0,1 M Tris-Perfluoroctanoat und 2,4 ml H&sub2;O wurde eine klare Lösung erhalten.
Lösung E: Durch Vermischung von 6,0 ml 50% (G/V) PEG 3350, 7,5 ml 20% (G/V) FC-430, 0,75 ml Tris-Perfluoroctanoat und 0,75 ml H&sub2;O wurde eine klare Lösung erhalten.
Lösung F: Durch Vermischen von 1,8 ml 25% (G/V) Pluronic F-68, 6,0 ml 50% (G/V) PEG 3350, 0,12 ml 0,1 M Tris- Perfluoroctanoat und 7,7 ml H&sub2;O wurde eine klare Lösung erhalten.
Lösung G: Durch Vermischen von 3,0 ml Pluronic F-68, 3,75 ml (G/V) FC-430, 6,0 ml PEG 3350, 0,68 ml Tris-Perfluoroctanoat und 1,57 ml H&sub2;O wurde eine klare Lösung, die ein winziges Präzipitat enthielt, gebildet.
Zu 7,0 ml der Lösungen A bis 6 wurde bei 4ºC eine 0,14 ml- Portion Dodecafluorpentan zugesetzt. Die kolloidalen Dispersionen wurden dadurch erzeugt, daß man unter Verwendung eines Dreiwegehahns 40 Durchgänge zwischen zwei Spritzen durchführte.
Die Formulierung D wurde per Schwanzveneninjektion an Mäuse verabreicht und wies einen LD50 von 20 ml/kg auf. Die Formulierungen F und G waren bei 10 ml/kg toxisch.

Beispiel 37

Eine Emulsion wurde dadurch formuliert, daß man 45 ml 20% PEG 3350, 237 mg Pluronic F68, 0,225 ml Fluorad FC-171, 2,25 ml 0,1 M Tris-Perfluoroctanoat und 10% (V/V) Dodecafluorpentan mischte. Diese wurde durch Mischen in einer Zweispritzen-, Dreiwegehahn-Vorrichtung zerkleinert.
Diese Formulierung war in einem Test zur Hämolyse biokompatibel. Durch Intrakardial-Punktierung wurde aus einer Ratte Vollblut in ein EDTA-enthaltendes evakuiertes Sammelröhrchen gesammelt. Eine Teilmenge von 0,10 ml des Bluts wurde zu einer 0,20 ml-Teilmenge der obigen Formulierung zugegeben, um die Spitzen-Blutspiegel zu simulieren, die im Anschluß an eine intravenöse Dosierung von 100 ml/kg erhalten werden. Das Blut wurde mit der Formulierung 2 min vermischt, und die Probe wurde zentrifugiert. Der überstand war klar, das Pellet dunkelrot, was anzeigte, daß selbst bei dieser extrem hohen Dosierung keine Hämolyse auftrat.
Diese Formulierung war auch in einem Test auf akute Toxizität biokompatibel, indem sie nur zu einem geringfügigen erschwerten Atmen von Mäusen nach einer intravenösen Verabreichung bei 20 ml/kg führte.

Beispiel 38

Eine Formulierung, die Dodecafluorpentan und amphiphile Materialien in einem wäßrigen Medium enthielt, wurde auf Biokompatibilität und Nützlichkeit als Ultraschall- Kontrastmittel getestet. Eine Vorratslösung von 90 ml 20% PEG 3350, 474 mg Pluronic F-68, 0,45 ml Fluorad FC-171 und 4,5 ml 0,1 M Tris-Perfluoroctanoat wurde vermischt und lieferte eine klare Lösung. Zu 9,0 ml der obigen Lösung wurden 0,18 ml Dodecafluorpentan zugegeben. Durch Zerkleinerung zwischen zwei 5 ml-Spritzen wurde eine kolloidale Dispersion gebildet.
Gemäß dem Modell, das beschrieben wurde von Keller MW, Feinstein SB, Watson DD: Successful left ventricular opacification following peripheral venous injection of sonicated contrast: An experimental evaluation. Am. Heart. J. 114: 570d (1987), das durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird, wurde eine echokardiologische Studie an einem 32 kg-Hund durchgeführt. Elf Verabreichungen der obigen Formulierung wurden intravenös bei Dosen von 0,05 bis 0,75 ml/kg gegeben. Die 0,05 ml/kg-Dosis lieferte nur eine schwache Kontrastverstärkung der rechten und linken Herzkammern direkt im Anschluß an die Injektion. Alle Dosierungen zwischen 0,10 und 0,75 ml/kg lieferten diagnostisch nützliche Verstärkungen der Herzkammern. Die Injektionen wiesen einen minimalen Effekt auf die hämodynamischen Parameter auf.
Eine 10%ige Dodecafluorpentan-Emulsion wurde in dem obigen formulierten wäßrigen Medium gebildet, und die erzeugte Kontrastverstärkung mit der 2%igen Formulierung verglichen. Bei Dosen von 0,20 und 0,25 ml/kg lieferte diese Formulierung eine intensive Herzkammer-Verdunklung im Anschluß an eine intravenöse Verabreichung bei minimalen hämodynamischen Veränderungen.

Beispiel 39

Eine Emulsion, die ein biokompatibles wäßriges Medium hoher Dichte und hoher Viskosität als kontinuierliche Phase enthielt, wurde formuliert. Sie enthielt 0,06 ml 15% Pluronic F68, 0,06 ml Zonyl FSO-100, 0,12 ml 5% Zonyl FSN-100, 0,146 ml 0,1 M Tris-Perfluoroctanoat, pH 7,2, 4,47 ml 76% (G/V) Iohexol (Omnipaque 350, Sterling Winthrop, New York) und 0,6 ml Dodecafluorpentan. Im Anschluß an eine Zerkleinerung durch Zwei-Spritzen-Mischen wurde eine stabile Formulierung gebildet. Andere hochdichte jodierten Röntgenkontrastmaterialien können anstelle von Iohexol verwendet werden, wie beispielsweise Iopamidol, Ioversol, Iopentol, Iodiximol und andere verwandte Verbindungen. Die Verwendung von Wasser allein als Medium für die kontinuierliche Phase lieferte Kontrastmittel, die im Anschluß an die Formulierung rasch in der Flasche zum Absetzen führten. Dieses Beispiel demonstriert die Nützlichkeit eines biokompatiblen wäßrigen Mediums hoher Dichte und einer hohen Viskosität als kontinuierliche Phase.

Beispiel 40

Eine Reihe von nichtionischen Polyoxypropylen-Polyoxyethylen- Glycol-Blockcopolymeren wurde im Hinblick auf ihre Fähigkeit getestet, als amphiphile Materialien zur Stabilisierung der Formulierungen von Dodecafluorpentan-Flüssig-Flüssig- Emulsionen zu wirken. Es wurden die folgenden Lösungen gebildet:
A- 1,9 ml 25% Pluronic F-68 und 0,04 ml Dodecafluorpentan,
B- 1,9 ml Pluronic L-121 und 0,04 ml Dodecafluorpentan,
C- 1,9 ml Pluronic L-122 und 0,04 ml Dodecafluorpentan,
D- 1,9 ml Pluronic L-121 und 0,04 ml Dodecafluorpentan,
E- 1,9 ml Pluronic L-101 und 0,04 ml Dodecafluorpentan,
F- 1,9 ml Pluronic L-92 und 0,04 ml Dodecafluorpentan,
G- 1,9 ml Pluronic L-81 und 0,04 ml Dodecafluorpentan,
H- 1,9 ml Pluronic P-123 und 0,04 ml Dodecafluorpentan.
Die obigen Lösungen wurden in verschlossene Glasröhrchen gegeben und bei 4ºC 10 min einer Verwirbelungsmischung unterzogen. Die Größe und Zahl der dispergierten Dodecafluorpentan-Phasenteilchen wurde visuell bewertet. Lösung H lieferte die kleinsten Teilchen.

Beispiel 41

Das relative (HLB)-System stellt ein Verfahren zur Optimierung einer nichtionischen Tensid-Lösung zur Erreichung der höchsten Stabilität dar. Es wird im Detail beschrieben in Emulsions: Theory and Practice, Paul Becher, 1965, Robert E. Krieber Publishing Company Malabar, FL sowie in den darin enthaltenen Literaturstellen.
Lösungen von Pluronic L61 (HLB 3,0) und F68 (HLB 29) wurden vermischt, um dazwischenliegende HLB-Werte gemäß der folgenden Formel zu erhalten:
HLB = fL61 {HLB von L61} + ff68 {HLB von F68}
Die tatsächlichen Lösungen, die errechneten HLB-Werte und die Stabilität der endgültigen Formulierung (eine 2%ige (V/V) Emulsion von Dodecafluorhexan) sind in der folgenden Tabelle enthalten.
0 = keine Stabilität; + = etwas Stabilität; +++ = größte Stabilität.
Der durch diese Arbeit festgestellte relative HLB für Perfluorhexan beträgt 6 bis 8. Die größte Stabilität von Perfluorhexan-Emulsionen werden erhalten, indem man amphiphile Materialien mit relativen HLB-Werten von 6 bis 8 verwendet, und zwar unabhängig von ihrer chemischen Struktur.

Beispiel 42

Eine Formulierung von Ultraschall-Kontrastmitteln der vorliegenden Erfindung im großen Maßstab kann die folgende Ausrüstung und die folgenden Stufen involvieren: Microfluidizer, Modell 110Y, Wechselwirkungs-Kammerdruck 96,53 MPa (14 000 Psi); Druckbehälter, 316-Stahl, 5 l- und 12 l-Größen; Filter, Celluloseacetat, 0,22 um (Micron); Filterhalter, 142 mm. Es wurden die folgenden Lösungen hergestellt: 25% (G/V) Sorbit, 12 l; 60 g Pluronic P-123, 60 g Zonyl FSO, 1 l, Ultraschallmischung zur Unterstützung der Auflösung (Tensid-Vorratslösung). Der Microfluidizer wurde zuerst mit der Sorbit-Lösung beschickt. Die Wechselwirkungskammer, die Rohrverbindungen und die Kühlspule werden während des Zerkleinerungsverfahrens mit Eisschnitzeln bedeckt. Einem 5 l-Druckbehälter mit einem Rührstab in einem Eisbad werden nacheinander zugegeben: 500 ml Sorbit-Lösung; 500 ml Tensid- Vorratslösung; 800 ml Wasser, 200 g Dodecafluorpentan. Der Behälter wird mit Stickstoff 35 min unter einen Druck von 0,068 MPa (10 Psi) gesetzt. Die Suspension wird 45 min bei 96,53 MPa (14 000 Psi) durch den Microfluidizer gefördert. Die Emulsion wird in einen Behälter überführt, der 8 l 25% Sorbit bei 4ºC enthält, und gut gemischt. Die Emulsion wird in 100 ml-Ampullen unter Einwirkung eines positiven Drucks überführt, wobei man das Material in dem Verfahren durch ein 0,22 um (Micron)-Filter hindurchleitet. Die Ampullen werden mit Deckeln versehen und verschlossen.

Beispiel 43

Eine Formulierung von Ultraschall-Kontrastmitteln der vorliegenden Erfindung im großem Maßstab kann die folgende Ausrüstung und die folgenden Stufen heranziehen: Microfluidizer, Modell 110Y, Wechselwirkungs-Kammerdruck 96,53 MPa (14 000 Psi); Druckbehälter, 316-Stahl, 5 l- und 12 l-Größen; Filter, Celluloseacetat, 0,22 um (Micron); Filterhalter, 142 mm. Es wurden die folgenden Lösungen hergestellt: 62,5% (G/V) Sorbit, 10 l; 41,75 g Pluronic P-123, 41,75 g Zonyl FSO, 2,5 l, Ultraschallmischung zur Unterstützung der Auflösung (Tensid-Vorratslösung). Der Microfluidizer wurde zuerst mit der Sorbit-Lösung beschickt. Die Wechselwirkungskammer, die Rohrverbindungen und die Kühlspule werden während des Zerkleinerungsverfahrens mit Eisschnitzeln bedeckt. Einem 5 l-Druckbehälter mit einem Rührstab in einem Eisbad werden nacheinander zugegeben: 1800 ml Tensid-Vorratslösung; 200 g Dodecafluorpentan. Der Druck im Behälter wird mit Stickstoff für 45 min bei gleichzeitigem Rühren auf 0,068 MPa (10 Psi) eingestellt. Die Suspension wird 30 min bei 5 000 Psi und 60 min bei 96,53 MPa (14 000 Psi) durch den Microfluidizer geführt. Die Emulsion wird in einen Behälter mit 8 l 62,5% Sorbit von 4ºC überführt und gut gemischt. Die Emulsion wird in 100 ml-Ampullen unter Einwirkung eines positiven Drucks überführt, wobei man das Material in dem Verfahren durch ein 0,22 um (Micron)- Filter hindurchleitet. Die Ampullen werden mit Deckeln versehen und verschlossen.

Beispiel 44

Eine Formulierung der vorliegenden Erfindung im großem Maßstab kann die folgende Ausrüstung und die folgenden Stufen heranziehen: Microfluidizer, Modell 110Y, Wechselwirkungs- Kammerdruck 96,53 MPa (14 000 Psi); Druckbehälter, 316-Stahl, 5 l- und 12 l-Größen; Filter, Celluloseacetat, 0,22 um (Micron); Filterhalter, 142 mm. Es wurden die folgenden Lösungen hergestellt: 33,3% (G/V) Saccharose, 20 l; 150 g Pluronic P-123, 150,0 g Zonyl FSO, 2,5 l und Ultraschallmischung zur Unterstützung der Auflösung (Tensid- Vorratslösung). Der Microfluidizer wurde mit der Saccharose- Lösung vorbehandelt. Die Wechselwirkungskammer, die Rohrverbindungen und die Kühlspule werden während des Zerkleinerungsverfahrens mit Eisschnitzeln bedeckt. Zu einem 5 l-Druckbehälter mit einem Rührstab in einem Eisbad werden nacheinander zugegeben: 1800 ml Tensid-Vorratslösung; 333 g Dodecafluorpentan. Der Behälter wird unter Rühren mit Stickstoff 60 min auf einen Druck von 0,068 MPa (10 Psi) eingestellt. Die Suspension wird durch den Microfluidizer bei 96,53 MPa (14 000 Psi) für 160 min geführt, wobei ein zirkulierendes Wasserbad die Wechselwirkungskammer auf -3,0ºC kühlt. Die Emulsion wird in einen Behälter überführt, der 18 l 33,3%ige (G/V) Saccharose bei 4ºC enthielt und 45 min gemischt. Die Emulsion wird in vorgekühlte 20 ml-Ampullen unter positivem Druck überführt, wobei man das Material durch ein 0,22 um (Micron)-Filter in dem Verfahren hindurchleitet.
Die Ampullen werden mit einem Deckel versehen und verschlossen.

Beispiel 45

Die dispergierte Phase der vorliegenden Erfindung sollte aus irgendeiner biokompatiblen Chemikalie mit einem Siedepunkt bei der oder unterhalb der Körpertemperatur des Organismus zusammengesetzt sein, dem die Formulierung verabreicht werden soll und der im Anschluß an die Verabreichung mit Ultraschall untersucht wird, damit eine ausreichende Menge der Chemikalie eine gasförmige Dispersion wird, um eine diagnostisch nützliche Änderung der erhaltenen Ultraschalldaten während der Untersuchung zu erhalten. Beispiel 2 enthält eine Tabelle der Körpertemperaturen einer Anzahl von Spezies, die verwendet werden kann, um die geeignete dispergierte Phase für die hierin offenbarten Formulierung auszuwählen.
Unter bestimmtem Bedingungen, beispielsweise im Falle von Organismen mit Fiebererkrankungen oder wenn Untersuchungen in medizinischen Einrichtungen in großen Höhen durchgeführt werden, wo der Luftdruck niedriger ist, können Chemikalien mit Siedepunkten bis zu 18 Grad über der normalen Körpertemperatur des Organismus als dispergierte Phase für derartige Ultraschall-Kontrastmittel von Nutzen sein.
Während so die obere Temperaturgrenze für die Auswahl der niedrigsiedenden Flüssigkeit für die dispergierte Phase festgesetzt wurde, wird die untere Grenze durch das Herstellungsverfahren bestimmt. Wenn die verfügbaren Ausrüstungen nur undichte Behälter enthalten, und man den Reaktionsbehälter während der Formulierung der kolloidalen Dispersion nicht unter Druck setzen kann, können nur dispergierte Phasen mit Siedepunkten bei der oder oberhalb der Einfriertemperatur der kontinuierlichen Phase verwendet werden. Beispielsweise weist eine kontinuierliche Phase, die ca. 25% (G/V) Iohexol enthält, einen Gefrierpunkt in der Nähe von -6ºC auf. Wenn man eine derartige kontinuierliche Phase verwendet, kann irgendeine niedrigsiegende Flüssigkeit, die oberhalb -6ºC siedet, durch reines Abkühlen verflüssigt werden.
Wenn man den Reaktionsbehälter jedoch unter Druck setzen kann, beispielsweise mit einem Stickstofftank, der bei 0,20 MPa (30 Psi) Druck arbeitet, kann man potentiell jede beliebige niedrigsiedende Flüssigkeit verflüssigen und auf diese Weise dispergieren, selbst diejenigen, die bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunkts der kontinuierlichen Phase sieden.
Beispiel 44 beschreibt ein Verfahren zur Bildung einer Emulsion mit einer Flüssigkeit als dispergierte Phase, die oberhalb des Gefrierpunkts der kontinuierlichen Phase siedet, während Beispiel 48 ein Verfahren zur Bildung einer Emulsion unter Anwendung sowohl von Druck als auch Kühlung mit einer Flüssigkeit als dispergierte Phase beschreibt, die unter dem Gefrierpunkt der Flüssigkeit der kontinuierlichen Phase siedet. Es ist offensichtlich, daß jede beliebige Chemikalie wirksamer dispergiert wird, wenn man einen gewissen positiven Druck ausübt, um die Verdampfung dieser Materialien mit den beträchtlichen Dampfdrücken zu vermindern, die ein niedriger Siedepunkt impliziert.
Wenn man den geeigneten Siedepunkt der Flüssigkeit der dispergierten Phase bestimmt hat, können die tatsächlichen Chemikalien, die nützlich sind, rasch unter Bezugnahme auf Standardtexte bestimmt werden, beispielsweise das CRC oder ein ähnliches Nachschlagwerk. Eine Liste einiger, jedoch nicht aller niedrigsiedenden Flüssigkeiten, nach dem Siedepunkt geordnet folgt: Chemikalienliste: Siedepunkte in ºC
1 Aliphatische Kohlenwasserstoffe und/oder Derivate
2 Aromatische Kohlenwasserstoffe und/oder Derivate
3 Organische Halogenide und/oder Derivate
6 Ether und/oder Derivate
7 Aldehyde und/oder Derivate
9 Carbonsäuren und/oder Derivate
10 Amine und/oder Derivate
11 Vermischtes

Beispiel 46

Die dispergierte Phase kann auch aus einer Gruppe von Azeotropen nach den Prinzipien und Kriterien ausgewählt werden, wie sie in Beispiel 45 erläutert sind. Eine Liste von einigen, jedoch nicht allen binären Azeotropen mit ihren Siedepunkten folgt:
Aceton (21%)-Pentan (79%) 32ºC; Ethylether (48%)-Isopren (52%) 33ºC; Ethylether (44%)-Methylformiat (56%) 28ºC; Ethylether (98,8%)-Wasser (1,2%) 34ºC; Isopren (86%)-2- Methyl-2-butan (14%) 34ºC; Isopropylchlorid (99%)-Wasser (1%) 35ºC; Methylvinylchlorid (99,1%)-Wasser (0,9%) 33ºC; Pentan (98,6%)-Wasser (1,4%) 34ºC; Vinylethylether (98,5%)-Wasser (1,5%) 34ºC.
Ein Liste von einigen, jedoch nicht allen ternären Azeotropen mit den Siedepunkten folgt:
Aceton (7,6%)-Isopren (92%)-Wasser (0,4%) 32ºC; Schwefelkohlenstoff-Methanol-Methylacetat 37ºC; Schwefelkohlenstoff (55%)-Methanol (7%)-Methylal (38%) 35ºC.

Beispiel 47

Die kolloidalen Dispersionen der vorliegenden Erfindung sind speziell und unterscheiden sich von Emulsionen des Standes der Technik für den Ultraschallkontrast dadurch, daß wenigstens ein gewisser Teil der dispergierten Phase im Anschluß an die Verabreichung an einen Organismus perkuliert oder verdampft. Die Anwesenheit dieses dispergierten Materials mit einer ausgeprägten Flüssigkeits-Gas-Grenzfläche schafft die Grundlage für die starke Rückstreuung des akustischen Strahls.
Ein Test für die Anwesenheit einer dispergierten Gasphasen- Emulsion ist die Reaktion der Ultraschall-Rückstreuung der Dispersion gegenüber Veränderungen des Drucks. Während echte Flüssigkeits-Dispersionen gegenüber Druckkräften im wesentlichen unempfindlich sind, zeigt eine gasförmige kolloidale Dispersion eine Abnahme der akustischen Rückstreuung, wenn Druck angewandt wird, und zwar aufgrund der Verdichtung des Gases und einer Abnahme des effektiven Rückstreuungs- Querschnitts.
Mit dem experimentellen System von Beispiel 1 wurde die akustische Rückstreuung in einem abgedichteten Becher durch ein akustisches Fenster getestet. Dann wurde auf das System Druck ausgeübt, und die akustische Rückstreuung wurde ein weiteres Mal aufgezeichnet. Da die akustische Rückstreuung im Anschluß an die Ausübung von Druck signifikant verschieden war, wurde geschlossen, daß die dispergierte Phase einen gewissen Teil im Gaszustand enthält.

Beispiel 48

Eine Formulierung der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden durch Kondensation der dispergierten Phase aus dem Gaszustand anstelle einer Feinzerkleinerung aus dem flüssigen Zustand, und beinhaltet die folgende Ausrüstung und Stufen: Microfluidizer, Modell 110Y, Wechselwirkungskammerdruck 96,35 MPa (14 000 Psi); Druckbehälter, 316-Stahl, 5 l und 12 l-Größen; Filter, Celluloseacetat, 0,22 um (Micron); Filterhalter, 142 mm. Es wurden die folgenden Lösungen hergestellt: 36% Iohexol, 10 l, 41,75 g Pluronic P-123, 41,75 g Zonyl FSO, 2,5 l, Ultraschallmischung zur Unterstützung der Auflösung (Tensid-Vorratslösung). Der Microfluidizer wurde mit der Iohexol-Lösung vorbehandelt und der gesamte Behälter auf -6ºC abgekühlt. Die Wechselwirkungskammer, die Rohrverbindungen und die Kühlspule werden während des Kondensationsprozesses mit Eisschnitzeln bedeckt. Zu einem 5 l-Druckbehälter mit einem Rührstab in einem Eisbad werden 1800 ml Tensid-Vorratslösung gegeben. Mit Hilfe gasdichter Anschlußstücke wurde ein Propantank (Sdp. -42ºC) an die Wechselwirkungskammer angeschlossen, und die Kammer wurde mit 200 g Propan beschickt. Der gesamte Behälter wurde mit Stickstoff für 45 min unter Rühren auf einen Druck von 0,068 MPa (10 Psi) gebracht. Die Suspension wurde 30 min bei 34,47 MPa (5 000 Psi) rund 60 min bei 96,53 MPa (14 000 Psi) durch den Microfluidizer geführt. Die Emulsion wurde in einen Behälter überführt, der 8 l Wasser bei 4ºC enthielt, gut gemischt und in 100 ml-Ampullen unter Anwendung von positiven Druck überführt, wobei das Material durch einen 0,22 um (Micron)-Filter in dem Verfahren geleitet wurde. Die Ampullen wurden mit einem Deckel versehen und verschlossen.
Andere Emulsionen, die andere niedrigsiedende Materialien gemäß Beispiel 45 enthalten, können auf eine ähnliche Weise hergestellt werden, indem man die dispergierte Phase variiert und sicherstellt, daß der Druck und die Temperatur ausreichen, um das Material der dispergierten Phase zu verflüssigen.

Beispiel 49

Die dispergierte Phase kann aus irgendeiner Chemikalie zusammengesetzt sein, die unter Standarddruckbedingungen einen Siedepunkt unterhalb der Körpertemperatur des Organismus aufweist, dem die Formulierung verabreicht werden soll und der im Anschluß an die Verabreichung mit Ultraschall untersucht werden soll. Beispiel 45 diskutiert, wie man geeignete Chemikalien für die dispergierte Phase auswählt, und zwar auf der Basis der Temperaturbereichs, der unter Berücksichtigung des Siedepunkts der ausgewählten Chemikalie sowie der Parameter des Herstellungsverfahrens erhalten wird.
Wenn man festgestellt hat, daß der Siedepunkt unter Standard- Druckbedingungen vorzugsweise unterhalb etwa 37ºC liegt, wurde gefunden, daß die Auswahl von Chemikalien auf der Basis der Gesamtzahl von vorhandenen Atomen ein alternatives Verfahren zur Auswahl geeigneter Materialien als Ultraschallkontrastmittel darstellt. Eine Liste von geeigneten Chemikalien, geordnet nach der Gesamtzahl von vorhandenen Atomen, zeigt, daß alle bevorzugten Chemikalien zwischen 4 und 17 Atome aufweisen, wie folgt: Chemikalienliste: Siedepunkte in ºC

Beispiel 50

Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die dispergierte Phase aus irgendeiner Chemiklalie zusammengesetzt sein, die bei Standarddruckbedingungen einen Siedepunkt unterhalb der Körpertemperatur desjenigen Organismus aufweist, dem die Formulierung verabreicht werden soll und der im Anschluß an die Verabreichung mittels Ultraschall untersucht werden soll. Beispiel 45 diskutiert, wie man geeignete Chemikalien für die dispergierte Phase ausgewählt, und zwar auf der Grundlage des Temperaturbereichs, den man unter Berücksichtung des Siedepunkts der ausgewählten Chemikalie sowie der Parameter des Herstellungsverfahrens erhält. Der Siedepunkt von Pentan (Dodecahydropentan) und Perfluorpentan (Dodecafluorpentan) betragen 36 bis 37ºC bzw. 28 bis 29ºC. Das stellt einen hervorragenden Temperaturbereich dar, in dem man geeignete Chemikalien als dispergierte Phase auswählen kann. Es werden daher Chemikalien, die 5 Kohlenstoffatome und variable Wasserstoff- und Fluoratome enthalten, Siedepunkte zwischen 28 und 37ºC aufweisen, geeignete Chemikalien für die dispergierte Phase bilden. Die folgende Liste von geeignete Chemikalien enthält einige, jedoch nicht alle Chemikalien, die fünf Kohlenstoffatome enthalten, bei gleichzeitig variablen Zahlen an Wasserstoff- und Fluoratomen, z. B. C&sub5;HxFy:
1,-Cyclopentadien, 5,5-Difluor-; Cyclobutan, 1-Fluor-3- methylen-; 2H-Fluorinium; Cyclobutan, (Fluormethylen)-; Methylen, Cyclobutylfluor-; 2,4-Cyclopentadien-1-yl, 2-Fluor-; 2H-Fluoriniumion(-1), (Deloc-2,3,4,5,6)-; 6-Fluoroniabicyclo(3.1.0)hexan; 6-Fluoroniabicyclo(3.1.0)hex-2- en,Hydroxid, inneres Salz; Fluor(2+), 1,3-Pentadieny-1-yl-5- yliden-; 1,3-Pentadien, Fluor-Komplex; Fluoranium; Cyclopentin, 4-Fluor-; Cyclobuten, 3-(Trifluormethyl)-; Cyclopentan, 1,1,2,2,3,3-Hexafluor-; Tricyclo(1.1.1.01.3)pentan, Fluor-, ion(1-); Spiro(2.2)pentan, Fluor-, ion(-1); Tricyclo(1.1.1.01.3)pentan, Fluor-; Cyclopentan, 1,2-Difluor-, trans-; Cyclobutan, 1,1-Difluor-3-methylen; 1,3-Cyclopentadien, 2-Fluor-; 1,3-Cyclopentadien, 1-Fluor-; Bicyclo(1.1.1)pentan, 1,3-Difluor-; 1,3-Cyclopentadien, 1,2,3,4,5-Pentafluor-, Dimer; 1,3-Cyclopentadien, 1,2,3,4- Tetrafluor; 1,3-Cyclopentadien, 1,2,3,4,5-Pentafluor-; Cyclopenten, 1,2,3,3,4,5-Hexafluor-; Cyclobutan, 1,1,2,2,3- Pentafluor-3-(trifluormethyl)-; Cyclobuten, 3,3,4,4- Tetrafluor-1-methyl-; Cyclobutan, 1-Fluor-1-methyl-; Bicyclo(2.1.0)pentan, 2,2,3,3-Tetrafluor-; Cyclopenten, 3,3-Difluor-; 1,3-Cyclopentadien, 5-Fluor-; Cyclobutan, 2-(Difluormethylen)-1,1,3,3-tetrafluor-; Spiro(2, 2)pentan, 1,1,2,2,4,4-Hexafluor-; Bicyclo(1.1.1)pentan, 1-Fluor-; Cyclopenten, 4,4-Difluor-; Cyclobutan, (Difluormethylen)-; Cyclobutan, 1,1-Difluor-2-methylen-; Spiro(2.2)pentan, 1,1-Difluor-; Cyclobutan, 1,1,3,3-Tetrafluor-2-methylen-; Cyclobutan, 2-(Difluormethylen)-1,1-difluor-, Spiro(2.2)- pentan, 1,1,4,4-Tetrafluor-; Cyclopropan, 1,1-Bis- (trifluormethyl)-; Spiro(2.2)pentan, 1,1,2,2-Tetrafluor-; Tricyclo(1.1.0.02.4)butan, (Trifluormethyl)-; Spiro(2.2)- pentan, 1,4-Difluor-; Spiro(2.2)pentan, 1,2-Difluor-; Spiro(2.2)pentan, Fluor-; Bicyclo(1.1.0)butan, 1-(Trifluormethyl)-; Cyclopentan, 1,2-Difluor-, cis-; Cyclopropan, (1,1,2-Trifluorethyl)-; Cyclopropan, (1,1-Difluorethyl)-; Cyclopropan, (1,2,2-Trifluorethyl)-; Cyclopropan, (2,2-Difluorethyl)-; Cyclopropan, (2-Fluorethyl)-; Cyclopropyl, 1-Fluor-2,2-dimethyl-; Cyclopropyl; 1-Fluor-2,3-dimethyl-; cis-; Cyclobutan, (Trifluormethyl)-; Fluoriranium, Trimethyl-; Cyclopenylium, 1-Fluor-; Cyclopropan, 1,1-Difluor-2-methyl-2- (trifluormethyl)-; Cycloropan, 1-Fluor-2,3-dimethyl, (1.alpha,2.alpha,3.alpha.)-; Cycloropan, 1-Fluor-2,3- dimethyl, (1.alpha,2.beta.,3.beta)-; Cyclopropan, 1-Ethyl-2- fluor; Cyclopropan, 1-Ethyl-2-fluor-, trans-; Cyclopropan, 1-Fluor-2,3-dimethyl-, (1.alpha,2.alpha,3.beta)-; Cyclobutan, 1,1,2-Trifluor-2-(trifluormethyl)-; Cyclopropan, 1- (Difluormethyl)-1-fluor-2-methyl-, trans-; Cyclopropan, 1-(Difluormethyl)-1-fluor-2-methyl-, cis-; Cyclobutan, 1,1,2,2,3-Pentafluor-3-methyl-; Cyclobutan, 1,1,2,3- Tetrafluor-2-(trifluormethyl)-; Cyclopropan, (2- Fluorethenyl)-; Cyclopropan, (1-Fluorethenyl)-; Bicyclo(2.1.0)pentan, 5,5-Difluor-; Cyclobuten, 1,4,4- Trifluor-3-methylen-; Cyclopropan, 2-Ethenyl-1,1-Difluor-, Homopolymer, Cyclobutan, 3-(Difluormethylen)-1,1-difluor-; Cyclopropan, 1,1,2-Trifluor-2-(trifluorvinyl)-, Cyclopenten, 1-Fluor-; Cyclopropan, 2-Ethyl-1,1-Difluor; Cyclopropen, 3,3-Difluor-1-(pentafluorethyl)-; Cyclopropan, 1-Methyl-2- (trifluormethyl)-, cis-; Cyclopropan, 1-Methyl-2- (trifluormethyl)-, trans-; Cyclopropan, 1-Methylen-2- (trifluormethyl)-, Cyclopentan, 1,1,2,2,3,3,4,5-Octafluor-; Cyclopropan, 1-(Difluormethyl)-1-fluor-2-methyl-, cis-; Cyclopropan, 1-(Difluormethyl)-1-fluor-2-methyl-, trans-; Cyclopentan, 1,1,2,2,3,3,4-Heptafluor-; 1,3-Cyclopentadien, 1,2,4,5,5-Pentafluor-, dimer; 1,3-Cyclopentadien, 1,2,3,5,5- Pentafluor-, dimer; 1,3-Cyclopentadien, 1,2,3,5,5- Pentafluor-; 1,3-Cyclopentadien, 1,2,4,5,5-Pentafluor-; Cyclopentan, 1,2,3,4,5-Pentafluor-, Stereoisomer; Cyclopentan, 1,1,2,3,4,5-Hexafluor-, Stereoisomer; Cyclobuten, 3-Fluor-1-methyl-; Cyclopenten, 1,4,5,5- Tetrafluor-; Cyclopenten, 3,3,4,4-Tetrafluor-; Cyclopenten, 3,3,4,4,5-Pentafluor-; Cyclopenten, 1,4,4,5,5-Pentafluor-; Cyclopenten, 1,3,3,4,4,5-Hexafluor-; Cyclopropan, (2,2,2-Trifluormethyl)-; Cyclopentan, 1,1,2,3,3,4,5- Hexafluor-; Cyclobuten, 2,3,3-Trifluor-1-(trifluormethyl)-; Cyclopenten, 1,2,3,3,4,5,5-Heptafluor-; Cyclopenten, 1,2,3,3,4,4,5-Heptafluor-; Cyclobuten, 3,3,4,4-Tetrafluor-1- (trifluormethyl)-; Cyclopenten, 1,3,3,4,4,5,5-Heptafluor-; Cyclopropan, 2-Fluor-1,1-Dimethyl-; Cyclopentan, 1,1,2,2,3,4,5-Heptafluor-; Cyclobutan, 1,1,2,2-Tetrafluor-3- (trifluormethyl)-; Cyclopentan, Fluor-; Cyclopenten, 1,2,3,3,4,5-Heafluor-, trans-; Cyclopentan, 1,1-Difluor-; Cyclopentan, 1,1,2,3,3,4,5-Heptafluor-; Stereoisomer; Cyclopentan, 1,1,2,3,3,4,5-Hexafluor-, Stereoisomer; Cyclopentan, 1,1,2,3,3,4,5-Heptafluor-, cis,cis-; Cyclopenten, 1,3,3,4,5,5-Hexafluor-; Cyclopenten, 1,2,3,3,4,5-Hexafluor-, cis-; Cyclopentan, 1,1,2,3,4,5- Hexafluor-, Stereoisomer; Cyclopentan, 1,1,2,4,4,5- Hexafluor-, (2.alpha,3.alpha,4.beta,5.alpha)-; Cyclopentan, 1,1,2,3,4,5-Hexafluor-, Stereoisomer; Cyclopenten, 1,3,4,4,5,5-Hexafluor-; Cyclopenten, 3,3,4,4,5,5-Hexafluor-; Cyclopenten, 1,2,3,4,5-Pentafluor-; Cyclopenten, 1,3,4,5,5- Pentafluor-; Cyclopentan, 1,1,2,2,3,3,4,5-Octafluor-; Cyclopentan, 1,1,2,2,3,4,4,5-Octafluor-; Cyclopentan, 1,1,2,3,4,5-Hexafluor-; Cyclopropan, 2-Ethenyl-1,1-difluor-; Cyclopropan, 1,1-Difluor-2,3-dimethyl-, trans-; Cyclopropan, 1,1-Difluor-2,3-dimethyl-, cis-; Cyclobutan, 1,1,2,2- Tetrafluor-3-methylen-; Cyclobutan, 1,1,2,2,3,4-Hexafluor-3- (trifluormethyl)-; Cyclopentan, Nonafluor-; Cyclobutan, 1,1,2,2-Tetrafluor-3-methyl-; Cyclopropan, 1,2- Bis(trifluormethyl)-; Cyclobuten, 1,3,3,4,4-Pentafluor-2- methyl-; Cyclopropan, 1,1-Difluor-2,3-dimethyl-; Cyclopropan, 1-Methyl-1-(trifluormethyl)-; Cyclopropan, 1,1-Difluor-2,2- dimethyl-; 1-Butin, 1,3,4,4,4-Pentafluor-3-(trifluormethyl)-; 1,3-Pentadien, 1,1,2,3,4,5,5,5-Octafluor-; Cyclobuten, 1,2,3,3,4-Pentafluor-4-(trifluormethyl)-; 1,3-Pentadien, 1,1,2,3,4,5,5,5-Octafluor-; Spiro(2.2)pentan, Octafluor-; Pentadien, Octafluor-; 1,2-Butadien, 1,1,4,4,4-Pentafluor-3- (trifluormethyl)-; 1,2-Pentadien, 1,1,3,4,4,5,5,5-Octafluor-; Cyclopropan, Pentafluor(trifluorvinyl)-; 1,3-Pentadien, 1,1,2,3,4,5,5,5-Octafluor-; 1,4-Pentadien, 1,1,2,3,3,4,5,5- Octafluor-; Cyclopropen, 3,3-Difluor-1,2- bis(trifluormethyl)-; Cyclopenten, Octafluor-; 1,3-Butadien, 1,1,2,4,4-Pentafluor-3-(trifluormethyl)-; Cyclobuten, 1,3,3,4,4-Pentafluor-2-(trifluormethyl)-; 2-Pentin, 1,1,1,4,4,5,5,5-Octafluor-; 2-Penten, 1,1,1,2,3,4,4,5,5,5- Decafluor-; 1-Buten, 1,1,3,3,4,4,4-Heptafluor-2- (trifluormethyl)-; Cyclopropan, 1,1,2,3,-Tetrafluor-2,3- bis(trifluormethyl)-, cis-; Cyclopropan, 1,1,2,3-Tetrafluor- 2,3-bis(trifluormethyl)-, trans-; 2-Penten, 1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-Decafluor-; Cyclopropan, Pentafluor(pentafluorethyl)-; Cyclopropan, 1,1,2,3- Tetrafluor-2,3-bis(trifluormethyl)-; Cyclopropan, 1,1,2,2- Tetrafluor-3, 3-bis(trifluormethyl)-; Cyclopentan, Decafluor-, Radikalion (1-); 2-Penten, 1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-Decafluor-; 2-Buten, 1,1,1,2,4,4,4-Heptafluor-3-(trifluormethyl)-; Pentyliden, 1,2,2,3,3,4,4,5,5,5-Decafluor-; 1-Buten, 1,1,2,3,4,4,4-Heptafluor-3-(trifluormethyl)-; Penten, Decafluor-; Cyclobutan, Heptafluor(trifluormethyl)-; 1-Penten, 1,1,2,3,3,4,4,5,5,5-Decafluor-; Cyclopentan, Decafluor-; 2-Cyclobuten-1-on, 2,3,4,4-Tetrafluor-; Furan, Tetrafluor-; Silan, Tetrakis(trifluormethyl)-; Silan, Trifluor(nonafluorbutyl)-; Pentan, 1,1,1,2,2,4,5,5,5- Nonafluor-; Pentan, 1,1,1,2,2,3,5,5,5-Nonafluor-; Pentan, 1,1,1,2,2,3,3,4,5-Nonafluor-; Pentan, 1,1,1,2,3,3,5,5,5- Nonafluor-; Propan, 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-methyl-2- (trifluormethyl)-; Butan, 1,1,1,2,4,4-Hexafluor-2- (trifluormethyl)-; Pentan, 1,1,2,2,3,3,4,4,5-Nonafluor-; Butan, 1,1,1,4,4,4-Hexafluor-2-(trifluormethyl)-; Propan, 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2,2-dimethyl-; Pentan, 1,1,3,3,5,5- Hexafluor-; Butan, 1,1,1,2,3,3,-Hexafluor-2-methyl-; Pentan, Hexafluor-; Pentan, 1,2,3,3,4,5-Hexafluor-; Butan, 2-(Difluormethyl)-1,1,1,2-tetrafluor-; Butan, 1,1,1-Trifluor- 2-(trifluormethyl)-; Butan-1-13C, 4,4,4-Trifluor-3- (trifluormethyl)-; Pentan, 1,1,1,5,5,5-Hexafluor-; Pentan, 1,1,1,2,3,3-Hexafluor-; Pentan, 2,2,3-Trifluor-; Pentan, 2,2,4-Trifluor-; Butan, 1,1,1-Trifluor-2-methyl-; Butan, 1,1,1-Trifluor-2-methyl-; Butan, 1,2,2-Trifluor-3-methyl-; Butan, 1,3,3-Trifluor-2-methyl-; Butan, 2,2,3-Trifluor-3- methyl-; Butan, 1,1,1-Trifluor-2-methyl-; Butan, 1,1,2- Trifluor-3-methyl-; Pentan, 1,1,2-Trifluor-; Propan, 1,1,1-Trifluor-2,2-dimethyl-; Pentan, 1,1,1-Trifluor-; Butan, 1,1,1-Trifluor-3-methyl-; Silan, (Nonafluorbutyl)-; Silan, Dimethylbis(trifluormethyl)-; Silan, (Difluormethyl)- (fluormethyl)methyl(trifluormethyl)-; Silan, Bis- (difluormethyl)bis(fluormethyl)-; Silan, (3,3,3-Trifluor-2- (trifluormethyl)propyl)-; Silan, Trimethyl(trifluormethyl)-; Silan, Trimethyl(trifluormethyl)-; Silan, Trifluor(1- methylpropyl); Silan, (Difluormethyl)(fluormethyl)dimethyl-; Silan, Tris(fluormethyl)methyl-; Silan, (1,1-Dimethylethyl)- trifluor-; Silan, Trifluor(2-methylpropyl)-; Silan, Methyl(3,3,3-trifluorpropyl)-; Silan, Butyltrifluor-;

Beispiel 51

Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die dispergierte Phase aus irgendeiner Chemikalie zusammengesetzt sein, die einen Siedepunkt unter Standarddruckbedingungen unterhalb der Körpertemperatur des Organismus aufweist, dem die Formulierung verabreicht werden soll und der im Anschluß an die Verabreichung mit Ultraschall untersucht wird. Beispiel 45 diskutiert, wie man geeignete Chemikalien für die dispergierte Phase auf der Basis des Temperaturbereichs ausgewählt, der unter Berücksichtigung des Siedepunkts der ausgewählten Chemikalie sowie von Parametern des Herstellungsverfahrens erhalten wird.
Fluorkohlenstoffe sind, aufgrund ihrer geringen Toxizität, ihrer guten Emulgiereigenschaften sowie ihrer niedrigen Wasserlöslichkeit, die zu dauerhaften Mikroblasen führt, besonders geeignet als Chemikalien, aus denen man die dispergierte Phase ausgewählt:
1,2,2-Tris(trifluormethyl)propan; 2,2-Bis(trifluormethyl)- propan; 2-Methyl-2-trifluormethylpropan; Tetrakis(Trifluormethyl)silan; Methyl-tris(trifluormethyl)silan; Bis(trifluormethyl)dimethylsilan; Trifluormethyltrimethylsilan; 1,1-Bis(trifluormethyl)-2,2,3,3-tetrafluorcyclopropan; 1,1-Bis(trifluormethyl)cyclopropan; 1,1-Bis(trifluormethyl)- 2,2-difluorcyclopropan; 1,1-Dimethyl-(2,2,3,3)-tetrafluorcyclopropan, 2, 2-Difluor-1-methyl-1-trifluormethylcyclopropan; 1,2-Bis(trifluormethyl)-1,2,3,3-tetrafluorcyclopropan(cis+trans); 1,2-Bis(trifluormethyl)-1,2-difluorcyclopropan(cis+trans); 1,2-Bis(trifluormethyl)-3,3-difluorcyclopropan; 1,2-Bis(trifluormethyl)cyclopropan(cis+trans); 1,1,2,2,4,4,5,5-Octafluor-spiro[2.2]pentan; 1,1,2,2-Tetrafluor-spiro[2.2]pentan; 1,1,4,4-Tetrafluor-spiro[2.2]pentan; 1,1,5,5-Tetrafluor-spiro[2.2]pentan; 3,3,4,5-Tetrafluorfuran; Tris(trifluormethyl)phosphin; 1,1,2,2,3,3,4,4,5,5- Decafluorcyclopentan; 1,2,2,3,4,4,5,5-Octafluorbicyclo[1.1.1]pentan; 2,2,4,4,5,5-Hexafluorbicyclo[1.1.1]- pentan; 1,2,2,3,4,4-Hexafluorbicyclo[1.1.1]pentan; 1,2,2,3- Tetrafluorbicyclo[1.1.1]pentan; 2,2,3,3-Tetrafluorbicyclo- [1.1.1]pentan; 1,2,2,3,3,4,4-Pentafluor-1-trifluormethylcyclobutan; 2,2,3,4,4-Pentafluor-1-trifluormethylbicyclo- [1.1.0]butan; 2,2,4,4-Tetrafluor-1-trifluormethylbicyclo- [1.1.0]butan; Bicyclo[2.1.0]pentan.

Beispiel 52

Die folgenden Emulsionen wurden gemäß den Verfahren, die in Beispiel 18 beschrieben sind, formuliert und getestet.
Alle Lösungen wurden als 2%ige Lösung in einer Salzlösung hergestellt. Ein Volumen von 0,1 cm³ jeder Chemikalie wurde mit 5 cm³ Salzlösung durch einen Dreiwegehahn in 25 Durchgängen zerteilt. Ein Volumen von 1,0 ml der Mischung wurde sofort durch einen 1,2 um-Filter in ein gerührtes Wasserbad injiziert, das 1000 ml Wasser bei 37ºC enthielt. Die resultierende Rückstreuung wurde dann unter Verwendung eines Hewlett-Packard 77020A-Ultraschallsystems bei 5,0 MHz aufgezeichnet.
Die Chemikalie mit dem niedrigsten Siedepunkt und dem höchsten Dampfdruck, Dodecafluorpentan, erzeugte die stärkste Rückstreuung (den hellsten Kontrast), der am längsten anhielt und langsam innerhalb von 4 bis 5 min geringer wurde. Die hochsiedenden Chemikalien mit niedrigem Dampfdruck, Nonan und Perfluordecalin, lieferten eine gewisse Rückstreuung (weniger ausgeprägt als Dodecafluorpentan), die innerhalb von 1,5 min rasch abnahm, wobei Perfluordecalin eine höhere Rückstreuung lieferte als Nonan. Die Ethane, Dichlorethan und Halothan, lieferten eine minimale Rückstreuung, die innerhalb einer Minute bis auf die Grundlinie abnahm. Eine Mischung einer Salzlösung mit Luft lieferte die geringste Menge an Rückstreuung, die nur 5 bis 10 s anhielt.
Wenn man der Beständigkeit von Salzlösung + Luft den Wert 1 gibt, wäre Dodecafluorpentan 24-fach stärker. Wenn die Rückstreuungs-Intensität qualitativ auf einer Skala von 0 bis 5 eingeordnet würde, wäre Salzlösung+Luft 0 und Dodecafluorpentan wäre 5, Nonan 1, 2, Dichlorethan, Halothan und Perdluordecalin wären 0,5, 0,25, 0,25 bzw. 2,0.

Beispiel 53

Das Ziel dieser Untersuchung war, das Potential festzustellen, daß eine intravenöse Verabreichung der erfindungsgemäßen Emulsionen in Dosen, die im Hinblick auf eine Erzeugung eines Ultraschallkontrasts wirksam sind, an weiße Neuseeland-Kaninchen zu dem Syndrom der übermäßig aufgeblähten, nicht kollabierenden Lunge (hyperinflated noncollapsible lung; HNCL) führt. Das HNCL-Syndrom wurde von einer Anzahl von Fluorkohlenstoff-Emulsionen erzeugt, einschließlich 20% Fluorsol®, einer von der F.D.A. zugelassenen intravaskularen Perfluorchemikalien-Emulsion (beschrieben im Patent JP 1609986, durch Bezugnahme in diese Beschreibung aufgenommen), Emulsionen, die Perfluoroctylbromid enthalten (beschrieben im Patent US 4987154 und durch Bezugnahme in diese Beschreibung aufgenommen) sowie andere Fluorkohlenstoff-Emulsionen (beschrieben in den Patenten oder Anmeldungen EP 231091, JP 63060943, US 4859363, US 5171755 und JP 21196730, die durch Bezugnahme in diese Beschreibung aufgenommen werden). Der Mechanismus der Erzeugung des HNCL- Syndroms, seine potentielle Reversibilität sowie die klinische Bedeutung sind nicht bekannt. Das Syndrom wird durch Lungen charakterisiert, die bei der Nekropsie übermäßig aufgebläht sind, ein erhöhtes Gesamtvolumen aufweisen, eine verminderte mittlere Dichte und die nachweisbaren Mengen des verabreichten Fluorkohlenstoffs in den Geweben enthalten. Leland Clark, der Entdecker von HNCL, hat erklärt (Clark LC, et al., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 20, 1085-1099, 1992, durch Bezugnahme in diese Beschreibung aufgenommen), daß "wenn HNCL in anderen Spezies (d. h. Menschen) auftritt, dann können nur Fluorkohlenstoffe, die oberhalb 150ºC sieden, als sicher betrachtet werden".
Vier Gruppen von männlichen weißen Neuseeland-Kaninchen (3 pro Gruppe) wurde intravenös die Emulsion von Beispiel 44 in 0,2 oder 1,0 ml/kg verabreicht, Fluosol (Alpha Therapeutic Corp.) bei 24 ml/kg Körpergewicht, oder eine Salzlösung bei 24 ml/kg. Die Dosen wurden auf der Basis einer Dosis ausgewählt, die einen Ultraschallkontrast liefert. Körpergewichte, Nahrungsaufnahme und klinische Beobachtungen erfolgten während und unmittelbar im Anschluß an die Verabreichung. 24 Stunden nach der Verabreichung wurden die Kaninchen euthanisiert, die Lungen entnommen und das Ausmaß an Aufblähung bewertet, die Gewichte und Volumina der Lungen gemessen und die Anwesenheit von Perfluorkohlenstoffen in dem Gewebe gaschromatographisch bestimmt, und zwar unter Verwendung eines Kopfraum-Analysators.
Die Lungen der Kaninchen, die eine Salzlösung oder die Emulsion von Beispiel 44 erhielten, waren bei der Nekropsie normal und kollabierten beim Öffnen des Brustkorbs. Die Lungen der Kaninchen, die Fluosol erhielten, zeigten eine moderate bis schwere Aufblähung.
Es existierten keine behandlungsbezogenen Veränderungen unter den Gruppen im Hinblick auf die Lungengewichte oder das Lungengewicht/Körpergewicht-Verhältnis. Das Lungenvolumen, das Lungenvolumen/Körpergewicht-Verhältnis und die Lungendichtenmessungen bei den Kaninchen, denen die Emulsion von Beispiel 44 verabreicht worden war, waren verglichen mit Kontrolltieren unverändert. Die Verabreichung von Fluosol führte zu einer 175%igen Zunahme des Lungenvolumens, einer 185%igen Zunahme des Lungen/Körpergewichts-Verhältnisses und zu einer 45%igen Abnahme der Lungendichte, und zwar im Vergleich zu Kontrolltieren. Diese Veränderungen waren hoch signifikant (p = 0,001).
Dodecafluorpentan wurde bei der Analyse von Lungengewebe bei keinem der Tiere in der Gruppe nachgewiesen, die die Emulsionen von Beispiel 44 erhielten. Fluosol enthält vier Hauptpeaks und einen kleineren Peak bei der gaschromatographischen Analyse. Alle fünf Peaks wurden in Gaschromatogrammen von Kopfraum-Gewebeproben von Tieren gefunden, die Fluosol erhielten.
Unter den Bedingungen der Untersuchung hatte eine einzige Verabreichung der Emulsion von Beispiel 44 in Dosen, die einen hervorragenden Ultraschallkontrast lieferten, keinen Effekt auf die Aufblähung, das Gewicht oder die Dichte der Lunge, führte zu keinen nachweisbaren Mengen von Dodecafluorpentan in Lungengeweben, und es wird daher geschlossen, daß sie nicht zu dem Syndrom übermäßig aufgeblähter nicht-kollabierender Lungen in Kaninchen führt.
Die Emulsionen, die nach dem im Stand der Technik beschriebenen Verfahren gebildet wurden, führten zu diesem unsicheren Zustand bei Dosen, die erforderlich waren, einen Ultraschallkontrast zu erzeugen, während überraschenderweise Emulsionen mit Fluorkohlenstoffen, die so niedrig wie z. B. 29ºC sieden, die nach den in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren formuliert wurden, kein HNCL erzeugten.

Beispiel 54

Es wurde eine pharmakokinetische Studie in Beagle-Hunden durchgeführt, denen eine einzige intravenöse Dosis der Emulsion von Beispiel 44 innerhalb von 5 bis 8 s bei 0,05, 0,10 und 0,15 ml/kg verabreicht wurde, indem mehrfache, getimte Blutproben entnommen wurden und man den Dodecafluorpentan-Gehalt mittels eines validierten Gaschromatographie- Assays quantitativ bestimmte. In drei Dosierungsgruppen wurden 24 Hunde, und zwar 12 männliche und 12 weibliche untersucht.
Die Daten wurden an ein Zwei-Kompartement-Modell angepaßt, mit einem Bolus-Input und einem Output erster Ordnung. Es bestand kein signifikanter Unterschied, wenn man die männlichen und weiblichen Hunde separat verglich, oder wenn man die drei Dosierungsgruppen verglich.
Die Verteilungsphase variierte von 0,9 bis 1,3 min. Die Eliminierungsphase variierte von 30 bis 48 min. Der Wert für tmax (Zeit bis zur Maximalkonzentration im zweiten Kompartement) variierte von 5,1 bis 6,6 min. Diese Eliminierungszeiten werden verglichen mit den Eliminierungszeiten von Fluorkohlenstoff-Emulsionen des Standes der Technik, die in der Größenordnung von Monaten lagen (vgl. Clark et al., oben). Es ist klar, daß ein Bilderzeugungsmittel, das aus dem Körper in der Größenordnung von Stunden verschwindet, bevorzugt ist.

Beispiel 55

Emulsionen von Dodecafluorpentan (Siedepunkt 28 bis 29ºC), einer Mischung aus Dodecafluorpentan und Decafluorbutan mit einem Siedepunkt von 20ºC und Perfluorcyclopentan (Siedepunkt von 22,5ºC) wurden gebildet und ihre Echogenität wurde untersucht. Die Emulsionen enthielten Fluorad 170C als Tensid und wurden gebildet, indem man akustische Energie aus einem Wasserbad-Ultraschallmischer einwirken ließ. Die Echogenität wurde dadurch getestet, daß man 0,2 ml einer jeden Emulsion 1000 ml Wasser bei 37ºC durch ein 1,2 um (Micron)-Filter zusetzte und die Videodichte nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ermittelte. Die Emulsion, die Dodecafluorpentan enthielt, erzeugte eine Grauskalaintensität 6 s nach der Verabreichung von 58,5 Einheiten (Hintergrund von 2,9), die Mischung von Fluorkohlenstoffen erzeugte eine Zunahme von 3,0 auf 133,3 unter den gleichen Bedingungen, und das Perfluorcyclopentan erzeugte die stärkste Zunahme, von 3,6 auf 158,9. Somit erzeugten die niedriger siedenden Fluorkohlenstoffe eine höhere Echogenität als die höhersiedenden Fluorkohlenstoffe.

Beispiel 56

Nützliche Ultraschall-Kontrastmittelformulierungen werden dadurch gebildet, daß man Dispersionen einer niedrigsiedenden Chemikalie mit Emulsionen stabilisierte, die eine dispergierte Phase enthielten, die aus Chemikalien gebildet wird, die als solche bei der Körpertemperatur eines Organismus, der einer Ultraschalluntersuchung unterzogen wird, nicht in einem nennenswerten Ausmaß verdampfen. Beispielsweise können Fluorkohlenstoff- oder Kohlenwasserstoff-haltige Emulsionen, die aus hochsiedenden dispergierten Phasen zusammengesetzt sind, wie sie beschrieben sind in US-A-4 767 410, US-A-4 987 154, JP-A-2196730, JP-A-1609986, JP-A-63060943 und EP-A-245019 die Basis einer Formulierung bilden, bei der die Rückstreuungswirksamkeit durch die Zugabe einer Chemikalie von hohem Dampfdruck stark erhöht ist. Beispielsweise weisen Lecithinstabilisierte Perfluoroctylbromid-Emulsionen eine signifikant erhöhte Echogenität auf, wenn Perfluorcyclopentan (Siedepunkt = 22ºC) zu der dispergierten Phase vor der Feinzerteilung zugesetzt wird. Andere niedrigsiedende organische Halogenide, Kohlenwasserstoffe oder Ether zeigen den gleichen Effekt.
Obwohl die Erfindung in gewisser Hinsicht unter Bezugnahme auf definierte bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben wurde, sind für den Fachmann viele Variationen und Modifikationen offensichtlich. Es ist daher die Absicht, daß man den nachfolgenden Ansprüchen keine eng einschränkende Interpretation gibt, sondern diese sollten betrachtet werden, daß sie derartige Variationen und Modifikationen umfassen, die routinemäßig vom offenbarten Gegenstand der Erfindung ableitbar sind.

Claims

1. Kontrastmedium für die Ultraschall-Bilduntersuchung in der Form einer kolloidalen Dispersion, die eine dispergierte flüssige Phase, die eine Flüssigkeit umfaßt, die einen Siedepunkt unter 40ºC aufweist, sowie eine wäßrige kontinuierliche Phase enthält, die zur Stabilisierung wenigstens ein Tensid enthält, das nicht Tween 20 (Polyethoxysorbitanlaurat) oder SDS (Natriumdodecylsulfat) ist, wobei die genannte Dispersion einen Fluorkohlen(wasser)stoff oder eine Mischung von Fluorkohlen(wasser)stoffen umfaßt.

2. Kontrastmedium nach Anspruch 1, bei dem die Flüssigkeit der dispergierten Phase einen Perfluorkohlenstoff oder eine Mischung von Perfluorkohlenstoffen umfaßt.

3. Kontrastmedium nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Flüssigkeit der dispergierten Phase eine Chemikalie mit 5 Kohlenstoffen enthält.

4. Kontrastmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die dispergierte Phase Dodecafluorpentan umfaßt.

5. Kontrastmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Tensid ein fluorhaltiges Tensid umfaßt.

6. Kontrastmedium nach Anspruch 5, bei dem das Tensid ein Telomer B enthaltendes fluoriertes Tensid oder ein Perfluoralkylpoly(oxyethylen)-Tensid umfaßt.

7. Kontrastmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Tensid ein nicht-ionisches Polyoxypropylen-polyoxyethylenglycol-Blockcopolymer umfaßt.

8. Kontrastmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, das ein fluorhaltiges Tensid und ein nicht-ionisches Polyoxypropylen-polyoxyethylenglycol-Tensid umfaßt.

9. Kontrastmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, das außerdem ein Mittel zur Viskositätserhöhung umfaßt.

10. Kontrastmedium nach Anspruch 5, bei dem das Tensid anionisch ist.

11. Kontrastmedium nach Anspruch 10, bei dem das Mittel zur Viskositätserhöhung Saccharose ist.

12. Kontrastmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Konzentration der dispergierten Phase 0,05 bis 5% Gewicht/Volumen beträgt.

13. Kontrastmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Konzentration der dispergierten Phase 0,5 bis 3,5% Gewicht/Volumen beträgt.

14. Kontrastmedium nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem der Durchmesser der Tröpfchen der dispergierten Phase zwischen 100 und 3000 nm liegt.

15. Eine stabile biokompatible kolloidale Dispersion zur Verwendung bei der Ultraschall-Bilduntersuchung eines Tiers mit einer Körpertemperatur T, die eine flüssige dispergierte Phase und eine wäßrige kontinuierliche Phase sowie wenigstens ein fluorhaltiges Tensid zur Stabilisierung der flüssigen dispergierten Phase aufweist, wobei die genannte flüssige dispergierte Phase eine Chemikalie mit einem ausreichend hohen Dampfdruck einschließt, so daß ein Teil der genannten Chemikalie ein Gas bei der Temperatur T ist, wobei der Teil ausreichend ist, um ein Ultraschallbild des Tiers gegenüber dem Bild zu verstärken, das erhalten wird, wenn die Chemikalie sich vollständig in einer flüssigen Form befindet.

16. Stabile biokompatible kolloidale Dispersion nach Anspruch 15, bei der die genannte flüssige dispergierte Phase ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus aliphatischen Kohlenwasserstoffen, organischen Halogeniden und Ethern mit sechs oder weniger Kohlenstoffatomen.

17. Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen Kontrastmittels, das die Schritte umfaßt.

(a) Vermischen wenigstens eines synthetischen Tensids, das nicht Tween 20 (Polyethoxysorbitanlaurat) oder SDS (Natriumdodecylsulfat) ist, mit Wasser, um eine wäßrige kontinuierliche Phase zu bilden;

(b) Zugeben einer Flüssigkeit mit einem Siedepunkt von weniger als 40ºC zu der genannten kontinuierlichen Phase;

(c) Feinzerteilen der Mischung manuell, mechanisch oder unter der Wirkung von Ultraschall für eine Zeit, die ausreicht, eine Flüssig-in-Flüssig-Dispersion von Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 3000 nm zu bilden.

18. Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen Kontrastmittels, das die Schritte umfaßt:

(a) Vermischen wenigstens eines synthetischen Tensids mit Wasser, um eine wäßrige kontinuierliche Phase zu bilden;

(b) Zugeben einer Menge eines Gases, das einen Siedepunkt von weniger als 40ºC aufweist, zu der genannten kontinuierlichen Phase;

(c) Kondensieren des Gases unter Bildung einer Flüssig-in- Flüssig-Kolloiddispersion, um Teilchen der dispergierten Phase mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 3000 nm zu bilden.

19. Verwendung eines Perfluorkohlenstoffs zur Herstellung eines diagnostischen Ultraschall-Kontrastmittels zur Verwendung in einem Verfahren der in vivo-Ultraschall-Bilduntersuchung einer Person, wobei das genannte Mittel eine Flüssig-in- Flüssig-Kolloiddispersion des Perfluorkohlenstoffs in Wasser, die durch ein Tensid, das nicht Tween 20 ist, stabilisiert ist, umfaßt, worin der Perfluorkohlenstoff einen ausreichend hohen Dampfdruck aufweist, so daß wenigstens ein Teil des Perfluorkohlenstoffs bei der Körpertemperatur der Person ein Gas ist und in einer Menge vorliegt, die ausreicht, ein Ultraschallbild der Person. gegenüber dem Bild, das erhalten wird, wenn der Perfluorkohlenstoff sich vollständig in flüssiger Form befindet, zu verstärken.

20. Kontrastmedium für die Ultraschall-Bilduntersuchung in der Form einer kolloidalen Dispersion, die eine dispergierte flüssige Phase, die Perfluorhexan umfaßt, sowie eine wäßrige kontinuierliche Phase, die zur Stabilisierung wenigstens ein fluorhaltiges Tensid enthält, einschließt.