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DE69420974T2 - Separationsverfahren - Google Patents

Separationsverfahren

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DE69420974T2
DE69420974T2 DE69420974T DE69420974T DE69420974T2 DE 69420974 T2 DE69420974 T2 DE 69420974T2 DE 69420974 T DE69420974 T DE 69420974T DE 69420974 T DE69420974 T DE 69420974T DE 69420974 T2 DE69420974 T2 DE 69420974T2
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DE
Germany
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solution
particles
magnetic
container
magnetic element
Prior art date
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DE69420974T
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Matti Korpela
Jukka Tuunanen
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Thermo Fisher Scientific Oy
Original Assignee
Labsystems Oy
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Publication date
Application filed by Labsystems Oy filed Critical Labsystems Oy
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Publication of DE69420974T2 publication Critical patent/DE69420974T2/de
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Description

    Technischer Bereich
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Separierung von Biomaterialien mit der Hilfe magnetischer Partikel. Die Erfindung kann in vielen Bereichen der Biotechnologie, Biochemie und der Biomedizin angewendet werden.
    • Technischer Hintergrund
  • Polymere Mikropartikel werden in vielfacher Art als Festphase angewendet, um Biomaterial zu binden. Als Anwendungsbeispiele können DNA-Hydrierung, PCR, Separierung von Zellen und Proteinen, sowie die Reinigung von Proteinen genannt werden.
  • Große Festphasenoberflächenbereiche und geringe Diffusionsdistanzen sind vorteilhafte Eigenschaften von Mikropartikeln. Die Größe der Mikropartikel liegt üblicherweise im Bereich von 0,05 - 10um. Sie sind als unterschieliche Materialien verfügbar und für viele Anwendungsfälle preaktiviert. Die Separierung der Mikropartikel von der Lösung erfolgt in einem Zentrifugal- oder Filtrationsprozeß.
  • Auch magnetische Mikropartikel werden vielfach verwendet. Ihr Vorteil besteht in der Möglichkeit der Separierung durch äußere Magnetkräfte, ohne dass ein Zentrifugier- oder Filtrationsprozeß notwendig wäre.
  • Bei gegenwärtig verwendeten Verfahren für die Separierung magnetischer Partikel wird der Reaktionskessel in einem magnetischen Feld gehalten, sodass die Partikel konzentriert wer den, um einen sogenannten Bodensatz auf dem Kesselboden zu bilden.
  • Die von den Partikeln befreite Lösung wird dann dekantiert oder abgesaugt. Die Abtrennung magnetischer Partikel ist demgegenüber einfacher, rascher und schonender als die Abtrennung üblicher Partikel. Es muß jedoch die Lösung sehr sorgfältig aus dem Kessel entfernt werden, sodass nicht mit ihr auch Partikel entfernt werden.
  • In der Publikation US-4.272.510 werden magnetische Stifte, an deren Spitze Partikel haften, für die Verwendung zum Separieren magnetischer Mikropartikel (etwa 0,1-20 mm) bei der Immunisation vorgeschlagen. Die Partikel werden von den Stiften mechanisch getrennt, indem sie mit der Hilfe von unter dem Kessel angeordneter Magnete abgedrückt oder abgezogen werden.
  • In der Publikation EP-140787 wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem magnetische Mikropartikel mit Hilfe einer magnetischen Stange, die in eine Lösung eintaucht, aus der Lösung heraus separiert. Unter Verwendung eines starken Magneten werden dann die Partikel von der Stange entfernt.
  • In der Publikation WO-86/06493 wird ein Verfahren für die Immunüberprüfung vorgeschlagen, bei dem magnetische Partikel und ein fester labellierter Komplex aus der Lösung unter Verwendung einer magnetischen Stange und zu anschließendem Entfernen zu Prüfzwecken separiert werden. Die Stange weist einen festen Magneten auf und ein Stangenende ist mit einer entfernbaren Schutzschicht versehen, auf deren Außenseite die Partikel haften. Nach dem Separieren und vor dem Messen wird die Schutzschicht vorzugsweise mit einer anderen Schutzschicht abge deckt. Nach dem Messen werden die Schichten zusammen mit den Partikeln entfernt und entsorgt und an ihrer Stelle werden neue Schutzschichten für eine neue Separierung aufgebracht.
  • Gemäß der Publikation kann der Magnet auch ein Permanentmagnet sein, in welchem Fall das Magnetfeld entfernt wird, wenn dies notwendig ist.
  • In der Publikation WO-87/05536 wird wiederum zur Separierung magnetischer Partikel eine Stange vorgeschlagen, in der ein Magnet vertikal verstellbar ist. Wenn sich der Magnet in seiner unteren Endstellung in der Stange befindet, wird die Stange in eine Lösung eingetaucht, die Partikel enthält, wobei sich die Partikel um dieses Stangenende herum versammeln. Indem der Magnet in die obere Endposition zurückkehrt, können die Partikel von der Stange abtropfen. Auf diese Weise können Partikel gesammelt und von einer Lösung in eine andere transferiert werden.
  • In der Publikation EP-A-0479448 wird einem Behälter, der mit einer Kügelchen enthaltenden Lösung gefüllt ist, ein elektrisches Feld zugeordnet, sodass die Kügelchen immobilisiert werden. Danach wird die Lösung mittels einer Pipette dem Behälter entnommen.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Ein Separierungs- bzw. Trennverfahren, wie es durch den Anspruch 1 definiert ist, wurde nun erfunden. Einige vorteilhafte Anwendungen der Erfindung sind in den anderen Ansprüchen beschrieben.
  • Bei diesem Verfahren wird eine magnetische Partikel und an diese möglicherweise angelagertes Material enthaltende Lösung zur Trennung in einen Behälter eingesaugt und die Trennung bzw. Separierung der Partikel von der Lösung wird dadurch herbeigeführt, dass ein Separierungsmittel verwendet wird, das mit einem magnetischen Element versehen ist, das in unterschiedliche Zustände gebracht werden kann. Mit Hilfe dieses Elementes kann das magnetische Feld durch eine Trennwand in dem Separierungsmittel zur Einwirkung auf die Lösung gebracht werden, sodass die Partikel an der Trennwand angesammelt werden, oder die Einwirkung des magnetischen Feldes kann unterbrochen werden, sodass die Partikel nicht mehr an der Trennwand gehalten, sondern in eine Lösung freigegeben werden. Die Lösung, in die die Partikel freigegeben werden, ist üblicherweise verschieden von der Lösung, aus der die Partikel übernommen worden sind, sodass die Partikel von einer in eine andere Lösung übertragen werden. In einigen besonderen Fällen kann die zweite Lösung jedoch auch die ursprüngliche Lösung sein, die jedoch zwischenzeitlich einer Behandlung unterzogen wurde (beispielsweise einer Reaktion oder Messung), während die Partikel an dem Separierungsmittel haften.
  • In den meisten Fällen ist das magnetische Element vorzugsweise ein Permanentmagnet und ein das magnetische Feld wirkungslos machendes Mittel ist dem Permanentmagneten gegenüber bewegbar. Im Prinzip kann natürlich auch ein Elektromagnet zur Anwendung kommen.
  • Die Trennwand ist vorzugsweise von der Art eines Hohlkörpers, dessen Außenfläche mit der Lösung in Berührung kommt und der innerhalb eines magnetischen Elements angeordnet ist. Um die Separierung wirkungsvoller zu machen, kann die Trennwand auch einen Trennbereich geeigneter Form haben. Es kann jedoch auch die Außenwand des Behälters die Wirkung als Trennwand haben, in welchem Fall das magnetische Element außerhalb des Behälters angenordnet ist. Dabei kann das magnetische Element ringförmig oder anders ausgebildet sein.
  • Um die Erfindung anzuwenden, können Handwerkzeuge angewendet werden, die beispielsweise wie eine Pipette funktionieren. Eine andwendbare Pipettenart ist beispielsweise in den Publikationen wie folgt beschrieben: FI-47460, FR-2287941, FI-55126, FI-55127, FI-57540, EP-78724 und FI-86812. Die Werkzeuge können auch mit elektrischer Energie betrieben werden.
  • Um die Erfindung anzuwenden, kann auch ein Zubehörteil Anwendung finden, das das magnetische Element einschließt und das zusammen mit einer üblichen Pipette angewendet werden kann. Das Zubehörteil könnte beispielsweise ein Gestell sein, dem die Pipette während des Separierungsvorganges zugeordnet ist, oder es könnte sich um ein der Pipette zugeordnetes Zusatzbauteil handeln.
  • Um die Erfindung anzuwenden, können verschiedene Ein- oder Mehrkanalbausätze automatischer Ausrüstungen Anwendung finden. Auch können sie als ein Bestandteil verschiedener Arten von Ausrüstungen und Systemen verwendet werden.
  • Die Erfindung kann insbesondere für die Separierung von Mikromassepartikeln angewendet werden. Insbesondere paramagnetische Partikel können verwendet werden, wobei ihre Wiederabtrennung vom Separierungsmittel einfacher ist.
  • Durch die Erfindung ist die Entfernung magnetischer Partikel und ihre Wiedereinführung in eine Lösung einfacher, schneller und vollständiger möglich, als mit bekannten Verfahren. Außerdem ist die Erfindung für sowohl manuelle, als auch automatische Anwendung geeignet.
  • Nachfolgend werden einige vorteilhafte Anwendungen der Erfindung mehr ins einzelne gehend beschrieben. In den Zeichnungen, auf die die Beschreibung Bezug nimmt, sind:
    • Figuren
  • 1 und 2 eine Vorrichtung gemäß der Erfindung mit einem Separierungsmittel gemäß der Erfindung;
  • Fig. 3 eine Einzelheit der Vorrichtung gemäß der den Fig. 1 und 2;
  • Fig. 4 eine andere Vorrichtung mit dem in Fig. 1 und 2 dargestellten Separierungsmittel;
  • Fig. 5 eine Vorrichtung mit einem anderen Separierungsmittel gemäß der Erfindung;
  • Fig. 6 ein drittes Separierungsmittel gemäß der Erfindung;
  • Fig. 7 eine Vorrichtung mit einem vierten erfindungsgemäßen Separierungsmittel;
  • Fig. 8 eine Vorrichtung mit einem fünften erfindungsgemäßen Separierungsmittel und
  • Fig. 9 eine Vorrichtung mit einem sechsten erfindungsgemäßen Separierungsmittel.
  • Bei dem in Fig. 1 und 2 dargestellten Separierungsmittel 1 ist einem Handgriff 2 eine Pipettendüse 3 und ein diese außen umschließender verstellbarer Ringmagnet 4 zugeordnet. Die Düse ist in das Bodenende eines Zylinders 5 innerhalb des Handgriffs eingesetzt; in dem Zylinder 5 ist ein Kolben 6 verstellbar, um in der Düse eine Saug- oder Druckwirkung erzielen zu können.
  • Der Magnet 4 ist einem verstellbaren Element 7 des Handgriffes zugeordnet, das eine Stange oder ein ähnliches Bauteil sein kann und dazu dient, den Magneten in vertikaler Richtung zu verstellen.
  • Die Pipettendüse 3 umschließt einen Düsenkanal, der einen Abschnitt mit kleinerem Innendurchmesser und darüber einen kammerartigen Abschnitt mit größerem Innendurchmesser bildet. Der Bodenteil des Behälters bildet einen Separationsbereich 8 in dessen Höhe der Magnet 4 sich befindet, wenn er seine untere Endstellung einnimmt. Um magnetische Partikel 9 aus der Lösung zu separieren, wird die Lösung in den Düsenkanal eingesaugt, während der Magnet 4 seine untere Endstellung einnimmt. Dabei legen sich die Partikel an der Innenwand des Düsenkanals im Separationsbereich an und bleiben auch dann haften, wenn die Lösung aus dem Düsenkanal ausgetrieben worden ist. Wenn es gewünscht wird, kann nun eine andere Lösung in den Düsenkanal angesaugt werden, um beispielsweise einen Wascheffekt oder eine Reaktion herbeizuführen. Um die Partikel von der Wand des Düsenkanals zu lösen, wird der Magnet 4 nach oben verstellt. Wenn es gewünscht wird, kann die Lösung mit den von der Düsenkanalwand gelösten Partikeln aus dem Düsenkanal herausgedrückt werden.
  • Die Pipettendüse 3 kann jederzeit ausgewechselt werden.
  • In Fig. 4 ist eine Mehrfachsepariervorrichtung 1' dargestellt, die mit acht Pipettendüsen in paralleler Anordnung ausgestattet ist. Jede Pipettendüse ist von einem Magneten 4 umgeben und alle Magnete 4 werden zeitgleich und in gleicher Weise mittels einer gemeinsamen, dem Handgriff 2' zugeordneten Stange 7' verstellt. Die Kolben 6 haben ein gemeinsames Verstellmittel.
  • Die Mehrfachsepariervorrichtung kann auch in der Weise ausgebildet sein, dass beispielsweise zwischen benachbarten Düsen ein gemeinsamer Magnet angeordnet ist.
  • Bei der Separiervorrichtung 1.1 gemäß Fig. 5 ist ein Ringmagnet 4.1 einem Handgriff 2 zugeordnet und umgibt außen eine Pipettendüse 3. Dabei ist jedoch der Magnet im Bereich 8 der Separierung fest angeordnet. Zusätzlich ist der Düsenaußenfläche eine vertikal verstellbare Metallhülse 10 zugeordnet, deren Außendurchmesser so klein ist, dass sie in einen offenen Ringkanal zwischen dem Magneten und der Düse hinein verschoben werden kann. Dem Handgriff ist ein Bauteil 7.1 in der Form beispielsweise eines Hebels oder dergleichen zugeordnet, mit dem die Metallhülse verstellt werden kann. Ansonsten ist die Bauweise ähnlich der in Fig. 1 und 2 dargestellten Bauweise. Befindet sich die Metallhülse zwischen dem Magneten und den Düsen, so verhindert sie die Einwirkung des Magnetfeldes auf die in der Düse befindlichen Metallpartikel. Befindet sich die Metallhülse in ihrer oberen Endstellung und nicht zwischen dem Magneten und der Düse, so hält der Magnet die Partikel im Separierbereich.
  • In Fig. 6 ist die Erfindung in der Zuordnung zu einer sogenannten Pasteurpipette dargestellt. Die Separiervorrichtung 11 weist eine Pipette mit einem Düsenkanal 13 auf, der am unteren Ende offen ist und einen elastischen Behälter 14 am oberen Ende aufweist. Am oberen Ende des Behälters bildet dessen Außenfläche einen engen hohlwellenförmigen Kanal 15, bis zu dessen oberem Ende der Düsenkanal reicht. In dem Kanal befindet sich eine verstellbare Stange 16 mit einem Magneten 17 an ihrem unteren Ende.
  • Wird der Behälter 14 zusammengedrückt, so wird der Düsenkanal 13 in die Flüssigkeit eingeführt und es wird dem Behälter möglich gemacht, in seine Ausgangsform zurückzukehren, sodass Flüssigkeit in die Pipette eingesaugt wird. Nimmt die Stange 16 ihre untere Endstellung ein, so legen sich magnetische Partikel 9 aus der Flüssigkeit auf der Innenfläche des Behälters im Separierungsbereich 18 am unteren Ende des Kanals 15 an. Um die Partikel wieder freizugeben, wird die Stange in ihre obere Endstellung angehoben.
  • Bei der Separiervorrichtung 19 gemäß Fig. 7 ist ein Handgriff 20 mit einem einen verstellbaren Kolben 6.1 aufnehmenden Zylinder 5.1 vorgesehen. Innerhalb des Kolbens ist eine verstellbare Magnetstange 16' gegen Leckage abgedichtet angeordnet, der an ihrem unteren Ende ein Magnet 17 zugeordnet ist. Die Magnetstange ist mittels eines Knopfes 21 verstellbar, der ihr oberhalb des Zylinders 5.1 zugeordnet ist. Mit ihrem unteren Ende ragt die Stange 16' aus dem Zylinder heraus. Die Düse 3.1 ist gegen Verluste abgedichtet am unteren Ende des Zylinders angeordnet, sodass die Saug- oder Druckwirkung unter Einsatz des Kolbens in der Düse aufgebaut werden kann. Innerhalb der Düse halten radiale Rippen 22 ein Schutzrohr 23, das die Magnetstange am unteren Ende umschließt, wenn die Düse innerhalb des Zylinders angeordnet ist. Befindet sich die Magnetstange in ihrer unteren Endstellung, so werden sich in der Flüssigkeit enthaltene Magnetpartikel im Separierbereich 18.1 niederschlagen. Eine Halterung 24 macht es möglich, die Düse von dem Zylinder zu trennen.
  • Die Düse 3.1 enthält einen dünneren Düsenkanal und oberhalb dieses einen etwas dickeren Übergangsteil im Separierbereich 18.1 und einen noch dickeren Behälterteil am oberen Ende. Das Schutzrohr 23 bildet eine Düse, die sich über die gesamte Länge zum Düsenkanal erstreckt. Düse und Schutzrohr sind so ausgebildet, um die Separierung der Partikel zu begünstigen und eine vollständige Entfernung der Flüssigkeit zu ermöglichen.
  • Das Separiermittel 19.1 gemäß Fig. 8 ist eine Anwendung des Separiermittels 19. Dabei ist das Schutzrohr 23.1 von der Düse 3.2 getrennt. Das Schutzrohr 23.1 ist unter Verwendung eines geeigneten Mittels 25', beispielsweise eines Bundes, innerhalb des Zylinders 5.1 so angeordnet, dass der Zylinder nicht verschlossen ist. Dieses Mittel hat den Vorteil, dass die Düse unabhängig vom Schutzrohr ausgewechselt werden kann beispielsweise, wenn Partikel am Schutzrohr haften bleiben. Die Unabhängigkeit des Schutzrohres vereinfacht auch die Herstellung der Düse und des Schutzrohres unabhängig voneinander. Im Prinzip kann die Halterung 24.1 so gebaut sein, dass sie zweistufig funktioniert, indem Düse und Schutzrohr aufeinanderfolgend ausgebaut werden können. Vorzuziehen ist es jedoch, ein Schutzrohr mit einer eigenen Halterung zu verwenden und es mit dem Druckknopf des Kolbens bzw. der Kolbenstange zu betätigen.
  • Die Ausführungsform gemäß Fig. 9 ist ähnlich der Separiervorrichtung gemäß Fig. 1 und 2, weist jedoch ein separates Gestell 26 mit verstellbaren Magnetelementen 4.2 auf. Die Separiervorrichtung 1.2 weist eine Pipettendüse 3 auf, in die die Flüssigkeit zu ihrer Behandlung eingesaugt wird. Das Gestell ist mit einer Halterung 27 ausgerüstet, die dem Halten der Pipette dienen kann, sodass das magnetische Element die magnetischen Partikel 9 zum Niederschlag auf der Innenfläche der Pipette im Separierbereich 8 bringen kann. Die Flüssigkeit kann dann aus der Düse herausgebracht werden, während die Partikel in der Düse verbleiben.
  • Das bei der Erfindung verwendete magnetische Element kann auch zwei Magnete aufweisen, die mit einander zugeordneten Gegenpolen (SN-NS) angeordnet sind. Dadurch wird ein energiereicher Wechsel des Magnetfeldes im Magnetverbindungsbereich erhalten und eine günstige Voraussetzung zum Ansaugen der Partikel in diesen Bereich geschaffen. Entsprechend wird das Außenfeld der magnetischen Kupplung vertikal schwächer werden, wobei die Partikel sich einfacher nur an Stellen ansammeln, wo die Magnete angeordnet sind. Auf ähnliche Weise können mehrere Magnete hintereinander angeordnet vorgesehen sein. Dies ist vorteilhaft, wenn eine platzsparende Struktur gewünscht wird.

Claims (10)

1. Verfahren zum Entfernen von magnetischen Partikeln aus einer diese enthaltenden Lösung und zum Überführen dieser Partikel in eine andere Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung durch einen Düsenkanal eines Behälters in den Behälter eines Separationsmittels eingesaugt wird, wobei eine Trennwand vorgesehen ist, mit deren einen Seite die Lösung in Kontakt kommt und deren andere Seite ein magnetisches Element aufweist, wobei das magnetische Element einmal in einen Zustand versetzt werden kann, daß die unter dem Einfluß des magnetischen Feldes des magnetischen Elements stehenden Partikel an der der Lösung zugewandten Seite der Trennwand gesammelt werden, daß danach die Lösung durch den Düsenkanal aus dem Behälter entfernt wird und daß danach eine andere Lösung durch den Düsenkanal in den Behälter eingesaugt wird und das magnetische Element in einen Zustand derart gebracht wird, daß die Partikel nicht länger auf der Trennwand festgehalten werden.
2. Separationsmittel zum Entfernen von magnetischen Partikeln aus einer sie enthaltenden Lösung, um diese Partikel in eine andere Lösung zu überführen, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Separationsmitttel einen Behälter (3.2, 3.1, 14 oder 3) mit einem Düsenkanal zum Einsaugen der Lösung in den Behälter und zum Entfernen der Lösung aus dem Behälter aufweist, wobei eine Seite einer Trennwand(23.1, 3.1, 15 oder 3) in Kontakt mit der Lösung kommt und die andere Seite ein magnetisches Element (17, 4, 4.1 oder 4.2) aufweist, das einmal in einen Zustand versetzt werden kann, daß für die Lösung ein magnetisches Feld derart aufgebaut wird, daß die unter dem Einfluß des magnetischen Feldes stehenden Partikel auf der der Lösung zugewandten Seite der Trennwand gesammelt werden oder das zum anderen mal in einen Zustand versetzt werden kann, daß an der Trennwand nicht länger Partikel infolge des magnetischen Feldes festgehalten werden.
3. Separationsmittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennwand ein Bauteil (23.1, 23 oder 15) ist, dessen Außenfläche in Kontakt mit der Lösung kommt und das in sich das magnetische Element aufnimmt.
4. Separationsmittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennwand ein Bauteil (3) ist, mit dessen Innenfläche die Lösung in Kontakt kommt, und dessen Außenseite das magnetische Element zugeordnet ist.
5. Separationsmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Saugzylinder (5.1 oder 5) mit ihm verbunden ist, um Flüssigkeit in den Zylinder einzusaugen oder aus dem Zylinder zu entfernen.
6. Separationsmittel nach Anspruch 3 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Bauteil (23.1) und der Behälter (3.2) getrennt voneinander dem Saugzylinder zugeordnet werden können.
7. Separationsmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Element von einem Magneten (17.4 oder 4.2) gebildet wird, der gegenüber der Trennwand bewegbar ist oder von einem Magneten (4.1) dem ein Magnetfeldabschaltmittel (10) zugeordnet ist, das gegenüber der Trennwand bewegbar ist.
8. Separationsmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Element (17, 4, 4.1 oder 4.2) ein bewegbarer Magnet ist.
9. Separationsmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das magnetische Element (17.4, 4.1 oder 4.2) ein Permanentmagnet ist.
10. Separationsmittel nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennwand ein Hohlkörper ist.
DE69420974T 1993-06-21 1994-06-20 Separationsverfahren Expired - Lifetime DE69420974T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

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