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DE69403588T2 - 4-ethoxy-5-fluor-2'-deoxyuridine - Google Patents

4-ethoxy-5-fluor-2'-deoxyuridine

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DE69403588T2
DE69403588T2 DE69403588T DE69403588T DE69403588T2 DE 69403588 T2 DE69403588 T2 DE 69403588T2 DE 69403588 T DE69403588 T DE 69403588T DE 69403588 T DE69403588 T DE 69403588T DE 69403588 T2 DE69403588 T2 DE 69403588T2
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DE
Germany
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compound
fluoro
fdc
carbon atoms
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Lawrence Sowers
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City of Hope
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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft die Synthese von 5-Fluor-2'-desoxycytidin, von 5-Fluor-2'- desoxycytidin enthaltenden Oligonudeotiden und von bestimmten neuen 4-Alkoxy- 5-fluor-2'-desoxyuridinen. Die Erfindung betrifft auch diese Verbindungen enthaltende Antitumormittel.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die 5-Fluorpyrimidine umfassen eine wichtige Klasse von Antitumor-Verbindungen. Von einem Derivat dieser Klasse, 5-Fluor-2'-desoxycytidin (FdC) ist es bekannt, daß es eine potente¹&supmin;&sup5; 1/ und seiektive&sup6;&supmin;&sup8; cytostatische Eigenschaften aufweist. Es ist anerkannt, daß FdC zu FdUMP über zwei distinkte Stoffwechselwege kinasiert und deaminiert werden kann, was zur Inhibierung der Thymidylatsynthase&sup9; führt. Aufgrund der erhöhten Aktivität sowohl der Cytidin- und Desoxycytidindeaminase in vielen menschlichen Tumorzellen, ist es vorgeschlagen worden, daß FdC hervorragende Eigenschaften als ein Antitumormittel beim Menschen&sup8; haben könnte.
  • 1/Vgl. die vor den Ansprüchen angeführte Bibliographie
  • FdC wurde zuerst durch Fox et al über die Aminolyse von 4-Thio-5'-fluor-2'- desoxuridin¹&sup4; synthetisiert. FdC ist ebenfalls durch Kopplung des fluorierten Pyridimins mit einer geeigneten derivatisierten Desoxyribose¹&sup5; hergestellt worden.
  • Diese beiden Verfahren haben die Nachteile einer geringen Ausbeute und Komplexität des Erzeugnisses. Robins et al haben ein Verfahren zur direkten Fluorierung von Desoxycytidin¹&sup6; vorgestellt. Während FdC in hoher Ausbeute mit wenigen Nebenprodukten bereitgestellt wurde, sind die erforderlichen Fluorierungsreagenzien potentiell toxisch und explosiv.
  • Aus diesem Grund umfaßt ein Aspekt der Erfindung ein neues Verfahren zum Bereitstellen von FdC in hohen Ausbeuten unter milden Bedingungen.
  • Es ist ebenfalls bekannt, daß FdC wichtige biochemische Eigenschaften hat, die nicht in Beziehung mit der Inhibierung der Thymidilatsynthetase stehen. FdC kann die Zelldifferenzierung¹&sup0; induzieren und dramatische Verringerungen in den DNA 5- Methylcytosin-Niveaus10,11 verursachen. FdC wird in die zelluläre DNA inkorporiert und es konnte gezeigt werden, daß das Niveau der FdC-Inkorporierung proportional mit der Cytotoxizität¹¹ ist. Erst kürzlich ist das Interesse an FdC erneuert worden, da gezeigt werden konnte, daß FdC enthaltende Oligonudeotide potente auf Inhibitoren basierende Mechanismen von sowohl procaryotischen¹² und eucaryotischen¹³ DNA (cytosin-5)-Methyltranferasen sind.
  • Die physikalischen und biochemischen Studien zielten auf die Aufklärung der Mechanismen, welche die erforderlichen Verfahren der biologischen Eigenschaften des FdC zur Synthese von FdC in Oligonudeotiden an einzigen Stellen erklären. Früher ist FdC in Oligonudeotide durch die Inkorporation von FDCTP duch DNA- Polymerase4,5 eingeführt worden. Dieses Verfahren leidet an dem Nachteil, daß FdC an vielen Stellen inkorporiert werden würde und für physikalische Studien ausreichende Mengen praktisch nicht erhaltbar sind. Es ist berichtet worden, daß Versuche zum Herstellen von FdC-haltigen Oligonudeotiden über Standardverfahren zur Desoxycytidininkorporation fehlgeschlagen sind, da sich das N-benzylierte Derivat des FdC unter normalen synthetischen Bedingungen zersetzt&sup4;.
  • Demgemäß umfaßt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein praktisches Verfahren zum Herstellen von FdC-haltigen Oligonudeotiden.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird FdC über das Zwischenprodukt 4-Alkoxy-5-fluor-2'-desoxyuridin (4-Alkoxy FdU) hergestellt. Die 4- Alkoxy-Zwischennucleoside zeigen cytotoxische Aktivität und signifikant erhöhte Lipophilizität und Hydrolysieren zu FdU.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird FdC in Oligonudeotiden durch Aminolyse der 4-Alkoxy-5-fluor-2'-desoxyuridin- Bestandteile enthaltenden Oligonudeotide hergestellt (Vgl. Figur 2).
  • Die Erfindung beinhaltet ebenfalls eine Klasse neuer Verbindungen mit der Strukurformel
  • in welcher R&sub1; ein geradkettiger oder verzweigtkettiger Akylrest mit eins bis achtzehn Kohlenstoffatomen und R&sub2; Wasserstoff, ein Phosphat, ein Thiophosphat, ein Phosphatester oder Thiophosphatester sind. So kann R&sub1; Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Hexyl, oder jeder zwei bis achtzehn Kohlenstoffe enthaltender geradkettiger oder verzweigtkettiger Alkylrest sein. Der R&sub1;-Rest kann Kohlenstoffdoppel- oder dreifach- bis Kohlenstoffatombindungen enthalten. Der R&sub1;- Rest kann auch mit Chlor, Brom, Fluor oder Jod, durch eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe, mit -NO&sub2; oder mit anderen Substituenten substituiert sein. Diese Verbindungen hydrolysieren spontan in Zielzellen (Targetzellen), um das aktive chemotherapeutische Mittel FdU und dessen Derivate zu bilden.
    • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Figur 1 zeigt ein Reaktionsschema für die Herstellung von FdC gemäß einer Ausführungsform der Erfindung. Beachte, daß die Figur den Nummern 1 bis 3, 4a, 4b und 5 den verschiedenen Verbindungen zuschreibt, welche im Text der ausführlichen Beschreibung der Erfindung wiederholt werden.
  • Figur 2 zeigt ein Reaktionsschema für die Synthese von FdC-haltigen Oligonudeotiden gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung. Beachte, daß die Figur den Nummern 4b, 6, 7, 8 und 9 den verschiedenen involvierten Verbindungen zugeschrieben ist. Diese Bezeichnungen werden im Text in der detaillierten Beschreibung der Erfindung wiederholt.
  • Figur 3 zeigt ein Gaschromatogramm hydrolysierten Cytosins (C) und Fluorcytosin (FC) von FdC-haltigem Oligonucleotid aus sieben Basen.
  • Figur 4 ist ein Massenspektrum des silylierten FC-Peaks gemäß Figur 3.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Synthese von FdC
  • Das Syntheseverfahren gemäß der Erfindung für die Umwandlung von FdU in FdC ist ähnlich dem kürzlich durch Divakar und Reese für die Umwandlung von araU in araC¹&sup7; beschriebenen, mit der Ausnahme der Einführung der hier beschriebenen 4- Alkoxyderivat-Zwischenprodukte. Aufgrund der erhöhten Reaktivität der 5- Fluorderivate werden gewisse Modifaktionen angewendet, um die Umwandlung von FdU in FdC in hoher Ausbeute unter milden Bedingungen zu erzielen.
  • Wie in Figur 1 dargestellt, wurden die Zuckerhydroxyle des FdU (1) mit Essigsäureanhydrid in Pyridin acetyliert. Die Umsetzung schreitet in beinahe quantitativer Ausbeute fort. Lösungsmittel und überschüssiges Acetylierungsmittel werden unter verringertem Druck entfernt und das erhaltene weiße Diacetylderivat (2) wurde in demselben Kolben zu den 4-Triazol-Zwischenprodukt (3) umgewandelt. Der Fortlauf der Reaktion wurde durch Änderungen in dem Ultravioletspektrum eines Aliquots in Methanol überwacht. Das Absorptionsmaximum des Ausgangsmaterials beträgt 271 nm, während das des Triazol-Zwischenprodukts 331 nm ist.
  • In dem Divakar und Reese-Verfahren¹&sup7; wurde das 4-Triazol-Zwischenprodukt mit einer Bicarbonatlösung gewaschen. Jedoch war es die Erfahrung des Anmelders, daß dies zu einer signifikanten Zersetzung des Triazol-Zwischenprodukts (3) führt, sogar mit frisch zubereitetem Bicarbonat. Versuche, das Triazolderivat- Zwischenprodukt durch entweder Kristallisierung oder Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie zu isolieren, führte unweigerlich zur Erzeugung großer Mengen der Verbindung (2). Versuche, das rohe Triazolderivat in FdC durch entweder Ammoniumhydroxid oder ethanolischem Ammoniak umzuwandeln, führte zur Wiedergewinnung signifikanter Mengen an FdU.
  • Gemäß der Erfindung wurde das Triazol-Zwischenprodukt (3) in die Alkoxyderivate durch entweder Natriummethoxid (4a) oder Natriumethoxid (4b) umgewandelt. Der Ersatz des Triazolrestes durch Alkoxy führte zur hoher Ausbeute mit gleichzeitiger Deprotektion des Zuckerbestandteiles. Die 4-Alkoxydesoxynucleoside (4) werden leicht durch Siliciumdioxid-Gelchromatographie getrennt Die Ausbeuten an dem Ethoxyderivat waren erheblich höher als die Ausbeuten an dem Methoxyderivat.
  • Die Alkoxyderivate wurden in FdC (5) mit ethanolischem Ammoniak umgewandelt. Das 4-Ethoxy-5-fluor-2'-desoxyuridin (4b) wird quantitativ in FdC mit ethanolischem Ammoniak über Nacht bei Raumtemperatur umgewandelt, wohingegen die Behandlung des Methoxyderivates (4a) mit methanolischem Ammoniak signifikante Mengen an FdU (1) erzeugt. Das aus dem Ethoxyderivat gebildete FdC ist analytisch rein und erfordert keine nachfolgende Chromatographie. FdU kann daher in FdC über das 4-Ethoxyderivat in 78 % Ausbeute umgewandelt werden.
  • In wäßriger Lösung werden die 4-Alkoxyderivate (4) in FdU (1) umgewandelt. Die Reaktion wird durch Änderungen im UV-Spektrum überwacht, welche ein isosbestischen Punkt bei 276 nm zeigen. Die Reaktion ist sowohl säure- wie basenkatalysiert. Bei pH 11 sind die Halbwertszeiten für die jeweiligen Methoxy (4a)- und Ethoxy (4b) -Derivate 3,3 und 12 Stunden. Die Hydrolyserate wurde als direkt proportional zu der Hydroxidkonzentration gefunden.
  • Bei pH 8, sind die Alkoxyderivate elektronisch neutral und signifikant lipophiler als die Ausgangsverbindung FdU. Die relativen Verteilungskoeffizienten zwischen 0,1M Phosphatpuffer, pH 7,0, und 1-Octanol¹&sup8; wurden für FdU mit (1) 0,053; FdC mit (5), 0,028; 4-Methoxy-FdU (4a) mit 0,24; 4-Ethoxy-FdU (4b) mit 0,78 bestimmt.
    • BIOLOGISCHE TESTS
  • Zellkultur und cytostatische Aktivität (Wachstumsinhibierung): Die menschliche T- Zelllinie CCRF-CEM wurde von J.S. Holcenberg, Childrens Hospital of Los Angeles, erhalten. Die Pflege der Kulturen in RPMI 1640-Medium und die Wachstumsinhibierungs-Assays wurden wie vorher beschrieben²&sup4; durchgeführt, mit der Ausnahme, daß mit Eisen ergänztes Rinderkälber-Serum routinemäßig anstelle von dialysiertem fötalem Rinderserum verwendet wurde und die Inhibierung des Zellwachstums auf die Kulturdichten nach vier Tagen ohne Verdünnung der Kulturen basierte. Dreifachkulturlöcher wurden für jede Arzneimittelkonzentration ausgezählt und die Mittelwerte wurden verwendet, um die EC&sub5;&sub0;S durch lineare Interpolation zwischen den Konzentrationen jedes Arzneimittels, welche zu Kulturdichten direkt über und unter 50 % der Dichte der arzneimittelfreien Kontrollkulturen führte, berechnet. Die Kulturdichten wurden auch nach drei Tagen bestimmt, um zu überprüfen, ob das Zellwachstum in Kulturen ohne cytotoxische Mittel fortfuhr.
  • Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigen die vier 5-Fluorpyrimidine FdU, FdC, 4a und 4b Cytotoxizität gegenüber CCRF-CEM-Zellen in Kultur: Tabelle 1
  • Wie Tabelle 1 zeigt, ist die Reihenfolge der Aktivität FdC (5) > FdU (1) > 4- EthoxyFdU (4b) > 4-MethoxyFdU (4a). Die größere Toxizität von FdC ist wahrscheinlich das Ergebnis multipler Wirkungsmechanismen.
  • Die Alkoxyderivate hatten eine zu 5-Fluoruracil ähnliche Aktivität, welches in regelmäßiger klinischer Verwendung ist. Die größere Beschränkung bei der in vivo- Aktivität des FdUrd ist die Spaltung über die Plasmathymidinphosphorylase, und weder die Desoxycytidin-Derivate²&sup5; noch das 4-Methoxy-5-fluor-2'-desoxyuridin²&sup6; werden über diesen Weg katabolisch abgebaut. Anders also sowohl Fluoruracil und FdUrd sind die Alkoxyderivate elektronisch neutral bei physiologischem pH. Die Alkoxyderivate sind signifikant lipophiler und die Lipophilizität ist abhängig von der Länge des 4-Alkoxyrestes.
  • Kürzlich ist gezeigt worden, daß das Nudeosidanaloge AZT in menschliche Erythrocyten und Lymphocyten durch nicht-erleichterte Diffusion¹&sup8; eintreten kann. Diese unübliche Eigenschaft wurde mit der erhöhten Lipophilizität (20-fach) des AZT gegenüber dem dT erklärt. Die Alkoxyderivate (4a) und (4b) sind lipophiler als FdU (jeweils 4,5- und 14,7-fach). Die von der Formel I umfaßten 4-Alkoxyderivate und verwandten Verbindungen können daher die Zeilen sowohl über einen erleichterten Transport betreten, da das 3'-Hydroxyl noch intakt ist, oder durch die nicht-erleichterte Diffusion wegen der erhöhten Lipophilizität.
    • Beispiel I
  • Dieses Beispiel beschreibt die tatsächlichen, gemäß Figur 1 gezeigten Verfahren.
    • Materialien und chemische Verfahren
  • FdU wurde von QUAD Pharmaceutical, Inc. erhalten. Alle anderen Chemikalien wurden von Aldrich Chemical Co. erhalten. Pyridin und Acetonitril wurden destilliert und über Molekularsieben gelagert. Alle anderen Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung verwendet. NMR-Protonenspektren wurden bei 500MHz aufgezeichnet. Massenspektren wurden unter Verwendung einer Glycerinmatrix erhalten.
  • Das Instrument wurde auf die positive Ionenweise betrieben und die Proben wurden chemisch ionisiert (CI). UV-Spektren wurden mit einem Cary 219 UV/sichtbaren Spektralphotometer erhalten. Die Dünnschichtchromatographie wurde mit Siliciumdioxidgelplatten durchgeführt, die mit 10 % Methanol in Dichlormethan entwickelt wurden. Die Säulenchromatograhpie verwendete ein Siliciumdioxidgel von 60-120 Mesh und Methanol in Dichlormethan. Der pH der wäßrigen Lösungen wurde mit einem Fisher Accumet pH-Meter bestimmt.
    • Biologische Tests:
  • CCRF-CEM-Zellen waren eine Spende von Dr. John Holcenberg und wurden wie vorstehend beschrieben in Suspension wachsen gelassen.
    • Chemie 3',5'-Diacetyl-5-fluor-2'-desoxycvtidin (2)
  • FdU (2g, 8,1 mmol) wurde zweimal durch Verdampfung des Pyridins getrocknet und in 50 ml trockenem Pyridin resuspendiert. Fünf Aquivalente Essigsäureanhydrid (3,82ml) wurden tropfenweise zugesetzt. Der Fortgang der Reaktion wurde durch TLC überprüft. Nach zwei Stunden wurde ein Überschuß an Methanol zugesetzt und die Reaktion während zehn Minuten unter Rühren fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei ein klares Glas erhalten wurde, welches zu einem weißem Pulver durch Co-Verdampfung von Toluol getrocknet wurde. Die Ausbeute an (2) war 2,65g (quantitative Umwandlung), welches analytisch rein war. TLC Rf 0,85 in 10 % MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;, ¹H- NMR (D&sub6;DMSO) ppm 11,90 (1H, s, NH), 7,97 (1H, d, CH&sub6;), 6,14 (1H, t, H1'), 5,17 (1H, m, H3'), 4,24 (2H, d H5'), 4,16 (1H, m, H4'), 2,47 (1H, m, H2'/H2"), 2,29 (1H, m H2'/H2") 2,26 (6H, s, Acetyl). M+H/e berechnet: 331,0941, gefunden: 331,1010. Anal. (C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub5;N&sub2;O&sub7;F) C, H, N, F.
    • 3',5'-Diacetyl-4-triazol-5-fluor-2'-desoxyuridin (3)
  • Zu 50 ml trockenem Acetonitril in einem Eisbad wurden 1,2,4-Triazol (5,04g, 9eq) und Phosphorylcplorid (1,51 ml, 2eq) zugesetzt. Anschließend wurde Triethylamin (9,7 ml, 8,6 eq) tropfenweise zugesetzt. DiacetylFdU (2) in 50 ml trockenem Acetonitril (8,1 mmol) wurde anschließend der das Trialzolreagenz enthaltenden Lösung über einen Zeitraum von fünf Minuten tropfenweise zugesetzt. Der Fortgang der Reaktion wurde durch Änderungen in den UV-Spektren eines Aliquots der Reaktionsmischung in MeOH überwacht. Nach 45 Minuten bei Eisbad- Temperatur wurde die Reaktion durch die Zugabe von Triethylamin (6,76 ml, 6eq) und Wasser (1,75 ml, 12 eq) beendet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck verdampft. Die Identität des Zwischenprodukts wurde durch Massen-, NMR- und UV-Spektroskopie bestätigt. Das 4-Triazol-Zwischenprodukt ist eine hochreaktive Verbindung und Versuche, eine analytisch reine Probe für die Elementaranalyse sowohl durch Chromatographie oder Umkristallisation zu erhalten, führte unweigerlich zu der Erzeugung signifikanter Mengen des 4-Keto- Ausgangsmaterials (2). TLC Rf 0,90 in 10 % MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;, ¹H-NMR ppm 9,37 (1H, S, Imidazol), 8,64 (1H, d, H&sub6;), 8,43 (1H,s, Imidazol), 6,15 (1H, t, H1'), 5,18 (1H, m, H3'), 4,27 (2H, d, H5'), 4,19 (1H, m, H4'), 2, 47 (1H, m, H2'/H2"), 2,25 (1H, m, H2'/H2"), 2,09 (6H, 5, Acetyl). TLC Rf 0,90 (10 % MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;). UV (MeOH) 331 (3,290), 293 (1,270), 254 (5,850), 232 (2,810) M+H/e berechnet: (C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub7;N&sub5;O&sub6;F) 382,1162, gefunden: 382,1106.
    • 4-Methoxy-5-fluor-2'-desoxyuridin (4a)
  • Die Hälfte der rohen Triazolreaktionsmischung (3) wurde durch Verdampfung des Lösungsmittels unter verringertem Druck getrocknet und anschließend zweimal aus MeOH umkristallisiert. Der Rückstand wurde anschließend in 50 ml MeOH suspendiert und eine Lösung von 3,5 eq NaOMe in 50 ml MeOH zugesetzt. Die TLC ergab eine vollständige Umwandlung in weniger als 10 Minuten. Das Lösungsmittel wurde verdampft und die Verbindung (4a) wurde durch Siliciumdioxidgel-Chromatographie isoliert. Erhalten: 0,78 g, 74 % Ausbeute an FdU. TLC Rf 0,29 (10 % MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;). H-NMR 8,47 (1H, d, H&sub6;), 6,06 (1H, t, H1'), 5,31 (1H, d, 3'OH), 5,23 (1H, t, 5'OH), 4,22 (1H, q, H3'), 3,91 (3H, 5, 0-CH&sub3;), 3,82 (1H, q, H4'), 3,59 (2H, m, H5'/H5"), 2,22 (1H, m, H2'/H2"), 2,05 (1H, m, H2'/H2"): UV (pH 7,0) 284 nm (6,324), 242nm (766). M+H/e berechnet: 261,0886, gefunden: 261,0933. Anal (C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub3;N&sub2;O&sub5;F) C,H,N,F.
    • 4-Ethoxy-5-fluor-2'-desoxyuridin (4b)
  • Die 4-Ethoxy-Verbindung (4b) wurde wie vorstehend mit Natriumethoxid in Ethanol hergestellt. Die Ersetzung des Triazonbestandteus war sehr schnell, jedoch erforderte die Deprotektion des Zuckers ein Rühren bei Raumtemperatur während 30 Minuten. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt und die Verbindung durch Siliciumdioxidgel-Säulenchromatographie isoliert. Erhalten: 0,89g, 80 % Ausbeute an FdU. TLC Rf 0,31(10 % MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;). ¹H-NMR ppm 8,47 (1H, d, H&sub6;), 6,06 (1H, t, H1'), 5,24 (1H, d, 3'OH), 5,18 (1H, t, 5'OH), 4,37 (2H, m, O-CH&sub2;-CH&sub3;), 4,23 (1H, m, H3'), 3,83 (1H, m, H4'), 3,67 (2H, m, H5'/H5"), 2,24 (1H, m, H2'/H2"), 2,05 (1H, m, H2'/H2"), 1, 32 (3H, m, O-CH&sub2;-CH&sub3;). UV (pH 7,0) 284 nm (6,324), 242 nm (811). M+H/e berrechnet: 275,1043, gefunden: 275,0976. Anal (C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub5;N&sub2;O&sub5;F) C,H,N,F.
    • 5-Fluor-2'-desoxycytidin (5)
  • Das 4-Ethoxyderivat (4b) (0,5 g, 1,8 mmol) wurde mit ethanolischem Ammoniak bei Raumtemperatur über Nacht behandelt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. TLC ergab eine komplette Umwandlung in 5-Fluor-2'desoxycytidin. Erhalten: 0,44 g, 98 % gereinigte Ausbeute an Verbindung (4b), 78 % Gesamtausbeute. TLC Rf 0,11(10 % MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;). ¹H-NMR ppm 8,08 (1H, d, H&sub6;), 7,73 (1H, breites Singlett, Amino)7, 49 (1H, breites Singlett, Amino) 6,09 (1H, t, H1'), 5,22 (1H, d, 3'OH), 5,11 (1H, t, 5'OH), 4,21(1H, m, H3'), 3,76 (1 H, m, H4'), 3,56 (2H, m, H5'/H5"), 2,11 (1H, m, H2'/H2"), 1,97 (1H, H2'/H2"). UV (pH 7,0) 280 (8,700), 258 (5,890). M+H/e berechnet: 246,0890, gefunden 246,0897. Anal. (C&sub9;H&sub1;&sub2;N&sub3;O&sub4;F) C,H,N,F.
    • Hydrolyse der Alkoxyderivate (4a und 4b)
  • Lösungen von 4-Methoxy (4a)- und 4-Ethoxy-5-fluor-2'-desoxyuridin (4b) (1,5 x 10&supmin;&sup4; M) wurden in ungepuffertem deionisiertem Wasser hergestellt. Der pH der Lösungen wurde durch Zugabe von 1N NaOH oder 1N HCl eingestellt. Beide Alkoxyderivate wurden quantitativ in FdU in wäßriger Lösung umgewandelt. Ein isosbestischer Punkt wurde im UV-Spektrum der Lösungen bei 276 nm beobachtet. Das erhaltene UV-Spektrum nach Vervollständigung der Hydrolyse bei beiden Verbindungen 4a und 4b waren von FdU&sup9; nicht unterscheidbar. Bei pH 11, wurden die Umwandlungshalbwertszeiten (4T1) jeweils für die Methoxy- und Ethoxy- Derivate zu 2,2H und 12,5H bei 25ºC gefunden. Es wurde gefunden, daß die beobachtete Hydrolyserate für beide Verbindungen proportional zu [-OH] war (Daten nicht gezeigt).
    • Inkorporation von FdC in Oligonucleotide
  • Die Inkorporation von FdC in ein Oligonucelotid gemäß dem Verfahren der Erfindung ist in Figur 2 gezeigt. Verbindung (4b) wurde als ein Precursor für die Synthese verwendet. Die 4b-Verbindung wurde in das 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O- (N,N-diisopropylcyanoethyl)phosphoramidit (4b T6T7) gemäß Standardverfahren umgewandelt¹&sup9;&supmin;²¹. Verbindung (6) ¹H-NMR (DMSO d&sub6;) 7,9 (d,1, H5), 7,3 (9, m, Ar), 6,9 (4, m, Ar), 6,2 (t, 1, H1'), 5,4 (d, 1, 3'OH), 4,3 (m, 3, O-CH&sub2;CH&sub3;), 3,9 (m, 1, H4'), 3,4 (m, 2, H5'), 2,87 (s, 3, OCH&sub3;), 2,85 (s, 3, OCH&sub3;), 2,2 (2, m, H2'), 1,15 (t, 3, OCH&sub2;CH&sub3;). Verbindung (7) ³¹P-NMR (Cl&sub3;CD) 146,9, 146,4. Ein Oligodesoxynucleotid mit sieben Basen 3'd (C G G FC G A C) wurde manuell im 20 µmol Maßstab unter Verwendung von Standardphosphoramidit-Verfahren synthetisiert. Das wirksam an das Oligonucleotid gekoppelte O&sup4; EtFdU-Amidit (6) war nicht von der Kopplung der normalen Amidite (> 98 %) unterscheidbar.
  • Nach Synthese wurde das Oligonucleotid in ethanolischem Ammoniak bei 60ºC während 12 Stunden (9T10) deprotektiert. Das einen 5'Tritylrest enthaltende Oligonucleotid wurde durch Reversphasen-HPLC gereinigt. Nach Detritylierung mit 80 % Essigsäure wurde das Oligonucleotid erneut durch Ionenaustausch-HPLC gereinigt. Überschüssiges Salz wurde durch Dialyse entfernt.
  • Ein Teil des gereinigten Oligonucleotids wurde enzymatisch mit Nudease P1 und bakterieller alkalischer Phosphatase gespalten²². Die durch die Spaltung erhaltenen Desoxynudeoside wurden durch Reversphasen-HPLC analysiert. (Beachte: HPLC verwendete eine Perkin Eimer Serien-4-Gradientenpumpe und eine Pharmacia/LKB-Spektraldiodenarray-Detektor. Die Trennung der Desoxynudeoside wurde mittels Chromotographie durch eine Elution mit 0,05 M Natriumphosphat pH 4,5 und einem zunehmenden linearen Methanolgradienten (3- 50 %) erreicht). Die Desoxynudeoside dC, FdC, dG und dA lagen in den korrekten Verhältnissen bezogen auf die Intergrierung der Chromatogramm-Peaks vor. Die Identität des FdC-Peaks wurde durch Co-Chromatpgraphie mit authentischem FdC und durch die charakteristischen UV-Spektren des mit einem Photodiodenarray- Detektors gemessenen Chromatogramm-Peaks bestätigt.
  • Auffallend fehlend in dem Chromatogramm war ein Peak, welcher dem FdU entspricht. Eine vorher versuchte FdC-Oligosynthese unter Verwendung von 4- MethoxyFdU gefolgt von der Deprotektion mit methanolischem Ammoniak führte zu einer signifikanten Hydrolyse bei der Bildung des FdU.
  • Um die Zusammensetzung weiter zu bestätigen, wurde das FdC-Oligonucleotid in Ameisensäure hydroylisiert. Die freigesetzten Basen wurden silyliert (TMS) und anschließend durch GCMS analysiert. Das Verfahren gemäß Dizdaroglu²³ wurde für die Herstellung der Basen für die GCMS-Analyse und für die GCMS- Bedingungen verwendet. Als Instrumente wurde ein HP5070B Massenselektiv- Detektor mit einer modifizierten Phrasor Scientific-Hochenergiedynode und einem HP 5890A-Gaschromatographen verwendet. Das ausgewählte Ionenchromatogramm bei 254amu ist in Figur 3 gezeigt. Cytosin und 5-substuierte Cytosinderivate haben ein charakteristisches Ionenbruchstück bei 254amu. Das Massenspektrum des silylierten Fluorcytosin-Peaks ist in Figur 4 gezeigt. Das Ausgangsion wird bei 273amu beobachtet. Das häufigste Ion wird bei 258amu beobachtet, entsprechend einem Verlust einer Methylgruppe aus dem Trimethylsilylderivat. Das 254amu-Ion resultiert aus dem Verlust an Fluor.
    • BIBLIOGRAPHIE
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Claims (10)

1. Verfahren zum Synthetisieren von 5-Fluor-2'-desoxycytidin durch
(a) Umsetzung eines Triazols mit der Strukturformel
mit einem Alkalimetallalkoxid der Formel
X-O-R ,
worin X ein Alkalimetall und R ein geradkettiger oder verzweigtkettiger Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen sind, um eine Verbindung der Formel II
zu ergeben, und
(b) Umsetzung dieser Verbindung der Formel II mit einer nudeophilen Base, um 5-Fluor-2'-desoxycytidin zu erzeugen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das in Stufe (a) verwendete Alkalimetallalkoxid Natriummethoxid oder Natriumethoxid und die in Stufe (b) verwendete Base ethanolischer Ammoniak sind.
3. Verfahren zum Synthetisieren von 5-Fluor-2'-desoxycytidin nach Anspruch 1, bei dem das in Anspruch 1 definierte 4-Triazol der Formel I durch Acetylieren der Hydroxylgruppen einer Verbindung der Formel
mit Essigsäureanhydnd in Pyridin hergestellt wird, um eine Verbindung der Formel
zu bilden, die zu dem 4-Triazolzwischenprodukt der Formel I umgewandelt wird.
4. Verfahren, das die Umwandlung einer Verbindung der Formel
worin R eine Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen ist, zu dem entsprechenden 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-(N,N-diisopropylcyanoethyl)-phosphoramidit und anschließendes Koppeln dieses Phosphoramidits an ein Oligonucleotid umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin R Ethyl ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, das weiter die Umsetzung dieses an ein Oligonucleotid gekoppelten Phosphoramidits mit einem Nucleophil umfaßt, um ein Oligonucleotid mit darin eingebautem 5-Fluor-2'-desoxycytin zu erzeugen.
7. Verbindung der Formel
worin R&sub1; ein geradkettiger oder verzweigtkettiger Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen und R&sub2; Wasserstoff, ein Phosphat, Thipohosphat, Phosphatester oder Thiophosphatester sind, mit der Maßgabe, daß diese Verbindung nicht 4-Methoxy- 5-fluor-2-desoxyuridin oder dessen Monophosphatderivat ist.
8. Verbindung nach Anspruch 7, worin R&sub1; ein Alkylrest mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
9. Verbindung nach Anspruch 7, worin R&sub1; Ethyl ist.
10. In vitro-Verwendung einer Verbindung der Formel
als cytotoxisches, Mittel, worin R&sub1; ein geradkettiger oder verzweigtkettiger Alkylrest mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen und R&sub2; Wasserstoff, ein Phosphat, Thipohosphat, Phosphatester oder Thiophosphatester sind.
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