DE69331193T2

DE69331193T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur verhinderung von entzündungen, die durch endothelzellen und fibrinogen ausgelöst werden

Info

Publication number: DE69331193T2
Application number: DE69331193T
Authority: DE
Inventors: C. Altieri; E. Geltosky; R. Languino; F. Plow
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1992-06-11
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 2002-04-18
Anticipated expiration: 2013-06-12
Also published as: EP0644768A4; AU675073B2; DE69331193D1; ATE209040T1; CA2137813A1; AU4632793A; WO1993025218A1; PT644768E; EP0644768B1; DK0644768T3; EP0644768A1; ES2165366T3

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Zusammensetzungen zur Hemmung der Fibrinogen-Bindung an Endothelzellen zum Zwecke der Hemmung der durch Endothelzellen und Fibrinogen vermittelten Entzündung.

Hintergrund

Die Adhäsion von Leukozyten an das Gefäßendothel ist eines der ersten Ereignissein einer Vielzahl von immun-entzündlichen Reaktionen. Der Vorgang ist an Gefäßverschlüssen beteiligt und trägt zu atherothrombotischen Läsionen bei. Auf der molekularen Ebene ist die Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen ein redundanter Mechanismus, unterstützt durch die geregelte Erkennung einer ungleichartigen Gruppe von Membran-Rezeptoren, einschließlich Integrinen, exprimiert sowohl auf Leukozyten und ruhenden oder Cytokin-aktivierten Endothelzellen.
Integrine sind eine funktionell und strukturell verwandte Gruppe von Rezeptoren, die mit einer großen Vielzahl von Liganden, einschließlich extrazellulären Matrixglycoproteinen, Komplement und anderen Zellen, wechselwirken. Integrine sind an der Zell-Matrix- und an der Zell-Zell-Adhäsion in vielen physiologisch wichtigen Vorgängen beteiligt, einschließlich embryologischer Entwicklung, Hämostase, Thrombose, Wundheilung, Immun- und Nichtimmun-Abwehrmechanismen und onkogener Transformation; vgl. Hynes, Cell, 48: 549-554 (1987). Die Mehrzahl der Integrine, die an der dynamischen Zelladhäsion beteiligt sind, binden ein Tripeptid, Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD), das in ihrem Liganden vorliegt, was Zelladhäsion bewirkt; vgl. Ruoslahti et al., Science, 238: 491-497 (1987).
Mac-1 (CD11b/CD18) ist ein Integrin-Rezeptor, der vorherrschend auf Macrophagen und Granulozyten gefunden wird. Wie alle Integrin-Rezeptoren ist Mac-1 ein heterodimeres, Transmembran-Glycoprotein, das aus nicht kovalent assoziierten α- und β-Untereinheiten zusammengesetzt ist.
Mac-1 vermittelt die Adhäsion von Neutrophilen/Monozyten am Gefäßendothel und die Phagocytose von Komplement-opsonisierten Teilchen. Antikörper zu dem Mac-1- Rezeptor ändern die neutrophile Funktion in vivo einschließlich der Hemmung der Neutrophilmigration in entzündliche Stellen; vgl. Price et al., J. Immunol., 139: 4174- 4177 (1987). Mac-1 fungiert ebenfalls als ein Rezeptor für Fibrinogen in einer Reaktion, die mit der Fibrinabscheidung auf der Monozytenoberfläche verbunden ist; vgl. Altieri et al., J. Cell Biol., 107: 1893-1900 (1988); Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 7734-7738 (1988); Trezzini et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 156: 477-484 (1988) und Gustafson et al., J. Cell Biol., 109: 377-387 (1989).
Fibrinogen ist ein komplexes Molekül von annähernd 340000 Dalton und besteht aus drei Paaren von Polypeptid-Untereinheiten, die als α-, β-. und γ-Ketten bezeichnet werden. Diese einzelnen Ketten werden durch einige Disulfidbindungen zusammengehalten. Die proteolytische Verdauung von Fibrinogen durch Plasmin ergibt Fragmente A, B, C, D und E, die alle ein Molekulargewicht von weniger als 85000 Dalton haben; vgl. Pizzo et al., J. Biol. Chem., 247 : 636-645 (1972).
Die weitere proteolytische Verdauung von Fibrinogen durch Plasmin ergibt ein D&sub3;&sub0;-Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 30000 Dalton, das Teile der α-, β- und γ-Ketten von Fibrinogen enthält; vgl. Furlan et al., Biochim. Biophys. Acta., 400: 95-111 (1975).
Die Abscheidung von Fibrinogen auf der Leukozytenoberfläche tritt in einer Vielzahl von entzündlichen Reaktionen auf, wie der Hypersensitivität vom verzögerten Typ, der Abstoßung von unverträglichem Transplantat und der Physiopathologie beim Gefäßverschluss und bei der Atherogenese; vgl. Geczy et al., J. Immunol., 130: 2743-2749 (1983); Hooper et al., J. Immunol., 126: 1052-1058 (1981); Colvin et al., J. Immunol., 114: 377-387 (1975); Hattler et al., Cell Immunologiv, 9: 289-295 (1973); Gerrity, R. G., Am. J. Pathol., 103: 181-190 (1981) und Am. J. Pathol., 103: 191-200 (1981); und Shelley et al., Nature, 270: 343-344 (1977).
Wechselwirkungen von Fibrinogen auf Rezeptoren der Zelloberfläche von Endothelzellen sind beschrieben worden. Languino et al., Blood, 73: 734 (1989) beschreiben die Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen durch einen RGD-abhängigen Mechanismus. Es wird allgemein angenommen, dass der Vitronectin-Rezeptor der Hauptendothel- Rezeptor für Fibrinogen ist; Cheresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 6471-6475 (1987). Andere Endothelzell-Rezeptoren, von denen berichtet ist, dass sie Fibrinogen binden, umfassen an die Zelloberfläche gebundene Transglutaminase und einen Rezeptor mit 130 Kilodalton, der an Fibrinpeptide bindet; Erban et al., J. Biol. Chem., 267: 2451 (1992):
Ebenfalls an der Oberfläche von Endothelzellen befindet sich ein interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1), das von Springer, Nature, 346: 425-433 (1990) beschrieben worden ist, und von dem gezeigt worden ist, dass er das Leukozytenintegrin LFA-1 bindet.
Kürzlich ist gezeigt worden, dass die Wechselwirkung von Fibrinogen mit dem Mac-1-. Rezeptor von Leukozyten eine dynamische Zelladhäsionsreaktion ist, welche die Erkennung des Tripeptids RGD in Fibrinogen durch den Mac-1-Rezeptor umfasst, ähnlich zu der Wechselwirkung von Fibrinogen mit den Integrin-Rezeptoren auf Plättchen und Endothelzellen; vgl. Altieri et al., J. Clinic Invest., 78: 968-976 (1986); Pytela et al., Science, 231: 1559-1562 (1986) und Ruoslahti et al., Science, 238: 491-497 (1987) und Cell, 44: 517-518 (1986). Die Internationale PCT-Anmeldung Nr. PCT/US91/05096 beschreibt Zusammensetzungen, welche D&sub3;&sub0; und Varianten davon umfassen.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Es ist nun gefunden worden, dass Fibrinogen sowohl an den Mac-1-Rezeptor auf Leukozyten und an einen Endothelzell-Rezeptor (ECR) bindet, wodurch der Leukozyt und die Endothelzelle während des Entzündungsvorgangs durch eine Brücke verbunden werden. Die aus dieser Brückenbildung hervorgehende Entzündung wird als eine durch Endothelzellen/Fibrinogen vermittelte Entzündung bezeichnet. Der ECR ist ICAM-1, was ein RGD-unabhängiger, Fibrinogen-spezifischer Rezeptor ist.
In dieser Beschreibung bezieht sich der Ausdruck "ECR" auf ICAM-1.
Die Erfindung beschreibt neue Zusammensetzungen, welche die Bindungsstellen für die Wechselwirkung zwischen ECR und Fibrinogen definieren.
Somit ist eine Zusammensetzung vorgesehen, die eine therapeutisch wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen und pharmazeutisch annehmbaren Fibrinogen-Homologs umfasst, das zur Bindung an ECR und zur Hemmung der Fg-Bindung an Endothelzellen befähigt ist. In den Zusammensetzungen, die hierin beansprucht werden, ist das Homolog weder D&sub3;&sub0; noch eine Variante davon.
Ebenfalls ist eine Zusammensetzung vorgesehen, die eine therapeutisch wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen und pharmazeutisch annehmbaren ICAM-1- Homologs umfasst, das zur Bindung an Fibrinogen und zur Hemmung der Fibrinogen- Bindung an Endothelzellen befähigt ist.
Die Erfindung beschreibt auch einen monoklonalen Antikörper, der mit ICAM-1 immunreagiert, aber nicht mit dem Vitronectin-Rezeptor immunreagiert, derart, dass der monoklonale Antikörper vorzugsweise die Fibrinogen-Bindung an stimulierte Endothelzellen hemmt.
Es wird auch ein monoklonaler Antikörper beschrieben, der mit Fibrinogen immunreagiert und der vorzugsweise die Fibrinogen-Bindung an stimulierte Endothelzellen hemmt.
Ebenfalls wird ein Verfahren zur Hemmung der Fibrinogen-Bindung (Fg-Bindung) an Endothelzellen beschrieben, welches das Inberührungbringen der Endothelzellen mit einer die Fg-Bindung hemmenden Menge einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung umfasst, die ein im Wesentlichen reines Homolog, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Fg-Homolog und einem ICAM-1-Homolog, umfasst.
Das Verfahren ist anwendbar zur Hemmung der durch Fibrinogen/Endothelzellen vermittelten Entzündung bei einem Patienten und umfasst das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, umfassend ein im Wesentlichen reines Homolog, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Fg-Homolog und einem ICAM-1-Homolog, an einen Patienten.
Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zum Nachweis der Menge eines Fibrinogen-Homologs (Fg-Homologs) in einer flüssigen Probe, umfassend:
(a) das Vermischen einer Probe stimulierter Endothelzellen mit einer vorbestimmten Menge einer flüssigen Probe, die ein Fg-Homolog und eine vorbestimmte Menge von markiertem Fg-Homolog enthält, um eine Konkurrenzreaktionsmischung zu bilden;
(b) das Aufrechterhalten der Reaktionsmischung für einen vorbestimmten Zeitraum, der ausreichend ist, dass das gesamte in der Zusammensetzung vorhandene Fg-Homolog an die Endothelzellen bindet und einen Endothelzell: Fg-Homolog- Komplex bildet, und dass das markierte Fg-Homolog an die Endothelzellen binden gelassen wird, um einen markierten Endothelzelle: Fg-Homolog-Komplex zu bilden; und
(c) das Bestimmen der Menge des in Schritt (b) gebildeten markierten Endothelzell: Fg-Homolog-Komplexes, wodurch die Menge eines Fg-Homologs in der Zusammensetzung nachgewiesen wird.
Es wird auch ein Verfahren zum Durchmustern auf Zusammensetzungen beschrieben, die bei der Hemmung der Fibrinogen-Bindung an ICAM-1 wirksam sind, umfassend die Schritte:
a) in einer Hemmungsreaktionsmischung das Vermischen von ausgewählten Mengen einer mutmaßlichen Hemmerzusammensetzung, eines Fibrinogen-Homologs und eines ICAM-1-Homologs;
b) das Aufrechterhalten der Mischung unter Bedingungen, die ausreichend sind, dass das ICAM-1-Homolog an das Fg-Homolog bindet und einen ICAM-1-Homolog: Fg- Homolog-Komplex bildet; und
c) das Messen der Menge des in Schritt (b) gebildeten ICAM-1-Homolog: Fg- Homolog-Komplexes und dadurch der Wirksamkeit der Hemmerzusammensetzung.
Ebenfalls wird ein Verfahren zur Herstellung eines im Wesentlichen reinen ICAM-1 beschrieben, umfassend die Schritte:
(a) das Bereitstellen einer wässrigen Detergenszusammensetzung, die wenigstens ICAM-1 enthält;
(b) das Inberührungbringen der ICAM-1 enthaltenden Zusammensetzung mit einer Fibrinogen immobilisierten Matrix, enthaltend an einen festen Träger gebundenes Fibrinogen, worin das Inberührungbringen unter Bedingungen durchgeführt wird, die ausreichend sind, dass das ICAM-1 an das Fibrinogen bindet und einen Festphasen-ICAM-1: Fibrinogen-Komplex bildet;
(c) das Waschen des festen Trägers und des Komplexes mit einem wässrigen Waschpuffer, enthaltend Mg&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus; und ein RGD enthaltendes Polypeptid unter Bedingungen, die ausreichend sind, um sämtliche an Fibrinogen in einer RGDabhängigen Weise gebundene Proteine zu eluieren, worin der Waschpuffer im Wesentlichen frei ist von Ca&spplus;&spplus;; und
(d) das Eluieren des ICAM-1 von dem festen Träger unter Verwendung eines wässrigen Puffers, enthaltend Mg&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus; und EDTA, um das im Wesentlichen reine ICAM-1 zu bilden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den Zeichnungen, die einen Teil der Offenbarung bilden:
erläutert Fig. 1 die autoradiografischen Ergebnisse der Elektrophorese von aliquoten Anteilen von Spitzenfraktionen sowohl der RGD als auch der EDTA-Elutionen der Zelllysat-Überstände, hergestellt aus Zellen, die entweder unbehandelt gelassen oder mit TNF behandelt wurden, wie in Beispiel 2A beschrieben. Die Bahnen 1 und 3 zeigen die RGD-eluierten Rezeptoren, die aus Zelllysaten isoliert wurden, die aus unbehandelten bzw. mit TNF behandelten Zellen hergestellt wurden. Das charakteristische Muster von VNR ist in der Bahn 3 vorhanden. Die Bahnen 2 bzw. 4 zeigen den EDTA eluierten ECR, der aus unbehandelten und mit TNF behandelten Zellen eluiert wurde mit einem Molekulargewichtsband von annähernd 90-95 kD, wobei seine Intensität etwa 3- bis 5-fach erhöht ist als Ergebnis der Induktion der ECR-Expression durch Einwirkenlassen von TNF.
Fig. 2 erläutert die Ergebnisse der autoradiografischen Einwirkung der elektrophoretisierten ¹²&sup5;I-markierten Rezeptoren, die aus der sequentiellen Affinitätschromatografie von ¹²&sup5;I-markierten HUVEC-Zelllysat-Überständen über eine RGD-Sepharose®-, gefolgt von einer Fibrinogen-Sepharose®-Säule, isoliert wurden. Die Bahnen sind mit 1-8 bezeichnet. Die Bahnen 1 bis 4 zeigen die Migration von Proteinen unter reduzierenden Bedingungen, während die Bahnen 5 bis 8 die Migration von identischen, aliquoten Anteilen zeigen, die unter nicht reduzierenden Bedingungen liefen. ¹²&sup5;I-markierte Molekulargewichtsstandards von 210, 107, 71 bzw. 41 kD, Myosin, β-Galactosidase, Rinderserumalbumin und Ovalbumin sind in den Bahnen 4 und 8 gelaufen.
In den Bahnen 3 und 7 weist der mit EDTA aus der RGD-Sepharose®-Säule eluierte Vitronectin-Rezeptor das charakteristische Profil von alpha v/beta 3 unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen auf, wie in Beispiel 2C beschrieben. Eine andere Integrin-beta-Untereinheit, beta 1, ebenfalls gezeigt in den Bahnen 3 und 7, wurde aus der RGD-Sepharose®-Säule mit EDTA eluiert.
Die Bahnen 1 und 5 zeigen die RGD-Elution des Durchflusses aus der ersten RGD- Säule, die auf die zweite Fibrinogensäule aufgebracht wurde. Die Bahn 6 zeigt die Ergebnisse der EDTA-Elution, welche der RGD-Elution folgt, wo eine Einzelbande von annähernd 90-95 kD unter nicht reduzierenden Bedingungen gefunden wurde. Unter reduzierenden Bedingungen stieg das Molekulargewicht des EDTA eluierten Fibrinogen- Rezeptors nur geringfügig an, wie in der Bahn 2 gezeigt.
Fig. 3 erläutert die Dosis-Wirkung-Kurve von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen, das an Monoschichten von HUVEC bindet, wie in Beispiel 3A2) beschrieben. Das gebundene, ¹²&sup5;I-markierte Fibrinogen in Zählimpulsen pro Minute (cpm) pro Vertiefung (x 10&supmin;³) ist auf der Y-Achse gegen ansteigende Konzentrationen von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen (x 10&supmin;&sup7; M) auf der X-Achse aufgetragen. Die Daten zeigen, dass ¹²&sup5;I-markiertes Fibrinogen sättigungsfähig bei einer Konzentration von annähernd 0,36 uM an Monoschichten von unstimulierten HUVEC bindet.
Fig. 4 erläutert die Dosis-Wirkung-Kurve von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen, das an unstimulierte und entweder TNF- oder LPS-stimulierte HUVEC bindet, wie in Beispiel 3A3) beschrieben. ¹²&sup5;I-markiertes, gebundenes Fibrinogen in Molekülen pro Zelle (x 10&supmin;&sup6;) ist auf der Y-Achse gegen ansteigende Konzentrationen von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen (x 10&supmin;&sup7; M) auf der X-Achse aufgetragen. Unter Stimulierung mit entweder TNF oder LPS verdoppelt sich die Zahl von markierten, gebundenen Fibrinogenmolekülen pro Zelle im Vergleich zu jenen, die an unstimulierte Zellen gebunden sind.
Fig. 5 erläutert die dosis- und zeitabhängigen Wirkungen auf die Fähigkeit von Fibrinogen, die Bindung von &sup5;¹Cr-markierten THP-1-Zellen an HUVEC zu vermitteln. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Fig. 5A und Fig. 5B gezeigt, worin die Daten ausgedrückt sind als Zahlen von &sup5;¹Cr-markierten THP-1-Zellen (x 10&supmin;³) auf der Y-Achse, aufgetragen gegen die Bestimmungszeit auf der X-Achse. Fig. 5A zeigt die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von γereinigtem Fibrinogen, das mit THP-1-Zellen vermischt ist, im Vergleich zu der Abwesenheit von Fibrinogen (markiert als -Fg) bei der Vermittlung der Bindung an HUVEC-Kulturen über eine Zeit von 60 Minuten, wie in Beispiel 3B1) beschrieben. Fig. 5B zeigt Ergebnisse ähnlicher Bestimmungen, die in Gegenwart von Verdünnungen von normalem menschlichem Plasma (NHP) durchgeführt wurden.
Fig. 6 erläutert die Ergebnisse des Western Blots, wie in Beispiel 4E beschrieben. Radiomarkierte Molekulargewichtsmarker von 97, 66, 45, 30 und 21 kD sind in der Bahn links von der ersten Gruppe von 5 Daudi-Bahnen und links von der zweiten Gruppe von 8 HUVEC-Bahnen gezeigt. Die mit 1-5 am unteren Ende des Blots bezeichneten Bahnen, sowohl Daudi und HUVEC, wurden mit 2E1, PMI-I, affinitätsgereinigten 14E11, 14E11-Kulturüberständen bzw. den anti-ICAM-1 BD monoklonalen Antikörpern immunreagiert. Die drei Extrabahnen auf der HUVEC-Seite des Blots zeigenden nicht spezifischen Hintergrund, wenn kein primärer Antikörper verwendet wird.
Fig. 7 erläutert in Säulendiagrammen die Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen an HUVEC-Kulturen in Gegenwart eines 50-fachen Überschusses von unmarkiertem Fibrinogen (Fg) gegenüber der Zeit, wie in Beispiel 5A1) beschrieben. Die Menge der mit den Zellen nach dem Ernten assoziierten Radioaktivität ist auf der Y-Achse als cpm/Vertiefung (x 10&supmin;³) ausgedrückt. Die nicht hemmenden Wirkungen des Einwirkenlassens der monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen VNR, bezeichnet mAb 609 und mAb 7E3, sind ebenfalls gezeigt. Die Gesamtbindung von ¹²&sup5;1-markiertem Fibrinogen in Abwesenheit von zugemischten Hemmern ist ebenfalls gezeigt.
Fig. 8 erläutert die Wirkungen des Einwirkenlassens von RGD- und RGE-enthaltenden Peptiden auf die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen auf HUVEC, wie in Beispiel 5A1) beschrieben. Die Menge von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen, gebunden an HUVEC, in cpm/Vertiefung (x 10&supmin;³), ist auf der Y-Achse gegen die Zeitdauer aufgetragen, in welcher markiertes Fibrinogen mit HUVEC zusammen vorlag.
Fig. 9 erläutert die Hemmung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen auf unstimulierte bzw. TNF-stimulierte HUVEC-Kulturen, Fig. 9A und 9B, durch Behandlung von HUVEC mit den monoklonalen Antikörpern 14E11, BD (anti-ICAM-1, Becton Dickinson) und einem Kontroll-Antikörper PMI-I. Das experimentielle Protokoll ist in Beispiel 5 beschrieben. Die Daten sind in einem Säulendiagramm als die spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen, in cpm/Vertiefung (x 10&supmin;³), auf der Y-Achse gegen die spezifischen Behandlungen auf der X-Achse ausgedrückt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

A. Allgemeine Beschreibung

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung einer neuen und speziellen Rolle für Fibrinogen (Fg) bei der Vermittlung entzündlicher Vorgänge bei Endothelgeweben. Es wird gezeigt, dass die Rolle eine Brückenbildung zwischen dem Mac-1-Rezeptor auf Leukozyten und anderen Mac-1-Rezeptor tragenden Zellen und einer Klasse von Molekülen auf Endothelzellen ist, die hierin als Endothelzell-Rezeptor (ECR) bezeichnet werden. Es wird gezeigt, dass die Wechselwirkung von Fg mit dem ECR eine einzigartige RGD-unabhängige Bindungswechselwirkung ist, die verschieden ist von der bekannten Bindung von Fg an den Vitronectin-Rezeptor und an andere Endothelzellen- Oberflächenrezeptoren, wie Transglutaminase oder den 130 kD-Rezeptor, der an Peptide bindet, die von Fibrin abgeleitet sind.
Insoweit wie die hierin beschriebene Fg-Brückenbildung Mac-1 tragende Zellen an Endothelzellen anheftet, ist der aufgefundene und hierin beschriebene Mechanismus aufgrund der von Fibrinogen gespielten Rolle in der vorliegenden Brückenwechselwirkung verschieden von dem ICAM-1 : Mac-1 abhängigen Weg der Leukozytenadhäsion. Der hierin beschriebene Fg-abhängige Entzündungsweg wird als Endothelzell/Fibrinogen vermittelte Entzündung bezeichnet, um das Erfordernis nach Fibrinogen in dem Vorgang zu betonen.

B. Homologe

Ein Homolog, wie hierin verwendet, ist ein Makromolekül, typischerweise ein Protein oder Polypeptid, welches die Struktur und Funktion einer Domäne eines Proteins nachbildet, nachdem es gebildet ist. Wo ein natives Protein multiple Strukturdomänen trägt und dadurch multiple verschiedene Funktionen vermittelt, wie bei Fibrinogen, bildet ein Homolog eine besondere Domäne nach und ist fähig, mit dem nativen Protein zur Mitwirkung mit den Mediatoren dieser Proteinfunktion, an welcher die Domäne teilnimmt, in Wechselwirkung oder Konkurrenz zu treten.

1. Fibrinogen-Homologe

Somit ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Fibrinogen-Homolog oder Fg-Homolog ein Makromolekül, welches einen Bereich von Fibrinogen nachbildet, der an Endothelzell-Rezeptoren (ECR, ICAM-1) in einer RGD-unabhängigen Weise gemäß dieser Erfindung bindet. Die Stelle auf dem ECR, an welche Fibrinogen in einer RGD-unabhängigen Weise bindet, wird als die "ECR RGD-unabhängige Fg-Bindungsstelle" oder "Endothelzell RGD-unabhängige Fg-Bindungsstelle" bezeichnet, d. h., eine Stelle auf Endothelzellen und auf dem hierin beschriebenen ECR, der an Fibrinogen in einer RGDunabhängigen Weise bindet. Die Bindungsstelle ist als RGD-unabhängig charakterisiert, da Endothelzellen andere Rezeptoren zur Bindung von Fibrinogen enthalten, welche die Bindung durch die RGD enthaltende Region von Fibrinogen vermitteln.
Ein Fg-Homolog ist jedes Makromolekül, welches befähigt ist, an die ECR RGD-unabhängige Fg-Bindungsstelle zu binden und dadurch eine Bindung von Fg an die ECR RGD-unabhängige Fg-Bindungsstelle auf Endothelzellen hemmen kann und dadurch die RGD-unabhängige Bindung von Fg an Endothelzellen hemmt. Versuchsanordnungen zum Messen der Bindung eines Fg-Homologs an die ECR RGD-unabhängige Fg- Bindungsstelle sind in Beispiel 3a beschrieben. Versuchsanordnungen zum Messen der Hemmung der Fg-Bindung an die ECR RGD-unabhängige Fg-Bindungsstelle sind in Beispiel 5 beschrieben.
Ein bevorzugtes Fg-Homolog ist ein Fragment von Fibrinogen, welches die Region von Fg enthält, die an die ECR RGD-unabhängige Fg-Bindungsstelle bindet. Bevorzugter bindet das Fg-Homolog nicht an den Mac-1-Rezeptor. Solche Fg-Fragmente können proteolytische Fragmente von Fg, von Fibrinogen abgeleitete Polypeptide, Teile von Fibrinogen, D&sub3;&sub0;, Teile von D&sub3;&sub0;, zu D&sub3;&sub0; homologe Polypeptide oder Proteine oder Fibrinogen enthaltende, nicht natürliche Aminosäurederivate oder nicht proteinartige Seitenketten, Analoge oder chemische Derivate von entweder D&sub3;&sub0;, Fibrinogen, Fragmenten oder Polypeptiden davon und ein Fg-Homolog enthaltende Konjugate sein. Ein bevorzugtes Fg-Homolog ist Fibrinogen, ein proteolytisches Fragment von Fibrinogen und insbesondere das D&sub3;&sub0;-Fragment von Fg, das auch als D&sub3;&sub0; bezeichnet wird.
Obwohl D&sub3;&sub0; und Homologe davon in den Verfahren der Erfindung verwendet werden können, werden sie nicht in den Zusammensetzungen des Patentanspruchs 1 verwendet.
Das D&sub3;&sub0;-Fragment von Fibrinogen wird durch proteolytische Verdauung von Fibrinogen hergestellt. Die Herstellung von D&sub3;&sub0; ist von Fair et al., J. Biol. Chem. 256: 8018-8023 (1981), Furlaw et al., Biochem. Biophys. Acta., 400: 95-11) (1975) und in Beispiel 1 beschrieben worden. D&sub3;&sub0; enthält abgebaute β- und γ-Ketten und weitgehend abgebaute α-Ketten, verbunden durch Interketten-Disulfidbindungen, wie von Pizzo et al., J. Biol. Chem., 247: 636-645 (1972) beschrieben.
Das N-Ende des Aα-Kettenrestes von D&sub3;&sub0; tritt mit Aminosäureresten Leu¹³&sup6;, Gln¹³&sup7;, Lys¹³&sup8; und Asn¹³&sup9; auf unter Verwendung der Aminosäuresequenz der α-Kette, beschrieben von Doolittle et al., Nature, 280: 464-469 (1979).
Der Aα-Kettenrest von D&sub3;&sub0; enthält keine Aminosäurereste Arg&sup9;&sup5; Gly&sup9;&sup6; und Asp&sup9;&sup7; (RGD) oder die Aminosäurereste Arg&sup5;&sup7;², Gly&sup5;&sup7;³ und Asp&sup5;&sup7;&sup4; (RGD) und hat ein Mw von etwa 11 bis 13 Kilodalton (kD). Die N-Enden der β-Kette von D&sub3;&sub0; enthalten Aminosäurereste Asp¹³&sup4;, Asn¹³&sup5;, Glu¹³&sup6; und Asn¹³&sup7;. Das N-Ende von γ von D&sub3;&sub0; enthält die Aminosäurereste Met&sup8;&sup9;, Leu&sup9;&sup0;, Glu&sup9;¹ und Glu&sup9;².
Ein betreffendes Fg-Homolog umfasst jedes Analog, Fragment oder chemische Derivat eines aktiven Fibrinogenpolypeptids, wie hierin definiert, solange wie das Polypeptid befähig ist, eine Bindung von Fg an die ECR RGD-unabhängige Fg-Bindungsstelle zu hemmen. Daher kann ein Polypeptid-Fg-Homolog verschiedenen Änderungen, Substitutionen, Insertionen und Deletionen unterworfen sein, wo solche Änderungen bestimme Vorteile bei seiner Verwendung ergeben. In diesem Zusammenhang kann ein Fg- Homolog dieser Erfindung eine oder mehrere Änderungen in dem Polypeptid enthalten, solange wie das Homolog seine Funktion in einer oder mehreren der Bindungs- und Hemmungsversuche, wie hierin definiert, beibehält.
Der Ausdruck "Analog" umfasst jedes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer Sequenz eines Fg-Homologs oder einer Domäne von Fibrinogen identisch ist, worin einer oder mehrere Reste konservativ mit einem funktionell ähnlichen Rest substituiert worden sind, und welches die Fähigkeiten, wie hierin beschrieben, aufweist. Beispiele von konservativen Substitutionen umfassen die Substitution eines nicht polaren (hydrophoben) Restes, wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen, die Substitution eines polaren (hydrophilen) Restes durch einen anderen, wie zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin, zwischen Glycin und Serin, die Substitution eines basischen Restes, wie Lysin, Arginin oder Histidin, durch einen anderen, oder die Substitution eines sauren Restes, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, durch einen anderen.
Der Ausdruck "konservative Substitution" beinhaltet auch die Verwendung eines chemisch derivatisierten Restes anstelle eines nicht derivatisierten Restes, mit der Maßgabe, dass ein solches Polypeptid die erforderliche Bindungsaktivität zeigt.
"Chemisches Derivat" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einem oder mehreren Resten, die chemisch durch die Reaktion einer funktionellen Seitengruppe derivatisiert sind. Solche derivatisierten Moleküle umfassen z. B. solche Moleküle, in welchen freie Aminogruppen derivatisiert sind, um Amin-Hydrochloride, p-Toluolsulfonylgruppen, Carbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloracetylgruppen oder Formylgruppen zu bilden. Freie Carboxylgruppen können derivatisiert sein, um Salze, Methyl- und Ethylester oder andere Typen von Estern oder Hydrazide zu bilden. Freie Hydroxylgruppen können derivatisiert sein, um O-Acyl- oder O-Alkylderivate zu bilden. Der Imidazol- Stickstoff von Histidin kann derivatisiert sein, um N-Imbenzylhistidin zu bilden. In den chemischen Derivaten sind ebenfalls diejenigen Peptide eingeschlossen, welche ein oder mehrere natürliche Aminosäurederivate der zwanzig Standardaminosäuren enthalten. Zum Beispiel kann Prolin durch 4-Hydroxyprolin ersetzt sein; Lysin kann durch 5-Hydroxylysin ersetzt sein; Histidin kann durch 3-Methylhistidin ersetzt sein; Serin kann durch Homoserin ersetzt sein; und Lysin kann durch Ornithin ersetzt sein. Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls jedes Polypeptid mit eins oder mehreren Additionen und/oder Deletionen oder Reste in Bezug auf die Sequenz eines Polypeptids, dessen Sequenz hierin gezeigt ist, solange die erforderliche Bindungsaktivität aufrechterhalten ist.
Der Ausdruck "Fragment" bezieht sich auf jedes Polypeptid mit einer Aminosäure- Restsequenz, die kürzer ist als das native Protein.
Wenn ein Polypeptid, welches einen Teil eines Fg-Homologs der vorliegenden Erfindung definiert, eine Sequenz hat, die nicht identisch ist mit der Sequenz eines Teils von Fibrinogen, ist dies typischerweise so, weil eine oder mehrere konservative oder nicht konservative Substitutionen durchgeführt worden sind, gewöhnlich sind nicht mehr als etwa 30 Zahlenprozent, gewöhnlicher nicht mehr als 20 Zahlenprozent und vorzugsweise nicht mehr als 10 Zahlenprozent der Aminosäurereste substituiert. Zusätzliche Reste können ebenfalls an jedem Ende addiert sein, um einen "Linker" vorzusehen, durch welchen die Polypeptide dieser Erfindung in geeigneter Weise an eine Markierung oder eine feste Matrix oder einen Träger gebunden werden können. Bevorzugt bilden die Linker-Reste keine Fg-Homolog-Epitope, d. h. sie sind in ihrer Struktur keinem Fg-Homolog ähnlich.
Markierungen, feste Matrizes und Träger, die mit den Fg-Homologen dieser Erfindung verwendet werden können, sind hierin nachstehend beschrieben.
Aminosäurerest-Linker sind gewöhnlich wenigstens ein Rest und können 40 oder mehr Reste, häufiger 1 bis 10 Reste sein, bilden aber keine Fg-Epitope. Typischere Aminosäurereste, die zum Verbinden verwendet werden können, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- und Asparaginsäure oder Ähnliche. Zusätzlich kann sich ein betreffendes Polypeptid, falls nicht anders angegeben, von der natürlichen Sequenz der γ-Kette von Fibrinogen durch die Sequenz unterscheiden, die durch terminale NH&sub2;-Acylierung, z. B. Acetylierung, oder Thioglycolsäure-Amidierung, durch terminale Carboxyl-Amidierung, z. B. mit Ammoniak, Methylamin und Ähnlichem, modifiziert ist.
Ein Polypeptid, welches ein Fg-Homolog der vorliegenden Erfindung bildet, kann unter Verwendung der Festphasen-Synthesetechnik hergestellt werden, die ursprünglich von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963) beschrieben wurde. Andere Polypeptid-Synthesetechniken können z. B. sowohl in M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2. Aufl., (1976) als auch in anderen Referenzarbeiten gefunden werden, die dem Fachmann bekannt sind. Eine Zusammenfassung von Polypeptid-Synthesetechniken können in J. Stuart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 3. Aufl., Neurath, H. et al., Hrsg., S. 104-237, Academic Press, New York, NY (1976) gefunden werden. Geeignete Schutzgruppen zur Verwendung in solchen Synthesen können sowohl in den vorstehenden Dokumenten als auch in J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973) gefunden werden.
Allgemein umfassen diese Syntheseverfahren die sequentielle Zugabe eines oder mehrerer Aminosäurereste oder geeignet geschützter Aminosäurereste zu einer wachsenden Polypeptidkette. Normalerweise wird entweder die Amino- oder Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerestes, geschützt durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe, für Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe, wie Lysin, haben.
Bei Verwendung einer Festphasensynthese als Beispiel wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure an einen inerten, festen Träger über ihre ungeschützte Carboxyl- oder Aminogruppe gebunden. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann selektiv entfernt, und die nächste Aminosäure in der Sequenz mit der komplementären, geeignet geschützten (Amino- oder Carboxyl-)Gruppe wird zugesetzt und unter Bedingungen umgesetzt, die zur Bildung der Amidbindung mit dem bereits an den festen Träger gebundenen Rest geeignet sind. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann von diesem neu zugesetzten Aminosäurerest entfernt, und die nächste (in geeigneter Weise geschützte) Aminosäure wird dann zugesetzt usw. Nachdem sämtliche erwünschten Aminosäuren in der richtigen Sequenz gebunden worden sind, werden sämtliche noch vorhandenen End- und Seitengruppe-Schutzgruppen (und der feste Träger) sequentiell oder gleichzeitig entfernt, um das Endpolypeptid zu ergeben.
Methoden und Verfahren zur Bestimmung der Hemmung sind im Stand der Technik bekannt und umfassen die Verwendung von Konkurrenzansätzen ähnlich zu den Antigen- Konkurrenzansätzen, die in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Hrsg., Cold Spring Harbor, NY (1988) beschrieben sind. So kann z. B. eine unmarkierte Verbindung, von der angenommen wird, dass sie ein Fg-Homolog sei, verwendet werden, um die Bindung von markiertem Fg oder eines markierten Fg-Homologs an die ECR RGDunabhängige Fg-Bindungsstelle von ECR auf Endothelzellen zu hemmen. Die Menge der markierten Fg-Bindung an die Bindungsstelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der unmarkierten Verbindung wird verglichen, und falls die Anwesenheit der unmarkierten Verbindung die Menge der markierten Fg-Bindung an die Bindungsstelle hemmt, ist die unmarkierte Verbindung dann ein Fg-Homolog. Eine bevorzugte Methode zur Messung der Hemmung von Fg-Bindung an ECR ist in Beispiel 5 beschrieben.
Ein anderes Fg-Homolog, das in der vorliegenden Erfindung vorgesehen ist, sind Antikörpermoleküle, die mit der ECR RGD-unabhängigen Fg-Bindungsstelle immunreagieren.
Beispielhafte Antikörpermoleküle sind nachstehend weiter definierte anti-ECR- Antikörper und anti-ICAM-1-Antikörper.

2. Homologe des Endothelzell-Rezeptors

Ein Homolog des Endothelzell-Rezeptors (ECR) ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein Markomolekül, das eine Region von ECR nachbildet, die an Fibrinogen in einer RGD-unabhängigen Weise bindet. Die Stelle auf Fibrinogen, an welche ECR in einer RGD-unabhängigen Weise bindet, wird als die "Fg RGD-unabhängige ECR-Bindungsstelle" bezeichnet, d. h. eine Stelle auf Fg, die an ECR in einer RGD-unabhängigen Weise bindet.
Ein ECR-Homolog ist jedes Makromolekül, das zur Bindung an die Fg RGD-unabhängige ECR-Bindungsstelle befähigt ist und dadurch die ECR-Bindung an die Fg RGDunabhängige ECR-Bindungsstelle auf Fg hemmen kann und dadurch die RGD-unabhängige Fg-Bindung an Endothelzellen hemmt. Versuchsanordnungen zur Messung der Bindung eines ECR-Homologs an die Fg RGD-unabhängige ECR-Bindungsstelle sind in Beispiel 3a beschrieben. Versuchsanordnungen zur Messung der Hemmung der ECR- Bindung an die Fg RGD-unabhängige ECR-Bindungsstelle sind in Beispiel 5 beschrieben.
Das ECR-Homolog der vorliegenden Erfindung ist ein im wesentlich gereinigtes ICAM-1- Homolog. Ein besonders bevorzugtes ECR-Homolog ist ICAM-1 selbst. Ebenfalls in Betracht gezogene ECR-Homologe sind ICAM-1 assoziierte oder ICAM-1 verwandte Moleküle.
Ein ECR-Homolog der vorliegenden Erfindung kann modifiziert, fragmentiert, gekuppelt oder in anderer Weise behandelt sein, wie hierin für ein Fg-Homolog beschrieben, solange wie die erwünschten Bindungs- und Hemmeigenschaften aufrecht erhalten werden.
Besonders bevorzugt sind Polypeptide und ihre von der Region von ICAM-1 abgeleiteten Analoge, die an Fibrinogen binden, insbesondere ein lösliches ICAM-1 und funktionelle Derivate davon. Ein lösliches ICAM-1 zur Verwendung in einer hierin beschriebenen Zusammensetzung oder einem hierin beschriebenen Verfahren fehlt typischerweise die Transmembrandomäne, die als ein Membrananker dient. ICAM-1 und lösliche ICAM- 1-Zusammensetzungen, die zur Verwendung als ein ECR-Homolog geeignet sind, können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, einschließlich der in Beispiel 2 beschriebenen Reinigungsverfahren. Zusätzliche präparative Verfahren für ICAM-1 und lösliches ICAM-1 sind in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. EP 365837 und in der veröffentlichten kanadischen Patentanmeldung Nr. 2008368 beschrieben.
Ein anderes ECR-Homolog, das von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, ist ein Antikörpermolekül, welches mit der Fg RGD-unabhängigen ECR-Bindungsstelle immunreagiert. Beispielhafte Antikörpermoleküle sind anti-Fg-Antikörper, die hierin weiter definiert sind.
Ein Fg- oder ECR-Homolog kann an ein anderes Protein oder Polypeptid gekuppelt oder damit konjugiert sein, um ein Homolog-Konjugat zu ergeben. Ein Homolog-Konjugat hat Vorteile gegenüber einem allein verwendeten Homolog. So erlaubt z. B. das Kuppeln des Homologs an ein Protein oder ein Polypeptid, von dem bekannt ist, dass es eine zweite biologische Funktion enthält, das gezielte Einbringen dieser zweiten biologischen Funktion an eine Stelle bei oder nahe eines ECR.
Wenn eine Kupplung an einen Träger zur Bildung eines im Stand der Technik bekannten Träger-Hapten-Konjugats erfolgt, ist ein Homolog der vorliegenden Erfindung befähigt, Antikörper zu induzieren, die mit dem Homolog immunreagieren. Im Hinblick auf das gut etablierte Prinzip der immunologischen Kreuzreaktivität zieht die vorliegende Erfindung daher antigenisch verwandte Varianten eines Fg- oder ECR-Homologs in Betracht. Eine "antigenisch verwandte Variante" ist ein Polypeptid, das befähigt ist, Antikörpermoleküle zu induzieren, die mit einem Fg-Homolog dieser Erfindung und mit Fg oder mit einem ECR-Homolog dieser Erfindung und mit ECR immunreagieren.
Jedes Peptid der vorliegenden Erfindung kann in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes verwendet werden. Geeignete Säuren, die zur Bildung von Salzen mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung befähigt sind, umfassen anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphoressigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure, Sulfanilsäure oder Ähnliche.
Geeignete Basen, die zur Bildung von Salzen mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung befähigt sind, umfassen anorganische Basen, wie Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ähnliche; und organische Basen, wie Mono-, Di- und Trialkyl- und -arylamine (z. B. Triethylamin, Diisopropylamin, Methylamin, Dimethylamin und Ähnliche) und optional substituierte Ethanolamine (z. B. Ethanolamin, Diethanolamin und Ähnliche).
In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist ein Homolog mit einem Trägermolekül konjugiert, um ein Homolog-Konjugat zu bilden, das wenigstens ein Trägermolekül enthält. Typische Träger umfassen Sepharose®, Sephadex®, Proteine, Polypeptide und Ähnliche.
Ein Homolog kann ebenfalls an sich selbst konjugiert oder in einer solchen Weise aggregiert sein, dass ein großer, ein Homolog enthaltender Komplex gebildet wird. Ein großer, ein Homolog enthaltender Komplex ist vorteilhaft, da er neue biologische Eigenschaften hat, wie längere Halbwertszeit im Umlauf oder größere Aktivität.

C. Homologe enthaltende Zusammensetzungen

In einer bevorzugten Ausführungsform zieht die Erfindung eine Zusammensetzung in Betracht, die einen Träger und eine therapeutisch wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen und pharmazeutisch annehmbaren Fibrinogen-Homologs (Fg-Homologs) gemäß dieser Erfindung umfasst, das zur Bindung an die ECR RGD-unabhängige Fg-Bindungsstelle und zur Hemmung der Bindung von Fibrinogen an die ECR RGDunabhängige Fg-Bindungsstelle befähigt ist. Bevorzugte Fg-Homologe zur Verwendung in einer Zusammensetzung wurden früher beschrieben.
In einer verwandten Ausführungsform zieht die Erfindung eine Zusammensetzung in Betracht, die einen Träger und eine therapeutisch wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen und pharmazeutisch annehmbaren Homologs eines Endothelzell-Rezeptors gemäß dieser Erfindung umfasst, das zur Bindung an die Fg RGD-unabhängige ECR- Bindungsstelle und zur Hemmung der ECR-Bindung an die Fg RGD-unabhängige ECR- Bindungsstelle befähigt ist. Bevorzugte ECR-Homologe, insbesondere ICAM-1- Homologe, zur Verwendung in einer Zusammensetzung wurden früher beschrieben.
Beide dieser Zusammensetzungen sind verwendbar zur Hemmung der Bindung von Fg an Endothelzellen, wodurch die durch Endothelzell/Fibrinogen vermittelte Entzündung und die damit verbundenen Krankheitsvorgänge gehemmt werden, die an anderer Stelle hierin detaillierter beschrieben werden.
Eine therapeutisch wirksame Menge eines Fg- oder ECR-Homologs ist eine Menge die, wenn sie an einen Patienten verabreicht wird, befähigt ist, die Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen zu hemmen. Versuchsanordnungen zum Bestimmen der Hemmung der Bindung von Fg an Endothelzellen und dadurch zur Messung der wirksamen hemmenden Mengen des Homologs umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die kompetitiven und anderen Bindungs-Versuchsanordnungen, die in Beispiel 5 dieser Beschreibung beschrieben sind.
Bevorzugt ist eine therapeutisch wirksame Menge eines Fg- oder ECR-Homologs eine Menge, welche die Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen um wenigstens 10 Prozent, vorzugsweise um wenigstens 50 Prozent und weiter vorzugsweise um wenigstens 99 Prozent verringert (hemmt) wenn die Messung in einer in vitro-Versuchsanordnung zur Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen erfolgt. Eine beispielhafte in vitro-Versuchsanordnung zur quantitativen Bestimmung wirksamer hemmender Mengen eines Fg-Homologs ist in Beispiel 5 beschrieben.
In einer Ausführungsform ist eine therapeutische Zusammensetzung zur Hemmung der durch Endothelzell/Fibrinogen vermittelten Entzündung in einem Patienten verwendbar, der eine oder mehrere der mit einer Entzündung verbundenen Zustände aufweist, wie hierin weiter beschrieben. In dieser Ausführungsform ist eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die, wenn sie an einen Patienten verabreicht wird, ausreichend ist, um die Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen zu hemmen und dadurch die durch Endothelzell/Fibrinogen vermittelte Entzündung zu hemmen.
Prüfungen zum direkten Nachweis der Hemmung von durch Endothelzell/Fibrinogen vermittelten Entzündung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die klinische Untersuchung von begleitenden Symptomen eines Patienten, der sich mit einer Entzündung vorstellt.
Wenn "im Wesentlichen rein" im Zusammenhang mit einem Fg- oder ECR-Homolog verwendet wird, so bezieht sich dies auf Zusammensetzungen, die mit dem Fg- oder ECR-Homolog angereichert sind und vorzugsweise frei sind von nachweisbaren Mengen von Blutzellen, Immunoglobulin und Albuminproteinen und Lipoproteinen, und weiter vorzugsweise mehr als 99 Gewichtsprozent des Homologs, bezogen auf die gesamte Masse in der Zusammensetzung, enthalten.
In einer Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und ihre Anwendungsverfahren in Betracht, die sowohl ein Fg- als auch ein ECR-Homolog dieser Erfindung in einem Bereich von Verhältnissen des Fg-Homologs zu dem ECR-Homolog umfassen. Das Verhältnis kann jedes Verhältnis von großen Überschüssen des Fg-Homologs zu dem ECR-Homolog bis zu großen Überschüssen des ECR-Homologs zu dem Fg-Homolog sein, d. h. etwa 0,01 : 99,00 Gewichtsprozent. Bevorzugte Verhältnisse liegen im Bereich von 10 : 1 bis 1 : 1. Die einzige unzulässige Kombination von Fg-Homologen und ECR-Homologen in einer in Betracht gezogenen Zusammensetzung ist die Mischung eines anti-ECR-Antikörpers (Fg-Homologs) mit einem ECR-Homolog oder die Mischung eines anti-Fg-Antikörpers (ECR-Homologs) mit einem Fg-Homolog, da diese speziellen Kombinationen eine Immunkreuzreaktion eingehen und die Wirksamkeit neutralisieren.
Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist gemeint, dass ein Fg- oder ECR-Homolog, wenn es in einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet wird, keine unerwünschten physiologischen Wirkungen aufgrund der Anwesenheit von Verunreinigungen hervorruft. So ist ein pharmazeutisch annehmbares Fg- oder ECR-Homolog frei von pharmazeutisch nicht annehmbaren Verunreinigungen, wie Pyrogenen (Lipopolysacchariden) und anderen Verunreinigungen, wie giftige Chemikalien (d. h. Natriumazid) und Detergenzien, nämlich Natriumdodecylsulfat.
Die Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen, die Polypeptide oder Proteine als aktive Bestandteile enthalten, ist im Stand der Technik bekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als Injektionspräparate, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt, es können jedoch auch feste Formen hergestellt werden, die zur Lösung in oder zur Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind. Die Präparation kann auch emulgiert sein. Der aktive therapeutische Bestandteil wird mit anorganischen und/oder organischen Trägern vermischt, die pharmazeutisch annehmbar und mit dem aktiven Bestandteil verträglich sind. Träger sind pharmazeutisch annehmbare Träger (Vehikel), die mehr oder weniger inerte Substanzen umfassen, wenn sie zu einer therapeutischen Zusammensetzung zugesetzt werden, um der Zusammensetzung eine geeignete Konsistenz oder Form zu verleihen. Geeignete Träger sind z. B. Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder Ähnliche und Kombinationen davon. Zusätzlich kann die Zusammensetzung, falls erwünscht, geringere Mengen von Hilfssubstanzen enthalten, wie Netz- oder Emulgiermittel und pH-Puffer, welche die Wirksamkeit des aktiven Bestandteils erhöhen.
Eine therapeutische Zusammensetzung, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, enthält typischerweise ein Fg- oder ECR-Homolog, das in der therapeutischen Zusammensetzung als eine neutralisierte, pharmazeutisch annehmbare Salzform formuliert ist. Pharmazeutisch annehmbare Salze umfassen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptid- oder Antikörpermoleküls) und die mit anorganischen Säuren gebildet werden, z. B. Chlorwasserstoffsäure oder Phosphorsäure, oder solchen organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und Ähnliche. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen abgeleitet sein, wie z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)hydroxiden, und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und Ähnliche.
Die therapeutische Zusammensetzung, die ein Fg- oder ECR-Homolog enthält, wird üblicherweise parenteral verabreicht, wie z. B. durch Injektion einer Einheitsdosis. Auf diese Weise kann die therapeutische Zusammensetzung durch eine Vielzahl von Arten zugeführt werden, einschließlich intravenös, intramuskulär, durch Infusion, oral, intranasal, intraperitoneal, subkutan, rektal, topisch oder in andere Bereiche, wie in Synovialflüssigkeiten. Die transdermale Zufuhr einer Zusammensetzung, die ein Fg- oder ECR- Homolog enthält, wird jedoch ebenfalls in Betracht gezogen, wie durch Diffusion über ein transdermales Kissen.
Der Ausdruck "Einheitsdosis", wenn er mit Bezug auf eine in der vorliegenden Erfindung verwendete therapeutische Zusammensetzung verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosen für Menschen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die so berechnet ist, dass die erwünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel oder Träger erhalten wird.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine wirksame Menge eines Fg- oder ECR-Homologs und ist eine sterile Zusammensetzung. Eine sterile Zusammensetzung ist im pharmazeutischen Stand der Technik bekannt und ist im Wesentlichen frei von Bakterien und Pilzen. Typischerweise wird eine Zusammensetzung durch Durchleiten der Zusammensetzung durch ein Filter, wie ein für diesen Zweck konstruiertes 0,2 Mikron Filter, steril gemacht.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung optimiert, um zu erlauben, dass das Fg- oder ECR-Homolog, das sie enthält, transdermal zugeführt werden kann.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen enthält eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine immunologisch wirksame Menge von Fg- oder ECR-Homolog. Eine immunologisch wirksame Menge von Fg- oder ECR-Homolog ist eine Menge, die ausreichend ist, um Antikörper zu bilden, die mit dem immunisierten Homolog immunreagieren.

D. Antikörper und monoklonale Antikörper

Der Ausdruck "Antikörper" in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird hierin als kollektives Substantiv verwendet, das sich auf eine Population von Immunglobulinmolekülen und/oder immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen bezieht, d. h., Moleküle, die eine Antikörper-Bindungsstelle oder ein Paratop enthalten.
Eine "Antikörper-Bindungsstelle" ist derjenige Strukturteil eines Antikörpermoleküls, das die variablen und hypervariablen Regionen der Schwer- und Leichtkette umfasst, die spezifisch Antigen binden. Die Stelle kann auf eine minimale Menge der Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) der variablen Regionen verringert werden, solange die Antigen bindende Eigenschaft erhalten bleibt.
Der Ausdruck "Antikörpermolekül" in seinen verschiedenen grammatischen Formen, wie hierin verwendet, zieht daher sowohl ein intaktes Immunoglbulinmolekül als auch einen immunologisch aktiven Teil eines Immunglobulinmoleküls in Betracht.
Beispielhafte Antikörpermoleküle zur Verwendung in den Verfahren und Systemen der vorliegenden Erfindung sind intakte Immunglobulinmoleküle, im Wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und diejenigen Teile eines Immunglobulinmoleküls, welche das Paratop enthalten, einschließlich jener Teile, die im Stand der Technik als Fab, Fab', F(ab')&sub2;, F(v) bekannt sind, und Teile davon.
Fab- und F(ab')&sub2;-Teile von Antikörpern können durch die proteolytische Reaktion von Papain bzw. Pepsin mit im Wesentlichen intakten Antikörpern durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden; vgl. z. B. die US-Patentschrift Nr. 4,342,566, Inbar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659-62 (1972) und Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 118-124 (1983).
Teile von Fab'-Antikörpern sind ebenfalls bekannt und werden aus Teilen von F(ab')&sub2; hergestellt, gefolgt von der Reduktion der Disulfidbindungen, welche die zwei Schwerkettenteile verbinden, z. B. mit Mercaptoethanol, und gefolgt von der Alkylierung des resultierenden Proteinmercaptans mit einem Reagens, wie Iodacetamid. Ein Antikörper, welcher intakte Antikörpermoleküle enthält, ist bevorzugt und wird hierin erläuternd verwendet.

1. Antikörper gegen ECR-Homolog

In einer Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung einen Antikörper gegen ECR-Homolog in Betracht, d. h. eine Zusammensetzung, welche Antikörpermoleküle umfasst, die mit einem ECR-Homolog dieser Erfindung bei oder nahe der ECR RGD- unabhängigen Fg-Bindungsstelle immunreagiert. Anders ausgedrückt, immunreagiert ein Antikörper gegen ECR-Homolog mit ECR, ist spezifisch für die Fg-Bindungsstelle auf ECR, wie hierin definiert, und hemmt vorzugsweise die Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen.
Ein bevorzugter Antikörper gegen ECR geht keine Immunreaktion mit Vitronectin- Rezeptor (VnR) ein, d. h. ist im Wesentlichen frei von Antikörpermolekülen, die mit VnR immunreagieren. Weiter vorzugsweise geht der Antikörper keine Immunreaktion mit irgendeinem RGD-abhängigen Endothelzell-Oberflächenrezeptor oder mit Transglutaminase oder dem 130 kD-Rezeptor ein, der Fibrinpeptide bindet.
Mit "hemmt vorzugsweise" ist gemeint, dass der Antikörper mehr Hemmung der Bindung von Fg an stimulierte Endothelzellen als an nicht stimulierte Endothelzellen aufweist, wenn die Prüfung an Endothelzellen in einer Monoschicht erfolgt, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist. Mit anderen Worten hemmt ein bevorzugter Antikörper die Bindung von Fg an stimulierte Endothelzellen bei niedrigeren Antiköperkonzentrationen oder ergibt eine niedrigere Bindung von Fg als der gleiche Antikörper, wenn die Prüfung an nicht stimulierten Endothelzellen erfolgt. Endothelzellen können durch eine Vielzahl von Maßnahmen stimuliert werden, einschließlich dem Einwirkenlassen von Cytokinen, wie TNF und chemisch anziehenden Peptiden, wie N-FMLP.
"Im Wesentlichen frei" bedeutet, dass die Antikörpermoleküle nicht mit dem festgestellten Antigen auf Niveaus innerhalb einer Größenordnung und vorzugsweise innerhalb von zwei Größenordnungen des Niveaus der Immunreaktion mit einer Antigenart immunreagieren, von der gesagt wird, dass sie mit dem Antikörpermolekül immunreagiert, wenn die Immunreaktion ausgedrückt wird als eine Gleichgewichtskonstante zwischen gebundenem (immunreagiertem) und nicht gebundenem Antigen.
Die Reaktivität eines Antikörpers mit einem festgestellten Antigen kann durch verschiedene immunologische, im Stand der Technik bekannte Prüfungen gemessen werden. Beispielhafte Immunreaktionsprüfungen werden hierin beschrieben.
Die Herstellung von Antikörpern ist im Stand der Technik bekannt; vgl. Staudt et al., J. Exp. Med., 157: 687-704 (1983), Beispiele 4 und 6 der Beschreibung oder Antibodies:
A Laboratory Manual, Harlowe and Lane, Hrsg., Cold Spring Harbor, NY (1988). Kurz gesagt, wird zur Herstellung einer Antikörper-Zusammensetzung dieser Erfindung ein Laborsäugetier mit einer immunologisch wirksamen Menge eines ECR-Homologs inokuliert, wie es typischerweise in einer Vakzine oder einem Inokulum der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, wodurch in dem Säugetier Antikörpermoleküle mit einer Immunspezifizität für das Immunogen induziert werden. Die induzierten Antikörpermoleküle werden dann aus dem Säugetier gesammelt und auf das erwünschte Ausmaß durch bekannte Techniken, wie z. B. durch Immunaffinitätschromatografie oder durch Verwendung von DEAE Sephadex® isoliert, um die IgG-Fraktion zu erhalten.
Um die Spezifizität des Antikörpers zu erhöhen, werden die Antikörpermoleküle vorzugsweise durch Immunaffinitätschromatografie unter Verwendung von an die feste Phase gebundenem Immunogen gereinigt. Der Antikörper wird mit dem an die feste Phase gebundenen Immunogen für einen Zeitraum in Berührung gebracht, der ausreichend ist, um das Immunogen mit den Antikörpermolekülen immunreagieren zu lassen, um einen an die feste Phase gebundenen Immunkomplex zu bilden. Die gebundenen Antikörper werden aus dem Komplex durch Standardtechniken abgetrennt.
Eine zur Herstellung von Antikörpern der vorliegenden Erfindung verwendbare Vakzine umfasst immunologisch wirksame Mengen von sowohl einem Immunogen als auch einem Immunverstärker, der zur Verwendung in Säugetieren geeignet ist.
Ein Immunverstärker ist eine molekulare Einheit, welche die Reifung, Differenzierung und Funktion von B- und/oder T-Lymphozyten stimuliert. Immunverstärker sind im Stand der Technik bekannt und umfassen T-Zellen stimulierende Polypeptide, wie diejenigen, die in der US-Patentschrift Nr. 4,426,324 beschrieben sind, und die C8-substituierten Guaninnukleoside, die von Goodman et al., J. Immunol., 135: 3284-3288 (1985) und in der US-Patentschrift Nr. 4,643,992 beschrieben sind.
Das Wort "Inokulum" in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird hierin verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein ECR-Homolog dieser Erfindung als einen aktiven Wirkstoff enthält, der für die Herstellung von Antikörpern dieser Erfindung verwendet wird.
Wenn ein kleines Molekül, wie ein Polypeptid, in einem Inokulum verwendet wird, um Antikörper zu induzieren, wird darunter verstanden, dass das Polypeptid in verschiedenen Ausführungsformen verwendet werden kann, z. B. allein oder an einen Träger als ein Konjugat gebunden oder als ein Polypeptidpolymer. Zur leichteren Ausdrucksweise und im Zusammenhang mit einem Polypeptid-Inokulum werden jedoch die verschiedenen Ausführungsformen der Polypeptide dieser Erfindung hierin kollektiv durch den Ausdruck "Polypeptid" und seine verschiedenen grammatischen Formen bezeichnet.
Für ein Polypeptid, das weniger als etwa 35 Aminosäurereste enthält, ist es bevorzugt, das Peptid gebunden an einen Träger zum Zwecke der Induktion der Produktion von Antikörpern zu verwenden.
Ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste können zu den Amino- oder Carboxyenden des Polypeptids zugesetzt werden, um die Bindung des Polypeptids an einen Träger zu unterstützen. Es ist festgestellt worden, dass an die Amino- oder Carboxyenden des Polypeptids zugesetzte Cysteinreste besonders verwendbar zur Bildung von Konjugaten über Disulfidbindungen sind. Andere im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Herstellung von Konjugaten können jedoch ebenfalls verwendet werden.
Die Techniken der Polypeptid-Konjugation oder -Kupplung durch aktivierte, funktionelle Gruppen, die dereit im Stand der Technik bekannt sind, sind besonders gut anwendbar; vgl. z. B. Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7: 7-23 (1978) und die US-Patentschriften Nr. 4,493,795, Nr. 3,791,932 und Nr. 3,839,153. Zusätzlich kann eine auf eine spezielle Stelle gerichtete Kupplungsreaktion durchgeführt werden, so dass jeder Aktivitätsverlust aufgrund der Polypeptidorientierung nach der Kupplung minimiert werden kann; vgl. z. B. Rodwell et al., Biotech., 3: 889-894 (1985) und die US- Patentschrift Nr. 4,671,958.
Beispielhafte zusätzliche Bindungsverfahren umfassen die Verwendung von Michael- Additionsreaktionsprodukten, Dialdehyden, wie Glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147: 318-326 (1983) und Ähnliche oder die Verwendung der Carbodiimid- Technologie, wie bei der Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids zur Bildung von Amidbindungen zu dem Träger. Alternativ kann der heterobifunktionelle Vernetzer SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)proprionat) verwendet werden, um Peptide zu konjugieren, in welche ein Carboxy-terminales Cystein eingeführt worden ist.
Verwendbare Träger sind im Stand der Technik bekannt und sind im Allgemeinen selbst Proteine. Beispiele für solche Träger sind sowohl Schlüsselloch-Napfschnecken- Hämocyanin (KLH), Edestin, Thyroglobulin, Albumine, wie Rinderserumalbumin (BSA) oder menschliches Serumalbumin (HSA), rote Blutzellen, wie Schaferythrozyten (SRBC), Tetanus-Toxoid, Cholera-Toxoid als auch Polyaminosäuren, wie Poly(D-Lysin : D-Glutaminsäure), und Ähnliche.
Die Wahl des Trägers ist abhängiger von der Endverwendung des Inokulums und basiert auf Kriterien, die nicht besonders an der vorliegenden Erfindung beteiligt sind. So sollte z. B. ein Träger ausgewählt werden, der keine ungünstige Reaktion in dem speziellen zu inokulierenden Tier hervorruft.
Das vorliegende Inokulum enthält eine wirksame, immunogene Menge eine Homologs dieser Erfindung, typischerweise als ein an einen Träger gebundenes Konjugat. Die wirksame Menge des Homologs pro Einheitsdosis, die ausreichend ist, um eine Immunreaktion des Immunogens zu induzieren, hängt u. a. von der Art des inokulierten Tiers, dem Körpergewicht des Tiers und der gewählten Inokulationsdosierung ab, was im Stand der Technik bekannt ist. Inokula enthalten typischerweise Homologkonzentrationen von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 500 Milligramm pro Inokulation (Dosis), vorzugsweise etwa 50 Mikrogramm bis etwa 50 Milligramm pro Dosis.
Der Ausdruck "Einheitsdosis", wie er die Inokula betrifft, bezieht sich auf körperlich diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen für Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die so berechnet ist, dass die erwünschte immunogene Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. dem Träger oder Vehikel, erhalten wird. Die Spezifikationen für die neue Einheitsdosis eines Inokulums dieser Erfindung werden diktiert durch und sind direkt abhängig von (a) den einmaligen Charakteristiken des aktiven Materials und der zu erzielenden speziellen immunologischen Wirkung und (b) den inhärenten Beschränkungen bei der Formulierung solchen aktiven Materials für die immunologische Verwendung in Tieren, wie es im Einzelnen hierin beschrieben ist, wobei diese Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
Inokula werden typischerweise aus dem getrockneten, festen Homolog-Konjugat durch Dispergieren des Konjugats in einem physiologisch tolerierbaren (annehmbaren) Verdünnungsmittel hergestellt, wie Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, um eine wässrige Zusammensetzung zu bilden.
Inokula können auch ein Adjuvans als Teil des Verdünnungsmittels enthalten. Adjuvanzien, wie komplettes Freunds Adjuvans (CFA), inkomplettes Freunds Adjuvans (IFA) und Alaun sind im Stand der Technik bekannte Materialien und sind im Handel aus verschiedenen Quellen erhältlich.
Der so hergestellte spezifische Antikörper gegen das Homolog kann u. a. in den therapeutischen und diagnostischen Methoden und Systemen der vorliegenden Erfindung zur Hemmung der Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen und zum Nachweis von Homologen, die in einer Probe, wie einer Körperflüssigkeitsprobe, vorhanden sind, verwendet werden.
Ein Antikörper dieser Erfindung ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper aufgrund der einem monoklonalen Antikörper zukommenden kontrollierten Spezifizität.
Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" in seinen verschiedenen grammatischen Formen bezieht sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Art einer Antikörper-Bindungsstelle enthalten, die zur Immunreaktion mit einem speziellen Epitop befähigt ist. Ein monoklonaler Antikörper zeigt somit typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für jedes Epitop, mit welchem es immunreagiert. Ein monoklonaler Antikörper kann daher ein Antikörpermolekül mit mehreren Antikörper-Bindungsstellen enthalten, wobei jede immunspezifisch für ein verschiedenes Epitop ist, z. B. ein bispezifischer, monoklonaler Antikörper.
Ein monoklonaler Antikörper ist typischerweise aus Antikörpern zusammengesetzt, die durch Klone einer Einzelzelle, genannt Hybridom, hergestellt werden, die nur eine Art eines Antikörpermoleküls sezerniert (produziert). Die Hybridomzelle wird durch Verschmelzen einer Antikörper produzierenden Zelle und eines Myeloms oder einer anderen selbst perpetuierenden Zelllinie gebildet.
Die Herstellung von solchen Antikörpern wurde zuerst von Kohler und Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) beschrieben. Eine beispielhafte Hybridom-Technologie wird von Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80: 4949-4953 (1983) beschrieben. Andere Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, einer Hybridomzelle oder einer Hybridomzellkultur sind ebenfalls bekannt; vgl. z. B. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; oder das Verfahren zum Isolieren von monoklonalen Antikörpern aus einem immunologischen Repertoire, wie von Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5728-5732 (1989) und Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1981) beschrieben. Die zitierten Literaturstellen sind hierin durch Bezug eingeschlossen.
Das so hergestellte Hybridom produziert einen Überstand, der auf die Anwesenheit von Antikörpermolekülen, die mit einem Homolog dieser Erfindung immunreagieren, oder auf die Hemmung der Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen, wie hierin weiter beschrieben, durchgemustert werden kann.
Kurz gesagt, wird zur Bildung des Hybridoms, aus welchem die monoklonale Antikörper- Zusammensetzung hergestellt wird, ein Myelom oder eine andere selbst perpetuierende Zelllinie mit Lymphozyten verschmolzen, die aus der Milz eines mit einem Homolog dieser Erfindung als Immunogen hyperimmunisierten Säugetiers erhalten werden.
Es ist bevorzugt, dass die zur Herstellung eines Hybridoms verwendete Myelom-Zelllinie aus der gleichen Art stammt wie die Lymphozyten. Typischerweise ist eine Maus des Stammes 129 GIX&spplus; das bevorzugte Säugetier. Geeignete Maus-Myelome zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidinempfindlichen (HAT) Zelllinien P3X63-Ag8.653 und Sp2/0-Ag14, die von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter den Bezeichnungen CRL 1580 bzw. CRL 1581 erhältlich sind.
Splenozyten werden typischerweise mit Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) 1500 verschmolzen. Verschmolzene Hybride werden durch ihre Empfindlichkeit auf HAT ausgewählt. Hybridome, welche einen monoklonalen Antikörper dieser Erfindung produzieren, werden unter Verwendung des Enzymimmunoassays (ELISA), beschrieben in Beispiel 4, identifiziert.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auch durch das Starten einer monoklonalen Hybridomkultur hergestellt werden, die ein Nährmedium umfasst, welches ein Hybridom enthält, das Antikörpermoleküle der geeigneten Polypeptid- Spezifizität herstellt und sezerniert. Die Kultur wird unter Bedingungen und für einen Zeitraum aufrecht erhalten, der für das Hybridom ausreichend ist, um die Antikörpermoleküle in das Medium zu sezernieren. Das Antikörper enthaltende Medium wird dann gesammelt. Die Antikörpermoleküle können dann nach bekannten Techniken weiter isoliert werden.
Für die Herstellung dieser Zusammensetzungen verwendbare Medien sind sowohl im Stand der Technik bekannt als auch im Handel erhältlich und umfassen synthetische Kulturmedien, durch Inzucht erzeugte Mäuse und Ähnliche. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbeccos essentielles Minimalmedium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8: 396 (1959)), ergänzt mit 4,5 g/l Glucose, 20 mm Glutamin und 20% fötalem Kalbsserum. Ein beispielhafter durch Inzucht erzeugter Mäusestamm ist Balb/c.
Die monoklonalen Antikörper dieser Erfindung können in der gleichen Weise verwendet werden, wie hierin für Antikörper der vorliegenden Erfindung beschrieben.
So kann z. B. der monoklonale Antikörper in den hierin beschriebenen therapeutischen, diagnostischen oder in vitro-Methoden verwendet werden, wo die Hemmung der Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen erwünscht ist.
Ein bevorzugter monoklonaler Antikörper immunreagiert mit dem hierin beschriebenen Prototyp von ECR, nämlich ICAM-1.
Der monoklonale Antikörper gegen ICAM-1 wurde hergestellt durch Immunisieren mit Endothelzellen, gefolgt von dem Durchmustern auf die Fähigkeit, die Bindung von Fg an Endothelzellen zu hemmen, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Ein besonders bevorzugter monoklonaler Antikörper gegen ICAM-1 ist der von dem Hybridom 14E11, 16G8, 2E12 und 2B12 produzierte monoklonale Antikörper, der mit ICAM-1 immunreagiert und die Bindung von Fg an Endothelzellen hemmt.
Ebenfalls in Betracht gezogen werden monoklonale Antikörper mit einer Bindungsspezifizität für die gleichen oder kreuzreagierenden Epitope, d. h. immunspezifisch für das gleiche Epitop, auf ICAM-1 als den vorstehend bevorzugten Antikörpern gegen ICAM-1 oder abgeleitet von den vorstehenden Antikörpern. Somit zieht die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper und immunreaktive Fragmente davon in Betracht, der die Immunspezifizität eines monoklonalen Antikörpers hat, hergestellt durch ein Hybridom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 14E11, 16G8, 2E12 und 2B12.
Immunologische Techniken zur Bestimmung der Immunspezifizität eines monoklonalen Antikörpers sind im Stand der Technik bekannt und können Konkurrenzbindungsstudien und andere Kreuzreaktions-Assays umfassen; vgl. z. B. die Immunoassays, die in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 beschrieben sind.
Durch diese Erfindung wird ebenfalls die Hybridomzelle und eine Hybridomzelle enthaltende Kulturen, die einen monoklonalen Antikörper dieser Erfindung produzieren, in Betracht gezogen.
Die Hybridome 14E11, 16G8, 2E12 und 2B12 sind gemäß den Erfordernissen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, am 10. Juni 1992 hinterlegt worden und erhielten die Hinterlegungsnummern HB 11064, 11063, 11061 bzw. 11062.
Die Hybridome 14E11, 16G8, 2E12 und 2B12 wurden in einer Hinterlegungsstelle hinterlegt, welche die Dauerhaftigkeit der Hinterlegung und die rasche Zugänglichkeit durch die Öffentlichkeit nach der Ausgabe eines Patents unter Bedingungen gewährleistet, die sicherstellen, dass der Zugang zu den Hybridomen während der Anhängigkeit der Patentanmeldung für diejenigen möglich ist, die der Commissioner als für solchen Zugang berechtigt ansieht, und dass sämtliche Beschränkungen der Erhältlichkeit der hinterlegten Hybridome gegenüber der Öffentlichkeit unwiderruflich nach der Erteilung des Patents entfallen. Die hinterlegten Hybridome werden von der ATCC für die Laufzeit des Patents oder 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung, je nachdem, welcher Zeitraum länger ist, und unter allen Umständen für wenigstens fünf Jahre nach dem Datum des letzten Antrags auf Zugänglichkeit aufrecht erhalten.

E. Verfahren zur Hemmung der Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen und zur Hemmung von durch Fibrinogen/Endothelzellen vermittelter Entzündung

Die vorliegende Erfindung zieht ein Verfahren der Hemmung der Bindung von Fibrinogen (Fg) an Endothelzellen durch Kontaktieren der Endothelzellen mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung in Betracht, die ein Fg- oder ECR- Homolog oder beide dieser Erfindung enthalten, dispergiert in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Wie hierin beschrieben, weisen die Verwendung eines Fg-Homologs oder eines ECR- Homologs oder von beiden eine therapeutisch wirksame Hemmung der Bindung von Fg an Endothelzellen auf, da diese zwei therapeutischen Reagenzien als Homologe ihre natürlichen Gegenstücke nachbilden und dadurch die Fibrinogen-ECR-Wechselwirkung, wie durch die vorliegende Erfindung gezeigt, blockieren.
In den Beispielen hierin wird der ECR-Homolog-monoklonale Antikörper gegen ICAM-1 als ein beispielhaftes therapeutisches Reagens zur Verwendung in einer Zusammensetzung für das vorliegende Verfahren verwendet. In einem anderen Beispiel wird das Fg-Homolog, intaktes Fibrinogen, als ein beispielhaftes therapeutisches Reagens verwendet. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die Erfindung die Verwendung jedes Fg- oder ECR-Homologs in Betracht zieht und nicht auf diese speziellen Reagenzien beschränkt ist.
Insofern die Bindung von Fg an Endothelzellen die durch Fibrinogen und Endothelzellen vermittelte Entzündung vermittelt, stellt die Hemmung der Bindung von Fg in vivo ein Verfahren zur Hemmung einer Entzündung in einem Patienten bereit, der unter einer durch Fibrinogen und Endothelzellen vermittelten Entzündung leidet oder ein Risiko hierfür hat.
Somit zieht die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Hemmung der durch Fibrinogen/Endothelzellen vermittelten Entzündung in einem Patienten in Betracht, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung an den Patienten umfasst, wobei die Zusammensetzung ein im Wesentlichen reines Homolog enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Fg-Homolog und einem ICAM-1-Homolog, dispergiert zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Patienten, in welchen die Hemmung der Bindung von Fg an Endothelzellen und die Hemmung der Entzündung klinisch anwendbar ist, umfassen Patienten mit verschiedenen Entzündungstypen oder einem Entzündungsrisiko, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Patienten mit erst kürzlich erfolgtem Myocardinfarkt (innerhalb von 40 Stunden nach dem akuten Ereignis), worin das Fg- oder ECR-Homolog die Neutrophil-Akkumulation auf exponierten Geweben aufgrund der Verletzung solcher Gewebe verhindern würde, Patienten mit Autoimmunreaktionen, allgemeinen Entzündungsreaktionen oder lokalisierten Entzündungsreaktionen, Glomerulonephritis, Hypersensitivität vom verzögerten Typ, Psoriasis, Autoimmun-Schilddrüsenentzündung, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Lupus erythematodes, Gewebetransplantaten, Transplantatabstoßung, Reperfusionsverletzung des Gewebes und ähnlichen entzündlichen Störungen.
Die Hemmung der durch Fibrinogen/Endothelzellen vermittelten Entzündung kann durch Messen der Änderungen der Menge der Neutrophil-Akkumulation an der Stelle einer Verletzung oder Wunde, die eine Entzündung hervorruft, nachgewiesen werden. So kann z. B. die Anzahl von Neutrophilen, die an der Stelle eines Schwamms akkumulieren, der unter die Haut gelegt ist, sowohl vor als auch nach der Verabreichung eines Fg- oder ECR-Homologs an den Patienten bestimmt werden; vgl. z. B. Price et al., J. Immunol., 139: 4174-4177 (1987).
Eine durch Fibrinogen/Endothelzellen vermittelte Entzündung umfasst jeden der verschiedenen biologischen Vorgänge vermittelten Lymphozyt mit einem Mac-1-Rezeptor auf seiner Zelloberfläche. Typische biologische Vorgänge umfassen die Adhäsion von Mac-1 tragenden Zellen an Gefäßendothel und spezielle Wechselwirkungen mit extrazellulären Matrixproteinen.
Ein Homolog wird typischerweise als eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung in Form einer Lösung oder Suspension verabreicht. Wie jedoch bekannt ist, können Peptide und Proteine, wie ein Fg- oder ECR-Homolog, auch zur therapeutischen Verabreichung als Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern formuliert werden. Typischerweise liegen geeignete Dosierungsbereiche für eine therapeutische Zusammensetzung in der Größenordnung von eins bis einigen hundert Nanomol Fg- oder ECR-Homolog pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute und hängen von dem Verabreichungsweg ab. In jedem Fall enthält die verabreichte Zusammensetzung wenigstens etwa 0,10 bis etwa 99 Gew.-% eines Fg- oder ECR-Homologs, bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise 10-90% und weiter vorzugsweise 25-75%.
Die Zusammensetzung wird in einer Weise, die mit der Dosierungsformulierung verträglich ist, und in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die zu verabreichende Menge hängt ab von dem zu behandelnden Lebewesen, von der Fähigkeit des hämostatischen Blutsystems des Lebewesens, den aktiven Bestandteil zu verwenden, und von dem Grad der erwünschten Entzündungshemmung oder der Hemmung der Fibrinogen-Bindung. Genaue Mengen des aktiven Bestandteils, der für die Verabreichung erforderlich ist, hängen von der Einschätzung des Praktikers ab und sind eigentümlich für jedes Individuum.
Eine therapeutisch wirksame Menge von Homolog kann ausgedrückt werden als eine Menge, die ausreichend ist, um eine Endkonzentration von Homolog in dem Blut eines Patienten hervorzurufen. Diese Blutkonzentration kann durch einen in vitro-Assay für das Homolog in einer Körperflüssigkeitsprobe (z. B. Blut), wie er hierin beschrieben ist, bestimmt werden oder kann berechnet werden, bezogen auf das Körpergewicht und das Blutvolumen des Patienten, wie bekannt ist.
Geeignete Dosierungsbereiche eines Homologs für die hierin beschriebenen therapeutischen Methoden liegen in der Größenordnung von etwa 0,1 bis etwa 20 Milligramm, vorzugsweise eins bis zehn Milligramm Homolog pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten pro Tag und sind abhängig von dem Verabreichungsweg. Anders ausgedrückt, ist eine therapeutisch wirksame Dosierung eine Menge, die ausreichend ist, um eine intravaskuläre Konzentration in dem Blut des Patienten in dem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 Mikrogramm/Milliliter (ug/ml), vorzugsweise etwa 10 bis etwa 20 ug/ml, des aktiven Bestandteils hervorzurufen.

F. Verfahren zum Nachweis von Homolog

Die vorliegende Erfindung zieht jedes Verfahren in Betracht, das zum Nachweis eines Homologs durch die Herstellung eines Reaktionsprodukts unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, polyklonalen Antikörpers oder Homolog-Bindungsreagens führt. Aufgrund der Bindungswechselwirkung eines Fg-Homologs und eines ECR-Homologs kann ein Fg-Homolog-Bindungsreagens jedes ECR-Homolog sein, und ein ECR- Homolog-Bindungsreagens kann jedes Fg-Homolog sein.
Dem Fachmann ist bekannt, dass es zahlreiche bekannte chemische Verfahren der klinischen Diagnostik gibt, die zur Bildung und zum Nachweis solcher Reaktionsprodukte verwendet werden können. Obwohl beispielhafte Assay-Methoden hierin beschrieben werden, ist die Erfindung somit nicht darauf beschränkt.
Es können verschiedene heterogene und homogene Assay-Protokolle, entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv, zum Nachweis der Anwesenheit und vorzugsweise der Menge eines Fg- oder ECR-Homologs in einem Gewebe oder einer flüssigen Zusammensetzung verwendet werden.
Ein Fg- oder ECR-Homolog kann in jeder Probe, wie einem Feststoff, einer Flüssigkeit oder einer Körperflüssigkeitsprobe, nachgewiesen werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein Homolog in Körperflüssigkeitsproben nachgewiesen, einschließlich Blut, Plasma, Serum, Schleim, Sputum und Ähnlichem.
Ein Homolog kann auch in vitro oder in vivo in verschiedenen Geweben und Organen nachgewiesen werden. In bevorzugten Ausführungsformen können Gewebestücke oder Gewebeschnitte auf die Anwesenheit und den Ort eines Homologs geprüft werden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen können Organe in vivo auf die Anwesenheit und um den Ort eines Homologs zu bestimmen, geprüft werden.
Der Nachweis der Menge von Homolog, das in vitro oder in vivo vorhanden ist, ist verwendbar, da die Menge des vorhandenen Homologs mit dem Fortschritt des therapeutisch verabreichten Homologs korreliert, das in dem untersuchten Patienten vorhanden ist. So erlaubt die Bestimmung der Menge von Homolog, das in dem untersuchten Patienten vorhanden ist, die therapeutische Verabreichung eines Homologs an einen Patienten, der überwacht wird, um den klinischen Status des Patienten zu bestimmen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit und vorzugsweise der Menge eines Fg-Homologs in einer flüssigen Zusammensetzung in Betracht gezogen. Die Schritte dieses Verfahrens umfassen:
(1) Das Vermischen einer Probe von Endothelzellen mit einer vorbestimmten Menge einer flüssigen Probe, enthaltend ein Fg-Homolog und eine vorbestimmte Menge von markiertem Fg-Homolog, um eine Konkurrenzreaktionsmischung zu bilden;
(2) Das Aufrechterhalten der in Schritt (1) gebildeten Reaktionsmischung für einen vorbestimmten Zeitraum, der ausreichend ist, dass das in der flüssigen Zusammensetzung vorhandene Fg-Homolog an die Endothelzellen bindet und einen Endothelzellen: Fg- Homolog-Komplex bildet und die Bindung des markierten Fg-Homologs an die Endothelzellen erlaubt und einen markierten Endothelzellen: Fg-Homolog-Komplex bildet;
(3) Die Prüfung auf die Anwesenheit und/oder Menge des in Schritt (2) gebildeten markierten Endothelzellen: Fg-Homolog-Komplexes, wodurch die Anwesenheit und/oder Menge eines Fg-Homologs in der Zusammensetzung nachgewiesen wird.
Eine vorbestimmte Menge einer flüssigen Zusammensetzung, die ein Fg-Homolog enthält, ist eine bekannte Menge einer Fg-enthaltenden, flüssigen Zusammensetzung, die verwendbar und in einfacher Weise untersuchbar ist. Diese vorbestimmte Menge an Fg-Homolog enthaltender flüssiger Zusammensetzung hat sich als verwendbar erwiesen bei der Durchführung einer Reihe von Test-Assays mit einer Menge an flüssiger Zusammensetzung, die eine bekannte Konzentration von Fg-Homolog enthält, und ausreichend ist, um die Durchführung des Assays zu erlauben. Bevorzugte Mengen einer flüssigen Zusammensetzung betragen von etwa 1 Mikroliter (ul) bis etwa 1000 ul.
Die flüssige Zusammensetzung enthält ebenfalls ein markiertes Fg-Homolog. Ein Marker ist ein Atom oder Molekül, das entweder direkt oder indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals beteiligt ist, um die Anwesenheit eines Komplexes anzuzeigen. Jeder Marker oder Indikator kann an ein exprimiertes Protein, ein Polypeptid oder einen Antikörper oder eine monoklonale Antikörper-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gebunden oder darin inkorporiert sein oder getrennt verwendet werden, und diese Atome oder Moleküle können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden. Marker umfassen verschiedene in vivo-Marker, die im Körper eines Patienten verwendbar sind, wie ¹¹¹In, &sup9;&sup9;Tc, &sup6;&sup7;Ga, ¹&sup8;&sup6;Re, und ¹³²I.
Der Marker kann ein fluoreszierendes Markierungsmittel sein, das chemisch an Antikörper oder Antigene bindet, ohne sie zu denaturieren, um ein fluoreszierendes Material (Farbstoff) zu bilden, das ein verwendbarer Immunfluoreszenz-Tracer ist. Geeignete fluoreszierende Markierungsmittel sind Fluorochrome, wie Fluoresceinisocyanat (FIC), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), 5-Dimenthylamin-1-naphthalinsulfonylchlorid (DANSC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), Lissamin, Rhodamin 8200-Sulfonylchlorid (RB 200 5C) und Ähnliche. Eine Beschreibung der Immunfluoreszenz-Analysetechniken findet sich in Deluca, "Immunofluorescence Analysis", in Antibody As A Tool, Marchalonis et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Ltd., Seiten 189-231 (1982), was hierin durch Bezug eingeschlossen ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Marker ein Enzym, wie Meerrettich- Peroxidase (HRP), Glucoseoxidase oder Ähnliches. In solchen Fällen, wo die Hauptindikatorgruppe ein Enzym, wie HRP oder Glucoseoxidase, ist, sind zusätzliche Reagenzien erforderlich, um die Tatsache sichtbar zu machen, dass sich ein Rezeptor-Ligand- Komplex (Immunreaktant) gebildet hat. Solche zusätzlichen Reagenzien für HRP umfassen Wasserstoffperoxid und einen Oxidationsfarbstoff-Vorläufer, wie Diaminobenzidin. Ein zusätzliches Reagens, das mit Glucoseoxidase verwendet wird, ist 2,2'-Azinodi(3-ethyl-4-2-benzthiazolin-G-sulfonsäure) (ABTS).
Radioaktive Elemente sind ebenfalls als Marker verwendbar. Ein beispielhafter Radiomarker ist ein radioaktives Element, das Gammastrahlen-Emissionen hervorruft. Elemente, welche selbst Gammastrahlen emittieren, wie ¹²&sup4;I, ¹²&sup5;I, ¹²&sup8;I, ¹³¹I, ¹³²I und &sup5;¹Cr, repräsentieren eine Klasse von Gammastrahlemission hervorrufenden Indikatorgruppen radioaktiver Elemente. Besonders bevorzugt ist ¹²&sup5;I. Eine andere Gruppe von verwendbaren Indikatorgruppen sind solche Elemente, wie ¹¹C, ¹&sup8;F, ¹&sup5;O und ¹³N, welche selbst Positronen emittieren. Die so emittierten Positronen rufen Gammastrahlen beim Zusammentreffen mit Elektronen hervor, die in dem Tierkörper vorhanden sind. Ebenfalls verwendbar ist ein Betastrahler, wie Indium.
Die Bindung von Markern, d. h. das Markieren von Polypeptiden und Proteinen, wie einem Fg-Homolog, ist im Stand der Technik bekannt. So können z. B. durch ein Hybridom hergestellte Antikörpermoleküle durch metabolische Inkorporation von Radioisotop enthaltenden Aminosäuren, die als eine Komponente in dem Kulturmedium bereit gestellt sind, markiert werden; vgl. z. B. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73: 3-46 (1981). Die Techniken der Protein-Konjugation oder -Kupplung durch aktivierte funktionelle Gruppen sind insbesondere anwendbar; vgl. z. B. Aurameas et al., Scand. 1 Immunol., Bd. 8, 7: 7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3: 889-894 (1985) und die US-Patentschrift Nr 4,493,795. Zusätzlich können auf eine bestimmte Stelle gerichtete Kupplungsreaktionen derart durchgeführt werden, dass der Marker im Wesentlichen nicht die Fähigkeit der Antikörpermoleküle stört, an ihr spezifisches Antigen zu binden; vgl. z. B. Rodwell et al., Biotech., 3: 889-894 (1985).
Die Reaktionsmischung wird für einen vorbestimmen Zeitraum aufrecht erhalten, der ausreichend ist, dass das in der flüssigen Zusammensetzung enthaltene Fg-Homolog und das markierte Fg-Homolog an die Endothelzellen binden und einen Endothelzellen: Fg-Homolog-Komplex und einen markierten Endothelzellen : Fg-Homolog-Komplex bilden.
Die Zeit, die für das Fg-Homolog und das markierte Fg-Homolog ausreichend ist, um die Endothelzellen zu binden, hängt von verschiedenen physikalischen Parametern einschließlich der Temperatur und der Konzentration der verschiedenen Reaktanten ab. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt der vorbestimmte Zeitraum etwa 1 Minute bis 24 Stunden. In bevorzugteren Ausführungsformen beträgt der vorbestimmte Zeitraum etwa 10 Minuten bis etwa 1 Stunde. In den bevorzugtesten Ausführungsformen beträgt, der vorbestimmte Zeitraum etwa 15 Minuten bis 30 Minuten. Typischerweise wird dieser Zeitraum vorbestimmt, um den Assay zu optimieren.
Typischerweise wird die Reaktionsmischung unter biologischen Assay-Bedingungen aufrecht erhalten, welche die Aktivität der Polypeptid- und Proteinmoleküle einschließlich des Fg-Homologs und der zu untersuchenden Endothelzellen aufrecht erhalten, und umfassen einen Temperaturbereich von etwa 4ºC bis etwa 45ºC, einen Bereich des pH- Werts von etwa 5 bis etwa 9 und eine Ionenstärke, die von der Ionenstärke von destilliertem Wasser bis zu der Ionenstärke von etwa eins molarem Natriumchlorid variiert. Verfahren zum Optimieren solcher Bedingungen sind im Stand der Technik bekannt.
Die Anwesenheit von markiertem Endothelzellen : Fg-Homolog-Komplex, der durch das Aufrechterhalten der Reaktionsmischung in Schritt (2) gebildet wurde, wird untersucht.
Die zur Untersuchung auf die Anwesenheit und vorzugsweise die Menge von gebildetem, markiertem Endothelzellen : Fg-Homolog-Komplex verwendeten direkten oder indirekten Methoden hängen von dem speziellen verwendeten Marker ab und sind im Stand der Technik bekannt.
So kann z. B. die Menge an Radioaktivität in dem markierten Endothelzellen : Fg- Homolog-Komplex bestimmt werden, wie in Beispiel 5 beschrieben. Alternative, homogene Assay-Methoden sind solche, die in den US-Patentschriften Nr. 4,536,479, Nr. 4,233,401, Nr. 4,233,402 und Nr. 3,996,345 beschrieben sind.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen zieht die vorliegende Erfindung ein anderes Verfahren zum Nachweis der Menge eines Fg-Homologs in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines Fg-Homolog-Bindungsreagens, d. h. eines ECR-Homologs, in Betracht. Die Stufen dieses Verfahrens umfassen:
(1) Das Vermischen eines ECR-Homologs mit einer vorbestimmten Menge einer flüssigen Probe, die ein Fg-Homolog enthält, um eine Bindungsreaktionsmischung zu bilden;
(2) Das Aufrechterhalten der in Schritt (1) gebildeten Bindungsreaktionsmischung für einen vorbestimmten Zeitraum, der ausreichend ist, um das in der flüssigen Probe vorhandene Fg-Homolog an das ECR-Homolog zu binden und einen Fg-Homolog und ECR-Homolog enthaltenden Komplex zu bilden; und
(3) Das Bestimmen der Menge des in Schritt (2) gebildeten Komplexes, wodurch die Menge eines Fg-Homologs in der flüssigen Probe nachgewiesen wird.
Ein bevorzugtes ECR-Homolog ist ein monoklonaler Antikörper gegen Fg, und der gebildete Komplex ist ein Immunreaktionskomplex.
In einer verwandten Ausführungsform zieht die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Menge eines ECR-Homologs in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines ECR-Homolog-Bindungsreagens, d. h., eines Fg-Homologs, in Betracht. Das Verfahren wird in der gleichen Weise wie vorstehend ausgeführt, mit der Ausnahme, dass ein Fg- Homolog als Bindungsreagens zu einer ein ECR-Homolog enthaltenden Probe zugesetzt wird.
Vorzugsweise ist die ein Homolog enthaltende flüssige Probe eine biologische Flüssigkeitsprobe, wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Speichel und Ähnliches. Vorzugsweise ist die Menge der zugesetzten flüssigen Probe bekannt.
Für den Bestimmungsschritt ist es bevorzugt, dass das zugesetzte Homolog (Fg- Homolog zum Nachweis von ECR-Homolog und ECR-Homolog zum Nachweis von Fg-Homolog) markiert ist, d. h. operativ an einen Indikator gebunden, wie ein Enzym, Radionuklid und Ähnliches, wie früher beschrieben. In dieser Ausführungsform wird die Bestimmung durchgeführt, indem die Anwesenheit/Menge des Markers in dem Komplex nachgewiesen wird, wodurch die Anwesenheit/Menge des Homologs in der Probe bestimmt wird.
In einer Ausführungsform ist das zugesetzte Homolog als Teil des festen Trägers vorhanden, d. h., operativ an eine feste Matrix gebunden, so dass die gebildete Reaktionsmischung eine feste und flüssige Phase ist mit dem Ziel, die zu bestimmende Probe "einzufangen".
Die Reaktionsmischung wird für einen vorbestimmten Zeitraum aufrecht erhalten, der ausreichend ist, um das in der flüssigen Probe vorhandene Homolog an den Antikörper zu binden und einen Komplex zu bilden, der ein nachzuweisendes Homolog und das zugesetzte Homolog enthält.
Biologische Assay-Bedingungen sind solche Bedingungen, welche die biologische Aktivität der Reagenzien und des zu untersuchenden Homologs aufrecht erhalten, wie früher diskutiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Menge an Homolog in dem Komplex entweder direkt oder indirekt unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Assay-Techniken bestimmt werden, und sie hängen typischerweise von dem Typ des verwendeten Indikators ab.

6. Nachweis von ECR-Rezeptoren in vivo

Ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit und vorzugsweise der Menge und des Orts von Zellen mit ECR-Rezeptoren in einem Säugetier ist in Betracht gezogen. Eine wirksame Menge einer Zusammensetzung, die ein physiologisch tolerierbares Verdünnungsmittel und eine Menge an Fg-Homolog enthält, das an einen in vivo-Indikator gebunden ist, wird parenteral an einen Menschen verabreicht. Die parenterale Verabreichung umfasst die intramuskuläre Verabreichung, die intravenöse Verabreichung und die Verabreichung in andere Körperstellen, wie die Synovialflüssigkeit. Die Menge der verabreichten Zusammensetzung ist ausreichend, um eine nachweisbare Menge von ECR-Rezeptoren zu binden. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Fg-Homolog Antikörpermoleküle gegen ICAM-1 oder D&sub3;&sub0;-Fragment.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke "Marker" und "Indikator" in ihren verschiedenen grammatischen Formen auf einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals beteiligt sind, um die Anwesenheit eines Komplexes anzuzeigen. "In vivo"-Marker oder -Indikator sind solche, die in dem Körper eines Menschen verwendbar sind. Jeder Marker oder Indikator kann gebunden sein oder inkorporiert in einem exprimierten Protein, Polypeptid oder Antikörpermolekül, das Teil einer Antikörper- oder monoklonalen Antikörper-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist, oder er kann getrennt verwendet werden, und solche Atome oder Moleküle können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden. Solche Marker sind selbst in der klinischen, diagnostischen Chemie bekannt und bilden einen Teil dieser Erfindung nur insoweit, wie sie mit sonst neuen Proteinen, Methoden und/oder Systemen verwendet werden.
Die Bindungsmarker, d. h. das Markieren von Polypeptiden und Proteinen ist im Stand der Technik bekannt. So können z. B. Antikörpermoleküle, die von einem Hybridom produziert werden, durch metabolische Inkorporation von Radioisotop enthaltenden Aminosäuren, die als eine Komponente in dem Kulturmedium enthalten sind, markiert werden; vgl. z. B. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73: 3-46 (1981). Die Techniken von Proteinkonjugation oder -Kupplung durch aktivierte, funktionelle Gruppen sind insbesondere anwendbar; vgl. z. B. Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Bd. 8, 7: 7-23 (1978), Rodweil et al., Biotech., 3: 889-894 (1984) und die US-Patentschrift Nr. 4,493,795.
Die betreffende Person wird dann für einen vorbestimmten Zeitraum gehalten, der ausreichend ist, um das Fg-Homolog an die ECR-Rezeptoren zu binden, die auf den Zellen des Menschen vorhanden sind und einen ECR : Fg-Homolog-Komplex bilden. Vorzugsweise ist dieser Zeitraum vorbestimmt worden, um die Bildung eines ECR : Fg- Homolog-Komplexes zu optimieren.
Die betreffende Person wird dann auf die Anwesenheit und vorzugsweise den Ort von jedem der gebildeten ECR : Fg-Homolog-Komplexe untersucht.

H. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren

Die vorliegende Erfindung zieht auch Verfahren zum Identifizieren einer Zusammensetzung in Betracht, welche die Fibrinogen-Bindungswechselwirkung an Endothelzellen hemmt, wo die Wechselwirkung durch die Fibrinogen-Bindungsstelle auf ECR vermittelt wird, wie hierin beschrieben.
Das Verfahren ist allgemein verwendbar für den Entwurf neuer Therapeutika, die zur Hemmung von durch Endothelzellen/Fibrinogen vermittelter Entzündung verwendet werden, und ist insbesondere als ein Massen-Durchmusterungsverfahren verwendbar, um aktive Inhibitorverbindungen und -Formulierungen zu identifizieren.
Die Erfindung zieht daher ein Verfahren zum Identifizieren einer Zusammensetzung in Betracht, welche die Bindung von Fibrinogen an ECR auf Endothelzellen hemmt, welches umfasst:
(a) Das Inkubieren von Komponenten, welche die zu prüfende Zusammensetzung zusammen mit einem ECR-Homolog und einem Fg-Homolog unter Bedingungen umfassen, welche es erlauben, dass das ECR-Homolog mit dem Fg-Homolog in Wechselwirkung tritt und daran bindet; und
(b) Das Messen der Wechselwirkung des ECR-Homologs mit dem Fg-Homolog, wodurch die Kapazität der Zusammensetzung zur Hemmung der Wechselwirkung gemessen wird.
Ein bevorzugtes ECR-Homolog ist ICAM-1, und ein bevorzugtes Fg-Homolog ist Fg, wie hierin definiert.
Die Messung kann auf den Nachweis des freien Fg-Homologs, des freien ECR- Homologs oder der freien Zusammensetzung gerichtet sein. Alternativ kann die Messung die Bindungswechselwirkung der Zusammensetzung mit entweder dem ECR- Homolog oder dem Fg-Homolog nachweisen. Typischerweise wird die Bindungswechselwirkung durch Nachweis eines durch die Bindung gebildeten Komplexes gemessen.
Die Bedingungen, die für die Bindungswechselwirkung ausreichend sind, sind im Allgemeinen physiologisch und sind Zeit-, Temperatur- und Pufferbedingungen, die mit der Bindung von Fibrinogen auf Endothelzellen verträglich sind, wie in den Beispielen gezeigt.
Bevorzugter wird die Bindungswechselwirkung in Assays nachgewiesen, worin das eine oder das andere von Fg-Homolog und ECR-Homolog in der festen Phase sind, und das andere markiert ist. Die Messung umfasst den Nachweis der Anwesenheit und vorzugsweise der Menge des Markers in der festen Phase, was direkt den Grad der Hemmung durch die Zusammensetzung anzeigt.
In einer verwandten Ausführungsform beschreibt die Erfindung ein Verfahren zum Durchmustern auf Zusammensetzungen, die bei der Hemmung der Bindung von Fibrinogen an ECR wirksam sind, umfassend die Schritte:
a) Das Mischen von vorher bestimmten Mengen einer mutmaßlichen Inhibitor- Zusammensetzung, eines Fibrinogen-Homologs und eines ECR-Homologs, wie hierin definiert, in einer Hemmungsreaktionsmischung;
b) Das Aufrechterhalten der Mischung unter Bedingungen, die ausreichend sind, dass das ECR-Homolog an das Fg-Homolog bindet und einen ECR-Homolog : Fg-Homolog- Komplex bildet; und
c) Das Messen der Menge des in Schritt (b) gebildeten ECR-Homolog : Fg-Homolog- Komplexes und dadurch der Wirksamkeit der Inhibitor-Zusammensetzung.
Bei der Durchführung des Verfahrens ist eines der Homologe markiert und in der flüssigen Phase, und das andere Homolog ist in der festen Phase, worin die Messung den Nachweis der Menge an Marker in der festen Phase beinhaltet. Andere Formate sind rasch ersichtlich.
Vorzugsweise ist das ECR-Homolog gereinigtes ICAM-1. Weiter vorzugsweise ist das ECR-Homolog in der festen Phase. Noch weiter vorzugsweise ist die feste Phase eine Zelle, auf der ECR lokalisiert ist, wie eine Endothelzelle, eine Lymphoidzelle oder eine rekombinante Zelle, die zur Expression von rekombinantem ICAM-1 befähigt ist.
Beispielhafte Durchmusterungsverfahren sind in Beispiel 5 beschrieben, wo Antikörper identifiziert wurden, welche die Bindung von Fg an Endothelzellen hemmen. Fg- Homologe und ECR-Homologe können durch die vorstehenden Verfahren auch entwickelt und/oder identifiziert werden.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, aber nicht beschränken.

1. Herstellung von Fibrinogen-Analogen

A. Reinigung von Plasma-Fibrinogen

Fibrinogen wurde aus frischem Plasma durch Fraktionierungsverfahren mit kaltem Ethanol isoliert. Zu 1 Volumen Plasma wurden 0,22 Volumen kaltes 50%iges Ethanol, pH 7,0, zugemischt, wodurch die Temperatur auf -3ºC erniedrigt wurde. Die Mischung wurde zentrifugiert, und der erhaltene Niederschlag wurde mit 0,5 Originalvolumina (OV) von 7%igem Ethanol, pH 6,5, bei -3ºC gewaschen. Der Niederschlag wurde gesammelt und in 0,25 OV 0,55 M Trinatriumcitrat-Puffer, pH 6,5, bei 30ºC gelöst. Die erhaltene. Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt, und das Fibrinogen wurde durch Zugabe von kaltem, 20%igem Ethanol bis auf eine Endkonzentration von 8% ausgefällt, um gereinigtes Fibrinogen zu bilden.
Um jede mögliche Verunreinigung des gereinigten Fibrinogens mit Fibronectin zu entfernen, wurde die gereinigte Fibrinogen-Präparation über eine Gelatine-Säule Sepharose® 4B (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) entsprechend den Anweisungen des Herstellers geleitet, was zu Fibronectin-freiem Fibrinogen führte.

B. Herstellung von D&sub3;&sub0; aus gereinigtem Fibrinogen

1) Proteolytische Verdauung von gereinigtem Fibrinogen

50 mg gereinigtes Fibrinogen, hergestellt in Beispiel 1A, wurden in 1 ml einer TBS- Pufferlösung gelöst, enthaltend 0,01 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris-HCl), 0,14 M Natriumchlorid (NaCl), pH 7,4, und wurden proteolytisch durch Streptokinaseaktiviertes Plasminogen (Plasmin) gemäß dem folgenden Verfahren gereinigt.
Streptokinaseaktiviertes Plasminogen wurde hergestellt durch Vermischen von Plasminogen (KABI, 20 Einheiten (U)) mit 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, und Aufrechterhalten für 10 Minuten bei 37ºC mit 500 U Streptokinase (Streptase, Behring). Diese Lösung wurde dann auf eine Endkonzentration von 18 ug/ml mit der Lösung des gereinigten Fibrinogens in 2 M Harnstoff vermischt.
Die Mischung wurde 2 Stunden bei 37ºC gehalten. Die proteolytische Reaktion in der Mischung wurde durch die Zugabe von 50000 U/ml Trasylol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) beendet. Die erhaltene Lösung von Fibrinogen-Fragmenten wurde extensiv gegen eine Lösung von TBS 24 Stunden bei 4ºC dialysiert. Der Dialysepuffer wurde alle 8 Stunden gewechselt. Die dialysierte Lösung wurde dann zurückgewonnen und auf eine Sephadex® G-100-Säule (Pharmacia LKB) aufgebracht. Die Säulenchromatografie wurde durchgeführt, um die aus der proteolytischen Verdauung von Fibrinogen erhaltenen Fragmente zu trennen. Die Säule war mit einem TBS-Laufpuffer vorgewaschen, gefolgt von dem Aufbringen der dialysierten Fibrinogen-Fragmente. Fraktionen von 3 ml wurden gesammelt, und die Molekulargewichte der getrennten Fragmente in den Fraktionen wurden durch 10%ige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit und ohne Reduktion mit 3%igem Mercaptoethanol bestimmt.
Drei Fragmente mit verschiedenen Molekulargewichten wurden durch Coomassie-Blau- Färbung des Gels sichtbar gemacht. Die Fraktionen X, D und E hatten Molekulargewichte von annähernd 240000, 85000 bzw. 50000 unter nicht reduzierenden Bedingungen. Die Fraktionen, welche den drei getrennten Spitzen entsprachen, wurden getrennt vereinigt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch Lyophilisierung konzentriert.

2) Proteolytische Verdauung des Fragments D zur Herstellung eines D&sub3;&sub0;-Homologs

Das Fibrinogen-Fragment D mit einem Molekulargewicht von 80000 (80 Kilodalton (kD)), gereinigt und konzentriert, wurde proteolytisch mit Plasmin in 2 M Harnstoff 24 Stunden bei 37ºC verdaut, wie in Beispiel 1 B beschrieben. Die Verdauung wurde beendet, und die erhaltene Lösung wurde dialysiert, wie in Beispiel 1 B beschrieben. Die dialysierte Lösung wurde zurückgewonnen, und die Produkte der Verdauung wurden durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) auf einer Mono-Q-Säule (Pharmacia LKB), äquilibriert in 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,0, isoliert. Die Fragmente wurden mit einer Lösung von 0,01 M Natriumphosphat und 1 M Natriumchlorid, pH 7,0, eluiert. Die Reinheit der eluierten Proteine in den gesammelten Fraktionen wurde auf 15% SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen geprüft. Coomassie-Blau-Färbung des Gels zeigte ein 30 kD-Fragment mit einer Homogenität von größer als 90%. Das gereinigte Produkt der proteolytischen Verdauung von Fragment D mit 30 kD wurde als D&sub3;&sub0; bezeichnet. Die D&sub3;&sub0; enthaltenden Spitzenfraktionen wurden vereinigt und durch Lyophilisieren konzentriert.

2. Reinigung des RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptors von Endothelzellen

A. Herstellung eines Lysats von Endothelzellen einer menschlichen Nabelvene

Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), im Handel erhältlich von Clonetics, San Diego, CA, wurden in 40 mit Gelatine überzogenen T75 Gewebekulturkolben (Falcon, Thousand Oaks, CA) passagiert und in Endotoxin-freiem RPMI 1640 (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone, Sterile Systems, Logan, UT), 25 mM Hepes [4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperidinethansulfonsäure] (Galbiochem Boehring, La Jolla, CA), 100 ug/ml Penicillin- Streptomycin-Fungizon (Whittaker), 0,5% Endothelzellen-Wachstumsfaktor (Biomedical Technologies, Stoughton, MA) und 1 mM Glutamin (Whittaker), gehalten. Um die Ausbeute an gereinigtem Endothelzellen-Rezeptor (ECR) zu erhöhen, wurden die kultivierten Endothelzellen bei einer Dichte von annähernd 5 · 106 Zellen/Kolben 6 Stunden vor dem Ernten durch Einwirkenlassen von Tumornekrosefaktor alpha (TNF, Genzyme Corp., Cambridge, MA) mit einer Konzentration von 20 ng/ml stimuliert. Die zelluläre Reaktion auf TNF wurde ursprünglich in den in Beispiel 3A beschriebenen Experimenten offenbart. Nachdem das Kulturmedium entfernt war, wurden die Zellen von den Kolben mit 4 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Sigma Chemical Co.) bei 37ºC 30 Minuten lang losgelöst. Die losgelösten Zellsuspensionen von sämtlichen Kolben wurden vereinigt und pelletisiert durch Zentrifugieren bei 1200 Upm für 10 Minuten. Die pelletisierten Zellen wurden zweimal mit kalter, phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
Nach dem letzten Waschen wurden die Zellen wieder in PBS suspendiert, das 1 mM Calciumchlorid (CaCl&sub2;) und 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl&sub2;) enthielt, zur Herstellung von markierten Zelloberflächenproteinen mit 4 mci Natrium¹²&sup5;iodid (¹²&sup5;I) (NEN Du Pont de Nemours, Wilmington, DE) durch das Lactoperoxidase-lodierungsverfahren, das dem Fachmann bekannt ist, und wie beschrieben ist in "Antibodies: A Laboratory Method", Hrsg. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 434-435 (1988). Nach dem Markierungsvorgang wurden die Zellen dreimal mit PBS, welches keine Kationen enthielt, gewaschen. Nach dem letzten Waschen durch Zentrifugieren wurde das Pellet gefroren, aufgetaut, dann wieder in einem Volumen von 3 Teilen Tris-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung als Extraktionspuffer (TBS-Extraktionspuffer) auf 1 Teil Pellet suspendiert. Der TBS-Extraktionspuffer bestand aus 25 mM Tris-HCl, 136 mM NaCl und 2 mM Kaliumchlorid (KCl), das ebenfalls 1-2 mM MgCl&sub2;, 1-2 mM Manganchlorid (MnCl&sub2;), 50 mM Octyl-β-glucopyranosid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 ug/ml Aprotinin, 1 ug/ml Leupeptin, 1 ug/ml Pepstatin und 1 ug/ml alpha-2- Makroglobulin enthielt. Die bevorzugten Konzentrationen von MgCl&sub2; und MnCl&sub2; waren 1 mM. Calciumchlorid war in dem Extraktionspuffer und in allen nachfolgenden Puffern, die bei der Isolierung und Reinigung von ECR verwendet wurden, nicht enthalten.
Das erhaltene Zelllysat mit einem Volumen von 3 ml wurde bei 3000 · g zentrifugiert, um die unlöslichen Zellbruchstücke zu pelletisieren. Der den isolierten ECR enthaltende Überstand wurde entfernt, und die Markierungswirksamkeit wurde durch Gamma- Nachweis bestimmt. Durch das Markierungsverfahren wurde eine spezifische Aktivität von annähernd 200000 Zählimpulsen pro Minute (cpm) pro 10 Mikroliter (ul) erhalten.

B. Reinigung des markierten ECR durch Affinitätschromatografie auf einer Fibrinogen-Sepharose®-Säule

1) Seguentielle Elutionen der Fibrinogen-Affinitätssäule

Der vorstehend hergesellte markierte Zellüberstand wurde vor der Reinigung durch Chromatografie über eine einfache Sepharose CL4B-Säule (Pharmacia) vorgereinigt, die vorher mit dem TBS-Extraktionspuffer äquilibriert war. Zur Reinigung des ECR durch Affinitätschromatografie wurde der den markierten ECR enthaltende Durchfluss aus der einfachen Sepharose -Säule gesammelt und auf eine Fibrinogen-Sepharose®-Säule aufgebracht, die mit 10 Säulenvolumina des TBS-Extraktionspuffers vorgewaschen war. Die Säule war vorher hergestellt worden durch Kuppeln von 8 mg gereinigtem Fibrinogen, hergestellt in Beispiel 1A, an 1 ml (annähernd 0,333 g Harz) Cyanbromid-aktivierter (CNBr) Sepharose® 4B gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pharmacia LKB). Die markierte, ECR enthaltende Lösung wurde über Nacht bei 4ºC auf der Fibrinogen-Säule gehalten und gelegentlich gemischt, um das ECR auf dem Fibrinogen-Liganden zu immobilisiern. Nach dieser Halteperiode wurde der Durchfluss gesammelt und bei 4ºC getrennt gelagert.
Die Säule wurde dann mit 10 Säulenvolumina TBS-Extraktionspuffer gewaschen. Vor der EDTA-Elution des auf der Fibrinogen-Säule immobilisierten ECR wurde die Säule zuerst mit 300 ul einer 1 mg/ml Arg-Gly-Glu-Peptidlösung (RGE-Peptidlösung), gelöst in TBS-Extraktionspuffer, gehalten, um nicht-spezifisch immobilisierte, markierte Proteine zu eluieren. Dem Sammeln des Eluats folgte eine Wartezeit von 10 Minuten vor der nächsten Anwendung von 300 ul der RGE-Lösung auf die Säule. Die Elution mit RGE wurde 10-mal wiederholt für eine Gesamtzahl von 10 gesammelten Fraktionen. Für die zweite Gruppe von Elutionen zur Entfernung von verunreinigendem, an Fibrinogen gebundenem, markiertem Vitronectin-Rezeptor, ein Glied der Integrin-Oberfamilie, wurde die Säule mit 300 ul einer 1 mg/ml Arg-Gly-Asp-Peptidlösung (RGD-Peptidlösung) gelöst in TBS-Extraktionspuffer, gehalten. Das RGD-Eluat wurde gesammelt, und der Elutionsvorgang wurde getrennt 10-mal wiederholt, wie für die RGE-Elution beschrieben, was zur Sammlung des markierten Vitronectin-Rezeptors über 10 Fraktionen führte. Die Spitzenfraktionen wurden durch Gamma-Nachweis bestimmt. Die für die vorstehend beschriebenen Elutionen verwendeten Peptide wurden unter Verwendung der klassischen Festphasentechnik synthetisiert, beschrieben von Merrifield, Adv. Enzvmol., 32: 221-296 (1969), adaptiert Zur Verwendung mit einem automatischen Peptidsynthesegerät Modell 430 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Die hergestellten Polypeptid- Harze wurden durch Fluorwasserstoff gespalten, extrahiert und auf Reinheit durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasen-Säule C18, hergestellt von Waters Associates, Milford, MA., analysiert.
Der markierte ECR, der an die nun Vitronectin-Rezeptor-freie Fibrinogen-Säule gebunden war, wurde dann mit 10-20 mM EDTA, gelöst in TBS-Extraktionspuffer, eluiert. Die Elution mit 20 mM EDTA war bevorzugt. Der Elutionsvorgang wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben, was zur Sammlung von γereinigtem ECR über 10 getrennte Fraktionen führte. Die Spitzenfraktionen, welche den eluierten¹²&sup5;I-markierten ECR enthielten, wurden durch Gamma-Nachweis bestimmt. Die Säule wurde dann mit 10 Säulenvolumina TBS-Extraktionspuffer, gefolgt von 3 Säulenvolumina 1 M NaCl in TBS, gewaschen. Die Säule wurde nach dem letzten Waschen mit wenigstens 20 Säulenvolumina PBS, enthaltend 0,02% Natriumazid, bei 4ºC aufbewahrt.

2) Charakterisierung des gereinigten Fibrinogen-spezifischen ECR

Das Molekulargewicht des an Fibrinogen-Sepharose® gereinigten, ¹²&sup5;I-markierten ECR wurde durch 7,5% SDS-PAGE mit und ohne Reduktion mit 3% β-Mercaptoethanol bestimmt. Fig. 1 zeigt die autoradiografischen Ergebnisse der Elektrophorese von aliquoten Anteilen von Spitzenfraktionen von sowohl den RGD- als auch den EDTA-Elutionen von Zelllysaten, hergestellt aus Zellen, die entweder unbehandelt gelassen oder mit TNF behandelt wurden, wie in Beispiel 2A beschrieben. Die Bahnen 1 und 3 zeigen die RGDeluierten Rezeptoren, die aus Zelllysaten isoliert wurden, die aus unbehandelten oder mit TNF behandelten Zellen hergestellt wurden. In Bahn 1 sind keine Banden nachweisbar. In Bahn 3 sind jedoch zwei Banden vorhanden, welche den angenäherten Molekulargewichten von 125 und 110 kD entsprechen. Diese Banden entsprechen den alpha v- und beta 3-Untereinheiten des Vitronectin-Rezeptors, wie von Cheresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 8471-6475 (1987) beschrieben, was hierin durch Bezug eingeschlossen ist. Die Bahnen 2 und 4 mit EDTA-eluiertem ECR, isoliert aus unbehandelten und mit TNF behandelten Zellen, zeigen die Anwesenheit einer Bande mit einem niedrigeren Molekulargewicht von annähernd 90-95 kD, wobei ihre Intensität auf das etwa 3-5-fache erhöht ist als Ergebnis der Induktion der ECR-Expression durch Einwirkenlassen von TNF. Somit sind die EDTA eluierten Fraktionen, die in einem nicht-RGDabhängigen ECR mit einem Molekulargewicht von 90-95 kD enthalten sind, verschieden von dem Vitronectin-Rezeptor, der an Fibrinogen über die RGD-Tripeptidsequenz bindet (Cheresh et al., supra).

C. Reinigung von markiertem ECR durch Affinitätschromatografie auf einer RGD-Sepharose®-Säule gefolgt von einer Fibrinogen-Sepharose®-Säule

1) Seguentielle Säulenchromatoqrafie

Dass der EDTA-eluierte Fibrinogen bindende ECR ein von dem Vitronectin-Rezeptor verschiedener Rezeptor war, wurde unter Verwendung einer alternativen Methode der Reinigung von ECR aus markierten Zelllysaten durch Affinitätschromatografie über zwei verschiedene Säulen bestätigt. Das in Beispiel 2A hergestellte Zelllysat wurde zuerst auf eine RGD Sepharose®-Säule aufgebracht, die vorher mit TBS-Extraktionspuffer äquilibriert wurde, um RGD-spezifische Rezeptoren an dem Sepharose® gebundenen RGD zu immobilisieren. Die Kupplung von RGD an CNBr-Sepharose® wurde durchgeführt, wie in Beispiel 2A für die Herstellung einer Fibrinogen-Sepharose®-Säule beschrieben. Nach der Haltezeit über Nacht zum Maximieren der Wechselwirkung des ¹²&sup5;I-markierten Zelllysats, das RGD-abhängige Rezeptoren mit dem an Sepharose® gebundenen RGD enthält, wurde der Durchfluss gesammelt und auf eine Fibrinogen-Sepharose®-Säule aufgebracht, wie in Beispiel 2B beschrieben. Die RGD-Säule wurde dann gewaschen, wie vorstehend beschrieben. EDTA-Elutionspuffer wurde anschließend auf die gewaschene RGD-Säule aufgebracht, und Fraktionen, die ¹²&sup5;I-markierte, mit EDTA-eluierte Rezeptoren enthielten, wurden gesammelt, wie für den Elutionsvorgang in Beispiel 2B beschrieben. Die Charakterisierung der mit EDTA eluierten Rezeptoren von der RGD- Sepharose -Säule wird nachstehend in Beispiel 2C2) beschrieben.
Der Durchfluss von der RGD-Säule wurde über Nacht mit der Fibrinogen-Säule gehalten, um eine maximale Wechselwirkung des RGD-extrahierten Zelllysats, das RGDunabhängige Fibrinogen-Rezeptoren enthält, mit dem an Sepharose® gebundenen Fibrinogen zu erlauben. Nach der Haltezeit wurden die an Fibrinogen gebundenen, ¹²&sup5;I-markierten Rezeptoren nach der gleichen Verfahrensweise eluiert, wie für die Elution aus der Fibrinogen-Säule in Beispiel 2B beschrieben. Zehn Fraktionen wurden von jeder der sequentiellen RGE-, RGE- und EDTA-Elutionen gesammelt. Die Charakterisierung des RGD- und EDTA eluierten Materials von der Fibrinogen-Sepharose®-Säule ist nachstehend in Beispiel 2C2) beschrieben.

2) Charakterisierung der RGD- gegenüber Fibrinogen-abhängigen Rezeptoren

Aliquote Anteile der gesammelten Fraktionen aus der EDTA = Elution der RGD- Sepharose -Säule wurden elektrophoretisiert benachbart zu aliquoten Anteilen von beiden der RGD- und EDTA-Elutionen von der Fibrinogen-Sepharose®-Säule sowohl unter nicht reduzierenden als auch reduzierenden Bedingungen, um einen optimalen Vergleich und eine Charakterisierung der eluierten Rezeptoren zu ergeben. Aliquote Anteile der gesammelten Fraktionen wurden elektrophoretisiert, wie in Beispiel 2B2) beschrieben. Die Ergebnisse des autoradiografischen Einwirkens der elektrophoretisierten ¹²&sup5;I- markierten Rezeptoren sind in Fig. 2 in 8 Bahnen gezeigt. Die Bahnen 1 bis 4 zeigen die Wanderung von Proteinen unter reduzierenden Bedingungen, während die Bahnen 5 bis 8 die Wanderung identischer aliquoter Anteile zeigen, die unter nicht reduzierenden Bedingungen liefern. Die Molekulargewichtsbestimmungen der elektrophoretisierten, eluierten Rezeptoren werden durch Vergleich mit ¹²&sup5;I-markierten Molekulargewichtsstandards von 210, 107, 71 und 41 kD bzw. Myosin, β-Galactosidase, Rinderserumalbumin und Ovalbumin gemacht. Diese Marker sind in den Bahnen 4 und 8 gezeigt.
In den Bahnen 3 und 7 zeigt der mit EDTA von der RGD-Sepharose®-Säule eluierte Vitronectin-Rezeptor das charakteristische Profil von alpha v/beta 3 unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen. Unreduziertes alpha v hat ein Molekulargewicht von 150 kD (Bahn 7, obere Bande), welches in zwei Polypeptide von 125 und 25 kD unter reduzierenden Bedingungen gespalten wird (Bahn 3, mittlere Bande - das 25 kD- Fragment ist aus dem Gel herausgelaufen). Unreduziertes beta 3 hat ein Molekulargewicht von 90 kD (Bahn 7, untere Bande), welches auf 110 kD unter reduzierenden Bedingungen erhöht wird (Bahn 3, untere Bande).
Zusätzlich zu dem Vitronectin-Integrin-Rezeptor mit alpha v- und beta 3-Untereinheiten, wurde eine andere Integrin-beta-Untereinheit, beta 1, von der RGD-Sepharose®-Säule mit EDTA eluiert. Es hat sich gezeigt, dass alpha v getrennt sowohl mit beta 3 als auch beta 1 assoziiert, wie von Vogel et al., J. Biol: Chem., 265: 5934-5937 (1990) beschrieben. Beta 1 wandert als ein 120 kD-Protein unter nicht reduzierenden Bedingungen (Bahn 7, mittlere Bande), welches auf 140 kD unter reduzierenden Bedingungen (Bahn 3, obere Bande) erhöht wird. Somit wurde der RGD-abhängige Vitronectin- Rezeptor, bestehend aus alpha v/beta 3-Untereinheiten sowohl von einer Fibrinogen- Sepharose®-Säule mit RGD als auch von einer RGD-Säule mit EDTA eluiert.
Im Gegensatz dazu wurde ein unterschiedliches Profil der eluierten Proteine aus der Fibrinogen-Affinitätschromatografie von Zelllysaten erhalten, die auf der RGD- Sepharose®-Säule vorgereinigt waren. Wie vorstehend unter Beispiel 2C1) beschrieben, wurde der aus der RGD-Sepharose®-Säule gesammelte Durchfluss, der kein alpha v/beta 1 und beta 3 enthielt, dann auf einer Fibrinogen-Sepharose®-Säule chromatografiert. Da sämtliche der RGD-abhängigen Rezeptoren durch den ersten Lauf der Affinitätssäulenchromatografie entfernt wurden, wurden keine ¹²&sup5;I-markierten Elutionsprodukte erhalten, wenn die Fibrinogen-Säule der RGD-Elution unterworfen wurde (Bahnen 1 bzw. 5, reduzierende und nicht reduzierende Bedingungen). Bei der EDTA-Elution, die der RGD-Elution folgt, wurde jedoch eine Einzelbande von annähernd 90-95 kD unter nicht reduzierenden Bedingungen (Bahn 6) erhalten. Unter reduzierenden Bedingungen erhöhte sich das Molekulargewicht des EDTA-Fibrinogen-Rezeptors, abgeleitet aus menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), als ECR bezeichnet, nur geringfügig (Bahn 2). Die bestimmten Molekulargewichte des isolierten ECR, gereinigt durch jede der beiden Methoden, die in den Beispielen 2B (sequentielle Elutionen einer einzelnen Fibrinogen-Sepharose®-Affinitätschromatografie) oder 2C (sequentielle Affinitätschromatografie auf getrennten Affinitätssäulen) beschrieben sind, waren die gleichen. Somit wurde der identische ECR unter Verwendung von zwei alternativen Methoden gereinigt, wie sowohl in Fig. 1 als auch Fig. 2 gezeigt. Zusätzlich wurde der ECR ebenfalls durch Affinitätschromatografie auf einer Fibrinogen-Sepharose®-Säule mit EDTA ohne einen vorhergehenden Elutionsschritt mit RGD gereinigt, um andere Fibrinogen bindende Rezeptoren zu entfernen.

D. Identifizierung des gereinigten Fibrinogen-spezifischen ECR als ICAM-1 durch Immunpräzipitation

1) Immunpräzipitation eines 90-95 kD ECR mit monoklonalen Antikörpern gegen ICAM-1

Aliquote Anteile von Fraktionen, die ¹²&sup5;I-markierten 90-95 kD ECR enthalten, die durch jede Methode, wie in Beispiel 2B oder 2C gereinigt waren, wurden in den Immunpräzipitationsreaktionen verwendet, um den Fibrinogen bindenden ECR weiter zu identifizieren. 50 bis 100 ul von Spitzenfraktionen, welche den ECR enthalten, bestimmt durch Affinitätschromatografie, wie vorstehend beschrieben, wurden getrennt mit 20 ug eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen das humane interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) vermischt, der im Handel von Becton Dickinson Immunocytochemistry Systems, Mountain View, CA, erhältlich ist. Getrennte aliquote Anteile wurden mit Kontroll- Antikörpern vermischt. Für die IgG-Kontrolle wurde ein monoklonaler Maus-Antikörper, bezeichnet als 1C10, im Handel erhältlich von Telios, San Diego, CA, als Kontrolle verwendet, der ein 130 kD Endothelzellen-Oberflächenprotein erkannte. Für die IgM-Kontrolle wurde ein irrelevanter IgM monoklonaler Maus-Antikörper verwendet. Die Mischungen wurden eine Stunde auf Eis gehalten, um Immunkomplexe zu bilden. Um die gebildeten Immunkomplexe zu immunpräzipitieren oder zu sammeln, wurden 100 ul von anti-Maus IgG aus Ziege an Agarose (Sigma Chemical Co.) in einem Verhältnis von 1 : 1 gekuppelt.
Typischerweise wurden 50 ul des eluierten ECR in einer Spitzenfraktion mit 50 ul des anti-Maus IgG, gekuppelt an Agarose, vermischt und 30 Minuten auf Eis gehalten. Die an Ziege-anti-Maus-Agarose gebundenen Immunkomplexe wurden anschließend durch Zentrifugation bei 10000 · g eine Minute bei 4ºC pelletisiert Die erhaltenen Überstände wurden durch Absaugen entfernt, und die Pellets wurden in TBS-Extraktionspuffer wieder suspendiert. Die Pellets wurden dreimal gewaschen und schließlich in Laemmli- Probenpuffer wieder suspendiert für die SDS-PAGE-Analyse gegen die vorstehend beschriebenen Molekulargewichtstandards. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und autoradiografiert. Eine einzige 90-95 kD-Bande war auf den entwickelten Filmen sichtbar, was anzeigt, dass der Fibrinogen affinitätsgereinigte 90-95 kD ECR tatsächlich ICAM-1 war, bestimmt durch Immunpräzipitation mit einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen das humane ICAM-1.

2) Immunpräzipitation eines 90-95 kD ECR mit monoklonalen Antikörpern gegen HUVEC

Immunpräzipitationen, wie vorstehend beschrieben, wurden ebenfalls mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen intakte unstimulierte HUVEC durchgeführt. Die Herstellung und Charakterisierung von vier solcher monoklonaler Antikörper ist in Beispiel 4 beschrieben. 50 ul des lgM monoklonalen Antikörpers, als 2E12 bezeichnet, wurden mit 50 ul der gleichen Fraktion vermischt, wie sie in den Immunpräzipitationen mit dem im Handel erhältlichen Antikörper gegen ICAM-1 verwendet wurden. Nach der Elektrophorese und dem Einwirken des Autoradiografiefilms war eine 90-95 kD-Bande sichtbar. Somit immunpräzipitierten die gegen HUVEC-Zelloberflächenproteine gerichteten monoklonalen Antikörper das gleiche 90-95 kD-Protein, wie dasjenige, das mit einem im Handel erhältlichen monoklonalen Maus-Antikörper zu humanem ICAM-1 immunpräzipitierte. Der ECR, der an Fibrinogen über eine RGD-unabhängige Bindungsstelle bindet, ist nun als ICAM-1 identifiziert, bestimmt durch Affinitätschromatografie-Analyse (Beispiele 2B und 2C). Die Bindung des ECR, nachstehend als ICAM-1 bezeichnet, an eine RGDunabhängige Bindungsstelle in Fibrinogen ist eine neue Feststellung.

3. Bestätigung eines RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptors auf Endothelzellen (HUVEC)

Die Adhäsion von Leukozyten an Gefäßendothel ist eines der ersten Ereignisse in einer Vielzahl von entzündlichen Immunreaktionen. Auf der molekularen Ebene ist die Leukozytenadhäsion an Endothelzellen ein redundanter Mechanismus, unterstützt durch die regulierte Erkennung einer unterschiedlichen Gruppe von Membran-Rezeptoren, exprimiert sowohl auf Leukozyten als auch Endothelzellen, wobei die letzteren davon entweder in einem Ruhezustand oder in einem Cytokin-stimulierten Zustand sein können. Eine neue Gruppe von molekularen Wechselwirkungen, die bei der Adhäsion von Leukozyten beteiligt sind, sind nun identifiziert. Es wurde gezeigt, dass Fibrinogen mit Leukozyten (Monozyten, periphere mononukleare Zellen und verschiedene Zelllinien) über das Integrin CD11b/CD18, auch als Mac-1 bezeichnet, wechselwirkt, wie von Altieri et al., J Biol. Chem., 265: 12119-12122(1990) beschrieben, wobei diese Literaturstelle durch Bezug hierdurch eingeschlossen ist. Studien der Wechselwirkung von Fibrinogen mit Endothelzellen in vitro haben nun zu der Feststellung eines Endothelzellen-Oberflächenmembran-Rezeptors geführt, der an eine RGD-unabhängige Stelle auf Fibrinogen bindet. Hierin werden Daten vorgelegt, welche zeigen, dass die Wechselwirkung zwischen zirkulierenden Leukozyten und Endothelzellen durch einen Brückeneffekt von verschiedenen Teilen des Fibrinogenmoleküls zu bestimmten Zelloberfläche-Membran- Rezeptoren vermittelt wird, die auf jedem Zelltyp exprimiert werden.

A. Nachweis der Bindung von Fibrinogen an HUVEC

1) Herstellung von iodiertem Fibrinogen

Fibrinogen wurde unter Verwendung der Iodogen®-Methode iodiert. Kurz gesagt, wurde Iodogen® in Dichlormethan bis zu einer Endkonzentration von 1 ug/ml und 170 ul gelöstem Iodogen® aufgelöst, welches auf dem Boden eines Glasrohrs getrocknet war. Fibrinogen, hergestellt in Beispiel 1A, wurde wieder in 0,055 M Natriumcitratpuffer, pH 7,4, bis zu einer Endkonzentration von 5 ug/ml suspendiert. 200 ul der Lösung von γelöstem Fibrinogen wurde in das mit Iodogen® beschichtete Rohr mit 700 uCl trägerfreiem Natriumiodid verbracht. Die Mischung wurde 20 Minuten auf Eis unter gelegentlichem Schütteln gehalten. Um die Iodierungsreaktion zu beenden, wurde die Mischung aus dem Rohr entfernt und auf einer grobkörnigen Sepharose® G-25-Säule (100 · 2,5) gelfiltriert. Fraktionen des iodierten Fibrinogens wurden durch die Impulse bestimmt, die mit dem Trichloressigsäure-Niederschlag erhalten wurden. Das hergestellte markierte Fibrinogen war mit einer spezifischen Aktivität von 0,3 uCi/ug Protein radiomarkiert. Das markierte Fibrinogen wurde in den hierin beschriebenen Bindungsversuchen und den Versuchen zur Hemmung der Bindung bei einer Konzentration von 50 ug/ml verwendet, während nicht markiertes Fibrinogen im Allgemeinen in einer Konzentration von 500 ug/ml verwendet wurde.

2) Analyse der Dosisabhängigkeit

Um zu bestimmen, ob Fibrinogen an einen Zelloberflächen-HUVEC-Rezeptor gebunden ist, und falls dies der Fall ist, in welchen Konzentrationen, wurden ansteigende Konzentrationen von 0,01 Mikromolar (uM) bis zu 0,44 uM (0,14 uM ist äquivalent zu 50 ug/ml; 0,29 uM ist äquivalent zu 100 ug/ml und 0,44 uM ist äquivalent zu 150 ug/ml) von vorstehend hergestelltem, iodiertem Fibrinogen (¹²&sup5;I-Fg) getrennt mit Monoschichten von HUVEC-Zellen vermischt, die vorher zweimal mit serumfreiem RPMI 1640 gewaschen waren. Die HUVEC-Zellkulturen wurden am Anfang in einzelne Vertiefungen einer Platte mit 48 Vertiefungen plattiert, die für Gewebekultur beschichtet war (Costar Corp., Cambridge, MA), wie in Beispiel 2A für die Züchtung von Zellen in T75-Kolben beschrieben.
Das zweiwertige Kation, das als Calciumchlorid (CaCl&sub2;) in einer Konzentration von 2,5 mM vorlag, wurde ebenfalls in die Zell-Fibrinogen-Mischungen eingemischt. Der Inhibitor der Fibrinpolymerisation, PPack (D-Phenyl-1-prolyl-1-arginin-chloramethyl; Calbiochem Boehring) wurde mit den Zelimischungen in einer Konzentration von 100 mM vermischt. PPack war in allen Versuchen vorhanden, wo es notwendig war, die Polymerisation von Fibrinogen tu Fibrin zu verhindern.
Die erhaltenen Mischungen wurden 45 Minuten bei 22ºC gehalten, um das Fibrinogen an das auf der Platte befindliche HUVEC zu binden. Nach der Haltezeit wurden die Zellen zweimal mit serumfreiem RPMI 1640 gewaschen, um nicht gebundenes Fibrinogen zu entfernen. Die Zellen wurden dann in 10% SDS löslich gemacht, und die unter den Haltebedingungen aufgenommene Radioaktivität wurde in einem Gammazähler quantitativ gemessen.
Die erhaltenen Daten sind in Fig. 3 als ¹²&sup5;I-markiertes, gebundenes Fibrinogen in Zählimpulsen pro Minute (cpm) pro Vertiefung (x 10&supmin;³) auf der Y-Achse gegen ansteigende Konzentrationen von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen (x 10&supmin;&sup7; M) auf der X-Achse aufgetragen. Die Daten zeigen, dass ¹²&sup5;I-markiertes Fibrinogen in gesättigter Weise in einer Konzentration von annähernd 0,36 uM an Monoschichten von unstimuliertem HUVEC bindet.

3) Analyse der Wirkung der HUVEC-Stimulation durch Einwirkung von TNF oder Lipopolysaccharid auf die Bindung von Fibrinogen

Um die Wirkung zu bestimmen, die bekannte Stimulatoren von HUVEC auf die Bindungscharakteristiken von Fibrinogen an HUVEC haben, wurden Dosis-Wirkung- Experimente, wie in Beispiel 3A2) beschrieben, an unbehandeltem HUVEC und TNF oder Lipopolysaccharid (LPS, Genzyme) - stimuliertem HUVEC durchgeführt. TNF und LPS wurden getrennt in den jeweiligen Konzentrationen von 5 Nanogramm (ng)/ml und 1,0 ug/ml zu Monoschichten von HUVEC zugesetzt und 4 Stunden bei 37ºC vor der Zumischung des markierten Fibrinogens im Konzentrationsbereich von 0,01 uM bis zu 0,36 uM gehalten.
Die erhaltenen Daten sind in Fig. 4 aufgetragen als ¹²&sup5;I-markiertes, gebundenes Fibrinogen in Molekülen pro Zelle (x 10&supmin;&sup6;) auf der Y-Achse gegen ansteigende Konzentrationen von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen (x 10&supmin;&sup7; M) auf der X-Achse. Unter Stimulation mit entweder TNF oder LPS verdoppelte sich die Zahl der markierten, gebundenen Fibrinogen- Moleküle pro Zelle im Vergleich zu jenen, die an unstimulierte Zellen gebunden sind. Somit wird der Anstieg der Bindung von Fibrinogen an den ICAM-1-Rezeptor auf HU- VEC durch Cytokin oder ein Immunstimulans vermittelt.

4) Analyse der Bindung von D&sub3;&sub0; an HUVEC

Die vorstehend in Beispiel 3A2) beschriebenen Bindungsversuche wurden ebenfalls mit dem Fibrinogen-Homolog, D&sub3;&sub0;, durchgeführt, um zu bestimmen, ob diese Region des Fibrinogens auch mit HUVEC immunreagiert. Da bekannt war, dass D30 an Leukozyten über den Mac-1-Rezeptor bindet, wie von Altieri et al., J. Biol. Chem., 265: 12119- 12122 (1990) beschrieben, wurden diese Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Region von Fibrinogen, welche die Bindung von Leukozyten an HUVEC vermittelt, in dem D&sub3;&sub0;-Fragment enthalten war. Für diese Analyse wurde das D&sub3;&sub0;-Fragment von Fibrinogen, hergestellt in Beispiel 1B, mit ¹²&sup5;I markiert; wie für die Markierung von Fibrinogen vorstehend beschrieben. Das iodierte D&sub3;&sub0; wurde mit HUVEC-Monoschichten in einer Konzentration von 10 ug/ml vermischt, um einen Bindungskomplex zu bilden. Nach dem Waschen der Zellen zur Entfernung des nicht gebundenen D&sub3;&sub0;, wie vorstehend in Beispiel 3A2) beschrieben, wurden die Zellen löslich gemacht, und die Menge an gebundener Radioaktivität wurde bestimmt. Die Bindung von D&sub3;&sub0; an HUVEC war bei 120 Minuten der Haltezeit mit annähernd 60000 cpm maximal. Die Bindung von D3o unterlag einer spezifischen Konkurrenz durch Zumischung von 50-fachem molarem Überschuss von kaltem Fibrinogen, wodurch bestätigt wird, dass D&sub3;&sub0; spezifisch an eine Fibrinogen-Bindungsstelle auf HUVEC bindet. Myoglobin, ein nicht spezifisches Protein, hemmte die Bindung von D&sub3;&sub0; an HUVEC nicht.
Die Bestätigung der Spezifizität der Bindung von D&sub3;&sub0; an HUVEC wurde erhalten durch die Hemmung der Bindung von D&sub3;&sub0; an ICAM-1 transfektierte Zellen, hergestellt in Beispiel 4 in Gegenwart des 14E11 lgG monoklonalen Antikörpers, der ebenfalls in Beispiel 4 hergestellt wird. Die Versuche zur Hemmung der Bindung wurden durchgeführt, wie in Beispiel 5 beschrieben. Der BD monoklonale Antikörper gegen ICAM-1, beschrieben in Beispiel 4, wurde ebenfalls in dem Versuch verwendet. Sowohl 14E11 als auch die BD monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1, in einer Konzentration von 20 ug/ml in Gegenwart von MnCl&sub2;, hemmten spezifisch die Bindung von D&sub3;&sub0; an HUVEC. Annähernd 3000 und 7500 cpm wurden aus der Bindung von D&sub3;&sub0; in Gegenwart von CaCl&sub2; bzw. MnCl&sub2; in Abwesenheit von sämtlichen Inhibitoren gefunden. Mit 14E11 und MnCl&sub2; wurde die Bindung von D&sub3;&sub0; an die Transfektanten vollständig gehemmt. Der Teil des Fibrinogens, der D&sub3;&sub0; enthält, bindet daher an den Fibrinogen-Rezeptor auf HUVEC und an den oberflächenexprimiertes ICAM-1 auf Transfektanten.
Die Fibrinogen-Brücke ist jedoch nicht in dem D&sub3;&sub0;-Fragment enthalten, wie durch die Hemmung der Bindungsversuche in Gegenwart von Peptiden bestimmt wurde, die von der Mac-1-Rezeptor-Bindungsstelle auf D&sub3;&sub0; abgeleitet waren. Die D&sub3;&sub0;-abgeleiteten Peptide blockierten weder die Bindung von Fibrinogen noch von D&sub3;&sub0; an HUVEC. Daher ist die Bindungsstelle von Fibrinogen, die an den Endothel-Fibrinogen-Rezeptor bindet, in dem D&sub3;&sub0;-Fragment, aber es ist nicht die gleiche Region, welche die Bindung von D&sub3;&sub0; oder Fibrinögen an Mac-1 auf Leukozyten vermittelt.

B. Nachweis der Fibrinogen-Brückenbildung bei der Bindung von Mac-1-tragenden Zellen an einen RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor auf HUVEC

1) Analyse der Dosisabhängigkeit gegen die Zeit

In vivo ist gezeigt worden, dass zirkulierende Leukozyten an die apicale Oberfläche von Endothelzellen binden. Darüber hinaus sind Experimente in vitro durchgeführt worden, worin gezeigt wurde, dass die gezüchtete Monozyten-Zelllinie, THP-1 mit der ATCC- Hinterlegungsnummer TIB 202, (ATCC, Bethesda, MD), direkt an ungestörtes HUVEC in Gegenwart von zweiwertigen Kationen mit oder ohne Stimulation mit 1 kM des chemotaktischen Peptids, N-Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (N-FMLP) (Sigma Chemical Co.) bindet, wie von Altieri, J. Immunol., 147: 1891-1898 (1991) beschrieben, was hierdurch durch Bezug eingeschlossen ist. Um zu bestimmen, ob dieses Ereignis das Ergebnis eines durch Fibrinogen vermittelten Brückenphänomens ist, wurden in vitro Zellanheftungs-Bindungsversuche durchgeführt.
Für diese Versuche wurden HUVEC indem in Beispiel 2A beschriebenen Medium in einer Dichte von annähernd 1-5 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung in Mikrotitervertiefungen mit flachem Boden einer mit Gewebekultur behandelten Platte mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Zellen wurden dann in serumfreiem RPM) 1640 gewaschen und weiter mit &sup5;¹-Chrom-markierten (&sup5;¹Cr) THP-1-Zellsuspensionen gehalten, die vorher verschiedenen Konzentrationen von nicht markiertem Fibrinogen ausgesetzt oder unbehandelt gelassen waren. Um THP-1-Zellen zu markieren, wurden serumfreie Suspensionen der Zellen in einer Konzentration von 1 · 10&sup7; Zellen/ml mit 0,5 mCi &sup5;¹Cr (Na&sub2;CrO&sub4; mit einer spezifischen Aktivität von 487,4 mCi/mg, NEN Du Pont de Nemours) 2 Stunden bei 37ºC markiert, wobei ein Einbau von durchschnittlich 12 bis 20 cpm/THP-1-Zelle erfolgte. Die markierten Zellen wurden dann zweimal bei Raumtemperatur mit serumfreiem RPMI 1640 gewaschen und wieder in dem gleichen Medium in einer Konzentration von 5 · 10&sup5; Zellen/ml suspendiert. Die markierten Zellen wurden in den Versuchen innerhalb von 2 Stunden nach dem Markierungsvorgang verwendet. Für die Versuche wurden die Zellen mit 1 uM N-FMLP in Gegenwart von 1 mM CaCl&sub2; und 100 mM PPack vorstimuliert. Die erhaltenen N-FMLP-stimulierten THP-1-Zellsuspensionen wurden dann getrennt mit den folgenden Materialien vermischt: 1) Medium ohne zugesetztes Fibrinogen als Kontrolle; 2) Fibrinogen bei Konzentrationen von 1,2 mg/ml und bei 2,5 mg/ml; und 3) normales menschliches Plasma (NHP), verdünnt 1 : 2 und 1 : 50. Das gereinigte Fibrinogen war hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Fibrinogen war in unverdünntem, normalem, menschlichem Plasma in der Konzentration von annähernd 1-3 mg/ml vorhanden. Die erhaltenen Mischungen wurden 20 Minuten bei 22ºC gehalten, um die Bindung des Fibrinogens, entweder gereinigt oder in NHP vorhanden, an den Mac-1- Rezeptor auf der Oberfläche der THP-1-Zellen zu erlauben.
Die erhaltenen THP-1-Zellen mit gebundenem Fibrinogen wurden dann mit dem gewaschenen, immobilisierten, vorstehend beschriebenen HUVEC vermischt, um die Bindung einer nicht-Mac-1-Rezeptor-Bindungsstelle auf Fibrinogen an den RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor auf der Oberfläche von HUVEC zu erlauben, was eine Bindung von THP-1-Zellen an HUVEC über eine Fibrinogen-Brücke ergibt. Die Mischungen wurden bei 37ºC gehalten, um eine Adhäsion zu erlauben. Bei ausgewählten Zeitabschnitten zwischen 1 bis 60 Minuten wurden die HUVEC-Monoschichten vorsichtig mit serumfreiem RPMI 1640 fünfmal gewaschen, um nicht anhaftende oder nur lose anhaftende THP- 1-Zellen zu entfernen, an welche Fibrinogen ursprünglich immobilisiert war. Die anhaftenden Zellen wurden dann in 10% SDS löslich gemacht, und das Zelllysat wurde quantitativ in einem β-Szintillationszähler gemessen. Die spontane Freisetzung von &sup5;¹Cr aus THP-1-Zellen war während des Adhäsionsversuchs immer geringer als 2%. Die Zahl von spezifisch gebundenen THP-1-Zellen wurde bestimmt durch Dividieren der geernteten Zählimpulse pro Minute durch die Zählimpulse pro Minute/Zelle.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 5A und Fig. 5B gezeigt, wo die Daten ausgedrückt sind als Zahl von &sup5;¹Cr-markierten THP-1-Zellen (x 10&supmin;³) auf der Y-Achse, aufgetragen gegen die Versuchszeit auf der X-Achse. THP-1-Zellen banden nicht signifikant an immobilisiertes HUVEC in Abwesenheit von Fibrinogen während des Zeitablaufs. Im Gegensatz dazu zeigten THP-1-Zellen, die in Anwesenheit von 1,2 mg/ml Fibrinogen gehalten waren, signifikante Erhöhungen der Bindung an HUVEC während des Zeitablaufs mit der maximalen, bei 10000 Zellen auftretenden Zellbindung (Fig. 5A). In Anwesenheit von 2,5 mg/ml Fibrinogen war die TPC-1-Zellbindung am Ende von 60 Minuten noch nicht gesättigt, wo annähernd 18000 THP-1-Zellen an Fibrinogen gebunden waren (Fig. 5A). Ähnliche Bindungskurven wurden in Gegenwart von NHP erhalten, was in Fig. 5B gezeigt ist. Eine maximale THP-1-Zellbindung von annähernd 23000 Zellen wurde nach 40 Minuten in Gegenwart von 1 : 2 verdünntem NHP erhalten, welches annähernd 0,5-1,5 mg/ml Fibrinogen enthält. 1 : 50 verdünntes NHP zeigte ein Profil, das vergleichbar ist mit demjenigen, welches sich bei 1,2 mg/ml gereinigtem Fibrinogen zeigte. Somit war die zeitabhängige Bindung von THP-1-Zellen an HUVEC von Fibrinogen abhängig, was bestätigt, dass Fibrinogen, entweder gereinigt oder in NHP vorhanden, als eine Proteinbrücke zwischen den zwei Zelltypen dient.

2) Analyse der Temperaturabhängigkeit

Um die Wirkungen zu bestimmen, welche die Temperatur auf die Fähigkeit von Fibrinogen hat, die Bindung von &sup5;¹Cr-markierten THP-1-Zellen an Monoschichten von HUVEC zu vermitteln, wurden die Zelladhäsionsversuche, wie in Beispiel 3B1) beschrieben, bei 22ºC und 37ºC während des Verlaufs einer Stunde durchgeführt. Die Versuche wurden in identischer Weise, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 500 ug/ml Fibrinogen anstelle von 1, 2 oder 2,5 ug/ml verwendet wurden. Die maximale Bindung von THP-1-Zellen an HUVEC bei 22ºC betrug 7500 Zellen nach 40 Minuten. Nach 60 Minuten war die Bindung auf 5000 Zellen abgefallen. Die Daten sind signifikant im Vergleich zu den annähernd 2000 THP-1-Zellen, die in Abwesenheit von Fibrinogen gebunden wurden. Bei 37ºC banden jedoch annähernd 20000 THP-1- Zellen nach 40 Minuten an HUVEC gegenüber einer Hintergrundbindung von annähernd 5000 Zellen in Abwesenheit von Fibrinogen. Die Bindung von &sup5;¹Cr-markierten THP-1- Zellen an HUVEC ist somit bei der physiologischen Temperatur von 37ºC mit physiologischen Konzentrationen von Fibrinogen maximiert.

3) Analyse der Spezifizität des Zelltyps

Die vorstehend beschriebenen Zelladhäsion-Bindungsversuche wurden an aortischen Endothelzellen von Rindern (BAE) durchgeführt, um zu bestimmen, ob Fibrinogen die Bindung von 51Cr-markierten THP-1-Zellen an Endothelzellen aus einer verschiedenen Quelle vermitteln kann. Die Zellkulturen wurden aus Rinderaorta nach Verfahrensweisen hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind. THP-1-Zellen wurden entweder unbehandelt gelassen oder mit 500 u,g/ml Fibrinogen über einen Zeitraum von 60 Minuten behandelt. Die Zellen wurden zu ausgewählten Zeitpunkten geerntet, wie in Beispiel 3B1) beschrieben, und die Zahl von gebundenen THP-1-Zellen wurde bestimmt, wie vorstehend beschrieben. In Abwesenheit von Fibrinogen banden THP-1-Zellen nicht signifikant an BAE-Zellen (weniger als 5000 gebundene Zellen) nach einem anfänglichen Anstieg einer Bindungsspitze bei 20 Minuten. In Gegenwart von Fibrinogen banden jedoch annähernd 20000 Zellen an BAE-Zellen nach einer Haltezeit von 40 Minuten. Diese maximale Bindung fiel nach 60 Minuten auf annähernd 15000 gebundene Zellen ab. Die Bindung von THP-1-Zellen an HUVEC wurde parallel als eine Kontrolle für das Experiment durchgeführt; die nicht sättigungsfähige Bindung von THP-1-Zellen in Gegenwart von Fibrinogen war maximal bei 60 Minuten mit annähernd 25000 gebundenen Zellen. Somit vermittelt Fibrinogen die Bindung von THP-1-Zellen nicht nur an menschliche Endothelzellen, sondern auch an von Rindern stammende Endothelzellen.

4. Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Endothelzellen zu einem RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor auf HUVEV

A. Herstellung von Immunogen

HUVEC, gezüchtet wie in Beispiel 2A, aber ohne TNF- oder LPS-Stimulation wurden zur Verwendung als Immunogene hergestellt, um monoklonale Antikörper gegen HUVEC- Oberflächenproteine zu bilden für eventuelles Durchmustern durch Bestimmen der Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen an HUVEC-Kulturen. Für die Imunisierungen wurden 10 · 10&sup6; Zellen, geerntet von den Kulturplatten durch Behandlung mit 4,0 mM EDTA und Wiedersuspendieren in physiologischer Kochsalzlösung in Mäuse injiziert, wie nachstehend beschrieben.

B. Herstellung von monoklonalen Antikörpern zu einem RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor auf HUVEC

HUVEC, hergestellt aus Immunogenen gemäß Beispiel 4A, wurden intraperitoneal (i.P.) in getrennte Balb/c ByJ-Mäuse (The Scripps Research Institute Vivarium, La Jolla, CA) injiziert. Die Mäuse erhielten Verstärkungsinjektionen nach 1, 3 und 5 Wochen. Die letzte Verstärkung war 4 Tage vor der Fusion.
Die so behandelten Tiere wurden getötet, und die Milz jeder Maus wurde geerntet. Dann wurde eine Suspension von Milzzellen hergestellt. Die Milzzellen wurden dann aus der Suspension von Milzzellen durch Zentrifugation für etwa 10 Minuten bei 1000 Upm bei Raumtemperatur extrahiert. Nach der Entfernung des erhaltenen Überstands wurde das Zell-Pellet wieder in 5 ml kaltem Ammoniumchlorid- (NH&sub4;Cl) Lyse-Puffer suspendiert und etwa 10 Minuten gehalten.
10 ml von Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (Whittaker M.A. Bioproducts) und Hepes-Puffer wurden der lysierten Zellsuspension zugesetzt, um eine Mischung zu bilden, und diese Mischung wurde etwa 10 Minuten bei 1000 Upm bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Nachdem der erhaltene Überstand dekantiert war, wurde das Pellet wieder in 15 ml DMEM und Hepes suspendiert und wurde etwa 10 Minuten bei 1000 Upm bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das vorstehend beschriebene Verfahren wurde wiederholt.
Das Pellet wurde dann wieder in 5 ml DMEM und Hepes suspendiert. Ein aliquoter Anteil der Suspension der Milzzellen wurde dann zur Zählung entfernt. Die Fusionen wurden in der folgenden Weise unter Verwendung der nicht sezernierenden Maus- Myelomzelllinie P3X63Ag8.653.1, einem Subklon der Linie P3X63Ag8.653 (ATCC Hinterlegungsnummer CRL 1580) durchgeführt. Mit einem Verhältnis von Myelom zu Milzzelle von etwa 1 zu 10 oder etwa 1 zu 5 wurde eine ausreichende Menge von Myelomzellen zu einem Pellet zentrifugiert, zweimal in 15 ml DMEM und Hepes gewaschen und dann 10 Minuten bei 1000 Upm bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Die Milzzellen und die Myelomzellen wurden in 15 ml Röhren mit rundem Boden vereinigt. Die Zelimischung wurde 10 Minuten bei 1000 Upm bei Raumtemperatur zentrifugiert, und der Überstand wurde durch Absaugen entfernt. Danach wurden 200 ul 50%iges (Gewicht pro Volumen) wässriges Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 4000 (PEG) bei etwa 37ºC zu dem Pellet unter Verwendung einer 1 ml Pipette unter heftigem Rühren zugesetzt, um das Pellet aufzubrechen. Die Zellen wurden dann zwischen 15 und 30 Sekunden sanft vermischt. Die erhaltene Zellmischung wurde 4 Minuten bei 700 Upm zentrifugiert.
Nach etwa 8 Minuten vom Zeitpunkt der Zugabe des PEG wurden 5 ml DMEM plus Hepes-Puffer langsam zu dem Pellet zugesetzt, ohne die Zellen zu stören. Nach 1 Minute wurde die erhaltene Mischung mit einer 1 ml Pipette aufgebrochen und weitere 4 Minuten gehalten. Diese Mischung wurde 7 Minuten bei 1000 Upm zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde dekantiert, 5 ml HAT-Medium (Hypoxanthin/Thymidin- Medium) wurden langsam zu dem Pellet zugesetzt, und die Mischung wurde ungestört 5 Minuten gehalten. Das Pellet wurde dann in große Brocken gebrochen, und die Endzellsuspension wurde in T75-Kolben (2,5 ml pro Kolben) verbracht, in welche vorher 7,5 ml HT-Medium eingebracht worden waren. Die erhaltene Zellsuspension wurde bei 37ºC gehalten, um die fusionierten Zellen wachsen zu lassen. Nach 24 Stunden wurden den Kolben 10 ml HT-Medium zugesetzt, gefolgt von einem 6 Stunden später erfolgenden Zusatz von 0,3 ml 0,04 mM Aminopterin. 48 Stunden nach der Fusion wurden den Kolben 10 ml HAT-Medium (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin-Medium) zugesetzt.
Drei Tage nach der Fusion wurden lebensfähige Zellen in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen mit etwa 2 · 10&sup4; lebensfähigen Zellen pro Vertiefung (insgesamt 768 Vertiefungen) in HAT-Puffermedium ausplattiert, wie in Kennett et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81: 77 (1978) beschrieben. Die Zellen wurden sieben Tage nach der Fusion mit HAT-Medium und in etwa 4-5 Tagesintervallen danach nach Bedarf mit HT-Medium gefüttert. Das Wachstum wurde mikroskopisch verfolgt, und die Kulturüberstände wurden etwa zwei Wochen später gesammelt.

C. Immun-Durchmusterung von monoklonalen Antikörpern durch Zelladhäsionsversuche

Die Kulturüberstände der gegen HAT widerstandsfähigen, vorstehend hergestellten Kulturen wurden anschließend auf die Anwesenheit von HUVEC RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor-Antikörpern durch die Bindungsversuche bzw. Zelladhäsionsversuche geprüft, die in Beispiel 3A und 3B und weiter in Beispiel 5 beschrieben sind. Die Kulturüberstände wurden auf ihre Fähigkeit geprüft, die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen an Monoschichten von HUVEC zu hemmen. Für diesen Versuch wurden die Monoschichten in Gegenwart des Überstands der Hybridomkultur und 2,5 mM CaCl&sub2; 30 Minuten bei 37ºC gehalten. Nach der Haltezeit wurden die mit Überstand behandelten HUVEC einmal mit RPMI 1640 gewaschen. Markiertes Fibrinogen wurde dann zu dem behandelten HUVEC in einer Konzentration von 50 ug/ml in Gegenwart von 2,5 mM CaCl&sub2; und 100 mM PPack zugesetzt. Die erhaltenen Mischungen wurden 30-60 Minuten bei 22ºC gehalten. Die mit Fibrinogen behandelten HUVEC wurden dann gewaschen, löslich gemacht und gezählt, wie in Beispiel 3A beschrieben.
Die Überstände wurden auch auf ihre Fähigkeit durchgemustert, die Bindung von &sup5;¹Cr-markierten THP-1-Zellen, die vorher Fibrinogen ausgesetzt waren, an HUVEC- Zellen zu blockieren. Der Versuch wurde im Wesentlichen durchgeführt, wie für den Zelladhäsionsversuch in Beispiel 3B beschrieben, mit der Ausnahme, dass die HUVEC getrennt mit Hybridom-Überständen 30 Minuten bei 37ºC, wie vorstehend beschrieben, gehalten wurden. Nach der Antikörper-Einwirkung wurden die Zellen einmal mit Kulturmedium gewaschen vor der Zugabe der Fibrinogen gebundenen und markierten THP-1- Zellen bei den gewünschten Konzentrationen, wie in Beispiel 3B beschrieben.
Die Überstände der Hybridomkultur, die einen Antikörper dieser Erfindung produzierten, welcher die durch Fibrinogen vermittelte Bindung von THP-1-Zellen an Monoschichten von HUVEC wirksam blockiert, wurden dann für die nachfolgende Reinigung und Charakterisierung ausgewählt. Hybridomkulturen, die Antikörper gegen RGD-unabhängige Fibrinogen-Rezeptoren (auch als eine Fibrinogen-Bindungsstelle) bezeichnet auf HUVEC produzieren, wurden identifiziert. Vier getrennte Antikörper, als 14E11, 16GB, 2E12 und 2B12 bezeichnet, wurden erhalten. 14E11 wurde als ein IgG bestimmt, während die restlichen monoklonalen Antikörper als lgMs bestimmt wurden. Die monoklonalen Antikörper, die spezifisch sind für einen Endothelzellen RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor (auch als ein anti-ECR-Äquivalent zu anti-ICAM-1 auf der Basis der Affinitätschromatografieanalyse in Beispiel 2 bezeichnet) zeigten eine Immunreaktion mit HUVEC zusätzlich zu dem gereinigten ECR, das von einer Fibrinogen-Sepharose®- Säule mit EDTA eluiert war, wie in Beispiel 2D beschrieben, und zeigte keine Immunreaktion mit VNR.

D. Reinigung der ausgewählten monoklonalen Antikörper

Die vier Hybridome, die Antikörper gegen ECR sezernieren, wie in Beispiel 4C beschrieben, wurden in 10 Wochen alte Balb/c-Mäuse, wie nachstehend beschrieben, injiziert, um Aszites-Flüssigkeit herzustellen.
Hierfür wurden getrennten Gruppen von 10 Wochen alten Balb/c-Mäusen 0,3 ml Mineralöl verabreicht, und dann wurden intraperitoneal 5 · 10&sup6; Hybridomzellen für jeden monoklonalen Antikörper injiziert. Die durchschnittliche Zeit zur Entwicklung von Aszites betrug 9 Tage. Nach der Klärung durch Zentrifugation bei 15000 · g für 15 Minuten bei Raumtemperatur, wurden die von den Hybridomen hergestellten Aszites-Flüssigkeiten vereinigt und gefroren bei -20ºC gelagert, um monoklonale Antikörper-Zusammensetzungen zu bilden.
Die durch Aszites hergestellten monoklonalen Antikörper wurden durch Protein-Schnellflüssigkeitschromatografie (FPLC) unter Verwendung einer Pharmacia Mono Q HR5/5- Anionenaustauschersäule (Pharmacia) unter Verwendung eines 0-0,5 M NaCl- Gradienten in 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0 unter Befolgen der mit der Säule gelieferten Anweisungen weiter gereinigt. Die FPLC-behandelten monoklonalen Antikörper wurden dann unter Verwendung einer gerührten Amicon Ultrafiltrationszelle (Danvers, MA; PM 30 Membran) auf eine Konzentration von 1 mg/ml konzentriert, in PBS hinein dialysiert und bei -70ºC gelagert, um gereinigte MAb zu bilden.
Der monoklonale Antikörper 14E11 wurde unter Verwendung eines Affinitätsreinigungs- Kits, Affi-Prep, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad, Richmond, CA) weiter gereinigt. Die IgM monoklonalen Antikörper wurden weiter durch Hydroxylapatit- Gelfiltration über eine Bio-Gel HPHT Hydroxylapatit-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad) gereinigt. Diese gereinigten Antikörper wurden in den nachfolgenden Bindungsversuchen verwendet, Western Immunoblots und Immunpräzipitationen sind in den Beispielen beschrieben.

E. Bestätigung der Immunspezifizität der monoklonalen Antikörper zu einem RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor auf HUVEC

Die Immunspezifizität der monoklonalen Antikörper 14E11, 16G8, 2E12 und 2B12 wurde durch eine Anzahl von Methoden bestätigt. Zunächst wurde, wie in Beispiel 2D beschrieben, eine Immunpräzipitation des durch Fibrinogen-Affinitätschromatografie gereinigten ECR unter Verwendung von 2E12 im Vergleich zu einer Immunpräzipitation mit einem im Handel erhältlichen Antikörper gegen ICAM-1 (Becton Dickinson, bezeichnet als BD) durchgeführt. Der gereinigte 90-95 kD ECR wurde mit beiden Antikörpern immunpräzipitiert, was anzeigte, dass der 2E12-Antikörper die gleiche Immunspezifizität hatte wie der Antikörper gegen ICAM-1, und dass der gereinigte ECR ICAM-1 war. Die exakten Epitope des ECR (ICAM-1), die von den Antikörpern 2E12 und Becton Dickinson anti-ICAM-1 erkannt wurden, sind nicht bestimmt worden. Auf der Grundlage des Blotting-Profils, das durch die nachstehend beschriebene Western Immunoblot-Analyse und durch die in Beispiel 5 vorgelegten Daten der Bindungshemmung erhalten wurde, ist es wahrscheinlich, dass die Epitope einmalig sind.
Eine Fluoreszenz-aktivierte Zellabtastanalyse (FACscan) wurde an einer Fibroblastartigen Zelllinie durchgeführt, die durch genetisches Engineering zur Expression der rekombinanten Form von ICAM-1 auf der Oberfläche der Zellen gebracht war, wie von Seed et al., Nature, 331: 624-627 (1988) beschrieben, was hierdurch durch Bezug eingeschlossen ist. Kurz gesagt, wurde eine cDNA-Bibliothek, konstruiert unter Verwendung von RNA, hergestellt aus HL-60-Zellen, die mit 12-O-Tetradecanoylphorbol-13- acetat (TPA) induziert waren, in COS-Zellen transfektiert. Die Oberflächenantigene exprimierenden Zellen wurden durch Zusammenbringen mit monoklonalen Antikörpern gegen ICAM, als 8F5 und 84H10 bezeichnet, durchmustert, was zu der Auswahl eines cDNA-Klons in einer transfektierten, ICAM-1 exprimierenden Zelle führt. Diese Transfektanten werden in der FACscan-Analyse verwendet, um die Immunspezifizität der Antikörper gegen ECR dieser Erfindung zu bestätigen.
Für die Analyse wurden 1 · 10&sup6; ICAM-1-Transfektantenzellen in Suspension getrennt mit 1 ug/ml affinitätsgereinigtem 14E11, einer Mischung von mit Hydroxylapatit gereinigten sämtlichen drei lgM monoklonalen Antikörpern (16G8, 2E12 und 2B12) mit dem BD monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1 und einem mit PMI-I bezeichneten monoklonalen Kontroll-Antikörper mit der ATCC-Hinterlegungsnummer HB 9476 vermischt. Der letztere erkennt das C-terminale hGPIIb-Fragment des Rezeptors GPIIb/111a, der auf Plättchen gefunden wird. Die getrennten Mischungen wurden 30 Minuten bei 4ºC gehalten, um Immunreaktionsprodukte zu bilden. Nach 3 Waschvorgängen in serumfreiem RPMI 1640 wurden die immunreagierten, transfektierten Zellen mit Fluorescein-konjugierten Ziege-gegen-Maus-Immunglobulinen vermischt und 30 Minuten bei 4ºC gehalten, um sekundäre Immunreaktionsprodukte zu bilden. Nach dreimaligem Waschen wurden die Zellen einer Fließ-Cytometrie auf einem Becton Dickinson 1 V/40 Fluoreszenz-aktivierten Zellsortiergerät unterworfen.
Die Ergebnisse der FACscan zeigten, dass 16G8, 2E12 und 2B12 monoklonale Antikörper spezifisch mit den ICAM-1-exprimierenden Transfektanten immunreagierten, was vergleichbar war zu dem, was sich mit dem BD Antikörper gegen ICAM-1 zeigte. 14E11 ging jedoch keine spezifische Immunreaktion mit den ICAM-1-exprimierenden Transfektanten ein, da sein Profil mit demjenigen überlappte, das sich mit dem Kontroll-PMI-1- Antikörper zeigte. Da das auf den Transfektanten exprimierte ICAM-1 als unglykosyliert bekannt ist, beruht das Fehlen der Immunreaktivität von 14E11 mit den Zellen höchstwahrscheinlich auf diesem Grund. In der anfänglichen Durchmusterung der Hybridome blockierte der 14E11 monoklonale Antikörper sowohl die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen an HUVEC als auch die Bindung von THP-1-Zellen über eine Fibrinogen- Brücke an HUVEC-Zellen.
Dass der 14E11 monoklonale Antikörper spezifisch den als ICAM-1 identifizierten ECR erkannte, wurde durch Western-Immunoblot bestätigt. Sowohl HUVEC- als auch Daudi- Zellen wurden für das Blotting verwendet. Daudi ist eine menschliche Lymphomzelllinie von Burkitt, die hohe Konzentrationen von ICAM-1 exprimiert und von ATCC mit der ATCC Hinterlegungsnummer CCL 213 erhältlich ist. Zelllysate wurden aus Kulturen von jedem Zelltyp, wie für die Herstellung eines Zelllysats in Beispiel 2A, hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Zellen mit 0,5% Triton-X 100 und 0,5% NP-40 lysiert wurden. Nach der Zentrifugation, wie in Beispiel 2A beschrieben, wurden aliquote Anteile jedes erhaltenen Überstands der Elektrophorese in mehreren Bahnen mit 10% SDS-PAGE unterworfen.
Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in dem Gel elektrophoretisch auf Nitrozellulose für die nachfolgenden Immunreaktionen übertragen. Nachdem der Nitrozellulose-Blot 2 Stunden bei Raumtemperatur, eingetaucht in eine Lösung einer nicht fetten Trockenmilch (Blotto), gehalten war, um nicht spezifische Bindungsstellen zu blockieren, wurde er dann in Streifen geschnitten, um jede einzelne Bahn der der Elektrophorese unterworfenen Proteine zu isolieren, 5 für Daudi und 8 für HUVEC. Die Nitrozellulosestreifen wurden dann getrennt der Immunreaktion mit zwei Kontroll-Antikörpern, 2E1 und PMI-I, gereinigtem 14E11 IgG, 14E11 Kulturüberstand und BD monoklonalem Antikörper gegen ICAM-11 Stunde bei Raumtemperatur der Immunreaktion unterworfen, um primäre Immunreaktionsprodukte zu bilden. Die Konzentration der zugesetzten primären Antikörper betrug annähernd 10 ug/ml. Die durch Immunreaktion erhaltenen Blots wurden dann viermal mit PBS für jeweils 5 Minuten gewaschen. Die gewaschenen Blots wurden dann 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Lösung von sekundären ¹²&sup5;I-markierten Ziege-gegen-Maus-Antikörpern (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA) eingetaucht, um sekundäre Immunreaktionsprodukte zu bilden. Die immunreagierten Blots wurden dann viermal mit PBS gewaschen und einem Röntgenfilm zum Nachweis der immunreagierten, der Elektrophorese unterworfenen Proteine aus den Zelllysat-Überständen ausgesetzt. Zusätzliche Kontrollen umfassten die Reaktion der Streifen mit lediglich dem markierten sekundären Antikörper.
Die Ergebnisse des Western-Blots sind in Fig. 6 gezeigt. Die relativen Molekulargewichte der der Elektrophorese unterworfenen Proteine in den Zelllysat-Überständen wurden durch Vergleich mit einer Gruppe von radiomarkierten Molekulargewichtsmarkern von 97, 66, 45, 30 und 21 kD bestimmt, die in der Bahn links von der ersten Gruppe der 5 Daudi-Bahnen und links von der zweiten Gruppe der 8 HUVEC-Bahnen gezeigt sind. Die mit 1-5 bezeichneten Bahnen am unteren Ende des Blots sowohl für Daudi bzw. HUVEC wurden der Immunreaktion mit 2E1, PMI-I, affinitätsgereinigtem 14E11, 14E11-Kulturüberständen und den BD monoklonalen Antikörpern gegen ICAM-1 unterworfen. Eine 90-95 kD-Bande wurde sowohl in den Daudi- als auch HUVEC-Zelllysat- Überständen mit dem affinitätsgereinigten 14E11 monoklonalen Antikörper, gezeigt in den mit Nr. 3 bezeichneten Bahnen, nachgewiesen. Zusätzlich wurde das affinitätsgereinigte 14E11 mit einem Protein von annähernd 50-55 kD in Bahn 3 der der Elektrophorese unterworfenen HUVEC-Proteine immunreagiert. Während der BD Antikörper gegen ICAM-1 schwach mit den Daudi-Proteinen immunreagierte, zeigte er eine starke Immunreaktion mit lediglich der 90-95 kD-Bande in den der Elektrophorese unterworfenen HUVEC-Proteinen. Der ersichtliche Unterschied in den Blotting-Mustern zwischen 14E11 und den BD monoklonalen Antikörpern gegen ICAM-1 stützt die Ansicht, dass sie getrennte Epitope auf dem ICAM-1-Molekül erkennen. Die primären Kontroll-Antikörper 2E1 und PMI-I immunreagierten mit den der Elektrophorese unterworfenen Daudi- und HUVEC-Proteinen, wie auf der Grundlage früherer Charakterisierungen von Bindungsspezifizitäten vorhergesagt. Somit erkennt der 14E11 IgG monoklonale Antikörper spezifisch das sowohl aus Daudi und HUVEC isolierte 90-95 kD-Zelloberflächenprotein, vergleichbar mit demjenigen, das sich mit dem BD Antikörper gegen ICAM-1 sowohl durch den hierin beschriebenen Western Blot und durch die in Beispiel 2D beschriebene Immunpräzipitation zeigte.
Zusätzlich, wie in Beispiel 5 gezeigt, war der affinitätsgereinigte 14E11 Antikörper vollständig wirksam bezüglich der Hemmung der Bindung von THP-1-Zellen über die Fibrinogen-Brücke an HUVEC.

5. Hemmung von durch Fibrinogen vermittelter Bindung von Leukozyten an Endothelzellen

A. Hemmung von durch Fibrinogen vermittelter Bindung von THP-1-Zellen an HUVEC unter Verwendung von Fibrinogen-Analogen

1) Überschüssiges kaltes Fibrinogen

Versuche zur Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen, das an HUVEC bindet, wurden in Gegenwart von 50 molarem Überschuss von unmarkiertem Fibrinogen durchgeführt, um die Spezifizität der Bindung zu bestätigen, wie in Beispiel 3A gezeigt. Der Bindungsversuch wurde durchgeführt, wie in Beispiel 3A beschrieben, mit der Ausnahme, dass unmarkiertes Fibrinogen zu HUVEC in einem 50 molaren Überschuss (annähernd 7,5 · 10&supmin;³ M Fibrinogen) gleichzeitig mit 50 ug/ml ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen zugesetzt wurde. Die Protein-Zeil-Mischungen wurden 30 Minuten bei 22ºC gehalten, um die Bindung von Fibrinogen an HUVEC zu erlauben. Zusätzlich zu kaltem Fibrinogen wurde ein 50-facher molarer Überschuss von BSA getrennt als eine Kontrolle zugesetzt. Die Menge an Fibrinogen, die unter den vorstehenden Bedingungen gebunden wurde, wurde quantitativ bestimmt, wie in Beispiel 3A beschrieben. Die nicht inhibierte Gesamtbindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen war nach 30 Minuten bei annähernd 4000 cpm pro Vertiefung gesättigt. Das BSA hemmte nicht die Bindung, und somit zeigte ¹²&sup5;I-markiertes Fibrinogen ein ähnliches Profil in Gegenwart von BSA. Unmarkiertes Fibrinogen konkurrierte jedoch mit der Bindung des markierten Fibrinogens, um dieses auf die Hälfte der gesamten, nicht inhibierten Bindung zu verringern. Die Bindung von Fibrinogen an den Fibrinogen-Rezeptor der HUVEC-Oberfläche ist daher spezifisch.
Die Spezifizität der Bindung an einen RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor wurde in Konkurrenzversuchen bestätigt, die wie vorstehend beschrieben in Gegenwart von monoklonalen Antikörpern gegen die p-Untereinheit des RGD-abhängigen VNR und in Gegenwart von RGDenthaltenden Peptiden durchgeführt wurden. Für die Versuche, in welchen die Fähigkeit von monoklonalen Antikörpern gegen VNR, bezeichnet als mAb 609 und mAb 7E3, die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen an HUVEC zu hemmen, untersucht wurde, wurden die Antikörper getrennt bei einer Konzentration von 25 ug/ml mit HUVEC 20 Minuten bei 37ºC gehalten. Nach der Haltezeit wurden die mit Antikörper behandelten HUVEC einmal mit serumfreiem RPMI 1640 gewaschen, um jeden nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Markiertes Fibrinogen wurde dann zu den behandelten HUVEC in einer Konzentration von 50 ug/ml in Gegenwart von 2,5 mM CaCl&sub2; und 100 mM PPack zugesetzt. Die erhaltenen Mischungen wurden 10-30 Minuten bei 22ºC gehalten. Die mit Fibrinogen behandelten HUVEC wurden dann gewaschen, löslich gemacht und gezählt, wie in Beispiel 3A beschrieben.
Die Ergebnisse sind in den Säulendiagrammen in Fig. 7 gezeigt, wo die Menge von an HUVEC gebundenem, ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen in cpm/Vertiefung (x 10&supmin;³) auf der Y-Achse gegen die Zeitspanne aufgetragen ist, in der markiertes Fibrinogen mit HUVEC in Kontakt war. Jeder Teil des Säulendiagramms wird zu jedem Zeitpunkt getrennt wie folgt identifiziert: Gesamtbindung (keine Inhibitoren zugesetzt), +Fg (Fibrinogen) zugesetzt, +mAb 609; und +mAb 7E3. Kaltes Fibrinogen, das in 50 molarem Überschuss, wie vorstehend beschrieben, zugesetzt war, hemmte fast vollständig die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen an HUVEC. Die VNR-Antikörper hatten jedoch keine Hemmwirkung, wie es aus den Ergebnissen der Affinitätschromatografie in Beispiel 2 erwartet wurde. Somit bindet Fibrinogen an einen Rezeptor auf HUVEC, der nicht VNR ist.
Um zu bestätigen, dass die Fibrinogen-Bindungsstelle auf HUVEC nicht RGD-abhängig ist, wurden Hemmversuche durchgeführt, wie vorstehend für die Hemmung mit Antikörpern beschrieben, mit der Ausnahme, dass sie in Gegenwart von 1,0 mM eines RGDenthaltenden Peptids durchgeführt wurden. Ein RGE-enthaltendes Peptid war in dem Versuch als Kontrolle ebenfalls enthalten. Bei ausgewählten Zeitpunkten während des Verlaufs von einer Stunde wurden die HUVEC geerntet, wie in Beispiel 3A beschrieben.
Die erhaltenen Daten sind in Fig. 8 gezeigt, wo die Menge von an HUVEC gebundenem, ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen in cpm/Vertiefung (x 10&supmin;³) auf der Y-Achse gegen die Zeitspanne aufgetragen ist, in der markiertes Fibrinogen mit HUVEC in Kontakt war. Weder das RGD- noch das RGE-enthaltende Peptid hatte eine Hemmwirkung auf die Bindung von markiertem Fibrinogen an HUVEC, verglichen mit der Gesamtbindung des markierten Fibrinogens in Abwesenheit von jedem Inhibitor. Die Daten des RGD- und des RGEenthaltenden Peptids sind als die Kurven gezeigt, die durch die ausgefüllten bzw. offenen Quadrate wiedergegeben sind. Wie erwartet, hemmte kaltes Fibrinogen die Bindung von markiertem Fibrinogen vollständig.
Zusammenfassend hemmt ein Überschuss von unmarkiertem Fibrinogen die Bindung von markiertem Fibrinogen an HUVEC vollständig, und diese Bindung wird durch einen RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor vermittelt, der nicht VNR ist.

2) Monoklonale Antikörper gegen ECR (ICAM-1)

Die durch Immunisieren von Mäusen mit intakten, unstimulierten HUVEC erzeugten monoklonalen Antikörper, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden auf ihre Fähigkeit geprüft, die Bindung von ¹²&sup5;I-Fibrinogen an HUVEC, entweder unstimuliert oder mit TNF stimuliert, zu hemmen. Die Bindungsversuche wurden durchgeführt, wie in Beispiel 3A beschrieben, mit den in Beispiel 4 beschriebenen Ausnahmen für das Durchmustern von Hybridom-Kulturüberständen. HUVEC wurden 5 ng/ml TNF für 4 Stunden bei 37ºC vor dem Zusatz der Antikörper ausgesetzt. Nach der Stimulierung wurden die Zellen einmal mit dem in Beispiel 2A hergestellten HUVEC-Kulturmedium gewaschen. Die monoklonalen Antikörper, affinitätsgereinigtes 14E11, anti-ICAM-1 BD und PMI-I (sämtliche in Beispiel 4 beschrieben), wurden getrennt in einer Konzentration von 20 ug/ml entweder zu stimulierten oder unstimulierten HUVEC-Kulturen zugesetzt und 30 Minuten bei 37ºC gehalten. Nachdem die mit Antikörper reagierten Zellen einmal mit Kulturmedium gewaschen waren, wurden 50 ug/ml ¹²&sup5;I-markiertes Fibrinogen, hergestellt in Beispiel 3A, zu jeder Vertiefung zugesetzt und 30 Minuten bei 22 uC gehalten. Die Zellen wurden anschließend gewaschen und löslich gemacht, wie in Beispiel 3A beschrieben.
Die erhaltenen Daten sind in Fig. 9A und Fig. 9B gezeigt, welche die Wirkungen der Antikörpereinwirkung auf die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen auf unstimulierte bzw. mit TNF-stimulierte HUVEC zeigen. Die Daten sind in einem Säulendiagramm als die spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen in cpm/Vertiefung (x 10&supmin;³) auf der Y-Achse gegen die spezifischen Behandlungen auf der X-Achse ausgedrückt. Wie in Fig. 9A gezeigt, hemmte 14E11 die Bindung von Fibrinogen teilweise, während der BD Antikörper gegen ICAM-1 geringfügig wirksamer war. In den mit TNF-stimulierten HU- VEC-Kulturen, die in Fig. 9B gezeigt sind, hemmte jedoch 14E11 die Bindung vollständig, während der BD-Antikörper nur teilweise wirksam war. Der Kontroll-Antikörper, PMI- I, hatte keine Hemmwirkung, verglichen mit der Bindungsmenge in Abwesenheit eines Antikörpers. Die Ergebnisse stützen daher den Befund, dass 14E11 spezifisch einen Fibrinogen-Rezeptor (oder eine Bindungsstelle) auf der Oberfläche von HUVEC erkennt, wobei seine Besetzung die Bindung von Fibrinogen an TNF-stimulierte HUVEC vollständig hemmt. Dieses in vitro-System bildet dasjenige nach, das in vivo gefunden wurde, und somit sind die Antikörper dieser Erfindung als Therapeutika verwendbar.

6. Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Fibrinogen, welche die Bindung von Fibrinogen an den RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor auf Endothelzellen blockieren

A. Herstellung des Immunogens

Fibrinogen und die daraus, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellten Fragmente D und E werden zur Verwendung als Immunogene hergestellt, um monoklonale Antikörper gegen den Teil von Fibrinogen zu bilden, welcher die Bindung von Fibrinogen an die RGD-unabhängige Fibrinogen-Bindungsstelle auf Endothelzellen vermittelt. Für die Immunisierungen werden 50 ug von getrennt hergestellten Fibrinogen-Immunogenen zu komplettem Freunds Adjuvans (CFA) zugesetzt.

B. Herstellung von monoklonalen Antikörpern zu der Fibrinogen-Stelle, welche die Bindung von Fibrinogen auf HUVEC vermittelt

Die HUVEC, hergestellt als Immunogene gemäß Beispiel 4A, werden intraperitoneal (i.P.) in getrennte Balb/c ByJ-Mäuse injiziert, gefolgt von einer zweiten und dritten Immunisierung unter Verwendung der gleichen Fibrinogen-Immunogene, jede etwa drei Wochen auseinander, in inkomplettem Freunds Adjuvans (IFA). Die Mäuse erhalten eine Verstärkung von 50 ug von hergestellten Fibrinogen-Immunogenen intravenös (i.v.) in normaler, physiologischer Kochsalzlösung vier Tage vor der Fusion und eine zweite, ähnliche Durchströmungsverstärkung einen Tag später.
Die so behandelten Tiere werden getötet, und die Milz jeder Maus wird geerntet. Eine Suspension von Milzzellen wird dann hergestellt und der Fusion unterworfen, wie in Beispiel 4 beschrieben. Wachsende Klone werden dann für die Expression von Hybridomen mit der ausgewählten Spezifizität durchmustert, wie nachstehend beschrieben.

C. Immundurchmusterung von monoklonalen Antikörpern durch Bindungsassays

Die Kulturüberstände von vorstehend hergestellten Kulturen, die gegen HAT widerstandsfähig sind, werden anschließend auf die Anwesenheit von Fibrinogen-Antikörpem geprüft, welche die Bindung von Fibrinogen an den RGD-unabhängigen Fibrinogen- Rezeptor auf Endothelzellen hemmen. Die Überstände werden sowohl mit dem die Hemmung betreffenden Bindungsversuch mit ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen als auch mit dem die Hemmung betreffenden Bindungsversuch mit &sup5;¹Cr-markierten, Fibrinogen gebundenen THP-1-Zellen durchgemustert, wie in Beispiel 4C beschrieben, die auf den in Beispiel 3A und 3B beschriebenen Versuchen basieren. Die Hemmung des Bindungsversuchs wird weiter in Beispiel 5 beschrieben.
Hybridom-Kulturüberstände, die einen Antikörper produzieren, der an die Stelle auf Fibrinogen bindet, welche die Bindung von Fibrinogen an den RGD-unabhängigen Fibdnogen-Rezeptor auf Endothelzellen (auch als ICAM-1 bezeichnet) vermittelt, basierend auf der Analyse in den Beispielen 2-5, werden dann für die nachfolgende Reinigung und Charakterisierung ausgewählt. Hybridomkulturen produzierende Antikörper gegen Fibrinogen werden identifiziert. Die monoklonalen Antikörper, die spezifisch für einen Bereich auf Fibrinogen sind, der an den RGD-unabhängigen Fibrinogen-Rezeptor auf Endothelzellen (ICAM-1) bindet, ergaben eine Immunreaktion mit Fibrinogen zusätzlich zu den Analogen davon und keine Immunreaktion mit der Stelle auf Fibrinogen, welche die Bindung an MAC-1 vermittelt, nämlich die durch die D&sub3;&sub0;-abgeleiteten Peptide definierte Stelle, beschrieben in Beispiel 3.

D. Reinigung der ausgewählten monoklonalen Antikörper

Die ausgewählten Hybridome, die Antikörper gegen Fibrinogen sezernieren, wie in Beispiel 6C beschrieben, wurden in 10 Wochen alte Balb/c-Mäuse injiziert, wie in Beispiel 4D beschrieben, um Aszites-Flüssigkeit zu produzieren.
Die durch Aszites produzierten monoklonalen Antikörper werden weiter durch schnelle Protein-Flüssigchromatografie (FPLC) unter Verwendung einer Pharmacia Mono Q HR5/5-Anionenaustauschersäule (Pharmacia) unter Verwendung eines 0-0,5 M NaCl- Gradienten in 10 mM Tris-HCl bei pH 8,0 unter Befolgung der mit der Säule gelieferten Anweisungen gereinigt. Die FPLC-behandelten monoklonalen Antikörper werden dann unter Verwendung einer gerührten Amicon Ultrafiltrationszelle (Danvers, MA; PM 30 Membran) auf eine Konzentration von 1 mg/ml konzentriert, in PBS hinein dialysiert und bei -70ºC aufbewahrt, um gereinigten monoklonalen Antikörper zu bilden.
Die monoklonalen Antikörper werden weiter unter Verwendung eines Affinitätsreinigungs-Kits, Affi-Prep, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad, Richmond, CA) affinitätsgereinigt. Die IgM monoklonalen Antikörper werden weiter durch Hydroxylapatit-Gelfiltration über eine Bio-Gel HPHT Hydroxylapatit-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad) gereinigt. Diese gereinigten Antikörper werden in den nachfolgenden Bindungsversuchen, Western-Immunoblots und Immunpräzipitätionen zur Verwendung in dieser Erfindung verwendet.
Die vorstehende Beschreibung einschließlich der speziellen Ausführungsformen und Beispiele soll die vorliegende Erfindung erläutern und darf nicht als beschränkend ausgelegt werden. Zahlreiche andere Variationen und Modifikationen können durchgeführt werden, ohne den Bereich der vorliegenden Erfindung, wie er in den beigefügten Patentansprüchen definiert ist, zu verlassen.

Claims

1. Eine Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen und pharmazeutisch annehmbaren Fibrinogen-Homologs, das zur Bindung an 1CAM-1 und zur Hemmung der Fg-Bindung an Endothelzellen befähigt ist, mit der Maßgabe, dass dieses Homolog nicht D&sub3;&sub0; oder eine Variante davon ist.

2. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die therapeutisch wirksame Menge wenigstens etwa 0,1 Gew.-% Fibrinogen-Homolog, bezogen auf das Gewicht der Gesamtzusammensetzung, beträgt.

3. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Fibrinogen-Homologe in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger dispergiert ist.

4. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Fibrinogen-Homolog in einer sterilen Lösung dispergiert ist.

5. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Fibrinogen-Homolog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem proteolytischen Fragment von Fibrinogen und einem monoklonalen Antikörper, der mit ICAM-1 immunreagiert, aber nicht mit dem Vitronectin-Rezeptor immunreagiert, worin der monoklonale Antikörper vorzugsweise eine Fibrinogen-Bindung an stimulierte Endothelzellen hemmt.

6. Die Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin der monoklonale Antikörper die Immunspezifizität eines durch ein Hybridom hergestellten Antikörpers, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 14E11, 16GB, 2E12 und 2812, hat.

7. Eine Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines im Wesentlichen reinen und pharmazeutisch annehmbaren ICAM-1-Homologs, das zur Bindung an Fibrinogen und zur Hemmung einer Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen befähigt ist.

8. Ein monoklonaler Antikörper, der mit ICAM-1 immunreagiert, aber nicht mit dem Vitronectin-Rezeptor immunreagiert, worin der monoklonale Antikörper vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmt.

9. Der monoklonale Antikörper nach Anspruch 8, worin der Antikörper die Immunspezifizität eines monoklonalen Antikörpers, hergestellt durch ein Hybridom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 14E11, 16G8, 2E12 und 2B12, hat.

10. Ein monoklonaler Antikörper, der mit Fibrinogen immunreagiert und der vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmt.

11. Die Verwendung eines Fibrinogen-Homologs (Fg-Homologs) oder eines ICAM-1- Homologs zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung einer Fg-Bindung an Endothelzellen in einem Patienten, wobei das Fg-Homolog zur Bindung an ICAM-1 und zur Hemmung einer Fg-Bindung an Endothelzellen befähigt ist, und das ICAM-1-Homolog zur Bindung an Fibrinogen und zur Hemmung einer Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen befähigt ist.

12. Die Verwendung nach Anspruch 11, worin das Fg-Homolog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem proteolytischen Fragment von Fibrinogen, D&sub3;&sub0; und einem monoklonalen Antikörper, der mit ICAM-1 immunreagiert, aber nicht mit dem Vitronectin-Rezeptor immunreagiert, worin der monoklonale Antikörper vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmt.

13. Die Verwendung nach Anspruch 12, worin der monoklonale Antikörper die Immunspezifizität eines monoklonalen Antikörpers, hergestellt durch ein Hybridom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 14E11, 16G8, 2E12 und 2B12, hat.

14. Die Verwendung nach Anspruch 11, worin das ICAM-1-Homolog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ICAM-1 und einem monoklonalen Antikörper, der Antikörpermoleküle umfasst, die mit Fibrinogen immunreagieren und die vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmen.

15. Die Verwendung nach Anspruch 11, worin das Medikament das Analog in einer Menge enthält, die ausreichend ist, um eine intravaskuläre Konzentration des Homologs in dem Blut des Patienten in dem Bereich von etwa 0,1 bis 100 ug/ml zu ergeben.

16. Das Verfahren nach Anspruch 11, worin das Medikament zur Verabreichung in einer Menge vorhanden ist, um etwa 0,1 bis etwa 20 Milligramm Homolog pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten pro Tag zu ergeben.

17. Die Verwendung eines Fg-Homologs oder eines ICAM-1-Homologs zur Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung der durch Fibrinogen/Endothelzellen vermittelten Entzündung in einem Patienten, wobei das Fg-Homolog zur Bindung an ICAM-1 und zur Hemmung einer Fg-Bindung an Endothelzellen befähigt ist, und das ICAM-1-Homolog zur Bindung an Fibrinogen und zur Hemmung einer Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen befähigt ist.

18. Die Verwendung nach Anspruch 17, worin das Fg-Homolog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem proteolytischen Fragment von Fibrinogen, D3o und einem monoklonalen Antikörper, der mit ICAM-1 immunreagiert, aber nicht mit dem Vitronectin-Rezeptor immunreagiert, worin der monoklonale Antikörper vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmt.

19. Die Verwendung nach Anspruch 17, worin das ICAM-1-Homolog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ICAM-1 und einem monoklonalen Antikörper, der Antikörpermoleküle umfasst, die mit Fibrinogen immunreagieren und die vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmen.

20. Die Verwendung nach Anspruch 17, worin das Medikament das Homolog in einer Menge enthält, die ausreichend ist, um eine intravaskuläre Konzentration des Homologs in dem Blut des Patienten in dem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 100 ug/ml zu ergeben.

21. Ein Verfahren zum Nachweisen der Menge eines Fibrinogen-Homologs (Fg- Homologs) in einer flüssigen Probe, umfassend:

(a) Das Vermischen einer Probe von stimulierten Endothelzellen mit einer vorbestimmten Menge einer flüssigen Probe, die ein Fg-Homolog und eine vorbestimmte Menge eines markierten Fg-Homologs enthält, um eine Konkurrenzreaktionsmischung zu bilden;

(b) Das Aufrechterhalten dieser Reaktionsmischung für einen vorbestimmten Zeitraum, der ausreichend ist, dass das gesamte, in der Zusammensetzung vorhandene Fg-Homolog an die Endothelzellen bindet und einen Endothelzelle : Fg-Homolog-Komplex bildet, und dass das markierte Fg-Homolog an die Endothelzellen binden gelassen wird, um einen markierten Endothelzelle : Fg-Homolog-Komplex zu bilden; und

(c) Das Bestimmen der Menge des in Schritt (b) gebildeten markierten Endothelzelle : Fg-Homolog-Komplexes, wodurch die Menge eines Fg-Homologs in der Zusammensetzung nachgewiesen wird.

22. Das Verfahren nach Anspruch 21, worin das markierte Fibrinogen-Homolog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem proteolytischen Fragment von Fibrinogen, D&sub3;&sub0; und einem monoklonalen Antikörper, der mit ICAM-1 immunreagiert, aber nicht mit dem Vitronectin-Rezeptor immunreagiert, worin der monoklonale Antikörper vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmt.

23. Ein Verfahren zum Durchmustern auf Zusammensetzungen, die zur Hemmung einer Bindung von Fibrinogen an ICAM-1 wirksam sind, umfassend die Schritte:

a) Das Vermischen ausgewählter Mengen einer mutmaßlichen Hemmerzusammensetzung, eines Fibrinogen-Homologs und eines ICAM-1-Homologs in einer Hemmungsreaktionsmischung, worin das Fg-Homolog zur Bindung an ICAM-1 und zur Hemmung einer Bindung von Fg an Endothelzellen befähigt ist, und das ICAM-1-Homolog zur Bindung an Fibrinogen und zur Hemmung einer Bindung von Fibrinogen an Endothelzellen befähigt ist;

b) Das Aufrechterhalten dieser Mischung unter Bedingungen, die ausreichend sind, dass das ICAM-1-Homolog an das Fg-Homolog bindet und einen ICAM- 1-Homolog : Fg-Homolog-Komplex bildet; und

c) Das Messen der in Schritt (b) gebildeten Menge des ICAM-1-Homolog : Fg- Homolog-Komplexes und dadurch der Wirksamkeit der Hemmerzusammensetzung.

24. Das Verfahren nach Anspruch 23, worin das Fg-Homolog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fibrinogen, einem proteolytischen Fragment von Fibrinogen, D&sub3;&sub0; und einem monoklonalen Antikörper, der mit ICAM-1 immunreagiert, aber nicht mit dem Vitronectin-Rezeptor immunreagiert, worin der monoklonale Antikörper vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmt.

25. Das Verfahren nach Anspruch 23, worin das ICAM-1-Homolog ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ICAM-1 und einem monoklonalen Antikörper, welcher Antikörpermoleküle umfasst, die mit Fibrinogen immunreagieren und die vorzugsweise eine Bindung von Fibrinogen an stimulierte Endothelzellen hemmen.

26. Ein Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen reinem ICAM-1, umfassend die Schritte:

(a) Das Bereitstellen einer wenigstens ICAM-1 enthaltenden wässrigen Detergenszusammensetzung;

(b) Das Inberührungbringen der ICAM-1 enthaltenden Zusammensetzung mit einer Fibrinogen immobilisierten Matrix, enthaltend an einen festen Träger gebundenes Fibrinogen, wobei das Inberührungbringen unter Bedingungen erfolgt, die ausreichend sind, dass das ICAM-1 an das Fibrinogen bindet und einen Festphasen-ICAM-1 : Fibrinogen-Komplex bildet;

(c) Das Waschen des festen Trägers und des Komplexes mit einem wässrigen Waschpuffer, enthaltend Mg++, Mn&spplus;&spplus; und ein RGD enthaltendes Polypeptid, unter Bedingungen, die ausreichend sind, um sämtliche in einer RGD-abhängigen Weise an Fibrinogen gebundene Proteine zu eluieren, wobei der Waschpuffer im Wesentlichen frei ist von Ca&spplus;&spplus;; und

(d) Das Eluieren des ICAM-1 von dem festen Träger unter Verwendung eines wässrigen, Mg&spplus;&spplus;, Mn&spplus;&spplus; und EDTA enthaltenden Puffers, um im Wesentlichen reines ICAM-1 zu bilden.