DE69326018T2

DE69326018T2 - Methoden zur bestimmung der blutplaettchenfunktion

Info

Publication number: DE69326018T2
Application number: DE69326018T
Authority: DE
Inventors: Andrew Shaw; Michael Stewart
Original assignee: Alberta Cancer Board
Current assignee: Alberta Cancer Board
Priority date: 1992-12-03
Filing date: 1993-12-03
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2013-12-04
Also published as: EP0672170A1; ATE183243T1; CA2160982C; DE69326018D1; CA2160982A1; AU5558294A; US5427913A; WO1994012664A1; EP0672170B1; US5952184A

Description

Störungen der Funktion der Blutplättchen gehen einher mit krankhaftem Blutungsverhalten, einschließlich leichter Quetschung, punktförmiger Hautblutung (Petechiae) und der Blutfleckenkrankheit (Purpura), und sind gemeinsame Ursache exzessiven Blutens aufgrund von Operationen oder Verletzungen. Hyper-reagierende Blutplättchen (Thrombozyten) können für Thrombosen, Embolien, Ischämien und Infarkte prädisponieren. Es ist daher wünschenswert, die Blutplättchen-Funktion bestimmen und ihre Dysfunktion mittels verläßlicher und angenehmer in vitro-Tests, die sinnvollerweise die Blutplättchen-Funktion in vivo widerspiegeln, diagnostizieren zu können.
Derzeit verfügbare Tests auf die Blutplättchen-Funktion schließen Tests ein, die die Gerinnungszeit wie die Blutungszeit betreffen. Andere Tests beinhalten die Ermittlung der Blutplättchen-Aktivierung als Antwort auf lösliche Aktivierungsmittel wie Thrombin, fibrilläres Collagen und ADP.
Keiner dieser Tests hat sich als gute Vorhersage der Blutplättchen-Funktion in vivo erwiesen. Die wahrscheinlich beste verfügbare Methode zur Vorhersage von krankhaftem Blutungsverhalten während Operationen ist die Blutungszeit, aber selbst diese ist nur mäßig in ihrer voraussehenden Aussagekraft.
Ein wichtiger Auslöser für die primäre Blutplättchen-Aktivierung in vivo ist der Kontakt mit der subendothelialen Basalmembran, die der Endothelbekleidung von Blutgefäßen aufgrund von Schädigungen ausgesetzt ist, oder der Kontakt mit der Intima der Gefäßwand durch ernsthaftere Verletzungen oder Brüche eines arteriosklerotischen Plaques.
Die Blutplättchen-Aktivierung in vivo ist ein komplexes Phänomen und erfolgt in mehreren Schritten. Der anfängliche Schritt kann die Blutplättchen-Adhäsion an Komponenten der subendothelialen Basalmembran beinhalten. Ein in vitro-Modell für diesen Schritt ist die Adhäsion der Blutplättchen an Oberflächen wie mit extrazellulären Matrixprotein beschichteten Kügelchen, wie beschrieben von Coller et al., (1980), Blood, Bd. 55, S. 169 und (1989), Blood, Bd. 74, S. 182. Nachdem sich die Blutplättchen an solche Kügelchen heften, bilden sie Brücken zwischen den Kügelchen, so daß lockere Zusammenschlüsse von Kügelchen und Blutplättchen entstehen, jedoch ohne Freisetzung von Granulum - dies nennt man "Blutplättchen-Agglutination".
Im zweiten Schritt der Aktivierung werden die Blutplättchen degranuliert, wobei ATP freigesetzt wird, und dieser Prozeß ist begleitet von der Auffrischung durch weitere Blutplättchen sowie eine Blutplättchen-Blutplättchen-Adhäsion und die Bildung von eng zusammenhängenden Aggregaten von Blutplättchen - dies nennt man "Blutplättchen- Aggregation".
Dieser Prozeß der Blutplättchen-Aggregation unter Freisetzung von Granulum wird physiologisch für höchst relevant für die Bildung von Ihromben und die Hämostase in vivo gehalten.
Verschiedene Ansätze der Untersuchung legen nahe, daß Zellen und Blutplättchen auf ein immobilisiertes Aktivierungsmittel eine Antwort zeigen könnten, die anders ist als die Antwort derselben Zelle oder derselben Blutplättchen auf das Mittel in löslicher Form (Schwartz et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 88, S. 7849-7853; Griffith et al., (1991), Blood, Sp. 78, S. 1753-1759).
Tests auf Blutplättchen-Aktivierung mittels löslicher Aktivierungsmittel können daher die wesentlichen Vorgänge, die an der Hämostase oder Thrombose in vivo beteiligt sind, nicht widerspiegeln.
Coller et al. (1989) untersuchten die Blutplättchen-Agglutination als Antwort auf immobilisiertes Collagen mit dem Blick auf die Identifizierung des molekularen Rezeptors für Collagen auf der Blutplättchenoberfläche. Sie untersuchten jedoch nicht die Collageninduzierte Agglutination in bezug auf irgendwelche klinischen Bedingungen.
Coller et al. (1980) untersuchten die Blutplättchen-Agglutination als Antwort auf immobilisiertes Fibrinogen und bemerkten eine verschlechterte Antwort bei zwei Patienten mit Thrombasthenie, ein Zustand, von dem bekannt ist, daß er mit einer Abnormalität der Blutplättchen-Fibrinogen-Wechselwirkung zusammenhängt.
In vitro-Untersuchungen, die die Messung von Blutplättchen-Agglutination beinhalten, wie die von Coller et al. beschriebenen, spiegeln den Status des späteren und physiologisch wesentlichen Schritts der Blutplättchen-Aktivierung, in der die Blutplättchen aggregieren, mit der Freisetzung von Granulum, nicht wider. Diese Beschränkung ist reflektiert im Mangel verfügbarer Tests auf Blutplättchen-Funktion, die eine gute Korrelation mit physiologisch wesentlichen Zuständen, wie Blutungsunregelmäßigkeiten zeigen.
Es bleibt ein Bedarf bestehen für einen angenehmen klinischen Test, der die physiologisch wesentliche in vivo-Funktion oder Dysfunktion der Blutplättchen widerspiegelt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Beurteilung der vollständigen Blutplättchen-Aktivierung in einem Säugetier als Antwort auf den von Willebrand-Faktor (vWf), wobei das Verfahren die Schritte umfaßt
(a) Blutplättchen von einem Säugetier bereitzustellen;
(b) die Blutplättchen in Suspension mit immobilisiertem vWf oder einem wirksamen Fragment oder Analog davon in Berührung zu bringen, während die Blutplättchen über einen wirksamen Zeitraum einem wirksamen mechanischen Stimulus ausgesetzt werden; und
(c) die vollständige Blutplättchen-Aktivierung, die erzeugt worden ist, zu bestimmen. Die vorliegende Erfindung, wie sie beispielhaft anhand der bevorzugten Ausführungsformen dargestellt ist, wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Figuren beschrieben. Dabei zeigt:
Fig. 1 die Blutplättchen-Aktivierung mittels immobilisiertem gereinigtem vWf und mittels immobilisiertem vWf, eingefangen mit F(ab')&sub2;;
Fig. 2A die Aggregation als Antwort auf immobilisierten vWf in bezug auf Rührgeschwindigkeit und Durchmesser der Kügelchen;
Fig. 2B die Freisetzung von ATP als Antwort auf immobilisierten vWf in bezug auf Rührgeschwindigkeit und Durchmesser der Kügelchen;
Fig. 3 die Wirkung von Acetylsalicylsäure (ASS) und BM13.177 auf die Blutplättchen- Aggregation;
Fig. 4 die Aggregation als Antwort auf Collagen, das an Kügelchen verschiedener Größen immobilisiert ist;
Fig. 5 die Freisetzung von ATP ( ) und Aggregation (+) als Antwort auf immobilisiertes Collagen in bezug auf die Rührgeschwindigkeit;
Fig. 6 die Wirkung von BM13.177 auf die Blutplättchen-Aggregation als Antwort auf immobilisiertes Collagen;
Fig. 7A und 7B die Freisetzung von ATP als Antwort auf immobilisierten vWf nach verschiedenen Zeiten der Exposition.
Der Begriff "Blutplättchen-Aktivierung" wird in der wissenschaftlichen Literatur nicht immer konsistent verwendet und kann sich auf verschiedene Stufen des Aktivierungsprozesses beziehen.
Der Begriff "Blutplättchen-Aktivierung" wird hier mit der Bedeutung benutzt, daß er die volle Aktivierung, einschließlich der Blutplättchen-Aggregation unter Freisetzung von Granulum bezeichnet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, daß Proteine der extrazellulären Matrix (ECM), die immobilisiert worden sind, beispielsweise durch Anlagerung an Mikropartikel, die Blutplättchen-Aktivierung mittels eines neuen Weges verursachen, wenn sie mit Blutplättchen und einem mechanischen Reiz in Berührung gebracht werden. Dieser neue Weg wird durch lösliche ECM-Proteine oder durch immobilisierte ECM- Proteine in Abwesenheit von dem mechanischen Reiz nicht stimuliert.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Blutplättchen-Aktivierung als Antwort auf immobilisierten von Willebrand- Faktor (vWf) bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, die Blutplättchen in vitro mit immobilisiertem vWf in Berührung zu bringen, während die Blutplättchen einem wirksamen mechanischen Reiz ausgesetzt werden, und das Maß der Blutplättchen- Aktivierung, die erzeugt worden ist, zu bestimmen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden das oder die ECM-Protein(e) immobilisiert, indem es (sie) an Polystyrol-Latex-Kügelchen gebunden wird (werden) und mit den Blutplättchen mittels mechanischen Rührens der Lösung, in der die Blutplättchen suspendiert vorliegen, in Berührung gebracht wird (werden).
Die Verwendung von Kügelchen ist aus verschiedenen Gründen angenehm: a) Sie erlaubt die Kontrolle über die Oberfläche und deshalb über die Menge des Aktivietungsmittels, das bereitgestellt werden muß, und b) sie ermöglicht eine Untersuchung der Blutplättchen- Blutplättchen-Adhäsion und der Degranulierung in der Suspension. Andere Typen von festen Trägern können ebenfalls verwendet werden, um die ECM-Proteine zu immobilisieren. Ein Beispiel dafür sind Immunogold-Partikel.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet neue Mittel, die Integrität des Weges der Blutplättchen-Aktivierung einschließlich des Schritts der Blutplättchen-Aggregation und der Freisetzung von Granulum, der den physiologisch höchst wichtigen Teil des Weges ausmacht, abzuschätzen.
Obgleich bisher von Blutplättchen berichtet worden ist, daß sie an Kügelchen-immobilisierte ECM-Proteine binden, stimulierte diese Bindung das Freisetzen von Blutplättchen-Granula nicht (Coller, 1989). Bis zu der Arbeit der Erfinder der vorliegenden Erfindung wurde nicht vermutet, daß das Inkontaktbringen der Blutplättchen mit immobilisierten ECM-Proteinen unter Rühren die Blutplättchen schnell aktivieren könnten bis zu dem Punkt der Aggregation und der Freisetzung von Granulum.
Überraschenderweise ist nun gefunden worden, daß, wenn die Blutplättchen-Aktivierung als Antwort auf immobilisierten vWf in Zusammenhang mit einem mechanischen Reiz mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Blutplättchen von Patienten, die unter Blutungsunregelmäßigkeiten leiden, bestimmt wird, eine gute Unterscheidung zwischen diesen Patienten und gesunden Menschen erzielt wird aufgrund des Ausmaßes der Blutplättchen-Aktivierung, die beobachtet wird. Dies ist auch anhand der Beispiele 11 und 12 zu erkennen.
Es ist von den Erfindern der vorliegenden Erfindung herausgefunden worden, daß die Blutplättchen-Aktivierung mittels immobilisiertem vWf unter Rühren nicht konsistent ist, wenn gewaschene Blutplättchen verwendet werden. Die Blutplättchen sollten als blutplättchenreiches Plasma wie in Beispiel 2 zubereitet werden.
Die Blutplättchen-Aktivierung als Antwort auf immobilisierten vWf, bestimmt mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, wurde bei 39 gesunden Probanden untersucht, und der Bereich der gefundenen Werte betrug 146 bis 923 pMol ATP, das freigesetzt wurde pro 10&sup8; Blutplättchen (Beispiel 10).
Daß die beobachtete Blutplättchen-Antwort abhängig ist von der Wechselwirkung mit immobilisiertem vWf, und daß diese Antwort ausbleibt, wenn löslicher vWf als Agonist verwendet wird, zeigt sich an dem Ausbleiben der Blutplättchen-Aktivierung, das in Kontrollen beobachtet wurde, bei denen Rinderserumalbumin gebunden an Polystyrolkügelchen (Fig. 1) verwendet wurde, da PRP von gesunden Probanden löslichen vWf enthält.
Wie in Tabelle 5 zu sehen ist, zeigten nur drei von achtzehn Patienten mit Blutungsunregelmäßigkeiten eine Rate der ATP-Freisetzung innerhalb des normalen Bereichs 5 Minuten nachdem die Blutplättchen dem immobilisiertem vWf unter Rühren ausgesetzt worden sind. Das heißt, die Abnormalität ist zu 83% nachgewiesen worden. Von diesen drei Patienten zeigte einer eine signifikant verlängerte Verzögerungszeit bezüglich Blutplättchen- Aktivierung im Vergleich mit der Kontrolle.
Im Gegensatz dazu, wie dargestellt in Tabelle 3, lieferten herkömmliche Untersuchungen der Blutplättchen-Funktion eine mäßige Unterscheidung zwischen gesunden Probanden und Pateienten mit Blutungsunregelmäßigkeiten.
Ein Überblick über die Freisetzung von ATP bei gesunden und kranken Menschen nach verschiedenen Zeiträumen der Exposition der Blutplättchen gegenüber immobilisiertem vWf und Rühren zeigte, daß eine optimale Unterscheidung zwischen gesunden Probanden und Patienten mit Blutungsunregelmäßigkeiten bei etwa 5-minütigem Rühren erhalten wurde, wie zu sehen in Beispiel 12 und den Fig. 7A und 7B. Unterhalb von etwa drei Minuten war die Freisetzung von ATP sowohl in gesunden Probanden als auch in Patienten gering.
Ein weiteres Anzeichen dafür, daß die beobachtete Antwort spezifisch für gebundenen vWf ist, ist das Auffinden, daß die Blutplättchen-Aggregation und die Freisetzung von ATP als Antwort auf immobilisierten vWf in Gegenwart eines mechanischen Reizes verhindert wurde durch die Zugabe von F(ab')&sub2;-Fragmenten eines polyklonalen Antiserums gegen vWf.
Es wird somit ein Mittel zur Verfügung gestellt, mittels eines angenehmen klinisch durchführbaren Verfahrens Dysfunktionen des Blutplättchen-Aktivierungs-Weges, die sich in vivo als gestörtes Blutplättchen-Verhalten manifestieren, wie beispielsweise in thrombotischen Fällen oder bei Blutungsunregelmäßigkeiten, nachzuweisen.
Zur Untersuchung der Antwort der Blutplättchen auf ein immobilisiertes ECM-Protein gemäß des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann das ECM-Protein, das verwendet wird, direkt an den festen Träger gebunden sein. Es kann jedoch auch indirekt gebunden sein, beispielsweise mittels eines Spacer-Moleküls wie einem synthetischen Peptid, das wiederum selbst an das Kügelchen gebunden ist, wie es der Durchschnittsfachmann ohne weiteres verstehen wird. Die Bindung zwischen Spacer-Molekül und ECM-Protein kann kovalent oder nicht-kovalent sein. Solche Variationen sind mitumfaßt von der vorliegenden Erfindung. Wie in Beispiel 1 zu sehen ist, kann das ECM-Protein auch an einen geeigneten Antikörper gebunden sein, der wiederum an den festen Träger gebunden ist. Ein Antikörper-Fragment kann ebenfalls verwendet werden. Für die Stimulation der Blutplättchen mittels immobilisiertem vWf sind Kügelchen bevorzugt, die direkt mit vWf beschichtet sind.
Wirksame Fragmente oder Analoga eines ECM-Proteins können auch immobilisiert und für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Sie sind ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise kann die Wirkung eines immobilisierten ECM- Proteins auf seinen Rezeptor mittels Bindung eines gegen diesen Rezeptor gerichteten Antikörpers oder mittels Bindung eines Fragments eines solchen Antikörpers, nachgeahmt werden. Auch dies ist für den Durchschnittsfachmann ohne weiteres zu verstehen (Schwartz et al., (1991), Exp. Cell Res., Bd. 195, S. 533). Die Verwendung eines solchen Analogons von einem ECM-Protein ist ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Der mechanische Reiz, dem die Blutplättchen in Verbindung mit den immobilisierten ECM- Proteinen ausgesetzt wird, kann angenehmerweise durch Rühren der Blutplättchen- Suspension in Berührung mit dem immobilisierten ECM-Protein erfolgen.
Der Durchschnittsfachmann wird auch ohne weiteres verstehen, daß auch andere Verfahren verwendet werden können, um einen mechanischen Reiz auszuüben.
Die Wirkungen der Rührgeschwindigkeit und der Größe der Kügelchen auf die Blutplättchen- Aktivierung, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt wird, sind untersucht worden.
Wie in Beispiel 3 zu sehen ist, löste die Berührung mit Blutplättchen keine signifikante Aggregation oder ATP-Freisetzung aus, wenn der vWf auf Kügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1,4 um immobilisiert war. Die Verwendung von Kügelchen eines Durchmessers von 2,9 um, 4,2 um oder 5,9 um ergab ein ähnliches Niveau der Blutplättchen-Aggregation und ATP-Freisetzung. Die Kontrolle auf die Dichte der vWf- Moleküle auf der Kügelchen-Oberfläche und des Verhältnisses Blutplättchen/Kügelchen zeigte identische Ergebnisse.
Die Blutplättchen-Aggregation und ATP-Freisetzung als Antwort auf immobilisierten vWf waren bei Rührgeschwindigkeiten unter etwa 200 UpM insignifikant und wuchsen auf ein Maximum für die Aggregation bei etwa 500 UpM und für die ATP-Freisetzung bei etwa 900 UpM. Dies ist in Beispiel 4 und in Fig. 2A und 2B zu sehen. Diese Daten zeigen die Bedeutung des mechanischen Reizes für die Blutplättchen-Antwort, bestimmt mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
Es ist gefunden worden, daß die Blutplättchen, die mit immobilisiertem vWf in Berührung sind, mindestens 3 Minuten lang gerührt werden müssen, um eine ATP-Freisetzung auszulösen. Dies ist in Beispiel 12 zu sehen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Blutplättchen-Funktion bestimmt, indem die Blutplättchen in Blutplättchen-reichem Plasma mit vWf, immobilisiert an Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 2,9 um bis etwa 5,9 um unter Rühren bei einer Geschwindigkeit im Bereich von etwa 500 UpM bis etwa 900 UpM, etwa 3 bis etwa 10 Minuten lang in Berührung gebracht werden. Dann erfolgt die Bestimmung der Blutplättchen-Aktivierung.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Kügelchen-Durchmesser etwa 4,2 um, das Rühren erfolgt bei etwa 500 UpM etwa 5 Minuten lang, und die Blutplättchen- Aktivierung wird bestimmt als Aggregation oder ATP-Freisetzung.
Die Blutplättchen-Antwort kann mittels jeden geeigneten Nachweisverfahrens für die Blutplättchen-Aktivierung gemessen werden. Dies schließt ein die ATP-Freisetzung, die Aggregometrie, die Messung von Second Messengern wie intrazellulärer Calciumspiegel oder intrazellulärer pH, die Messung der Produzierung von aktivietungs-abhängigen Metaboliten wie Thromboxan B2 oder die Freisetzung von Arachidonsäure und die Messung der aktivierungsabhängigen Phosphorylierung von Blutplättchen-Proteinen.
Die optimale Größe der Kügelchen, die optimale Rührgeschwindigkeit und die optimale Dauer des Rührens hängen ab vom Typ der verwendeten Kügelchen, dem einzelnen ECM- Protein, das verwendet wird, und von der Größe des Mischbehälters, kann aber ohne weiteres durch den Durchschnittsfachmann bestimmt werden.
Die Untersuchung einiger der Charakteristika der Blutplättchen-Aktivierung, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung beobachtet wurden, hat gezeigt, daß die Blutplättchen- Aktivierung einen neuen Weg der Antwort umfaßt, unterscheidbar von zuvor berichteten Blutplättchen-Antworten.
Die Aggregation und Freisetzung von ATP als Antwort auf immobilisierten vWf wurden durch monoklonale Antikörper gegen GPIb (AN51, AP1), GPIIb-IIIa (MCA 467, P2) und GPIIIa (SZ21) inhibiert, nicht jedoch durch die monoklonalen Antikörper gegen GPIV oder die β1-Integrin-Untereinheit (4B4).
Wenn die Blutplättchen mit Acetylsalicylsäure (ASS) oder dem Thromboxan-Analogon BM 13.177 präinkubiert wurden, ehe sie dem immobilisierten vWf unter Rühren ausgesetzt wurden, war die Blutplättchen-Aktivierung ernsthaft reduziert (Beispiel 5), was anzeigt, daß die Blutplättchen-Aktivierung, wie bestimmt, mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, abhängig ist von einem intakten Thromboxan-Stoffwechselweg. Das ist im Gegensatz zu der von Coller (1980, supra) beobachteten Agglutination, die durch ASS nicht inhibiert wurde.
Die Aufnahme von ASS führt auch zu einer verminderten Blutplättchen-Aktivierung als Antwort auf immobilisierten vWf im Zusammenhang mit einem mechanischen Reiz, wie in Beispiel 13 zu sehen ist.
Wenn die Blutplättchen-Aktivierung durch immobilisierten vWf bestimmt wird mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, um Blutungsunregelmäßigkeiten nachzuweisen, sollten die zu untersuchenden Personen kein Aspirin oder andere Substanzen einnehmen, die den Thromboxan-Stoffwechselweg unterdrücken oder inhibieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Bestimmung der physiologisch wesentlichen Blutplättchen-Aktivierung zur Verfügung. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt somit ein Mittel bereit, die Wirksamkeit von die Blutplättchen-Funktion beeinflussenden Mitteln in vivo oder in vitro aufzuzeichnen. Solche Mittel können entweder darauf gerichtet sein, die Blutplättchen-Aktivierung zu stimulieren, zu reduzieren oder zu verhindern.
Beispielsweise werden Wirkstoffe, die die Blutplättchen-Funktion herabsetzen, zum Beispiel Aspirin, Sulfinpyrazon oder Dipyridimol, gemeinhin verwendet als antithrombotische Wirkstoffe beim Menschen. Es gibt gegenwärtig jedoch kein vernünftiges Verfahren, die Wirkung dieser Substanzen auf die Blutplättchen-Funktion, induziert mittels eines physiologisch relevanten Reizes, aufzuzeichnen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Blutplättchen- Aktivierung durch immobilisierten vWf mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bestimmt, ehe die antithrombotische Therapie beginnt und in Intervallen während der Therapie. Man kann dadurch die Wirksamkeit eines bestimmten antithrombotischen Mittels bezüglich des Herabsetzens der Blutplättchen-Funktion in einem einzelnen Patienten bestimmen und den für diesen Patienten wirkungsvollsten Wirkstoff auswählen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Blutplättchen- Aktivierung bestimmt, indem die Blutplättchen mit auf Polystyrolkügelchen immobilisiertem Collagen in Berührung gebracht werden. Eine ähnliche Blutplättchen-Aktivierung wurde als Antwort auf immobilisiertes Collagen beobachtet, wenn die Blutplättchen entweder als PRP wie in Beispiel 2 oder als eine gewaschene Blutplättchen-Zubereitung wie in Beispiel 7 bereitet wurden.
Wie in Beispiel 7 zu sehen ist, wurde die Blutplättchen-Aggregation durch Collagen stimuliert, das an Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,74 um gebunden war. Die Blutplättchen-Antwort wuchs mit der Größe der Kügelchen bis zu einem Durchmesser von 4,22 um. Bei Größen der Kügelchen von mehr als 4,22 um nahm die Blutplättchen- Aggregation scharf ab, wie es in Fig. 4 dargestellt ist.
Die Blutplättchen-Aggregation und ATP-Freisetzung als Antwort auf immobilisiertes Collagen waren bei Rührgeschwindigkeiten unter etwa 200 UpM insignifikant. Die Blutplättchen-Aggregation stieg an mit einer Rührgeschwindigkeit von bis zu etwa 500 UpM und blieb im wesentlichen konstant auch bei höheren Rührgeschwindigkeiten, wie es in Fig. 5 dargestellt ist. Dahingegen stieg die ATP-Freisetzung mit Rührgeschwindigkeiten von bis zu etwa 1200 UpM an.
Die Blutplättchen-Aggregation und ATP-Freisetzung als Antwort auf immobilisiertes Collagen waren zu beobachten nach etwa 30 Sekunden Rühren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Blutplättchen- Funktion dadurch bestimmt, daß die Blutplättchen mit Collagen in Kontakt gebracht werden, das an Polystyrolkügelchen immobilisiert ist, die einen Durchmesser von etwa 4,2 um haben. Das Inkontaktbringen erfolgt unter Rühren bei etwa 900 UpM über einen Zeitraum von etwa 2 Minuten, woraufhin die Blutplättchen-Aktivierung bestimmt wird.
Wie auch die Antwort auf immobilisierten vWf wurde auch die Blutplättchen-Aggregation als Antwort auf immobilisiertes Collagen in Gegenwart eines mechanischen Reizes durch monoklonale Antikörper gegen GPIb (AN51, AP1), GPIIb-IIIa (MCA 467, P2) und GPIIIa (SZ21) inhibiert, nicht jedoch durch monoklonale Antikörper gegen GPIV. Der monoklonale Antikörper gegen die β1-Integrin-Untereinheit (4B4) inhibierte die immobilisierte Collageninduzierte Aggregation jedoch.
Die Blutplättchen-Aggregation als Antwort auf immobilisiertes Collagen wurde durch eine Präinkubation mit dem Thromboxan-Inhibitor BM13.177 inhibiert, wie es in Fig. 6 dargestellt ist. Dies zeigt an, daß für die Antwort ein intakter Thromboxan-Stoffwechsel nötig ist.
Wenn die Blutplättchen solubilisiertem hydrolysiertem Collagen und BSA-beschichteten Kügelchen unter Rühren ausgesetzt wurden, wurde keine Blutplättchen-Aktivierung beobachtet, was anzeigt, daß die Antwort abhängig ist von der Wechselwirkung zwischen Blutplättchen mit immobilisiertem Collagen.
Die nachfolgenden Beispiele sind lediglich Illustrationen, um das Verfahrender vorliegenden Erfindung näher zu beschreiben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1 - Herstellung von immobilisiertem vWf Material und Methoden Gereiniger vWf:

vWf wurde von 4 ml Kryopräzipitat gereinigt, das von einem Pool von 16 Typ 0-Donor- Einheiten mittels des Verfahrens von Thorell und Blomback (14) erhalten wurde. Die Reinheit der Präparation wurde mittels Kreuz-Immunoelektrophorese unter Verwendung von Kaninchen Anti-Humanplasma in der zweiten Dimension beurteilt (Dimension Laboratories, Mississauga, Ont., Kanada).
Ein einziger Präzipitin-Bogen wurde erhalten, dessen Mobilität identisch ist mit derjenigen, die unter Verwendung monospezifischer Anti-vWf-Antikörper für die Präzipitation erhalten wurde.
Polyklonale Anti-human vWf F(ab')&sub2;-Fragmente wurden von American Diagnostics über Inter-Haematol (Hamilton, Ontario) gekauft.

Anlagern von vWf an die Kügelchen:

Von Polysciences Corporation über Analychem (Markham, Ont., Kanada) erhaltene Polystyrolkügelchen wurden vor ihrer Verwendung dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
Die Kügelchen wurden entweder mit gereinigtem vWf oder zunächst mit polyklonalen AntivWf F(ab')&sub2;-Fragmenten, die verwendet wurden, um vWf aus der gereinigten vWf- Zubereitung einzufangen, beschichtet.
vWr oder die F(ab')&sub2;-Fragmente wurden unter alkalischen Bedingungen an die Kügelchen adsorbiert. In Kurzform: vWf oder die Antikörper-Fragmente wurden in 0,2 Moll Carbonat- Puffer verdünnt und mit Polystyrolkügelchen gemischt, die in Carbonat-Puffer prä-äquilibriert worden waren. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert, dann von ungebundenem Protein mittels drei Waschgängen in normaler Salzlösung freigewaschen. Die Kügelchen wurden mit 1% (w/v) Rinderserumalbumin in Salzlösung blockiert. Wenn die Kügelchen anfänglich mit den Antikörper-Fragmenten beschichtet wurden, wurde gereinigter vWf anschließend mit den Kügelchen 1 Stunde bei 37 Grad inkubiert, worauf drei Waschgänge in normaler Salzlösung folgten. Der an die Kügelchen gebundene vWf wurde unter Verwendung eines kompetitiven ELISA-Verfahrensquantitativ erfaßt (Brien et al., (1986), Clin. Bioch., Bd. 19, S. 179). An die Kügelchen gebundenes BSA diente als Kontrolle.
"F(ab')&sub2;-eingefangene" vWf-Kügelchen erzeugten eine ähnliche Blutplättchen-Aktivierung (Aggregation und ATP-Freisetzung) wie die, die beobachtet wurde mit gereinigtem vWf, das direkt an die Kügelchen gebunden war. Dies läßt sich in Fig. 1 erkennen. Beide Zubereitungen sind gemeint mit dem Begriff "immobilisierter vWf", wie er hier verwendet wird. "F(ab')&sub2;-eingefangene" vWf-Kügelchen wurden in allen nachfolgenden Beispielen verwendet.
Andere ECM-Proteine oder ihre Fragmente einschließlich Fibronectin, Vitronectin und Thrombospondin können auch an die Kügelchen gebunden werden, und zwar bei alkalischem pH, wie des der Fachmann ohne weiteres verstehen wird.
Derivatisierte Kügelchen (z. B. CNBr-aktivierte, Carbodiimid- oder Hydrazid-aktivierte) können ebenfalls verwendet werden, die eine kovalente Bindung der Proteine an die Kügelchen ermöglichen.
Kügelchen aus anderen Materialien wie Polyacrylnitril können ebenfalls verwendet werden.

Beispiel 2 - Blutplättchen-Aktivierung durch immobilisierten vWf Blutplättchen-Zubereitung:

Venöses Blut wurde von gesunden Freiwilligen genommen und in ein Zehntel Volumen 3,8% Trinatriumcitrat gegeben (nach Einwilligung). Blutplättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch Zentrifugation von Gesamtblut von 150 · g bei 22ºC, 10 Minuten, erhalten. Die verwendeten Zubereitungen hatten eine Blutplättchen-Dichte im Bereich von 200-400 · 10&sup9;/1.

Blutplättchen-Aktivierung:

Die Blutplättchen-Aktivierung wurde ermittelt mittels Bestimmung der Blutplättchen- Aggregation durch Lichttransmissionstechniken oder durch Bestimmung der ATP- Freisetzung.
Die ATP-Freisetzung wurde bestimmt unter Verwendung des Feuerfliegenluziferin- Luziferase-Systems in einem Chronologmodell 560VS Zweikanal-Lumi-Aggregometer, das verbunden ist mit einem Chronolog 810-Datenreduktionssystem, gekauft bei Chronolog Corporation, Haverton, P. A., wobei die vom Hersteller angegebenen Reagenzien und Verfahrensschritte angewendet wurden.
Die Blutplättchen-Aggregation wurde unter Verwendung derselben Maschine bestimmt, wobei wiederum dem von dem Hersteller angegebenen Verfahren gefolgt wurde.
Zur Bestimmung der ATP-Freisetzung wurden 10 ul einer Suspension der Kügelchen (hergestellt wie in Beispiel 1; 1-2 Einheiten vWf/10&sup8; Kügelchen), 240 ul PRP und 15 ul Chrono-Lume-Reagenz in einer zylindrischen silikonisierten Küvette mit einem Innendurchmesser von 6 mm bei 37º gemischt.
Das Gemisch wurde mit einem Magnetrührer bei 500 UpM 10 Minuten lang gerührt, und die ATP-Freisetzung wurde gemessen.
Die Blutplättchen-Aggregation wurde quantitativ erfaßt, indem die Transmission des Lichtes gemessen wurde. In jedem Assay wurden normale Blutplättchen als Kontrolle verwendet, und die beobachtete Aggregation in den Testproben wurde ausgedrückt als Prozentsatz der Lichttransmission, die in der normalen Kontrolle beobachtet wurde, die als 100% angenommen wurde.

Beispiel 3: Wirkung der Größe der Kugelchen

Verschieden große Polystyrolkügelchen wurden erhalten und beschichtet mit vWf durch Antikörper-Einfang, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Klassen der Größe der Kügelchen waren wie folgt: durchschnittlicher Durchmesser der Kügelchen 1,4 um ± 0,1, 2,9 um ± 1,1, 4,2 um ± 0,1 und 5,9 um ± 0,1.
Die Blutplättchen-Aktivierung als Antwort auf die Stimulierung durch diese vWf- beschichteten Kügelchen wurde bestimmt wie beschrieben in Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in den Fig. 2A und 2B dargestellt.
Weitere Beispiele für Antworten auf immobilisierten vWf machten Gebrauch von 4,2 um Kügelchen, sofern es nicht anders angegeben ist.

Beispiel 4

Die Wirkung der Rührgeschwindigkeit auf die Blutplättchen-Aktivierung als Antwort auf immobilisierten vWf an verschieden großen Kügelchen wurde untersucht.
Die Blutplättchen-Aktivierung wurde bestimmt durch Aggregation und ATP-Freisetzung gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 2A und 2B dargestellt. Sowohl Aggregation als auch ATP- Freisetzung stiegen an mit der Rührgeschwindigkeit bis zu einem Maximalwert bei einer Rührgeschwindigkeit um 500 UpM für die Aggregation und um 900 UpM für die ATP- Freisetzung.

Beispiel 5

Die in vitro-Wirkungen von Acetylsalicylsäure (ASS) und dem Thromboxan-Analogon BM 13.177 (Geschenk von Dr. Stegmeier, Boehringer-Mannheim, Deutschland) auf die Blutplättchen-Aggregation als Antwort auf immobilisierten vWf in Verbindung mit einem mechanischen Reiz wurden untersucht. Beide Substanzen inhibieren den Thromboxan- Stoffwechselweg.
Venöses Blut wurde von normalen Spendern erhalten, PRP wurde hergestellt wie in Beispiel 2.
Die Aggregation wurde bestimmt wie in Beispiel 2 beschrieben, mit dem Zusatz von 500 uM ASS oder 450 uM BM 13.177, die mit den Blutplättchen 15 bzw. 10 Minuten vor der Zugabe des immobilisierten vWf prä-inkubiert wurden. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.
Die Wirkungen von ASS und BM13.177 auf die ATP-Freisetzung wurden ebenfalls untersucht.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.

Tabelle 1

Proband TI - Ohne BM13.I77 190 pMol ATP-Freisetzung
Mit BM13.177 30 pMol ATP-Freisetzung
Proband MS - Ohne BM13.177 540 pMol ATP-Freisetzung
Proband LM - Ohne BM13.177 32 pMol ATP-Freisetzung
Proband LM - Ohne BM13.177 335 pMol ATP-Freisetzung
Proband MS - Ohne BM13.177 0 pMol ATP-Freisetzung
Proband MS - Ohne BM13.177 372 pMol ATP-Freisetzung
Mit BM 13.177 545 pMol ATP-Freisetzung
Proband BB - Ohne BM13.177 545 pMol ATP-Freisetzung
Proband Mit BM13.177 32 pMol ATP-Freisetzung

Tabelle 2

Proband LM - Ohne ASS 370 pMol ATP-Freisetzung
Proband MS - Ohne ASS 13 pMol ATP-Freisetzung
Proband MS - Ohne ASS 279 pMol ATP-Freisetzung
Mit ASS 6 pMol ATP-Freisetzung

Beispiel 6 - Zubereitung von immobilisiertem Collagen

Gereinigtes Pepsin-solubilisiertes Rinderdermal-Collagen (Collagen Corporation, Palo Alto, CA) in 0,012 N HCl (pH 2,0) wurde auf einen pH von 3,5 eingestellt und mit Polystyrolkügelchen 16-18 Stunden bei 4ºC und einer Konzentration von 3,0 mg/ml Collagen inkubiert.
Das Protein war nicht-kovalent an die Kügelchen gebunden. Die Kügelchen wurden mehrere Male in Puffer gewaschen, um überschüssiges Protein zu entfernen. Die zurückbleibenden Bindungsstellen wurden blockiert durch Beschichten mit Rinderserumalbumin. Die Kügelchen wurden in HEPES-Puffer pH 7,1 gelagert. Die Lagerbeständigkeit in Carbonat- Puffer beträgt zumindestens 7 Tage.
Wie für vWf beschrieben, kann auch Collagen indirekt an die Kügelchen gebunden werden, und zwar mittels eines Antikörpers oder eines Antikörper-Fragments oder mittels eines Spacer-Moleküls.

Beispiel 7

Die Blutplättchen-Aktivierung als Antwort auf immobilisiertes Collagen, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde bestimmt mittels eines Verfahrens ähnlich dem in Beispiel 2 beschriebenen.
Collagen wurde immobilisiert an Kügelchen verschiedener Größe, und die Wirkung der Größe des Kügelchens auf die Blutplättchen-Antwort wurde untersucht. Die Größe der Kügelchen war wie folgt:
durchschnittlicher Durchmesser der Kügelchen 0,74 um ± 0,1, 2,65 um ± 0,1, 4,22 um ± 0,1 und 5,55 um ± 0,1.
Gewaschene Blutplättchen wurden aus normalem venösen Blut nach Zugabe von Apyrase und Prostacyclin, wie beschrieben von Griffith et al., (1991), Blood, Bd. 78, S. 1753, zubereitet.
Die Blutplättchen wurden mit immobilisiertem Collagen 5 Minuten lang bei 900 UpM gerührt und die Aggregation und ATP-Freisetzung wie in Beispiel 2 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.
Die Blutplättchen-Aggregation wurde stimuliert durch Collagen, das an Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,74 um gebunden war, und nahm zu mit der Größe der Kügelchen bis zu einem Durchmesser von 4,22 um. Bei größeren Größen der Kügelchen nahm die Blutplättchen-Aggregation wieder scharf ab.

Beispiel 8

Die Wirkung der Rührgeschwindigkeit auf die Blutplättchen-Aggregation und ATP- Freisetzung als Antwort auf immobilisiertes Collagen wurde untersucht.
Collagen wurde immobilisiert an Kügelchen mit einem Durchmesser von 2,65 um, wie es in Beispiel 6 beschrieben ist. Die Blutplättchen-Antwort wurde wie in Beispiel 7 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt.

Beispiel 9

Die Wirkung des Thromboxan-Inhibitors BM13.177 auf die Blutplättchen-Aktivierung mittels immobilisiertem Collagen wurde untersucht.
Die Blutplättchen wurden prä-inkubiert mit 450 uM BM13.177, ehe immobilisiertes Collagen (2,65 um Kügelchen) zugegeben wurde. Die Blutplättchen-Aggregation wurde wie in Beispiel 7 bestimmt und die Ergebnisse sind dargestellt in Fig. 6.

Beispiel 10

Venöses Blut wurde von 39 gesunden erwachsenen Freiwilligen erhalten. Das Blutplättchenreiche Plasma (PRP) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
Die Blutplättchen-Aktivierung (ATP-Freisetzung) als Antwort auf immobilisierten vWf wurde bestimmt durch das Verfahren von Beispiel 2, wobei 4,2 um Kügelchen verwendet wurden, die direkt mit vWf beschichtet waren. Es wurde 5 Minuten lang bei 500 UpM gerührt.
Der Bereich der Werte, die bei diesen gesunden Probanden gefunden wurden, erstreckte sich von 146 bis 923 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen (Durchschnitt ± 1 S. A. = 433 ± 186 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen. Der Durchschnittswert für die Aggregation betrug 61,97 ± 13,46 (S. A.).

Beispiel 11

Achtzehn Patienten, ausgewählt aufgrund ihrer Blutungsunregelmäßigkeiten unbestimmter Herkunft, wurden einer Reihe von Tests auf Blutplättchen-Funktion unterworfen. Die meisten dieser Patienten hatte eine "leichte Quetschung" (easy bruising).
Die folgenden herkömmlichen Tests zur Beurteilung der Blutungsunregelmäßigkeiten wurden verwendet:
1. Blutungszeit (B. T.): Normalbereich 0-8 Minuten
2. Blutplättchen-Aggregation als Antwort auf lösliche Agonisten (Blutplättchen- Aggregation):
Lösliche Agonisten, von denen bekannt ist, daß sie Blutplättchen-Aggregation bei normalen Probanden induzieren, wurden unter Rühren zu Blutplättchen-reichem Plasma (PRP) gegeben. Abnormale Aggregationsmuster (d. h. Rate und Ausmaß der Blutplättchen-Verklumpung) zeigen eine Blutplättchen-Dysfunktion an. Verwendete Agonisten waren Adrenalin (1 uM, 5 uM, 50 uM), ADP (1 uM, 2 uM, 4 uM, 10 uM), Collagen (1 ug/ml, 5 ug/ml), Arachidonsäure (500 uM) und Ristocetin (0,5 mg/ml, 1,2 ug/ml, 1,5 ug/ml). Die Verfahren waren wie die von Howard et al. (1971), Thromb. Diath. Hemrrh., Bd. 26, S. 362; Born (1962), J. Physiol., Bd. 162, S. 67 und Weiss (1973), J. Clin. Invest., Bd. 52, S. 2697, beschriebenen Verfahren.
3. vWf-Konzentration (vWf): Die vWf-Konzentration wurde immunologisch nach dem Verfahren von Brien et al. (1986), Clin. Biochem., Bd. 19, S. 179, bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Einheiten pro ml Plasma ausgedrückt, wobei die willkürliche Einheit definiert wurde als die Aktivität, die in 1 ml normalem Plasma gefunden wurde. Normaler Bereich 0,5-1,5 U/ml.
4. Biologische Funktion von vWf (RCof): Die Beurteilung der biologischen Funktion von vWf erfolgte unter Verwendung des Ristocetin-Cofaktors (RCoF)-Assays nach MacFarlane et al., (1975), Thromb. Daith. Hem., Bd. 34, S. 306. Einheiten und Normalbereich wie bei vWf.
5. Faktor VIII-Komplex (FVIII):
Der Faktor VIII-Komplex besteht aus einem kleinen, die Prokoagulation verursachenden Molekül (FVIII:C), gebunden an ein großes Molekül (von Willebrarid-Faktor) (vWf). FVIII:C wurde quantitativ erfaßt auf der Basis eines Gerinnungsassays, der die biologische Funktion anzeigt und nicht die absolute Menge an Protein im Blut ("Human blood coagulation, hemostasis and thrombosis", Biggs, R (ed), (1972)) Einheiten und Normalbereich wie bei vWf.
6. Anzahl der Blutplättchen: Normalbereich 140-340 · 10&sup9;/1
7. Prothrombin-Zeit (PT): Die Gerinnungszeit wurde bestimmt und ausgedrückt als International Normalised Ratio (INR). Normalbereich 0,8-1,2 INR
8. Aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (aPTT): wurde bestimmt wie beschrieben in Cartwright, Diagnostic Lab. Hematology, 3. Ausgabe, S. 159 und Proctor et al., (1961), Amer. J. Clin. Path., Bd. 36, S. 212. Normalbereich 25,0-36,0 Sekunden.
9. Blutplättchen-Aktivierung (ATP-Freisetzung) als Antwort auf immobilisierten vWf: bestimmt an Blutplättchen-reichem Plasma, wie in Beispiel 10 beschrieben. Die Ergebnisse der Untersuchungen 1 bis 8 sind in Tabelle 3 dargestellt. Die ATP- Freisetzung als Antwort auf immobilisierten vWf ist in Tabelle 4 dargestellt. Der durchschnittliche Wert für die Aggregation betrug 38,24 ± 17,58 (S. A.) Tabelle 3

TABELLE 4

J. A. 13,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
A. P. 0,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
N. D. 13,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
T. L. 719,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
T. W.* 43,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
K. F. 9,2 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
A. P. 17,8 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
D. B.* 127,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
B. P. 11,6 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
W. C.* 75,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
D. C. 0,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
G. B.* 206,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
H. A. 385,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
K. E. 0,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
D. B. 41,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
E. A. 0,0 pMol ATP/ Blutplättchen
K. E. 0,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
F. W. 0,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
T. M.** 333,0 pMol ATP/10&sup8; Blutplättchen
* Zeit der Verzögerung bis zur Blutplättchen-Aktivierung signifikant verlängert im Vergleich zur Kontrolle.
* * Gesunder Proband als Kontrolle eingeschlossen.

Beispiel 12

Die 39 normalen Blutplättchen-Zubereitungen aus Beispiel 10 und die achtzehn Zubereitungen von kranken Probanden aus Beispiel 11 wurden verwendet, die Blutplättchen-Aktivierung (ATP-Freisetzung) als Antwort auf Rühren mit immobilisiertem vWf für verschiedene Zeitdauern zu untersuchen. Dies geschah nach dem Verfahren von Beispiel 10. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt.

Beispiel 13

Venöses Blut wurde von drei gesunden Freiwilligen genommen, sowohl vor als auch zu verschiedenen Zeitintervallen nach der Einnahme von Aspirin (ASS).
PRP wurde hergestellt und die ATP-Freisetzung als Antwort auf immobilisierten vWf wurde wie in Beispiel 10 beschrieben bestimmt, außer daß 10 Minuten lang gerührt wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

TABELLE 5

Proband LP - Vor der Aspirin-Einnahme 217 pMol ATP-Freisetzung
2 Tage nach der Aspirin-Einnahme 47 pMol ATP-Freisetzung
Tage nach der Aspirin-Einnahme 385 pMol ATP-Freisetzung
*325 mg ASS eingenommen
Proband MS - Vor der Aspirin-Einnahme 303 pMol ATP-Freisetzung
12 Stunden nach der Aspirin-Einnahme 6 pMol ATP-Freisetzung
3 Tage nach der Aspirin-Einnahme 30 pMol ATP-Freisetzung
14 Tage nach der Aspirin-Einnahme 340 pMol ATP-Freisetzung
*325 mg ASS eingenommen
Proband LM - Vor der Aspirin-Einnahme 340 pMol ATP-Freisetzung
12 Stunden nach der Aspirin-Einnahme 3 pMol ATP-Freisetzung
8 Tage nach der Aspirin-Einnahme 440 pMol ATP-Freisetzung
*325 mg ASS eingenommen
Die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf die Merkmale der hier beschriebenen Ausführungsformen, sondern schließt alle Variationen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Ansprüche ein.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der vollständigen Blutplättchenaktivierung in Reaktion auf den von Willebrand-Faktor (vwf), umfassend

(a) Gewinnung einer Blutplättchenprobe;

(b) Inkontaktbringen der Blutplättchen in Suspension mit vWf oder einem wirksamen Fragment oder Analogon davon, immobilisiert auf einem partikulären festen Träger, während auf die Blutplättchen ein wirksamer mechanischer Reiz für einen Zeitraum ausgeübt wird, der wirksam ist, um die Aktivierung der Blutplättchen zu erreichen;

(c) Bestimmung der erzeugten vollständigen Blutplättchenaktivierung.

2. Verfahren zur Beurteilung der Blutplättchenfunktion in Säugern durch Bestimmung der in vitro-Blutplättchenaktivierung in Reaktion auf den von Willebrand-Faktor, umfassend

(a) Gewinnung einer Blutplättchenprobe von dem Säuger;

(b) Bestimmung eines Blutplättchenaktivierungswertes für die Blutplättchenprobe durch das Verfahren nach Anspruch 1;

(c) Beurteilung der Blutplättchenfunktion des Säugers, indem der bestimmte Blutplättchenaktivierunswert der Probe mit Blutplättchenaktivierungswerten, die für Kontrollproben bestimmt wurden, verglichen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Säuger ein Mensch ist, und die Blutplättchen als blutplättchenreiches Plasma bereitgestellt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei ein für die Probe bestimmter niedrigerer Blutplättchenaktivierungswert im Vergleich mit den Blutplättchenaktivierungswerten, die für Kontrollproben ermittelt wurden, bei dem Menschen eine mit einem Blutplättchenaktivierungsdefekt verbundene Blutungsunregelmässigkeit anzeigt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, wobei der immobilisierte vWf direkt oder indirekt an Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser im Bereich von ungefähr 2,9 um bis ungefähr 5,9 um gebundenen vwf umfaßt, der wirksame mechanische Reiz durch Rühren der Blutplättchen in Kontakt mit dem immobilisierten vWf ausgeübt wird und die Blutplättchenaktivierung durch Messung der Aggregation oder ATP-Freisetzung bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Rühren bei einer Geschwindigkeit im Bereich von ungefähr 500 UpM bis ungefähr 900 UpM für einen Zeitraum von ungefähr 3 Minuten bis ungefähr 10 Minuten erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Rühren bei einer Geschwindigkeit von ungefähr 500 UpM für ungefähr 5 Minuten erfolgt und der Kügelchendurchmesser ungefähr 4,2 um beträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Blutplättchenaktivierung bestimmt wird durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Messung von second Messengern, wie beispielsweise dem intrazellulären Calciumspiegel oder dem intrazellulären pH, Messung der Produktion aktivierungsabhängiger Metabolite, wie beispielsweise die Freisetzung von Thromboxan B2 oder Arachidonsäure, und Messung der aktivierungsabhängigen Phosphorylierung von Blutplättchenproteinen.

9. Verfahren zur Überwachung des Behandlungserfolges bei einem Menschen während der Behandlung mit einem Mittel, welches die Blutplättchenaktivierung beeinflußt, umfassend

(a) Gewinnung einer Blutplättchenprobe von dem Menschen zu ausgewählten Zeiten während der Behandlung;

(b) Bestimmung des Blutplättchenaktivierungswertes für jede Blutplättchenprobe nach dem Verfahren nach Anspruch 1;

(c) Überwachung der Behandlungswirksamkeit durch Vergleich der ermittelten Blutplättchenaktivierungswerte der Proben mit vorbestimmten Kriterien, die einen ausgewählten Wert oder Bereich von Werten der Blutaktivierung definieren, der bei der Behandlung erreicht werden soll.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Mittel ein Anti- Thrombosemittel ist.