TECHNISCHES GEBIET
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Die Erfindung betrifft die Isolierung eines Genes, das die Resistenz sowohl gegen einen
Pilz und ein Pilzerkrankungstoxin kontrolliert, und dessen Verwendung als selektierbarer
Marker.
STAND DER TECHNIK
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Krankheitsresistenzgene werden als Mendelsche Faktoren definiert, die mit der
Resistenzeigenschaft cosegregieren. Das HM1-Gen, das die Resistenz gegen Cochliobolus carbonum
Nelson Rasse 1 kontrolliert, war eines der ersten beschriebenen Krankheitsresistenzgene. Die
durch C. carbonum Rasse 1 verursachte Erkrankung kann verheerend sein, und kann aufgrund
von Pflanzensterben und Kornschimmel zu Ernteverlusten von 80% oder mehr führen. Das
dominante Allel, Hm1, und der duplizierte Faktor Hm2 sind die einzigen Krankheitsresistenzgene,
von denen bekannt ist, daß sie mit hoher Häufigkeit in Maiskeimzellenplasma fixiert sind.
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Seit der Entdeckung eines rassenspezifischen Kompatibilitätsfaktors, der von dem Pilz
gebildet wird, war die von C. carbonum Rasse 1 hervorgerufene Erkrankung das Ziel genauer
Untersuchungen. Dieser Kompatibilitätsfaktor ermöglicht es dem Pilz, bestimmte Maisgenotypen
zu infizieren, die ansonsten resistent wären. Die Rolle von HM1 bei der Erzeugung der Resistenz
gegenüber dem Pilz ist eine Funktion der Fähigkeit von HM1, eine erniedrigte Sensitivität
gegenüber dem Kompatibilitätsfaktor hervorzurufen. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das
Vorhandensein des Kompatibilitätsfaktors die gleiche Rassenspezifität (für hm1/hm1-Mais) auf
das Weizenpathogen Cochliobolus victoriae überträgt. Die Struktur dieses Kompatibilitätsfaktors,
HC-Toxin, ist bekannt, jedoch muß die Wirkungsweise noch aufgeklärt werden. Jüngst wurde in
Maisextrakten ein Enzym identifiziert, das das HC-Toxin inaktiviert. Das Enzym, die HC-
Toxinreduktase (HCTR), ist lediglich in Extrakten von resistenten (Hm1) Genotypen
nachweisbar: Somit wurde die HCTR-Aktivität als biochemischer Phänotyp von Hm1 nachgewiesen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Es wurde nun nachgewiesen, daß das Hm1-Gen in Verbindung mit HC-Toxin in einem
selektierbaren Markersystem zur Verwendung bei der Maistransformation verwendet werden
kann. Wenn das klonierte Gen mit geeigneten regulatorischen Sequenzen zur Expression in
Pflanzenzellen verbunden wird, und in Maiszellen zusammen mit einer anderen quantitativen
oder qualitativen Eigenschaft, die nichtselektierbar ist, cotransformiert wird, so verleiht es den
Transformanten eine Resistenz gegen HC-Toxin durch die Produktion von HCTR. Die Zellen
können auf Medium, das das isolierte HC-Toxin enthält, weiterwachsen. Nichttransformierte
Zellen exprimieren das HCTR nicht und werden durch das vom Pathogen erzeugte Toxin schnell
getötet. Der Endeffekt ist eine Zellkultur, die lediglich transformierte Zellen enthält, die dann
mittels bekannter Verfahren regeneriert werden können, um transformierte Schößlinge und sogar
ganze Pflanzen zu bilden.
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Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Pflanzentransformation
unter Verwendung von C. carbonum oder dem von C. carbonum hergestellten Toxin als
phytotoxischem Marker bereit, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:
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a) Kultivieren von Zellen oder Geweben von einer ausgewählten Zielpflanze,
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b) Einführen wenigstens einer Kopie einer Expressionskassette, die eine DNA-Sequenz
enthält, die für im wesentlichen ausschließlich das Hm1-Gen von Mais codiert, und die
funktionell nvt pflanzenregulatorischen Sequenzen, die die Expression der DNA-Sequenz in
Pflanzenzellen bewirkt, verbunden ist, in die Zell- oder Gewebekultur,
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c) Einführen von C. carbonum oder dem Toxin, das es herstellt, in die Zell- oder
Gewebekultur und
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d) Identifizieren transformierter Zellen als überlebende Zellen in der Zell- oder
Gewebekultur.
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Vorzugsweise besitzt in der Expressionskassette die DNA-Sequenz, die im wesentlichen
ausschließlich für das Hm1-Gen von Mais codiert, eine wenigstens 90%ige translationelle
Homologie zu der Sequenz von SEQUENZ I. D. No. 1 oder von SEQUENZ I. D. No. 2.
Genetisches Material und Fortpflanzung
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Die in dieser Arbeit verwendeten Mutatorvorratsstämme wurden von Dr. D. Robertson,
Iowa State University, erhalten. Die verwendeten Ac/Ds-Stämme wurden von D. I. Greenblatt,
University of Connecticut, erhalten. Das Verfahren zur HM1-Mutantenisolation wurde auf eine
Art und Weise durchgeführt, die zuvor von einem der Erfinder veröffentlicht wurde [S. P. Briggs,
Curr. Top. Plant Biochem. Physiol., 6: 59 (1987)].
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Inzucht-HM1-Allel Bezeichnungen sind: Pr, hm1-1; K61, hm1-2; P8, Hm1-A; Pr1, Hm1-
Pr1; B79, Hm1-B79; 4Co63, Hm1-4CO63; Pioneer PHV12, Hm1-PHV12.
Experimenteller Ansatz
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Das Transposonanheften ist als ein verläßliches Werkzeug zur Isolierung von Genen aus
Mais bekannt. Die Grundlehre der Transposonanheftung ist, daß DNA-Neuanordnungen (d. h.
Insertionen oder Exzisionen); die gleichzeitig mit genetischen (phänotypischen) Änderungen
auftreten, eine Kausalbeziehung definieren, wodurch die neuangeordnete DNA als verändertes
Gen identifiziert wird. Als Identitätsbeweis werden mehrere unabhängige Ereignisse dieser Art
angenommen. Wie im folgenden beschrieben, haben die Erfinder beobachtet, daß 5 mutante
Allele von HM1 mit Insertionen innerhalb einer transkribierten Region assoziiert sind (hm1-
656::Mu1), hm1-1369::Mu3, Hm1-1062::dHbr, hm1-2355 hm1-1040::Spm), und 1
Deletionsallel Def(HM1)-1790 ist mit dem Verlust des transkribierten Bereiches assoziiert. Schließlich
bildete lediglich das Wildtyp-Allel (Hm1-Pr1) eine 1,3 kb mRNA.
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Die Mutatorfamilie als transponierbares Element ist zur Erzeugung von Hinmutationen
besonders effektiv. Eine Keimzellenreversion von Mutanten zurück zum Wildtyp ist mit
Muta
tor-induzierten Allelen selten. Somatische Reversion wurde beobachtet, jedoch können die
kleinen somatischen Sektoren, die für Mutator typisch sind, nicht für Eigenschaften nachgewiesen
werden, die nicht zellautonom oder komplex sind, wie z. B. Krankheitsläsionsentwicklung.
Daher wurde zum Erhalten mehrfacher genetischer Ereignisse, die gleichzeitig mit Neuanordnungen
von HM1 auftreten, eine Strategie verwendet, die eher auf unabhängigen Hinmutationen als auf
Reversionen basiert.
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Um eine Cosegregation zwischen HM1 und einem Restriktionsfragment zu identifizieren,
wurde die Segregationsnachkommenschaft zuerst durch Untersuchung ihrer DNA auf Southern
blots klassifiziert. Die Blots wurden mit Sonden für RFLP-Orte, die den Ort flankieren,
hybridisiert; PIO200644 und PIO200044 (erhalten von D. Grant, Pioneer HI-Bred International, Inc.)
liegen 5 cM proximal bzw. distal von HM1 (2; nichtveröffentlichte Beobachtungen). Lediglich
Nachkommenschaft, die Allele an beiden Loci von dem gleichen Elternteil ererbten, wurden für
die Analyse verwendet. Dieser Ansatz ermöglichte den Nachweis von Nachkommenschaft, die
den 10 cM-Block von Chromosom 1, gebunden von den RFLP-Orten ererbten. Durch
Zusammengruppierung der Nachkommenschaft, die entweder das mutante Allel, oder das rezessive
Testallel, mit welchem das mutante Allel gepaart wurde, ererbte, gefolgt von einem Vergleich
der zwei Klassen miteinander, wurden Restriktionsfragmente identifiziert, die einer
Nachkommenschaftsklasse gemein und bei der anderen abwesend waren. Dieses Verfahren führte zum
Nachweis einer Bindung zwischen Restriktionsfragmenten und dem 10 cM-Block der HM1
enthielt.
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Um in direkter Weise die Bindung zwischen HM1 und einem Restriktionsfragment zu
bestimmen, wurden verbundene Fragmente geclont und verwendet, um DNA-
Hybridisierungssonden herzustellen. Die Sonden wurden dann mit einem Southern blot von
DNA aus 60 Nachkommen der Rückkreuzung K61/Pr1 X K61 hybridisiert. Die
Rückkreuzungsnachkommen wurden im Hinblick auf das Ererben der HM1-Allele durch Inokulation mit
Conidien des C. carbonum Rasse-1-Stammes SB111, und in Hinblick auf Ererben der alternierenden
Allele, die durch die DNA-Sonden nachgewiesen wurden, durchgemustert. Ein Vergleich der
Vererbungsmuster ergaben die Kopplungsbeziehungen zwischen den Sonden und HM1.
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Die oben beschriebenen RFLP-Orte und ein RFLP-Ort, der durch die Sonde NPI429
nachgewiesen wird, wurden verwendet, um den Vorläufer/ Vorfahren der mutanten Allele zu
identifizieren. NPI429 wurde von T. Helentjaris, Native Plants, Inc. erhalten.
Isolierung von DNA und Blothybridisierung
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Gesamt-DNA aus dem Blattgewebe von Mais; Sorghum (Pioneer Inzucht P285) und
Coix (Lachrymae jobi) sowie Sämlingsgewebe von Arabidopsis thaliana L. (Landsberg erecta?)
wurden durch das wie in S. L. Dellaporta, J. Wood, J. B. Hicks, Plant Mol Biol Rep, 1, 18
(1983) beschriebene Harnstoffextraktionsverfahren isoliert. Die Southern blots wurden, wie von
Athma et al. Genetics 128, 163 (1991) beschrieben, hergestellt. Zur RFLP-Analyse wurde die
DNA auf Nylonmembranen (MSI von Fisher) transferiert, und die Hybridisierungen wurden wie
oben beschrieben, jedoch ohne Zugabe von Formamid, durchgeführt. Sonden wurden aus
gelgereinigten DNA Fragmenten, die durch Randompriming (zufälliges Primen) (Amersham) markiert
wurden, hergestellt. Die Mu1-spezifischen Sonden waren ein internes 650 bp Aval/BstEII-
Fragment, das aus pA/B5 isoliert wurde; das Plasmid wurde von L. Taylor, Stanford University,
bereitgestellt. Die Mu3-spezifische Sonde war das interne HindIII/XbaI-Fragment eines Clones
der von V. Chandler, University of Oregon, erhalten wurde. Die Spm-Sonden waren pBx1 und
pXS2.3, die von K. Cone, Brookhaven National Laboratory, erhalten wurden.
Isolation von RNA und Northern Blot-Experimente
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Gesamt-RNA von 5 bis 6 Tage alten etiolierten Sämlingen wurde mittels des Guanidin-
Thiocyanat-Verfahrens [P. Chomczynski und N. Sacchi, Anal Biochem 162, 156 (1987)] isoliert.
Poly(A) + RNA wurde unter Verwendung des polyATtract mRNA Isolationssystems von
Promega angereichert. Proben (ungefähr 15 ug) poly(A) + RNA wurden unter Verwendung von
Formaldehyd denaturiert, in einem 1,3% Agarosegel fraktioniert und auf Hybond-N mittels
Standardverfahren geblottet. Die DNA-Sonden wurden durch Randompriming radioaktiv markiert, und
die Blots wurden hybridisiert und gewaschen, wie beschrieben.
Genomisches Clonieren
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Aus von homozygoten mutanten Sämlingen isolierte DNA wurde mit SstI oder XhoI
gespalten, und die geeigneten DNA Fragmente (die aus den Southern blots ermittelt wurden)
wurden durch präparative Gelelektrophorese und Elektroelution in Dialyseröhrchen gereinigt.
Diese gereinigte DNA wurde mit vorhybridisierten SstI oder XhoI-geschnittenen Armen des
bakteriophagen Vektors λ sep6-lac5, der von R. Martienssen, Cold Spring Harbor Laboratory,
erhalten wurde, ligiert. Das Verpacken in Gigapack Gold (Stratagene) und das Durchmustern
der Genbanken wurde nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Alle Clone wurden in
Bluescript SK+ (Stratagene) subcloniert und im SURE-Stamm (Stratagene) von E. coli gehalten.
PCR (Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzanalyse)
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Zur Analyse von DNA aus der resistenten Nachkommenschaft der hm1-656::Mu1/hm1-
1369::Mu3-Heterozygote, wurden Primer, die zu Sequenzen auf jeder Seite der Insertionsstellen
homolog waren, zur PCR-Amplifikation verwendet. Die Primersequenzen waren: 5' CTG CTC
ATG ACT CAT ATC AGG CGG TAG C 3' UND 5' GAC CAG CCG ACG CAG CAG CCC
CGC CTT C 3'. Die PCR-Bedingungen waren wie von Perkin Elmer-Cetus beschrieben, mit der
Ausnahme, daß die Reaktionen in 20% Glycerin durchgeführt wurden. Die Reaktionen wurden
auf 94ºC während 3 Minuten erhitzt, dann wurden 40 Zyklen mit 1 min bei 94ºC, 2 min bei 65ºC
und 2 min bei 72ºC durchgeführt; zuletzt wurde während 15 Minuten bei 72ºC inkubiert. Die
gelgereinigten PCR-Produkte wurden erneut amplifiziert und unter Verwendung synthetischer
Sequenzierprimer direkt sequenziert.
HM1-Mutanten, die von Mutatorstämmen abgeleitet sind
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Mehrere mutante Allele von HM1 wurden aus den Mutatorelementstämmen gewonnen, 4
von diesen wurden für eine weitere Untersuchung ausgewählt. Selektionskriterien beinhalteten
DNA-Hybridisierungsdaten durch welche Pollenkontamination als Quelle der mutanten Allele
ausgeschlossen wurde und eine niedrige Frequenz empfindlicher Nachkommen, die in einer
Familie auftauchten. RFLP-Loci wurden verwendet, um zwischen den mutanten Allelen und den
Standard-rezessiven Allelen, mit denen sie gepaart worden waren, zu unterscheiden.
Segregierende Nachkommenschaft wurde auf das Ererben mutanter Allele unter Verwendung der RFLP-
Sonden klassifiziert.
hm1-656::Mu1
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Nachkommenschaft, die durch Befruchtung von Pflanzen des Genotyps Y wx g11 Hm1-
B79-Mutator (als 81-82-9537 Mu² per se von D. Robertson bezeichnet) mit Pollen von dem
Hybrid K61/Pr erzeugt worden waren, führten zu zwei empfindlichen Pflanzen von 253
Nachkommen. Es wurde gefunden, daß beide empfindlichen Pflanzen das mutante Allel, hm1-
656::Mu1 trugen, was darauf hinweist, daß sie als Ergebnis eines kleinen somatischen Sektors
auf der Ähre entstanden sind. Pollen von beiden Pflanzen wurden verwendet, um Ähren der
Pioneer Inzucht PHV12 zu befruchten.
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Als die Nachkommenschaft der hm1-656::Mu1/hm1-1 · Hm1-PHV12/Hm1-PHV12-
Kreuzung nach der Vererbung des hm1-656::Mu1-Alleles (unter Verwendung der RFLP-Loci)
klassifiziert wurden, wurde ein Hybridisierungsmuster mit der Sonden-DNA von dem Mu1-
Element beobachtet. Ein 3,2 kb SstI-Fragment cosegregierte mit dem hm1-656::Mu1-Allel.
Keine Ausnahmen hierzu wurden in einer Probe von 92 Nachkommen gefunden. Das 3.2 kb-
Fragment, das Mu1 plus einige flankierende DNA enthielt, wurde aus einem Gel ausgeschnitten,
in die SstI-Spaltstelle von λ sep6-lac5 in Bluescript SK+ subcloniert, cloniert, durch
Restriktionsenzyme kartiert und verwendet, um eine Sonde von der DNA, die die Mu1-Insertion
flankiert, herzustellen (als *656 bezeichnet).
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Die *656-Sonde wurde mit einem Southern blot von DNA von 4 verschiedenen,
homozygoten Mutanten hybridisiert. Die Klassifikation unter Verwendung der RFLP-Loci zeigte, daß
jedes der mutanten Allele von dem B79-Inzuchtelternteil 1-B79 abgeleitet war. Die
Beobachtung von Polymorphismen zeigte, daß eine DNA-Neuordnung in dem geclonten Bereich
gleichzeitig mit der Erzeugung der Mutationen stattfand. Mit dem verwendeten Enzym bildete
hm1-1062::dHbr ein dem B79 identisches Fragment. Jedoch können unter Verwendung anderer
Enzyme zwischen hm1-1062::dHbr und B79 Polymorphismen nachgewiesen werden.
hm1-1369::Mu3
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Das hm1-1369::Mu3-Allel wurde als einzelne empfängliche Pflanze aus 230
Nachkommen gewonnen. Die Nachkommen wurden durch Bestäubung von Pflanzen des Genotyps y wx
g11 Hm1-B-79-Mutator (von Dr. Robertson als 81-82-9537 Mu² per se bezeichnet) mit dem
Hybrid K61/kPr (hm1-2/hm1-1) hergestellt.
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Die Heterozygote hm1-1369::Mu3/hm1-2 war selbstbestäubend, und die Nachkommen
wurden unter Verwendung der RFLP-Loci klassifiziert. Die Hybridisierung einer Mu3-Sonde
ergab eine cosegregierende Bande. Ein 4,6 kb SstI-Fragment cosegregierte mit dem hm1-
1369::Mu3-Allel. Die Signalintensitätsdifferenz, die eine Folge von zwei Alleldosen bei
Homozygotie ist, ermöglichte es, hm1-1369::Mu3 als codominanten Marker durchzumustern, was die
Kartierungsauflösung erhöhte. Es wurden in einer Probe von 60 Nachkommen keine
Rekombinanten gefunden. Das 4,6 kb-Fragment, das Mu3 plus flankierende DNA enthielt, wurde aus
dem GeI ausgeschnitten und in die SstI-Spaltstelle von λ sep6-lac5, in Bluescript SK+
subcloniert, cloniert, restriktionskartiert, und verwendet, um eine Sonde (als · 1369 bezeichnet) aus der
DNA, die die Mu3-Insertion flankiert, herzustellen.
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Die *1369-Sonde wies die gleichen Polymorphismen nach, die durch die *656-Sonde
ermittelt wurden, was darauf hinweist, daß die Mu1- und Mu3-Elemente in das gleiche
Restriktionsfragment insertiert worden waren. Dieser Schluß wurde durch den Vergleich der
Restriktionskarten der zwei Clone bestätigt. Mit SstI wurde eine Anomalie ermittelt, bei welcher die
hm1-656::Mu1-DNA ein 3,2 kb Fragment ergab, wenn mit der *656-Sonde hybridisiert wurde,
jedoch ein 1,0 kb-Fragment, wenn die *1369-Sonde verwendet wurde; mit anderen Enzymen
wurde diese Anomalie nicht nachgewiesen. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß das Mu1-
Element eine SstI-Spaltstelle durch Insertion in HM1 erzeugt hatte.
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Es wurde eine Anstrengung unternommen, um resistente Nachkommen von den Mu-
Allelen zu gewinnen. Die Heterozygote hm1-656::Mu1/hm1-1369::Mu3 wurde unter
Verwendung von Pollen von der Inzucht Pr (hm1-1) befruchtet. Von 500 Nachkommen wurde 1
resistente Pflanze gewonnen. Die Untersuchung der DNA von 10 empfindlichen Geschwistern der
resistenten Pflanze bestätigte, daß alle 3 Elternallele, wie erwartet, segregierten. Die
Untersuchung von DNA von der resistenten Pflanze ergab ein Fragment von B79 mit der Größe des
Vorfahren (als Hm1-B79R bezeichnet) sowie das hm1-1-Allel von Pr. Diese Pflanze war
selbstbestäubend. DNA von diesen Nachkommen wurde unter Verwendung der Sonden *1369,
PIO200644 PIO200044 und NPI429 untersucht. Die gleiche Nachkommenschaft wurde im
Hinblick auf Empfindlichkeit gegenüber einer Infektion durch Inoculieren mit SB111 getestet.
Die Ergebnisse bestätigten, daß durch das Hm1-B79R-Allel Resistenz verliehen wurde. Es
wurde homozygote Hm1-B79R-Nachkommenschaft identifiziert. Die Insertionsstelle von Mu1/Mu3
wurde durch PCR amplifiziert und sequenziert; es wurde zwischen dem neuen Allel und dem
B79-Vorfahren kein Unterschied beobachtet.
hm1-1062::dHbr
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Nachkommenschaft, die durch Bestäubung des Hybrids K61/Pr (hm1-2/hm1-1) mit
Pflanzen des Genotyps y wx g11 Hm1-B79-Mutators (von Dr. Robertson als 81-82-9539 Mu²
per se bezeichnet) erzeugt wurde, führte zum Erhalten des hm1-1062::dHbr-Allels aus 1 von 2
empfindlichen Pflanzen aus 483 Nachkommen.
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Durch Hybridisierung mit Sonden, die spezifisch für Mu1, Mu3, Mu7 und Muß sind,
konnte kein Fragment identifiziert werden, das mit hm1-1062::dHbr cosegregierte. Durch die
Hybridisierung mit der *656-Sonde wurde ein Polymorphismus zwischen hm1-1062::dHbr und
dem Vorfahrenallel Hm1-B79 nachgewiesen. Die Erfinder clonierten ein 3,1 kb XhoI-Fragment
aus der hm1-1062::dHbr-Mutante in λ sep6-lac5, unter Verwendung von *656 als Sonde. Die
Restriktionskartierung bestätigte die B79-Struktur mit der Ausnahme einer kleinen (etwa 400
bp) Insertion in das SstI-XhoI-Fragment am 3'-Ende des Clones. Die Identität dieses
Insertionselementes wurde nicht bestimmt, es fehlt diesem jedoch eine Homologie mit Ac-, Ds1-, Ds2- und
Spm/En-internen Sequenzsonden und mit der Mu-terminalen invertierten Wiederholung.
Def(HM1-1790)
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Nachkommen, die durch Bestäubung von Pflanzen des Genotyps y wx g11 Hm1-B79-
Mutator (von Dr. Robertson als 81-82-9536 Mu&sub2; per se bezeichnet) mit dem Hybrid K61/Pr
(hm1-2/hm1-1) erzeugt wurden, führten zur Gewinnung des Def(HM1)-1790-Allels aus einer
einzelnen empfindlichen Pflanze von 345 Nachkommen.
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Das Def(HM1)-1790-1790-Allel zeigt ein aberrantes Transmissionsmuster. Eine Def(HM1)-
1790/hm1-1-Heterozygote war selbstbestäubend und die Nachkommenschaft wurde unter
Verwendung der flankierenden RFLP-Loci charakterisiert. Es wurde gefunden, daß lediglich 14 der
56 Nachkommen das Def(HM1)-1790-Chromosom ererbt hatten. Wurde eine Heterozygote
unter Verwendung von Pollen von einem Wildtypstamm (SB509) befruchtet, ererbten 8 von 25
Nachkommen das Def(HM1)-1790-Chromosom. Wurde die Heterozygote als die Pollenquelle
verwendet, um einen Wildtypinzuchtstamm (W23) zu befruchten, ererbte keine der 32
Nachkommen das Def(HM1)-1790-Chromosom. Die Ergebnisse zeigen, daß das Def(HM1)-1790-
Allel (oder Chromosom) nicht durch Pollen übertragen wurde und lediglich schwach durch das
Ei übertragen wurde. Ein derartiges Transmissionsmuster ist für eine chromosomale Defizienz
typisch. Die *1369-Sonde hybridisierte nicht mit DNA aus dem Def(HM1)-1790-Allel, was das
Vorhandensein einer Deletion bestätigt, und zeigt, daß die clonierte Region innerhalb der
Deletion liegt. Testkreuzungen mit br2 das in einem Abstand von 0,1 cM von HM1 liegt, führte
lediglich zu Wildtypnachkommen. In ähnlicher Weise wiesen sowohl PIO200644 als auch PIO200044
zwei Allele in der Nachkommenschaft, die Def(HM1)-1790 ererbte; nach. Deshalb kann die
Deletion nicht mehr als 5 cM des Chromosoms umfassen, und dies ist an br2 und einen der RFLP-
Loci gebunden.
Eine HM1-Mutante, die von einem Ac/Ds-Stamm abgeleitet ist
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Ein Allel, Hm1-1040::Spm.. wurde von dem Inzuchtstamm 4Co63 gewonnen; das P-VV-
Allel (Ac das in das P1-Gen insertiert ist) war in diese 4Co63-Version rückgekreuzt worden.
Dieses Allel wurde für eine Untersuchung ausgewählt, da es zur Bildung eines großen
Narbenfadensektors zu führen schien. Der Hybrid K61/Pr(hm1-2/hm1-1) wurde unter Verwendung von
Pollen von dem P-VV/P-WW-Inzuchtstamm 4Co63 (Hm1-4Co63/Hm1-4Co63), der als
610417(X) von I. Greenblatt (persönliche Mitteilung) bezeichnet wurde, befruchtet. 17
männliche Pflanzen wurden verwendet, um 32 Ähren zu erzeugen. Lediglich 2 Ähren bildeten
empfindliche Nachkommenschaft, und beide waren von der männlichen Pflanze Nummer 16 abgeleitet.
Die Pflanze 16 der Kreuzung 741-11 · 741-9 bildete 47 empfindliche Nachkommen von 323.
Die Pflanze 16 der Kreuzung 741-13 · 741-9 bildete 16 empfindliche Nachkommen von 323.
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Die Ergebnisse werden am besten durch ein einzelnes mutagenes Ereignis erklärt, das während
der Narbenfadenentwicklung stattfand, wodurch viele Gameten entstanden, die die gleiche
Mutation trugen.
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Genetische Tests zeigten, daß Ac nicht in der hm1-1040::dSpm-Mutante transponierte.
Durch Ac-, Ds1-, und Ds2-Sonden konnten kein Restriktionsfragment nachgewiesen werden,
das mit hm1-1040::dSpm cosegregierte. Die Untersuchung von DNA aus der hm1-1040::dSpm-
Mutante durch Hybridisierung mit der *1369-Sonde ergab ein 11,0 kb SstI-
Restriktionsfragment, das 6 kb größer war als das Hm1-4Co63-Vorfahrenallel. Dieses Fragment
wurde in l sep6-lac5 cloniert. Durch Hybridisierung verschiedener Sonden an DNA aus dem
Clon wurde die Insertion als ein Spm/En-homologes Element identifiziert.
Natürliche Variation
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Die Hm1-Elternallele, von welchen hier beschriebene Mutanten abgeleitet wurden, führen
zu einer vollständigen Resistenz gegen C. carbonum Rasse 1 während der Entwicklung der
Pflanze. Im Gegensatz dazu führt das Hm1-A-Allel, das im Inzuchtstamm P8 gefunden wurde,
zu einer teilweisen Resistenz, die während der Pflanzenentwicklung ansteigt. Die Untersuchung
der DNA von P8 durch Hybridisierung mit der *1369-Sonde zeigte, daß die clonierte Region
dupliziert ist. Der duplizierte Ort segregiert unabhängig von HM1. Die Beziehung zwischen dem
Expressionsmuster und der Duplikation wurde nicht ermittelt. Die *1369-Sonde hybridisierte mit
DNA von den Gräsern Sor um und Coix gut, jedoch mit DNA von Arabidopsis schlecht.
Poly(A) + RNA von den von den Erfindern hergestellten Mutanten und von den Inzuchtstämmen
K61 (hm1-2) und Pr1 (Hm1-Pr1) wurde geblottet und mit der *1062-Sonde hybridisiert. Eine
1,3 kb mRNA Bande war lediglich in den Pr1-Spuren vorhanden. Die empfindlichen Genotypen
hatten entweder keine nachweisbar hybridisierende mRNA oder aber die Größe war aberrant. In
allen Fällen war das Signal extrem schwach.
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Diese Ergebnisse zeigen, daß das ganze HM1-Gen oder ein ausreichender Teil des HM1-
Genes cloniert und sequenziert wurde, und zwar mit genomischen und mit cDNA-Sequenzen,
wie in SEQUENZ LD. No. 1 bzw. SEQUENZ LD. No. 2 gezeigt. Rezessive Allele des Genes
enthalten eindeutig homologe DNA (z. B. hm1-1 und hm1-2). Dies ist im Gegensatz zu den 2
Pilz-Pflanzen-pathogenen Genen, die cloniert wurden und die Rassenspezifität kontrollieren:
TOX2 verleiht Rasse 1 Typ Pathogenität gegen C. carbonum (Walton, persönliche Mitteilung)
und avr9 verleiht rassenspezifische Avirulenz in Bezug auf Cladosporium fulvum; beide Gene
fehlen in Stämmen, denen ihre entsprechenden Funktionen fehlen.
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Resistenz scheint von Empfindlichkeit auf transkriptioneller Ebene verschieden zu sein,
zumindest in den kleinen Proben an Allelen, die untersucht wurden. Dies zeigt, daß empfindliche
Genotypen keine alternative Form von HM1 mit Spezifität für ein anderes Substrat als HC-Toxin
besitzen. Dieses Ergebnis legt ebenso nahe, daß die einzige Funktion von HM1 in jungem
Blättergewebe die Bereitstellung von Resistenz ist, da die HM1-Mutationen nicht pleiotrop sind.
SEQUENZPROTOKOLL
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(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
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(i) ANMELDER: Briggs, Steven P.; Johal, Gurmukh S.
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(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Krankheitsresistenzgen aus Mais als
Selektionsmarker
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(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
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(iv) KORRESPONDENZADDRESSE:
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(A) ADRESSAT: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
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(B) STRASSE: 700 Capital Square, 400 Locust Street
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(C) ORT: Des Moines
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(D) STAAT: Iowa
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(E) LAND: U. S. A.
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(F) POSTLEITZAHL 50309
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(v) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
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(A) DATENTRÄGER: Diskette, 3,5 Inch, 1,44 Mb Speicherplatte
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(B) COMPUTER: IBM-compatibel
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(C) BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS
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(D) SOFTWARE: Microssoft Windows Notepad
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(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
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(A) ANMELDENUMMER:
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(B) ANMELDEDATUM:
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(C) KLASSIFIKATION:
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(vii) DATEN DER VORHERIGEN ANMELDUNG:
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(A) ANMELDENUMMER
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(B) ANMELDEDATUM
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(viii) ANWALT/VERTRETERINFORMATION:
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(A) : NAME: Roth, Michael J.
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(B) : REGISTRIERUNGSNUMMER: 29 342
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(C) : REFERENZ/AKTENNUMMER: 0212 US
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(ix) INFORMATIONEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
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(A) TELEFON: (515) 245-3594
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(B) TELEFAX: (515) 245-3634
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(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NO: 1:
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(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
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(A) LÄNGE: 5198 Basenpaare
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(B) ART: Nucleotid
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(C) STRANGFORM: doppelsträngig
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(D) TOPOLOGIE: linear
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(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
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(A) BESCHREIBUNG:
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(iii) HYPOTHETISCH: Nein
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(iv) ANTISENSE: Nein
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(v) FRAGMENTTYP:
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(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
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(A) ORGANISMUS: Zea mays
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(B) STAMM:
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(C) INDIVIDUELLES ISOLAT:
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(D) ENTWICKLUNGSSTUFE:
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(E) HAPLOTYP:
-
(F) GEWEBETYP:
-
(G) ZELLTYP:
-
(H) ZELLLINIE:
-
(I) ORGANELLE:
-
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
-
(A) GENBANK:
-
(B) CLON:
-
(viii) POSITION IM GENOM:
-
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
-
(B) KARTENPOSITION:
-
(C) EINHEITEN:
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL:
-
(B) ORT:
-
(C) IDENTIFIKATIONS VERFAHREN:
-
(D) ANDERE INFORMATION:
-
(x) INFORMATION ZUR PUBLIKATION:
-
(A) AUTOREN:
-
(B) TITEL:
-
(C) ZEITSCHRIFT:
-
(D) BAND:
-
(E) HEFT:
-
(F) SEITEN:
-
(G) DATUM:
-
(H) DOKUMENT NUMMER:
-
(I) EINREICHEDATUM:
-
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM:
-
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO:
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
-
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
-
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
-
(A) LÄNGE: 1374 Basenpaare
-
(B) ART: Nucleotid
-
(C) STRANGFORM: doppelsträngig
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
-
(A) BESCHREIBUNG:
-
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
-
(iv) ANTISENSE: Nein
-
(v) FRAGMENTTYP:
-
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
-
(A) ORGANISMUS: Zea mays
-
(B) STAMM:
-
(C) INDIVIDUELLES ISOLAT:
-
(D) ENTWICKLUNGSSTUFE:
-
(E) HAPLOTYP:
-
(F) GEWEBETYP:
-
(G) ZELLTYP:
-
(H) ZELLLINIE:
-
(I) ORGANELLE:
-
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
-
(A) GENBANK:
-
(B) CLON:
-
(viii) POSITION IM GENOM:
-
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
-
(B) KARTENPOSITION:
-
(C) EINHEITEN:
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL:
-
(B) ORT:
-
(C) IDENTIFIKATIONS VERFAHREN;
-
(D) ANDERE INFORMATION:
-
(x) INFORMATION ZUR PUBLIKATION:
-
(A) AUTOREN:
-
(B) TITEL:
-
(C) ZEITSCHRIFT:
-
(D) BAND:
-
(E) HEFT:
-
(F) SEITEN:
-
(G) DATUM:
-
(H) SEITEN.
-
(I) EINREICHEDATUM:
-
(1) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM:
-
(K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO:
-
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: