DE69322073T2

DE69322073T2 - Analyseverfahren

Info

Publication number: DE69322073T2
Application number: DE69322073T
Authority: DE
Inventors: Julian Bangor Gwynedd Ll57 4Ln Burt; Adrian Suffolk Cb8 7Hx Parton; Ronald Menia Bridge Gwynedd Ll59 5Dt Pethig
Original assignee: Genera Technologies Ltd
Current assignee: Genera Technologies Ltd
Priority date: 1992-02-08
Filing date: 1993-02-05
Publication date: 1999-07-15
Anticipated expiration: 2013-02-06
Also published as: EP0625267B1; DE69322073D1; NZ246927A; AU3459193A; CA2129729A1; ATE173338T1; EP0625267A1; AU671816B2; JP3200066B2; WO1993016383A1; JPH07506898A; CA2129729C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf analytische Verfahren basierend auf der Beobachtung der Rotation von Mikropartikeln in Reaktion auf ein rotierendes Feld.
Es ist bekannt, daß Mikropartikel in Form von Kunststoffkügelchen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind, in Reaktion auf ein rotierendes elektrisches Feld, welches durch eine Elektrodenanordnung angelegt wird, rotieren. Dieses Phänomen ist als Elektrorotation bekannt. Auf ähnliche Weise ist es bekannt, daß ein Mikropartikel, welches einen magnetischen Dipol darstellt, oder bei welchem ein solcher Dipol induziert werden kann, in Reaktion auf ein rotierendes Magnetfeld rotiert.
Die Rotation eines Mikropartikels in Reaktion auf die Rotation eines angelegten Feldes, ob ein elektrisches oder magnetisches, wird hier "Feld-Rotation" genannt.
Es wurde vorgeschlagen, daß Elektrorotation analytische Verwendungen haben könnte. So haben Arnold und Zimmeruran (Natur Wissenschaften, 69 (1982) 297; Z. Natur Forsh., C.37 (1982) 908-915) vorgeschlagen, daß eine mögliche Anwendung der Elektrorotation von Zellen die Detektion von Wechselwirkungen zwischen der Zellmembran und ökotoxikologischen Substanzen sein könnte, welche die elektrischen Eigenschaften der Membran beeinflussen, wie beispielsweise durch Ändern ihrer Durchlässigkeit für bestimmte Ionen. Demgemäß hat sich herausgestellt, daß die Elektro-Rotations-Eigenschaften einer Hefezelle beobachtbar durch Schwermetallionen beeinflußt werden können. Dies kann zurückzuführen sein auf die elektrischen Eigenschaften der Zellmembran, die durch die Schwermetallionen geändert werden. Solche Verfahren haben eine potentielle Anwendbarkeit weitgehend nur bei Arten, die für solche Zellen giftig sind.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Beobachtung, daß die Rotations-Eigenschaften eines Mikropartikels durch Bildung eines Komplexes geändert werden können, welcher die Mikropartikel und das zu analysierende Target beinhaltet, und daß durch Beobachtung der charakteristischen Rotationseigenschaften des Komplexes Informationen bezüglich des Targets erhalten werden können.
Während erfindungsgemäße Verfahren in einer breiten Vielzahl von analytischen Anwendungen verwendet werden können, haben sie eine besondere Bedeutung für die Analyse von Proben, die Mikroorganismen oder mikrobiologische Produkte enthalten. Derzeitige Verfahren zum Identifizieren von Mikroorganismen selbst, z. B. Bakterien, beinhalten die Verwendung von immunologischen, DNA-, biochemischen und mikrobiologischen Verfahren. Herkömmlicherweise werden standardmäßige mikrobiologische Verfahren, wie Ablagerung der Organismen und Beobachten ihres Wachstums auf selektiven Medien, für die Detektion von spezifischen Organismen verwendet. In neuerer Zeit sind weithin Verfahren wie beispielsweise Immuno- Untersuchung, welche die Verwendung von Antikörpern beinhaltet, die auf die spezifischen betreffenden Organismen gerichtet sind, und Verfahren zum Vermehren und Detektieren von charakteristischen DNA-Sequenzen gebräuchlich geworden. Verfahren, wie Immuno- Untersuchung und DNA-Detektion bieten Vorteile dadurch, daß sie relativ spezifisch sind und ausnahmslos schneller sind als herkömmlichere biologische Verfahren. Jedoch unterliegen die bekannten Verfahren Einschränkungen, unter anderem dadurch, daß ihr Maß an Empfindlichkeit beschränkt ist, daß sie in einigen Fällen sehr fachmännische bedienungstechnische und labortechnische Anforderungen benötigen, daß sie von Natur aus nicht sehr quantitativ sind und daß nur die herkömmlichen Plattierungsverfahren zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen unterscheiden.
Die im folgenden beschriebenen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bieten eine Lösung für einige oder alle dieser Nachteile.
Die vorliegende Erfindung bietet ein Analyseverfahren, welches das Bilden eines Komplexes zwischen einem Mikropartikel, einem mit dem Mikropartikel verbundenen, verknüpfenden Molekülteil und einem Target, wobei der Komplex Feld-Rotationseigenschaften aufweist, die sich deutlich von denjenigen der Mikropartikel und dem verbundenen, verknüpfenden Molekülteil allein unterscheiden, und Beobachten der charakteristischen Feld-Rotationseigenschaften des Komplexes beinhaltet.
Das obengenannte "Target" muß nicht selbst die Art für die Bestimmung der Präsenz, Natur oder Menge sein, die der letztendliche Zweck der Analyse ist. Somit kann das Target ein Reagens in der Analyse und die interessierende Art in der Analyse kann eine andere Komponente des Komplexes sein, z. B. das verknüpfende Molekülteil.
Zur Hintergrundinformation: Wenn ein Mikropartikel einem externen elektrischen Feld ausgesetzt wird, werden elektrische Ladungen induziert, die auf den Oberflächen des Partikels auftreten, so daß es ein elektrisches Dipolmoment erhält. Wenn das elektrische Feld rotiert, wirkt ein Drehmoment auf das Partikel von einer Größe, die proportional zu dem induzierten Dipolmoment und der Feldgröße ist, um eine Eigendrehbewegung des Partikels zu bewirken. Methodenlehren zum Erzeugen rotierender elektrischer Felder und zur visuellen Beobachtung der resultierenden elektrischen Rotation von Kolloidalpartikeln, einschließlich biologischer Zellen wurden von W. M. Arnold und N. Zimmeruran (Journal of Electrostatics, Bd. 21, S. 151-191 (1988) und R. Holzel (Medical and Biological Engineering and Computing, Bd. 28, S. 102-105 (1988)) beschrieben. Die Rotationsrichtung des Partikels hängt von den dielektrischen und elektrischen Leitfähigkeits- Eigenschaften des Partikels und des umgebenden Suspensionsmediums ab und kann entweder dieselbe Richtung wie das rotierende elektrische Feld (bekannt als Co-Feld-Rotation) haben oder entgegengesetzt dazu sein (bekannt als Anti-Feld-Rotation). Die Rate der elektrischen Rotation des Partikels liegt normalerweise im Bereich von 2 bis 6 rad pro Sekunde, was natürlich langsam genug ist, um es direkt durch ein Mikroskop zu beobachten und die Rotationsrate der Partikel einfach durch einen Beobachter zu messen, welcher die Anzahl an Rotationen innerhalb einer Zeitspanne zählt. Das Phänomen hängt von der Rotationsfrequenz des angelegten elektrischen Feldes und von der Natur des Mikropartikels ab, wobei Feldrotations-Raten von 10 Hz bis 100 MHz verwendet werden können.
Das von dem Mikropartikel in dem rotierenden elektrischen Feld erfahrene Drehmoment kann als Folge einer Verschiebung zwischen der Rotation des Feldes und der Rotation des induzierten Dipols des Mikropartikels betrachtet werden. Der in das Mikropartikel induzierte Dipol kann mit dem Feld erneut ausgerichtet werden, ohne daß das Partikel durch das Abklingen des in einer ersten Feldausrichtung induzierten Dipols und die Bildung eines neuen Dipols, welcher mit einer neuen Feldausrichtung ausgerichtet ist, rotiert. Insofern, daß dieser Vorgang des Abklingens und Repolarisierung hinter dem angelegten Rotationsfeld nacheilt, ist der effektive Dipolmoment des Mikropartikels zu keinem Zeitpunkt mehr mit dem Feld ausgerichtet und somit wird ein Drehmoment an das Partikel angelegt. Somit ist die Abhängigkeit des beobachteten Elektro- Rotations-Phänomen von der Rotationsfrequenz des angelegten Feldes unter folgenden Bedingungen verständlich. Bei sehr niedrigen Anregungsfrequenzen kann die Neuanordnung des Dipols in dem Partikel Schritt halten mit dem Rotationsfeld und die Verzögerung zwischen dem Dipol und dem Feld ist sehr gering, so daß keine Rotation verursacht wird. Innerhalb eines Frequenzbereichs ist der Dipol in bezug auf das Feld verzögert und Elektrorotation wird beobachtet. Bei sehr hohen Frequenzen kann der Dipol dem Feld nicht ausreichend schnell folgen, um ein konstantes Verhältnis zu diesem beizubehalten und kein Dipol wird induziert, so daß es keinen Elektro-Rotations-Drehmoment gibt.
Es hat sich herausgestellt, daß Elektro-Rotationseigenschaften, z. B. die Rate der Partikelrotation, die bei einer gegebenen Feldrotationsfrequenz beobachtet wird, für ein gegebenes Mikropartikel durch Bilden eines Komplexes zwischen dem Mikropartikel und einer zu analysierenden Targetart, wie beispielsweise eine Mikroorganismuszelle, ausreichend geändert werden, kann, so daß die Änderung der Elektro-Rotations-Eigenschaften beobachtet werden kann und die Basis eines analytischen Verfahrens bilden kann. Wie im folgenden gezeigt wird, gibt es in diesem breiten Konzept Analyseverfahren, mittels welcher zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Mikroorganismuszellen unterschieden werden kann, und Analyseverfahren, welche ein Maß an Empfindlichkeit bereitstellen, welches zuvor nicht möglich war. Falls gewünscht, können quantitative Informationen erhalten werden.
Deshalb sind die beobachteten Feld-Rotations-Eigenschaften vorzugsweise Elektro-Rotations- Eigenschaften.
Der verknüpfende Molekülteil, welcher mit dem Mikropartikel verbunden ist, ist eine Art, die eine Affinität für das Target hat. Vorzugsweise ist die Affinität für das Target eine selektive Affinität, dergestalt, daß die Bildung des Komplexes zwischen dem Mikropartikel und dem Partikel selektiv ist und mindestens ein (bestimmtes) Maß an Identifikation des Targets bereitstellt. Vorzugsweise ist die Affinität höchst spezifisch und demgemäß kann der mit dem die selektive Affinität für das Target bereitstellenden Mikropartikel-Substrat verbundene verknüpfende Molekülteil ein Antikörper oder ein Antikörperfragment mit Antikörper-Aktivität, ein Antigen, eine Nukleinsäure- Sonde oder eine Nukleinsäureanalog-Sonde mit selektiver Affinität für komplementäre Nukleinsäuresequenzen oder Avidin oder ein avidinähnliches Molekül wie Strept-Avidin sein. Antikörper und Antikörperfragmente mit Antikörpereigenschaften sind besonders bevorzugt. Es gibt bekannte Techniken, die zum Aufbringen von Antikörper auf die Oberfläche von Partikeln, wie beispielsweise Kunststoff-Mikrokügelchen geeignet sind, welche dem Fachmann wohlbekannt sind. Mit Antikörpern beschichtete Mikropartikel können entsprechende Antigene, welche auf Mikroorganismuszellen oder anderen Targets vorhanden sind, erkennen und binden.
Es sind auch Verfahren bekannt zum Binden von Oligo-Nukleinsäure-Sonden an solche Mikropartikel. Geeignete Techniken sind beispielsweise in der PCT-Anmeldung Nr. GB92/01526 beschrieben. Wenn der verknüpfende Molekülteil eine Nukleinsäure-Sonde oder eine Nukleinsäureanalog-Sonde ist, ist das Mikropartikel natürlich dafür geeignet, komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu erkennen und zu binden.
Der genannte Komplex kann weiterhin eine Markierung aufweisen, welche mit dem Target verbunden ist. Die Markierung kann mit dem Target entweder vor, gleichzeitig mit oder nach der Bildung des Komplexes zwischen dem Target und dem Mikropartikel verbunden werden. Die Markierung kann einen zweiten verknüpfenden Molekülteil, welcher eine Affinität für das Target hat, und einen markierenden Molekülteil aufweisen, welcher von dem verknüpfenden Molekülteil getragen ist. Wiederum ist es bevorzugt, daß die Affinität des zweiten verknüpfenden Molekülteils für das Target selektiv, vorzugsweise höchst spezifisch ist und der zweite verknüpfende Molekülteil kann auch ein Antikörper, ein Antikörperfragment mit Antikörperaktivität, ein Antigen, eine Nukleinsäure-Sonde, eine Nukleinsäureanalog-Sonde, Avidin oder ein avidinähnliches Molekül sein. Die Verwendung einer Markierung dieser Art kann dort erwünscht sein, wo ein Komplex zwischen dem Mikropartikel und dem Target nicht an sich ausreichend kennzeichnende Feld-Rotationseigenschaften hat. Die Feld-Rotationseigenschaften können weiterhin durch Miteinbeziehen in den Komplex der Markierung geändert werden. Zu diesem Zweck kann der Markierungs-Molekülteil, den der verknüpfende Molekülteil in der Markierung trägt, ein Mikroorganismus, ein Metallpartikel, ein Polymerkügelchen oder ein Magnetpartikel sein. Zur Verwendung in Verbindung mit Elektro-Rotations-Messungen hat die Markierung vorzugsweise dielektrische Eigenschaften und ist fähig, eine beachtliche Oberflächenladung anzunehmen. Ein besonders bevorzugtes Material ist kolloidales Gold, welches einfach an Antikörper (als die genannte zweite Art) gebunden werden kann, um eine Markierung zu bilden. An kolloidales Gold gebundene Antikörper sind kommerziell erhältlich und Verfahren zum Binden von Antikörpern an kolloidales Gold sind z. B. beschrieben in Geohegan W. D. et al (1978) Immunol. Comm 7 pl. Andere Metallpartikel können jedoch verwendet werden, z. B. Silberpartikel und Eisenpartikel.
Die Verwendung einer Markierung der oben beschriebenen Art kann bevorzugt sein, selbst wenn ein Komplex zwischen dem Target und einem Mikropartikel ausreichend unterscheidungskräftige Elektro-Rotationseigenschaften hat, um die Bildung eines solchen zu beobachtenden Komplexes zu ermöglichen. Ein höheres Maß an Spezifizität kann in bestimmten Fällen durch Verwendung einer Markierung in einem solchen Komplex erhalten werden. Somit kann z. B. ein Mikroorganismus, welcher sowohl ein erstes Antigen und ein zweites Antigen exprimiert, von einem Mikroorganismus unterschieden werden, welcher nur das erste Antigen exprimiert, durch Verwendung von Mikropartikeln mit einem Antikörper als verknüpfender Molekülteil mit dem ersten Antigen und einer Markierung, welche einen Antikörper als zweiten verknüpfenden Molekülteil mit dem zweiten Antigen hat, wobei die charakterisierenden Feld- Rotationseigenschaften des Komplexes zwischen dem Mikropartikel, dem Mikroorganismus und der Markierung beobachtet werden und von denjenigen des Mikropartikels und des Mikroorganismus, die nur das erste Antigen exprimieren, unterschieden werden.
Die Markierung kann ein magnetisches Partikel beinhalten, so daß die Markierung von einem Magneten angezogen werden kann, um Komplexe, die die Markierung beinhalten, zur Vereinfachung der Beobachtung zu konzentrieren. In einigen Fällen kann es möglich sein, markierte Komplexe durch einen Magneten anzuziehen und nicht markierte Kügelchen wegzuwaschen, um den Hintergrund der Kügelchen, die verknüpfende Molekülteile, jedoch kein Target/Markierung haben, welche normalerweise vorhanden wären, zu eliminieren. Geeignete magnetische Markierungen für diesen Zweck beinhalten Eisen-Mikropartikel, welche verknüpfende Molekülteile, wie beispielsweise Antikörper haben. Solche mit Eisenpartikel beschichteten Antikörper sind kommerziell erhältlich.
Normalerweise ist es bevorzugt, ein elektrisches Feld zu verwenden, welches zwischen 10 Hz und 1 MHz, vorzugsweise zwischen 100 Hz und 1000 Hz, z. B. ca. 300 Hz rotiert.
Vorzugsweise werden die Elektro-Rotations-Eigenschaften unter Verwendung eines rotierenden elektrischen Feldes mit einer Stärke von zwischen 50 und 650 Volt pro Zentimeter, vorzugsweise 100 bis 500 Volt pro Zentimeter, z. B. ca. 200 V/cm, beobachtet.
Eine generell bevorzugte Form einer Elektro-Rotations-Vorrichtung hat die Form einer eine Probe aufnehmenden Oberfläche mit einem Satz von Elektroden, die daran angeordnet sind und ein Probenanalysefeld umgeben, in welchem Elektrorotation beobachtet werden soll, einer Lichtquelle, die auf das genannte Feld gerichtet ist und einer Einrichtung zum Beobachten der Partikel in dem Feld, wie beispielsweise ein Mikroskop oder eine Kamera. Die Vorrichtung beinhaltet typischerweise weiterhin einen Signalgenerator zum Anlegen einer gewählten Spannung in den Elektroden bei einer gewählten Frequenz, um ein rotierendes Feld zu erzeugen.
Typischerweise kann man ein Analysefeld zwischen der Elektrode von einer Fläche von ca. 0,01 bis 0,3 mm², z. B. 0,08 mm² verwenden, indem Elektroden verwendet werden, die auf die die Probe aufnehmende Oberfläche aufgedruckt sind und sich einander bis zwischen 100 um und 0,6 mm annähern. Vier Elektroden mit pfeilförmigen Enden, die sich einem gemeinsamen Punkt aus vier orthogonalen Richtungen annähern, können verwendet werden. An sie kann ein Quadratur-Ausgangssignal von einem Signalgenerator angelegt werden.
Jedoch können größere Analysefelder verwendet werden, insbesondere, wenn die Anordnung (Anzahl und Beabstandung) der Elektroden geeignet gewählt wird und größere Spannungen verwendet werden.
Die Feld-Rotationseigenschaften des Komplexes können direkt durch ein Mikroskop beobachtet werden, wobei der Beobachter die Rotationsrate von einzelnen Partikeln in dem Mikroskopfeld abwechselnd mißt und wahlweise die Anzahl der beobachtbaren Partikel notiert.
Bevorzugter noch wird die Beobachtung der Feld-Rotations-Eigenschaften auf einer automatisierten Basis unter Verwendung von optischen Detektionstechniken ausgeführt, z. B. Bild-Analyse-Techniken, welche verwendet werden können, um die einzelnen Rotationsprofile von mehreren oder allen Komplexen in dem Sichtfeld der Vorrichtung zu detektieren und charakterisieren.
Die verwendeten Mikropartikel-Substrate sind vorzugsweise Polymerkügelchen, vorzugsweise Polystyrol-Kügelchen. Die Polymerkügelchen können magnetisiert werden, damit sie bei den Verarbeitungsstufen besser gehandhabt werden können oder um ihre Visualsierung bei Elektro- Rotations-Messungen zu unterstützen, was im folgenden beschrieben wird.
Die Kügelchen können sphärisch sein, es mag jedoch bevorzugt sein, Kügelchen zu verwenden, welche visuell unterscheidungskräftige Merkmale haben, wie Oberflächenvertiefungen oder Markierungen oder aspherische Eigenschaften, um die Visualisierung der Rotation der Kügelchen zu unterstützen.
Da es schwierig ist, die Rotation von sphärischen Kügelchen durch Bildanalyse aufgrund der mangelnden Merkmale, die beobachtet werden können, um die Rotation der Kügelchen zu verfolgen, zu beobachten, können Kügelchen wahlweise markiert werden, um zu verfolgende Merkmale bereitzustellen.
Bevorzugte Markierungsmethoden beinhalten das Beschichten von Kügelchen oder anderen Mikropartikeln mit einem Farbstoff, z. B. einem fluoreszierenden Farbstoff und dann weitere Behandlung der Farbstoff-beschichteten Kügelchen, um den Farbstoffüberzug visuell unterschiedlich zu machen. Dies kann z. B. eine physikalische Behandlung sein, wie die Verwendung von Laser, um den Farbstoff zu ändern, ihn z. B. zu bleichen. Eine Seite der Kügelchen kann durch einen Laser beleuchtet werden, um diesen Effekt zu erzeugen, so daß die Kügelchen bei Beleuchtung mit UV-Licht eine fluoreszierende Hemisphäre und eine dunkle Hemisphäre haben, so daß eine Rotation einfach beobachtet werden kann.
Ein Farbstoff, z. B. ein fluoreszierender Farbstoff kann als eine Markierung in das verknüpfende Molekülteil aufgenommen werden, um mit den Kügelchen oder anderen Mikropartikeln verbunden zu werden. Wiederum können visuell beobachtbare Stellen durch Laser-Beleuchtung erzeugt werden.
Bei beiden der obgengenannten Verfahren kann eine chemische Behandlung anstelle der Laserbehandlung verwendet werden, um die erforderliche unregelmäßige Farbstoff-Beschichtung zu erzeugen.
Als Alternative kann Farbstoff an die Kügelchen ungleichmäßig aufgetragen werden, um die visuellen Unregelmäßigkeiten direkt zu erzeugen. Somit kann man Farbstoff-Diffusion verwenden, um Farbstoffe nur an eine Seite der Masse der Kügelchen oder anderen Mikropartikel zu übertragen.
Ein weiterer geeigneter Lösungsansatz besteht darin, eine erste Beschichtung auf einer ersten Gruppe von Mikropartikeln und eine zweite Beschichtung auf einer zweiten Gruppe von Mikropartikeln bereitzustellen, wobei die erste und zweite Beschichtung eine Affinität, z. B. eine selektive Affinität füreinander haben. Antikörper/Antigen-Beschichtungen können verwendet werden. Wenn die Kügelchen vermischt werden, verbinden sie sich, um zusammengesetzte Mikropartikel zu bilden, welche einfach zu beobachten sind.
Vorzugsweise ist eine Gruppe der ersten und zweiten Gruppe von Mikropartikeln aus Partikeln von einem Durchmesser gebildet, welcher im Vergleich zu dem der Mikropartikel der anderen Gruppe klein ist. Die Verbindungen nehmen dann die Form von größeren Mikropartikeln an, die von kleineren umgeben sind. Der verknüpfende Molekülteil für die Untersuchung kann in die kleineren Partikel durch Beschichten eingebracht sein. Geeignete Partikeldurchmesser- Verhältnisse reichen von 1 : 4 bis 1 : 8 z. B. < 1 um Partikel und 6 um Partikel.
Die Erfindung beinhaltet ein Kit zur Verwendung bei der Analyse durch Elektro-Rotation, das Mikropartikel, welche verknüpfende Molekülteile tragen, die geeignet sind, einen Komplex mit einer besonderen Targetart zu bilden, und mindestens eines der folgenden aufweist:
(a) eine eine Probe aufnehmende Oberfläche, auf welcher ein Muster von Elektroden ist, welche ein Analysefeld umgeben, welches für die Verwendung in einer Elektrorotations- Untersuchung geeignet ist; oder
(b) eine Elektrorotations-Markierung, welche geeignet ist, einen Komplex mit derselben Targetart zu bilden.
Die die Probe aufnehmende Oberfläche kann auf einem durchlässigen Element vorgesehen sein, welches eine Probe filtern kann, um die Targetart zu konzentrieren. Um z. B. Mikroorganismen zu konzentrieren, können die Elektroden auf der Oberfläche eines mikroporösen Filters sein, z. B. einer Membran, durch welche ein Volumen einer Probe hindurchgeht, um Mikroorganismen auf der Membran zu fangen, um sie mit den Mikropartikeln zu verbinden. Das Kit kann dann eine Einrichtung zum Passieren eines Flüssigkeitsvolumens durch ein durchlässiges Element beinhalten, welches die eine Probe aufnehmende Oberfläche bereitstellt und vorzugsweise eine Einrichtung zum Messen des Volumens aufweisen.
Ein separater Aspekt der Erfindung beinhaltet zur Verwendung bei einer Elektro-Rotations- Untersuchung ein mikroporöses Filterelement, welches ein Elektrodenmuster trägt, welches ein eine Probe aufnehmendes Feld definiert und ein rotierendes elektrisches Feld an diese Probe anlegen kann.
Der breite Bereich von analytischen Techniken, welchen die Erfindung bietet, wird in der folgenden Erörterung einer Anzahl von allgemeinen Beispielen von Analyseverfahren im Rahmen der Erfindung illustriert.
Es wird bezug genommen auf die beiliegenden Zeichnung, welche zeigen:
Fig. 1 eine schematische Seitenansicht einer Meßvorrichtung gemäß der Erfindung;
Fig. 2 eine schematische Darstellung der Elektrodenanordnung der Elektro-Rotations- Meßvorrichtung in Draufsicht;
Fig. 3 eine schematische Seitenansicht einer weiteren Form einer Meßvorrichtung für die Verwendung bei der Erfindung;
Fig. 4 eine schematische Darstellung des Komplexes zwischen einem Mikropartikel und einer Bakterienzelle;
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Komplexes zwischen einem Mikropartikel, einem Target und einer Markierung;
Fig. 6 die Detektion eines Nukleinsäure-Targets unter Verwendung einer Fangsonde, die an ein Polymerkügelchen gebunden ist, und einer Detektionssonde, die ein Markierungs-Molekülteil trägt;
Fig. 7 die Detektion eines Nukleinsäure-Vermehrungsprodukts, welches eine Elektro-Rotations- Markierung beinhaltet, die ursprünglich in einem Primer vorhanden war;
Fig. 8 eine Modifikation des in Fig. 7 gezeigten, wobei das Target eine erste Markierung beinhaltet, welche durch Reaktion mit einer geeigneten Elektro-Rotations-Markierung detektierbar ist;
Fig. 9 eine ähnliche Anordnung wie in Fig. 8, wobei Biotin als eine Markierung verwendet wird, welches in das Target mittels biotinisierter Nukleotide in einer Vermehrungsreaktion aufgenommen wird; und
Fig. 10 die mittels Polymerase vermittelte Extension eines Sondenprimers, der von einem Polymerkügelchen (Polymerperle) getragen wird, zum Bilden eines verlängerten Linker- Molekülteils, welches eine Elektro-Rotations-Markierung fangen kann, welche als das erforderliche Target agiert, wobei die Anwesenheit des verlängerten Linker-Molekülteils der tatsächliche Gegenstand der Analyse ist.
Fig. 11 bis 16 zeigen die Ergebnisse der Elektro-Rotations-Analysen, die in Beispielen 1 bis 8 im Detail beschrieben sind. Die Figuren und Beispiele beziehen sich aufeinander wie folgt:
Fig. 1 l - Beispiel 3
Fig. 12 - Beispiel 4
Fig. 13 - Beispiel 5
Fig. 14 und 15 - Beispiel 6
Fig. 16 - Beispiel 7
Fig. 17 - Beispiel 8
Wie in Fig. 1 gezeigt ist, weist eine Vorrichtung zur Verwendung gemäß der Erfindung ein Lichtmikroskop auf, welches schematisch durch eine Linse 100 angedeutet ist, welches mit einem CCD-Kamera-Zusatz 102 sowie einer herkömmlichen das Feld beleuchtenden Lichtquelle 103 und Objektträger-Stütz-Tisch (nicht gezeigt) ausgerüstet ist.
Die CCD-Kamera 102 ist mit einer Signalprozessoreinheit 104 und einem Anzeige-Bildschirm 106 verbunden. Die Vorrichtung weist weiterhin einen Frequenzgenerator 108 auf, welcher bei der Verwendung mit Anschlüssen verbunden ist, die an einem Mikroskop-Objektträger 110 vorgesehen sind, welcher ein Elektrodenmuster 112-118 aufweist, was detaillierter in Fig. 2 gezeigt ist.
Die Elektroden können zusammen mit Bahnen, die zu Anschlüssen führen zur Verbindung mit dem Frequenzgenerator 108, auf den Mikroskop-Objektträger 110 aufgedruckt, z. B. in Gold, oder beschichtet und geätzt sein. Der Abstand zwischen einander gegenüberliegenden Elektroden 112 und 114 und zwischen einander gegenüberliegenden Elektroden 116 und 118 liegt vorzugsweise im Bereich von 200 bis 500 um. Bei der Vorrichtung, die verwendet wird, um die beschriebenen, in bezug auf die folgenden Beispiele erhaltenen Ergebnisse zu erzeugen, betrug der Abstand 315 um. Der Frequenzgenerator liefert zwei Sinuswellen-Ausgangssignale, die um 90º phasenverschoben sind (Quadratur-Ausgangssignal), wobei eines davon zwischen den Elektroden 112, 114 und das andere zwischen den Elektroden 116, 118 angeschlossen ist. Falls erwünscht, kann eine größere Anzahl an Elektroden verwendet werden, welche ein gleichmäßigeres Rotationsfeld liefern können. Der Frequenzgenerator weist verschiedene Ausgänge auf, um es dem Bediener zu ermöglichen, die Frequenz der Sinuswellen- Ausgangssignale und deren Spitze-Spitze-Spannung einzustellen. Typische Bedingungen, die bei den folgenden Beispielen angewandt wurden, betrugen 300 Hz bei 6 Volt von Spitze zu Spitze. Bei der Verwendung zeigt das Bild, das auf dem Display der Vorrichtung erscheint, eine Anzahl an Kügelchen in dem Feld des Mikroskops, welche ausreichend langsam rotieren, so daß die Anzahl an Rotationen in einer Zeitspanne von beispielsweise 30 Sekunden direkt von einem Beobachter, der abwechselnd jedes Kügelchen betrachtet, gezählt werden kann. Während die oben beschriebene Vorrichtung ausreicht, um nützliche Ergebnisse zu erzeugen, was durch die unten beschriebenen spezifischen Beispiele gezeigt ist, ist es generell bevorzugt, daß Rotationsgeschwindigkeits-Messungen bei mehr Kügelchen, als ein Beobachter direkt hinreichend bewältigen könnte, ausgeführt werden. Zu diesem Zweck ist es erwünscht, Bild- Verarbeitungstechniken zu verwenden, um die Rotation der Kügelchen in der Vorrichtung zu messen. Von dem CCD-Kamera-Zusatz kann man Bilder eines Sichtfeldes erhalten, welches eine Anzahl an rotierenden Kügelchen enthält. Eine Reihe solcher Bilder, oder Rahmen, kann durch Rahmen-Greif-Schaltungen in einem Computer aufgenommen werden und die Reihe der Bilder kann durch Bild-Verarbeitungs-Software analysiert werden.
Dementsprechend kann ein Schwellen-Verfahren verwendet werden, um die von der Kamera erzeugte Graustufen-Bild in ein binäres Bild zu konvertieren. Eine separate Schwelle wird ausgeführt, um jegliche Bereiche des Bildes zu identifizieren, welche als zu dunkel betrachtet werden, wobei diese Bereiche aus dem binären Bild der Kügelchen entfernt werden. Die verbleibenden Formen in dem Bild können von dem Rest des Bildes getrennt werden und einem Test von einer oder mehr charakteristischen Eigenschaften unterzogen werden, wie beispielsweise dem Bereich, um diejenigen auszuwählen, die wahrscheinlich Kügelchen darstellen. Däs Massenzentrum und die Ausrichtung können dann für jede qualifizierende Form festgestellt werden. Die Positionen der Zentren können zwischen den aufeinander folgenden Rahmen verglichen werden, damit jedes Kügelchen in einem Rahmen in dem nächsten aufgefunden werden kann. Sobald ein Kügelchen in zwei Rahmen aufgefunden wurde, ergibt die Differenz der Ausrichtung des Kügelchens direkt das Maß, um welches es rotiert hat, aus welchem seine Rotationsgeschwindigkeit berechnet und über mehrere Rahmenpaare gemittelt werden kann. Durch solche automatisierte Techniken können die Rotationsgeschwindigkeiten aller Kügelchen in dem Sichtfeld zu jedem Zeitpunkt gemessen werden und ein statistisches Bild der Rotationseigenschaften der Kügelchen kann entwickelt werden, wahlweise durch Verwendung einer Anzahl an Feldrotations-Frequenzen.
Die Vorrichtung kann weiterhin durch Miteinbeziehen eines Magneten, geeigneterweise eines Elektromagneten, modifiziert werden, welcher so angeordnet ist, daß er jegliche magnetischen Kügelchen in der Probe in das Blickfeld des Mikroskops zieht. Der Magnet würde dann entfernt oder abgeschaltet, während die Rotationseigenschaften der Kügelchen gemessen werden.
Es ist nicht essentiell, daß die Vorrichtung ein visuelles Bild erzeugt, die für die menschliche Interpretation geeignet ist. Wie in Fig. 3 gezeigt ist, kann die Vorrichtung zur Verwendung bei der Erfindung eine Laser-Lichtquelle 303 beinhalten, welche einen Proben-Objektträger mittels geeigneter Optik beleuchtet, um ein Bild an der Licht-Detektions-Vorrichtung 302 zu erzeugen, welches einer Signal-Analyseschaltung 304 zugeführt wird, um ein numerisches Ausgangssignal der Rotationseigenschaften bereitzustellen, die beobachtet werden, wenn ein rotierendes elektrisches Feld an den Proben-Objektträger über Elektroden 312 von einem Frequenzgenerator 308 angelegt wird. Der Objektträger weist ein Deckglas 320 auf.
Wie in Fig. 4 gezeigt ist, kann ein Mikropartikel ein Kunststoff-Kügelchen 12 aufweisen, an welches als verknüpfender Molekülteil ein oder mehr Antikörpermoleküle 14 gebunden sind. Es sollte beachtet werden, daß die Zeichnung nicht maßstabsgetreu ist und daß normalerweise in Realität die Kunststoffkügelchen mit einer Mehrzahl von Antikörper-Molekülen beschichtet sind. Die Mikropartikel können den Mikroorganismus-Zellen 16 ausgesetzt werden, welche Oberflächen-Antigene tragen, welche mit dem gebundenen Antikörper reagieren, um einen Komplex 10 zwischen dem Mikropartikel und der Zelle zu bilden. Die Mikro-Organismuszellen können z. B. E. coli oder Coliforme sein, die in Wasser vorhanden sind, oder pathogene Mikroorganismen, die in Nahrungsmitteln vorhanden sind, wie beispielsweise Listeria oder Salmonellen, vorhanden sind. Es hat sich herausgestellt, daß die Rotationsrate solcher Mikropartikel/Mikroorganismus-Zellkomplexe unter geeignet gewählten Bedingungen sich von den Rotationsraten unterscheidet, die nur mit den Mikropartikeln allein erhalten wurden, und weiterhin, daß die Rotationsraten, die für Komplexe zwischen Mikropartikeln und lebensfähigen Mikroorganismus-Zellen erhalten wurden, von denen unterschieden werden können, welche zwischen Mikropartikeln und ähnlichen nicht lebensfähigen Zellen erhalten wurden.
Wie in Fig. 5 gezeigt wurde, kann ein ternärer Komplex 10 zwischen einem Mikropartikel 12 der in Fig. 4 gezeigten Art, wie oben beschrieben, einem Antigen 18 und einer Markierung 20, welche einen verknüpfenden Molekülteil 22 aufweist, und einem zweiten Antikörper 24, welcher derselbe oder unterschiedlich zu dem Antikörper 14 sein kann, erzeugt werden. Ein ternärer Komplex dieser Art kann dort verwendet werden, wo das Antigen 18 zu klein ist oder keine ausreichenden dielektrischen Eigenschaften aufweist, um die Elektro-Rotationseigenschaften des Mikropartikels 10 zu beeinflussen, oder wo es erwünscht ist, einen höheren Pegel an Spezifizität durch Verwendung der zwei unterschiedlichen Antikörper in einer einzigen Analyse zu erhalten. Das Antigen kann z. B. ein Toxin sein, welches als Verunreinigung in einem Nahrungsmittel vorhanden ist.
Fig. 6 bis 11 zeigen Verfahren zum Detektieren von Nukleinsäuren und insbesondere Nukleinsäure-Sequenzen, die als Produkte von Vermehrungsverfahren, wie PCR, LCR und 3SR- Verfahren erzeugt werden. Bekannte Verfahren zum Detektieren von Nukleinsäure- Vermehrungsverfahrensprodukten hängen davon ab, daß sie einer Form von Reinigungs- und/oder Trennungs-Verfahren unterzogen werden, bevor sie analysiert werden. Ein weitgehend verwendetes Verfahren beinhaltet die Analyse des Produkts durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Dadurch werden aufgrund der Größe die vermehrten DNA-Fragmente und jegliche verbleibende Oligonukleotid-Primer getrennt. Das Trennen von Produkten allein aufgrund der Größe ermöglicht es nicht, zwischen PCR-Produkten der erforderlichen Basissequenz und einer vermehrten ( = amplifizierten) Verunreinigung von ungefähr derselben Länge zu unterscheiden.
Um PCR-Produkte weiterhin zu identifizieren, kann die Gel-Elektrophorese einen Schritt weitergeführt werden, indem ihr Produkt dem Southern-Blotting-Verfahren unterworfen wird, bei welchem die getrennten Fragmente von dem Gel zu einer Membran in direkter Korrespondenz zu ihren relativen Positionen an dem Gel übertragen werden. Sie werden dann mit einer markierten, einsträngigen DNA-Sonde mit einer zu der interessierenden Sequenz komplementären Basissequenz geprüft. Die für die Sonde verwendete Markierung ist normalerweise Biotin oder ein Radio-Isotop, wie beispielsweise ³²P. Southern-Blotting ist relativ arbeitsintensiv und erfordert ein moderates Maß an Labor-Fachkenntnissen sowie Laborausrüstung und -einrichtungen. Es ist nicht zur Verwendung beim schnellen Durchtesten einer großen Anzahl von Proben oder Durchtesten von Proben außerhalb des Labors geeignet. Das Dot-Blotting-Verfahren, bei welchem der Agarose-Gel-Trennschritt des Southern-Blotting-Verfahrens weggelassen wird, ist etwas schneller, weist jedoch im Prinzip dieselben Nachteile wie Southern-Blotting auf.
Wie in Fig. 6 gezeigt ist, kann bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine Mikrospäre ein Oligonukleotid oder synthetisches Oligonukleotid-Analogon als Fangsonde 26 (Linker-Molekülteil) beinhalten, welches an die Oberfläche eines Polymerkügelchens gebunden ist und eine Sequenz komplementär zu der eines erwarteten Vermehrungsverfahrensprodukts 28 hat. Eine Markierung 30 wird verwendet, welche einen Elektro-Rotations-Markierungs-Molekülteil 32, wie oben beschrieben, aufweist, welcher mit einer zweiten Oligonukleotid- oder Oligonukleotid-analogen Sequenz 34, die komplementär zu einem zweiten Bereich der Target- Nukleinsäuresequenz ist, verbunden ist. Die Mikropartikel und die Markierung können dem Produkt der Vermehrungsreaktion vor oder nach dem Aufarbeiten des Reaktionsgemisches hinzugefügt werden, um die Vermehrungsprodukte zu trennen. Die Elektro-Rotations- Eigenschaften des ternären Komplexes Mikropartikel/Vermehrungsprodukt/Markierung können dann beobachtet und von denjenigen der Mikropartikel alleine unterschieden werden. Eine Variante dieser Prozedur ist in Fig. 7 gezeigt, in welcher einer der Primer, der in dem Vermehrungsverfahren verwendet werden, mit einem geeigneten die Elektrorotation markierenden Molekülteil 32 gekennzeichnet wird, welcher dadurch kovalent in das Nukleinsäureprodukt des Vermehrungsverfahrens inkorporiert wird. Ein binärer Komplex wird dann zwischen einem eine Fangsonde 26 tragenden Mikropartikel und dem Vermehrungsprodukt erzeugt und die Elektro-Rotations-Eigenschaften des Komplexes werden beobachtet.
Eine weitere Variante ist in Fig. 8 gezeigt, in welcher die in dem Vermehrungsverfahren in den Primer inkorporierte Markierung selbst kein eine Elektro-Rotation markierendes Molekülteil ist, sondern statt dessen eine Markierung 36, welche so gewählt ist, daß sie eine Affinität mit dem zweiten Linker-Molekülteil einer Elektro-Rotations-Markierung ist, wie oben beschrieben, welche selbst ein eine Elektro-Rotation markierendes Molekülteil 32 enthält. Die Markierung 36 kann z. B. mit einem mit dem markierenden Molekülteil 32 verbundenen Antikörper reagieren oder ein Biotin-Markierungs-Reaktionsmittel mit einem Avidin- oder Avidin-ähnlichen Molekül, welches mit dem markierenden Molekülteil 32 verbunden ist, sein. Bei einer Variation dieses Verfahrens kann ein mit dem markierenden Molekülteil gebundener Antikörper einer sein, welcher gegen jegliche Nukleinsäuresequenz gezüchtet wurde, die in dem Vermehrungsprodukt vorhanden ist. Bei einer Variation dieses in Fig. 9 gezeigten Verfahrens kann die Markierung eher in einige oder alle Nukleotide, die in dem Vermehrungsverfahren verwendet werden, eingebaut sein, z. B. kann man biotinierte Nukleotide 40 verwenden, anstatt die Markierung in den Primer einzubringen. Eine Markierung kann dann verwendet werden, welche einen Elektro-Rotations-Markierungs- Molekülteil aufweist, welcher mit Avidin oder einem Avidin-ähnlichen Molekül, wie Streptavidin, verbunden ist.
Bei dem in Fig. 10a und 10b gezeigten Verfahren wird eine Targetsequenz 28a zuerst an eine Fangsonde 26a hybridisiert, welche mit einem Mikropartikel-Substrat verbunden ist, und das Vermehrungsverfahren wird fortgesetzt oder ein neues Vermehrungsverfahren wird begonnen, um die Fangsonde des Mikropartikels durch Verwendung von Polymerase und markierten Nukleotiden, z. B. biotinierten Nukleotiden, zu verlängern. Die Targetsequenz kann dann von den Mikropartikeln dehybridisiert werden, wobei die markierte verlängerte Sonde 26b mit dem Mikropartikel-Substrat verbunden bleibt. Die Markierung an der Sonde kann dann mit einer Elektro-Rotations-Markierung reagiert werden, welche ein Elektro-Rotations-Markierungs- Molekülteil 32 und eine Art, die mit der markierten Sonde reagiert, aufweist, z. B. Avidin. Dadurch wird ein Komplex zwischen dem Mikropartikel, welches als ein verknüpfendes Molekülteil die verlängerte Fangsonde 26b trägt, und der das markierende Molekülteil 32 beinhaltenden Markierung, welche als ein Target für eine Elektro-Rotations-Untersuchung agiert, gebildet.
Als Alternative muß die verlängerte Fangsonde keine Markierung beinhalten. Stattdessen kann das markierende Molekülteil 32 mit einem Oligonukleotid oder Nukleinsäure-Analogon verbunden sein, welches komplementär zu der verlängerten Fangsonde sind.
In bestimmten Fällen kann es sogar möglich sein, die Änderung der Elektro-Rotations- Eigenschaften, die durch die Verlängerung (Extension) der Fangsonde bewirkt wird, ohne Verwendung jeglicher weiterer Markierung zu beobachten. In einem solchen Fall bildet die Extension der Fangsonde die Targetart, wobei man sagen kann, daß mit diesem der Komplex mit dem Mikropartikel (Kügelchen) und verknüpfendem Molekülteil (Fangsonde) gebildet wird.
Es ist ersichtlich, daß die Nukleinsäure-Einheit, welche gemäß den in bezug auf Fig. 6 bis 10 gezeigten Verfahren, insbesondere denjenigen, die in Fig. 6 und 10 gezeigt sind, detektiert wird, nicht unbedingt das Produkt eines Vermehrungsverfahrens sein muß.
Die Erfindung wird durch folgende spezifische Beispiele weiter dargestellt:

Beispiel 1

Vorbereitung von mit Antikörpern beschichteten Polymer-Kügelchen

Polyrol-Mikropartikel von einem Durchmesser von 6 um (Polysciences Limited) wurden als eine Vorrats-Suspension, die 2,1 · 10&sup8; Kügelchen pro ml enthält, verwendet. 500 ul des Kügelchenmaterials wurden bei 6000 Umdrehungen pro Minute in einer Eppendorf-Zentrifuge für 1 Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Kügelchen wurden in 1 ml PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) resuspendiert. Das Verfahren wurde drei mal wiederholt, um die Kügelchen zu waschen. Die letzte Resuspension erfolgte in PBS, welches Antikörper bei 100 ug ml&supmin;¹ oder 300 ug ml&supmin;¹ enthielt. Die Kügelchen wurden in eine Rohrtrommel zum passiven Binden der Antikörper gegeben, was über Nacht bei Zimmertemperatur erfolgte. Danach wurde die Suspension geschleudert und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden in 1 ml 1%-igem Rinderserum-Albumin in PBS erneut suspendiert. Nach dem Rühren für 30 Minuten bei Zimmertemperatur wurden die Kügelchen in PBS mittels des oben beschriebenen Verfahrens gewaschen.
Die resultierenden mit Antikörpern beschichteten Kügelchen haben jeweils eine große Anzahl an Antikörper-Molekülen, die auf ihre Oberfläche aufgebracht sind.

Beispiel 2

Bildung von mit Antikörpern beschichteten Kügelchen - E. coli-Komplexe

Eine Vorratslösung, die ungefähr 10&sup7; E. coli-Organismen pro 100 ul enthält, wurde verwendet, wobei die Konzentration der vorhandenen Organismen durch Standard-Techniken geprüft wurde.
Verdünnungen der Vorratslösung wurden mit Faktoren 10&supmin;¹, 10&supmin;³, 10&supmin;&sup4; 10&supmin;&sup7;, 10&supmin;¹&sup0; vorgenommen.
Die Vorratslösung und jede Verdünnung wurden separat mit mit Antikörpern beschichteten Kügelchen, welche wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Antikörpern, geliefert von Biogenesis Ltd, hergestellt wurden, zur Komplexbildung gebracht. Die mit Antikörpern beschichteten Kügelchen wurden aus der Suspension herausgeschleudert und in der Suspension von E. coli in PBS jedes mal bei einer Kügelchenkonzentration von 300 Mikrogramm pro ml erneut suspendiert.
Binden der Bakterien an die Kügelchen wurde für 1 Stunde bei 37ºC vor der Rotationsmessung fortgesetzt.

Beispiel 3

Elektro-Rotation von mit Antikörpern beschichteten Polystyrol-Kügelchen - E. coli-Komplexe

Eine Probe von 15 ul jeder Suspension der in Beispiel 2 hergestellten Komplexe wurde auf die Mitte der Elektrodenanordnung des oben in bezug auf Fig. 2 beschriebenen Objektträgers gegeben und durch ein Deckglas bedeckt. Der Objektträger wurde auf die Mikroskop-Unterlage der in bezug auf Fig. 1 beschriebenen Vorrichtung gelegt und die Kügelchen wurden unter Verwendung eines 300 Hz Feldes mit einer Spitze-Spitze-Spannung von 6 V einer Elektro- Rotation unterzogen. Die rotierenden Kügelchen wurden mittels der mit einem Fernsehbildschirm verbundenen CCD-Kamera visualisiert und die Anzahl der von den einzelnen Kügelchen in 30 Sekunden ausgeführten Rotationen wurde mit dem Auge und einer Stoppuhr gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 gezeigt. Jeder Punkt in der Figur stellt die Rotationsrate dar, die für ein bestimmtes einzelnes Partikel unter dem Mikroskop beobachtet wurde. Es ist ersichtlich, daß eine Streuung der Rotationsraten bei Kontroll-Kügelchen beobachtet werden konnte (mit Antikörpern beschichtete Kügelchen, die in der Abwesenheit von E. coli inkubiert wurden), daß jedoch wesentlich schneller rotierende Kügelchen sowohl bei 10&supmin;¹ als auch 10&supmin;³ Verdünnungen beobachtet werden konnten. Die Verdünnung 10&supmin;³ entspricht ungefähr 10000 E. coli Organismen in der gesamten verwendeten 100 ul Probe. Es kann beobachtet werden, daß die Rotationsrate, die bei der Verdünnung von 10&supmin;¹ beobachtet wurde, etwas geringer ist als bei 10&supmin;³. Der Grund hierfür kann darin bestehen, daß mehr E. coli Organismen sich an jedes beobachtete Kügelchen binden. Dadurch würde ein Komplex erzeugt, welcher an sich weniger asymmetrisch ist in bezug auf seine dielektrischen Eigenschaften, als wenn der Komplex aus einem einzigen Kügelchen und einem einzigen Organismus bestehen würde.

Beispiel 4

Vergleich von Elektro-Rotations-Eigenschaften von lebensfähigen und nicht lebensfähigen E. coli

Eine Suspension von nicht lebensfähigen E. coli Organismen wurde erzeugt durch Behandeln der obengenannten Vorratssuspension von lebensfähigen E. coli (10&sup7; Organismen pro 100 ul) mit Bleichmittel und die Lebensunfähigkeit der Organismen wurde nach der Bleichmittel-Behandlung geprüft durch Ablagerung auf einem geeigneten Wachstumsmedium. Die Elektro-Rotations- Eigenschaften der lebendigen Vorratssuspension und der mit Bleichmittel behandelten Vorratssuspension wurden nach dem Bilden des mit Antikörper beschichteten Kügelchen - E. coli Organismus-Komplexe wie oben in Beispiel 3 beschrieben, verglichen und dieses Verfahren wurde auch unter Verwendung von 10&supmin;¹ Verdünnungen der lebendigen und mit Bleichmittel behandelten Vorratssuspensionen ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 gezeigt. Es ist ersichtlich, daß, während die nicht lebensfähigen mit Bleichmittel behandelten Organismen Elektro-Rotation bei Raten produzieren, die geringfügig kleiner sind als die Kontrolle, die lebendigen Organismen eine Elektro-Rotation bei bedeutend höheren Raten erzeugen, wodurch die Fähigkeit der Elektro-Rotations-Untersuchung gezeigt wird, zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen E. coli bei Verdünnungen von mindestens bis auf 106 Organismen pro lOOpl der Probe herab zu unterscheiden.

Beispiel 5

Elektro-Rotations-Analvse von mit Antikörpern beschichteten Polystyrol-Kügelchen - IgG Gold- Konjugat

Kommerziell erhältliche Goldpartikel, die mit ca. 4 lgG Antikörper-Molekülen pro Goldpartikel (10 nm Durchmesser) komplexiert sind, wurden zum Bilden von Komplexen mit mit Anti-lgG Antikörpern beschichteten Kügelchen, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Eine Vorratssuspension von lgG-Gold-Konjugat-Partikeln, welche pro 100 ul 10&supmin;¹³ bis 10¹&sup5; Goldpartikel enthält, wurde zusammen mit zunehmenden Verdünnungen im Bereich zwischen dem 10&supmin;¹ und 10&supmin;²³-fachen verwendet und die resultierenden Komplexe wurden der Elektro-Rotations-Analyse, wie oben in Beispiel 3 beschrieben, unterzogen. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 gezeigt. Die Kontrolle stellt mit Antikörpern beschichtete Kügelchen dar, welche nicht dem lgG-Gold-Konjugat ausgesetzt wurden. Es ist ersichtlich, daß die Präsenz des IgG-Gold-Konjugats bis herab zu Verdünnungen von 10&supmin;¹³ der Materialsuspension festgestellt werden kann, bei welchem Pegel es wahrscheinlich ist, daß man die Rotation von Kügelchen beobachtet, mit welchen nur ein einzelnes IgG-Gold-Partikel durch Komplexbildung verbunden ist.

Beispiel 6

Elektro-Rotations-Analvse eines Ferrofluids (Eisenpartikel - Antikörperkomplex

Das vorhergehende Beispiel wurde wiederholt, wobei anstelle des IgG-Goldkomplexes Partikel verwendet wurden, die aus Eisen, komplexiert mit zahlreichen Antikörpermolekülen (Durchmesser ungefähr 16 nms) bestehen. Wiederum wurden Verdünnungen einer Vorratslösung, welche ungefähr 10¹³ Eisenpartikel pro 100 ul enthält, im Bereich von 10&supmin;¹ bis 10&supmin; ²¹ fachen verwendet. Die Ergebnisse für unterschiedliche Verdünnungen sind in Fig. 14 und 15 gezeigt.

Beispiel 7

Elektro-Rotations-Untersuchung von Biotin unter Verwendung von Polystyrol-Kügelchen Antibiotin-Komplexe und Streptavidin - Meerrettich-Peroxidase-Konjugat

Eine Vorratslösung und ein Verdünnungsbereich von dieser mit ungefähr 2,4 · 10¹&sup4; Biotin- Molekülen pro 100 ul (Vorratskonzentration) wurden mit Suspensionen von mit Antibiotin beschichteten Polystyrol-Mikrokügelchen und Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) Konjugat inkubiert, um Elektro-Rotations-Komplexe zu erzeugen, die aus einem Mikropartikel bestehen, welches über Antikörper mit Biotin verbunden ist, mit welchem ebenfalls Meerrettich- Peroxidase als Elektro-Rotations-Markierung verbunden ist. Die Ergebnisse für eine Verdünnungsreihe im Bereich von 10&supmin;¹ bis 10&supmin;¹&sup9; facher Verdünnung der Vorratslösung sind in Fig. 16 gezeigt. Erhöhte Rotationsgeschwindigkeitsraten sind zumindest bis auf die 10&supmin;¹&sup7; fache Verdünnungen herab beobachtbar, welche nur ca. 2400 Biotin-Molekülen pro 100 ul entsprechen.

Beispiel 8

Elektro-Rotations-Analvse von Polystyrol-Kügelchen - Oligonukleotid-Fangsonde - PCR Produktkomplex-Bindung von Fangsonden an Kügelchen

Eine 39 bp lange Fangsonde, die 20 bp von der Codiersequenz von dem hlyA-Gen in Listeria- Monocytogen erkennt (das Komplement der Sequenz von Base 858 bis 877 gemäß Mengaud et al., 1986) wurde synthetisiert. Das Oligonukleotid wurde dann am 5-Ende phosphoryliert gemäß Maniatis et al (1991); durch Inkubation mit T4 Polynukleotid-Kinase in Anwesenheit von ATP und kommerziell erhaltenem Puffer für 2 Stunden bei 37ºC.
Das phosphorylierte Oligonukleotid wurde an Polystyrol-Mikrosphären mit Oberflächen- Aminogruppen (Polybead Amino Microspheres, 6 um Durchmesser Polysciences Inc.) durch Inkubation über Nacht in einem 0,1 M Imidazol-Puffer pH7 und 0,1 M 1-Ethyl-3-(3- Dimethylaminopropyl)-Carbodümid (Lund et al., 1988) gebunden.

Fangreaktion

Vor der Fangreaktion wurde die Target-DNA (144 bp doppelsträngiges biotin-markiertes DNA- Fragment erzeugt durch PCR unter Verwendung von Primern, die die Basen 757 bis 901 in dem hlyA-Gen flankieren, Mengaud et al., 1986) für 5 Minuten bei 95ºC in einem Konzentrationsbereich pro 100 ug der Probe denaturiert, was in Fig. 17 gezeigt ist. Die Reaktion beinhaltete Target-DNA, Polystyrol-Kügelchen mit Fangsonden und PCR-Puffer.
Wärmebehandlung der Targetsequenz mit der Fangsonde fand bei 55ºC für 15 Minuten statt, gefolgt von einem Wasch-Schritt bei 50ºC und weiteren drei Waschungen bei Zimmertemperatur in 2 · SSC + 0,1% SDS.
Die Kügelchen wurden durch Inkubation in 1% Rinderserum-Albumin (BSA) in PBS-Lösung für 30 Minuten bei Zimmertemperatur blockiert, gefolgt durch Waschen in PBS und Resuspension in PBS, welches 0,05% Tween-20 (PBST) enthielt. Die Kügelchen ließ man dann mit Anti-Biotin- Antikörpern reagieren, welche in Goat (Sigma) für 30 Minuten bei Zimmertemperatur entwickelt wurden (engl. goat = Ziege). Darauf folgten vier Waschungen in PBST und eine zweite Reaktion auf an Gold konjugierte Anti-Goat-Antikörper für 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Nach vier Waschungen in PBST und weiteren vier Waschungen in sterilem Wasser wurden die Kügelchen unter dem Mikroskop durch Elektro-Rotation analysiert, wie in früheren Beispielen beschrieben.
Wie aus Fig. 17 ersichtlich ist, kann das PCR-Produkt bis herab zu 0,5 pg/100 ug detektiert werden.

Beispiel 9

Diskriminierung von lebendigen und toten Cryptosporidium-Oozyten

Cryptosporidium ist ein Parasit, welcher die Eingeweiden von grasenden Tieren infiziert, und oft in unbehandeltem Wasser und manchmal im Trinkwasser gefunden wird.
Wir haben eine Elektrorotations-Untersuchung verwendet, um zwischen lebendigen und toten Cryptosporidium-Oozyten zu unterscheiden. Kunststoff-Mikrosphären beschichtet mit Anti- Cryptosporidium-Antikörper werden mit einer lebendige und tote Cryptosporidia enthaltenden Probe gemischt. Die Bildung von Mikropartikel-Organismus-Komplexen zeigt die Präsenz der Cryptosporidia. Indem die Komplexe einer Elektrorotation bei 100 Hz unterzogen werden, wird bewirkt, daß die toten Organismuskomplexe entgegen dem Feld rotieren, während die lebendigen Organismuskomplexe dies nicht tun. Bei 1 MHz wird eine Co-Feldrotation von sowohl den lebendigen als auch toten Komplexen beobachtet.
Ein ähnlicher Lösungsansatz kann bei einem breiten Bereich von anderen Organismen angewandt werden, beispielsweise Giardia, Hefe, Bakterien, mit Viren infizierte Zellen, z. B. HIV-infizierte Leukozyten und Leukämie-Zellen.

Claims

1. Verfahren der Analyse durch Beobachten von Feldrotations-Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren aufweist:

Bilden eines Komplexes zwischen einem Mikropartikel, einem mit dem Mikropartikel verbundenen, verknüpfenden Molekülteil und einem Target, wobei der Komplex Feld-Rotationseigenschafteri hat, welche sich deutlich von denjenigen des Mikropartikels und des verknüpfenden Molekülteils für sich allein unterscheiden, und Beobachten dieser charakteristischen Feldrotations-Eigenschaften des Komplexes.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die beobachteten Feldrotations-Eigenschaften Elektro-Rotations-Eigenschaften sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das verknüpfende Molekülteil ein Antikörper oder ein Antikörperfragment mit Antikörper-Aktivität, ein Antigen, eine Nukleinsäure-Sonde oder eine Nukleinsäureanalog-Sonde mit selektiver Affinität für komplementäre Nukleinsäuresequenzen, oder Avidin oder ein avidinähnliches Molekül ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Komplex weiterhin eine mit dem Target verbundene Markierung aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Markierung ein zweites verknüpfendes Molekülteil mit einer Affinität für das Target und ein markierendes Molekülteil, welches von dem verknüpfenden Molekülteil getragen wird, aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das verknüpfende Molekülteil ein Antikörper, ein Antikörperfragment mit Antikörper-Aktivität, ein Antigen, eine Nukleinsäure-Sonde, eine Nukleinsäureanalog-Sonde, Avidin oder ein avidinähnliches Molekül ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das markierende Molekülteil, welches von dem verknüpfenden Molekülteil in der Markierung getragen wird, ein Mikroorganismus, ein Metallpartikel, ein Polymertropfen (Polymerperle) oder ein Magnetpartikel ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die an das Target gebundene Markierung ein Magnetpartikel aufweist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Elektrorotation unter Verwendung eines elektrischen Feldes, welches bei zwischen 100 Hz und 1000 Hz rotiert, beobachtet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das rotierende elektrische Feld eine Stärke von zwischen 50 und 500 Volt pro Zentimeter hat.

11. Kit zur Verwendung bei der Analyse durch Elektrorotation, das Mikropartikel, welche verknüpfende Molekülteile tragen, die geeignet sind, einen Komplex mit einer besonderen Targetart zu bilden, und mindestens eines der folgenden aufweist:

(a) eine eine Probe aufnehmende Oberfläche, auf welcher ein Muster von Elektroden ist, welche ein Analysefeld umgeben, welches für die Verwendung in einer Elektrorotations-Untersuchung geeignet ist; oder

(b) eine Elektrorotations-Markierung, welche geeignet ist, einen Komplex mit derselben Targetart zu bilden.

12. Kit nach Anspruch 11, wobei die die Probe aufnehmende Oberfläche auf einem durchlässigen Element vorgesehen ist, welches eine Probe filtern kann, um die Targetart zu konzentrieren.

13. Kit nach Anspruch 12, mit der eine Probe aufnehmenden Oberfläche, wobei die Elektroden auf der Oberfläche eines mikroporösen Filters sind, durch welches ein Probevolumen hindurchgelangen soll, um Mikroorganismen auf der Membran zum Binden an dem Mikropartikel zu fangen.

14. Kit nach Anspruch 13, mit einer Einrichtung zum Durchleiten eines Flüssigkeitsvolumens durch den mikroporösen Filter, welcher die eine Probe aufnehmende Oberfläche bereitstellt.