DE69317883T2

DE69317883T2 - Neue Sieben-Transmembran-Rezeptor V28

Info

Publication number: DE69317883T2
Application number: DE69317883T
Authority: DE
Inventors: Ronald Bothell Wa 98011 Godiska; Patrick W. Seattle Wa 98112 Gray; Vicki Louise Seattle Wa 98109 Schweickart
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1992-11-17
Filing date: 1993-11-17
Publication date: 1998-11-12
Anticipated expiration: 2013-11-18
Also published as: ES2118372T3; US5759804A; JP2000350582A; EP0630405B1; JP2004298202A; WO1994012635A3; EP0846762A2; WO1994012635A2; US6348574B1; DE69317883D1; CA2128208C; JP2004000268A; EP0630405A1; CA2128208A1; JPH07503145A; EP0846762A3; ATE164884T1; JP2006129879A; DK0630405T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine Familie von zellulären Rezeptoren, die bei der Signaltransduktion beteiligt sind, Sieben-Transmembran-Rezeptoren und insbesondere das Klonieren und die Expression von DNA-Sequenzen, die für sieben neue Sieben-Transmembran-Rezeptoren kodieren.

Hintergrund

Die Sieben-Transmembran-Rezeptoren (auch bekannt als heptahelikale, schlangenförmige oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) umfassen eine Superfamilie von strukturell verwandten Molekülen. Mögliche Beziehungen unter Sieben-Transmembran- Rezeptoren (7TM-Rezeptoren), für die eine Aminosäuresequenz kürzlich berichtet worden war, sind besprochen in Probst et al., DNA and Cell Biology, 11(1): 1-20 (1992). Kurz gesagt weisen die 7TM-Rezeptoren nachweisbare Aminosäuresequenz- Ähnlichkeiten auf und alle scheinen eine Anzahl Strukturcharakteristika zu teilen, einschließlich: einen extrazellulären Aminoterminus; sieben vorherrschend hydrophobe α-helikale Domänen (von etwa 20-30 Aminosäuren), von denen man glaubt, daß sie die Zellmembran durchspannen und als transmembrane Domänen 1-7 bezeichnet werden; etwa 20 hoch konservierte Aminosäuren; und einen zytoplasmatischen Carboxyterminus. Die Aminosäure-Ähnlichkeit unter verschiedenen 7TM- Rezeptoren reicht von etwa 10% bis zu mehr als 80% und Rezeptoren, die ähnliche oder identische Liganden erkennen, weisen im allgemeinen hohe Homologiewerte auf. Die 7TM- Rezeptoren können auf der Grundlage ihrer Homologiegrade und/oder der Liganden, die sie erkennen, in Gruppen eingeteilt werden. Zum Beispiel binden der Interleukin-8-Rezeptor, der Angiotensin II-Rezeptor, der Thrombin-Rezeptor, die Endothelin-Rezeptoren, der N-Formyl-Peptid-Rezeptor und der C5a-Rezeptor alle Peptid-Liganden und teilen eine Aminosäure-Ähnlichkeit von 20-40%.
7TM-Rezeptoren erkennen eine große Vielzahl von Liganden (z.B. Licht, Geruchsstoffe, Neurotransmitter, Peptidhormone und kleine Moleküle) und übertragen ihre Signale vermittels heterotrimerer Guanin-Nukleotid-bindender Proteine (G-Proteine), die eine große Menge an biologischen Aktivitäten (einschließlich visueller Erregung, olfaktorischer Rezeption und Neurotransmission) durch verschiedene intrazelluläre Enzyme, Ionenkanäle und Transporter bewirken. Signaltransduktionswege sind aufgeklärt worden für Rhodopsin [Khorana, J. Biol. Chem. 267: 1-4 (1992) und Stryer, J. Biol. Chem., 266: 10711-10714(1991)] und den beta-adrenergen Rezeptoren [Dohlman et al., Ann. Rev. Biochem., 60: 653-688 (1991)] und man glaubt, daß sie die Wege veranschaulichen, die von anderen 7TM-Rezeptoren verwendet werden. Man sagt, daß jeder 7TM-Rezeptor mit einem speziellen G-Protein an der intrazellulären Oberfläche der Zytoplasmamembran assoziiert. Die Bindung des Rezeptors an seinen Liganden soll zur Aktivierung (d. h. Austausch von GTP für GDP auf der α-Untereinheit) des G-Proteins führen, das wiederum spezifische intrazelluläre signalübertragende Enzyme und Kanäle stimuliert. Somit besteht die Funktion eines jeden 7TM-Rezeptors darin, seinen spezifischen Liganden von dem komplexen extrazellulären Milieu zu unterscheiden und dann G-Proteine zu aktivieren, um ein spezifisches intrazelluläres Signal zu produzieren. Cotecchia et al., Proc. Nall. Acad. Scil. USA, 87: 2896-2900 (1990) berichtet, daß die intrazelluläre Schleife der dritten Transmembran-Domäne der 7TM-Rezeptoren wichtige Determinanten für Rezeptorkopplung an spezifische G-Proteine umfaßt, jedoch faßt Lefkowitz, Nature, 265: 603-604 (1993) Berichte zusammen, daß andere Regionen von 7TM-Rezeptoren auch wichtig darfür sein können, daß 7TM-Rezeptoren in einer erzwungenen, inaktiven Konformation beibehalten werden, bis Ligandenbindung auftritt.
Kürzlich sind mehrere 7TM-Rezeptoren identifiziert worden, die Liganden erkennen, die wichtig sind für immunologische und hämostatische Aktivitäten. Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991) beschreibt den Interleukin-8-Rezeptor (IL8R1) als bei neutrophiler Chemotaxis beteiligt und Sasaki et al., Nature, 351: 230-233 (1991) berichtet, daß der Angiotensin 11-Rezeptor (AT2R) beteiligt ist bei vaskulärer Hämostase. In ähnlicher Weise regulieren die Endothelin- Rezeptoren (Arai, et al., Nature, 348: 730-732 (1990)] Vasokonstriktion und Tonus von glatten Muskeln. Der C5a-Rezeptor vermittelt Chemotaxis, Freisetzung granulärer Enzyme und Superoxid-Erzeugung in vitro und scheint bei Anaphylaxe und septischem Schock in vivo beteiligt zu sein [Gerard und Gerard, Nature, 349: 614-617 (1991)]. Thrombin wird auch von einem 7TM-Rezeptor erkannt und ist ein potenter Aktivator von Plättchenaggregation, Monozytenchemotaxis, Lymphozytenmitogenese und vermittelt entzündliche Reaktionen auf Gefäßverletzung hin. Der N-Formyl-Peptid (f-Met-Leu-Phe)-Rezeptor ist verantwortlich für neutrophilen Chemotaxis und Aktivierung [Thomas et al., J. Biol. Chem. 265: 20061 (1990)]. Während diese 7TM-Rezeptoren alle Peptid-Liganden aufweisen, vermitteln andere 7TM-Rezeptoren, die kleine organische Verbindungen erkennen, auch proinflammatorische Aktivitäten. Zum Beispiel erkennt der Rezeptor für Plättchenaktivierenden-Faktor ein bioaktives Phospholipid [Honda et al., Nature, 349: 342-346 (1991)], das Plättchenaggregation und endotoxischen Schock verursacht. Der Thromboxan-A2-Rezeptor erkennt einen Arachidonat-Metaboliten, der auch Vasokonstriktion und Plättchenaggregation stimuliert und bei Schlaganfall und bronchialem Asthma einbezogen ist [Hirata et al., Nature, 349: 617-620 (1991)].
Man hat berichtet, daß Mutationen im dritten intrazellulären Loop eines im 7TM-Rezeptors (des Thyrotropin-Rezeptors) und in der benachbarten sechsten Transmembran-Domäne eines weiteren 7TM-Rezeptors (des Rezeptors für Luteinisierungshormon) die genetischen Defekte sind, die für eine ungewöhnliche Form von Hyperthyroidismus [Parma et al., Nature, 365: 649-651 (1993)] bzw. für familiäre vorzeitige Pubertät [Shenker et al., Nature, 365: 652-654 (1993)] sind. In beidenfällen führen die Mutationen zur konstitutiven Aktivierung der 7TM-Rezeptoren. Kürzlich haben andere Studien gezeigt, daß Mutationen, die die Aktivierung von 7TM-Rezeptoren verhindern, verantwortlich sind für Zustände von Hormonresistenzen, die verantwortlich sind für Erkrankungen wie kongenitalenen nephrogenen Diabetes insipidus. Siehe Rosenthal et al., J. Biol. Chem., 268, 13030-13033 (1993). Noch andere Studien haben gezeigt, daß verschiedenen 7TM-Rezeptoren als Protoonkogene funktionieren können und durch Mutationsänderungen aktiviert werden können. Siehe zum Beispiel Allen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11354- 11358 (1991), der vorschlägt, daß spontan auftretende Mutationen in einigen 7TM-Rezeptoren die normale Funktion der Rezeptoren verändern und zu unkontrolliertem Zellwachstum führen können, das mit menschlichen Krankheitszuständen verbunden ist wie Neoplasie und Atherosklerose. Deshalb können Mutationen in 7TM-Rezeptoren einer Vielzahl von menschlichen Pathologien zugrundeliegen.
Da eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen für 7TM- Rezeptoren entworfen werden können, die bei immunologischen Prozessen sowohl in gesunden als auch krankhaften Zuständen einbezogen sein können, und da man allgemein annimmt, daß viele Proteine in die immunologischen Prozessen einbezogen sind, besteht andauernd ein Bedarf in der Technik zur Identifizierung zusätzlicher 7TM-Rezeptoren, die an derartigen Prozessen teilnehmen und insbesondere ein Bedarf an Information zum spezifischen Identifizieren und Charakterisieren derartiger Proteine hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz Isolierung von DNA, die einen neuen 7TM-Rezeptor kodiert, liefert auch die Basis für die Bestimmung der Rolle des Rezeptors in gesunden und krankhaften Zuständen. In dem Grade, in dem derartige Rezeptoren die Grundlage für die Entwicklung von therapeutischen und/oder diagnostischen Agenzien bilden können, ist es wichtig, daß die sie kodierende DNA isoliert wird. Die isolierte DNA würde, z. B., die Produktion der 7TM-Proteine im großen Maßstab bereitstellen, die Identifizierung von Zellen, die diese natürlicher Weise produzieren, erlauben und Herstellung/ Identifizierung von Antkörper-Substanzen und/oder anderen neuen Bindungssubstanzen (einschließlich natürlicher Liganden, Agonisten und Antagonisten) erlauben, die spezifisch mit einem bestimmten 7TM- Rezeptor (oder Gruppe von Rezeptoren) reagieren und die die Fähigkeit aufweisen, die biologischen Aktivitäten des Rezeptors/der Rezeptoren zu modulieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert gereinigte und isolierte Polynukleotide (d. h. DNA-Sequenzen und RNA-Transkripte davon), die einen neuen 7TM-Rezeptor kodieren, der als V28 bezeichnet wird, ebenso wie Polypeptid-Varianten (einschließlich Fragmenten und Analogen) davon, die wenigstens eine Liganden/Rezep-tor-Bindungsaktivität oder immunologische Eigenschaften aufweisen, die für den 7TM-Rezeptor spezifisch sind. Die Erfindung, wie hierin beansprucht, ist spezifisch auf einen Gegenstand gerichtet, der den V28-Sieben-Transmembran-Rezeptor betrifft, einschließlich Polynukleotide, die V28 kodieren und seine Fragmente; V28-Polypeptide; Antkörper, die spezifisch sind für V28 und Verfahren, die den V28-Rezeptor, anti-V28-Antikörper oder das V28-Gen einbeziehen. Viele der Lehren in der Anmeldung sind beispielhaft, einschließlich Lehren betreffend Gen- und Proteinisolierung, Produktion von rekombinantem Protein, Antikörperproduktion und Genexpressions-Studien. Derartige Lehren sollen und werden als anwendbar verstanden auf alle der Sieben-Transmembran-Erfindungen, wie hierin gelehrt, einschließlich V28, unabhängig davon, ob das spezielle Beispiel den V28-Sieben- Transmembran-Rezeptor betrifft oder die anderen Sieben- Transmembran-Rezeptoren (V31, V112, R20, R2, R12 und RM3), die hierin gelehrt werden. Fragmente eines 7TM-Rezeptors der Erfindung, der der N-terminalen extrazellulären Domäne entspricht; die Transmembran-Domänen; die einzelnen extrazellulären und intrazellären Loops, die die Transmembran-Domänen verbinden; die C-terminale cytoplasmatische Domäne und Fusionen davon, werden speziell betrachtet. Bevorzugte DNA- Sequenzen der Erfindung schließen genomische und cDNA-Sequenzen ebenso ein wie ganz oder teilweise chemisch synthe tisierte DNA-Sequenzen.
Spezifisch die Polynukleotid-Sequenzen der vorliegenden Erfindung illustrierend ist das DNA-Insert, das V28 kodiert, ein 7TM-Rezeptor in einem Plasmid, das bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 12. Oktober 1992 hinterlegt wurde und dem man die ATCC-Zugangsnummer 75330 zugewiesen hat.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung werden biologisch aktive Plasmid- und virale DNA-Vektoren vorgesehen, die DNA-Sequenzen der Erfindung beinhalten, ebenso wie Vektoren, worin die DNA, die einen 7TM-Rezeptor oder eine 7TM- Rezeptor-Variante kodiert, operativ an eine endogene oder heterologe Expressionkontrollsequenz gebunden ist. Ebenso werden von der Erfindung vorgesehen prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen, die stabil mit einer DNA-Sequenz der Erfindung transformiert oder transfiziert sind, so daß der 7TM-Rezeptor-Polypeptid oder das Variantenpolypeptid, das durch die DNA-Sequenz kodiert ist, in der Wirtszelle exprimiert wird. Wirtszellen, die derartige 7TM-Produkte exprimieren, können einer Vielzahl von Zwecken dienen. In dem Maß, wie die exprimierten Produkte auf den Wirtszellenoberflächen "angezeigt" werden, können die Zellen ein wertvolles Immunogen für die Entwicklung einer Antikörpersubstanz bilden, die spezifisch mit 7TM-Re-zeptoren oder 7TM-Rezeptorvarianten immunreaktiv ist. Wirtszellen der Erfindung sind hervorragend geeignet für Verfahren zur Herstellung von 7TM- Rezeptoren im großen Maßstab, wenn Zellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden und die 7TM-Rezeptor- Polypeptid-Produkte von den Zellen oder vom Medium, in dem die Zellen kultiviert werden, isoliert werden. Wirtszellen, die die neuen 7TM-Rezeptoren exprimieren, sind auch hilfreich bei Tests zum Identifizieren von Antagonisten oder Agonisten von 7TM-Rezeptorbindung.
Der neue 7TM-Rezeptor der Erfindung kann erhalten werden als ein Isolat aus natürlichen Zellquellen, wird aber bevorzugterweise produziert durch rekombinante Vorgehensweisen, die Wirtszellen der Erfindung einbeziehen. Die Produkte können als vollständig oder teilweise glycosylierte, teilweise oder vollständig deglycosylierte oder nicht-glycosylierte Formen erhalten werden, abhängig von der für die rekombinante Produktion ausgewählten Wirtszelle und/oder Verarbeitung nach Isolierung. 7TM-Rezeptorvarianten der Erfindung können Wasser-lösliche und unlösliche Polypeptid- oder Peptidfragmente umfassen und können auch Polypeptidanaloge umfassen, worin eine oder mehrere der natürlicherweise ausgegebenen Aminosäuren deletiert oder ersetzt ist: (1) ohne Verlust, und bevorzugterweise mit Verstärkung, einer oder mehrerer biobgischer Aktivitäten oder immunologischer Charakteristiken, die für den 7TM-Rezeptor spezifisch sind; oder (2) mit spezifischem Unvermögen einer speziellen Liganden/Rezeptor- Bindungsfunktion. Analoge Polypeptide, die zusätzliche Aminosäurereste (z. B. Lysin) einschließen, die die Ausbildung von Multimeren erleichtern, werden betrachtet.
Von der vorliegenden Erfindung sind auch Antikörpersubstanzen (zum Beispiel monoklonale und polyklonale Antikörper, einkettige Antikörper, chimäre Antikörper, CDR-gepfropfte Antikörper und dergleichen) oder andere Bindungsproteine umfaßt, die spezifisch reaktiv sind mit 7TM-Rezeptor oder 7TM- Rezeptor-varianten der Erfindung. Antikörpersubstanzen können entwickelt werden unter Verwendung isolierter natürlicher oder rekombinanter 7TM-Rezeptorprodukte (einschließlich Peptiden) oder Zellen, die derartige Produkte auf ihren Oberflächen exprimieren. Die Antikörpersubstanzen sind wiederum hilfreich in Komplexen zur Immunisierung, um antiidiotypische Antikörper zu erzeugen, ebenso wie zum Reinigen von Polypeptiden der Erfindung und zum Identifizieren von Zellen, die die Polypeptide auf ihren Oberflächen produzieren. Tests zum Nachweis und Quantifizieren von 7TM-Rezeptoren auf Zelloberflächen und in Flüssigkeiten wie bspw. Serum, können eine einzelne Antikörpersubstanz oder eine Vielzahl von Antikörper-Substanzen in einem "Sandwich"-Testformat verknüpfen. Die Antikörpersubstanz ebenso wie Agonisten oder Antagonisten von 7TM-Rezeptorbindung (z. B. kleine Moleküle oder Peptide) sind auch augenscheinlich hilfreich beim Modulieren (d. h. Blockieren, Inhibieren oder Stimulieren) von Ligand/Rezeptor-Bindungsreaktionen des 7TM- Rezeptors der Erfindung, insbesondere jene Reaktionen, die bei immunologischen und/oder entzündlichen Ereignissen in vivo einbezogen sind.
Der wissenschaftliche Wert der durch die Offenbarungen der DNA- und Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung beigetragenen Information ist augenscheinlich. Als eine Serie von Beispielen macht Kenntnis der Sequenz einer cDNA für einen 7TM-Rezeptor die Isolierung von genomischen DNA-Sequenzen durch DNA/DNA-Hybridisierung möglich, die für den 7TM- Rezeptor kodieren und die regulatorischen Kontrollsequenzen für die 7TM-Rezeptor-Genexpression spezifizieren, wie Promotoren, Operatoren und dergleichen. Man erwartet im gleichen Maße, daß DNA/DNA-Hybridisierungsprozeduren, die mit DNA- Sequenzen der Erfindung und unter stringenten Bedingungen ausgeführt werden, die Identifizierung von DNAs erlauben, die allelische Varianten eines 7TM-Rezeptors, mutierte Formen eines 7TM-Rezeptors, der mit einem spezifischen Erkrankungszustand verbunden ist, andere strukturell verwandte Proteine, die die biologische und/oder immunologische Spezifität des 7TM-Rezeptors teilen, und Proteine von nichtmenschlichen Spezies, die homolog zu den 7TM-Rezeptor sind, kodieren. DNAs der Erfindung sind nützlich in DNA/RNA-Hybridisierungstests, um die Fähigkeit von Zellen nachzuweisen, einen 7TM-Rezeptor zu synthetisieren.
Durch die Bereitstellung von DNA-Sequenzen der Erfindung sind auch verfügbar gemacht therapeutisch nützliche Oligonukleotide (z. B. antisense Oligonukleotide, Oligonukleotide für Triplex-Bildung oder Aptamere), die relevant sind bei der Regulierung der Expression eines 7TM-Rezeptors durch jene Zellen, die herkömmlicherweise dieselben exprimieren [wie für andere Oligonukleotide in Crooke et al., BIO/TECHNOLOGY, 10: 882-886 (1992) und in Alper, BIO/TECHNOLOGY, 11: 1225 (1993) beschrieben ist]. DNA-Sequenzen der Erfindung können auch in Vektoren verwendet werden, die für Gentherapie entwickelt wurden, wie beispielsweise jene bei Mitani et al., TIBTECH, 11: 162-166 (1993) (therapeutische Gene liefernd); Sikora, TIBTECH, 11: 197-201 (1993) (Gentherapie für Krebs); und Findeis et al., TIBTECH, 11: 202-205 (1993) (Gentherapie vermittels Rezeptoren)
Viele Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden Zeichnungen und der detaillierten Beschreibung offensichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Figur 1 ist eine schematische Darstellung einer möglichen Konformation des V31-7TM-Rezeptors in einer Zellmembran, worin die Transmembran-Domäne 1 zwischen Punkten A und B ist, Transmembran-Domäne 2 zwischen Punkten C und D, Transmembran-Domäne 3 zwischen Punkten E und F, Transmembran- Domäne 4 zwischen Punkten G und H, Transmembran-Domäne 5 zwischen Punkten I und J, Transmembran-Domäne 6 zwischen Punkten K und L und Transmembran-Domäne 7 zwischen Punkten M und N.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung wird veranschaulicht durch die folgenden Beispiele, die die Isolierung menschlicher genomischer und cDNA-Sequenzen betrifft, die neue 7TM-Rezeptoren kodieren, die hierin bezeichnet werden als V28, V31, V112, R20, R2, R12 und RM3. Insbesondere beschreibt Beispiel 1 die Isolierung von PCR-Fragmenten, die Teile der R20-, V31-, V28- und V112-7TM-Rezeptoren kodieren. Beispiel 2 beschreibt die Isolierung eines vollständigen menschlichen genomischen V31 Klons. Beispiel 3 beschreibt die Isolierung eines menschichen cDNA-Klons von V31 und weitere Charakterisierung des genomischen V31-Klons. Beispiel 4 stellt Experimente dar, die den chromosomalen Ort des menschlichen V31-Gens offenbart. Beispiel 5 beschreibt das Klonieren eines vollständigen murinen genomischen V31-Klons. Das Klonieren eines vollständigen menschlichen genomischen Klons für V28 ist beschrieben in Beispiel 6. Beispiel 7 beschreibt die Isolierung einer vollständigen menschlichen V28-cDNA. Beispiel 8 gibt eine Beschreibung einer vollständigen menschlichen V112-cDNA an. Beispiel 9 beschreibt die Isolierung einer vollständigen genomischen DNA, die für menschichen R20 kodiert. Die Isolierung von vollständigen R2- und R12-7TM- Rezeptor-Genen von einer menschlichen genomischen fötalen Lebergenbank ist in Einzelheiten beschrieben in Beispiel 10. Beispiel 11 beschreibt das Klonieren einer cDNA, die für den RM3-7TM-Rezeptor kodiert. Beispiel 12 präsentiert einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von 7TM-Rezeptoren der Erfindung mit Aminosäuresequenzen von kürzlich beschriebenen 7TM- Rezeptoren. Die Transfektion von menschlichen Zellen mit genomischen und cDNA- Sequenzen, die für den 7TM-Rezeptor V31 und den Phänotyp der transfizierten Zellen kodieren, sind detailliert beschrieben in Beispiel 13. Expression von 7TM- Rezeptoren der Erfindung in verschiedenen menschlichen Geweben und hämatopoietischen Zellinien, wie getestet durch Northern Blot- und in situ- Hybridisierung, ist beschrieben in Beispiel 14. Beispiel 15 bzw. 16 beschreibt die Expression von genomischen V31- und R20-Sequenzen als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase in E. coli, während Beispiel 17 die Expression von V31- und V28-cDNA-Sequenzen als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase in E. coli beschreibt. Beispiel 18 beschreibt die Erzeugung von polyklonalen Seren, die mit V31-Fusionsproteinen und V31-Peptiden reaktiv sind, die hilfreich sind beim Erzeugen von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, die spezifisch sind für V31. Beispiel 19 stellt verschiedene Verfahren zum Identifizieren extrazellulärer und intrazellulärer Liganden der 7TM- Rezeptoren der Erfindung dar.

Beispiel 1

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde ausgewählt als ein Verfahren zum Identifizieren neuer Mitglieder der 7TM-Rezeptor-Superfamilie.

Konstruktion und Synthese von PCR-Primern

Anfangs wurden acht verschiedene degenerierte Oligonukleotid-Primer konstruiert auf der Basis der Aminosäuresequenz des Rezeptors für Plättchen-aktivierenden-Faktor. PCR mit den acht Primerpools verfehlten es, irgendwelche neuen 7TM- Rezeptor-Sequenzen zu amplifizieren, obwohl mehrere Klone für den Rezeptor für Plättchen-aktivierenden-Faktor amplifiziert wurden.
Ein zweiter Satz von degenerierten Primern wurde dann konstruiert von Aminosäuresequenzregionen mit hoher Ähnlichkeit zwischen IL8R1 und AT2R, die eine Gesamtaminosäureähnlichkeit von 30% aufweisen. Die erste Region mit hoher Ähnlichkeit tritt auf in der zweiten Transmembrandomäne und enthält 16 von 20 Resten, die in beiden Rezeptoren identisch sind. Ein 5'-degenerierter Primerpool (wo jeder Primer 45 Nukleotide lang war plus eine Klonierungsstelle, ein längerer Primer als üblicherweise für PCR verwendet) wurde auf der Grundlage dieser Sequenz synthetisiert. Die Sequenz des aufwärts gelegenen Primers ist unten in IUPAC-Nomenklatur angegeben, worin die unterstrichenen Nukleotide eine BamHI-Stelle darstellen, die eingeführt ist, um Klonieren zu erleichtern.
Primepool 1 (SEQ ID NO: 1)
GAC GTT TTT CTG TTGAAT TTG GCT CTG GCT
GAC YTA YKC TTT KYM CTG ACY TTG CCM MTS TGG
Dieser Oligonukleotid-Pool war an zehn Stellen degeneriert, um multiple Codon-Auswahlen und die vier Aminosäure-Unterschiede zwischen IL8R1 und AT2R zu begründen. Zehn Positionen waren nicht degeneriert, aber waren statt dessen mit einem einzigen "Best Guess"-Nukleotid auf der Grundlage von menschlichen Codonfrequenztafeln in Wada et al., Nucl. Acids Res., 195: 1981-1986 (1991) konstruiert.
Eine zweite Region ausgedehnter Identität zwischen IL8R1 und AT2R tritt in der mutmaßlichen zweiten cytoplasmatischen Domäne auf, wo acht identische benachbarte Reste geteilt werden. Diese Region wurde verwendet, um einen stromabwärts gelegenen antisense PCR-Primerpool zu konstruieren (21 Nukleotide lang plus eine Restriktionsstelle). Die Sequenz des stromabwärtigen Primers ist unten in IUPAC-Nomenklatur angegeben, wobei die unterstrichenen Nukleotide eine HindIII- Stelle darstellen, die eingeführt ist, um Klonieren zu erleichtern.
Primerpool 2 (SEQ ID NO: 2)
GGC T GI ACI ATI GC(Y oder I) AGR TAL CGR TC
Dieses Oligonukleotid enthielt das Nukleotid Inosin an verschiedenen der degenerierten Stellen, aufgrund seiner Fähigkeit, mit mehreren Nukleotiden zu basenpaaren.

Isolierung von genomischen DNA-Sequenzen, die neue 7TM- Rezeptoren kodieren, durch PCR

Oligonukleotid-Primerpools 1 und 2 wurden verwendet, um menschliche genomische DNA zu amplifizieren, die aus Leukozyten gereinigt wurde durch das Verfahren von Blin und Stafford, Nucl. Acids Res., 3: 2303-2308 (1976). PCR wurde in einer Perkin Elmer Cetus-Maschine mit folgenden Thermozyklusparametern durchgeführt: Anfängliche 4 Minuten, um die Reaktion auf 94ºC zu bringen, gefolgt von 25 Zyklen aus (1) Denaturierungsschritt bei 94ºC für 30 Sekunden, (2) Anellierungsschritt bei 50ºC für 45 Sekunden und (3) Verlängerungsschritt bei 72ºC für 2 Minuten. Die Reaktionsmischung enthielt 1x PCR-Puffer, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM TTP, 0,01 ug/ul Primerpool 1, 0,01 ug/ul Primerpool 2, 0,125 mg/ml menschlicher genomischer DNA und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase in einem Gesamtreaktionsvolumen von 40 ul. Das beobachtete vorherrschende PCR-Produkt war von der vorhergesagten Größe von 172 Basenpaaren (bp), wie bestimmt durch Elektorphorese in einem 1,2% Agarosegel. Acht verschiedene PCR-Reaktionen wurden mit ansteigenden Mengen an MgCl&sub2; durchgeführt, die von 0,5 mM bis 2,25 mM reichten. Die Konzentration von MgCl&sub2; schien nicht die Menge an PCR- Produkt zu beeinflussen, so daß alle acht Reaktionen vereint, mit Phenol und Ohloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und dann mit Restriktions-Endonukleasen BamHI und HindIII verdaut wurden. Die verdaute DNA wurde einer Elektrophorese auf 1,2% Agarose unterworfen und die 192 bp-Bande wurde ausgeschnitten und aus dem Gel eluiert. Die wiedergewonnene DNA wurde dann in BamHI-HindIII-verdautes Plasmid Bluescript-SK (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Californien) ligiert und in bakteriellen Wirt XL-1Blue transfor miert. Mehrere tausend Klone wurden erhalten und die meisten schienen Rekombinanten zu sein, wie durch blau-weiß-Farbselektion bestimmt.
20 verschiedene Klone wurden zur DNA-Sequenzanalyse ausgewählt. Plasmid-DNA wurde hergestellt und sequenziert durch das Dideoxy-Kettenterminations-Verfahren. Die meisten der Plasmide enthalten Sequenzen entsprechend IL8R1 oder AT2R, aber zwei der zwanzig Klone enthielten eine einzigartige Sequenz, die ein Peptid mit 28% Ähnlichkeit zu IL8R1 und 46% Ähnlichkeit zu AT2R kodierte. Diese neue Sequenz wurde als R20 bezeichnet und kodierte eine Serie aus Aminosäuren, die mit einem 7TM-Rezeptor übereinstimmend ist: Die ersten 17 Reste waren allgemein hydrophil und enthielten einen hoch konservierten Cysteinrest und die letzten 22 Reste waren hydrophob, entsprechend der dritten Transmembran-Domäne.
Um zusätzlich neue Sequenzen zu identifizieren, wurden die durch PCR erhaltenen Primer unter Verwendung der Primerpools 1 und 2 durch Hybridisierung gescreent, um IL8R1-, AT2R- und R20-Klone auszuschalten. In etwa 1000 Klone wurden einzeln isoliert und in Mikrotiternäpfen angezogen. Mit der Hilfe einer Stechvorrichtung wurden die Kolonien auf Platten gestempelt, über Nacht kultiviert und auf Nitrozellulose überführt. DNA auf den Blots wurde denaturiert und nach Standardverfahren präpariert. Hybridisierung wurde dann mit ³²P- markierten Sonden vorgenommen, die spezifisch sind für IL8R1, AT2R und R20. Klone, die nicht hybridisierten, wurden dann für die Sequenzanalyse ausgewählt. Drei neue Klone wurde identifiziert, die ein 7TM-Rezeptorsegment zu kodieren schienen. Die Inserts der Klone wurden bezeichnet als V31, V28 und V112. Die Sequenz der Inserts, die für V112 (ATCC 75326), kodiert ist angegeben in SEQ ID NO:3. Ganze Gene, die für mutmaßliche 7TM-Rezeptor-Gene kodierten, bezeichnet als V31, V28 und R20, wurden von menschlichen genomischen DNA-Genbanken isoliert, die in Lambda-Phagen kloniert waren, wie unten in Beispielen 2, 6 bzw. 9 beschrieben.

Beispiel 2

Ein genomischer V31-Klon wurde isoliert durch PCR unter Verwendung der unten angegebenen spezifischen Primer.
Primer V31-nach vorne (SEQ ID NO: 4)
TGG GCC TAC AGC GCG GCC AA
Primer V31-umgekehrt (SEQ ID NO: 5)
TC AAT GCT GAT GCA AAG AAG
Eine menschliche genomische DNA-Lambda-Genbank (ATCC 37333) wurde in 150 Pools von etwa jeweils 3000 Klone fraktioniert. Die 150 Pools wurden in 15 Gruppen eingeteilt, jeweils 30000 Phagen enthaltend. PCR mit den V31-spezifischen Primern wurde vorgenommen mit den folgenden Parametern: Anfänglich vier Minuten, um die Reaktion auf 94ºC zu bringen, gefolgt von 30 Zyklen aus (1) Denaturierungsschritt bei 94ºC für 30 Sekunden (2) Anellierungsschritt bei 50ºC für 45 Sekunden und (3) Verlängerungsschritt bei 72ºC für zwei Minuten. Die Reaktionsmischung enthielt 1x PCR-Puffer, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM TTP, 0,01 ug/ul V31-nach vorne-Primer, 0,01 ug/ul V31-umgekehrt-Primer, 1ul Phagenpool-Lysat und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 ul. Eine der 15 Gruppen ergab ein PCR-Fragment der vorhergesagten Größe von 114 bp und ein einzelner Pool dieser Gruppe produzierte auch dasselbe Fragment, wenn er denselben PCR-Bedingungen unterworfen wurde. Hybridisierung wurde dann verwendet, um den V31-kodierenden Phagen zu identifizieren. Etwa 6000 Phagen wurden auf fünf 15 cm-Platten ausplattiert. Duplikat-Filter wurden auf jede Platte absorbiert und zur Hybridisierung nach Standardverfahren verarbeitet. Eine ³²P-markierte Sonde wurde hergestellt von dem V31-Segmentplasmid durch Einbau von ³²P-dCTP in eine PCR-Reaktion mit den V31-spezifischen Primern. Hybridisierung mit dieser radiomarkierten Sonde und Waschen von Filtern wurde vorgenommen unter Bedingungen reduzierter Stringenz. Die Hybridisierungslösung war 20% Formamid, 5X SSC (0,75 M Natriumchlorid, 0,075 M Natriumcitrat), 5X Denhardt's Lösung [1% Polyvinyl Pyrolidon (Sigma, St. Louis, Nissouri), 1% Ficoll, 1% Rinderserum-Albumin-Fraktion V], 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,5, und 50 ng/ml mit Ultraschall behandelte Lachssperma-DNA (Sigma). Nach übernachthybridisierung bei 42ºC wurden die Filter extensiv in 2X SSC bei 42ºC gewaschen. Ein hybridisierender Klon wurde für Plaque- Reinigung, DNA-Isolierung und Restriktionsendonukleasen- Analyse ausgewählt. Hybridisierende EcoRI und KpnI-Fragmente wurden subkloniert und einer DNA-Sequenzanalyse unterworfen. Die Sequenz zeigte, daß die V31-kodierende Sequenz in der Tat isoliert worden war und vollständig mit der 114 bp-Sequenz übereinstimmte, die durch PCR kloniert wurde. Jedoch enthielt die Sequenz nicht das gesamte 5'-Ende der kodierenden Region.
Konsequenterweise wurden mehr genomische V31-Sequenzen von einer verschiedenen menschlichen genomischen Plazenta-Genbank in Vektor Lambda-Fix-II (Stratagene) isoliert. Etwa 600.000 Phagen wurden durch Hybridisierung mit dem 5'-Ende der V31-ko-dierenden Sequenz (EcoRI-PstI-Fragment) gescreent. Die Sonde wurde durch Markieren von etwa 100 ng des denaturierten V31-DNA-Fragmentes in einer Reaktion hergestellt, die ³²P-dCTP, ³²P-dTTP, dGTP, dATP, zufällige Hexamerprimer und das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I enthielt. Nicht eingebaute Nukleotide wurden entfernt durch Passagieren der Reaktionsmischung über eine G-25 Sephadex Quick Spin-Säule (Boehringer Mannheim) entfernt. Die Sonde wurde durch Kochen denaturiert und dann mit den Phagen- Filtern über Nacht bei 42ºC in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5X SSC, 5X Denhardt's, 0,05 M Natriumphosphat, pH 6,5) und 50 ng/ml mit Ultraschall behandelter Lachssperma- DNA inkubiert. Die Filter wurden dreimal in 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 42ºC für 10 Minuten gewaschen. Die Filter wurden luftgetrocknet und dann einer Autoradiographie unterworfen. Sechs unabhängig hybridisierende Klone wurden ausgewählt für Plaque-Reinigung und Restriktionsendonukleasen-Analyse. Vier dieser Klone produzierten Hybridisierungsmuster, die mit genomischen Southerns Blots identisch waren unter Verwendung der V31-kodierenden Sequenzsonde. Das hybridisierende 1,9 Kb PstI-Fragment von einem dieser Phagen wurde isoliert und in die PstI-Stelle von Plasmid Bluescript SK&spplus; (Stratagene) subkloniert. Das resultierende Polyplasmid wurde einer DNA-Sequenzanalyse unterworfen und man fand, daß es die gesamte V31-kodierende Sequenz enthält. Dem vorhergesagten ATG-Initiationscodon gingen unmittelbar Nukleotide voraus in Übereinstimmung mit der Kozak-Konsens-Sequenz für Translationsinitiation [Kozak, Nucl. Acids Res., 12:857-872 (1984)]. Die DNA-und Aminosäuresequenzen des genomischen V31-Klons (ATCC 75327) sind in SEQ ID Nos: 6 bzw. 7 dargestellt. Die Sequenz des V31-Klons ist homologer zum IL8R1 (31%) und AT2R (27%) als zu den anderen Mitgliedern der 7TM-Rezeptor-Superfamilie (z.B. Rhodopsin, die adrenergen Rezeptoren oder die olfaktorischen Rezeptoren).

Beispiel 3

Isolierung von menschlicher V31-cDNA

Eine menschliche cDNA, die für den 7TM-Rezeptor V31 kodiert, wurde isoliert.
Zuerst wurde ein partieller cDNA-Klon durch PCR aus einer cDNA-Genbank von menschlichen Mandeln amplifiziert, die durch Standardverfahren in Vektor pCDM8 [Invitrogen, San Diego, CA] hergestellt wurde. Die in der PCR-Reaktion verwendeten Primer waren: PrimerPrimer V31-G+ (SEQ ID NO: 8)
GGT AGGCTITAAAGTFCCGCAC
Primer CDM8-Unten (SEQ ID NO: 9)
GCAGAACTGGTAGGTATGGA
Der Primer V31-G+ entspricht dem Komplement der Nukleotide 418 bis 437 von SEQ ID NO:6 und schließt eine EcoRI-Stelle (unterstrichen) und drei zusätzliche Nukleotide an seinem 5'-Ende ein, um Klonieren zu erleichtern. Primer CDM8-Unten anellierten an den Polylinker des Vektors pCDM8. Die resultierenden PCR-Produkte wurden auf Nitrozellulose geblottet und mit einer radioaktiven V31-spezifischen Sonde untersucht. Die radioaktive Sonde wurde hergestellt durch anellieren zweier Oligonukleotide, deren Sequenzen in SEQ ID Nos: 10 und 11 angegeben sind, und Auffüllen der Enden der anellierten Oligonukleotide mit ³²P-markierten Nukleotiden. Ein Hybridisierungsband wurde aus dem Gel isoliert und in Eluescript (SK-) (Stratagene) kloniert. Der resultierende Klon wurde bezeichnet als pV31-5'-Ende und seine DNA-Sequenz ist angegeben in SEQ ID NO: 12. Die Nukleotide 58-117 von pV31-5'-Ende umfaßen ko-dierende Sequenzen, die verschieden sind von dem ursprünglichen genornischen Klon, der angegeben ist in SEQ ID NO: 6, wohingegen Nukleotide 118-232 identisch sind zu Nukleotiden 322-437 von SEQ ID NO: 6.
Ein vollständiger cDNA-Klon wurde isoliert aus einer cDNA- Genbank von peripheren mononukleären Blutzellen. PCR unter Verwendung von V31-spezifischen Oligonukleotid-Primern wurde vorgenommen, um Fraktionen der Genbank zu identifizieren, die V31-Klone enthielten. Die verwendeten Primer waren:
Primer V31-B1 (SEQ ID NO: 13)
GCACAGCCTFCCTGTGTGG
Primer V31-umgekehrt (SEQ ID NO: 5).
Primer V31-B1 entspricht Nukleotiden 18 bis 36 bis SEQ ID NO: 12. Einzelne Fraktionen, die für V31 positiv waren, wurden ausplattiert und mit der V31-spezifischen radioaktiven Sonde, die oben für Isolieren des V31-5'-Ende Klons beschrieben wurde, untersucht. Klon PBMC7S wurde isoliert und schloß einen Poly-A-Schwanz ein, war aber am 5'-Ende fünf Nukleotide kürzer am 5'-Ende als die partielle Mandel-cDNA, die in SEQ ID NO: 12 angegeben ist. Das V31-cDNA-Insert in Klon PBMC75, das die vollständigen kodierenden Sequenzen für den V31-7TM-Rezeptor enthält, wurde als cDNA V31-B bezeichnet.
RACE PCR, vorgenommen unter Verwendung eines 5'-Amplifinder RACE-Kits (Clonetech) wurde verwendet, um zu amplifizieren und das 5'-Ende der V31-cDNA zu klonieren. Primer V31-F (SEQ ID NO: 52) und V31-G+ (SEQ ID NO: 8) wurden in den Reaktionen zusammen mit Primern verwendet, die in dem Kit enthalten sind, um cDNAs zu klonieren, die 17 zusätzliche nichtkodierende Nukleotide enthielten (von denen fünf dieselben waren wie die zusätzlichen fünf identifizierten in dem ursprünglichen Mandeln-Klon) stromaufwärts der V31-B-cDNA. Eine zusammengesetzte Sequenz, die die siebzehn Nukleotide und die V31-B-cDNA-Sequenz einschließt, ist dargestellt in SEQ ID NO: 14 und die Aminosäuresequenz, die davon abgeleitet ist, ist dargestellt in SEQ ID NO: 15. Die vorhergesagten sieben Transmembrandomänen des V31-7TM-Rezeptors (schematisch bezeichnet in Figur 1 als Regionen A bis B, C bis D, E bis F, G bis H, I bis J, K bis L und M bis N) entsprechen den Aminosäureresten 58 bis 86, 96 bis 119, 131 bis 152, 171 bis 196, 219 bis 247, 264 bis 284 und 306 bis 331 von SEQ ID NO: 15.

Erneute Charakterisierung des Klons von menschlichem genomischem V31

Ein Vergleich der Aminosäuresequenz, die von V31-B abgeleitet wurde, mit der Aminosäuresequenz, die von dem in Beispiel 2 beschriebenen genomischen V31-Klon abgeleitet ist, offenbarte, daß sich die zwei Sequenzen am Aminoterminus unterscheiden. Die ersten 52 Aminosäuren, die vom genomischen Klon abgeleitet sind (Reste 1 bis 52 von SEQ ID NO: 7) war nicht varhanden in der Aminosäuresequenz, die von V31-B-cDNA abgeleitet wurde, und waren statt dessen ersetzt durch 20 verschiedene Aminosäuren (Reste 1-20 von SEQ ID NO:15). Das Ergebnis zeigte an, daß das 5'-Ende des genomischen Klons wahrscheinlich ein Intron oder Introns enthalten würde.
Konsequenterweise wurde die V31-B-cDNA-Sequenz verwendet, um drei Exons in dem genomischen Klon von menschlichem V31 zu identifizieren, der in Beispiel beschrieben ist. Die DNA und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Exans 1 und 3 (zusammen mit partiellen Intron-Sequenzen) des genomischen V31- Klons sind angegeben in SEQ ID Nos: 15 und 17 bzw. 18 und 19. Nukleotide 151-156 von SEQ ID NO: 16 (Exon 1) umfaßt eine mutmaßliche TATA-Box, während Nukleotid 180 die Transkriptions-Initiationsstelle zu sein scheint und Nukleotide 243-245 das Startcodon zu umfassen scheinen. Eine weitere Promotor-Region, eine CAAT-Box, von der man annimmt, daß sie Transkription durch RNA-Polymerase II moduliert [Benoist et al., Nuc. Acids. Res., 8: 127-142 (1980)], weist die Konsens-Sequenz GG(C/T)CAATCT (SEQ ID NO: 21) auf. Eine ähnliche Sequenz findet man an Nukleotiden 104-113 von SEQ ID NO: 16. Die DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenzen des zweiten Exons von V31, wie von cDNA V31-B abgeleitet, sind entsprechend in SEQ ID NOS: 21 und 22 angegeben. Aminosäuren 6-15 von SEQ ID NO:22 (Exon 2) umfassen eine hydrophobe Sequenz, die kürzer, aber ähnlich zu derjenigen ist, die in einer entsprechenden Region des Serotonin-Rezeptors identifiziert wurde al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8547- 8551 (1993)] als eine mögliche zusätzliche Transmembrandomäne oder eine abspaltbare Signalsequenz. Die Intron-Sequenzen, die in SEQ ID NO: 18 (Exon 3) angegeben sind, schließen eine Nukleotid-Strecke ein, die für eine Alu-Wiederholung kodiert.

Beispiel 4

Die chromosomale Position des V31-Gens wurde bestimmt durch Sothern Blot-Analyse von human-murinen somatischen Zellhybriden (Naylor et al., J. Exp. Med., 57: 1020-1027 (1983) und in situ-Hybridisierung von Metaphasen-Chromosomen [Cherif et al., Hum. Genet., 81: 358-362 (1989) und Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6223-6227 (1990)].
DNA wurde isoliert von somatischen Mensch-Maus-Zellhybriden, mit EcoRI verdaut und hybridisiert auf Southern Blots unter Verwendung des humanen V31-Gens (das 1,9 Kb-PstI-Fragment, das in Beispiel 2 beschrieben wurde) als eine Sonde. Hybridisierung des V31-Gens trennte sich in konsistenter Weise mit menschlichem Chromosom 17. Um das V31-Gen spezifischer zu lokalisieren wurde, in situ Hybridisierung an menschlichen Metaphasen-Chro-mosomen mit einer Fluoreszenz-markierten V31-Gensonde (gegen das 1,9 Kb-Psti-Fragment, das in Beispiel 2 beschrieben ist) vorgenommen. Fluoreszenz-in situ- Hybrid-isierung von Metaphasen-Chromosomen wurde verwendet, um den genomischen V31-Klon der q12-q21.2-Region von Chromosom 17 zuzuordnen. Metaphasen-Chromosomen wurden hergestellt von 5-Bromdeoxyuridin-synchronisierten Lymphozyten-Kulturen. Die Sonde wurde biotinyliert, gegen die gespreiteten Chromosomen hybridisiert und durch Fluoreszein-konjugiertes Avidin (Vector Labs) nachgewiesen. Objektträger wurden bewertet mit einem Fluoreszenzmikroskop von Nikon. Fünfundvierzig Metaphasen-Präparate wurden untersucht. Q-(DAPI-Gegen-färbung) und R-Bandenbildung (Propidium-Iodid-Gegenfärbung) wurden verwendet, um die Identität des Chromosoms zu bestätigen. Das Fluoreszenz-Signal wurde nachgewiesen bei 17q12-q21.2 auf beiden Chromatiden von Chromosom 17 in achtzehn von den fünfundvierzig Zellen. Das ist dieselbe chromosomale Lokalisierung, die für ererbten familiären Brustkrebs identifiziert wurde [Hall et al., Science, 250: 1684-1689 (1990)].

Beispiel 5

Ein genomischer V31-Klon wurde isoliert aus einer genomischen Maus-Genbank, die durch Standardverfahren aus einer Mauszelle mit der Bezeichnung C6VL hergestellt wurde unter Verwendung des 1,9 Kb-V31-Gens als eine Sonde. Die Genbank wurde untersucht bei reduzierter Stringenz (30% Formamid bei 42ºC). Die DNA- und abgeleiteten Aminsäuresequenzen des isolierten murinen genomischen V31-Klons sind angegeben in SEQ ID Nos: 23 bzw. 24.

Beispiel 6

Das PCR-Fragment, dessen Isolierung in Beispiel 1 beschrieben wurde, das für den 71M-Rezeptor V28 kodiert, wurde verwendet, um synthetische Oligonukleotid-Sonden zu konstruieren, die spezifisch für V28 sind. Zwei überlappende Oligonukleotide wurden synthetisiert, wie unten gezeigt, die kodie rende und nicht-kodierende Stränge des Fragments darstellten mit eine Überlappung in der Mitte von 9 bP.
Primer V28L (SEQ ID NO: 25)
TGG ACT CAC TAT TTG ATA AAT GAA AAG GGC CTC CAC
AAT GCC ATG TGC AAA TrC ACT ACC
Primer V28R (SEQ ID NO: 26)
AAT GCT GAT GAC GGT GAT GAA GAA TAT GCT TCC AAA
AAA GCC GAT GAA GAA GAA GGC GGT AGT GAA
Die zwei synthetischen DNAs wurden anelliert und Klenow- Polymerase wurde verwendet, um ³²P-radiomarkierte Nukleotide in die resultierende spezifische V28-Sonde einzubauen (114 bp lang nach der Reaktion). Die Reaktion enthielt 0,76 ug von jedem V28-Oligonukleotide, 1X Klenow-Puffer, 0,015 mM dATP, 0,015 mM dGTP, 10 ul ³²P-dCTP (Amersham), 10 ul α-³²P- dTTP (Amersham) und 1,5 ul Klenow-Polymerase. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubiert und nicht inkorporierte Zähler wurden entfernt mit der Hilfe einer Quick-Spin G25-Säule.
Die V28-Sonde (46 x 10&sup6; cpm) wurde denaturiert durch Kochen für 2 Minuten und hybridisiert gegen die menschliche genomische Plazenta-Genbank (Stratagene). Die Genbank enthielt 360000 Phagen auf 12 Nitrozellulose-Filtern und Hybridisierung wurde vorgenommen über Nacht bei 42ºC in der oben beschriebenen Hybridisierungslösung, die 30% Formamid enthält. Die Filter wurden extensiv in 2x SSC bei 32ºC gewaschen und dann drei Tage exponiert. Sieben stark hybridisierende Signale wurden beobachtet und Plaque-gereinigt. Die V28-Sonde hybridisierte gegen einzelne Restriktions-Endonukleasen- Fragmente in Southern Blots der Phagen-DNA und menschlicher genomischer DNA. Sowohl HindII- (etwa 2 kbp) und PstI- (etwa 315 kbp) Fragmente wurden isoliert, in pbluescript subkloniert und sequenziert. Die DNA- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen des volisändigen genomischen V28-Klons (ATCC 75330) sind angegeben in SEQ ID Nos: 27 bzw. 28. Das Gen enthielt die genaue V28-Sequenz, die durch PCR isoliert wurden. Die kodierte Aminosäuresequenz sieht eine Struktur hervor, die mit der typischen 7TM-Struktur übereinstimmt. Es gibt 7 hydrophobe Domänen, die durch hydrophile Domänen getrennt sind und hoch konservative Reste werden in ihren typischen Positionen gefunden. Die vorhergesagten sieben Transmembrandomänen des V28-7TM-Rezeptors entsprechen den Aminsäureresten 26 bis 56, 68 bis 92, 107 bis 125, 146 bis 167, 197 bis 219, 232 bis 253 und 273 bis 297 von SEQ ID No: 28. Die V28-kodierende Sequenz ist 29% homolog mit IL8R1 und 27% homolog zu AT2R.

Beispiel 7

Eine menschliche V28 cDNA wurde isoliert von einer cDNA- Genbank von peripheren mononukleären Blutzellen, die durch Standardverfahren in Vektor pRc/CMV (Stratagene) hergestellt wurde (Stratagene). PCR unter Verwendung von V28-spezifischen Oligonukleotidprimern wurde durchgeführt, um Fraktionen der Genbank zu identifizieren, die V28-Klone enthielten. Die verwendeten Primer waren:
Primer V28F (SEQ ID NO: 29)
TGG ACT CAC TAT TTG ATA AA
Primer V28X (SEQ ID NO: 30)
AAG ATT TGA GAG TCA GAG
Primer V28F entspricht Nukleotiden 852 bis 871 von SEQ ID NO: 27, während Primer V28X dem Komplement von Nukleotiden 2047 bis 2064 von SEQ ID NO: 27 entspricht. Die PCR-Reaktion produzierte ein 1,2 Kb-DNA-Produkt, das mit ³²P mittels zufälligem Primen markiert wurde und dann als eine Sonde verwendet wurden, um individuelle V28-Klone zu identifizieren. Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren ähnlich den stringenten Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die DNA- und abgeleiteten Aminsosäuresequenzen des V28-cDNA- Klons sind in SEQ ID Nos. 31 bzw. 32 angegeben. Ein Vergleich der genomischen V28- und cDNA-Klone offenbarte, daß es ein Intron in dem 5'-untranslatierten Teil des V28-Gens gibt, dessen Splice-Stelle an Nukleotiden 84 bis 85 von SEQ ID NO: 31 erscheint.

Beispiel 6

Eine menschliche V112-cDNA entsprechend dem genomischen V112-Fragment, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde isoliert aus einer Makrophagen-cDNA-Genbank, die mittels Standardvorgehensweisen in Vektor pRc/CMV hergestellt wurde (Stratagene). PCR unter Verwendung von V112-spezifischer Oligonukleotid-Primer wurde durchgeführt, um Fraktionen der Genbank zu identifizieren, die V112-Klone enthielten. Die verwendeten Primer waren:
Primer V112-F (SEQ ID NO: 33)
TGGGTGGATAAAGAAGCATCTC
Primer V112-R (SEQ ID NO: 34)
AACACTCATGCAAGTGAGCA
Primer V112-F entspricht den Nukleotiden 1 bis 19 von SEQ ID NO:3, während Primer V112-R dem Komplement von Nukleotiden 101 bis 120 von SEQ ID NO: 3 entspricht. Die PCR-Reaktion produzierte ein 123 bp DNA-Produkt, das mit ³²P durch zufälliges Primen markiert war und dann als eine Sonde verwendet wurde, um individuelle V112-Klone zu identifizieren. Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren ähnlich zu den Verfahren mit reduzierter Stringenz, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Partielle DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenzen des etwa 850 bp V112-cDNA-Klons sind in SEQ ID NOS: 35 bzw. 36 angegeben. Die in SEQ ID NO: 35 gezeigte partielle Sequenz enthält V112-5'-untranslatierte Sequenz und kodiert den aminoterminal Teil von V112 bis zu der vierten Transmembrandomäne. Die vorhergesagten sieben Transmembran-Domänen 1-3 des V112-7TM-Re-zeptors entsprechen den Aminosäureresten 36 bis 58, 70 bis 90 und 108 bis 127 von SEQ ID NO: 36.

Beispiel 9

Die durch PCR isolierte R20-Sequenz, wie beschrieben in Beispiel 1, wurde verwendet, um eine genomische Genbank für das gesamte Gen zu screenen. Eine für R20 spezifische Sonde wurde hergestellt durch Amplifizieren der partiellen R20-Sequenz durch PCR unter Verwendung der spezifischen Primer Sequenzen, die unten angegeben sind, und ³²P-markierten Nukleotiden, wobei Primer R20-ul den ersten 21 Basen des kodierenden Stranges entspricht und Primer R20-153RC den ersten 20 Basen des nicht-kodierenden Stranges entspricht.
Primer R20-61 (SEQ ID NO: 37)
CTA CAC GTA CCG GGA CTA TGA
Primer R20-153RC (SEQ ID NO: 38)
AGA AGA CGC TGG CGT ACA TG
Die PCR-Reaktion enthielt 0,07 ug R20-Zielsequenz (Hind III - Bam-Fragment, das aus dem in pBluescript SK-) klonierten R20-Plasmid isoliert ist), 0,25 mM dATP, 0,25 mM DGTP, 0,25 mM DTTP, 1 uM DCTP, 4 u³²P-DCTP (Amersham), 0,01 mg/ml R20- spe-zifische Primer, 1 x PCR-Puffer und 0,5 ul Taq-Polymerase in einem Volumen von 40 ul. Die PCR wurde vorgenommen mit den folgenden Thermozyklisierungsparametern: anfänglich vier Minuten um die Reaktion auf 94ºC zu bringen, gefolgt von 12 Zyklen aus (1) Denaturierungsschritt bei 93ºC für 30 Sekunden, (2) Anellierungsschritt bei 50ºC für 30 Sekunden und (3) Verlängerungsschritt bei 72ºC für eine Minute. Die nicht eingebauten Zähler wurden mit einer Quick-Spin-G25- Säule entfernt.
Die Sonde wurde denaturiert durch Kochen für 2 Minuten und dann verwendet, um die menschliche genomische Plazenta-DNA- Genbank (Stratagene) zu screenen. Filter wurden über Nacht bei 42ºC in Hybridisierungslösung hybridisiert, die 40% Formamid enthielt, bei 42ºC in 0,2x SSC gewaschen und über Nacht exponiert. Vier stark hybridisierende Signale wurden Plaque-ge-reinigt, subkloniert und sequenziert. Die R20- Sequenz, die durch PCR identifiziert wurde, war in dem isolierten Gen vorhanden. Das Gen kodiert für ein Protein, das eine Struktur ähnlich den anderen 7TM-Rezeptoren aufweist. Die DNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen des vollständigen genomischen R20-Klons (ATCC 75328) sind in SEQ ID NOS: 39 bzw. 40 dargestellt. Die vorhergesagten sieben Transmembran-Domänen des R20-7TM-Rezeptors entsprechen den Aminosäure-Resten 28 bis 54, 66 bis 90, 107 bis 125, 146 bis 167, 208 bis 232, 246 bis 267 und 285 bis 312 von SEQ ID NO: 40. Das R20-Genprodukt ist zu 28% homolog mit dem IL8R1 und zu 29% homolog mit dem AT2R.

Beispiel 10

Während der Isolierung des R20-Gens wurden zwei schwach hybridisierende Sequenzen identifiziert, die wesentliche Homologie zu anderen 7TM-Rezeptorgenen aufweisen. Die R20-spezifische Sonde (beschrieben in Beispiel 9) wurde verwendet, um eine menschliche genomische DNA-Genbank von fötaler Leber (ATCC 37333) zu screenen mittels der in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren. Während das R20-Gen in dieser Genbank nicht identifiziert werden konnte, wurden mehrere schwach hybridisierende Klone Plaque-gereinigt, subkloniert und sequenziert. Die zwei Klone wurden als R2 (ATCC 75329) und R12 (ATCC 75331) bezeichnet. Die vollständigen DNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von R2 und R12 (welche dargestellt sind in SEQ ID Nos: 41 und 42 bzw. 43 und 44) weisen Homologien mit anderen 7TM-Rezeptoren auf. Die vorhergesagten Sieben-Transmembran-Domänen des R2-7TM-Rezeptors entsprechen den Aminosäureresten 41 bis 69, 77 bis 104, 120 bis 138, 161 bis 186, 207 bis 226, 247 bis 270 und 294 bis 318 von SEQ ID NO: 42, während die vorhergesagten Sieben-Transmembran-Domänen des R12-7TM-Rezeptors den Aminosäureresten 33 bis 57, 68 bis 90, 106 bis 127, 145 bis 168, 193 bis 217, 233 bis 251 und 290 bis 312 von SEQ ID NO: 44 entsprechen. R2 ist 25% homolog zu dem IL8R1 und 24% homolog zu dem AT2R, während R12 zu 26% homolog mit dem IL8R1 und zu 19% homolog mit dem AT2R ist.

Beispiel 11

Ein weiterer neuer 7TM-Rezeptor wurde identifiziert durch Verfahren entsprechend den in Beispiel 1 beschriebenen. Die zwei degenerierten Primerpools (mit SEQ ID Nos: 1 bzw. 2) wurden in einer PCR-Reaktion verwendet, die eine menschliche cDNA-Gen-bank von Makrophagen in Plasmid pRc/CMV (Stratagene) enthielt. Die Reaktionsrnischung enthielt lX PCR-Puffer, 0,25 mM DGTP, 0,25 mM DCTP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM TTP, 0,01 ug/ul Primerpaal 1, 0,01 ug/ul Primerpaal 2, 0,2 ug menschlicher cDNA-Genbank von Makrophagen und 2,5 ul Taq-Polymerase in einem Reaktionsvolumen von 40 ul. Wenn die PCR- Produkte Agarosegel-Elektro-phorese unterworfen wurden, wurde eine schwache Bande von 180-200 bp beobachtet. Um Klonieren zu erleichtern, wurde diese DNA aus dem Gel eluiert und erneut amplifiziert durch PCR unter denselben Bedingungen. Wesentlich mehr DNA wurde nachfolgend in der zweiten PCR isoliert. Das erneut amplifizierte Material wurde mit BamHI und HindIII verdaut und in das Plasmid Bluescript SK- kloniert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Von sechzehn sequenzierten Klonen entsprachen vierzehn R20 und zwei enthielten eine einzigartige Sequenz, die als RM3 bezeichnet wurde. Spezifische Primer für den partiellen RM3-Klon wurden verwendet, um einen vollständigen RM3-cDNA-Klon durch die PCR Verfahren zu identifizieren, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Die DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz der RM3- cDNA sind in SEQ ID NOS: 45 bzw. 46 dargestellt. Die vorhergesagten Sieben-Transmembran-Domänen des RM3 -7TM-Rezeptors entsprechen den Aminsosäureresten 48 bis 69, 82 bis 100, 115 bis 136, 159 bis 179, 198 bis 220, 246 bis 274 und 287 bis 311 von SEQ ID NQ: 46. Die Sequenz des partiellen RM3-Klons (ATCC 75340) ist dargestellt in SEQ ID NO: 45 als Nukleotide 438 bis 551. Die von RM3 abgeleitete Aminosäuresequenz weist 34% Identität zu dem IL-8R und 32% Identität zu dem AT2R auf.

Beispiel 12

Aminosäure-Identitätswerte zwischen fünf der sieben neuen 7TM-Rezeptoren, die in den Beispielen 1 bis 11 beschrieben sind, ebenso wie Werte im Vergleich zu verschiedenen kürzlich identifizierten 7TM-Rezep-toren sind dargestellt in Tabelle 1 unten, wobei fMLP der N-Formyl-Peptid-Rezeptor und ThrR der Thrombin-Rezeptor ist. Die Aminosäuresequenzen der kürzlich identifizierten 7TM-Rezeptoren sind wie folgt publiziert worden: IL8R1 in Holmes et al , aaO; IL8R2-Rezeptor in Murphy et al ., Science, 253: 1280-1283 (1991); AT2R in Sasaki et al., aaO; C5aR in Gerard und Gerard, aaO; fMLPR in Boulay, BBRC, 168: 1103-1109 (1990); ThrR in Vu et al., Cell, 64 :1057-1068 (1991) und PAFR in Honda et al., aaO. Tabelle 1

Beispiel 13

Genomische V31-DNA wurde in CHO/DHFR&supmin;-Zellen (ATCC CRL9096) und 293-Zellen (ATCC CRL1573) transfiziert und die Zellen wurden auf Expression von V31 mittels Northern Blot getestet.

Vektorkonstrukte für Expression von V31 in Säugerzellen

Die V31-kodierende Sequenz wurde aus dem in Beispiel 2 beschriebenen vollständigen genomischen Lambda-Klon ausgeschnitten (XS-V31-3) als ein 1,9 kb PstI-Fragment und in kommerzielles Plasmid Bluescript SK+ (Stratagene) ligiert, das mit PstI geschnitten war, um ein als pV31-Pst bezeichnetes Zwischenkonstrukt zu erzeugen. Das V31-Fragment plus 60bp aus flankierenden Polylinker-Sequenzen wurde dann aus pV31-Pst mit Hindih und Xbai herausgeschnitten und in kommerzielles Säugerexpressionsplasmid pRc/CMV (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ligiert, das mit HindIII und XbaI geschnitten war.

Transfektion von CHO und 293-Zellen

Das V31-Expressions-Konstrukt, pV31XP, wurde in CHO- und 293-Zellen durch Lipofektion unter Verwendung des kommerziellen Transfektionsreagens DOTAP (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) transfiziert. Nach Selektion auf G418-Resis-tenz wurden einzelne V31-Transfektanten subkloniert.

Northern Blot-Analyse

Spezifische Expression der V31-mRNA in transfizierten Zellen wurde getestet durch Northern Blot-Hybridisierung mit einer ³²P-markierten V31-Sonde. Transfektanten wurden bis zur logarithmischen Phase angezogen, dann zentrifugiert und einmal mit Phsophat-gepufferter Sahne gewaschen. mRNA wurde aus Zellen unter Verwendung des kommerziellen Micro-Fast Track mRNA-Isolierungskits (Invitrogen Corporation) isoliert. mRNA-Spezies wurden durch Elektrophorese durch 1% Agarosegele mit 2,2 M Formaldehyd getrennt. Proben wurden zuerst denaturiert durch Inkubieren für 15 Minuten bei 65ºC in 50% Formamid und 2,2 M Formaldehyd, dann wurden Bromphenolblau und Ethidiumbromid hinzugesetzt, bevor das Gel beladen wurde. mRNA wurde bei 50 V für etwa 4 Stunden elektrophoresiert. Nach Visualisieren durch UV-Trans-Illuminierung und Photographie wurde mRNA im Gel auf Nitrozellulose (Schleicher & Schuell, Keene, NH) überführt durch Kapillarwirkung über Nacht in 20X SSC. Nitrozellulose Blots wurden bei 80ºC in einem Vakuumofen für 1 bis 2 Stunden vor Hybridisierung mit Sonden gebacken.
Um die radiomarkierte V31-Sonde zu erzeugen, wurde Matrizen- DNA (1,9 kb HindIII-XbaI-Fragment, das die vollständige V31kodierende Sequenz enthielt) durch Kochen denaturiert, dann an eine Mischung aus zufälligen Hexamer-Primern anelliert. Primer wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur verlängert unter Verwendung von Klenow-Enzym und einer Mischung aus ³²P-dCTP, ³²P-dTTP, dATP und dGTP. Nicht eingebaute Nukleotide wurden entfernt durch Passagieren der Reaktionsmischung über eine G25 Sephadex Quick Spin-Säule (Boehringer Mannheim). Einbau von ³²P wurde bewertet durch Cherenkow- Zählung. Die Probe wurde durch Kochen denaturiert und sodann mit dem mRNA-Blot über Nacht bei 42ºC in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5X SSC, 5X Denhardts, 50 mM NaPO&sub4;, 10 ug/ml denaturierte Lachs-DNA) inkubiert. Blots wurden in 2X SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur zweifach für 10 Minuten gewaschen und dann jeweils in 0,1X SSC bei 50ºC 3-4 mal für 10 Minuten gewaschen. Blots wurden luftgetrocknet und dann einem Röntgenfum für verschiedene Zeitspannen ausgesetzt.
Nur zwei von zwölf transfizierten CHO-Klonen exprimierten V31-mRNA, wie durch Hybridisierung bestimmt. Die Zellinie wurde bezeichnet als CHO-V31-10. Das Signal von dieser Zellinie war innerhalb von acht Stunden beobachtbar, während die anderen scheiterten, wesentliche Mengen an Signal zu produzieren.
Von den neun transfizierten 293 Zellinien exprimierten zwei V31-mRNA in sehr hohem Maße (bezeichnet als 293-V31-1 und 293-V31-6), drei exprimierten in gemäßigtem Umfang (bezeichnet als 293-V31-5, 293-V31-7 und 293-V31-9) und vier scheiterten, signifikant zu exprimieren.

Phänotyp von transfizierten 293-Zellen, die V31-mRNA exprimieren

Der Phänotyp von transfizierten 293-Zellen, die V31-mRNA exprimieren, ist geändert verglichen mit Eltern-293-Zellen. Eltern-293-Zellen enthalten Fortsätze, die aus der Zelloberfläche hervorragen. Solche Vorsprünge (oder "Spikes") sind verbreitete Merkmale vieler transformierter Zelltypen. Die Zellen breiten sich nicht auf Kunststoff flach aus, sondern zeigen ein hohes Profil mit lokalisierten Adhäsions-Punkten (daher die Beschreibung als stachelig) und bilden keine glatte epitheliale Schicht. Im Gegensatz dazu erscheinen 293-Transfektanten, die V31-mRNA im hohen Maße exprimieren (293-V31-1 und 293-V31-6), in Kultur flach und glatt. Die Zellen bilden engen und kontinuierlichen Kontakt miteinander aus, um eine glatte epitheliale Schicht mit einem Kopfsteinpflastermäßigen Aussehen zu bilden. Die V31-transfizierten 293-Zellen weisen auch eine ausgeprägte Verringerung ihrer Wachstumsrate auf verglichen mit der Eltern-293-Zellinie. Diese morphologischen und Wachstumsratenunterschiede sind konsistent mit einem "weniger transformierten" Phänotyp für V31-Genex-pression. Diese Ergebnisse stehen in ausgeprägtem Unterschied zu anderen 7TM-Rezeptor-transfizierten Zellen. Zum Beispiel verleiht der Serotonin-Rezeptor einen transformierteren Phänotyp, wenn in Säugerzellen transfiziert [Julius et al, Science, 244: 1057 (1989)].

Expression von V31-cDNA in Säugerzellen

Die V31-B-cDNA wurde auch gebaut für Säugerzellexpression in pRc/CMV durch Verfahren, die den oben beschriebenen ähnlich sind. Das resultierende Expressionsplasmid wurde bezeichnet als pRcV31-B. Die 293-Zellen, die mit dem Expressionsplasmid transfiziert waren, die V31-B-mRNA exprimierten, wiesen eher einen Phänotyp ähnlich demjenigen der Eltern-293-Zellen auf als demjenigen von 293-Zellen, die mit den genomischen V31- DNA-Konstrukten transfiziert waren.

Beispiel 14

Expression von mRNA der neuen 7TM-Rezeptoren V31, V28 und R20 wurden getestet durch Northern Blot-Analyse und in situ Hybridisierung mit radiomarkierten Sonden in einer Vielzahl von menschlichen Geweben und hämatopoietischen Zellinien.

Hybridisierung von V31-Sonden gegen menschliches Gewebe in situ

Gefrorene Schnitte von verschiedenen menschlichen Geweben wurden in situ hybridisiert mit radiomarkierten Einzelstrang-RNA-Sonden, die von V31 abgeleitet sind. Gewebeproben, die von Lymphknoten, Milz, Thymus und Mandeln erhalten wurden, wurden in OTC-Blöcken eingefroren und bei -70ºC gelagert. Die Blöcke wurden in Schnitte mit 6 Mikron unter Verwendung eines Kryos-taten 2800M (Leica) geschnitten und auf Objekträger aufgetragen, die in Vectabond (Vector Labaratories, Burlingame, Californien) beschichtet war. Objekträger wurden über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet und dann bei -70ºC zur Lagerung plaziert. Vor Verwendung wurden die objektträger aus 70ºC entfernt und bei 55ºC für 5 Minuten plaziert. Schnitte wurden dann in 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten bei 4ºC fixiert, dreimal in PBS abgespült, dehydratisiert (70-95-100% Ethanol, jeweils eine Minute bei Raumtemperatur) und dann für 30 Minuten zu trocknen erlaubt. Schnitte wurden denaturiert in 70% Formamid, 2X SSC für 2 Minuten bei 70ºC, in 2X SSC abgespült, dehydradisiert und dann luftgetrocknet für 30 Minuten. Die Schnitte wurden dann in Prähybridisierungslösung (50% Formamid, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 10% Dextransulfat, 1X Denhardt's Lösung, 100 mM DTT und 5mM EDTA) inkubiert für 2 Stunden für 42ºC, radiomarkierte Sonde wurde zu der Lösung hinzugesetzt (6 x 10&sup5; cpm/Schnitt) und die Schnitte für 12-16 Stunden bei 50ºC zu hybridisieren erlaubt. Um sense und antisense V31-Sonden zu erzeugen, wurden T7- und T3-RNA-Polymerasen verwendet, um ³&sup5;S-markierte Transkripte von einem linearisierten, Gelgereinigten Plasmid, das ein 727 bp HindII-Fragment von V31 enthielt, zu synthetisieren.
Nach Hybridisierung wurden die Schnitte in 4X SSC, 10 mM DTT für eine Stunde bei Raumtemperatur, dann in 50% Formamid, 1X SSC, 10 mM DDT für 40 Minuten bei 60ºC und schließlich in 2X SSC und 0,1X SSC für 30 Minuten jeweils bei Raumtemperatur gewaschen. Nach Alkohol-Dehydratisierung wurden die luftgetrockneten Objektträger in Kodak NTB2-Nuclear Emulsion (erwärmt auf 42ºC) eingetaucht und für 2 Stunden bei Raumtemperatur in vollständiger Dunkelheit bis zur Entwicklungszeit zu trocknen erlaubt. Die Objektträger wurden dann in Kodak D19-Entwickler fur 4 Minuten bei 4ºC plaziert, viermal in Acid Stop (1 ml Eisessig/500 ml destilliertes Wasser) getaucht und dann in Kodak-Fixierer für 4 Minuten bei 400 plaziert. Die Objektträger wurden dreimal in Leitungswasser abgespült und dann mit Hämatoxylin/Eosin gegengefärbt.
Die V31-antisense-Sonde hybridisierte intensiv mit einer jeden der vier menschlichen Gewebeproben (Lymphknoten, Milz, Thymus und Mandeln). Im Gegensatz dazu hybridisierte die vom V31-sense-Strang produzierte Kontrollprobe nicht wesentlich mit diesen Geweben.

Northern Blot-Analyse von V31-Expression in menschlichen Geweben

Spezifische Expression von V31-mRNA in normalen Geweben wurde auch durch Northern Blot-Hybridisierung getestet. RNA wurde hergestellt von menschlichem Gewebe durch Standardverfahren (siehe beispielsweise Chirgwin et al., Biochemistry, 18: 5294-5299 (1979)] und fraktioniert auf oligo-dT-Zellulose zur Anreicherung von mRNA. Die mRNA-Proben wurden separiert auf einem Formaldehyd-Agarosegel, auf Nitrozellulose überführt und hybridisiert gegen die V31-³²P-markierte Sonde, wie beschrieben in Beispiel 13. Die V31-Sonde hybridisierte eindeutig mit den menschlichen Lymphgeweben, Mandeln, Lymphknoten und Milz. Keine Hybridisierung wurde beobachtet gegen Nebenniere, Herz, Niere, Leber, Lunge, Pankreus oder Hoden. Geringe Maße an Hybridisierung wurden beobachtet gegen Dünndarm was Lymphoide-Ausstrahlungen in dieses Gewebe darstellen mag.

Northern Blot-Analyse von V31-Expression in hämatopoietischen Zellinien

Zellen von verschiedenen hämatopoietischen Zellinien wurden bis zur log-Phase angezogen, durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit 150 mM NaCl gewaschen und die Pellets gefroren bei -70ºC gelagert. Um RNA zu extrahieren, wurden die Pellets in Guanidinium-Isothiocyanat-Puffer (GIT) resuspendiert und in einem Polytronmischer für 20 Sekunden geschert. RNA/- GIT-Mischungen wurden auf CsCl als Schicht aufgebracht und bei 35.000 Upm (179,000 x 9) für 21 Stunden zentrifugiert. RNA-Pellets wurden resuspendiert in H&sub2;O, Ethanol-präzipitiert und mit Proteinase K behandelt, um eine jegliche RNase-Kontamina-tion zu entfernen. Nach einer Phenol/Chloroform-Extraktion wurde die RNA präzipitiert, in H&sub2;O resuspendiert und spektrophotometrisch quanitifiziert.
10 ug einer jeden RNA-Probe wurden verwendet für Northern Blot-Analyse. Proben wurden denaturiert und durch ein Formaldehyd/Agarose-Gel elektrophoretisiert, auf Nitrozellulose überführt und gegen ³²P-markierte V31-Sonde hybridisiert, wie im wesentlichen beschrieben in Beispiel 13.
Die V31-Sonde hybridisierte stark mit der T-Zellinie Hut 78 und den B-Zellinien Raji und Jijoye. Die T-Zellinie CEM hybridisierte auch mit V31, aber weniger intensiv. Im Gegensatz dazu scheiterten die Zellinien SKW3 und Molt4, mit V31 zu hybridisieren, wie die myeloiden Linien KG1, K562, HL-60 und U937. Diese Ergebnisse bestätigen die Northern- und in situ Hybridisierungsergebnisse an menschlichen Geweben; V31 wird spezifisch in lymphoiden Zellen und Geweben exprimiert. Ergebnisse von Northern Blot-Tests zur Expression von V31- mRNA in anderen hämatopoietischen Zellinien sind unten in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

Northern Blot-Analyse von V28-Expression in menschlichen Geweben und Zellinien

Expression von V28-mRNA in einer Vielzahl von menschlichen Geweben wurde getestet durch Northern Blot-Analyse unter Verwendung von ³²P-markierten V28-Sonden. Gefrorene Gewebeproben wurden pulverisiert in flüssigem Stickstoff unter Verwendung von Mörser und Pistill und RNA wurde isoliert nach dem APGC-Protokoll von Chomczynski und Sacchi, Analytical Biochemistry, 162: 156-159 (1986). Kurz gesagt wurden Proben in einem 4 M Guanidium-Thiocyanat-Puffer homogenisiert und mehreren Durchgängen mit saurer Phenol-Extraktion und Isopropanol-Präzipita-tion unterworfen. RNA-Proben wurden mit RNase-freier DNase (Stratagene doning Systems, La Jolla, CA) für 30 Minuten bei 37ºC behandelt, um eine jegliche kontaminierende DNA zu entfernen, dann mit Phenol/Chloroform zweifach extrahiert, Ethanol-präzipitiert, in DEPC-behandeltem H&sub2;O resuspendiert und bei -70ºC bis zur weiteren Verwendung gelagert. RNA von Zellinien wurde hergestellt, wie oben beschrieben für die Analyse von V31.
10 bis 30 ug einer jeden RNA-Probe wurden denaturiert durch Inkubation in 50% Formamid und 3,5 M Formaldehyd für 10 Minuten bei 60ºC. Bromphenolblau und Ethidiumbromid wurden vor Elektrophorese hinzugesetzt. Proben wurden durch 1,2% Agarosegele, die 2% Formaldehyd enthielten, für vier Stunden bei 90 Volt elektrophoretisiert. Nach Visualisierung durch UV- trans-Illumination und Photographieren wurde RNA von dem Gel auf Nitrozellulose (Schleicher und Schuell) durch Kapillarwirkung über Nacht in 20X SSC überführt. Nitrozellulose Blots wurden bei 80ºC in einem Vakuum über 1-2 Stunden vor Hybridisierung gebacken.
Ein 1,5 kb Eco RI-Fragment, das die ganze V28-kodierende Sequenz enthält, wurde als eine Matrize verwendet, um radiomarkierte V28-Sonden zu erzeugen. Details zum Markieren, Hybridisieren und Waschen sind exakt so, wie in Beispiel 2 beschrieben. Ergebnisse zu Northern Blot-Analyse sind in Tabelle 3 unten dargestellt. Tabelle 3

Northern Blot-Analyse von R20 in menschlichen Geweben

Expression des R20-Gens in verschiedenen menschlichen Geweben wurde getestet durch Northern Blot-Analyse. Poly-A-mRNA wurde isoliert aus verschiedenen menschlichen Geweben, fraktioniert durch denaturierende Agararosegel-Elektrophorese und auf eine nitrozellulose Membran geblottet.
Eine Sonde wurde hergestellt aus den 1,5 kb HindIII-PstI- Fragment von R20, wie folgt. Fünfzig ng von Gel-gereinigtem Fragment wurde an 1 ug Zufallshexameren anelliert. Die Probe wurde behandelt mit Klenow-Enzym in der Gegenwart von Klenow-Puffer (siehe Beispiel 2), dATP, dGTP, ³²P-dCTP und ³²P-TTP bei Raumtemperatur für 75 Minuten. Das markierte Fragment wurde von nicht eingebauten Nukleotiden getrennt mittels Passage durch eine G-25 Quickspin-Säule (Boehringer Mannheim), denaturiert durch Kochen und auf Eis gekühlt. Diese Sonde wurde gegen den Filter für 16 Stunden bei 42ºC in einer Lösung aus 5X SSC, 50 mM NaPO&sub4;, 5X Denhardt's- Lösung und 10ug/ml Lachssperm-DNA hybridisiert. Der Filter wurde nachfolgend in 0,1X SSC bei 50ºC gewaschen. Hybridisierung wurde durch Autoradiographie visualisiert.
Von den analysierten Geweben wurde das stärkste Signal in Plazenta-RNA nachgewiesen. Eine schwachere Bande mit demselben apparanten Molekulargewicht war auch sichtbar in BNA von Lymphknoten, Niere und Thymus. Es war keine Hybridisierung gegen Leber-, Ovarien- oder Hoden-BNA ersichtlich.

Beispiel 15

Die kodierende Sequenz für V31 (und Fragmenten davon) wurde für die Expression in E.coli gebaut als ein Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (GST) [Smith et al., Gene, 67: 31-40 (1988)]. Fusionsproteine mit GST werden im allgemeinen im großen Umfang exprimiert und können oft gereinigt werden auf Gluthation-Agarose-Kügelchen. Diese Fusionen sind nützlich beim Bereitstellen von Material für biochemische Studien und als Immunogene für die Herstellung von Antikörpern.
Die gesamte kodierende Sequenz von V31 wurde gebaut für die Expression in dem Plasmid pGEX-2T, so daß ein Fusionsprotein produziert wurde, das GST am Amino-terminalen Ende enthielt und V31 am Carboxy-terminalen Ende. Das Plasmid pGEX-2T enthält einen lac-Promotor, der die Expression von GST vorantreibt. Das 3'-Ende des GST-Gens enthält BamHI- und EcoRI- Stellen und kodiert eine Thrombin-Spaltungsstelle. Das V31- Gen wurde in pGEX-2T kloniert, das mit BamHI und EcoRI verdaut war, durch zuerst Einführen einer BamHI-Stelle an dem 5'-Ende des V31-Gens und einer EcoRI-Stelle an seinem 3'- Ende durch PCR-gesteuerte Mutagenese. Ein 5'-Oligonukleotid (V31-A, SEQ ID NO: 47) enthielt eine BamHI-Stelle, die die Reste 225 und 226 von pGEX-2T kodierte, und 17 Basen des V31-Gens, beginnend mit dem Methionin-Initiations-Codon (ATG). Das stromabwärtige, antisense Oligonukleotid (V31-B, SEQ ID NO: 48) enthielt eine EcoRI-Stelle und 17 Basen des 3'-Endes der V31-kodierten Sequenz, die das natürliche Stop- Codon enthält. PCR wurde vorgenommen in einer Perkin Eimer Cetus-Maschine mit dem folgenden Thermozyklisierungsprotokall: anfänglich vier Minuten, um die Reaktion auf 94ºC zu bringen, gefolgt von 25 Zyklen von (1) Denaturierungsschritt bei 94CC für 30 Sekunden, (2) Anellierungs-Schritt bei 60ºC für 30 Sekunden und (3) verlängerungsschritt bei 72ºC für 30 Sekunden. Die Reaktionsmischung enthielt 1 x PCR-Puffer, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM TTP, 0,01 von jedem Primer, 3 x mg Matritzen-DNA und 2,5 Einheiten Tag-Polymerase in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50ul. Nach PCR wurde die Reaktion extrahiert mit Phenol und Chloroform und Ethanol-präzipitiert. Die DNA wurde dann verdaut bei 37ºC mit BamHI und EcoRI und elektrophoretisiert auf 1% Agarose/2% Nusieve-Agarosegel. Das vorherrschende PCR-Produkt wies eine elektrophoretische Mobilität auf, die übereinstimmt mit der vorhergesagten Größe von 1241bp. Diese DNA wurde elektroeluiert und dann an ein pGEX-2T-DNA-Fragment ligiert, das mit BamHI und EcoRI behandelt und durch Elektrophorese isoliert worden war. Die ligierte DNA wurde in kompetente E.coli transformiert und ein Klon, der das als pGEX-V31-F4 bezeichnete Plasmid enthielt, wurde für die Analyse ausgewählt. Die Insert-DNA, die für das V31-Fusionsprotein kodierte, wurde mittels der Dideoxy-Kettenterminations-Technik sequenziert.
Ein kürzeres Fusionsprotein, das nur die ersten 90 Aminosäuren von V31 enthielt (die vorhergesagte erste extrazelluläre Domäne), wurde auch mit GST hergestellt. Ähnlich dem obigen Beispiel wurden BamHI- und EcoRI-Stellen in die V31kodierende Sequenz durch PCR-gesteuerte Mutagenese eingeführt. Das 5'-Oligonukleotid (V31-A) war identisch zu dem, das für die erste GST-Fusion verwendet wurde, und enthielt eine BamHI-Stelle für das GST-Gen und 17 Basen des V31-Gens. Das stromabwärtige antisense Oligonukleotid (V31-C, SEQ ID NO: 49) enthielt 18 Basen des V31-Gens und führte ein Stop- Codon (nach Aminosäure 90 von V31) ein, gefolgt von einer EcoRI-Stelle. PCR-Bedingungen wurden vorgenommen exakt wie oben für die erste GST-Fusion. Die PCR-Produkte wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit BamHI und EcoRI verdaut. Die DNA wurde auf einem 1% Agarose/2% Nusieve-Agarose- Gel elektrophoretisiert und wies eine Mobilität auf 1 die mit einer vorhergesagten Größe von 281 bp übereinstimmte. Diese DNA wurde elektroeluiert und auch in pGEX-2T legiert. Das Insert des des resultierenden Plasmides, pGEX-V31-N1, wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
Ein drittes Fusionsprotein wurde hergestellt, das GST enthielt, die an alle vier mutmaßlichen extrazellulären Domänen fusioniert war. Regionen der Aminosäuresequenz von V31 wurden als Domänen definiert aufgrund ihrer vorhergesagten Hydrophihe und enthielten einen bis fünf hydrophobe Reste an jedem Ende (die Teile von Transmembran-Segmenten bilden); dieses Konstrukt sieht eine gewisse Trennung zwischen Domänen vor und ändert doch die allgemeine hydrophile Natur des Fusionsproteins nicht. Vier getrennte PCR-Reaktionen wurden durchgeführt, um DNA zu amplifizieren, die für jeweils eine getrennte Domäne kodiert. Das Verfahren, das verwendet wurde, um dann die Domänen-kodierenden Sequenzen zu fusionieren, ist dargestellt in Erlich, Ed., pp. 61-70 in PCR Technology, Stockton Press, New York, (1989). Das am meisten 5' gelegene verwendete Oligonukleotid (V31-A) war identisch zu dem in dem zwei V31-Fusionen verwendeten, das in den vorhergehenden Absätzen beschrieben wurde und enthielt die BamHI- Stelle für Ligation an die GST-Gensequenz. Das am weitesten 3' gelegene Oligonukleotid (V31-J, SEQ ID NO: 56) enthielt 17 Basen des V31-Gens und führte Stop-Codon nach Aminosäure 343 von von V31, gefolgt von einer EcoRI-Stelle.
Oligonukleotid V31-D (SEQ ID NO: 50) wurde mit dem stromaufwärtigen Oligonukleotid V31-A gepaart, um ein 294bp-Fragment zu amplifizieren, das für die erste extrazelluläre Domäne kodiert; das V31-A-Oligonukleotid enthält auch 12 Basen, die homolog sind zu dem Oligonukleotid der zweiten extrazellulären Domäne (V31-E, SEQ ID NO: 51). Die zweite extrazelluläre Domäne wurde mit Oligonukleotiden V31-E und V31-F (SEQ ID NO: 52) amplifiziert. Oligonukleotid V31-E enthält 12 Basen der ersten extrazellulären Domäne, gefolgt von 17 Basen der Sequenz der zweiten extrazellulären Domäne. Konsequenterweise enthält das 3'-Ende des PCR-Produkts der ersten extrazellulären Domäne 24 identische Nukleotide, wenn verglichen mit dem 5'-Ende des PCR-Produkts der zweiten extrazellulären Domäne, was erlaubt, daß die zwei PCR-Produkte aneinander anelliert und als ein fusioniertes DNA-Fragment reamplifiziert werden können (unter Verwendung von PCR und Oligonukleotiden V31-A und V31-F). Diese Strategie wurde auch auf die dritte und vierte extrazelluläre Domänen angewandt: die dritte extrazelluläre Domäne wurde amplifiziert unter Verwendung von Oligos V31-G (SEQ ID NO: 53) und V31-H (SEQ ID NO: 54) und die vierte extrazelluläre Domäne wurde amplifiziert unter Verwendung von Oligos V31-I (SEQ ID NO: 55) und V31-J und die resultierenden PCR-Fragmente wurden anelliert und reamplifiziert unter Verwendung von Oligos V31-G und V31-J. Schließlich wurden die zwei DNA-Fragmente, die die erste/zweite und dritte/vierte extrazellulären Domänen enthielten, zusammenfusioniert durch Anellieren der Fragmente und Amplifizieren mit Oligonukleotiden V31-A und V31-J in einer dritten PCR-Reaktion. PCR-Bedingungen und Verdau mit BamHI und EcoRI wurden vorgenommen wie beschrieben für die ersten zwei V31-Fusionsproteine. Produkte für die anfänglichen vier PCR-Reaktionen wurden elektrophoretisiert auf 1% Agarose/2% Nusieve-Agarose-Gel und eine jede Reaktion ergab das Fragment mit der vorhergesagten Größe (294 bp, 75 bp, 105 bp bzw. 111 bp für extrazelluläre Domänen eins bis vier). Zweite Reamplifikationsreaktionen wurden durchgeführt mit den gleichen PCR-Bedingungen, aber die Target-Sequenzen kamen aus den elektrophoretisierten Gelen, die ausgeschnitten worden waren durch Ausstechen der geeigneten Bande mit der Spitze einer Mikropipette. Die gewonnene Agarose (ein Volumen von zwei bis drei Mikrolitern) wurde dann in die zweite PCR-Reaktion ausgestoßen. Diese Reaktionen produzierten die DNA-Fragmente der vorhergesagten Größen von 345 pb (erste/zweite extrazelluläre Domäne) und 192 bp (dritte/vierte extrazelluläre Domäne). Diese DNA-Fragmente, einmal anelliert, wurden in der letzten PCR-Reaktion in ähnlicher Weise verwendet als Matrizen-DNA unter Verwendung von Oligos V31-A und V31-J. Das letzte PCR-Produkt wurde mit BamHI und EcoRI verdaut und wies eine Mobilität auf, übereinstimmend mit den erwarteten 513 bp. Die DNA wurde elektroeluiert und in pGEX-2T ligiert. Das resultierende Plasmid wurde bezeichnet als pGEX-V31-X10 und es wurde bestätigt, daß es die vorhergesagte DNA-Sequenz aufwies.
Die amplifizierten Sequenzen und Vereinigungen mit dem GST- Gen wurden sequenziert, um zu bestimmen, daß alle drei konstruierten Gene richtig zusammengebaut waren. Die drei GST/V31-Fusi-onsgene wurden in E.coli angezogen und ihre Synthese wurde mit IPTG induziert. Kulturen wurden bis zur späten exponentiellen Phase angezogen und durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden resuspendiert in PBS und durch Beschallung aufgebrochen. Zellulärer Debris wurde durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wurde mit Gluthation-Agarose-Kügelchen (Sigma) gemischt. Die Kügelchen wurden extensiv in PES gewaschen. An die Kügelchen gebundene Proteine wurden eluiert mit reduziertem Gluthation (Sigma). Aliquots von einer jeden Reinigungsstufe wurden auf Protein analysiert mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese. GST wird leicht durch dieses Verfahren gereinigt und stellt das Hauptprotein (mehr als 90%) dar, das von Gluthation-Agarose eluiert. Das GST-Fusionsprotein, das die vollständige V31- kodierende Sequenz enthält, produzierte mehrere Proteinbanden mit geringem Molekulargewicht (1000, 2500 und 4000 Da größer als GST) als dasjenige, das für das vollständige Fusionsprotein vorhergesagte war. Diese Produkte wurden von Gluthation-Agarose-Kügelchen eluiert, aber wurden in geringerem Maße als GST exprimiert. Diese Proteine können die Produkte der Fusions-Proteolyse (siehe unten) sein. Keine Proteinbande wurde bei dem vorhergesagtem Molekulargewicht für das vollständige V31-GST-Fusionsprotein beobachtet.
Das GST-Fusionsprotein, das die erste zelluläre Domäne enthielt (pGEX-V31-N1), produzierte mehrere Proteinbanden, die auf Gluthation-Agarose gereinigt wurden. Eine von diesen korrespondierte mit der ungefähren vorhergesagten Größe (10.000 Da größer als GST) und drei kleinere Banden wiesen Mobilitäten auf, die identisch mit dem GST-Fusionsprotein sind, das vollständigen V31 enthält.
Eine Reinigung des GST-Fusionsproteins, das alle vier extrazellulären Domänen (pGEX-V31-X10) enthält, wurde auch versucht. Nur geringe Mengen an Protein wurden von Gluthation- Agarose-Kügeichen eluiert und diese wiesen die gleiche Mobilität auf wie die pGEX-V31-F4-Banden und die kleineren pGEX- V31-X10-Banden. Es blieb jedoch eine große Menge an Protein mit dem Zellpellet assoziiert und wies eine Mobilität auf in Übereinstimmung mit der vorhergesagten Fusionsproteingröße. Aminoterminale Aminosäuresequenzierung wurde durchgeführt an diesem elektrophoretisch gereinigten Material und man bestimmte, daß die Sequenz die aminoterminale Sequenz von GST war. Dieses Protein kann somit das GST-Fusionsprotein mit den vier extrazellulären Domänen von V31 darstellen, das Einschlußkörper während der Synthese bilden und deshalb unlöslich und mit dem Zellpellet verbunden sein kann.
Es gibt verschiedene Beobachtungen, die vorschlagen, daß V31 eine Protease erkennen kann. Die Struktur von V31 ist sehr ähnlich dem Thrombin-Rezeptor. V31 teilt 30% Ähnlichkeit mit dem Thrombin-Rezeptor und beide Moleküle weisen ungewöhnlich lange erste extrazelluläre Domänen (89 Reste für V31, 100 für Thrombin) auf. Der Thrombin-Rezeptor enthält eine Thrombin-Spaltungsstelle in dieser ersten extrazellulären Domäne und der Rezeptor wird nach Proteolyse aktiviert. V31 enthält eine hervortretende proteolytische Erkennungssequenz, die fünf benachbarte Lysine (Aminosäurepositionen 18-22) einschließt, die ein gutes Ziel für eine für basische Reste spezifische Protease sein sollte (mehrere derartige Proteasen existieren, wie beispielsweise Trypsin). Darüber hinaus schlagen experimentelle Beobachtungen mit GST-V31-Fusionsproteinen vor, daß die erste extrazelluläre Domäne ein offensichtliches Ziel für eine E.coli-Protease ist. Während der Isolierung eines jeden der drei Fusionsproteine fand man, daß etwas von dem Material teilweise abgebaut war, wie beschrieben in den vorhergehenden Absätzen. Die Stellen der Proteolyse sind mutmaßlich in der ersten extrazellulären Domäne, da es die einzige Sequenz ist, die die drei Fusionsproteine gemeinsam haben. Die Größe (2500 Da größer als GST) von wenigstens einem dieser potentiellen Abbauprodukte ist konsistent mit einer Spaltung an oder nahe benachbarten Lysinen. Dieses Ergebnis schlägt vor, daß die erste extrazelluläre Domäne für Spaltung durch E.coli-Protease zugänglich ist. Derartige Zugänglichkeit für eine menschliche Protease kann zur Spaltung und nachfolgenden V31-Signaltransduktionsvorgängen in vivo führen.

Beispiel 16

Die extrazellulären Domänen der R20-Sequenz wurden auch gebaut für die Expression in E. coli als ein Fusionsprotein mit GST. Wie in Beispiel 15 für V31-Domänen beschrieben, wurden R20-Domänen ausgewählt durch ihre vorhergesagte Hydrophihe. Vier unabhängige PCR-Reaktionen wurden vorgenommen, um jede Domäne zu amplifizieren.
Das 5'-Oligonukleotid (R20-X1, SEQ ID NO: 57) kodiert für eine BamHI-Stelle für Ligation an das GST-Gen, gefolgt von 15 Nukleotiden des R20-Gens (beginnend mit dem Methionin- Initi-ationscodon) . Das am weitesten 3'gelegene Oligonukleotid (R20-Y4, SEQ ID NO: 64) enthielt 18 Reste des R20-Gens (viertes extrazelluläres kodierendes Segment), führte ein Stop-Codon nach Aminosäure 286 von R20 ein und wurde gefolgt von einer EcoRI-Stelle. Die erste eine extrazelluläre Domäne kodierende Sequenz wurde hergestellt durch PCR mit Oligonukleotiden R20-X1 und R20-Y1 (SEQ ID NO: 58) unter Verwendung der in Beispiel 15 beschriebenen Bedingungen. In ähnlicher Weise wurden die die zweite, dritte und vierte extrazelluläre Domäne kodierenden Sequenzen mit Primer-Paaren R20-X20 (SEQ ID NO: 59) und R20-Y2 (SEQ ID NO: 60); R20-X3 (SEQ ID NO: 61) und R20-Y3 (SEQ ID NO: 62); bzw. R20-X4 (SEQ ID NO: 63) und R20-Y4 amplifiziert. Die die erste und zweite extrazelluläre Domäne kodierenden Sequenzen wurden aneinander fusioniert durch eine zweite PCR-Reaktion ähnlich zu der in Beispiel 15 beschriebenen (Primer R20-Y1 und R20-X2 teilen 30 überlappende Nukleotide, die erlauben, daß die zwei primären PCR-Produkte für die Amplifikation eines fusionierten DNA-Fragmentes aneinander anellieren; die PCR-Reaktion enthält die zwei primären PCR-Produkte und Primer R20-X1 und R20-Y2. Die die dritte und vierte extrazelluläre Domäne kodierenden Sequenzen wurden ähnlich aneinander fusioniert in einer PCR-Reaktion mit Primern R20-X3 und R20-Y4. Schließlich wurden die PCR-Produkte von den zweiten Reaktionen anelliert und in einer dritten PCR amplifiziert mit Primern R20-X1 und R20-Y4; diese Reaktion produzierte eine DNA, die die vier extrazellulären Domänen kodierte. Die DNA wurde mit BamHI und EcoRI verdaut und dann in pGEX-2T ligiert, wie beschrieben in Beispiel 15. Das resultierende Plasmid wurde bezeichnet als pGEX-RDF6 und das Insert wurde durch DNA- Sequenzanalyse bestätigt.
Wie beschrieben in Beispiel 15 wurde E. coli, der dieses Plasmid beinhaltete, kultiviert und auf Produktion eines GST-R20-Domänen-Fusions-Protein analysiert. Eine Protein-Bande geeigneter Mobilität wurde auf SDS-PAGE von Gluthation-Agarose-gereinigtem Material beobachtet. Mehrere niedermolekulargewichtige Spezies (etwa 1000 Da kleiner) wurden auch beobachtet, die proteolytische Spaltungsprodukte darstellen können. Alle diese Banden konnten mit Thrombin gespalten werden, um eine Bande zu ergeben, die mit GST comigrierte. Dieses Ergebnis schlägt vor, daß die E. coli- Kulturen GST-Fusionsproteine mit R20-extrazellulären Domänensequenzen produzieren. Das auf Gluthation-Agarose gereinigte Material wurde direkt für Immunisierung von Mäusen verwendet zur Herstellung von Antikörpern, wie in Beispiel 18 unten beschrieben.

Beispiel 17

Durch Verfahren, ähnlich den in Beispiel 15 und 16 beschriebenen, wurden V31-B- und V28-kodierende Sequenzen gebaut, um als GST-Fusions-proteine exprimiert zu werden.
Die interessierende kodierende Sequenz (von der V31-B-cDNA, beschrieben in Beispiel 3, oder der V28-cDNA, beschrieben in Beispiel 7) wurde in die BamHI- und EcoRI-Stellen von pGEX-2T kloniert. Eine einzige bakterielle Kolonie, die dieses Plasmid enthielt, wurde verwendet, um 50 ml L Broth/Carbenicillin zu beimpfen und über Nacht bei 3700 kultiviert. Die Übernachtkultur wurde zehnfach verdünnt auf 500 ml mit L Broth/ Carbenicillin und für 1,5 Stunden bei 3700 inkubiert. IPTG wurde zu 1 mM zugesetzt und die Kultur wurde für 3,5 Stunden bei 3700 inkubiert. Die Bakterien wurden pelletiert, in 15 ml PBS/1% Triton X-100 resuspendiert und mit Bursts von 45-Sekunden beschallt, während sie eisgekühlt gehalten wurden. Das Homogenat wurde in Aliquots aufgeteilt und in einer Mikrofuge bei voller Geschwindigkeit für 5 Minuten rotiert. Die Pellets wurden resuspendiert in insgesamt 3 ml PBS/ 1% Triton X-100. Die Hälfte der Probe wurde auf 10 ml mit 3,5 ml H&sub2;O, 4,5 ml 2X Proben-Puffer und 0,5 ml 2 M DTT gebracht. Die Probe wurde für 3 Minuten gekocht und rotiert, bevor sie auf zwei präparative 10% Acrylamid-SDS-Gele geladen wurde. Die Gele liefen bei 30 InA für etwa 15 Stunden und wurden dann auf eiskalter 0,4 M KCl inkubiert, um Proteinbanden zu visulisieren. Die induzierte Bande wurde ausgeschnitten und für 4 Stunden bei 50 mA in etwa 10 ml Tris- Glycin-Puffer (kein SDS) in Dialyse-Schläuche elektroeluiert. Wenn notwendig, wurde das eluierte Fusionsprotein in Amicon Mikrokonzentratoren mit einem Molekulargeschwichtsausschluß von 30 kD konzentriert.

Beispiel 18

Erzeugung von Antikörder gegen V31-Fusionsproteine

Die GST-V31-Fusionsproteine V31-N1 und V31-X10, beschrieben in Beispiel 15, wurden auf Gluthation-Agarose gereinigt und mit einem gleichen Volumen Freundsches Adjuvans (vollständiges für die erste Injektion und unvollständiges für alle nachfolgenden Injektionen) emulgiert. Zwei Balb/c-Mäuse wurden anfangs subkutan mit etwa 200 ul eines jeden Konstruktes immunisiert. Nachfolgende Auffrischungen wurden vorgenommen in zweiwöchigen Intervallen und die Mäuse wurden retro-orbital nach drei Auffrischungen ausgeblutet.
Immunologische Reaktivität wurde bewertet durch Western Blot-Analyse. Etwa 25 ug von entweder Immunisierungs-Protein oder GST wurden in einem 10% Polyacrylamidgel aufgelöst und auf Nitrozellulose überführt. Der Filter wurde in PES, das 5% fettfreie Trockenmilch und 1% BSA enthielt, für 2-15 Stunden bei 4ºC blockiert. Das Serum (entweder präimmun oder immun) wurde 1:50 in Blockierungspuffer in einem Endvolumen von 2 ml verdünnt, mit dem Filterstreifen für 1 Stunde bei 4ºC inkubiert und dreimal mit 50 ml PBS gewaschen. Mit Meerrettich-Peroxidase (Amersham) konjugiertes Schaf-anti-Maus- Ig wurde 1:500 in PES verdünnt und mit einem jedem Filter für 1 Stunde bei 4ºC inkubiert. Die Filter wurden dreimal in 100 ml PES gewaschen und in 5 ml 3,3'-Diaminobenzidin (0,6 mg/rnl in 10 mM Tris-HCl; 0,6% NiCl&sub2;; 0,06% H&sub2;O&sub2;) plaziert. Immunaktivität gegen V31-Fusionsprotein wurde beobachtet bei Seren von Mäusen, die gegen V31-N1 und V31-X10 immunisiert waren. Zusätzlich wurde Immunreaktivität beobachtet gegen die Thrombin-gespaltenen V31-NI-Produkte (sowohl GST als auch die V31-aminoterminale Domäne).

Erzeugen von Antikörpern gegen V31-Peptide

V31-Peptide, die verwendet werden sollen, um V31-spezifische Antikörper zu erzeugen schließen ein, z. B.
Peptid ECDN-B (Aminosäuren 1 bis 15 von SEQ ID NO: 15)
MDLGKPMKSVLC
Aminsäurerest 12 (ein Cystein) wurde zu dem Peptid hinzugesetzt, um Konjugation des Peptids an einen immunogenen Träger zu erleichtern. Ein weiteres Peptid ist:
Peptid ECD2 (Aminosäuren 116 bis 129 von SEQ ID NO: 15)
YSAAKSWVFGVHFC
Peptid ECDN-B entspricht dem aminoterminalen Ende der ersten extrazellulären Domäne von V31, wohingegen Peptid ECD2 einer Region der zweiten extrazellulären Domäne von V31 entspricht.

Beispiel 19

Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um extrazelluläre und intrazelluläre Liganden für die 7TM-Rezeptoren der Erfindung zu identifizieren.
Zum Beispiel können, da 7TM-Rezeptoren an G-Proteine gekoppelt sind, um biologische Antworten zu bewirken, die sekundären Signaltransduktionsvorgänge (rezensiert von Linder et al., Sci. Am., 267: 56-65, (1992)], die von G-Proteinen verwendet werden, verwendet werden, um auf rekombinante 7TM- Rezeptorfunk-tion zu testen. Tests für die Aktivität von G- Protein-Effektormolekülen ( z. B. Adenylylcyclase, Phospholipase C, Ionen-Kanäle und Phosphodiesterasen) sind kürzlich beschrieben worden. Zum Beispiel kann die Konzentration an zyklischem AMP gemessen werden durch einen kommerziellen Radioimmuntest; Phosphoinositid-Produktion kann leicht überwacht werden [Downes et al., Biochern. J., 198: 133-140 (1981)]; und die kurzzeitige Freisetzung von intrazellulären Calcium-Ionenlagern kann mittels Spektrofluorimetrie beobachtet werden. Diese Tests können an säugerzellen vorgenommen werden, die 7TM-Rezeptoren der Erfindung exprimieren, in der Gegenwart und Abwesenheit von Testverbindungen, um potentielle Liganden der 7TM-Rezeptoren zu identifizieren oder zu reinigen und derartige Tests können auch verwendet werden für die Identifizierung oder Reinigung von Agonisten oder Antagonisten von 7TM-Rezeptoren.
Als weiteres Beispiel kann ein Calcium-Flux-Test verwendet werden, um Lösungen oder zelluläre Extrakte zu identifizieren, die Liganden für 7TM-Rezeptoren der Erfindung enthalten. Spezifischerweise werden 293-Zellen, die mit DNA-Sequenzen der Erfindung transfiziert wurden, die einen 7TM- Rezeptor kodieren, in einer 10 cm Schale bis zu 90% Konfluenz in MEM + 10% Serum kultiviert. Die Zellen werden mit CMF-PBS gewaschen und mit Fura-2 durch Inkubation in 4 ml MEM + 10% Serum + 1 uM Fura-2 AM (Molecular Probes - 1mM Stammlösung hergestellt in DMSC und in Aliquots eingefroren) beladen für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Zellen werden wiederum gewaschen und von der Platte mit Versen entfernt. Die Zellen werden pelletiert, in D-PBS (enthaltend 1 mM Ca&spplus;&spplus;) gewaschen und in 500 ul D-PBS resuspendiert für eine Konzentration von 10&sup7;/ml. Fluoreszenz-Änderungen werden überwacht in einem Hitachi F-4010 Fluoreszenzspektrometer. Etwa 10&sup6; Zellen werden in insgesamt 1,8 ml D-PBS unter Rühren in einer auf 37ºC gehaltenen Küvette resuspendiert. Anregungswellenlängen wechseln zwischen 340 nm und 380 nm in Intervallen von 4 Sekunden während Emission bei 510 nm überwacht wird. Testverbindungen werden durch eine Injektionsstelle hinzugefügt. Am Ende des Experiments wird Ionomycin hinzugefügt, um den maximalen Ca&spplus;&spplus;-Flux zu messen.
Ein kurzfristiger Ca&spplus;&spplus;-Flux ist ein Anzeichen für die Gegenwart eines Liganden für den 7TM-Rezeptor in der getesteten Lösung.
Die vorhergehenden veranschaulichenden Beispiele beziehen sich auf derzeit bevorzugte Ausführungen der Erfindung und man wird erwarten, daß zahlreiche Modifikationen und Varianten davon den Fachleuten einfallen werden. Es sollten daher nur solche Einschränkungen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen auftreten, dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung auferlegt werden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Godiska, Ronald
Gray, Patrick W.
Schweikart, Vicki L.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neuer Sieben-Transmembran-Rezeptor
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 64
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Bicknell
(B) STRASSE: 6300 Sears Tower, 233 South Wasser Drive
(C) ORT: Chicago
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 60606
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.01 Version 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG:
(A) ANMELDENMMMER: US 07/977,452
(B) ANMELDETAG: 17. November 1992
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Noland, Greta E.
(B) REGISTRIERNUMMMER: 35,302
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 31794
(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (312) 474-6300
(B) TELEFAX: (312) 474-0448
(C) TELEX: 25-3856
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 69 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:1:
GACGGATCCG TTTTTCTGTT GAATTTGGCT CTGGCTGACY TAYKOTTTKY MCTGACYTTG 60
CCMMTSTGG 69
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Base
(B) LAGE: 12
(D) WEITERE INFORMATION: /Beachte= "Die modifizierte Base an die ser Stelle ist ein Inosin."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Base
(B) LAGE: 15
(D) WEITERE INFORMATION: /Beachte= "Die modifizierte Base an dieser Stelle ist ein Inosin."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL:
(B) LAGE: 18
(D) WEITERE INFORMATION: /Beachte= "Die modifizierte Base an dieser Stelle ist ein Inosin."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezieller Unterschied
(B) LAGE: Ersetze (21,"")
(D) WEITERE INFORMATION: /Beachte= "Das Nukleotid an dieser Stelle kann auch ein Inosin sein."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifierzte Base
(B) LAGE: 27
(D) WEITERE INFORMATION: /Beachte= "Die modifizierte Base an die ser Stelle ist ein Inosin."
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:2:
GGCTAAGCTT GNACNATNGC YAGRTANCGR TC 32
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 120 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:3:
GTGGATAAAG AAGCATCTCT AGC-ACTGTGG AGGACGGGCT CCTTCCTGTG CAAAGGGAGC 60
TCCTACATGA TCTCCGTCAA TATGCACTGC AGTGTCCTCC TGCTCACTTG CATGAGTGTT 120
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:4:
TGGGCCTACA GCGCGGCCAA 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STEANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:5:
TCAATGCTGA TGCAAAGAAG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2058 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MEREMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL; CDS
(B) LAGE: 166..1355
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:6:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO:7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 410 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOFOLCGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:8:
GGTGAATTCA GGCTTTAAAG TTCCGCAC 28
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:9:
GCAGAACTGG TAGGTATGGA 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:10:
GTATGCCTGT GTCAAGATGA GGTCACGGAC GATTACATCG GAGACAACAC CACAGTGGAC 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NQ:11.
TTAAAGTTCC GCACGTCCTT CTTGGAGCAC AAAGACTCGA ACAAAGTGTA GTCCACTGTG 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 238 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 19 Basenpaare
(B) ART: Nuklearsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:13:
GCACAGCCTT CCTGTGTGG 19
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANDS: 2160 Basenpaare
(B) ART: Nuklearsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 64..1197
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:15:
(i) SEQUENZEENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 378 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 360 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(II) ART DES MOLEKÜLS DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B) LAGE: 253..360
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 243..251
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: TATA-Signal
(5) LAGE: 151..156
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5'-UTR
(5) LAGE: 180..242
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1900 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B) LAGE: 1..168
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) LAGE: 169..1245
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 169..1242
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 3'-UTR
(B) LAGE: 1246..1900
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 358 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:19:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 9 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:20:
GGYCAATCT
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 50 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 3..50
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TGPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SED ID NO:22:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2751 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B) LAGE: 1..691
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) LAGE: 692..1771
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
LAGE: 692..1768
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: polyA-Signal
(B) LAGE: 2341..2348
(xi) SEQUENZBESCHREISUNG: SEQ ID NO:23:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 359 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:24:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 60 Basispaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STEANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:25:
TGGACTCACT ATTTGATAAA TGAAAAGGGC CTCCACAATG CCATGTGCAA ATTCACTACC 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 66 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:26:
AATGCTGATG ACGGTGATGA AGAATATGCT TCCAAAAAAG CCGATGAAGA AGAAGGCGGT 60
AGTGAA 66
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2254 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STPANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 593..1657
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:27:
AAGCTTCAAA AAGCCTAGAG CTGGCTGGGC GCTGTGGCTC ACGCCTGTAA TCCTAGCATT 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 355 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STEANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:29:
TGGACTCACT ATTTCATAAA 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:30:
AAGATTTGAG AGTCAGAG 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1161 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOGOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) LAGE: 7..80
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 94..1158
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:31:
GAATTCACTC GTCTCTGGTA AAGTCTGAGC AGGACAGGGT GGCTGACTGG CAGATCCAGA 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 355 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:32:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:33:
TGGGTGGATA AAGAAGCATC TC 22
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
AACACTCATG CAAGTGACCA
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:35
(i) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 720 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 258..719
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:35:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:36:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 154 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:36:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:37
(i) SEQUENZKENNZEICHNEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:37:
CTACACGTAC CGGGACTATG A 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:38:
SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKOLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:38:
AGAAGACGCT GGCGTACATG 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1872 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 202.1341
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:39:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:40:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 380 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:40:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:41;
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2098 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFOSM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 551..1681
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:41:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 377 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1901 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 701..1717
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:43:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 339 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:44:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:45:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1317 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 201..1211
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:45:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 337 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:46:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:47:
GTTGGATCCA TGATTGCACC ACTGCA 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:48:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:48:
CGCGCTGTAG GCCCAGGCTT TAAAGTTCC 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:49.
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:49:
TTTAAAGCCT GGGCCTACAG CGCGGCCAA 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:50:
GTCACTGTAC AGGAGCTTGC AAAAGTGGA 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:51:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STPANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:51:
TTTTGCAAGC TCCTGTACAG TGACCTCCAG
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:52:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:52:
CTGGGCCAGG ACGATAAAGG CCTCCACATG 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:53:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:53:
GAGGCCTTTA TCGTCCTGGC CCAGACGGT 29
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:54:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SED ID NO:54:
TCAGAATTCA GGTGACGTCG TAGGCGA 27
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:55:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID 50:55:
ACTGAATTCT ATGGGGAGAA GGTGG
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:56:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID 50:56:
GGTGAATTCA GGCTTTAAAG TTCCGCAC 28
(2) ANGABEN ZU SEQ ID 50:57:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOFOLÖGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:57:
CTGGATCCAT GGAGGAAGGT GGT
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:58:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:58: ATAGTCCCGG TACGTGGCCC CCGAGGATTT 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:59:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:59:
AAATCCTCGG GGGCCACGTA CCGGGACTAT 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:60:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:60:
CCCGGTGGTG CGTAAGAGGT AGCTGCTGAG CT 32
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:61:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:61:
CTCAGCAGCT ACCTCTTACG CACCACCGGG GAC 33
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:62:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:62:
GTACAGCGTC TTCACAAGCC CACGGTGGTG G 31
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:63:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO:63:
ACCACCGTGG GCTTTGTGAA AGACGCTGTA CAT
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:64:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:64:
AGGAATTCTA GAAGAGGTCA AAGTCACA 28

Claims

1. Ein gereinigtes und isoliertes Polynukleotid, das die Aminosäuresequenz eines Sieben-Transmembran-Rezeptors V28 Codiert, angegeben in SEQ ID NO: 28, oder eines Fragmentes desselben, das wenigstens eine Liganden/Antiliganden-Bindungsaktivität oder immunologische Eigenschaft besitzt, die für besagten sieben-Transmembran-Rezeptor V28 spezifisch ist.

2. Das Polynukleotid nach Anspruch 1, welches eine DNA ist.

3. Das Polynukleotid nach Anspruch 11 welches eine cDNA ist.

4. Das Polynukleotid nach Anspruch 1, welches eine genomische DNA ist.

5. Das Polynukleotid nach Anspruch 1, welches eine vollständig oder teilweise chemisch synthetisierte DNA ist.

6. Das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches die Aminosäuresequenz eines Sieben-Transmembran-Rezeptors V28 codiert, angegeben in SEQ ID NO: 28.

7. Eine gereinigte und isolierte DNA, die einen Sieben-Transmembran-Rezeptor V28 codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) Nukleotiden 594 bis 1658 von SEQ ID NO: 27;

(b) dem Insert des Plasmids mit ATCC Accession No. 75326; und

(c) einer DNA, die unter stringenten Bedingungen an die DNA von (a) oder (b) hybridisiert.

8. Ein gereinigtes und isoliertes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches eine Sequenz umfaßt, die ein Fragment eines Sieben-Transmembran-Rezeptors V28 codiert, wobei besagtes Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus der N-terminalen extrazellulären Domäne von V28, Transmembran-Domänen von V28, extrazellulären Loops, die Transmembran-Domänen von V28 verbinden, intrazellulären Loops, die Transmembran- Domänen von V28 verbinden, der C-terminalen zytoplasmatischen Domäne von V28 und Fusionen derselben besteht.

9. Ein DNA-Vektor, der eine DNA nach einem der vorangehenden Ansprüche umfaßt.

10. Ein Vektor nach Anspruch 9, wobei besagte DNA operativ mit einer Expressionskontroll-DNA-Sequenz verknüpft ist.

11. Eine Wirtszelle, die mit einer DNA nach einem der vorangehenden Ansprüche in einer Weise stabil transformiert oder transfiziert ist, welche die Expression in besagter Wirtszelle von besagtem Sieben-Transmetnbran-Rezeptor V28 oder besagtem Fragment desselben, das wenigstens eine Liganden/Antiliganden- Bindungsaktivität oder immunologische Eigenschaft besitzt, die für besagten Sieben-Transmembran-Rezeptor V28 spezifisch ist, ermoglicht.

12. Ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids des Sieben- Transmembran-Rezeptors V28 oder eines Fragments desselben, welches die Schritte umfaßt, daß eine Wirtszelle nach Anspruch 11 in einem geeigneten Nährstoffmedium angezogen und besagtes Polypeptid oder Fragment desselben aus besagter Zelle oder besagtem Medium isoliert wird.

13. Ein gereinigter und isolierter Sieben-Transmembran-Rezeptor V28, der die Aminosäuresequenz umfaßt, die in SEQ ID NO: 28 angegeben ist, oder ein Fragment oder eine Variante desselben, das (die) wenigstens eine Liganden/Antiliganden-Bindungsaktivität oder immunologische Eigenschaft besitzt, die für besagten Sieben-Transmembran-Rezeptor spezifisch ist.

14. Ein gereinigter und isolierter Sieben-Transmembran-Rezeptor V28 nach Anspruch 13.

15. Ein gereinigtes und isoliertes Fragment des Sieben-Transmembran-Rezeptors V28 nach Anspruch 13, ausgewählt aus der Gruppe, die aus den N-terminalen extrazellulären Domänen von V28, Transmembran-Domänen von V28, extrazellulären Loops, die Transmembran-Domänen von V28 verbinden, intrazellulären Loops, die Transmembran-Domänen von V28 verbinden, der C-terminalen zytoplasmatischen Domäne von V28 und Fusionen derselben besteht.

16. Eine Antikörpersubstanz, die für Sieben-Transmembran-Rezeptor V28 spezifisch ist.

17. Die Antikörpersubstanz nach Anspruch 16, welche ein monoklonaler Antikörper ist.

18. Eine anti-idiotypische Antikörpersubstanz, die für eine Antikörpersubstanz nach Anspruch 16 oder 17 spezifisch ist.

19. Eine humanisierte Antikörpersubstanz nach Anspruch 16 oder 17.

20. Eine Antikörpersubstanz nach Anspruch 16, 17 oder 18 zur Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Entzündungen in einem Säuger.

21. Ein in-vitro-Verfahren zur Modulation der Liganden/Antiliganden-Bindung des Sieben-Transmembran-Rezeptors V28 nach Anspruch 14, welches den Schritt umfaßt, daß besagter Sieben- Transmembran-Rezeptor V28 mit einem für besagten Sieben-Transmembran-Rezeptor V28 spezifischen Antikörper in Kontakt gebracht wird.

22. Ein in-vitro-Verfahren zur Nodulation der Liganden/Antiliganden-Bindung des Sieben-Transmembran-Rezeptors V28 nach Anspruch 14, welches denschritt umfaßt, daß besagter Sieben- Transmembran-Rezeptor V28 mit einem Agonisten oder Antagonisten von besagtem Sieben-Transmembran-Rezeptor V28 in Kontakt gebracht wird.

23. Eine Wirtszelle, die mit einer DNA nach Anspruch 6 oder 7 in einer Weise stabil transformiert oder transfiziert ist, welche die Expression in besagter Wirtszelle von besagtem Sieben-Transmembran-Rezeptor V28 ermöglicht.