Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Verbesserung
des Nährwertes von fasrigen Feldfrüchten zur Verfütterung an
wiederkäuende und monogastrische Tiere durch Behandlung mit
neuen Enzympräparationen. Die Erfindung bezieht sich
insbesondere auf die Fraktionierung von Cellulase-Enzymen,
die beispielsweise, aber nicht speziell, von Trichoderma-
Spezies stammen, um deren Wirksamkeit bei der Verbesserung
der Verfügbarkeit der Energie aus Cellulose- und
Hemicellulolse-Einheiten von Faserstoffen für Mikroben im
Pansen wiederkäuender Spezies und/oder in den
Verdauungsprozessen von monogastrischen und wiederkäuenden
monogastrischen Tieren, die keine Enzymsysteme haben, welche
fähig sind, Faserstoffe zu verwerten, zu erhöhen. Außerdem
können diese neuen Enzymsysteme verwendet werden, um fasrige
Feldfrüchte während der Konservierung unter vorteilhafter
Wirkung auf das Silierungsverfahren zu behandeln; sie können
ebenso zur Behandlung konservierter Feldfrüchte und fasriger
Nebenprodukte anderer Feldfrüchte, z.B. Fruchtfleisch von
Zitrusfrüchten, Baumwolle, usw., kurz vor der Fütterung an
die Tiere eingesetzt werden. Ferner betrifft die vorliegende
Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Enzymprodukte.
Stand der Technik
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Wenn fasrige Feldfrüchte reifer werden, nimmt die
Energieausbeute pro Einheit Landfläche zu; allerdings nimmt
die Verfügbarkeit von energie, d.h. Cellulose und
Hemicellulose aufgrund des Pflanzenverholzungsprozesses, bei
dem die Celluloseketten in den Pflanzenzellwänden durch
komplexe Vernetzungen verholzt werden, ab. Dies führt bei dem
Tier zu einer beträchtlichen Verringerung der Verdaubarkeit
der Trockenmaterialkomponenten. Obwohl die Feldfrucht unter
wirtschaftlichem Gesichtspunkt reif mit höchster
Trockenmasseausbeute geerntet werden sollte, zwingt die
Limitierung bei der Energieverdaubarkeit dazu, daß die Ernte
in einem unreiferen Stadium mit geringerer
Trockenmasseausbeute und potentiellen Problemen bei der
Konservierung aufgrund eines geringeren Gehalts an
Trockenmasse stattfindet. Indem man solche Vernetzungen
zwischen Cellulose-Einheiten zerstört, können Enzyme es
zulassen, daß Feldfrüchte bei späteren Reifegraden geerntet
werden; auf diese Weise erhöht sich die Energieausbeute ohne
die übliche Reduzierung der Verdaubarkeit. Dasselbe Verfahren
kann Zucker für Silagemikroben verwertbar machen, was die
Konservierung solcher Feldfrüchte unter ungünstigen
Wetterbedingungen, bei denen der Gehalt an Trockenmaterial
gering ist, verbessert.
Konservierung
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Die Konservierung fasriger Feldfrüchte (Gras, Hülsenfrüchte,
ganze Getreidefrüchte - Mais, Sorgho, usw.) für eine
zukünftige Verwendung als Tierfutter beruht grundsätzlich
entweder auf der Entfernung von Wasser durch Trocknung (Heu
usw.) oder dem Ausschluß von Luft und Azidifizierung der
Masse zu einem Punkt, wo die Aktivitäten von epiphytischen
verderbniserregenden Mikroorganismen (Hefen, Schimmel und
Bakterien) reguliert und die Enzymaktivitäten des
Pflanzenmaterials eingeschränkt werden. In der Praxis wird
ein pH von weniger als etwa 4,2 benötigt und entweder durch
Säurezusatz zu der Feldfrucht oder durch Säuren, die durch
Fermentation von epiphytischen Mikroorganismen produziert
werden, erreicht.
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Übliche Umweltbedenken machen den Säurezusatz wenig
akzeptabel. Die Umweltbedenken werden durch die allgemein
verwendeten Säuren, z.B. Ameisensäure vergrößert. Diese
Säuren erhöhen die Produktion von saurem Ausfluß aus nassen
Feldfrüchten.
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Die Alternative besteht darin, sich auf eine natürliche
Fermentation zu verlassen. Allerdings produziert eine
natürliche Fermentation unterschiedliche Resultate, die
manchmal unzureichend sind. Unerwünschte Epiphyten können
gegenüber erwünschten Milchsäurebakterien in Feldfrüchten,
die geringe Mengen Zuckersubstrate enthalten, dominieren. Die
erwünschten Milchsäurebakterien, d.h. Homomilchsäure-
Bakterien, produzieren hauptsächlich Milchsäure. Diese
Milchsäureproduktion erniedrigt den pH-Wert ohne merkliche
Beeinträchtigung des Nährwertes, speziell der
Proteinqualität. Wenn dagegen unerwünschte Epiphyten
dominieren, wird der pH nur langsam erniedrigt und er kann
keinen ausreichend niedrigen Wert erreichen. Die
resultierende Wirkung auf die Futterqualität ist dann
schädlich für die Tierleistung.
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Die Situation kann verbessert werden, indem die erwünschten
Milchsäurebakterien der Feldfrucht in Konzentrationen
zugesetzt werden, die ausreichen, um über die Epiphyten zu
dominieren. Allerdings hilft diese Technik nicht, wenn der
Zuckerlevel in der Feldfrucht niedrig ist. Die
wasserlöslichen Kohlenhydrate, die von den
Milchsäurebakterien benötigt werden, können der Feldfrucht
zugesetzt werden. Man könnte beispielsweise Melasse, Stärke
oder Zucker wie Glucose, Lactose und Saccharose zusetzen.
Allerdings schafft dieses Verfahren andere Probleme. Im
allgemeinen muß eine große Zuckermenge zugesetzt werden, d.h.
10 bis 20 kg Zucker pro Tonne und zwischen 35 und 45 kg
Melasse pro Tonne Feldfrucht. Es ist schwierig, solche großen
Mengen dieser viskosen Materialien auf die Feldfrucht
aufzubringen. Es ist auch schwierig, der Feldfrucht trockene
Materialien gleichmäßig zuzusetzen. Einige Zusatzstoffe, wie
z.B. Glucose, Lactose und Saccharose sind zu teuer, um sie zu
verwenden. Darüber hinaus verwerten Lactose-Bakterien Stärke
nicht effektiv, wenn nicht Amylase vorhanden ist, um die
Stärke in Zucker umzuwandeln.
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Alternativ können Enzyme eingesetzt werden, um die komplexen
strukturellen Kohlenwasserstoffe in den Feldfrüchten in
einfache Zucker zu spalten. Milchsäurebakterien können die
auf diesem Wege freigesetzten Zucker verwerten und die
Fermentation bestimmen. Das US-Patent Nr. 4 751 089 von
Heikonen et al. stellt ein Verfahren zur Silierung von Futter
und Getreide durch Zusatz von Glucoseoxidase dar. Die
Glucoseoxidase produziert aus Glucose in den löslichen
Kohlenhydraten Gluconsäure. Die Gluconsäureanhäufung
erniedrigt den pH Entsprechend diesem US-Patent können
andere Enzyme, z.B. Cellulase, Hemicullulase und B-
Glucosidase zur Erhöhung der Glucose-Produktion zugegeben
werden.
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Allerdings können cellulolytische Enzyme unerwünschte
Nebenwirkungen produzieren, wenn sie fasrigen Feldfrüchten
zugesetzt werden, die wenig (d.h. weniger als 25 %)
Trockenmasse enthalten, z.B. unreife Feldfrüchte.
Cellulolytische Enzyme können beispielsweise die Menge und
die Zusammensetzung des ausfließenden Mediums erhöhen. Das
ausfließende Medium enthält lösliche zelluläre Materialien.
Diese Materialien geben dem ausfließenden Medium einen hohen
BOD und können Umweltprobleme verursachen. Der Verlust des
ausfließenden Mediums reduziert auch den Nährwert der
Feldfrucht. Diese Enzyme können die Milchsäurewerte erhöhen
und die Faserstruktur in einem Ausmaß verändern, daß die
Tierleistung verringert wird. Als Resultat der erhöhten
Zuckerlevel, die durch die Enzyme produziert werden, können
Hefen und Schimmel besser wachsen. Ein verstärktes Hefe- und
Schimmelwachstum kann die aerobe Stabilität erniedrigen und
gefährliche Mycotoxine produzieren. Zusätzlich setzen
Qellulasen Zucker frei, die ein Substrat für
verderbniserregende Bakterien, speziell Colstridien-Arten wie
auch für nützliche Milchsäurebakterien sind.
Futter-Effizienz
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Bei Wiederkäuern hängt die Effizienz, mit dem Faserstoff von
dem Wirtstier ausgenutzt wird, von der effektiven Tätigkeit
einer gemischten mikrobiellen Pansenpopulation ab. Die
Zusammensetzung dieser mikrobiellen Population hängt von dem
Futter ab. Das Endresultat mikrobieller Aktivität an
Energiequellen ist die Produktion von flüchtigen Fettsäuren,
die als Vorstufen innerhalb des Gewebes des Wirts für die
Zufuhr von Energie für Stoffwechselprozesse und für die
Synthese von Tierprodukten, z.B. Milch, Fleich und Wolle,
wirken. Die Effizienz, mit der diese Produkte produziert
werden, hängt von den jeweiligen Proportionen der flüchtigen
Fettsäuren, speziell Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure
und Valeriansäure untereinander ab. Futter mit einem hohen
Stärke- und/oder Zuckergehalt fördert die Synthese von
Butter- und Propionsäure, während Faserstoff Essigsäure
begünstigt. Der wünschenswerte Typ einer Pansenfermentation
hängt von dem verlangten Tierprodukt ab. Somit ist die
Fähigkeit, das Substrät zu modifizieren, speziell die
Fähigkeit, die Reaktivität der Fasern in dieser Hinsicht zu
modifizieren, von primärer wirtschaftlicher Bedeutung, da
diese die kostengünstigste Energieform ist.
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Für monogastrische Tiere ist Faserstoff keine günstige
Energiequelle, aber er liegt in den meisten Stärkequellen,
z.B. in Getreiden, vor. Faserstoff ist auch wichtig, um die
normale Darmfunktion aufrecht zu erhalten. Dies ist mit der
Reaktivität der Faser, z.B. Kationenaustauschervermögen,
assoziiert. Die Fähigkeit zur Energiefreisetzung aus der
Faserfraktion der Nahrung und zur Verbesserung ihrer
Reaktivität ist somit bei der monogastrischen Ernährung und
Gesundheit von großer Bedeutung.
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Enzymprodukte für die Konservierung von Viefutter mit
geringer Trockenmasse und zur Erhöhung der Futterausnutzung
haben zwei Hauptprobleme. Erstens, in einem effizienten
Sililierungsprozeß sollte das Enzym den gewünschten pH, die
gewünschte Milchsäure- und Kohlenhydrat-Konzentration bei
gleichzeitiger Minimierung der Produktion an ausfließendem
Medium und des Wachstums von verderbniserregenden Organismen
produzieren.
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Die Behandlung von Viehfutter mit einer kompletten Mischung
von cellulolytischen Enzymen verringert den Faserstoffgehalt
der Silage durch Löslichmachen von polymeren Kohlenhydraten.
Eine übereffektive Verdauung führt zu einem totalen
Zellwandzusammenbruch und folglich zur Produktion von
ausfließendem Medium mit hohem Zuckergehalt. Eine
Fermentation während der Silage wird angeregt; Milchsäure
sammelt sich an und der pH sinkt. Unter diesen Bedingungen
werden Bakterien gehemmt; aber die Enzyme produzieren weiter
monomere Kohlenhydrate, von denen ein Teil mit dem
ausfließenden Medium verloren geht. Die Silage, die hohe
Konzentrationen an Milchsäure und leicht vergärbaren Zuckern
enthält, kann für den Wiederkäuer schädlich sein, was
Milchsäure-Azidose und Verdauungsstörungen verursacht.
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Zweitens, um eine effiziente Pansenfunktion und
Futterausnützung durch Wiederkäuer zu gewährleisten, sollten
die Menge und die Typen der Zucker, die für die
Pansenmikroben verwertbar sind, und die Reaktivität des
Faserstoffs optimiert werden.
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GB-A-2 046 567 offenbart ein Verfahren zur Konservierung von
pflanzlichem Material, indem ein Bakterienkomplex, der einen
cellulolytischen Komplex enthält, in Luzernesilos verwendet
wird. Der cellulolytische Komplex beinhaltet eine Amylase aus
Pilzen, eine Amylase bakterieller Herkunft, eine
Amyloglucosidase sowie einen hemicellulolytischen Komplex aus
Pilzen, dessen Hauptaktivität galactomannasisch ist.
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Die EP-A-0 113 626 offenbart eine Stabilisierung von
Glucanase oder α-Amylasen unter Verwendung eines festen
Trägers, der von Branntweinbrenners verbrauchten Getreide
gebildet wird. Diese stabilisierten Enzyme werden Tierfutter
zugesetzt.
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WO 91/18090 offenbart Enzympräparationen, die mit
Hemicellulase-, Pektin- und/oder Lignin-abbauenden Enzymen
angereichert sind und denen ganz oder teilweise Cellulose
abbauende Aktivität fehlt. Solche Enzympräparationen werden
durch genetische Modifikation hergestellt und sind zur
Viehfutterproduktion verwendbar.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der
Bereitstellung einer Enzympräparation für verschiedene
Feldfrüchte, verschiedene Reifegrade und verschiedene
Trockenmassegehalte, welche die Nachteile der bekannten
Präparationen nicht aufweisen. Die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht insbesondere in der Bereitstellung von
Enzymkombinationen, die günstige Veränderungen in der
Struktur der Pflanzenzellwände ergeben, nur die für eine
effektive Silage benötigte Menge an Zuckern liefern, die
Produktion des ausfließenden Mediums nicht verstärken, das
Wachstum von Clostridien, Hefe oder Schimmel nicht
unterstützen, die aber fähig sind, die Struktur der Pflanzen-
Polymeren so zu verändern, daß sie für eine weitere
enzymatische Hydrolyse im Pansen zugänglicher sind und eine
verbesserte Verdauung im monogastrischen Verdauungstrakt
haben.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die
Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung dieser
Enzymprodukte.
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Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß die
nachteiligen Wirkungen der handelsüblichen Produkte durch das
Vorhandensein bestimmter Enzymkombinationen in den Zellulasen
handelsüblicher Qualität, die in diesen Produkten eingesetzt
werden, verursacht werden. Durch die Fraktionierung dieser
handelsüblichen Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung
wurden neue Enzymprodukte erhalten, die jeweils mehrere
einzelne Enzyme enthalten und die ihre eigenen
charakteristischen Merkmale haben, auf deren Basis die
geeignetesten Fraktionen für jeden besonderen
Verwendungszweck ausgewählt werden können.
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Nach einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Verbesserung des Nährwertes für Tiere bei einer
Feldfrucht bereit, das den Schritt einer Behandlung der
Feldfrucht mit einer cellulolytischen Enzymzusammensetzung,
die die Cytolase-123-Fraktion ist, welche sich bei pH 8 und
einer Leitfähigkeit, die der eines 20 mM-Tris-Puffers
äquivalent ist, nicht an ein Q-Sepharose-
Anionenaustauscherharz bindet, umfaßt.
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Nach einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung
einen cellulolytische Enzymzusammensetzung bereit, die die
Cytolase-123-Fraktion ist, welche sich bei einem pH von 8 und
einer Leitfähigkeit, die der eines 20 mM-Tris-Puffers
äquivalent ist, nicht an ein Q-Sepharose-
Anionenaustauscherharz bindet.
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Trennverfahren, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung
verwendbar sind, umfassen solche Verfahren, die
handelsübliche Oellulase-Zusammensetzungen auf der Basis der
Ionen-Austauschereigenschaften der Proteine trennen.
Beispielsweise sind chromatographische Verfahren verwendbar,
z.B. Ionen-Aus tauscherchromatographie. Verwendbare Harze
umfassen Q-Sepharose und Mono-Q (beide von Pharmacia)
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Die Cellulase-Fraktion ist zur Konservierung von fasrigem
Feldfrüchtefutter und zur Verbesserung der Futterverwertung
durch Wiederkäuer und monogastrische Tiere verwendbar. Jede
Cellulasefraktion hat einen charakteristischen Satz von
Enzymen und daher unterschiedliche Wirkungen auf die fasrige
Feldfrucht während der Silierung wie auch im Pansen und
Dünndarm nach der Futteraufnahme. Die Fraktion kann mit
geeigneten vorteilhaften Mikroorganismen wie Bakterien oder
Hefe eingesetzt werden, um so bei jeder besonderen Anwendung
verschiedene Wirkungen zu produzieren. Das Produkt kann auch
bei konserviertem Futter kurz vor der Fütterung eingesetzt
werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
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Figur 1 zeigt die Extinktion bei 280 nm für das Eluat aus
einer Trennung einer handelsüblichen Cellulase an einer
Anionen-Austauschersäule;
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Figur 2 zeigt die isoelektrischen Punkte von Proteinen in
einer handelsüblichen Cellulase und in jedem ihrer
Hauptfraktionen als Resultat einer Anionen-
Aus tauscherchromatographie;
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Figur 3 zeigt die Extinktion bei 280 nm für das Eluat aus
Trennungen einer handelsüblichen Cellulase und ihren vier
Hauptanionen-Austauscherfraktionen an einer analytischen
Mono-Q-Anionen-Austauschersäule; und
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Figur 4 zeigt die Extinktion bei 280 nm für das Eluat aus
einer Trennung einer handelsüblichen Cellulasefraktion A an
einer Kationen-Austauschersäule aus CM-Sepharose (Pharmacia)
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Cellulolytische Enzymgemische handelsüblicher Qualität (z.B.
solche, die unter der Handelsbezeichnung Cytolase-123 von
Genencor verkauft werden) enthalten typischerweise eine große
Anzahl an Enzymen. Handelsüblich wichtige callulolytische
Enzymgemische sind z.B. die, die von Trichoderma-Spezies,
beispielsweise Trichoderma longibrachiatum stammen. Andere
cellulolytische Enzymgemische, z.B. solche aus bakteriellen
oder anderen fungalen Quellen, haben ähnliche Eigenschaften.
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Die Wirkung der Enzymfraktionen auf behandeltes Futter und
Silage und auf die Tierleistung (Mastleistung), sowohl allein
als auch in mehreren unterschiedlichen Kombinationen, wurde
durch die Messung einer großen Zahl von Parameter bestimmt.
Die wichtigsten Parameter hinsichtlich der Tierleistung sind
die Menge und Typen von Zucker, die freigesetzt werden, und
die Veränderungen in der Struktur des Faserstoffs, welche das
Pansen-Fermentationsverfahren und die Verdauung im
monogastrischen Trakt regulieren. Durch Messung des
Potentials des Faserstoffs zur Freisetzung von Zuckern vor
und nach dem Silierverfahren kann der Verlust des Nährwertes
während der Konservierung bestimmt werden. Wenn ein
wesentlicher Teil des strukturellen Kohlenhydrats während des
Silierprozesses in Säure umgewandelt wird, ist die
Konservierung gut. Andererseits reduziert dies die Energie,
die für die Pansenmikroben verfügbar ist und limitiert auf
diese Weise den Futterwert. Eine optimale Kombination wäre
eine Produkt, das nur genügend Zucker freisetzt, um eine gute
Silierung zu gewährleisten, und einen Zuckertyp freisetzt,
der von den meisten verderbniserregenden Mikroben, nicht
verwertet wird, z.B. Xylose, und das die Pansenwirksamkeit
noch verbessert. Ein wichtiges Charakteristikum ist auch das
Potential zur Produktion von ausfließendem Medium, was mit
der Zuckerfreisetzungsaktivität in Verbindung steht.
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Jede der erhaltenen Enzymfraktionen enthält einen
charakteristischen Satz individueller Enzyme und hat
unterschiedliche Wirkungen auf die Faserstruktur,
Zuckerfreisetzung, Silierkonservierung und Produktion an
ausfließendem Medium.
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Auf der Basis dieser Merkmale ist es möglich, die für jeden
besonderen Verwendungszweck am besten geeignete Fraktion
auszuwählen. Zur Konservierung der Feldfrüchte ist die
Fraktion fähig, innerhalb von 48 h einen pH von etwa 4,0 zu
produzieren. Die Fraktion kann auch zur Verbesserung des
Futterwertes der frischen oder konservierten fasrigen
Feldfrucht vor der Fütterung verwendet werden.
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Insbesondere die Fraktion A, die die Fraktion von
Cytolase-123 ist, welche sich bei einem pH von 8 und einer
Leitfähigkeit, die der eines 20 mM-Tris-Puffers äquivalent
ist, nicht an ein Q-Sepharose-Anionenaustauscherharz bindet,
verbessert die Verwertbarkeit von Zucker für die
Pansenmikroben. Fraktion A verbessert auch die Reaktivität
des Faserstoffs.
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Wenn ausfließendes Medium kein Problem darstellt, z.B. bei
fasrigen Feldfrüchten, die bei Trockenmassekonzentrationen
von über 25 % siliert werden, kann Fraktion A sowohl zur
Verbesserung der Konservierung als auch zur Verbesserung der
Tierleistung verwendet werden.
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Wenn gewünscht wird, eine rasche Verbesserung bei der
Zuckerfreisetzung zu erzielen, beispielsweise vor einer
Fütterung der Tiere, wird die Fraktion A zur Behandlung
fasriger Feldfrüchte zur Verfütterung an Wiederkäuer und
speziell monogastrische Tiere verwendet.
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Die erfindungsgemäßen Enzymprodukte bieten daher mehrere
Vorteile. Durch die Verwendung der Enzymfraktion (mit oder
ohne günstige exogene Mikroorganismen) werden sowohl
hinsichtlich der Konservierung fasriger Feldfrüchte und der
Verwertung des Futters und der Tierleistung große
Verbesserungen erzielt. Vier Punkte sind es wert, besonders
hervorgehoben zu werden: durch die Verwendung der
erfindungsgemäßen Enzymprodukte wird die
Feldfruchtkonservierung verbessert; kann das Ausflußproblem
gelöst werden; kann der Zuckerfreisetzungswert verbessert
werden und kann der Faserreaktivitätswert verbessert werden.
BEISPIEL 1: FRAKTIONIERUNG VON CYTOLASE-123
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Die Fraktionierung wurde in einer 2-l-Säule mit Pharmacia Q-
Sepharose-Anionenaustauscher durchgeführt. Für jeden Lauf
wurde 1 l cytolase-123 (Genencor), die etwa 200 g Protein
(basierend auf der Extinktion bei 280 nm) mit pH 5,2
enthielt, auf pH 8 und die Leitfähigkeit des 20 mM Tris-
Puffer durch Ultrafiltration und anschließende Verdünnung mit
Wasser eingestellt. Die eingestellte Enzymlösung wurde in die
Säule gebracht. Das nicht-absorbierte Material (Fraktion A)
wurde mit etwa 10 l 20 inm Tris-Puffer ausgewaschen. Die
absorbierten Enzyme wurden mit einem linearen Gradienten von
0 bis 0,5 M NaCl mit einem Gesamtvolumen von etwa 10 l
eluiert. Das Säuleneluat wurde gesammelt. Die gebundenen
Fraktionen wurden mit 20 mM-Tris-Puffer bei Natriumchlorid-
Konzentrationen von 80 mM (Fraktion B), 150 mM (Fraktion C)
und 500 mM für Fraktion D eluiert. (Im folgenden werden diese
Fraktionen als Fraktionen A, B, C und D in der Reihenfolge
der Elution bezeichnet.) Diese Fraktionierungsresultate sind
in Figur 1 graphisch dargestellt.
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Die Fraktionen A, B, C und D enthielten, basierend auf der
Extinktion bei 280 nm, die folgenden Protein-Mengen:
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A 27 g, B 18,3 g, C 47,6 g, D 73 g.
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Es wird angenommen, daß der Schwanz der Fraktion D (d.h. das
Eluat in dem Puffer mit 0,3 M NaCl und mehr) nur Spuren von
Protein-Material enthielt und daß die in dem Schwanz
beobachtete Extinktion von etwas UV-absorbierendem Material
mit kleinem Molekulargewicht herrührte.
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Die Fraktionen wurden durch isoelektrische Fokussierung in
Gelen analysiert, um so Proteine mit isoelektrischen Punkten
zwischen 3 und 9 zu trennen. Diese Resultate wurden als
Fingerprints verwendet, um Fraktionen, die von verschiedenen
Trennungsverfahren stammten, zu vergleichen. Die erhaltenen
Resultate sind in Figur 1 graphisch dargestellt. Die
wichtigsten Fraktionen wurden auch durch analytische
Flüssigkeitschromatographie an Mono-Q, das hervorragende
Auflösungskraft für Proteine aufweist, analysiert. Die
Resultate sind in Figur 3 graphisch dargestellt.
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Das Material, das nicht an Q-Sepharose (Fraktion A)
absorbiert wurde, wurde mit einer Kationenaustauscher-OM-
Sepharose-Säule fraktioniert. Diese Resultate sind in Figur 4
dargestellt. Cytolase wurde mit Q-Sepharose in 4 Enzym-
Fraktionen aufgeteilt, von denen jede mehrere
unterschiedliche Proteine und Enzyme enthielt. Die Verteilung
verschiedener Aktivitäten bei Cytolase und den 4 Fraktionen
ist in Tabelle 1 beschrieben. Die Resultate zeigen, daß
Cytolase-123 ein sehr komplexes Enzym-Gemisch ist, und daß
sogar die erhaltenen Fraktionen Multienzympräparationen sind.
Die Fraktionen können - wenn gewünscht - beispielsweise
chromatographisch oder durch Präzipitation weiter gereinigt
werden.
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Alternativ können die Enzyme unter Verwendung varuerender
Kombinationen aus pH, Salzkonzentrationen und
Pufferkonzentration und -typ eluiert werden. Beispielsweise
führte eine Verwendung von 20 mM Tris-Puffer von pH 7,6 zu
der loseren Bindung der Fraktionen B, C und D an die Säule,
so daß sie bei Salzkonzentrationen von 20 mM (Fraktion B),
115 mM (Fraktion C) und 500 mM (Fraktion D) eluiert wurden.
Allerdings ändern Veränderungen dieser Parameter nicht die
Reihenfolge, in der die Fraktionen von der Säule eluiert
wurden, nachdem Fraktion A ausgewaschen worden war. In einem
alternativen Verfahren kann das Enzym mit einem schrittweisen
Gradienten mit entsprechenden pH, Puffer- und
Salzkonzentrationen eluiert werden.
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Unfraktionierte Cytolase und die Fraktionen A, B, C und D
wurden mit analytischer Flüssigkeitschromatographie unter
Verwendung einer Mono-Q-Säule (Pharmacia) analysiert. Die
Resultate zeigen, daß die Fraktionen B, C und D jeweils mehr
als eine Komponente enthalten (siehe Figur 3).
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Cellobiohydrolase I, Cellobiohydrolase II und Endogluconase I
wurden durch die Verwendung von Anticellobiohydrolase I-,
Anti-Cellobiohydrolase II- und Antiendogluconase 1-Antiseren
identifiziert (siehe Tabelle 1).
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Das Material, das nicht an Q-Sepharose (Fraktion A)
absorbiert wurde, wurde mit einer Kationenaustauscher-CM-
Sepharosesäule fraktioniert. Die CM-Sepharose-Fraktionierung
der Q-Sepharose-Fraktion A zeigte auf der Basis von Enzym-
Aktivitätsversuchen, daß das Material, das bei den Punkten
4.1 und 4.2 eluiert wurde, Esterase-Aktivität hatte; das
Material, das bei den Punkten 4.3, 4.4 und 4.5 eluiert wurde,
hatte CMC-Aktivität; das Material, das bei den Punkten 4.4
und 4.5 eluiert wurde, hatte auch Xylosidase-Aktivität; das
Material, das etwa bei Punkt 4.4 eluiert wurde, hatte auch
noch Arabinosidase-Aktivität; das Material, das bei Punkt 4.6
eluiert wurde, hatte Glucosidase (Cellobiose)-Aktivität; und
das Material, das bei Punkt 4.7 eluiert wurde, hatte
Xylanase-Aktivität
TABELLE 1
Enzymaktivitäten* für Cytolase und die Fraktionen
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*FPU = Filterpapiereinheiten - setzt 1 mol reduzierende
Zucker von 50 mg Whatman Nr. 1 Filterpapier in 1 min
bei 50ºC bei pH 4,8 in einem Reaktionsvolumen von 2
ml frei.
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CMC = Carboxymethylcellulose-Einheiten - setzt 1 uM
reduzierende Zucker aus 10 mg Carboxymethylcellulose
in einer Minute bei 50ºC bei pH 4,8 in einem
Reaktionsvolumen von 20 ml frei.
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Cellobiase-Einheit - setzt 1 nmol Glucose pro Sekunde aus
1,8 umol 4-Nitrophenyl-β-Glucopyranosid bei 50ºC bei
pH 4,8 in einem Reaktionsvolumen von 2 ml frei.
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Xylanase-Einheit - setzt ein 1 uM reduzierende Zucker aus
10 mg Xylan in 1 min bei 50,0 bei pH 4,2 in einem
Reaktionsvolumen von 2 ml frei.
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Arabinosidase-Einheit - setzt 1 nmol p-Nitrophenol pro
Sekunde aus 3,6 uM p-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid
bei 50ºC bei pH 4,0 in einem Reaktionsvolumen von
2 ml frei.
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xylosidase-Einheit - setzt 1 nmol p-Nitrophenol pro Sekunde
aus 3,6 umol p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranosid bei 40ºC
bei pH 5 in einem Reaktionsvolumen von 2 ml frei.
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Esterase-Einheit - setzt 1 nmol p-Nitrophenol pro Sekunde aus
1,8 umol p-Nitrophenylacetat bei 50ºC bei pH 4,8 in
einem Reaktionsvolumen von 2 mm frei.
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** CBHI ist Cellobiohydrolase I, CBHII ist
Cellobiohydrolase II und EGI ist Endoglucanase I, wie
sie mit Antiseren identifiziert werden.
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Die Fraktionen A, B, C und D wurden hinsichtlich
ihrer entsprechenden Konzentration in der
Originalcytolase untersucht.
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BEISPIEL 2: Wirkung von Enzym-Fraktionen, die aus
Cytolase-123 hergestellt werden, auf die Faserstruktur und die
chemische Zusammensetzung von Silage
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Tetraploides Roggengras (Düngung 120 kg N/Hektar) wurde von
Hand unter Anwendung keimfreier Techniken geschnitten und
kalt transportiert; das Experiment wurde innerhalb von 5 h
nach dem Schneiden begonnen. Der Trockenmassegehalt betrug
13 Gew.-%. Das Gras wurde mit Scheren in 1 cm Stücke
geschnitten und in Plastikbeutel gegeben, die jeweils 80 g
frisches Gras enthielten. Replikate Proben wurden mit allen
Kombinatiönen der Cytolase-123-Fraktionen A, B, C und D
behandelt. Nach der Enzym-Behandlung wurde das Gras als 25 g-
Aliquots in 160 ml Serumflaschen gepackt, mit anaeroben Gas
5 min gespült und die Flaschen mit Butylkautschukstopfen
verschlossen. Die Flaschen wurde 6 Wochen bei 30ºC inkubiert
und dann wurde die Neutraldetergens-Faser (NDF) extrahiert:
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75 ml Wasser wurden in die Flaschen mit behandeltem Gras
gegeben, 1 h lang bei Raumtemperatur geschüttelt und durch
ein Glassinter filtriert. Das Filtrat wurde für verschiedene
Analysen verwendet; das Präzipitat wurde weiter extrahiert.
Eine Neutraldetergens-Extraktion des Präzipitats wurde
folgendermaßen durchgeführt: i) das Präzipitat wurde
quantitativ in 100 ml einer Lösung (pH 7), die pro Liter
19,6 g Titriplex III, 3,6 g Na&sub2;B&sub4;O&sub7;, 4,6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 30 g
Natriumdodecylsulfat und 10 ml Ethylenglykolmonoethylether
enthielt, suspendiert und 40 min bei 60ºC gerührt; II) die
Temperatur der Extraktion wurde rasch auf 75ºC erhöht, es
wurde unter Verwendung eines Glassinters heiß filtriert;
iii) das Präzipitat wurde dann mit 100 ml Wasser gewaschen,
indem bei 60ºC 15 min lang geschüttelt wurde, die Temperatur
rasch auf 75ºC erhöht wurde und die Suspension filtriert
wurde; diese Wasserextraktion wurde wiederholt; iv) das
Präzipitat wurde danach mit 100 ml einer Salzlösung
extrahiert, die pro Liter 3,64 g KN03, 1,76 g KCL, 0,17 g
NaNO&sub3;, 1,92 g Ca(NO&sub3;)&sub2; 4H&sub2;O und 1,96 g Mg(NO&sub3;)&sub2;.6H&sub2;O
enthielt; v) als die Temperatur von 60 auf 40ºC gesunken war,
wurde die Suspension filtriert; vi) die Wasserextraktion
(Absatz iii) wurde zweimal wiederholt; vii) das Präzipitat
wurde mit 75 ml Aceton 15 min lang extrahiert und filtriert;
dies wurde 4-mal wiederholt; und viii) die erhaltene NDF
wurde über Nacht in einem Glassinter, der an ein Vakuum
angeschlossen war, getrocknet.
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1. Wirkungen der Enzym-Fraktionen auf die Zusammensetzung von
löslichen Silage-Bestandteilen
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D- und L-Milchsäuren wurden unter Verwendung des
enzymatischen Untersuchungssets von Boehringer, Mannheim GmbH
und nach dem von Hersteller angegebenen Verfahren analysiert.
Ammonium wurde in den alkalisierten Proben unter Verwendung
einer Ammoniak-spezifischen Elektrode analysiert.
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Nach dem Verfahren von Lowry wurde lösliches Protein
analysiert. Lösliche Zucker wurden als Trimethylsilyl-
Derivate durch GLC unter Verwendung einer Kapillarsäule und
eines Temperaturprogramms analysiert. Es wurde ein Verfahren
mit internem Standard, bei dem zwei interne Standards
(Erythrit und Phenyl-B-D-glycopyranosid) eingesetzt wurden,
verwendet.
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Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
TABELLE 2
Wirkungen von Enzym-Fraktionen, einzeln und in verschiedenen
Kombinationen, auf die Zusammensetzung von löslichen Silage-
Bestandteilen
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Die Restzuckerwerte werden in bezug auf die unbehandelte
Kontrolle festgestellt; positive Werte zeigen eine erhöhte
Konzentration und negative Werte eine Verringerung an. Es
wurden Monosaccharide und Disaccharide analysiert und ihre
Summen als Restzuckerwerte dargestellt. Die Restzuckerwerte
können die Gesamtzuckerfreisetzung in dem Silo wegen
möglicher Differenzen bei der Aufnahme und/oder dem Wachstum
der Silage-Mikroorganismen nicht wiedergeben.
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Alle Silagen wurden gut konserviert, hatten einen pH-Wert von
etwa 4 oder weniger und eine hohe Konzentration an
Milchsäure. Hinsichtlich der Form von Milchsäure kann erwähnt
werden, daß die Enzym-Behandlung das Verhältnis der beiden
Lactatformen nicht merklich beeinträchtigte. In allen Fällen
lagen etwa 50 % des Lactats in D-Form vor.
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Die Menge an Restzucker bei Kombination der Fraktionen ABD,
BCD, AD, BC, BD und D ist größer als die bei Kombination
aller Fraktionen ABCD. Die Wahl von Enzymfraktionen hat eine
deutliche Wirkung auf die Restkonzentration an Glucose,
Xylose, Fructose und Arabinose. Die Konzentration jedes der
genannten steht mit den anderen in Beziehung; die Behandlung,
die die höchste Glucose-Konzentration zeigt, liefert auch die
höchsten Konzentrationen für die anderen Zucker usw. Fraktion
D war der wirkungsvollste auftretende Zuckerproduzent bei der
Silage. Fraktion B und die Kombination AB zeigten negative
Werte bei der sichtbaren Zuckerproduktion.
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Die Konzentration an löslichem Protein lag bei allen
Behandlungen zwischen 50 und 60 mg/g Trockengras; die Silage-
Qualität wurde demnach durch die Enzym-Behandlung nicht
verringert. Die Ammonium-Konzentrationen standen entsprechend
nicht mit dem Vorliegen irgendwelcher Enzym-Fraktionen in
Beziehung.
2. Wirkung der Enzym-Fraktionen auf die Faserstruktur
Analyse der NDF-Struktur
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Die erhaltene NDF wurde gewogen und als Prozentanteil der
Trockenmasse des Ausgangsmaterials ausgedrückt.
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Die Empfindlichkeit gegenüber einer enzymatischen Hydrolyse
wurde bestimmt, indem NDF mit einem kompletten
cellulolytischen Enzym-Gemisch Cytolase-123 (50 000 HEC/g)
hydrolysiert wurde. Vor Verwendung wurde die Enzym-
Präparation durch eine Sephadex G-25-GPC-Säule geleitet, um
Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, die
die Bestimmung der reduzierenden Zucker stören könnte. 20 mg
NDF wurde in ein Röhrchen eingewogen und es wurde 9,6 ml
Sörensen Phosphatpuffer, pH 7, zugegeben. Nach einer 15-
stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Enzym
(0,4 ml) zugesetzt und die anfängliche Rate der
Zuckerfreisetzung bestimmt. Nach 0, 1, 2,5 und 5 h wurde eine
1-ml-Probe gezogen. Jede Probe wurde unverzüglich mit 4 ml
Dinitrosalicylsäure (DNS)-Reagens, das zur Analyse
reduzierender Zucker eingesetzt wird, vermischt. Dieses
Reagens unterbricht augenblicklich die enzymatische Reaktion.
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Die Proben wurden dann in einem siedenden Wasserbad 5 min
lang erhitzt, rasch in einem Eisbad abgekühlt und die
Extinktion bei 540 nm gemessen. Die Resultate wurden als Mol
reduzierende Zucker, die pro Stunde pro Gramm NDF freigesetzt
wurden, ausgedrückt.
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Die quantitative Bestimmung der reduzierenden Enden in NDF
wurde mit dem modifizierten DNS-Verfahren durchgeführt. 20 mg
NDF wurden in ein Röhrchen eingewogen, 1 ml Wasser zugesetzt,
das Gemisch für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, 4 ml DNS-
Reagens zugesetzt, das Gemisch in einem siedenen Wasserbad
5 min erhitzt, in einem Eisbad rasch abgekühlt, filtriert und
die Extinktion des Filtrats bei 540 nm gemessen. Die
Resultate wurden als Mol pro Gramm NDF ausgedrückt.
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Die Anzahl der reaktiven Hydroxyl-Gruppen wurde bestimmt,
indem die Anzahl der Acetyl-Gruppen, die in dem folgenden
Acetylierungsverfahren eingebaut wurden, bestimmt wurde.
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Dreifache 20 mg NDF-Proben wurden mit 2 ml Pyridin vermischt.
200 ul ¹&sup4;C-Essigsäureanhydrid (spezifische Aktivität 1,04 x
10&sup9; dpm/mol) wurden zugesetzt; dann wurde das Gemisch in
festverschlossenen Reaktionsröhrchen 30 min bei 70ºC
inkubiert. Das Filtrat wurde entfernt und das Präzipitat
zweimal mit 4 ml frischem Pyridin und dann 4-mal mit Wasser
gewaschen, wobei ein Ultraschallbad verwendet wurde, um das
Auswaschen des nicht kovalent-gebundenen Acetats aus dem
Faserstoff zu intensivieren. Die letzte Waschlösung wurde auf
Reaktivität untersucht; sie überschritt das Untergrundniveau
nicht. Acetylierter Faserstoff wurde mit 2 ml 4 N HCl 5 h bei
90ºC hydrolysiert; schließlich wurde die Radioaktivität des
neutralisierten Filtrats gemessen. Der Einbau von Acetyl-
Gruppen wurde als umol/Gramm NDF ausgedrückt.
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Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Tabelle 3
Wirkungen von Enzym-Fraktionen, einzeln und in verschiedenen
Kombinationen, auf die Faserstruktur
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* Die angegebenen Werte beziehen sich auf den Null-
Kontrollwert.
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TM = Trockenmasse
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Die NDF-Werte nahmen ab, wenn Enzyme bei Silage-Herstellung
verwendet wurden. Die Behandlung mit dem Enzym-Gemisch ABCD
reduzierte NDF von 35 % TM, wie sie bei der nicht-
enzymbehandelten Silage erhalten wurde, auf 18 %. Der NDF-
Abfall war geringer, wenn die Enzym-Fraktion D weggelassen
wurde. Die Enzym-Fraktion D hatte den stärksten Effekt auf
die NDF-Solubilisierung. Wenn D mit anderen Fraktionen
kombiniert wurde, wurde der Faserstoff sehr wirksam
aufgelöst. Die erklärt auch, warum die Anzahl der
reduzierenden Enden sich in Gegenwart von D verringerte. Es
wird angenommen, daß Fraktion D den Faserstoff systematisch
verdaut, wodurch die Masse löslich gemacht wird. Die Anzahl
an freien Enden nahm bis zu einem Level ab, der unter dem
lag, der bei der Kontrolle ohne Enzym-Behandlung festgestellt
wurde. Bei der Solubilisierung von NDF war Fraktion A in
Kombinationen mit den Fraktionen B und C ebenfalls wirksam.
Fraktion A verbesserte auch die Reaktivität stark,
möglicherweise durch Erhöhung der Anzahl reduzierender Enden.
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Es ist wünschenswert, den Faserstoff während einer Silierung
so zu modifizieren, daß es für die Pansenmikroben einfacher
wird, ihn anzugreifen, und daß er in dem monogastrischen
Trakt reaktiver wird. Der anfängliche Angriff im Pansen
erfolgt durch die cellulolytischem Mikroben und ihre Enzyme.
Daher wurde die anfängliche Rate der enzymatischen
Zuckerfreisetzung als Maß für die Empfindlichkeit der NDF-
Fraktionen für diesen Angriff bestimmt. Die Werte werden mit
der Kontrolle ohne Enzym (null) verglichen, wobei positive
Werte einen Anstieg der Verfügbarkeit von Zucker für
Pansenmikroben angeben und negative Werte anzeigen, daß im
Silierungsprozeß zu viel Zucker in Säuren umgewandelt wurde.
Es ist ersichtlich, daß die Enzymfraktion D, allein oder in
Kombinationen, aufgrund der starken
Zuckerfreisetzungswirksamkeit für die Verwendung im
Silierprozeß weniger geeignet ist. Fraktion A hatte eine
stark positive Wirkung auf die anfängliche Rate der
Zuckerproduktion. 95 % der freigesetzten Zucker bestanden aus
Glucose und Cellobiose. Wenn A und D gemeinsam vorlagen, war
Fraktion D die dominierende. Fraktion A, allein oder in
Kombination mit B, C oder BC, verbessert die Verfügbarkeit
von Zucker für die Pansenmikroben und ist für diese Anwendung
günstig.
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Eine Acetylierung der NDF-Fraktionen aus den
Enzymbehandelten Silagen zeigte, daß die Entfernung der
Kohlehydrat-Komponente des Zellwandmaterials die Anzahl der
reaktiven Hydroxyl-Gruppen nicht verringert. Im Gegenteil,
die effizient Kohlenhydrate verdauenden Enzym-Kombinatione
erhöhten den ¹&sup4;C-Acetyl-Einbau in den behandelten Faserstoff.
Die am wirksamsten solubilisierenden Enzym-Kombinationen und
die Cytolase selbst erhöhten daher die Anzahl an freigelegten
Hydroxyl-Gruppen. Die Fraktion D hatte die größte Wirkung auf
die Anzahl der Hydroxyl-Gruppen. Wahrscheinlich waren die
freigelegten Hydroxyl-Gruppen phenolische Lignin-
Substituenten. Fraktion C scheint ein Antagonist zu D zu
sein. Wiederum war die Wirkung von A der der Fraktion D
entgegengesetzt.
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Auf der Basis der vorliegenden Erfindung ist es daher
möglich, den nicht-löslichen Teil einer Silage auf mehreren
Wegen zu modifizieren, indem verschiedene Enzym-Kombinationen
ausgewählt werden. Die bemerkenswertesten Wirkungen werden
durch die Verwendung der Fraktionen A und D, einzeln oder in
Kombinationen, oder, wo geeignet, durch Weglassen dieser
erzielt. Ein Silieren von Futter in Gegenwart der Enzym-
Fraktion D in irgendeiner Kombination produziert eine
unlösliche Fraktion, die durch das verwendete Enzym-Gemisch
nicht weiter enzymatisch hydrolysiert werden kann. Fraktion A
hat die entgegengesetzte Wirkung; die Silage, die mit A, aber
ohne D hergestellt wurde, ist ganz klar gegenüber einer
weiteren enzymatischen Hydrolyse empfindlicher als die nicht
mit Enzym behandelte Kontrolle. Obgleich nicht alle
Fraktionen und Fraktionskombinationen im Detail diskutiert
wurden, ist es klar, daß alle möglichen
Fraktionskombinationen in den Schutzumfang der vorliegenden
Erfindung fallen.
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In einem anschließenden Experiment mit Mais-Silage
produzierten die Fraktionen A und D eine merkliche
Reduzierung des NDF, wohingegen AD und ABCD keine bedeutende
Wirkung hatten. Allerdings produzierten nur Fraktion D und
ABCD eine bedeutende Reduzierung des ADF.
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In einer α,α-Silage, die Klee und Timothy enthielt, wurden
die folgenden NDF- und ADF-Werte unter Verwendung der
identifizierten Fraktionen erhalten:
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Nur der NDF-Wert für Fraktion B war nicht bedeutend.
Allerdings hatte nur D, BC und BCD eine signifikante Wirkung
auf ADF.
BEISPIEL 3
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Es wird angenommen, daß Zusammensetzungen entsprechend den
Kominationen ABC, ACD, AC und ABD, wie auch weitere
Kombinationen durch genetische Manipulation der Cellulase-
Quelle hergestellt werden können. Beispielsweise können das
Gen, das für Cellobiohydrolase 1, Cellobiohydrolase II,
Endoglucanase I kodiert, und Kombinationen der Gene, die für
diese Enzyme kodieren, aus einer Trichoderma-Spezies gelöscht
werden. Es wird erwartet, daß die Cellulase, die aus einer
Spezies, der ein Gen fehlt, isoliert wird, auf Feldfrüchte
eine Wirkung haben wird, die der der entsprechenden
Kombinationen von Cellulase-Materialfraktionen aus einer
Anionen-Austauschersäule entspricht.
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Es wird auch angenommen, daß Kombinationen von gereinigten
oder angereichterten Enzymen, die in Cellulose-Material
vorliegen, auf Feldfrüchte auch eine Wirkung haben, die der
der entsprechenden Kombinationen von Cellulase-Material, das
an einer lonen-Austauschersäule fraktioniert wurde,
entspricht.