DE69233643T2 - Verwendung von Antizytokin-enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Therapie von multipler Sklerose - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Bindeproteins, welches hierin mit TBP bezeichnet wird, für die Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von multipler Sklerose.
• Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) ist ein multifunktionelles Cytokin, welches zum Schutz des Organismus beiträgt, bei verstärkter Produktion jedoch bei einigen Erkrankungen eine wesentliche pathogene Rolle spielen kann. Es ist bekannt, dass TNF an entzündlichen Prozessen beteiligt ist und ein Vermittler bei den Gewebeschädigungen rheumatischer Erkrankungen (Beutler, B. und Cerami, C. (1987) NEJM 316:379–385) und den Schädigungen, welche bei Transplantat-Wirt-Reaktionen auftreten (Piguet, P.F. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1280–89), ist.
• Zwei TNF-Bindeproteine, welche als TBP-I und TBP-II bezeichnet werden, wurden erstmals in den israelischen Patentanmeldungen Nr. 83878 bzw. 90339 oder den entsprechenden europäischen Patentanmeldungen EP-A 308 378 und 398 327 des gleichen Anmelders beschrieben, und es wurde gezeigt, dass sie Zellen vor TNF-Toxizität schützen und dass sie mit der Bindung von TNF an Zellen interferieren. Spätere Studien haben gezeigt, dass diese beiden Proteine strukturell mit zwei molekularen Arten der Zelloberflächen-TNF-Rezeptoren (TNF-R) verwandt sind und dass TBP-I tatsächlich mit einer löslichen Form des TNF-Typ I-Rezeptors verwandt ist, während TBP-II mit einer löslichen Form des TNF-Typ II-Rezeptors verwandt ist (Engelmann, H. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:11974–11980; Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1531–1536). Wie die Zelloberflächen-Rezeptoren für TNF können die löslichen Formen dieser Rezeptoren TNF spezifisch binden und damit seiner Bindung an Zellen entgegenwirken, wobei sie als physiologische Inhibitoren der TNF-Aktivität wirken.
• Obwohl die primäre Funktion des Immunsystems der Schutz eines Individuums gegen Infektion durch fremde Eindringlinge wie Mikroorganismen ist, kann es vorkommen, dass das Immunsystem eigene Gewebe des Individuums angreift, was zu pathologischen Zuständen führt, welche als Autoimmunerkrankungen bekannt sind, die häufig mit entzündlichen Prozessen assoziiert sind. Beispiele für Autoimmunerkrankungen sind rheumatoide Arthritis, juveniler Typ I-Diabetes mellitus, systemischer Lupus erythematodes, Thyreoiditis und multiple Sklerose. Rheumatoide Arthritis ist eine Erkrankung, welche durch Zeichen und Symptome der Entzündung von Gelenken gekennzeichnet ist. Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist im fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung durch rote, schuppige Flecken auf der Haut und durch Funktionsstörungen der Nieren charakterisiert und ist an entzündlichen Reaktionen beteiligt, welche durch Ablagerung von Immunkomplexen in Blutgefäßen, insbesondere in den Nieren ausgelöst werden. Multiple Sklerose ist eine menschliche Erkrankung, welche durch rezidivierende, entzündliche Zustände, die Schwäche verursachen können, durch Körperzittern und in extremen Fällen durch das Auftreten von Lähmungserscheinungen charakterisiert ist, und ist mit dem Angriff des Immunsystems auf die schützende Myelinscheide, welche die peripheren Nervenzellen umhüllt, assoziiert. TNF wurde mit entzündlichen Prozessen bei systemischem Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und multipler Sklerose in Verbindung gebracht.
• In den veröffentlichten europäischen Patentanmeldungen Nr. 398327 und 412486 des gleichen Anmelders ist offenbart, dass die Serummengen von sowohl TBP-I als auch TBP-II in SLE-Patienten in Bezug zur Erkrankungsaktivität signifikant erhöht sind, was bedeutet, das TBP-I und TBP-II als sensitive Marker der Erkrankungsaktivität verwendet werden können und für die Darstellung der Aktivierung des Immunsystems in Bezug auf die Erkrankungsaktivität in SLE-Patienten wie in Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen verwendet werden können.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, dass Tumor-Nekrose-Faktor-Bindeproteine für die Behandlung von multipler Sklerose verwendet werden können. Man geht davon aus, dass die TBPs die physiologische Aktivität der endogenen löslichen TNF-Rezeptoren, Typ I und Typ II, deren Bildung bei Autoimmunerkrankungen wie multipler Sklerose einen Sicherheitsmechanismus gegen die Überreaktion auf die schädigenden Wirkungen von TNF darstellen soll, komplementieren.
• Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Tumor-Nekrose-Faktor-Bindeproteins, hierin als TBP bezeichnet, eines Salzes, eines funktionellen Derivats, eines Vorläufers oder eines aktiven Teils davon oder Kombinationen der vorgenannten für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von multipler Sklerose bereit.
• Die TBPs, welche für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden, können aus natürlichen Quellen erhalten werden, wie menschlichem Urin (Engelmann, H. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:11974–11980; Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1531–1536; Olson, I. et al. (1989) Eur. J. Haematol. 42:270–275; Seckinger, P. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:11966–11973) oder durch rekombinante Verfahren (Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J. 9:3269–3278; Schall, T.J. et al. (1990) Cell 61:361–370; Loetscher, H. et al. (1990) Cell 61:351–359) und dann, wie in den vorstehend erwähnten israelischen Patentanmeldungen mit den Nr. 83878 und 90339 beschrieben, weiter aufgereinigt werden.
• Die Begriffe "TBPs", "TBP-I" und "TBP-II", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf alle TNF-Bindeproteine aus natürlichen Quellen oder durch rekombinante DNA-Techniken erhalten, einschließlich der TNF-Bindeproteine I und II, die in den israelischen Patentanmeldungen 83878 und 90339 beschrieben sind, (aber nicht auf diese beschränkt), sowie der löslichen Formen der Zelloberflächen-TNF-Rezeptor-Typen I und II und Salze, funktionellen Derivate, Vorläufer und aktiven Teile der vorgenannten, wobei diese letzten Bezeichnungen definiert sind wie in den israelischen Patentanmeldungen 83878 und 90339.
• Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bedeutet, dass jeder Träger beinhaltet ist, der nicht mit der Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Bestandteils interferiert und welcher für den Wirt, welchem er verabreicht wird, nicht toxisch ist. Für die parenterale Verabreichung zum Beispiel kann das TBP in einer Einheitsdosierungsform zur Injektion in Trägern wie Kochsalzlösung, Dextroselösung, normalem Serumalbumin und Ringerlösung formuliert sein. Jede Art parenterale Verabreichung kann geeignet sein, einschließlich intravenöse, intramuskuläre und subkutane Verabreichung. Die lokale Verabreichung kann jedoch bevorzugt werden, wenn eine lokale Entzündung behandelt werden soll, z.B. lokale Injektion zur Behandlung von Gelenkentzündungen bei rheumatoider Arthritis oder Injektion in die cerebrospinale Flüssigkeit bei multipler Skerose. Neben dem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung auch kleinere Mengen von Zusätzen wie Stabilisatoren, Excipienten, Puffer und Konservierungsmittel.
• Der Begriff "wirksame Menge" bezieht sich auf die Menge TBP, die ausreichend ist, um den Verlauf und den Schweregrad der Autoimmunerkrankung zu beeinflussen und den Zustand des Patienten zu verbessern, wobei eine Verminderung oder Remission der Erkrankung erreicht wird. Die wirksame Menge hängt von der Verabreichungsart, der zu behandelnden Erkrankung und der Verfassung des Patienten ab. Die Bestimmung der Mengen an TBP-I und TBP-II im Serum oder anderen geeigneten Körperflüssigkeiten des Patienten können dabei helfen, eine geeignete Dosis für den jeweiligen Patienten festzusetzen, wenn man berücksichtigt, dass das exogen verabreichte TBP das endogen gebildete TBP bei der Neutralisierung der schädigenden Aktivität von TNF komplementieren kann.
• Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. In einigen der Beispiele werden Tiermodelle experimenteller Autoimmunerkrankungen verwendet (Cohen, I.R. (1985) J. Invest. Dermatol. 85:34s–38s).
• Referenzbeispiel 1: Behandlung Adjuvant-Arthritis bei Ratten
• Adjuvant-Arthritis ist eine experimentelle Krankheit, die gekennzeichnet ist durch chronische Entzündungen der Gelenke, in bestimmten Rattenstämmen durch Impfung mit komplettem Freundschen Adjuvans oder mit Mycobacterium tuberculosis-Fraktionen induziert werden kann und als Modell für die rheumatoide Arthritis beim Menschen betrachtet wird (Pearson, C.M. (1964) Arthritits Rheum. 7:80–86). Die Krankheit tritt etwa 11–12 Tage nach der Impfung auf und ist durch mononucleare Zellinfiltration der Synovia, vor allem in den kleinen Gelenken der Extremitäten, mit Pannusbildung gekennzeichnet. Dies ist ein Prozess, dessen Verlauf sich über Monate erstrecken und zu Zerstörung von Knochen sowie Gelenkankylose führen kann. Lewis-Ratten werden zur Induktion der Adjuvant-Arthritis mit M. tuberculosis (1 mg) in Öl geimpft (Pearson, C.M. (1956) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 91:95–101). Nach einigen Tagen, vor oder nach dem Auftreten eindeutiger klinischer Symptome der Arthritis, werden die Ratten einmalig oder über mehrere Tage täglich mit verschiedenen Dosen TBP-I oder TBP-II subkutan geimpft und anschließend nach der Entwicklung der Arthritis anhand einer Skala von 0–16, wie beschrieben (Holoshitz, Y. et al., (1983) Science, 219:56–58), bewertet. Dosen, die das Auftreten der Krankheit verhindern oder eine teilweise Eindämmung der Krankheit hervorrufen, sind wirksame Dosen. Optimale Dosen sind Dosen, die nach dem Ausbruch der Krankheit verabreicht werden und das Fortschreiten der Krankheit verhindern sowie eine dauerhafte Remission der Krankheit bewirken. Für Humanpatienten geeignete Dosen können von diesen Dosen ausgehend errechnet werden.
• Referenzbeispiel 2: Behandlung experimenteller Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE) bei Ratten
• Experimentelle Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE) ist eine experimentelle Krankheit, die bei verschiedenen Spezies wie z.B. Ratten, Meerschweinchen, Mäusen, Kaninchen usw. durch Impfung mit weißer Hirn- und Rückenmarksubstanz aus dem Zentralnervensystem oder mit dem basischen Myelinprotein oder einem Fragment davon induzierbar ist. EAE wird als Modell der multiplen Sklerose betrachtet und ist, wie diese neurologische Humankrankheit, eine Autoimmunerkrankung, bei der das Immunsystem die schützende Myelinscheide, die die peripheren Nervenzellen umgibt, angreift. Die Krankheit ist klinisch durch akute Paralyse und histologisch durch mononucleäre Zellinfiltrate in der Umgebung der Blutgefäße in der weißen Hirn- und Rückenmarksubstanz des Zentralnervensystems gekennzeichnet (Cohen, I.R., s.o.). Ratten wird Meerschweinchen-BP oder das Encephalitis auslösende BP-Hauptfragment (Aminosäuren 68–88) in einem geeigneten Adjuvans wie z.B. komplettes Freundschem Adjuvans injiziert, um EAE zu induzieren. Einen Tag vor der Inokulation und täglich über einen Zeitraum von zehn Tagen erhalten die Ratten entweder Kochsalzlösung (Kontrolle) oder unterschiedliche Dosen TBP-I oder TBP-II. Die Ratten werden im Hinblick auf Entwicklung von Paralyse beobachtet. Dosen, die die Schwere der Krankheit eindämmen, werden als wirksame Dosen betrachtet.
• Referenzbeispiel 3: Korrelation zwischen Serummengen von TBP-I und TBP-II und anti-dsDNA-Antikörpern in SLE-Patienten
• Die Mengen an TBP-I und TBP-II wurden in den Seren von 38 SLE-Patienten und 140 gesunden Kontrollen mit dem ELISA-Verfahren, welches in den veröffentlichten europäischen Patentanmeldungen Nr. 398327 und 412486 beschrieben ist, bestimmt. Die Serum-Konzentrationen (Durchschnitt ± Standardabweichung; "standard deviation", SD) von TBP-I und TBP-II in der Kontrollgruppe waren 0,77 ± 0,19 ng/ml bzw. 3,02 ± 0,57 ng/ml. Diese Werte waren unabhängig von Alter und Geschlecht. In den SLE-Patienten wurden signifikant höhere Konzentrationen an TBP-I und TBP-II beobachtet. Die durchschnittlichen Konzentrationen + SD waren für TBP-I 1,89 ± 0,89 ng/ml und für TBP-II 7,25 ± 3,89 ng/ml.
• Die Ergebnisse wurden mit den Mengen anti-dsDNA-Antikörper verglichen, ein Parameter, der als geeigneter und sensitiver Indikator von SLE-Erkrankungsaktivität angesehen wird. Eine genaue Überprüfung des Ausmaßes der Korrelation der TBP mit den anti-dsDNA-Antikörpern in einzelnen Patienten ergab, wie in Tabelle 1 gezeigt, drei unterschiedliche Untergruppen von Patienten:
• Gruppe 1 – Patienten mit normalen Mengen anti-dsDNA-Antikörper und normalen Konzentrationen von TBP-I (9 Patienten) oder TBP-II (11 Patienten).
• Gruppe 2 – Patienten mit normalen Mengen anti-dsDNA-Antikörper, aber erhöhten Konzentrationen von TBP-I (18 Patienten) oder TBP-II (16 Patienten).
• Gruppe 3 – Patienten mit Erhöhung aller drei Parameter (11 Patienten).
• Obwohl die Gruppen 2 und 3 beide erhöhte Mengen TBP zeigten, unterschieden sie sich nicht nur durch den Grad des Anstiegs an Antikörpern gegen dsDNA signifikant, sondern auch in anderen Parametern der Erkrankungsaktivität (Tabelle I). Verglichen mit Gruppe 2 hatte Gruppe 3 einen höheren durchschnittlichen Krankheitsindex (1,7 ± 0,6 vs 2,4 ± 0,8, p < 0,02), niedrigere Komplement-C4-Mengen (9,4 ± 4 vs 30 ± 13 mg/dl, p < 0,001) und eine höhere durchschnittliche Prednisonaufnahme (20,7 ± 17,7 vs 9 ± 9 mg/Tag, p < 0,05).
• Die verstärkte Bildung von TBP-I und TBP-II, welche den löslichen TNF-Rezeptoren Typ I bzw. Typ II entsprechen, können einen antagonistischen Mechanismus des Organismus darstellen, um die schädigende Wirkung des TNF bei den Autoimmunerkrankungen zu antagonisieren. Der Nachweis einer Untergruppe von SLE-Patienten in dieser Studie, in welcher eine signifikante Erhöhung der TBPs, jedoch nur ein geringer Anstieg der Erkrankungsaktivität auftritt, stimmt mit der Feststellung überein, dass die TBPs das Fortschreiten dieser Erkrankung verhindern können, und ist ein Hinweis, dass die TBPs als therapeutische Wirkstoffe bei SLE verwendet werden können.
• Referenzbeispiel 4: Bioaktivität von TBPs in den Seren von SLE-Patienten – Hemmung der TNF-Cytotoxizität
• Um die Bioaktivität der Serum-TBPs zu bestimmen, wurden die Serumproben in einem TNF-Cytotoxizitätstest überprüft. Die zellzerstörende Aktivität von TNF wurde anhand von murinen A9-Zellen als Zelle bestimmt. Die Zellen wurden auf Mikroplatten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Überstände dekantiert. Die Zellen wurden auf Eis gestellt und rhuTNF (5 Einheiten pro ml, 6 × 10⁷ Einheiten/mg Protein) wurde alleine oder zusammen mit Serumproben mit oder ohne hinzugefügte Antikörper gegen die TBPs (beschrieben in den veröffentlichten europäischen Patentanmeldungen 398327 und 412486) oder mit Proben gereinigter TBPs, welche aus menschlichem Urin isoliert worden waren, angewendet. Nach zusätzlicher Inkubation auf Eis für 90 Minuten wurden die Proben dekantiert und die Platten zweimal mit kaltem Medium bei 4°C gewaschen. Danach folgte die Zugabe von Dulbecco's Modified Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM), welches 10% fetales Kälberserum und 25 mg/ml Cycloheximid enthielt. 12 Stunden später wurde mit dem Neutral-Rot-Aufnahmetest die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt.
• Mit dem vorstehenden Test wurden die Serumproben der SLE-Patienten getestet und es konnte gezeigt werden, dass sie in der Lage sind, die A9-Zellen vor der zellschädigenden Wirkung von TNF zu schützen. Der Grad an Hemmung korrelierte mit demjenigen, der beobachtet werden konnte, nachdem gereinigte TBPs aus Urin in Mengen verabreicht wurden, welche mit denen identisch waren, die in den Seren vorhanden waren. Kaninchen-Antiseren gegen die TBPs, welche selbst keine Wirkung im A9-Cytotoxizitätstest zeigen, blockierten die hemmende Wirkung der menschlichen Seren in diesem Test und bestätigten damit die Schlussfolgerung, dass die beobachtete Hemmung der TNF-Bioaktivität allein auf die Bioaktivität der TBPs, welche in den Seren anwesend waren, zurückzuführen war. Das bedeutet, dass die TBPs zur Neutralisation der Bioaktivität von TNF in vivo wirksam sein können, wobei sie fähig sind, Patienten vor Schädigungen, welche durch TNF bei Autoimmunerkrankungen verursacht werden, zu schützen.
• Tabelle I

  

Claims (6)

1. Verwendung eines Tumornekrosefaktor-Bindungsproteins (TBP), eines Salzes, eines funktionellen Derivats, eines Vorläufers oder eines aktiven Teils davon, oder Kombinationen der vorgenannten, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Multipler Sklerose.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das TBP TBP-I, TBP-II oder Kombinationen davon ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das TBP natürliches TBP-I ist.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das TBP rekombinantes TBP-I ist.
5. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das TBP natürliches TBP-II ist.
6. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das TBP rekombinantes TBP-II ist.