DE69233074T2

DE69233074T2 - Verfahren zur Herstellung von 1-alpha-24-dihydroxy-Vitamin D2

Info

Publication number: DE69233074T2
Application number: DE69233074T
Authority: DE
Inventors: Charles W. Bishop; Glenville Kingston Jones; Joyce C. Knutson; Robert M. Moriarty; Raju Penmasta; Stephen Strugnell
Original assignee: Bone Care International Inc
Current assignee: Bone Care International Inc
Priority date: 1991-01-08
Filing date: 1992-01-07
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2012-01-08
Also published as: CN1071574C; CN1078072C; PT99998B; DK0550702T3; AU1247592A; ATE240736T1; EP0550702B1; PT99998A; WO1992012165A1; CN1032256C; EP0550702A1; DE69229103D1; ES2200238T3; EP0914825A2; DE69233074D1; US6211168B1; DE69229103T2; MX9200070A; EP0914825B1; CN1133712A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung des hormonell aktiven, natürlichen Metaboliten 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ sowie auf Zwischenprodukte, die im Zuge dieser Herstellung erzeugt werden. Die Erfindung bezieht sich weiters auf ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine pharmazeutisch wirksame Menge an 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ enthält.
Vitamin D und seine aktiven Metaboliten sind bekannterweise wichtig für die Regulierung des Calciumstoffwechsels bei Tieren und Menschen. Die natürliche, bei Tieren und Menschen vorkommende Form von Vitamin D ist Vitamin D₃. Es ist herausgefunden worden, dass Vitamin D₃ sowohl beim Tieren als auch bei Menschen dadurch aktiviert wird, dass es an der C₂₅-Position in der Leber hydroxyliert wird und darauf eine 1α-Hydroxylierung in der Niere folgt, um das Hormon 1α,25-Dihydroxy-Vitamin D₃ ["1,25-(OH)₂D₃"] zu bilden (siehe US-A-3.880.894). Der wichtigste physiologische Weg zum Verlust von Vitamin-D₃-Metaboliten, 25-Dihydroxy-Vitamin D₃ und 1,25-(OH)₂D₃ wird durch C₂₄-Oxidation ausgelöst.
Holick, M. F., Kleiner-Bossallier, A., Schnoes, H. K., Kasten, P. M., Boyle, I. T. und DeLuca, H. F., J. Biol. Chem. 248, 6691–6696 (1973).
Vitamin D₂ ist die wichtigste, natürlich vorkommende Form von Vitamin D, die in Pflanzen gefunden werden kann. Vitamin D₂ unterscheidet sich in seiner Struktur von Vitamin D₃ insofern, dass Vitamin D₂ an der C₂₄-Position eine Methyl-Gruppe und eine Doppelbindung zwischen C₂₂ und C₂₃ aufweist.
Kurz nach ihrer Entdeckung schien es offensichtlich, dass Vitamin D₃ und Vitamin D₂ eine ähnliche, wenn auch nicht äquivalente, biologische Aktivität besaßen. Weiters wurde allgemein geglaubt, dass der Stoffwechsel (d. h. die Aktivierung und der Abbau) von Vitamin D₂ derselbe war wie für Vitamin D₃ (siehe Harrison's Principles of Internal Medicine: Part Seven, „Disorders of Bone and Mineral Metabolism: Chap. 35", in E. Braunwald, K. J. Isselbacher, R. G. Petersdorf, J. D. Wilson, J. B. Martin und H. S. Fauci (Hrsg.), Calcium, Phosphorous and Bone Metabolism: Calcium Regulating Hormones, 1860–1865, McGraw-Rill, New York. In dieser Hinsicht wird die aktive Form von Vitamin D₂ ["1,25-(OH)₂D₂"] als 1α,24,25-Trihydroxy-Vitamin D₂ angenommen. Darüber hinaus sind 24-Hydroxy-Derivate von 25-Hydroxy-Vitamin D₂ und 1,25-(OH)₂D₂, das sind 24,25-Dihydroxy-Vitamin D₂ und 1α,24,25-Trihydroxy-Vitamin D₂, bekannt. Was nahe legt, dass der Abbau von Vitamin D₂ über denselben C₂₄-Oxidationsschritt wie Vitamin D₃ erfolgt. Jones, G., Rosenthal, D., Segev, D., Mazur, Y., Frolow, F., Halfon, Y., Robinavich, D. und Shakked, Z., Biochemistry 18, 1094–1101 (1979).
Vor kurzem wurde herausgefunden, dass ein aktives Analog von Vitamin D₂, 1 α-Hydroxy-Vitamin D₂ ["1α-(OH)D₂"], jedoch pharmakologische Eigenschaften aufweist, die sich deutlich von denen seines Gegenstücks Vitamin D₃ ["1α-(OH)D₃"] unterscheiden. Die EP-A-0.381.750 offenbart, dass 1α-(OH)D₂ Knochenschwund bei menschlichen Osteoporose-Patienten umkehrt, wenn es in Dosierungen von 2,0 μg/Tag oder mehr verabreicht wird. Aufgrund seiner Toxizität können Dosierungen von 2,0 μg/Tag oder mehr mit 1α-(OH)D₃ nicht sicher beibehalten werden.
Solche ausgeprägte pharmakologische Eigenschaften können durch die Entdeckung der Erfinder, dass pharmakologische, dem Menschen verabreichte Dosen von 1α-(OH)D₂ zum Teil zu biologisch aktivem 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ ["1α,24-(OH)₂D₂"] metabolisiert werden, erklärt werden. Wie untenstehend detaillierter beschrieben werden wird, stellt die Hydroxylierung des 1-hydroxylierten Vitamin-D₂-Moleküls an der C₂₄-Position einen Aktivierungsweg dar, der für das Vitamin-D₂-Molekül eigen ist.
Obwohl 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₃ ["1α,24-(OH)₂D₃"] chemisch synthetisiert wurde (US-A-4.022.891), ist nicht bewiesen worden, dass es eine natürliche Verbindung in biologischen Systemen ist. Die Erfinder haben zudem herausgefunden, dass sich die biolo gische Aktivität von 1α,24-(OH)₂D₂ deutlich von der für 1α,24-(OH)₂D₃ gezeigten unterscheidet. Ishizuka et al., haben beispielsweise festgestellt, dass 1α,24-(OH)₂D₃ die 1,25-(OH)₂D₃-Rezeptorstelle stärker bindet als 1,25-(OH)₂D₃ selbst (Ishizuka, S., Bannai, K., Naruchi, T. und Hashimoto, Y., Steroids 37(1), 33–42 (1981); Ishizuka, S., Bannai, K., Naruchi, T. und Hashimoto, Y., Steroids 39(1), 53–62 (1982)). Mit einem ähnlichen Versuch haben die Erfinder herausgefunden, dass das 1,25-(OH)₂D₃ doppelt so kompetitiv bei der Bindung der 1,25–(OH)₂D₃-Rezeptorstelle ist wie 1α,24-(OH)₂D₂. Die Erfinder haben zudem festgestellt, dass 1α,24-(OH)₂D₂ relativ schlechte Bindungsaffinität gegenüber dem Vitamin-D-Serum-Bindungsprotein im Blut aufweisen, was auf eine relativ kurze Nalbwärtszeit schließen lässt, was wiederum ein Anzeichen für niedrige Toxizität ist.
Die Erfinder haben gezeigt, dass bei Menschen, denen 1α-(OH)D₂ verabreicht worden war, zirkulierendes 1α,24-(OH)₂D₂ vorhanden war. Dies weist darauf hin, dass Vitamin D₂ bei Tieren und Menschen natürlich zu 1,25-(OH)₂D₂ sowie 1α,24-(OH)₂D₂ metabolisiert wird. Die relativen Verhältnisse der beiden Vitamin-D₂-Hormone scheinen je nach Vorläufer und Menge des Vorläufers, die dem C₂₄-Weg zugeführt wird, zu variieren. Daher kommt es bei erhöhten Dosen von 1α-(OH)D₂ zu einem höheren Verhältnis von 1α,24-(OH)₂D₂ zu 1,25-(OH)₂D₂.
Diese Ergebnisse, die untenstehend detaillierter erläutert werden, weisen darauf hin, dass 1α,24-(OH)₂D₂ die gewünschte Eigenschaft, hohe biologische Aktivität bei geringer Toxizität, besitzt. Die Tatsache, dass 1α,24-(OH)₂D₂ ein signifikanter Metabolit ist, wenn pharmakologische Mengen an 1α-(OH)D₂ verabreicht werden, lässt darauf schließen, dass 1α,24-(OH)₂D₂ die gewünschte pharmakologische Wirkung von 1α-(OH)D₂ mediiert und ein nützliches therapeutisches Arzneimittel zur Behandlung von unterschiedlichen Arten von mit dem Calciumstoffwechsel in Verbindung stehenden Erkrankungen ist.
Die Erfindung stellt ein Syntheseverfahren zur Herstellung von 1 α,24-(OH)₂D₂ bereit, welches eine bioaktive Form von Vitamin D₂ ist. Das Hormon kann auch als 1α,24-Dihydroxyergocalciferol bezeichnet werden und wird durch die hierin untenstehend angeführte Struktur wiedergegeben. Die Verbindung besitzt starke biologische Aktivität und eine kurze systemische Clearance, was auf geringe Toxizität hinweist.
Zusammenfassend gesagt umfasst das Verfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ die Verwendung von Ergosterol als Ausgangsmaterial, die Bildung von 24-Hydroxy-Vitamin D₂ und anschließend die 1α-Hydroxylierung der 24-Hydroxy-Verbindung. Im Zuge dieser Synthese werden auch neuartige Zwischenprodukte hergestellt.
Die durch das Verfahren der Erfindung erhältliche Verbindung ist für die Behandlung von zahlreichen Erkrankungen nützlich, die durch Vitamin-D-Mangel gekennzeichnet sind, sowie verschiedener Knochenschwunderkrankungen, insbesondere für eine Behandlung ohne die Begleiterscheinungen von Hypercalcämie oder Hypercalcurie. Die durch das Verfahren der Erfindung erhältlichen Verbindungen können vorteilhaft als aktive Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen für Vitamin-D-Mangelerkrankungen verwendet werden, um Knochenschwund oder Abnahme des Knochenmineralstoffgehalts bei Personen, die prädisponiert sind, einen solchen Schwund auszubilden, gegenzusteuern oder zu verhindern und um die Knochendichte bei Personen, die an renaler Osteodystrophie leiden, zu stabilisieren.
Die durch das Verfahren der Erfindung erhältliche Verbindung kann weiters für topische Wirkstoffe zur Behandlung von gewissen Hauterkrankungen von Nutzen sein. Die Verbindung kann vorteilhaft als aktiver Bestandteil für topische Zusammensetzungen eingesetzt werden, die auch andere Wirkstoffe umfassen können, die sich zur Linderung von Hauterkrankungen eignen.
Weitere Vorteile sowie ein umfassenderes Verständnis der spezifischen Adaptionen, der Variationen in der Zusammensetzung und der physikalischen und chemischen Eigen schaften gemäß vorliegender Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen.
Die vorliegende Erfindung wird hierin nachstehend in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen beschrieben, worin ähnliche Bezeichnungen auf ähnliche Elemente verweisen und worin:
1 präparative Stufen bei der Synthese von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ darstellt; und
2 präparative Stufen bei der Synthese von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ darstellt, wobei 24-Hydroxy-Vitamin D₂ den Ausgangspunkt bildet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Syntheseverfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ [1α,24-(OH)₂-D₂] bereit.
Die hierin verwendeten Begriffe „biologische Aktivität", „biologisch aktiv", „bioaktiv" oder „biopotent" sind so zu verstehen, dass sie biochemische Eigenschaften von Verbindungen wie etwa das Beeinflussen des Stoffwechsels, z. B. die Serum-Calcium-Konzentration beeinflussend, oder die Bindung an ein geeignetes Rezeptorprotein, z. B. an ein Vitamin-D-Rezeptorprotein bindend, bezeichnen.
Die Erfindung umfasst die Herstellung einer Verbindung der Formel (1).
Ein Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zu Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ vor, Folgendes umfassend:

(a) Acetylierung von Ergosterol, um dessen 3β-Acetat zu bilden;
(b) Umsetzung mit einem Triazolindion und Ozonisieren, um 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat zu bilden;
(c) Addition von 3-Methylbutan-2-on an 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat, um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat zu bilden;
(d) Addition von Methylmagnesiumbromid an (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat, um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol zu bilden;
(e) Reduktion von(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol, um 24-Hydroxyergosterol zu bilden;
(g) Bestrahlung von 24-Hydroxyergosterol, um 24-Hydroxyvitamin D₂ zu bilden;
(h) Tosylierung von 24-Hydroxyvitamin D₂ in Gegenwart von trockenem Pyridin, um 24-Hydroxy-Vitamin D₂-3β-tosylat zu bilden;
(i) Solvolyse von 24-Hydroxyvitamin D₂-tosylat, um 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ zu bilden;
(j) allylische Oxidation von 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ mit Selendioxid, um 1α,24-Dihydroxycyclovitamin D₂ zu bilden; und
(k) Hydrolyse des 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamins D₂ mit einem Gemisch aus

Dimethylsulfoxid und einer organischen Säure, um ein Gemisch aus 5,6-cis-la-Hydroxy- und dem 5,6-trans-1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ zu bilden und ein Diels-Alder-Addukt von 5,6-trans-1α-Hydroxyvitamin D₂ zu bilden, um durch Reinigung 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ zu erhalten.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zur Herstellung von 24-Hydroxy-Vitamin D₂ vor, Folgendes umfassend:

(a) Acetylierung von Ergosterol, um dessen 3β-Acetat zu bilden;
(b) Umsetzung mit Triazolindion und Ozonisieren, um 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat zu bilden;
s(c) Addition von 3-Methylbutan-2-on an 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat, um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat zu bilden
(d) Addition von Methylmagnesiumbromid an (22E)-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo)-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat, um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol zu bilden;
(e) Reduktion von (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol, um 24-Hydroxyergosterol zu bilden; und
(g) Bestrahlung von 24-Hydroxyergosterol, um 24-Hydroxyvitamin D₂ zu bilden.

Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Verfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂ vor, Folgendes umfassend:

(a) Tosylierung von 24-Hydroxyvitamin D₂, um 24-Hydroxyvitamin D₂-tosylat zu bilden;
(b) Methanolyse des 24-Hydroxyvitamin D₂-tosylats, um 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ zu bilden;
(c) Oxidation von 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂, um 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ zu bilden; und
(d) aufeinander folgende Hydrolyse und Durchführung einer Diels-Alder-Reaktion von 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin D₂, um 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ zu bilden.

Weitere Aspekte der Erfindung stellen Synthese-Zwischenprodukte sowie Verfahren für deren Herstellung bereit, wie in den nachfolgenden Ansprüchen erläutert wird. Die Zwischenprodukte sind im Zuge der Durchführung der Verfahren des ersten, zweiten und dritten Aspekts erhältlich.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines medizinischen Mittels zur Behandlung einer durch Vitamin-D-Mangel herbeigeführten Knochen schwunderkrankung bei einem Säugetier bereit, umfassend die Herstellung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ durch ein Verfahren nach dem ersten oder dritten Aspekt und das Vermischen des 1α,24-Dihydroxyvitamins D₂ mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel.
Die Synthese von 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ wird gemäß dem in den 1 und 2 dargestellten Schema durchgeführt. Wie in 1 ersichtlich ist, dient bei der Synthese Ergosterol als Ausgangsmaterial. Ergosterol wird durch ein sechsstufiges Verfahren in 24-Hydroxyergosterol (5,7,22-Ergostatrien-3β,24-diol (7)) übergeführt. Das 24-Hydroxyergosterol wird nun bestrahlt und durch auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannte Verfahren thermisch in 24-Hydroxy-Vitamin D₂ übergeführt. Wie in 2 ersichtlich ist, wird das 24-Hydroxy-Vitamin D₂ anschließend in einem sechsstufigen Verfahren hydroxyliert, um 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ zu erhalten, wobei ein ähnliches Verfahren wie das von Paaren et al., J. Org. Chem. 45, 3253 (1980), beschriebene angewandt wird.
Im Speziellen wird Ergosterol acetyliert um das 3β-Acetat (2) zu bilden. Mit dem B-Ring der Ergosterol-Struktur wird ein Addukt (3) gebildet, indem das 3β-Acetat mit einem Triazolindion umgesetzt wird. Das Addukt (3) wird dann ozonisiert, um die Seitenkette abzuschneiden und ein C-21-Aldehyd zu bilden (4). Die Seitenkette wird durch Umsetzung des erhaltenen Aldehyds mit der geeigneten Ketoverbindung, um das 24-Enon zu bilden, wiederhergestellt (5). Das Enon wird anschließend in das 24-Methyl-3β,24-dihydroxy-Addukt umgewandelt (6). Dieses Addukt wird mit einem Lithiumaluminiumhydrid umgesetzt, um das Addukt von Schutzgruppen zu befreien und 24-Hydroxyergosterol zu bilden (7). Nun wird das 24-Hydroxyergosterol bestrahlt und wärmebehandelt, um 24-Hydroxy-Vitamin D₂ zu bilden. Das 24-Hydroxy-Vitamin D₂ wird nun tosyliert, um das 3β-Tosylat von 24-Hydroxy-Vitamin D₂ zu bilden. Das Tosylat wird durch Solvolyse verdrängt, um 6-Methoxy-24-hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ zu bilden. Das Cyclovitamin D₂ wird dann einer allylischen Oxidation unterzogen, um das 1α,24-Dihydroxycyclovitamin-Derivat zu bilden. Das 1α,24-Dihydroxycyclovitamin-Derivat wird aufeinander folgend solvolysiert und einer Diels-Alder-Reaktion unterzogen, die die 6-Methoxy- Gruppe entfernt und 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ (5,6-cis) von 5,6-trans-1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ trennt.
Die durch die Verfahren der Erfindung erhältliche Verbindung ist auf verschiedenen klinischen sowie veterinärmedizinischen Gebieten anwendbar und ist besonders für die Behandlung von abnormalem Calcium- und Phosphor-Metabolismus nützlich. Im Speziellen soll die Verbindung aus Formel (1) beispielsweise dazu dienen, die Osteoblasten-Aktivität anzuregen, die durch das Messen des Serumspiegels in Osteocalcin bestimmt wird. Osteocalcin ist eines der wichtigsten Proteine für die Knochenmatrix. Die Verbindung der Formel (1) bindet sich weniger stark an das Vitamin-D-Serum-Bindungsprotein als 1,25-(OH)₂D₃, was auf eine rasche Clearance und niedrige Toxizität hinweist, was wiederum die pharmazeutischen Eigenschaften verbessert.
Die durch die Verfahren der Erfindung erhältliche Verbindung kann zur Steuerung des Calcium-Stoffwechsels eingesetzt werden, wie z. B. zur Behandlung von durch Leberversagen, Nierenversagen, Magendram-Versagen etc. verursachtem, abnormalem Calcium-Stoffwechsels. Die Verbindungen der Formel (1) können zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Vitamin-D-Mangelerkrankungen sowie von damit verbundenen Erkrankungen verwendet werden, wie z. B. renale Osteodystrophie, Steatorrhoe, antikonvulsive Osteomalazie, hypophosphatämische Vitamin-D-resistente Rachitis, Osteoporose, einschließlich postmenopausaler Osteoporose, seniler Osteoporose, Steroid-Osteoporose und anderer Krankheitsbilder, die für Knochenschwund charakteristisch sind, Pseudo-Vitamin-D-Mangel-Rachitis, Ernährungs- und Malabsorptionsrachitis, Osteomalazie und Osteopenie nach Hypoparathyreose, post-operative Hypoparathyreose, idiopathische Hypothyreose, Pseudoparathyreose und Alkoholismus.
1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ ist zudem für die Behandlung von hyperproliferativen Hauterkrankungen wertvoll, wie z. B. Psoriasis, Ekzemen, fehlender Hautfestigkeit, dermaler Hydratation und Sebumsekretion.
Die Verbindung der Formel (1) kann als aktive Verbindung in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die im Vergleich zu bekannten Analoga der aktiven Form von Vitamin D₃ weniger Nebenwirkungen und eine geringe Toxizität aufweisen, wenn sie beispielsweise bei durch anormalen Calcium-Staoffwechsel herbeigeführten Erkrankungen eingesetzt werden.
1α,24-Dihydroxyvitamin D₂, das durch die Verfahren der Erfindung erhältlich ist, kann im Einklang mit herkömmlichen pharmazeutischen Verfahren verarbeitet werden, um medizinische Mittel zur Verabreichung an Patienten, z. B. Säugetiere einschließlich Menschen, herzustellen. Die Verbindung der Formel (1) kann beispielsweise im Gemisch mit herkömmlichen Arzneimittelträgern eingesetzt werden, wie z. B. pharamzeutisch annehmbaren Trägersubstanzen, die für die enterale (z. B. orale), parenterale oder topische Anwendung geeignet sind und mit der aktiven Verbindung nicht schädlich reagieren.
Zu geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern gehören u. a. Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummiarabicum, pflanzliche Öle (z. B. Mandelöl, Maiskeimöl, Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Olivenöl, Kokosnussöl), Mineralöl, Lebertran, ölige Ester, wie z. B. Polysorbat 80, Polyethylenglykole, Gelatine, Kohlenhydrate (z. B. Lactose, Amylose oder Stärke), Magnesiumstereat, Talk, Kieselsäure, viskoses Paraffin, Fettsäuremonoglyceride und -diglyceride, Pentaeryhtritfettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, etc.
Die pharmazeutischen Zubereitungen können sterilisiert werden und, falls gewünscht, mit Hilfsmitteln vermischt werden, wie z. B. Schmiermittels, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmackstoffen und/oder einer oder mehreren aktiven Verbindungen, wie z. B. Vitamin D₃ und dessen 1α-hydroxylierten Metaboliten, konjugierten Estrogenen oder deren Äquivalenten, Anti-Estrogenen, Calcitonin, Biphosphonaten, Calciumzusätzen, Cobalamin, Pertussis-Toxin und Bor.
Für die parenterale Verabreichung eignen sich besonders injizierbare, sterile Lösungen, vorzugsweise ölige oder wässrige Lösungen, wie auch Suspensionen, Emulsionen oder Implantate einschließlich Suppositorien. Die parenterale Verabreichung schließt subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, naopharyngeale oder mucosale Absorption oder transdermale Absorption ein. Ampullen sind bequeme Dosierungseinheiten.
Für die enterale Verabreichung eignen sich besonders Tabletten, Dragees, Flüssigkeiten, Tropfen, Suppositorien, Lutschtabletten, Pulver oder Kapseln. Wenn ein gesüßtes Vehikel erwünscht ist, können Sirupe, Elixiere oder dergleichen verwendet werden.
Für die topische Verabreichung können geeignete nicht-sprühbare, viskose, halbfeste oder feste Formen eingesetzt werden, die einen Träger einschließen, die für die topische Verabreichung kompatibel ist und eine dynamische Viskosität aufweist, die vorzugsweise größer als jene von Wasser ist, wie z. B. Mineralöl, Mandelöl, selbstemulgierendes Bienenwachs, pflanzliches Öl, weißes Petrolatum und Propylenglykol. Geeignete Formulierungen schließen u. a. Cremen, Salben, Lotionen. Lösungen, Suspensionen, Emulsinnen, Pulver, Linimente, Salben, Aerosole, Hautpflaster etc. ein, die, falls gewünscht, sterilisiert oder mit Hilfswirkstoffen vermischt werden, wie z. B. Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Demulgatoren, Netzmittel etc. Eine Cremezubereitung gemäß vorliegender Erfindung schließt geeigneterweise z. B. ein Gemisch aus Wasser, Mandelöl, Mineralöl und selbstemulgierendem Bienenwachs ein; eine Salbenzubereitung z. B. Mandelöl und weißes Petrolatum; und eine Lotionzubereitung z. B. trockenes Propylenglykol.
Topische Zubereitungen der Verbindung, die für die Behandlung von Hauterkrankungen von Nutzen sind, schließen die Epithelisierung herbeiführende Mittel wie Retinoide (z. B. Vitamin A), Chromanole wie Vitamin E, β-Agonisten wie Isoproterenol oder zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), entzündungshemmende Wirkstoffe wie Corticosteroide (z. B. Hydrocortison oder dessen Acetate, oder Dexamethason) sowie keratoplastische Stoffe wie Kohlenteer oder Anthralin ein. Wirksame Mengen solcher Mittel liegen z. B. bei Vitamin A bei etwa 0,003 bis etwa 0,3 Gew.-% der Zusammensetzung, bei Vitamin E bei etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-%, bei Isoproterenol bei etwa 0,1 bis etwa 2 Gew.-%, bei cAMP bei etwa 0,1 bis etwa 1 Gew.-% bei Hydrocortison bei etwa 0,25 bis etwa 5 Gew.-%, bei Kohlenteer bei etwa 0,1 bis etwa 20 Gew.-% und bei Anthralin bei etwa 0,05 bis etwa 2 Gew.-%.
Für die rektale Verabreichung wird die Verbindung als pharmazeutische Zusammensetzung ausgebildet, die eine Zäpfchenbasis wie Kakaoöl oder andere Triglyceride enthält. Um die Lagerfähigkeit zu verlängern, schließt die Zusammensetzung vorzugsweise ein Antioxidans wie Ascorbinsäure, butyliertes Hydroxyanisol oder Hydrochinon ein.
Zur Behandlung von Calcium-Stoffwechselstörungen wird eine orale Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen bevorzugt. Im Allgemeinen ist die Zusammensetzung der Erfindung in Dosierungseinheiten abgegeben, die etwa 0,5 μg bis etwa 25 μg pro Dosierungseinheit in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Die Dosis der Zusammensetzung liegt im Allgemeinen bei etwa 0,01 bis etwa 1,0 μg/kg/ Tag, vorzugsweise bei etwa 0,04 bis etwa 0,3 μg/kg/Tag.
Für die topische Behandlung von Hauterkrankungen beträgt die Dosis der Verbindung in einer topischen Zusammensetzung im Allgemeinen etwa 0,01 μg bis etwa 10 μg pro Gramm der Zusammensetzung.
Es ist offensichtlich, das die derzeit bevorzugten Mengen der aktiven Verbindung im Einzelfall je nach Wirksamkeit der spezifischen verwendeten Verbindung, der jeweiligen formulierten Zusammensetzung, der Verabreichungsart sowie von der/dem zu behandelnden Stelle und Organismus variiert. Die spezifische Dosis für einen bestimmten Patienten hängt beispielsweise von Alter, Körpergewicht, allgemeinem Gesundheitszustand und Geschlecht, von der Ernährung, der zeitlichen Steuerung und Art der Verabreichung, der Ausscheidungsrate, von den Medikamenten, die in Kombination verwendet werden, und der Schwere der jeweiligen Krankheit, die therapiert wird, ab. Die Dosen für eine vorbestimmten Wirt können anhand von herkömmlichen Überlegungen be stimmt werden, wie der übliche Vergleich der unterschiedlichen Aktivitäten der abhängigen Verbindungen und der eines bekannten Wirkstoffs mittels z. B. eines geeigneten herkömmlichen pharmakologischen Protokolls.
Die Verbindung kann des weiteren vorteilhaft in veterinärmedizinischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie z. B. Futterzusammensetzungen für Haustiere zur Behandlung oder Verhinderung von Hypocalcämie. Im Allgemeinen wird die Verbindung im Tierfutter so angegeben, dass der normale Verbrauch derartigen Futters das Tier mit etwa 0,01 bis etwa 1,0 μg/kg/Tag versorgt.
Die folgenden Beispiele sind als rein illustrativ und in keiner Weise als die übrige Offenbarung einschränkend zu verstehen. In den folgenden Beispielen wurden die Protonen-NMR-Spektren (¹H-NMR) mit einem Bruker AM-400 (400 MHz) mit Aspect 3000 Computer in CDCl₃-Lösungen mit CHCl₃ als innerem Standard aufgenommen. Chemische Verschiebungen sind in ppm angegeben. Ultraviolett-Spektren wurden mit einem Hitachi U-2000 Spektralphotometer aufgenommen und sind für Ethanollösungen angegeben.
Beispiel 1: Herstellung, Reinigung und Identifizierung von 1α,24-(OH)₂D₂ in menschlichen Leberzellen, die mit 1α-(OH)D₂ inkubiert wurden
Im Wesentlichen reines 1α-(OH)D₂ wurde von Bone Care International, Inc. of Madison, Wisconsin, USA, zur Verfügung gestellt. Das 1α-(OH)D₂ wurde mit Hep-3B-Zellen kultiviert, die mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren aus einem menschlichen Hepatom entnommen wurden.
Lipidextrakte wurde mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren hergestellt und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) auf Zorbax-S1L, das mit Hexan/Isopropanol/ Methanol entwickelt wurde, unterzogen. Der mutmaßliche 1α,24-(OH)₂D₂-Metabolit eluierte zwischen dem Ausgangsmaterial 1α-(OH)D₂ und dem Standard 1,25-(OH)₂D₂ (ebenfalls von Bone Care International, Inc. of Madison, Wisconsin, USA, zur Verfügung gestellt). Das 1α,24-(OH)₂D₂ wurde mittels des HPLC-Systems weiter gereinigt, bevor eine Identifizierung des Metaboliten durch Massenspektrometrie-Analyse vorgenommen wurde.
Der gereinigte Metabolit war polarer als das Ausgangsmaterial 1α-(OH)D₂ und wurde daher vorläufig als Dihydroxy-Vitamin-D₂-Metabolit angenommen. Der Metabolit besaß zudem das. Vitamin-D-Chromophor, was auf Beibehaltung cis-Trien-Systems von Vitamin D hinwies. Da der Metabolit aus 1α-(OH)D₂ gewonnen worden war, war seine Struktur 1α,X-(OH)₂D₂.
Mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren wurde das Trimethylsilyl-Derivat von 1α,X(OH)₂D₂ hergestellt, und das TMS-Derivat und die native Verbindung wurden Massenspektrometrie unterzogen. Das TMS-Derivat wurde mittels GC/MS analysiert, und die Identifizierung erfolgte größtenteils anhand der Interpretation der Fragmentierungsmuster des Pyro-Metaboliten. Das Molekülion wies ein m/z von 644 auf, was auf Dihydroxyvitamin D₂ plus drei TMS-Gruppen hindeutete, die 216 Einheiten an zusätzlicher Masse ausmachten. Da 1 α-(OH)D₂ 3β- und 1α-Gruppen besitzt und der mutmaßliche Metabolit ein zusätzliches Hydroxyl aufwies, wurden somit alle drei Hydroxyle derivatisiert. Charakteristische Fragmente wurden bei m/z 601, 511, 421, 331 festgestellt, was einen Verlust an 43 Masseneinheiten an Fragment allein oder zusammen mit ein, zwei oder drei TMS-Gruppen von je 90 Einheiten darstellte. Dieses Muster lässt sich höchstwahrscheinlich durch die Spaltung der C-24-zu-C-25-Bindung erklären, was einen C₃H₇-Verlust von 43 Masseneinheiten bedeutete. Dies stellt den Verlust des C₂₆-C₂₅-C₂₇-Fragments dar. Darüber hinaus fehlte im Massenspektrum das m/z 131-Fragment, das für sämtliche 25-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen charakteristisch ist.
Das Massenspektrum wies das m/z 513-Fragment auf, was auf einen Verlust von 131 Masseneinheiten aufgrund der Spaltung des A-Rings unter Verlust des ebenso für Vita min-D-Zusammensetzungen charakteristischen C₂-C₃-C₄ hindeutete. Das Massenspektrum enthielt weiters m/z 143, das wahrscheinlich aus der C-24-C-23-Spaltung und einem Verlust einer Methyl-Gruppe enstanden war. Der unübliche Verlust von 43 Einheiten, der auf eine C₂₄-C₂₅-Fragilität schließen ließ, zusammen mit dem Verlust eines Fragments aufgrund von C₂₃-C₂₄-Spaltung zeigte, dass das zusätzliche Hydroxyl in 1α,X(OH)₂D₂ an der C-24-Position lag. Somit war die Struktur als 1α,24-(OH)₂D₂ identifiziert.
Der ursprüngliche Metabolit wurde mittels Direktsonden-Massenspektrometrie analysiert. Diese Analyse stimmte mit einem Hydroxyl an der 24-Position und auch mit der oben erläuterten GC/MS-Analyse der TMS-Derivate überein. Der ursprüngliche Metabolit wies das erwartete Molekülion bei m/z 428 und ein charakteristisches Fragment bei m/z 367 auf, was den Verlust eines Wasser- und des C₂₅-C₂₆-C₂₇Fragments von 43 Masseneinheiten andeutete.
Beispiel 2: Synthese von 1,24-Dihydroxy-Vitamin D₂
(22E)-5,7,22-Ergostatrien-3(3-ylacetat (2)
Zu einer Lösung von 50 g (0,13 Mol) Ergosterol (1) in 300 ml wasserfreiem Pyridin wurden 33,3 ml (0,35 Mol) Acetanhydrid zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und anschließend 600 ml Wasser zugegeben. Der Niederschlag wurde abfiltriert, dreimal mit jeweils 200 ml Acetonitril gewaschen und dann luftgetrocknet um 42,0 g (74%) von (2) zu gewinnen.
22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3βyl-acetat (4)
Zu einer Lösung von 33,0 g (0,075 Mol) Ergosterolacetat (2) in 1000 ml Chloroform wurden 13,2 g (0,075 Mol) 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion zugegeben. Die Lösung des somit gebildeten (3) wurde bei Raumtemperatur für 30 min gerührt, und anschließend wurden 5 ml Pyridin zugegeben. Die Lösung wurde auf –78°C abgekühlt, bei –78 °C für 2 h mit einem Ozon-Sauerstoff-Gemisch behandelt und dann sorgfältig mit Stickstoff gespült. Anschließend wurden 50 ml Dimethylsulfid zugegeben und das Gemisch wurde mit 3 Wasser, dann zweimal mit 200 ml 2N HCl und schließlich mit 300 Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule mittels 30% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 16,0 g (39%) der obigen Verbindung als schaumigen Feststoff zu gewinnen.
¹H-NMR: (400 MHz; CDCl₃): δppm 0,85 (3H, s, 18-CH₃), 1,10 (3H, s, 19-CH₃), 1,15 (3H, d, 21-CH₃), 1,99 (3H, s, 3β-CH₃CO), 5,45 (1H, m, 3α-H), 6,26 (1H, d, 7-H), 6,40 (1H, d, 6-H), 7,42 (5H, m, PH), 9,58 (1H, d, HCO).
(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3βylacetat (5)
Butyllithium (1,6 M Lösung in Hexan 8,94 ml, 0,014 Mol) wurde zu einer gerührten, gekühlten (0°C) Lösung von Diisopropylamin (1,45 g, 0,014 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) unter Stickstoff zugesetzt. 3-Methylbutan-2-on (1,23 g, 0,014 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran (6 ml) wurde innerhalb von 15 min bei 0°C zugetropft. Die Lösung wurde bei 0°C für eine weitere Stunde gerührt, dann auf –70°C abgekühlt und eine Lösung von Aldehyd (4) (6,0 g, 0,011 Mol) in trockenem Tetrahydrofuran (60 ml) zugesetzt. Die Temperatur wurde auf –20°C erhöht und für 3 h gehalten. Anschließend wurde Eisessig (20 ml) bei –20°C zugegeben, und die Lösung wurde auf Raumtemperatur gebracht. Ether (800 ml) und Wasser (400 ml) wurden zugegeben, und die organische Phase abgetrennt und mit 10%iger Salzsäure (2 × 300 ml), gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (2 × 300 ml) und Wasser (2 × 300 ml) gewaschen. Durch Einengen wurde das Rohprodukt (7,5 g) erhalten, das in Tetrahydrofuran (100 ml), das 1,5 N Essigsäure (12 ml) enthielt, gelöst. Nach Rückflusserhitzen für 1,5 h wurde das Gemisch mit Ether (600 ml) verdünnt, mit 5%iger Natriumcarbonat-Lösung (2 × 200 ml) und Wasser (2 × 200 ml) gewaschen und getrocknet (wasserfreies MgSO₄). Durch Einengen unter reduziertem Druck wurde das Rohprodukt (7,0 g) erhalten. Chromatographie auf Kieselgel (50 Ethylacetat in Hexan) ergab das Enon (5) 4,0 g (59%).
¹H-NMR: (400 MHz): δppm 0,83 (3H, s, 18-CH₃), 0,99 (3H, s, 19-CH₃), 1,09 (6H, dd, 26 und 27-CH₃), 1,12 (3H, d, 21-CH₃), 2,0 (3H, s, 3(3-CH₃CO), 2,84 (1H, m, 25-H), 5,45 (1H, m, 3α-H), 6,06 (1H, d, 23-H), 6,24 (1H, d, 7-H), 6,39 (1H, d, 6-H), 6,71 (1H, dd, 22-H), 7,42 (5H, m, Ph).
(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol (6)
Das Enon (5) (3,5 g, 5,7 mMol) in trockenem Ether (100 ml) wurde auf 0°C abgekühlt, und Methylmagnesiumbromid (3,0 M Lösung in Ether, 6,8 ml, 0,02 Mol) zugetropft. Nach 1 h bei 0°C wurde gesättigtes Ammoniumchlorid (100 ml) zugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde mit Ether (2 × 200 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherphasen wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, um 3,0 g (90%) Rohprodukt von (6) zu gewinnen.
(22E)-5,7,22-Ergostatrien-3β,24-diol (7)
Zu einer Lösung von 3,0 g (5,1 mMol) von (6) in trockenem Tetrahydrofuran (250 ml) wurden 3,6 g (0,09 Mol) Lithiumaluminiumhydrid zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluss 3 h lang erhitzt, im Eiswasserbad abgekühlt und das Reaktionsgemisch dann durch vorsichtiges Zutropfen von Eiswasser (5 ml) zersetzt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt, um einen Großteil des Tetrahydrafurans zu entfernen. Der Rückstand wurde in 200 ml Ethylacetat gelöst, zweimal mit gesättigter NaCl-Lösung (2 × 200 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule mittels 30%igem Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 1,5 g (71%) von (7) zu gewinnen.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl₃): δppm 0,64 (3H, s, 18-H), 0,88 (6H, dd, 26 und 27-CH₃), 0,93 (3H, s, 19-CH₃), 1,06 (3H, d, 21-CH₃), 1,19 (3H, s, 28-CH₃), 3,55 (1H, m, 3α-H), 5,36 (1H, d, 7-H), 5,42 (2H, m, 22 und 23-H), 5,52 (1H, d, 6-H). UV (Ethanol) λ_max: 282 nm.
24-Hydroxyvitamin D₂ (8)
Ein Gramm (2,4 mMol) von (7) wurde in 250 ml Ether und Benzol (4 : 1) gelöst und unter Rühren unter Stickstoff in einer wassergekühlten Quarz-Tauchküvette mittels einer Hanovia-Mitteldruck-UV-Lampe für 2 h bestrahlt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt, in 100 ml Ethanol erneut gelöst und über Nacht rückflusserhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum bis zur Trockene eingeengt und der Rückstand auf einer Kieselgelsäule mittels 30%igem Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 0,55 g (55%) von (8) zu gewinnen.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl₃): δppm 0,57 (3H, s, 18-CH₃), 0,92 (6H, dd, 26 und 27-CH₃), 1,06 (3H, s, 19-CH₃), 1,06 (3H, d, 21-CH₃), 1,20 (3H, s, 28-CH₃), 3,93 (1H, m, 3-H), 4,79 (1H, m (scharf), 19-H), 5,01 (1H, m (scharf), 19-H), 5,43 (2H, m, 22 und 23-H), 6,02 (1H, d, 7-H), 6,22 (1H, d, 6-H). UV (Ethanol) λ_max: 265 nm.
24-Hydroxyvitamin D₂-tosylat (9)
Zu einer Lösung von 0,55 g (1,3 mMol) von (8), gelöst in 5 ml wasserfreiem Pyridin, wurden 0,6 g (3,2 mMol) Tosylchlorid zugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoff bei 5 °C für 20 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml kalte, gesättigte NaHCO₃-Lösung gegossen und mit Ether (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurde mit 5%iger HCl-Lösung (2 × 200 ml), gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung (2 × 200 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (2 × 200 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt, um 0,62 g (84%) von (9) zu erhalten.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl₃): δppm 0,57 (3H, s, 18-CH₃), 0,92 (6H, dd, 26 und 27-CH₃), 1,06 (3H, s, 19-CH₃), 1,08 (3H, d, 21-CH₃), 1,24 (3H, s, 28-CH₃), 2,43 (3H, s, CH₃ (Tosylat)), 4,69 (1H, m, 3-H), 4,77 (1H, m (scharf), 19-H), 5,0 (1H, m (scharf), 19-H), 5,42 (2H, m, 22 und 23-H), 6,03 (1H, d, 7-H), 6,25 (1H, d, 6-H) und 7,83 (4H, d, aromatisch).
24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ (10)
Zu einer Lösung von 0,6 g (1,06 mMol) von (9) in 50 ml wasserfreiem Methanol wurde Natriumbicarbonat 4,0 (0,047 Mol) zugegeben. Das Gemisch wurde unter für 6 h rückflusserhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt. Wasser (100 ml) wurde zugegeben und anschließend eine Extraktion mit Ether (2 × 200 ml) durchgeführt. Die vereinigten Etherextrakte wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, um 450 mg (100%) von (10) als Öl zu gewinnen.
1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamins D₂ (11)
tert-Butylhydroperoxid (870 μl (2,61 mMol); 3M in Toluol) wurde zu einer Suspension von 73 mg (0,66 mMol) Selendioxid in 50 ml wasserfreiem Dichlormethan unter Stickstoff zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoff für 3 h gerührt. Dann wurden 0,1 ml wasserfreies Pyridin zugegeben, und dann eine Lösung von 450 mg (1,06 mMol) von (10) in 15 ml wasserfreiem Dichlomethan gelöst. Das Gemisch wurde unter Stickstoff bei Raumtemperatur für 10 min gerührt, anschließend 25 ml 10%ige NaOH-Lösung zugegeben, und das Gemisch wurde mit Ether (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurde mit 10%iger NaOH-Lösung (2 × 100 ml), Wasser (2 × 100 ml) und gesättigter Natriumchlorid-Lösung (2 × 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule mittels eines Gemischs aus 30%igem Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 110 mg (24%) von (11) zu gewinnen.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl₃): δppm, 0,55 (3H, s, 18-CH₃), 0,90 (6H, dd, 26 und 27-CH₃), 1,03 (3H, d, 21-CH₃), 1,19 (3H, s, 28-CH₃), 3,25 (3H, s, -OCH₃), 4,19 (1H, d, 6-H), 4,19 (1H, m, 1-H), 492 (2H, d, 7-H), 5,15 (1H, m (scharf), 19-H), 5,2 15 (1H, m (scharf), 19-H), 5,42 (2H, m, 22 und 23-H).
5,6-cis- und 5,6-trans-1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ (12, 13)
110 mg (0,25 mMol) 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ (11) wurden in 2,0 ml Dimethylsulfoxid und 1,5 ml Essigsäure gelöst und unter Stickstoff für 1 h auf 50°C erhitzt. Die Lösung wurde auf Eis und 50 ml gesättigte NaHCO₃-Lösung gegossen. Das Gemisch wurde mit Ether (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurde mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (3 × 100 ml), Wasser (2 × 100 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (2 × 200 ml) gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt, um 100 mg (93%) Rohprodukt von (12) und (13) zu gewinnen.
5,6-cis-1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ (12)
Zu einer Lösung von (12) und (13) in 5 ml Ethylacetat wurden 20 mg (0,2 mMol) Maleinsäureanhydrid zugegeben, und das Gemisch wurde bei 35°C für 24 h unter Stickstoff gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule mittels 50%igem Ethylacetat in Hexan gereinigt, um 20 mg (22%) von (12) zu gewinnen.
¹H-NMR: (400 MHz, CDCl₃): δppm 0,57 (3H, s, 18-CH₃), 0,89 (6H, dd, 26 und 27-CH₃), 1,04 (3H, d, 21-CH₃), 1,21 (3H, s, 28-CH₃), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,40 (1H, m, 1-H), 5,0 (1H, m (scharf), 19-H), 5,33 (1H, m (schart), 19-H), 5,44 (2H, m, 22 und 23-H), 6,01 (1H, d, 7-H), 6,37 (1H, d, 6-H). UV (Ethanol) λ_max: 265 nm.
Obwohl die vorliegende Erfindung nun einigermaßen spezifisch beschrieben und anhand von Beispielen erläutert worden ist, ist es für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen, einschließlich Abänderungen, Zusätze und Auslassungen am beschriebenen Inhalt vorgenommen werden können. Dementsprechend seien diese Modifikationen auch von der vorliegenden Erfindung umfasst, und der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung soll nur durch die breitest gefasste Interpretation, die aus den nachfolgenden Ansprüchen gesetzmäßig hervorgehen kann, eingeschränkt werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxy-Vitamin D₂, Folgendes umfassend: (a) Acetylierung von Ergosterol, um sein 3β-Acetat zu bilden; (b) Umsetzung mit einem Triazolindion und Ozonisieren, um 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat zu bilden; (c) Addition von 3-Methylbutan-2-on an 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat, um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat zu bilden; (d) Addition von Methylmagnesiumbromid an (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat, um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3(3,24-diol zu bilden; (e) Reduktion von(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol, um 24-Hydroxyergosterol zu bilden; (g) Bestrahlung von 24-Hydroxyergosterol, um 24-Hydroxyvitamin D₂ zu bilden; (h) Tosylierung von 24-Hydroxyvitamin D₂ in Gegenwart von trockenem Pyridin, um 24-Hydroxy-Vitamin D₂-3β-tosylat zu bilden; (i) Solvolyse von 24-Hydroxyvitamin D₂-tosylat, um 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ zu bilden; (j) allylische Oxidation von 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ mit Selendioxid, um 1α,24-Dihydroxycyclovitamin D₂ zu bilden; und (k) Hydrolyse des 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamins D₂ mit einem Gemisch aus Dimethylsulfoxid und einer organischen Säure, um ein Gemisch aus 5,6-cis-1α-Hydroxy- und dem 5,6-traps-1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ zu bilden und ein Diels-Alder-Addukt von 5,6-traps-1α-Hydroxyvitamin D₂ zu bilden, um durch Reinigung 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂, Folgendes umfassend: (a) Tosylierung von 24-Hydroxyvitamin D₂, um 24-Hydroxyvitamin D₂-tosylat zu bilden; (b) Methanolyse des 24-Hydroxyvitamin D₂-tosylats, um 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ zu bilden; (c) Oxidation von 24-Hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂, um 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ zu bilden; und (d) aufeinander folgende Hydrolyse und Durchführung einer Diels-Alder-Reaktion von 1α,24-Dihydroxy-3,5-cyclovitamin D₂, um 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ zu bilden.
Verfahren zur Herstellung von (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat, umfassend das Umsetzen von 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat mit 3-Methylbutan-2-on in Gegenwart von Butyllithium und trockenem Tetrahydrofuran.
Verfahren zur Herstellung von (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol, umfassend das Umsetzen von 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-traizolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat mit einem Grignard-Reagens.
Verfahren zur Herstellung von 24-Hydroxyergosterol, umfassend das Umsetzen von (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol mit Lithiumaluminiumhydrid in Gegenwart von trockenem Tetrahydrofuran.
Verfahren zur Herstellung von 24-Hydroxyvitamin D₂-tosylat, umfassend das Umsetzen von 24-Hydroxyvitamin D₂ mit Toluolsulfonylchlorid in Gegenwart von trockenem Pyridin.
Verfahren zur Herstellung von 6-Methoxy-24-hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂, umfassend die Solvolyse von 24-Hydroxyvitamin D₂-tosylat in Methanol.
Verfahren zur Herstellung von 6-Methoxy-1α,24-dihydroxy-3,5-cyclovitamin D₂, umfassend die allylische Oxidation von 6-Methoxy-24-hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂ mit Selendioxid.
Verfahren zur Herstellung eines medizinischen Mittels zur Behandlung einer durch Vitamin D-Mangel herbeigeführten Knochenschwunderkrankung bei einem Säugetier, umfassend die Herstellung von 1α,24-Dihydroxyvitamin D₂ durch ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, und das Vermischen des 1α,24-Dihydroxyvitamins D₂ mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel.
(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyncholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat.
(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3(3,24-diol.
(22E)-5,7,22-Ergostatrien-3(3,24-diol.
24-Hydroxyergosterol.
24-Hydroxyvitamin D₂-tosylat.
6-Methoxy-24-hydroxy-3,5-cyclovitamin D₂.
Verfahren zur Herstellung von 24-Hydroxyvitamin D₂, umfassend: (a) Acetylierung von Ergosterol, um dessen 3β-Acetat zu bilden; (b) Umsetzung mit Triazolindion und Ozonisieren, um 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat zu bilden; (c) Addition von 3-Methylbutan-2-on an 22-Oxo-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-l,2-diyn-23,24-dinor-6-cholen-3β-ylacetat, um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat zu bilden (d) Addition von Methylmagnesiumbromid an (22E)-5α,8α-(4-phenyl-3,5-dioxo)-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)cholesta-6,22-dien-24-on-3β-ylacetat, um (22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-1,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol zu bilden; (e) Reduktion von(22E)-5α,8α-(4-Phenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-l,2-diyl)-6,22-ergostadien-3β,24-diol, um 24-Hydroxyergosterol zu bilden; und (g) Bestrahlung von 24-Hydroxyergosterol, um 24-Hydroxyvitamin D₂ zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 16, worin der Schritt des Bestrahlens von 24-Hydroxyergosterol zur Bildung von 24-Hydroxyvitamin D₂ in Diethylether/Benzol als Lösungsmittel durchgeführt wird.