DE69230828T2

DE69230828T2 - Gebrauchsfertige Reagenszusammensetzungseinheiten für einen spezifischen Bindungstest.

Info

Publication number: DE69230828T2
Application number: DE69230828T
Authority: DE
Inventors: M. Devereaux
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1992-09-22
Publication date: 2000-10-12
Anticipated expiration: 2012-09-23
Also published as: CA2119125A1; EP0607209B1; EP0607209A4; EP0607209A1; DE69230828D1; ES2147185T3; WO1993007466A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Bereich der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf das Gebiet von Assayreagenzien und ihres Einsatzes bei diagnostischen Assays. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf lyophilisierte Reagenzienzusammensetzungen in Verwendungseinheit, welche besonders vorteilhaft sind bei diagnostischen Assays.

2. Beschreibung des verwandten Fachgebietes

Verschiedene analytische Verfahren werden üblicherweise bei diagnostischen Assays verwendet um das Vorhandensein und/oder die Menge von Substanzen von Interesse oder klinischer Bedeutung in Testproben, sowie Körperflüssigkeiten, nachzuweisen. Diese klinisch bedeutsamen oder interessanten Substanzen werden allgemein als Analyte bezeichnet. Diagnostische Assays sind ein unverzichtbares Mittel geworden zum Nachweis von Analyten in Testproben, in dem die gegenseitige Reaktion zwischen dem Analyten und einem spezifischen Bindungsglied, wie verdeutlicht durch die Immunoreaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper gegen dieses Antigen, verwendet wird.
Kommerziell erhältliche Testvorrichtungen zum Durchführen spezifischer Bindungsassays sind üblicherweise in der Form von Testausrüstungen, welche abgepackte Kombinationen von Behältern, die individuelle Lösungen der Reagenzien enthalten, die notwendig sind zum Durchführen des Assays, umfassen. Um die gewünschte Assaytechnik durchzuführen, müssen Anteile solcher Reagenzienlösungen manuell oder instrumentell, in ein Reaktionsgefäß mit der Testprobe eingeführt werden. Beim manuellen Eingeben erfordert der Assay die Zeit und die Fähigkeit eines Technikers und falls instrumentell eingegeben wird, erfordert der Assay die Ausgaben und die Erhaltung eines Eingabeapparates.
Reagenzienimpregnierte Festphasentestvorrichtungen wurden für spezifische Bindungsassays entwickelt um das Bedürfnis für Reagenzienmessungen und die Eingabe einzelner Reagenzien zu überwinden. Üblicherweise verwendete Festphasevorrichtungen dieser Art umfassen die Meßstäbe, Teststreifen, Violen und Durchflußvorrichtungen wobei die meisten oder alle notwendigen Reagenzien, innerhalb des feste Phasematerials enthalten sind. Die Assayreagenzien werden im allgemeinen auf dem feste Phasematerial aufgebracht und getrocknet, um reaktive Stellen zu bilden.
Meßstabvorrichtungen umfassen üblicherweise einen Plastikstreifen mit einer darauf aufgebrachten reagenzienenthaltenden Matrix. Üblicherweise wird eine Testprobe in die Vorrichtung eingebracht, und die Anwesenheit des Analyten wird durch eine Reaktion in der Matrixschicht zwischen dem Analyten und der Assayreagenz, was ein visuelle nachweisbare Signal erzeugt, wie z. B. eine Färbung angezeigt. Hochstrasser (U.S. Patent 4,059,407) beschreibt eine Meßstabvorrichtung, welche in eine biologische Flüssigkeit eingetaucht wird, um Analyten in der Flüssigkeit nachzuweisen. Ebenfalls von Interesse im Bereich der Meßstabvorrichtungen sind die U.S. Patente Nr. 3,802,842; 3,915,639 und 4,689,309 und die WO Antragsnummer 8,600,670.
Teststreifenvorrichtungen werden durch die Vorrichtungen von Deutsch et al., welche chromatographische Teststreifen umfassen, verdeutlicht (U.S. Patente Nr. 4,094,647, 4,235,601 und 4,361,537). Die typische Vorrichtung umfaßt ein Material, welches in der Lage ist eine Lösung durch Kapillarwirkung, z. B. Dochtbildung, zu transportieren. Unterschiedliche Bereiche oder Zonen entlang des Streifens enthalten die Assayreagenzien, die benötigt werden um, beim Transport des Analyten zu oder durch solchen Zonen, ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Die Vorrichtung ist sowohl für chemische Assays als auch für Bindungsassays, welche, durch die Bindungsreaktion zwischen einem Antigen und einem komplimentären Antikörper charakterisiert sind, geeignet. Viele Variationen der Deutsch Vorrichtung wurden beschrieben. Ebenfalls von Interesse im Bereich der Teststreifen sind die U.S. Patente Nrn. 4,168,146; 4,298,688; 4,435,504; 4,461,829; 4,517,288 und 4,740,468; die Europäische Patentamt Publikationsnummer 88,636; 259,157; und 267,006 und die Deutsche Patentnummer 3,445,816.
Durchflußvorrichtungen umfassen im allgemeinen ein poröses Material welches ein immobilisiertes Assayreagenz beinhaltet. Die Testprobe wird aufgetragen und fließt durch das poröse Material und der Analyt in der Testprobe reagiert mit den Reagenz um einen immobilisierten Komplex zu erzeugen, welcher dann auf dem porösen Material nachgewiesen werden kann. Tom et al., (U.S. Patent Nr. 4,366,241) beschreibt ein latzförmiges Material mit einer immunoadsorbierenden Zone welche einen immobilisierten analytenspezifischen Antikörper enthält, auf welchen die Testprobe direkt aufgetragen wird. Andere Durchflußvorrichtungen sind beschrieben in den U.S. Patent Nrn. 3,825,410; 3,888,629; 4,446,232; 4,587,102; 4,632,901; 4,637,978 und 4,727,019 und in den Europäischen Patentamt Publikationsnrn. 212,603; 217,403 und 249,851.
Bisher bekannte Bindungsassayvorrichtungen werden im allgemeinen als schwierig herzustellen angesehen. Üblicherweise werden die Reagenzien einzeln auf die feste Phase aufgetragen um reaktive Stellen beim Trocknen der festen Phase, nach jedem Zusatz zu bilden, z. B. muß der Hersteller die Meß- und Eingabefähigkeiten bereitstellen, die durch die Assays erfordert werden. Die Tauchstab, Teststreifen und Durchflußvorrichtungen sind ebenfalls kompliziert da die chemischen oder physikalischen Reaktionen in der festen Phase stattfinden wenn die Testprobe durchläuft oder entlang der festen Phase wandert, und daher muß die feste Phase so entwickelt sein, daß geeignete Inkubations- und Reaktionszeiten zwischen jeder reaktiven Stelle gestattet werden. Zusätzlich müssen solche Geräte, wenn sie gebaut werden, mit dem Reagenzien, die für den nachzuweisenden Analyten spezifisch sind, bestückt werden. Dies führt zu dem Erfordernis die Produktionstechniken für jeden interessanten Analyten zu verändern. Weiterhin sind die Reagenzien, die durch direktes Auftragen auf und Trocknen auf der festen Phase eingebaut werden, Veränderungen der Stabilität ausgesetzt während der Lagerung der Vorrichtung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfaßt Reagenzienzusammensetzungen für spezifische Bindungsassays und Verfahren zu deren Herstellung. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist Reagenzienzusammensetzungen in Verwendungseinheit für spezifische Bindungsassays bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist stabile Reagenzienzusammensetzungen bereitzustellen, welche Lagerungsbedingungen für verlängerte Zeiträume unterzogen werden können. Die neuartigen Reagenzienzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zur Reaktion mit der Testprobe gebracht werden und die entstehenden interessanten Bindungskomplexe können aus dem Reaktionsgemisch durch jegliche geeignete Trennungsmittel, für folgenden Nachweis, entfernt werden. Die neuartigen Reagenzienzusammensetzungen in Verbindungseinheit machen das Bedürfnis des Abmessens und Eingebens individueller Assayreagenzien in dem Assayverfahren überflüssig. Darüber hinaus haben die Reagenzienzusammensetzungen in Verwendungseinheit der vorliegenden Erfindung eine erhöhte Stabilität zur Langzeitlagerung.
Die Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheit für einen spezifischen Bindungsassay enthält mindestens eine Fangreagenzien-beschichtete Partikel, wobei das Fangreagenz ein spezifisches Bindungsglied in einer Menge, die ausreichend ist um einen einzelnen Bindungsassay durchzuführen und eine verformbare Trägermatrix ist. Die Trägermatrix wird getrocknet, wodurch die Fangreagenz beschichtete Partikel stabilisiert wird. Die Trägermatrix kann bei Kontakt mit einem Lösungsmittel wieder hergestellt werden, wodurch die Fangreagenz beschichtete Partikel freigesetzt wird. Abhängig von dem gewünschten Assayformat kann das Fangreagenz für einen Analyten wie in einem Sandwichassay, für ein Indikatorreagenz wie in einem kompetitiven Assay, oder für ein zusätzliches spezifisches Bindungsglied wie in einem indirekten Assay spezifisch sein. Die verformbare Trägermatrix ist üblicherweise eine Gelatine, sowie eine Kalbshautgelatine, Fischgelatine, Schweinehautgelatine oder eine Gemüsegelatine.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Bildung einer Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheit für einen spezifischen Bindungsassay. In dem Verfahren wird mindestens eine Fangreagenzien-beschichtete Partikel, mit einer verformbaren Trägermatrix kombiniert. Ein Bruchteil der Mischung wird in eine geformte Höhlung eingesetzt und Erstarren gelassen. Das Reagenz kann luftgetrocknet oder lyophilisiert sein.
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung umfaßt das Reagenz in Verwendungseinheit ein Indikatorreagenz und eine verformbare Trägermatrix. Das Indikatorreagenz wird mit einer verformbaren Trägermatrix kombiniert, um eine Mischung zu bilden. Ein Bruchteil der Mischung wird in eine geformte Höhlung eingegeben, wo es gekühlt und/oder getrocknet oder anderweitig Erstarren gelassen wird um eine Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheit zu bilden. Die Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheit kann auch lyophilisiert sein. Die Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheit rehydratisiert bei Kontakt mit einem Lösungsmittel, wodurch das Indikatorreagenz freigesetzt wird um in einer spezifischen Bindungsreaktion teilzunehmen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheit und Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung. Die Reagenzienzusammensetzung kann für verlängerte Zeiträume bei Raumtemperatur gelagert werden und kann, ohne zahlreiche Reagenzienabmessungen und Zusätze zu dem Reaktionsgefäß oder zu der Testvorrichtung, durch einen Techniker eingesetzt werden.
Bevor mit der Beschreibung der zahlreichen Ausführungen der vorliegenden Erfindung fortgesetzt wird, wird eine Anzahl von Begriffen definiert. Eine Vielzahl von Assaytechniken in denen die Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, werden ebenfalls beschrieben.

I. Definitionen

Der Ausdruck "spezifisches Bindungsglied", wie es hier verwendet wird, bezeichnet ein Glied eines spezifischen Bindungspaares, z. B. zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Zusätzlich zu Antigen und Antikörper-spezifischen Bindungspaaren umfassen weitere spezifische Bindungspaare Biotin und Avidin, Kohlenhydrate und Lektine, komplementäre Nukleotidsequenzen (einschließlich Sonden- und Fangnukleinsäuresequenzen, die in DNA Hybridisierungsassays verwendet werden um eine Zielnukleinsäuresequenz nachzuweisen), komplementäre Peptidsequenzen, Effektor und Rezeptormoleküle, Enzymcofaktoren und Enzyme, Enzyminhibitoren und Enzyme, und ähnliches. Weiterhin können spezifische Bindungspaare Glieder umfassen, welche Analoga des originalen spezifischen Bindungsgliedes sind. Beispielsweise kann ein Derivat oder ein Fragment des Analyten, z. B. ein Analyt-Analogon, solang es mindestens ein Epitop gemeinsam mit dem Analyten hat, verwendet werden.
Immunoreaktive spezifische Bindungsglieder umfassen Antigene, Haptene, Antikörper und Anteile oder Komplexe davon, einschließlich jener die durch DNA-Rekombinationsverfahren, Fragmentierungsverfahren oder Peptidsynthese gebildet werden. Üblicherweise ist das immunoreaktive spezifische Bindungsglied in der Lage entweder an den Analyten wie in einem Sandwichassay, an das Fangreagenz wie in einem kompetitiven Assay oder an ein zusätzliches spezifisches Bindungsglied wie in einem indirekten Assay, zu binden. Falls ein Antikörper verwendet wird, kann es ein monoklonaler Antikörper, polyklonaler Antikörper, Antikörperfragment, rekombinanter Antikörper, eine Mischung davon, oder eine Mischung eines Antikörpers und eines anderen spezifischen Bindungsgliedes sein. Die Einzelheiten der Herstellung solcher Antikörper und ihre Eignung zur Verwendung als spezifisches Bindungsglieder sind im Fachgebiet gut bekannt.
Der Ausdruck "Analyt" wie es hier verwendet wird, bezeichnet die Substanz von Interesse in der Testprobe, die in dem Assay nachgewiesen oder gemessen werden soll. Der Analyt kann jede Substanz sein für die ein natürlich auftretendes spezifisches Bindungsglied (z. B. ein Antikörper) existiert oder für die ein spezifisches Bindungsglied hergestellt werden kann. Der Analyt kann an ein oder mehrere spezifische Bindungsglieder in dem Assay gebunden sein. "Analyt" umfaßt ebenfalls jede antigenische Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen davon. Analyten von Interesse umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Hormone, Steroide, Vitamine, Drogen einschließlich jener die zu therapeutischen Zwecken verabreichert werden wie auch jene die aus illegalen Gründen verabreichert werden, ein Bakterium, ein Virus und Metabolite von oder Antikörper gegen jede der obigen Substanzen.
Der Ausdruck "Indikatorreagenz", wie es hier verwendet wird, bezeichnet einen nachweisbaren Markierungsstoff, der direkt oder indirekt an das spezifische Bindungsglied angeheftet ist. Der Markierungsstoff kann an das spezifische Bindungsglied vor dem Assay oder während der Durchführung des Assays angeheftet werden. Das Indikatorreagenz erzeugt ein nachweisbares Signal welches mit dem Vorhandensein oder der Menge des Analyten in der Testprobe verknüpft ist. Im allgemeinen wird das Indikatorreagenz nachdem es gefangen worden ist an einem festen Material nachgewiesen oder gemessen, aber ungebundenes Indikatorreagenz kann ebenfalls nachgewiesen oder gemessen werden um das Ergebnis eines Assays zu bestimmen. Das spezifische Bindungsglied des Indikatorreagenz kann ein Glied jeglichen spezifischen Bindungspaares einschließlich Immunoreaktanten sein. Der Markierungsstoff des Indikatorreagenz ist in der Lage ein Signal zu erzeugen, das durch visuelle oder instrumentelle Mittel nachweisbar ist. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Indikatorreagenzien kann gebildet werden indem entweder der Markierungsstoff oder das spezifische Bindungsglied verändert werden.
Der Ausdruck "Markierungsstoff", wie es hier verwendet wird, bezeichnet jede Substanz welche an ein spezifisches Bindungsglied angeheftet ist oder wird, und welches in der Lage ist ein Signal zu erzeugen welche durch visuelle oder instrumentelle Mittel nachweisbar ist. Solche Markierungsstoffe umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Chromogene; Katalysatoren; fluoreszente Verbindungen; chemilumineszente Verbindungen; radioaktive Markierungsstoffe; direkt visuelle Markierungsstoffe, einschließlich kolloidal metallischer, nicht metallischer Partikeln, Farbstoffpartikeln, Enzyme oder Substrate, oder organische Polymerlatexpartikeln; Liposome oder andere Vesikeln welche signalerzeugende Substanzen enthalten; und ähnliches. Die Auswahl eines bestimmten Markierungsstoffes ist nicht kritisch für die vorliegenden Erfindung, aber der Markierungsstoff wird in der Lage sein ein nachweisbares Signal zu erzeugen, entweder durch sich selbst oder in Verbindung mit einer oder mehrer zusätzlicher Substanzen, wie in einem Enzym/Substrat signalerzeugenden System.
Der Ausdruck "signalerzeugendes System", wie es hier verwendet wird, bezeichnet die Gruppe der Assayreagenzien, welche benötigt werden um das gewünschte Reaktionsprodukt oder Signal zu erzeugen. Beispielsweise können ein oder mehrere signalerzeugende Verbindungen um mit einem Markierungsstoff zu reagieren und das nachweisbare Signal zu erzeugen verwendet werden, z. B. falls der Markierungsstoff ein Enzym ist, wird die Verstärkung des nachweisbaren Signals in dem das Enzym mit einem oder mehreren Substraten oder zusätzlichen Enzymen reagiert, erzeugt, um ein nachweisbare Reaktionsprodukt zu erzeugen. "Nachweisbares Signal" wie es hier verwendet wird, ist in seinem breitesten Sinn gemeint um jegliche beobachtbare Veränderung in einem Systemparameter zu umfassen, wie eine Veränderung in oder der Erscheinung eines Reaktants, einen beobachtbaren Niederschlag jeglicher Komponente in der Testprobe oder eine Veränderung in einem anderen Parameter, die durch direkte visuelle Beobachtung oder instrumentelle Mittel nachgewiesen wird.
Der Ausdruck "Fangreagenz", wie es hier verwendet wird, bezeichnet ein spezifisches Bindungsglied welches spezifisch sein kann, entweder für den Analyten wie in einem Sandwichassay, für das Indikatorreagenz und dem Analyten wie in einem kompetitiven Assay oder für ein zusätzliches spezifisches Bindungsglied, welches seinerseits spezifisch für den Analyten ist wie in einem indirekten Assay. Daher kann das spezifische Bindungsglied jedes Molekül sein, das in der Lage ist spezifisch mit einem anderen zu binden, genau wie bei den Indikatorreagenz spezifischen Bindungsgliedern. In einem Festphaseassay ist das Fangreagenz direkt oder indirekt an ein im wesentlichen festes Material angeheftet. Die feste Phase erleichtert die Trennung des Analyten und/oder der Assayreagenzien oder Komplexe davon, die von der Testlösung getrennt werden sollen. Üblicherweise ist die Anheftung des spezifischen Bindungsgliedes an das feste Material im wesentlichen unumkehrbar und kann kovalente oder nicht kovalente Mechanismen umfassen. Das Fangreagenz kann direkt an das feste Phase Partikel durch Adsorption angeheftet werden, aber vorzugsweise ist das Fangreagenz indirekt an das Partikel, durch einem kreuzverbindenden Mittel, angeheftet. Das kreuzverbindende Mittel ist vorzugsweise aus Glutaraldehyd, Formaldehyd, Glyoxal, Acrolein und Acetaldehyd gewählt. Es ist am meisten vorzuziehen, das das Fangreagenz kovalent an die Partikel durch ein Sensitisationsverfahren, unter Verwendung von Glutaraldehyd, gebunden ist.
Der Ausdruck "zusätzliches spezifisches Bindungsglied", wie es hier verwendet wird, bezeichnet jegliches Glied eines spezifischen Bindungspaares welches in dem Assay verwendet wird zusätzlich zu den spezifischen Bindungsgliedern des Fangreagenzes und des Indikatorreagenzes, um das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Testprobe nachzuweisen. Es können eine oder mehrere spezifische Bindungsglieder in einem Assay verwendet werden. Beispielsweise kann ein zusätzliches spezifisches Bindungsglied in der Lage sein den Analyten zu binden, sowohl als ein zweites spezifisches Bindungsglied an welchen der Analyt selber nicht anheften kann.

II. DIAGNOSTISCHE ASSAYS

Die neuartigen Reagenzienzusammensetzungen in Verwendungseinheit der vorliegenden Erfindung werden vorteilhafterweise in einer Vielzahl von Immunoassayformaten verwendet. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf Immunoassays begrenzt. Jegliche Assaykonfiguration die spezifische Bindungsglieder und einen nachweisbaren Markierungsstoff verwendet kann durchgeführt werden unter der Verwendung der Reagenzienzusammensetzungen in Verwendungseinheit, jedoch werden Immunoassayformate hierin beschrieben um die Beschreibung zu vereinfachen.
Bindungsassays werden im allgemeinen in einer von zwei Hauptklassen eingeteilt, homogene und heterogene Assays. In einem homogenen Assay bilden der Analyt und die Assayreagenzien eine Testlösung und werden nicht getrennt vor dem Nachweis des Signals welches durch das Indikatorreagenz erzeugt wird. In einem heterogenen Assay wird entweder ein Festphasematerial verwendet, welches die Trennung der gebundenen von den ungebundenen Reaktionsbestandteilen erlaubt oder ein Reagenz der ursprünglichen Lösung wird zum Ausfällen gebracht und dann aus der Testlösung entfernt. Diese Assays können weiterhin getrennt werden in Sandwich und kompetitive Assays, und Variationen davon.
Schematische Darstellungen von Beispielen von verschiedenen solcher Assaytypen für sowohl Antigen und Antikörperanalyte folgen. Es wird jedoch angenommen, daß ein im Fachgebiet bewanderter viele andere Arten von Assay entwickeln kann, einschließlich Assays für Analyte, die keine Antigene oder Antikörper sind, auf welche die vorliegenden erfinderischen Konzepte angewendet werden können. Heterogene Assays 1. Direkte Assays
Das spezifische Bindungsglied des Indikatorreagenz kann entweder das gleiche spezifische Bindungsglied wie das Fangreagenz sein, oder auch nicht. Antigen oder Antikörperanalyte sind unter Verwendung des vorherigen Reaktionsschemas nachweisbar. Variationen des Reaktionsschemas umfassen die folgenden, ohne Einschränkung:

2. Indirekter Assay

In dieser Gruppe von Assays wird ein zusätzliches spezifisches Bindungsglied zusammen mit jenen des Indikator- und Fangreagenz verwendet, um den nachweisbaren Bildungskomplex zu bilden. Beispielsweise kann ein zusätzliches spezifisches Bindungsglied verwendet werden indem das Indikatorreagenz spezifisch an das zusätzliche spezifische Bindungsglied bindet, welches seinerseits an den Analyten bindet. Es ist ebenfalls in einigen Fällen wünschenswert, das Analyt direkt auf der festen Phase zu fangen.

3. Kompetitiver Assay

Beispiele von kompetitiven Assayformaten umfassen die folgenden:
In diesen Beispielen sind sowohl der Analyt in der Testprobe wie auch das spezifische Bindungsglied des Indikatorreagenz in der Lage kompetitiv an das Fangreagenz zu binden. Die Menge an Indikatorreagenz, die so gebunden ist reflektiert die Menge an Analyt in der Testprobe. Zusätzliche spezifische Bindungsglieder können ebenfalls in kompetitiven Assays verwendet werden. Verallgemeinerte Beispiele, die Sandwich und kompetitive Assays beschreiben, welche die Reagenzienzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwenden können, sind unterhalb dargestellt. Detaillierte Diskussionen von Sandwichassayverfahren welche die Reagenzienzusammensetzung der Erfindung verwenden, sind dargestellt in den folgenden Beispielen.
Ein Festphasensandwichassay verwendet ein Fangreagenz, z. B. ein spezifisches Bindungsglied, das an ein Festphasematerial angeheftet ist. Das Fangreagenz wird mit einer Testprobe, die im Verdacht steht den Analyten zu enthalten, und einem Indikatorreagenz, welches ein zweites spezifisches markiertes Bindungsglied umfaßt, in Kontakt gebracht. Die Reagenzien und die Testprobe können entweder simultan oder der Reihe nach, entweder einzeln oder in Kombination in Kontakt gebracht werden. Eine Bindungsreaktion führt zu der Bildung eines Fangreagenz/Analyten/Indikatorreagenz-Komplexes, welcher auf den feste Phase Material fest gemacht ist. Der Assay kann ebenfalls die Schritte des Trennens des entstehenden Komplexes von den überschüssigen Reagenzien und der Testprobe beinhalten. Der Komplex der zurückgehalten wird auf dem feste Phase Material wird nachgewiesen in dem die feste Phase hinsichtlich des Indikatorreagenz untersucht wird. Falls Analyt in der Probe vorhanden ist, wird der Markierungsstoff in dem feste Phasematerial vorhanden sein. Die Menge des Markierungsstoffes an der festen Phase ist ein Funktion der Menge des Analyten in der Probe.
Die Reagenzienzusammensetzung der vorliegenden Erfindung werden vorteilhafterweise bei Sandwichassayformaten einschließlich der vorwärts, rückwärts und gleichzeitigen Techniken verwendet. Üblicherweise beinhaltet ein Vorwärtsassay den Kontakt der Testprobe mit dem Fangreagenz gefolgt durch eine bestimmte Inkubationszeit welche ihrerseits durch den Zusatz des Indikatorreagenz gefolgt ist. Ein Rückwärtsassay beinhaltet den Zusatz des Indikatorreagenz zu der Testprobe gefolgt, nach einer bestimmten Inkubationszeit, durch den Zusatz des Fangreagenz. Ein gleichzeitiger Assay beinhaltet einen ' einzigen Inkubationsschritt, da das Fangreagenz und das Indikatorreagenz gleichzeitig mit der Testprobe in Kontakt gebracht werden, so daß sowohl das Fangreagenz und das Indikatorreagenz in eine Trägermatrix in einer Reagenzienzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingekapselt sind.
Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung in einem indirekten Sandwichassay mit der Bildung eines Komplexes aus Fangreagenz/Analyt/Analyten-spezifisches Bindungsglied/Indikatorreagenz verwendet werden. In diesem Fall ist das zusätzliches Analyten-spezifische Bindungsglied ein zusätzliches spezifisches Bindungsglied, welches separat zugefügt werden kann oder welches in der eingekapselten Reagenzienzusammensetzung beinhaltet ist. Die Reagenzienzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in einem kompetitiven Assay verwendet werden. In einer feste Phase kompetitiven Konfiguration wird das Fangreagenz erneut an ein feste Phase Material angeheftet und wird sowohl mit der Testprobe wie mit einem Indikatorreagenz in Kontakt gebracht. Das Indikatorreagenz wird gebildet aus einem Analyten oder einem Analyten-Analogon welches markiert wurde. Eine Bindungsreaktion tritt auf und führt zu der Bildung von Komplexen aus (1) feste Phase: Fangreagenz/Analyten-Komplex und (2) feste Phase: Fangreagenz/Indikatorreagenzien-Komplex. In dem kompetitiven Assay ist die Menge von Markierungsstoff an der festen Phase umgekehrt proportional zu der Menge des Analyten in der Probe. Dadurch wird eine positive Testprobe eine Abnahme des Signals erzeugen. Beispielsweise kann in einem Theophyllinassay ein anti-Theophyllinantikörper (entweder monoklonales oder polyklonales Fangreagenz) auf eine festen Träger fest gemacht werden. Eine Kompetition um die Bindung an diesen Antikörper kann zwischen ein Indikatorreagenz von markiertem Theophyllin und unmarkierten Theophyllin, welches in der Testprobe vorhanden ist, hergestellt werden. Die Immunoreaktion führt zu einem feste Phase: Fangreagenz/Indikatorkreagenz-Komplex falls Theophyllin, oder eine Grenzwertmenge von Theophyllin in der Testprobe nicht vorhanden ist. Erhöhte Theophyllinniveaus in der Testprobe führen zu einer verringerten Indikatorreagenzmenge, die mit der festen Phase verknüpft ist.

Homogene Assays

Homogene Assays erfordern nicht die Trennung der Testlösung und des Indikatorreagenz vor der Beobachtung des Indikatorreagenz. Diese breite Klassifikation umfaßt viele Formate wie jene die unterhalb beschrieben sind, sowohl als auch solche die einem im Fachgebiet bewanderten offensichtlich sind unter Verwendung der neuartigen Reagenzienzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung.
Eine Hauptkategorie der homogenen Assays sind die Agglutinationsassays welche ebenfalls durchgeführt werden können unter Verwendung der Reagenzienzusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Agglutinationsreaktionen und ihre Verfahren sind im allgemeinen im Fachgebiet gut bekannt. Eine typische Agglutinationsreaktion besteht aus dem Zusammenklumpen von Analyt in Anwesenheit eines Analyten spezifischen Bindungsgliedes. Dieses Klumpen oder Agglutination der Reaktionsbestandteile wird überwacht um das Vorhandensein oder die Menge des Analyten festzustellen, der nachgewiesen werden soll. Die Agglutinationsreaktion soll überwacht werden in dem man eine Reaktionskomponente markiert, zum Beispiel ein spezifisches Bindungsglied, und in dem man das Signal, das, entweder mit den agglutinierten oder unagglutinierten Reagenzien assoziiert ist, nachweist. Der Nachweis kann visuell erzielt werden durch die Beobachtung des Klumpens des Reaktionsmediums, durch das Absetzen oder die Kugelbildung der Indikatorreagenzie in einem Schwerkraftfeld, durch Veränderungen der Lichtbrechung oder durch Änderungen der spektralen Eigenschaften des Indikatorreagenz.

1. Direkter Assay

In einem direkten Agglutinationsassay können, falls ein polyvalenter Analyt vorhanden ist, zwei oder mehr markierte spezifische Bindungsglieder an den Analyten binden, wodurch das Indikatorreagenz und der Analyt veranlaßt werden zu aggregieren. Eine Erhöhung der Aggreagtion kann eine Erhöhung der Menge des Analyten anzeigen, der in der Testprobe enthalten ist. Das Fangreagenz beschichtete Partikel kann ebenfalls als nachweisbarer Markierungsstoff dienen. Beispielsweise kann das Reagenz beschichtete Partikel ein gefärbtes Partikel sein, was den Nachweis von Partikelagglomeraten in Agglusinationsassay vereinfacht.

2. Indirekter/kompetitiver Assay

Ein indirekter Agglutinationsassay kann konstruiert werden unter der Verwendung eines zusätzlichen Bindungsgliedes, welches mit dem Analyten um die Bindung an das Indikatorreagenz konkurriert. Eine solche Assaykonfiguration ist besonders nützlich bei der Analyse eines monovalenten Analyten. In diesem Assay sind mehr als ein zusätzliches Bindungsglied an ein unlösliches Material angeheftet und es werden mit dem Indikatorreagenz und der Testprobe in Kontakt gebracht. Falls der Analyt fehlt, oder unterhalb eines Grenzwertniveaus ist, tritt Agglutination, aufgrund der Bindung von mehr als eines Indikatorreagenz an das unlösliche Material, auf. Falls der Analyt in der Testprobe vorhanden ist, bindet der Analyt kompetitiv an das Indikatorreagenz, wodurch die Bindung des Indikatorreagenz an das unlösliche Material geblockt wird und das Vorhandensein des Analyten wird angezeigt durch eine Abnahme der Agglutination des Indikatorreagenz.

III. LYOPHILISIERTE Reagenzienzusammensetzungen

Die vorliegende Erfindung umfaßt die Einbettung eines Fangreagenz beschichteten Partikels oder Partikeln in einer Trägermatrix, welche vorteilhafterweise verwendet wird um die Reagenzienzusammensetzung in der Menge, die für einen einzelnen Assay verwendet wird, auszugeben. Vorzugsweise können das Trägermaterial und die eingekapselten Reagenzien lyophilisiert werden. Die lyophilisierte Reagenzienzusammensetzung wird rehydriert während der Durchführung des diagnostischen Assays, wodurch das Assayreagenz oder die Reagenzien frei gesetzt werden können. Die Assayreagenzien können in die Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheit eingeschlossen sein um zahlreiche Nachweis- oder Meßformate herzustellen einschließlich Sandwichassays, kompetitive Assays und Agglutinationsassays in welchen alle oder die meisten der Reagenzien, die notwendig sind für den Assay, vorzugsweise durch die Trägermatrix enthalten sind. Die Lyophilisation der Reagenzienzusammensetzung ist nicht kritisch für die vorliegende Erfindung, aber es wurde nachgewiesen daß sie eine verlängerte Stabilität der Reagenzienbewirkt und daß sie den Umgang und das Abfüllen der Reagenzienzusammensetzungen erleichtert. Die neuartigen Reagenzienzusammensetzungen können in diagnostischen Instrumenten, anstelle von multiplen flüssigen Reagenzien, oder mit manuellen Assayvorrichtungen verwendet werden, was einen einzelnen Zusatz von Assayreagenzien durch den Anwender gestattet ohne die Notwendigkeit des Abmessens von Reagenzien.
Die Trägermatrix kann jede Substanz umfassen, die in der Lage ist mit einem oder mehreren spezifischen Bindungsassayreagenzien bestückt zu werden. In einer Ausführung ist die Trägermatrix ein verformbares Material welches den Einsatz von individuellen geformten Höhlungen zur Bildung von getrennten geformten Einheiten gestattet, welche Bruchteile der Reagenzien enthalten, die ausreichend sind für einen einzelnen Assay. Alternativ erlaubt die Trägermatrix die Bildung von Blättern oder ähnlichen Massen, die entfernt werden können aus einer einzelnen geformten Höhlung, welche dann in Verwendungsheitenblöcke oder Einschübe geteilt oder getrennt werden können. In jedem Fall können die Einheiten dann lyophilisiert werden, mit der folgenden Bildung einer getrockneten Reagenzienzusammensetzung mit einer hohen strukturellen Integrität. In einer weiteren Ausführung kann die Trägermatrix verwendet werden, um eine geeignet Menge an Assayreagenz auf ein latzförmiges Material, welches ein Teil einer Assayvorrichtung ist, zu beschichten oder auszulegen. Beispielsweise kann ein Indikatorreagenz in einer Trägermatrix auf einen porösen Filter aufgetragen werden, wodurch das Reagenz umschlossen ist. Der Zusatz einer flüssigen Testprobe zu den porösen Filter wird das Assayreagenz aus der Trägermatrix, für die Reaktion mit der Testprobe oder anderen Assayreagenzien, frei setzen. In einer weiteren Ausführung kann das so freigesetzte Assayreagenz ebenfalls aus dem latzförmigen Material zu einem anderen Anteil der Assayvorrichtung wandern.
Geeignete Materialien für die Trägermatrix sind gewählt aus Substanzen, welche beim Zusatz einer Testprobe oder eines anderen geeigneten Lösungsmittel rehydriert werden, aber welche, hinsichtlich der Assayreagenzien inert sind und welche getrocknet oder lyophilisiert werden können. Am besten ist wenn die Trägermatrix schnell rehydriert und sich auflöst wenn sie in Kontakt mit dem Lösungsmittel kommt, wodurch jegliche Assayreagenzien, die darin enthalten sind freigesetzt werden. Die aufgelöste Trägermatrix kann dann weggewaschen werden am Ende der Inkubationszeit des Assays.
Gelatine erwies sich als das am meisten bevorzugte Trägermatrixmaterial. Gelatinequellen umfassen Kalbshautgelatine und Schweinehautgelatine von zahlreichen "Blooms" (z. B. die Bloomszahl ist ein Anzeiger für die Stärke der erzeugten Gele, wobei je höher die Bloomszahl desto stärker das Gel). Fischgelatine und Gemüsegelatinen können ebenfalls verwendet werden. Assayreagenzien werden leicht mit Gelatinelösung gemischt und die gekühlte Gelatine formt eine gelierte Masse welche leicht verformbar ist. Die Einheiten der Gelatine eingekapselten Reagenzienzusammensetzungen können liophylisiert werden mit der daraus folgenden Bildung eines getrockneten Proteins mit einer hohen Integrität. Die liophylisierte Gelatine wird bei Kontakt mit einem Lösungsmittel schnell rehydrieren und sich auflösen, was jegliche enthaltene Reagenzien freisetzt, und die Gelatine kann dann abgewaschen werden.
Die Testprobe kann abgeleitet sein aus jeglicher Quelle, so wie eine physiologische Flüssigkeit, einschließlich Blut, Speichel, Augenlinsenflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Urin, Milch, Ascitesflüssigkeit, Schleim, Synovialflüssigkeit, peritonealflüssigkeit, Fruchtwasser, und ähnliches. Die Flüssigkeit kann vor Verwendung behandelt werden, so wie beim Herstellen von Plasma aus Blut, das Verdünnen viskoser Flüssigkeiten oder ähnliches; Behandlungsverfahren können Filtration, Destillation, Konzentration, Inaktivierung von störenden Bestandteilen, und Zusatz von Reagenzien sowie zusätzliche Lösungsmittel, umfassen. Abgesehen von physiologischen Flüssigkeiten können andere flüssige Proben verwendet werden, sowie Wasser, Nahrungsprodukte und ähnliches. Zusätzlich kann ein Feststoff verwendet werden, sobald das Probematerial verändert worden ist um ein flüssiges Medium zu bilden.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das Fangreagenz an einer Vielzahl von Partikeln, z. B. Mikropartikeln angeheftet, welche als das Festphasenmaterial dienen. Die Partikel können von jemand der im Fachgebiet bewandert ist ausgewählt werden, aus jedem geeigneten Typ von partikelförmigen Material, einschließlich, aber nicht beschränkt auf jene bestehend aus Polystyrol, Polyacrylamid, Polyurethan, Polymethylacrylat, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Polyacrylnitril, Polycarbonat oder ähnliche Materialien. In einer Ausführung können die Partikel aus einem magnetischen oder magnetisierbaren Material sein oder es enthalten, wodurch die Partikel aus einem Reaktionsgemisch entfernt werden können durch die Anwendung eines magnetischen Feldes.
Die mit Fangreagenz beschichteten Partikel werden in die Trägermatrix, welche dann lyophilisiert werden kann, eingekapselt. Die lyophilisierte Reagenzienzusammensetzung wird während der Durchführung des Assays wiederhergestellt, und die Trägermatrix setzt die Fangreagenz beschichteten Partikeln zur Reaktion mit dem Analyten und dem Indikatorreagenz frei. Die Partikeln können dann von der Testlösung getrennt werden. Zum Beispiel können die Partikeln von der Testlösung durch Zentrifugieren, Ausfällen, Agglutination, die Anwendung eines magnetischen Feldes, Filtration oder einfangen durch Mittel eines zusätzlichen feste Phase Basismaterials, getrennt werden. Ein geeignetes feste Phase Basismaterial kann jegliches poröses absorbierendes oder lätzchenförmiges Material sein welches zur Beobachtung in der Lage ist die Partikel aus der Testlösung zu trennen. Bevorzugte feste Phase Basismaterialien umfassen Fiberglas, Zellulose oder Nylonkissen durch welche die Testlösung und die ungebundenen Reagenzien fliesen. Die Größe der Partikeln ist nicht kritisch, allerdings wird bevorzugt daß der mittlere Durchmesser kleiner ist als die mittlere Porengröße des feste Phase Basismaterials.
In einer alternativen Ausführung ist das Fangreagenz auf einem einzigen Partikel, wie eine viertel Zoll-Kugel, immobilisiert. In diesem Fall kann der Assay in einem Reaktionsgefäß wie eine Kuvette, Mikrotiterplatte, oder Glas- oder Plastikteströhrchen aus welchen die Testlösung, ungebundene Reagenzien und Waschlösungen entfernt werden können, durchgeführt werden.
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das Indikatorreagenz wie auch das Fangreagenz beschichtete Partikel in der Trägermatrix eingekapselt. Der Einschluß eines Zuckeradditives hat nachweislich die Eigenschaft das Indikatorreagenz während des Lyophilisationsvorganges zu schützen und die Stabilitätscharakteristika- der Indikatorreagenzmarkierungsstoffkomponente zu verbessern. Beispielsweise wurde herausgefunden das d-Trehalosedihydrat die beste Stabilisierungsreaktion für Enzymmarkierungsstoffe liefert. Andere Zucker, welche vorteilhaft verwendet werden können in der Herstellung der Reagenzienzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen Dextran, Laktose, Saccharose, Maltose, Xylose, Arabitol und Xylitol. Vorzugsweise ist das Zuckeradditiv in der endgültigen Zusammensetzung, mit einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 50% vorhanden. Noch mehr vorzuziehen ist das Zuckeradditiv vorhanden in einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 20%.
Wie oben beschrieben können unterschiedliche Formen verwendet werden, um die gewünschte Trägermatrixeinheit zu bilden. Obwohl es keine Notwendigkeit ist kann die Form vorbehandelt werden mit einem Freisetzungsmittel um die Entfernung der neu gebildeten Reaktionszusammensetzungseinheiten zu erleichtern. Die Vorbehandlung der Formen der vorliegenden Erfindung wurde üblicherweise durch beschichten oder leichtes einsprühen der Oberfläche der Form, mit Lezithin durchgeführt.
Die Reagenzienzusammensetzungen in Verwendungseinheit können luftgetrocknet oder lyophilisiert werden. Die Details der unterschiedlichen Lyophilisationsverfahren sind jenen die im Fachgebiet bewandert sind, gut bekannt. Im allgemeinen sollte das zu lyophilisierende Material unter die eutektische Temperatur dieses Materials gebracht werden bevor Unterdruck angelegt wird. Für wässerige Materialien stellt eine Temperatur von weniger als -40ºC ein adäquates Einfrieren sicher. Dies kann durch das Einbringen der Vorrichtung in Trockeneis, das Eintauchen der Vorrichtung in ein Trockeneis-Acetonbad oder durch das Einbringen der Vorrichtung auf frierende Oberflächen, die verfügbar sind in vielen kommerziellen gefriertrocknenden Vorrichtungen, erreicht werden. Das auf das Material angewendete Vakuum sollte ausreichend sein, um das Entfernen von Wasser durch Sublimation zu sichern.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele zeigen wie die neuartigen Reagenzienzusammensetzungen, der vorliegenden Erfindung herzustellen sind und wie Assayprozeduren durchzuführen sind, die solche Reagenzienzusammensetzungen verwenden. Die Beispiele sollen jedoch nur erläuternd sein und zielen nicht darauf ab, Einschränkungen auf die Reichweite der Erfindung zu setzen, deren Reichweite allein durch die angefügten Ansprüche definiert ist.

Beispiel 1

Herstellung einer lyophilisierten Reagenzienzusammensetzung für einen carcinoembryonischen Antigen (CEA) Enzymimmunoassay

a) Herstellung der Assayreagenzien

Zehn Gramm d-Trehalosedihydrat (Aldrich, Milwaukee, WI) und zwei Gramm Kalbshautgelatine (60 Bloom, Sigma, St. Louis, MO) wurden in destilliertem Wasser (ca. 10 mL) in einer 50 mL graduierten Plastikzentrifugenröhre zusammengefügt. Das Volumen wurde auf etwa 30 mL mit destilliertem Wasser aufgefüllt und die Mischung wurde durch Umrühren gemischt. Die Mischung wurde erhitzt in dem die Röhre in einen mit Wasser gefülltes Becher gesetzt wurde, der sich auf einer heißen Platte befand. Das Wasser wurde zum Kochen gebracht. Die Röhre wurde entfernt und das Volumen der Lösung wurde auf 50 mL mit destilliertem Wasser und weiterem Umrühren aufgefüllt. Die entstehenden 4% Gelatine, 20% Trehaloselösung wurde später eins zu eins Volumenpart mit dem Testreagenz gemischt.
Fangreagenz beschichtete Partikeln umfaßten eine Mikropartikel feste Phase aus Cyanbromid-aktivierter Sepharose® 4B (Sigma) mit anti-CEA murine monoklonalen Antikörper (2 mg/mL) beschichtet. Die Fangreagenz beschichteten Partikel wurden zu 5% in einem Probenlösungspuffer suspendiert[SDB; Tris-(hydroxymethyl)aminomethan Puffer (Tris) welcher Gentamicin als Konservierungsstoff enthielt]. Das Indikatorreagenz war ein Konjugat aus anti-CEA Antikörper (muriner monoklonal) und Meerrettichperoxidase (HRPO) (150 ng/mL).
Eine Reagenzmischung wurde durch das kombinieren gleicher Volumina der suspendierten Fangreagenz beschichteten Partikel und des Indikatorreagenz gebildet (1004 Indikatorreagenz für jede 100 ul Fangreagenz beschichtete Partikel in SDB). Die Reagenzmischung wurde dann kombiniert mit einem gleichen Volumen der Trägermatrixlösung (20 ul Gelatinelösung für jeweils 100 ul Indikatorreagenz und 100 ul Fangreagenz beschichtete Partikel in SDB) um die Reagenzienzusammensetzung zu bilden.

b) Lyophilisation der Reagenzienzusammensetzung

Die Trägermatrixform war eine 1/4" dicke Plastikplatte mit einzelnen 3/8" Aushöhlungen. Die Form wurde leicht eingesprüht mit Lezithin um das Entfernen der Reagenzienzusammensetzungseinheiten zu erleichtern.
Ein Teil der Reagenzienzusammensetzung (40 ul) wurde in jede Formaushöhlung unter Verwendung einer Precisionspipette eingegeben. Die Form wurde über ca. drei Stunden einer Temperatur von -70ºC in einem Gefrierschrank ausgesetzt. Die Formen wurden dann in -50ºC Gefrierschrankregale übergeführt wo sie 3.5 Stunden lang unter einem Vakuum aufbewart wurden. Die Regaltemperatur wurde dann auf -35ºC erhöht und 16 Stunden lang erhalten. Der lyopholisationszyklus wurde durch Sublimation bei einer Regaltemperatur von -10ºC über fünf Stunden, gefolgt durch eine Regaltemperatur von +30ºC über 18 Stunden, abgeschlossen. Die lyophilisierten Reagenzienzusammensetzungseinheiten wurden aus der Form entfernt und in Glasgefäßen mit Silicagel- Trocknungsmittel gelagert. Die Lagerung bei 4ºC sicherte eine verlängerte Stabilität. Die Reagenzienzusammensetzungen, die bei Raumtemperatur gelagert wurden, zeigten jedoch eine stabile Leistung mit geringen Leistungsunterschiede verglichen mit jener von Reagenzienzusammensetzungen, die bei 4ºC gelagert wurden, und mit einer besseren Leistung als flüssige Kontroll-Reagenzienzusammensetzungen.

c) Akzeptierbarkeit der lyophilisierten Reagenzienzusammensetzung in dem CEA-Assay

Eine Einheit der lyophilisierten Reagenzienzusammensetzung wurde in einem gefilterten Reaktionsgefäß platziert, welches bei einer Temperatur von 40ºC gehalten, und während der Inkubation rotieren werden konnte um die Kinetik des Assays zu verbessern. Die lyophilisierte Reagenzienzusammensetzung wurde mit einer Testprobe oder CEA-Assay Standardlösung in dem Reaktionsgefäß kombiniert. Die CEA-Standards umfaßten Proben von 0, 4, 24, 44 und 84 Nanogramm Antigen pro Milliliter Trispuffer. Die Testproben, oder Standards, und die lyophilisierte Reagenzienzusammensetzung wurden bei 40ºC unter Rühren 20 Minuten lang inkubiert. Falls CEA vorhanden war wurde ein Fangreagenz/Antigen/Indikatorreagenz-Komplex, während der Inkubationszeit gebildet. Nach der Inkubation wurde das ungebundene Indikatorreagenz aus dem Reaktionsgefäß mit 0,9% Natriumchloridlösung oder Phosphatsalz Pufferlösung gewaschen; ein Volumen von drei Milliliter an Waschlösung wurde durch das Reaktionsgefäß gezogen, und dieser Vorgang wurde neun mal wiederholt.
Die Leistung der Reagenzienzusammensetzung wurde gemessen, in dem die Menge von Fangreagenz/Antigen/Indikatorreagenkomplex, die während der Inkubation gebildet wurde, nachgewiesen wurde. Je mehr Antigen in der Testprobe vorhanden war, desto mehr dreifacher Komplex wurde gebildet, und daher war die Menge von Indikatorreagenz die im Reaktionsgefäß zurückbehalten wurde umso größer. Tetramethylbenzidin (TMB) wurde als das farbproduzierende Substrat verwendet mit welchen das HRPO des Indikatorreagenz reagieren würde. Dreihundert Mikroliter des TMB Substrat wurden in jedes Reaktionsgefäß eingegeben. Die Reaktionsgefäße wurden acht Minuten bei 40ºC unter Rühren inkubiert. Eine blaue Farbe wurde in Anwesenheit von HRPO erzeugt, z. B. in jenen Proben welche einen Fangreagenz/Antigen/Indikatorreagenzkomplex gebildet hatten. Die Farbentwicklung wurde mit dem Zusatz von Schwefelsäure (1 mL, 1 N H&sub2;SO&sub4;) vermindert, und die Farbentwicklung wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers (450 nm) abgelesen. Die Farbmessungen zeigten, daß als die Menge von Analyt in der Testprobe stieg, die Menge von an das Fangreagenz gebundenem Indikatorreagenz ebenfalls erhöhte, wie durch eine Erhöhung der Lichtabsorption dargestellt wird. Es wurde herausgefunden daß das nachweisbare Signal für sowohl die lyophilisierten Reagenzienzusammensetzungen wie auch für die nicht lyophilisierten Reagenzien im wesentlichen das gleiche war, was anzeigt, daß keine wesentlichen Veränderungen der Reagenzien auftrat während des Lyophilisationsvorganges.

Beispiel 2

Lyophilisierte Reagenzienzusammensetzung

Eine lyophilisierte Reagenzienzusammensetzung wurde im wesentlichen gemäß dem Protokoll von Beispiel 1 oberhalb hergestellt, mit der Ausnahme, das eine einzelne Polystyrolkugel anstelle der Mikropartikel verwendet wurde. Die geformten Reagenzienzusammensetzungen wurden geformt in dem eine einzelne Fangreagenz beschichtete Polystyrolkugel in jede Formhöhlung eingefügt wurde, gefolgt durch den Zusatz des Fangreagenz und der Gelatinelösung. Ein CEA-Assay wurde, in wesentlichen gemäß dem Protokoll von Beispiel 1 durchgeführt, und es wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.
Die Assayergebnisse sind in Tabelle 1, welche die CEA- Konzentration in den Proben mit der Menge der entwickelten Farbe vergleicht, gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß als die Menge von Analyt in der Probe erhöht wurde, die Menge von an die Fangreagenz beschichtete Kugel gebundenem Indikatorreagenz ebenfalls stieg, wie durch eine Erhöhung der Lichtabsorption gezeigt. TABELLE 1 Polystyrenkugel feste Phase

Beispiel 3

Herstellung einer lyophilisierten Reagenzienzusammensetzung für ein humanes Choriongonadotropin (hCG) Enzymimmunoassay

a) Herstellung der Assayreagenzien

Einhundert Mikroliter Konjugat (anti-hCG Antikörper/m- Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) wurde mit einem gleichen Volumen Matrixlösung, welche 0,5% Gelatine und 6% Saccharose enthielt, im wesentlichen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren in Beispiel 1a hergestellt, gemischt.

b) Lyophilisation der Reagenzienzusammensetzung

Ein Teil der Reagenzienzusammensetzung (40 ul) wurde auf ein poröses Filtermaterial unter Verwendung einer Precisionspipette gegeben. Der Filter wurde über etwa zwei Stunden einer Temperatur von -70ºC in einem Gefrierschrank ausgesetzt. Die Einheiten wurden dann auf -44ºC Gefrierschrankregale übergeführt, wo sie über eine Stunde unter Vakuum gehalten wurde. Die Regaltemperatur wurde dann erhöht auf -20ºC und zwei Stunden lang erhalten. Der Lyophilisationszyklus wurde durch Sublimation bei einer Regaltemperatur von 0ºC über etwa 12 Stunden, gefolgt von einer Regaltemperatur von +30ºC für etwa eine Stunde, abgeschlossen. Die lyophilisierten Reagenzienzusammensetzungeinheiten wurden aus der Form entfernt und bei Raumtemperatur in Glasgefäßen mit Silicagel- Trocknungsmittel gelagert.

c) Akzeptierbarkeit der lyophilisierten Reagenzienzusammensetzung in dem hCG-Assay

Eine hCG-Assaystandardlösung wurde mit der lyophilisierten Reagenzienzusammensetzung welche ein poröses Kissen bedeckte, welches immobilisierten anti-hCG Antikörper enthielt, in Kontakt gebracht. Die hCG-Standards umfaßten Proben von 0 und 100 Nanogramm Antigen pro Milliliter Trispuffer. Die Testproben, oder Standards, und die Assayreagenzien wurden 90 Sekunden lang inkubiert. Der Inkubation folgte die Entfernung des lyophilisierten Reagenzienzusammensetzungsfilters und das Waschen des porösen Kissens. Eine Chromagenlösung von entweder 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (0,5 mg/mL in Trispuffer) oder Nitro-blautetrazolium (0,2 mg/mL in Trispuffer) wurde dann mit dem porösen Kissen in Kontakt gebracht. Falls hCG vorhanden war wurde während der Inkubationszeit ein Fangreagenz/Antigen/Indikatorreagenz-Komplex gebildet, und der Zusatz des Chromagen führte zu der Erzeugung eines visuell nachweisbaren gefärbten Reaktionsproduktes.

Beispiel 4

Stabilität der lyophilisierten Reagenzienzusammensetzung

a) Herstellung der Assayreagenzien

Eine Matrixlösung wurde im wesentlichen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren in Beispiel 1a hergestellt. Anti-hCG Antikörper/Alkaliphosphat-Konjugat (200 mL) wurde mit Gelatine (2,3 mL), Dextran (4 g) und Saccharose (4 g) kombiniert.

b) Lyophilisation der Reagenzienzusammensetzung

Die lyophilisierten Reagenzienzusammensetzungseinheiten wurden im wesentlichen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren in Beispiel 3b hergestellt. Die Einheiten wurden Hitzestreßbedingungen von 45ºC über eine Gesamtdauer von 111 Tagen ausgesetzt.

Die Assays wurden, unter Verwendung der lyophilisierten Reagenzienzusammensetzungseinheiten, im wesentlichen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren in Beispiel 3c, durchgeführt. Die Ergebnisse der durchgeführten Assays während des Belastungszeitraums (Tage 3, 7, 17, 21, 28 und 111) lieferten im wesentlichen identische Resultate bei der Produktion eines visuell nachweisbaren Signals bei Vorhandensein des Analyten.
Die Konzepte der vorliegenden Erfindung sind auf zahlreiche Typen von Bindungsassays anwendbar. Es wird jedoch angenommen, daß jemand der im Fachgebiet bewandert ist andere Assays erdenken kann, einschließlich Assays für Analyte, die keine Antigene oder Antikörper sind, auf welche die vorliegenden erfinderischen Konzepte angewendet werden können. Die beschriebenen Ausführungen und die dargestellten alternativen Ausführungen sind als Beispiele gedacht und nicht als Einschränkungen.

Claims

1. Eine Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheitsform für einen spezifischen Bindungsassay, die folgendes umfaßt:

a) mindestens eine mit Fangreagenz beschichtete Partikel, wobei das Fangreagenz ein spezifisch bindendes Glied ist, in einer für einen einzelnen Bindungsassay ausreichenden Menge; und

b) eine formbare Trägermatrix,

wobei die Trägermatrix getrocknet ist, wodurch die mit Fangreagenz beschichtete Partikel stabilisiert wird, und

wobei die Trägermatrix durch Kontakt mit einem Lösungsmittel rekonstituiert wird, wodurch die mit Fangreagenz beschichtete Partikel für eine spezifische Bindungsreaktion freigesetzt wird.

2. Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Fangreagenz für eine Substanz spezifisch ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus einem Analyten wie in einem Sandwichassay, einem Indikatorreagenz wie in einem kompetitiven Assay und einem zusätzlichen spezifischen Bindungsglied wie in einem indirekten Assay besteht.

3. Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die formbare Trägermatrix eine Gelatine ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Kalbshautgelatine, Fischgelatine, Schweinehautgelatine und pflanzlichen Gelatinen besteht.

4. Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 1, die weiterhin ein Indikatorreagenz umfaßt, das ein spezifisches Bindungsglied enthält, das an einen Markierungsstoff angebunden ist.

5. Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 4, die weiterhin einen Stabilisator für das Indikatorreagenz umfaßt.

6. Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei der Stabilisator ein Zucker ist.

7. Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei der Zucker in einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 50% vorhanden ist.

8. Reagenzienzusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei der Zucker aus der Gruppe gewählt ist, die aus Trehalose, Dextran, Lactose, Maltose, Xylose, Arabitol, Xylitol und Saccharose besteht.

9. Verfahren zur Bildung einer Reagenzienzusammensetzung für einen spezifischen Bindungsassay, das folgendes umfaßt:

a) das Kombinieren mindestens einer mit Fangreagenz beschichteten Partikel mit einer formbaren Trägermatrix, um eine Mischung zu bilden, wobei das Fangreagenz ein spezifisches Bindungsglied umfaßt, das an eine Partikel angebunden ist;

b) das Dispergieren eines Teils der Mischung in einer Formhöhlung;

c) das Abkühlen der Mischung, um eine Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheitsform zu bilden; und

d) das Lyophilisieren der Verwendungseinheits- Reagenzienzusammensetzung, wobei die Zusammensetzung bei Kontakt mit einem Lösungsmittel rehydratisiert, wodurch die mit Fangreagenz beschichtete Partikel frei gesetzt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, das weiterhin das Kombinieren eines Indikatorreagenz mit der mit Fangreagenz beschichteten Partikel und der formbaren Trägermatrix vor dem Einbringen eines Teiles der geschmolzenen Mischung in die Formhöhlung umfaßt.

11. Verfahren zur Bildung einer Reagenzienzusammensetzung für einen spezifischen Bindungsassay, der ein Indikatorreagenz und eine formbare Trägermatrix umfaßt, das folgende Schritte umfaßt:

a) Kombinieren eines Indikatorreagenz mit einer formbaren Trägermatrix, um eine Mischung zu bilden, wobei das Indikatorreagenz ein spezifisches Bindungsglied umfaßt, das an einen Markierungsstoff angebunden ist;

b) Dispergieren eines Teiles der Mischung in eine Formhöhlung;

c) Abkühlen der Mischung, um eine Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheitsform zu bilden; und

d) Lyophilisieren der Reagenzienzusammensetzung in Verbindungseinheitsform, wobei die Zusammensetzung bei Kontakt mit einem Lösungsmittel rehydratisiert, wodurch das Indikatorreagenz für eine spezifische Bindungsreaktion freigesetzt wird.

12. Verfahren gemäß den Ansprüchen 10 oder 11, das weiterhin das Kombinieren eines Stabilisators mit dem Indikatorreagenz umfaßt.

13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die formbare Trägermatrix eine Gelatine ist.

14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gelatine aus der Gruppe gewählt ist, die aus Kalbshautgelatine, Fischgelatine, Schweinehautgelatine und Pflanzengelatinen besteht.

15. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das weiterhin den Zusatz eines Zuckers als Stabilisator umfaßt, wobei der Zucker aus der Gruppe gewählt ist, die aus Trehalose, Dextran, Lactose, Maltose, Xylose, Arabitol, Xylitol und Saccharose besteht.

16. Verwendung einer Reagenzienzusammensetzung in Verwendungseinheitsform zum Durchführen eines spezifischen Bindungsassays, wobei die Zusammensetzung folgendes umfaßt:

a) mindestens eine mit Fangreagenz beschichtete Partikel, wobei das Fangreagenz ein spezifisches Bindungsglied in einer für einen einzelnen Bindungsassay ausreichenden Menge ist; und

b) eine formbare Trägermatrix,

wobei die Trägermatrix bei Kontakt mit einem Lösungsmittel rekonstituiert wird, wodurch die mit Fangreagenz beschichtete Partikel für eine spezifische Bindungsreaktion freigesetzt wird.