DE69229436T2

DE69229436T2 - Verwendung von somatostatinanalogen zur behandlung von melanomen

Info

Publication number: DE69229436T2
Application number: DE69229436T
Authority: DE
Inventors: Arthur Bogden; Jacques-Pierre Moreau
Original assignee: Ipsen Bioscience Inc
Current assignee: Ipsen Bioscience Inc
Priority date: 1991-02-08
Filing date: 1992-02-07
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2012-02-08
Also published as: ES2134798T3; GR3030856T3; DK0542934T3; US6087337A; ATE181240T1; JPH05506254A; IE920416A1; CA2079896A1; PT100111A; PT100111B; WO1992013554A1; EP0542934A4; EP0542934A1; EP0542934B1; DE69229436D1

Description

Diese Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung von Somatostatin und Somatostatinanalogpeptiden.
Somatostatin ist ein natürlich vorkommendes Tetradecapeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:
H-Ala¹-Gly²-Cys³-Lys&sup4;-Asn&sup5;-Phe&sup6;-Phe&sup7;- Trp&sup8;-Lys&sup9;-Thr¹&sup0;-Phe¹¹-Thr¹²-Ser¹³-Cys¹&sup4;-OH.
Eine Reihe von Somatostatinanalogen wurde in der Literatur und in Patenten beschrieben, einschließlich Analogen, die weniger als die natürlich vorkommenden vierzehn Aminosäuren enthalten. Zum Beispiel beschreibt Coy et ab, U. S. Patent Nr. 4,853,371, das hierin durch Bezugnahme eingebracht wird, Octapeptide mit NH&sub2; am C-Terminus und D-Trp an Position 4:
A¹-Cys-A³-D-Trp-A&sup5;-A&sup6;-Cys-A&sup8;-NH&sub2;
Eine bevorzugte Verbindung hat D-β-Naphthylalanin (D-β-Nal) an Position 1 und/oder 3; Tyr an Position 3 und Val an Position 6. (Wenn hierin keine Bezeichnung der Konfiguration angeführt ist, ist das L-Isomer gemeint). Die PCT Anmeldung, veröffentlicht als WO91/09056, offenbart Octapeptidanaloge von Somatostatin mit einer besonderen Formel, einschließlich Threonin an der sechsten Position, zur Verabreichung an Säugetiere.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Anmelder haben entdeckt, daß gutartige und bösartige wuchernde Hauterkrankungen, z. B. Melanome und bösartige Hautmetastasen von Melanomen, Somatostatinrezeptoren exprimieren.
Daher sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Somatostatinanalogs, das sechs oder mehr Aminosäure enthält, in der Zubereitung eines Mittels zur topischen Verabreichung in der Behandlung gutartiger oder bösartiger Melanome oder Metastasen von Melanomen vor, unter der Bedingung, daß das Somatostatinanalog weder eine Verbindung der in Anspruch 1 angeführten Formel noch ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist, und keine Verbindung der Formel
D-βNal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH&sub2;
oder
D-βNal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH&sub2;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
Die Verabreichung erfolgt an ein Säugetier (z. B. einen Menschen), das an solchen wuchernden Hauterkrankungen leidet.
Das Analog kann in dem Träger in einer Konzentration von z. B. mindestens 10 mg/ml vorhanden sein. Das Analog kann wiederholt auf die erkrankte Haut aufgetragen werden, um eine ungefähre Dosierung von 125 ug/cm² Haut/ Tag zu erreichen.
Die Somatostatinanaloge haben vorzugsweise eine Sequenz von vier oder mehr Aminosäuren, die mindestens 20% Homologie mit der Kernregion von Somatostatin aufweisen. Die Kernregion besteht aus den Aminosäuren an Position 7, 8, 9 und 10 der oben gezeigten, natürlich vorkommenden Somatostatinsequenz. Insbesondere haben die Somatostatinanaloge eine Sequenz von sechs oder sieben Aminosäuren, mit mindestens 20%, besonders bevorzugt, mindestens 50%, Homologie mit der Kernregion von Somatostatin. Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff "Somatostatinanalog" natürlich vorkommendes Somatostatin mit 14 Aminosäuren, wie zuvor unter "Hintergrund der Erfindung" angegeben wurde.
Eine Klasse von Somatostatinanalogen, die in dem Therapieverfahren der Erfindung für wuchernde Hauterkrankungen geeignet ist, enthält Octapeptide der Formel:
wobei A&sub1; D-Phe, N-Ac-D-hArg(Et)&sub2;-Gly, D-β-Nal, oder
ist, wobei Z&sub1; und Z&sub2; jeweils unabhängig H, C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkyl, C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;-Phenylalkyl, R&sub1;CO (wobei R&sub1; C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl, C&sub3;&submin;&sub2;&sub0;-Alkenyl, C&sub3;&submin;&sub2;&sub0;-Alkinyl, Phenyl, Naphthyl oder C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;- Phenylalkyl ist), oder R&sub2;OCO (wobei R&sub2; C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl oder C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;-Phenylalkyl ist) ist, vorausgesetzt, daß wenn eines von Z&sub1; oder Z&sub2; R&sub1;CO oder R&sub2;OCO ist, das andere H sein muß;
Z&sub3; CH&sub2;-Z&sub4; ist (wobei Z&sub4; Pentafluorophenyl, Naphthyl, Pyridyl, Phenyl oder o-, m- oder insbesondere p-substituiertes Phenyl ist, wobei der Substituent ein Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH oder C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl ist);
A&sub3; Phe, o-, m- oder insbesondere p-substituiertes X-Phe (wobei X ein Halogen, H, NH&sub2;, NO&sub2;, OH oder C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl ist), Pentafluoro-Phe, β-Nal, Tyr oder Thr ist;
A&sub6; Thr, Ser, Phe, Val, α-Aminobuttersäure oder Ile ist, vorausgesetzt, daß wenn Z&sub4; Phenyl ist, Z&sub1; H ist und Z&sub2; H ist, A&sub6; nicht Val sein kann; und
A&sub8; Thr-NH&sub2;, Trp-NH&sub2;, L-β-Nal-NH&sub2; oder Thr(ol) ist (wobei Thr(ol) NHCH(CH&sub2;OH)CHOHCH&sub3; ist); oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbares Salz" betrifft ein Salz, das die gewünschte biologische Aktivität der Stammverbindung beibehält und keine unerwünschten toxikologischen Wirkungen verleiht, z. B. ein Säure- oder Basenadditionssalz. Der Begriff "hArg" betrifft Homoarginyl.
In der oben angeführten Formel I ist die Konfiguration des Moleküls an dem Kohlenstoffatom, an welches 23 gebunden ist, nicht angegeben, um anzuzeigen, daß der Aminosäurerest, von welchem 23 ein Substituent ist, die D- oder L-Konfiguration aufweisen kann.
Wie in Formel I dargestellt ist, haben die Octapeptidsomatostatinanaloge, die in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, vorzugsweise D-Trp an Position 4.
Bevorzugte Verbindungen der obengenannten Formel I umfassen D-β-Nal-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-β-Nal-NH&sub2;; D-Phe-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-α-Aminobuttersäure-Cys-Thr-NH&sub2;; Pentafluoro-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-Thr-NH&sub2;; N-Ac-D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;; D-β-Nal-Cys-Pentafluoro-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;; D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-β-Nal-NH&sub2;; D-Phe-Cys-β-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;; D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-α-Aminobuttersäure-Cys-Thr-NH&sub2;; D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-a-Aminobuttersäure-Cys-Thr-NH&sub2;; und Acetyl-D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-α-Aminobuttersäure-Cys-Thr-NH&sub2;. Die Verbindungen, die einen aromatischen, lipophilen N-Terminus haben, weisen den weiteren Vorteil einer langanhaltenden in vivo Aktivität auf.
Andere bevorzugte Octapeptidsomatostatinanaloge innerhalb der Formel I, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind:
Andere Somatostatinanaloge, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind Hexapeptide, wie: Cyclo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe), von dem nachgewiesen wurde, daß es die biologischen Eigenschaften von Somatostatin aufweist; und Cyclo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Phe), das 50-100 mal stärker als natürlich vorkommendes Somatostatin in der Hemmung von Insulin, Glucagon und der Wachstumshormonfreisetzung ist.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung von Heptapeptidanalogen der Formel:
A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-Cys-A&sub7;-A&sub8;, (II)
wobei A&sub1;
oder
ist (wobei Q H oder eine C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe ist);
A&sub2; o-, m- oder p-substituiertes X-Phe oder X-D-Phe ist (wobei X H, ein Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy ist);
A&sub3; X-Trp, X-D-Trp, α-N-Methyl-X-Trp oder α-N-Methyl-D-X-Trp ist (wobei X ein Substituent auf dem Benzolring ist und H, ein Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy ist);
A&sub4; Lys, α-N-Methyl-Lys oder &epsi;-N-R&sub1;-Lys ist (wobei R&sub1; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist);
A&sub5; Val oder Thr ist;
A7 Pro oder
ist, wobei Z H oder CH&sub3; ist und T H, CH&sub2;OH, CH&sub2;CH&sub2;OH, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;OH, CH(CH&sub3;)OH, Isobutyl, Benzyl (substituiert in der o-, m- oder p-Position mit H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy), CH&sub2;-β-Naphthyl (substituiert am Benzolring mit H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy) oder CH&sub2;- Pyridyl (substituiert am Benzolring mit H, Halogen, NH&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;- Alkoxy) ist; und
A&sub8;
(wobei R&sub2; H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist), CH&sub2;OH, CH&sub2;OCR&sub3; (wobei R&sub3; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, C&sub8;- C&sub1;&sub2;-Aralkyl oder Phenoxy ist) oder
ist (wobei R&sub4; H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist und R&sub5; H, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Phenyl oder C&sub7;-C&sub1;&sub0;- Aralkyl ist); oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Weitere Octapeptidformeln, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind lineare Somatostatinanaloge:
wobei
A¹ ein D-Isomer von einem von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Met, Nle, Trp, β-Nal, o-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichloro-Phe oder Pentafluoro-Phe ist;
A² eines von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Met, Nle, Trp, β-Nal, o-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichloro-Phe oder Pentafluoro-Phe ist;
A³ eines von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Met, Nle, Trp, Tyr, β-Nal, o-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichloro-Phe oder Pentafluoro-Phe ist;
A&sup6; eines von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Lys, Met, Nle, Thr-R&sub4;, Trp, Ser-R&sub4;, β- Nal, o-X-Phe (wobei X CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X-Phe (wobei X CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichloro-Phe oder Pentafluoro-Phe ist;
A&sup7; eines von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Met, Nle, Trp, β-Nal, o-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichloro-Phe oder Pentafluoro-Phe ist;
A&sup8; ein D- oder L-Isomer von einem von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Ser-R&sub4;, Thr-R&sub4;, Val, Met, Nle, Trp, β-Nal, o-X-Phe (wobei X CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X- Phe (wobei X CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichloro-Phe oder Pentafluoro- Phe ist;
jedes von R&sub1; und R&sub2; unabhängig eines von H, niedrigerem Acyl, oder niedrigerem Alkyl ist; und R&sub3; H, NH&sub2; oder niedrigeres Alkyl ist; vorausgesetzt, daß mindestens eines von A¹ und A&sup8; eine aromatische Aminosäure sein muß; und weiters vorausgesetzt, daß, wenn eines von A² oder A&sup7; eine aromatische Aminosäure ist, A&sup8; keine aromatische Aminosäure sein kann; und weiters vorausgesetzt, daß R&sup4; nichts sein kann oder ein Kohlenhydrat sein kann, z. B. Cx(H&sub2;O)y, wobei x 1-18 und y 1-16 ist, verbunden durch die Hydroxylgruppe von Ser oder Thr; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Zur Verwendung wird eine therapeutisch wirksame Menge des Somatostatinanalogs auf die erkrankte Hautstelle aufgetragen oder wird mit einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz oder Excipient kombiniert, z. B. mit einer verteilbaren Creme, einem Gel, einer Lotion oder Salbe, zur Bildung einer therapeutischen Verbindung, die einen Transport des Analogs durch die Haut ermöglicht. Das Eindringen des Somatostatinanalogs in das erkrankte Gewebe kann durch eine Reihe von Methoden erreicht werden, die dem Durchschnittsfachmann in diesem Gebiet bekannt sind.
Zum Beispiel kann das Analog direkt oder mit einer Trägersubstanz vermischt aufgetragen werden und dann mechanisch in die Haut in einem befallenen Bereich eingerieben werden, so daß das Analog in die Haut eindringen kann. Das Analog kann auch in Liposomen enthalten sein, die mechanisch auf die erkrankte Haut aufgetragen werden. Ferner kann das Somatostatinanalog in einen transdermalen Flecken eingebracht werden, der auf die erkrankte Haut aufgelegt wird. Vorzugsweise kann das Eindringen, welches aus diesen Methoden resultiert, mit einem chemischen, perkutanen Abgabemittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder der nichtionischen oberflächenaktiven Substanz n-Decylmethylsulfoxid (NDMS) verstärkt werden, wie in Choi et al., Pharmaceutical Res., 7 (11): 1099-1106 (1990) beschrieben ist. Ferner kann das Eindringen des Somatostatinanalogs durch die Haut durch Iontophorese erfolgen, indem das Analog mit einer Trägersubstanz gemischt wird, die negative oder positive Ionen enthält, und die erhaltene therapeutische Verbindung in einen transdermalen Flecken eingebracht wird. Die therapeutische Zusammensetzung kann auch die Form einer biologisch abbaubaren Formulierung mit verzögerter Freisetzung zur topischen Verabreichung an der erkrankten Hautstelle aufweisen.
Die topische Behandlungsmethode der Erfindung stellt eine effektive Therapie für wuchernde Hauterkrankungen bereit, z. B. für Melanome und bösartige Hautmetastasen von Melanomen, bei hohen Dosierungen, wobei aber diese hohen Dosierungen keine signifikanten toxischen Nebenwirkungen verursachen.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsbeispiele und aus den Ansprüchen hervor.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Zunächst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.

Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Graphik, welche die Wirkung eines Somatostatinanalogs (in der Graphik als "BIM 23014C" bezeichnet) auf das Wachstum eines B16-F10 Melanoms zeigt.
Fig. 2 ist eine Serie von Photographien, die den Melanomwachstumsverlauf bei einer Maus, die mit BIM 23014C behandelt wurde, am Tag 4, 7 und 11 zeigt.
Fig. 3 ist eine Serie von Photographien, die den Melanomwachstumsverlauf bei einer Kontrollmaus am Tag 4, 7 und 11 zeigt.

Struktur

Geeignete Verbindungen zur Behandlung wuchernder Hauterkrankungen sind die Somatostatinanaloge, die unter "Zusammenfassung der Erfindung" beschrieben wurden. Beispiele bevorzugter Analoge umfassen die folgenden: D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- Thr-NH&sub2;; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH&sub2;; D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Thr(ol); D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;; und D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-β-Nal; ("Nal" bezeichnet Naphthylalanin).
Andere geeignete Somatostatinanaloge umfassen das natürlich vorkommende Tetra- Decapeptid-Somatostatin und die Analoge, die in Coy et al., U. S. Patent Nr. 4,904,642, 4,871,717 und 4,853,371; Freidinger et al., U. S. Patent Nr. 4,360,516 und 4,310,519; Nestor, EPA 0 363 589; und Bauer et al., U. S. Patent Nr. 4,395,403; beschrieben sind, die alle hierin durch Bezugnahme eingebracht werden.

Synthese

Es folgt die Synthese eines Octapeptid-Somatostatinanalogs. Andere Analoge können unter Durchführung geeigneter Modifizierungen, zu welchen ein Durchschnittsfachmann in diesem Gebiet fähig ist, des folgenden synthetischen Verfahrens hergestellt werden.
Der erste Schritt in der Herstellung von D-β-Naphthylalanin-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-Thr-NH&sub2; war die Herstellung des Tert-Butyloxycarbonyl-D-β-Naphthylalanin-S- Methylbenzyl-Cys-Tyr-D-Trp-N&epsi;-Benzyloxycarbonyl-Lys-Val-S-Methyl-Benzyl-Cys-O- Benzyl-Thr-Benzyhydrylamininharzzwischenprodukts, wie folgt.
Benzhydrylamin-Polystyrolharz (Vega Biochemicals, Inc.) in Chloridionenform wurde in das Reaktionsgefäß eines Beckman 990B Peptidsynthetisiergeräts eingebracht, das zur Durchführung des folgenden Reaktionszyklus programmiert war: (a) Methylenchlorid; (b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2-mal jeweils über 1 und 25 Min.); (c) Methylenchlorid; (d) Ethanol; (e) Methylenchlorid; (f) 10% Triethylamin in Chloroform.
Das neutralisierte Harz wurde mit Boc-O-Benzyl-Threonin und Diisopropylcarbodiimid (jeweils 1,5 mmol) in Methylenchlorid 1 h gerührt und das erhaltene Aminosäurenharz wurde dann durch die Schritte (a) bis (f) in dem obengenannten Waschprogramm geleitet. Die folgenden Aminosäuren (1,5 mmol) wurden dann der Reihe nach durch dasselbe Verfahren gekoppelt: Boc-S-Methylbenzyl-Cys, Boc-Val, Boc-Ne-benzyloxycarbonyl-Lysin; Boc-D-Trp, Boc-Tyr, Boc-S-Methylbenzyl-Cys, Boc-D-β-Naphthylalanin.
Das Harz wurde gewaschen und getrocknet und dann mit Anisol (4 ml) und wasserfreiem Fluorwasserstoff (36 ml) bei 0ºC gemischt und 45 Min. gerührt (es kann auch Thioanisol, Trifluoressigsäure und Trifluoromethansulfonsäure in einem Verhältnis von 1 : 90 : 9 über 6 h verwendet werden). Überschüssiger Fluorwasserstoff wurde rasch unter einem trockenen Stickstoffstrom verdampft und freies Peptid ausgefällt und mit Ether gewaschen. Das rohe Peptid wurde dann in 800 ml 90% Essigsäure aufgelöst, wonach 12 in Methanol zugegeben wurde, bis eine permanente braune Farbe vorhanden war. Die Lösung wurde dann 1 h vor Entfernung des Lösemittels in vacuo gerührt. Das erhaltene Öl wurde in einem Minimalvolumen von 50% Essigsäure aufgelöst und auf einer Sephadex G-25 Säule (2,5 · 100 mm) eluiert. Fraktionen, die durch UV-Absorption und Dünnschichtchromatographie (TLC) eine Hauptkomponente enthielten, wurden dann vereinigt, auf ein kleines Volumen eingedampft und auf eine Whatman LRP-1 Octadecylsilan (15-20 um) Säule (2,5 · 50 cm) aufgebracht.
Die Säule wurde mit einem linearen 10-50% Acetonitril-Gradienten in 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser eluiert. Die Fraktionen wurden durch TLC und analytische Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) untersucht und vereinigt, um eine maximale Reinheit zu erhalten, und nach Wunsch wurde ein anderes Salz hergestellt, z. B. Acetat oder Phosphat. Die wiederholte Lyophilisierung der Lösung von Wasser ergab 170 mg des Produkts als weißes, lockeres Pulver.
Das Produkt erwies sich durch HPLC und TLC als homogen. Die Aminosäurenanalyse eines Säurehydrolysats bestätigte die Zusammensetzung des Octapeptids.
Die Octapeptide der Erfindung mit den Formeln Pentafluoro-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;, D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-α-Aminobuttersäure-Cys-Thr-NH&sub2;, N-Ac- D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;, D-β-Nal-Cys-Pentafluoro-Phe-D-Trp-Lys- Val-Cys-Thr-NH&sub2;, D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-β-Nal-NH&sub2;, D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-β-Nal-NH&sub2;, D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-α-Aminobuttersäure-Cys-Thr-NH&sub2;, D-p-Cl-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-α-Aminobuttersäure-Cys-Thr-NH&sub2;, und Acetyl-D-p-Cl-Phe- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-α-Aminobuttersäure-Cys-Thr-NH&sub2; wurden nach Verfahren hergestellt, die den zuvor beschriebenen analog sind. Ähnliche Verfahren können zur Synthese der Hexa-, Hepta- und anderen Octapeptide verwendet werden, die in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind. Ferner werden die synthetischen Verfahren in U. S. Patent Nr. 4,360,516, 4,310,518 und 4,395,403 offenbart, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Reaktion von intradermal implantierten B16-F10 Melanom-Xenograften auf topisch aufgetragenes Somatuline BIM-23014C:
Implantation des Melanoms: Achtzehn von BALB/c abstammenden, athymischen nackten weiblichen Mäusen wurde intradermal (ID), an der rechten Flanke, eine 0,02 bis 0,05 ml Suspension von in vitro vermehrten B16-F10 Melanomzellen, die in einer normalen Kochsalzlösung suspendiert waren, implantiert. Die Implantation erfolgte am Tag 0 mit einer Nadel der Stärke 23, die an einer 1,0 ml Spritze befestigt war. Ein derartiges intradermales Implantat des murinen B 16-F 10 Melanoms ist im wesentlichen orthotopisch und führt zu einem äußerst rasch wachsenden Tumor. Am Tag 2 war ein flaches melanotisches Wachstum an der Injektionsstelle erkennbar. Die Läsionen waren in situ Melanomen ähnlich.
Behandlung: Somatuline (D-β-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;, erhältlich von Biomeasure, Inc. unter der Produktkennzeichnung BIM-23014C) wurde zu 50% DMSO in Kochsalzlösung in einer Konzentration von 10 mg/ml zugegeben. Nach dem Abwischen der Haut mit einem Gazebausch, der mit Isopropylalkohol befeuchtet war, wurde ein Tropfen (etwa 0,05 ml) der Somatuline-Lösung auf die Hautoberfläche der Mäuse über der melanotischen Läsion aufgetragen. Die Lösung wurde etwa 1 Minute mit einem Finger, der einen Latexschutz (Baxter Scientific Products/Flexam) trug, in die Haut eingerieben. Mehr als die Hälfte des Somatuline-Tropfens wurde nicht absorbiert und ging nach dem Einreibeverfahren verloren. Die Kontrollen wurden auf gleiche Weise mit 50% DMSO in Kochsalzlösung ohne Somatostatinanalog behandelt. Die topischen Behandlungen wurden zweimal täglich 11 Tage lang, beginnend am Tag 3 nach der Implantation aufgetragen. BEHANDLUNGSERGEBNISSE
Fig. 1 zeigt die Tumorwachstumskurven für das zuvor beschriebene Experiment. Figur und 3 zeigen Photographien von melanotischen Läsionen bei Mäusen, die am Tag 4, 7 und 11 aufgenommen wurden. Diese Photos in Fig. 2 und die Tumorwachstumskurven in Fig. 1 zeigen die deutliche Wachstumshemmung der melanotischen Läsion durch die Somatuline- Lösung, im Vergleich zu den Kontrollkurven in Fig. 1 und den unbehandelten Läsionen bei Kontrollmäusen, die in Fig. 3 dargestellt sind.

Therapie

Die Erfindung schalt eine effektive Behandlung für gutartige und bösartige wuchernde Hauterkrankungen durch die Verwendung der zuvor beschriebenen Analoge und Somatostatin- Hexapeptid- oder höhere Analoge im allgemeinen, wenn diese wie zuvor beschrieben verabreicht werden. Zu den zuvor beschriebenen gutartigen und bösartigen Hauterkrankungen zählen Melanome und bösartige Hautmetastasen von Melanomen, wiederauftretende Keratose, nichtinvasives, pagetoides Basalzellepitheliom und Basalzellkarzinom. Die Somatostatinanaloge können direkt auf die erkrankte Haut aufgetragen werden oder als Nachbehandlung nach einer chirurgischen Exzision oder Radiotherapie des primären Tumors verwendet werden, um ein Wiederauftreten zu verhindern.
Die Keratose umfaßt Präepitheliomatose, aktinische Keratose (aufgrund einer übermäßigen Sonnenbestrahlung) und altersbedingte Keratose. Die Somatostatinanaloge können auch zur präventiven Behandlung, z. B. bei aktinischer und altersbedingter Keratose, verabreicht werden.
Andere Ausführungsbeispiele sind in den folgenden Ansprüchen enthalten.

Claims

1. Verwendung eines Somatostatinanalogs mit sechs oder mehr Aminosäuren bei der Herstellung eines Mittels zur topischen Verabreichung bei der Behandlung gutartiger oder bösartiger Melanome oder Metastasen von Melanomen, ausschließlich Verbindungen der Formel:

wobei

A¹ und A² jeweils unabhängig H, C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkyl, C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;-Phenylalkyl, R&sub1;CO (wobei R&sub1; C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl, C&sub3;&submin;&sub2;&sub0;-Alkenyl, Phenyl, Naphthyl oder C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;- Phenylalkyl ist) oder R&sub2;OCO (wobei R&sub2; C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl oder C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;-Phenylalkyl ist) sind, vorausgesetzt, daß wenn eines von A&sub1; oder A&sub2; R&sub1;CO oder R&sub2;OCO ist, das andere H sein muß;

X&sub1; und X&sub2; jeweils unabhängig H, F, Cl, Br, OH, CH&sub3; oder CF&sub3; sind, vorausgesetzt, daß mindestens eines von X&sub1; und X&sub2; H sein muß;

A&sub3; Phe oder Tyr ist; und

A&sub4; OH, NH&sub2; NH-R&sub3; ist, wobei R&sub3; ein gesättigtes aliphatisches C&sub1;&submin;&sub8;-Alkyl ist:

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon; und Verbindungen der Formel

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Somatostatinanalog eine Sequenz von vier Aminosäuren mit mindestens 20% Homologie mit der Kernregion von Somatostatin umfaßt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Somatostatinanalog eine Sequenz von sechs oder sieben Aminosäuren mit mindestens 20% Homologie mit dem Kern-Somatostatin umfaßt.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Somatostatinanalog mindestens 50% Homologie mit der Kernregion von Somatostatin aufweist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Analog D-Trp an Position 4 hat.

206. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Somatostationanalog ein Octapeptid der Formel:

ist, wobei A&sub1; D-Phe, N-Ac-D-hArg(Et)&sub2;-Gly, D-β-Nal, oder

ist, wobei Z&sub1; und Z&sub2; jeweils unabhängig H, C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkyl, C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;- Phenylalkyl, R&sub1;CO (wobei R&sub1; C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl, C&sub3;&submin;&sub2;&sub0;-Alkenyl, C&sub3;&submin;&sub2;&sub0;-Alkinyl, Phenyl, Naphthyl oder C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;-Phenylalkyl ist), oder R&sub2;OCO (wobei R&sub2; C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;- Alkyl oder C&sub7;&submin;&sub1;&sub0;-Phenylalkyl ist) ist, vorausgesetzt, daß wenn eines von Z&sub1; oder Z&sub2; R&sub1;CO oder R&sub2;OCO ist, das andere H sein muß;

Z&sub3; CH&sub2;-Z&sub4; ist (wobei Z&sub4; Pentafluorophenyl, Naphthyl, Pyridyl, Phenyl oder o-, m- oder insbesondere p-substituiertes Phenyl ist, wobei der Substituent ein Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH oder C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl ist);

A&sub3; Phe, o-, m- oder insbesondere p-substituiertes X-Phe (wobei X ein Halogen, H, NH&sub2;, NO&sub2;, OH oder C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl ist), Pentafluoro-Phe, β-Nal, Tyr oder Thr ist;

A&sub6; Thr, Ser, Phe, Val, α-Aminobuttersäure oder Ile ist, vorausgesetzt, daß wenn Z&sub4; Phenyl ist, Z&sub1; H ist und Z&sub2; H ist, A&sub6; nicht Val sein kann; und

A&sub8; Thr-NH&sub2;, Trp-NH&sub2;, L-β-Nal-NH&sub2; oder Thr(ol) ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

7. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Somatostatinanalog ist:

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon;

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Somatostatin Cyclo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe) oder Cyclo(N-Me-Ala-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Phe) ist.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Somatostatinanalog ein Heptapeptid ist der Formel:

A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-Cys-A&sub7;-A&sub8;,

wobei A&sub1;

oder

ist (wobei Q H oder eine C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe ist);

A&sub2; o-, m- oder p-substituiertes X-Phe oder X-D-Phe ist (wobei X H, ein Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy ist);

A&sub3; X-Trp, X-D-Trp, α-N-Methyl-X-Trp oder α-N-Methyl-D-X-Trp ist (wobei X ein Substituent auf dem Benzolring ist und H, ein Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy ist);

A&sub4; Lys, α-N-Methyl-Lys oder &epsi;-N-R&sub1;-Lys ist (wobei R&sub1; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist);

A&sub5; Val oder Thr ist;

A7 Pro oder

ist, wobei Z H oder CH&sub3; ist und T H, CH&sub2;OH, CH&sub2;CH&sub2;OH, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;OH, CH(CH&sub3;)OH, Isobutyl, Benzyl (substituiert in der o-, m- oder p-Position mit H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy), CH&sub2;-β-Naphthyl (substituiert am Benzolring mit H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;- C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy) oder CH&sub2;-Pyridyl (substituiert am Benzolring mit H, Halogen, NH&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy) ist; und

A&sub8;

(wobei R&sub2; H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist), CH&sub2;OH, CH&sub2;OCR&sub3; (wobei R&sub3; C&sub1;- C&sub3;-Alkyl, C&sub8;-C&sub1;&sub2;-Aralkyl oder Phenoxy ist) oder

ist (wobei R&sub4; H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist und R&sub5; H, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Phenyl oder C&sub7;-C&sub1;&sub0;-Aralkyl ist); oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Somatostatinanalog ein lineares Octapeptid der Formel

R&sub1;

ist, wobei

A¹ ein D-Isomer von einem von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Met, Nle, Trp, β-Nal, o-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X- Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichlor-Phe oder Pentafluor-Phe ist;

A² eines von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Met, Nle, Trp, β-Nal, o-X- Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichlor-Phe oder Pentafluor-Phe ist;

A³ eines von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Met, Nle, Trp, Tyr, β-Nal, o- X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichlor-Phe oder Pentafluor- Phe ist;

A&sup6; eines von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Lys, Met, Nle, Thr-R&sub4;, Trp, Ser-R&sub4;, β-Nal, o-X-Phe (wobei X CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X- Phe (wobei X CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichlor-Phe oder Pentafluor-Phe ist;

A&sup7; eines von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Val, Met, Nle, Trp, β-Nal, o-X- Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X-Phe (wobei X H, CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichlor-Phe oder Pentafluor-Phe ist;

A&sup8; ein D- oder L-Isomer von einem von Ala, Pyridyl-Ala, Leu, Ile, Ser-R&sub4;, Thr-R&sub4;, Val, Met, Nle, Trp, β-Nal, o-X-Phe (wobei X CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), p-X-Phe (wobei X = CH&sub3;, Cl, Br, F, OH, OCH&sub3; oder NO&sub2; ist), 2,4-Dichlor-Phe oder Pentafluor-Phe ist;

jedes von R&sub1; und R&sub2; unabhängig eines von H, niedrigerem Acyl, oder niedrigerem Alkyl ist; und R&sub3; H, NH&sub2; oder niedrigeres Alkyl ist; vorausgesetzt, daß mindestens eines von A¹ und A&sup8; eine aromatische Aminosäure sein muß; und weiters vorausgesetzt, daß wenn eines von A² oder A&sup7; eine aromatische Aminosäure ist, A&sup8; keine aromatische Aminosäure sein kann; und weiters vorausgesetzt, daß R&sub4; nichts sein kann oder ein Kohlenhydrat sein kann, z. B. Cx(H&sub2;O)y, wobei x 1-18 und y 1-16 ist, verbunden durch die Hydroxylgruppe von Ser oder Thr; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.