DE69228436T2 - Monoklonaler Antikörper, der den C-Terminus von hBNP erkennt - Google Patents

Description

• Diese Erfindung betrifft einen monoclonalen Antikörper, der den C- Terminus von hBNP erkennt, ein Hybridom, welches den monoclonalen Antikörper produziert, ein Verfahren zur Herstellung des monoclonalen Antikörpers, welches die Züchtung des Hybridoms in einem Medium oder der Bauchhöhle einer Maus und die Gewinnung des monoclonalen Antikörpers aus dem Medium oder dem Ascites aus der Bauchhöhle umfaßt, sowie einen Immuntest für hBNP unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers.
• Das natriuretische Peptid aus dem Gehirn (brain natriuretic peptide; BNP) aus Schweinehirn wurde erstmals von Matsuo et al., Nature 332 (1988), 78-81 beschrieben. Es gibt im Schwein (p; porcine) BNP-26 mit 26 Aminosäureresten und pBNP-32 mit 32 Resten. Diese besitzen periphere und zentrale Wirkung, ähnlich der des natriuretischen Peptids aus dem Atrium (ANP; atrium natriuretic peptide) und spielen, zusammen mit ANP, eine wichtige Rolle in der Homöostase der Körperflüssigkeiten und bei der Kontrolle des Blutdrucks. Man nahm an, daß BNP beim Menschen im Herzen produziert und vom Herzen sekretiert wird (Biochem. Biophys. Res. Commun. 159 (1989) 1427-1434) und vor kurzem wurde BNP des menschlichen Herzen isoliert und charakterisiert (FEBS Lett. 259 (1990) 341-345). Menschliches BNP (hBNP) umfaßt 32 Aminosäurereste, die mit der Sequenz 77-108 des hBNP-Vorläufers übereinstimmen.
• Chem. Abstr. 113/17, Abstr. no. 145419e (Endocrinology 127(3) (1990) 7292-1300) offenbart zwei monoclonale Antikörper, die den N-terminalen Teil von hBNP erkennen.
• Da BNP, wie vorstehend erwähnt, eine wichtige Rolle bei der Homöostase der Körperflüssigkeiten und bei der Kontrolle des Blutdrucks spielt, erscheint die Bestimmung von hBNP im Blut durch einen Immuntest etc., zur Diagnose von Krankheiten wie Hypertension und ähnliche und Zustände von Herz, Niere und ähnliche, zweckmäßig, wobei ein Anstieg/Abfall des hBNP-Spiegels als Index verwendet wird. Der durchschnittliche Spiegel von hBNP im Blut normaler Erwachsener beträgt jedoch 0,9 ± 0,07 fmol/ml (3.12 ± 0.24 pg/ml) (J. Clin. Invest. 87 (1991), 1402-1412) und ein solch niedriger Spiegel hat die direkte Messung von hBNP im Blutplasma, ohne eine Extraktion, unmöglich gemacht. Die vorliegenden Emder bemühten sich, das vorstehend erwähnte Problem zu lösen und waren durch die Herstellung eines monoclonalen Antikörpers, welcher den C- Terminus von hBNP erkennt, erfolgreich und etablierten dabei einen spezifischen "Sandwich" - Radioimmuntest für hBNP. Der Immuntest für hBNP, der durch diese Erfindung bereitgestellt wird, ist so empfindlich, daß seine untere Nachweisgrenze 1 pg/ml beträgt, und kann deshalb einen hBNP-Spiegel im Plasma direkt bestimmen, das heißt, ohne hBNP aus dem Plasma zu extrahieren. Er kann zur Diagnose von Krankheiten wie Hypertension und ähnliche und Zuständen von Herz, Niere und ähnliche verwendet werden, wobei ein Anstieg/Abfall des hBNP- Spiegels als Index dient.
• Fig. 1 zeigt eine Standardkurve des "Sandwich" Radioimmuntests dieser Erfindung.
• Fig. 2 zeigt eine Standardkurve des kompetitiven Radioimmuntests, welcher den monoclonalen Antikörper dieser Erfindung verwendet.
• Diese Erfindung stellt einen monoclonalen Antikörper bereit, der den C- Terminus von hBNP erkennt, und ein Hybridom, welches ihn herstellt. Der monoclonale Antikörper dieser Erfindung reagiert mit hBNP, jedoch nicht mit hBNP, welches am C-Terminus einen zusätzlichen Tyrosinrest enthält. Es ist nicht wahrscheinlich, daß der monoclonale Antikörper mit hBNP reagiert, welches am C-Terminus irgendeine zusätzliche Aminosäure, mit Ausnahme von His, enthält. Deshalb wird daraus gefolgert, daß der monoclonale Antikörper dieser Erfindung hauptsächlich einen Histidinrest am C-Terminus von hBNP erkennt, insbesondere eine Carboxylgruppe des His-Restes.
• Der monoclonale Antikörper dieser Erfindung kann durch ein Hybridom BC203 produziert werden. Dieses Hybridom BC203 wurde am 20. August, 1991 gemäß dem Budapester Vertrag als Maus-Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-3515 beim Fermentation Research Institute, 1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken hinterlegt.
• Das Hybridom dieser Erfindung kann wie folgt hergestellt werden. Ein Peptid mit einer Sequenz um den C-Terminus von hBNP, vorzugsweise hBNP (27-32), wird hergestellt und mit Rinderserumalbumin, Rinderthyreoglobulin oder dergleichen konjugiert, um seine Antigenität zu erhöhen. Das so erhaltene Konjugat wird zur Verwendung für die Immunisierung von Mäusen mit einem entsprechenden Adjuvans, wie komplettes Freundsches Adjuvans, emulgiert. Zur Immunisierung wird die Emulsion in Intervallen von einigen Wochen mehrere Male intraperitoneal, intravenös oder subkutan verabreicht. 3-5 Tage nach der letzten Immunisierung wird die Milz entfernt, um als Antikörperproduzierende Zellen verwendet zu werden. Die so erhaltenen Antikörperproduzierenden Zellen werden mit Myelomzellen fusioniert, die einen geeigneten Marker besitzen, um Hybridome herzustellen.
• Als Medium für die Herstellung von Hybridomen können Eagle's MEM, Dulbecco's modifiziertes Medium, RPMI-1640 und ähnliche verwendet werden. Myelomzellen werden mit Milzzellen fusioniert (Myelomzellen: Milzzellen = etwa 1 : 5). Für eine größere Ausbeute an fusionierten Zellen kann als Fusionierungsmittel vorzugsweise 50% Polyethylenglykol (PEG) ausgewählt werden. Fusionierte Zellen werden nach dem HAT-Verfahren selektiert. Die so erhaltenen Hybridome werden, unter Verwendung ihrer Kulturüberstände, mit einem kompetitiven Radioimmuntest oder ähnlichem abgesucht, um Hybridome zu erhalten die das gewünschte Immunglobulin herstellen. Die erhaltenen Hybridome wurden zur Gewinnung monoclonaler Hybridome subcloniert. Kurz, sie werden in einer Konzentration von weniger als einer Zelle pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und die gewachsenen Clone werden erneut abgesucht. Diese Subclonierung wird zum Erhalt monoclonaler Hybridome wiederholt.
• Diese Erfindung stellt darüberhinaus ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper bereit, welches das Züchten der vorstehend erwähnten Hybridome in einem Medium oder in der Bauchhöhle einer Maus und die Gewinnung des monoclonalen Antikörpers aus diesem Medium oder aus dem Ascites, der sich in der Bauchhöhle ansammelt, umfaßt.
• Kurz, das vorstehend erwähnte Hybridom wird in einem Inkubator (in vitro) oder in einem Tier (in vivo) gezüchtet. Für das in vitro-System kann eines der vorstehend erwähnten Medien ausgewählt werden, welches mit fötalem Kälberserum (FCS) angereichert ist, in welchem Medium das Hybridom für 3-5 Tage gezüchtet wird um den monoclonaien Antikörper aus dem Überstand des Mediums zu gewinnen. Für das in vivo-System wird das Hybridom in die Bauchhöhle eines Säugers eingespritzt und nach 1-3 Wochen der Ascites, der sich in der Bauchhöhle angesammelt hat, gewonnen, aus welchem der monoclonale Antikörper gewonnen wird. Das in vivo-System ist dem in vitro- System vorzuziehen, da der monoclonale Antikörper im in vivo-System viel effizienter hergestellt werden kann als im in vitro-System.
• Der monoclonale Antikörper BC203 dieser Erfindung erkennt hBNP um den C-Terminus. Wie im Beispiel beschrieben, bindet BC203 nicht an [Tyr33]-hBNP, das ist hBNP, welches einen zusätzlichen Tyr-Rest am C-Terminus enthält, der durch Anheften eines Tyr-Restes an den C-terminalen Rest His32 von hBNP hergestellt wurde. Das bedeutet, daß BC203 den C-terminalen Rest His32 von hBNP erkennt. Diese Erfindung stellt einen Immuntest für hBNP bereit, der dadurch gekennzeichnet ist, daß hBNP zwischen dem vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper A und einem Antikörper B, der hBNP an einer anderen Stelle als der, die von Antikörper A erkannt wird erkennt, liegt ("sandwiched"). Eine bevorzugte Ausführungsform des Antikörpers B ist ein monoclonaler Antikörper, der insbesondere die Ringstruktur von hBNP erkennt, zum Beispiel der monoclonale Antikörper KY-hBNP-II (Japanische Patentanmeldung Nr. 2- 99623). Das Hybridom KY-hBNP-11, welches diesen Antikörper produziert, wurde am 11. April 1990 gemäß dem Budapester Vertrag, als Maus-Hybridom KYhBNP-II mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-286 beim Fermentation Research Institute, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, hinterlegt.
• Ein Immuntest dieser Erfindung ist nachfolgend, unter Verwendung eines "Sandwich" Radioimmuntests als Beispiel, kurz erklärt.
(1) Herstellung eines Isotop-markierten Antikörpers
• Eine IgG-Fraktion beider vorstehend erwähnter Antikörper A und B wird mit Pepsin gespalten um ein F(ab')2-Fragment bereitzustellen, welches mit 2- Mercaptoethanol, zum Erhalt eines Fab'-Fragments reduziert wird. Ein Verfahren zur Herstellung von Fab' aus IgG, welches ebenfalls für diese Erfindung anwendbar ist, ist in J. Immunoassay 4 (1983), 209-327 beschrieben. Das so erhaltene Fab'-Fragment wird nach herkömmlichen Verfahren, wie das Chloramin T-Verfahren, einem Verfahren welches Maleimid-monoiod ('251)-Tyramin verwendet, und ähnlichen, mit einem lsotop markiert. Der markierte Antikörper wird durch Gelfiltration, Säulenchromatographie oder ähnliches gereinigt.
(2) Herstellung eines immobilisierten zweiten Antikörpers
• Ein Anti-Maus-IgG-Fc-Fragment-Antikörper wird auf die Art und Weise wie in der japanischen KOKAI 62-132172 beschrieben, für eine Antigen- Antikörperreaktion an einem im Handel erhältlichen Träger, wie Kügelchen, einen Ball, einem Röhrchen oder einer Platte aus Glas oder synthetisiertem Harz, wie er gewöhnlich für herkömmliche Immuntests verwendet wird, immobilisiert.
(3) hBNP-Test
• In einem Röhrchen läßt man eine Standardlösung oder eine hBNP-Probe mit dem markierten Antikörper A oder B (Fab') aus vorstehendem Schritt (1) und dem anderen Antikörper B oder A reagieren. Der immobilisierte Anti-Maus-Fc aus vorstehendem Schritt (2) wird dazugegeben und reagieren gelassen. Nach einer Zentrifugation wird der Überstand zum Waschen entfernt. Die Radioaktivität des ausgefällten markierten Antikörpers wird bestimmt.
• Darüberhinaus kann der von dem markierten Antikörper verschiedene Antikörper A oder B an einen Träger immobilisiert werden und als immobilisierter Antikörper verwendet werden. In dem Fall wird hBNP mit dem markierten Antikörper A oder B bzw. dem immobilisierten Antikörper B bzw. A reagieren gelassen. Nach einer Zentrifugation wird der Überstand zum Waschen entfernt und die Radioaktivität des ausgefällten markierten Antikörpers wird bestimmt.
• Das Verfahren dieser Erfindung beinhaltet nicht nur einen Radioimmuntest, sondern auch einen Enzymimmuntest (EIA). Ein Enzym-konjugierter Antikörper für einen EIA wird wie folgt hergestellt.
• Eine IgG-Fraktion eines der vorstehend erwähnten Antikörper A oder B wird mit Pepsin gespalten, um ein F(ab')2-Fragment bereitzustellen, welches zum Erhalt eines Fab'-Fragments mit 2-Mercaptoethylamin reduziert wird. Ein Verfahren zur Herstellung von Fab' aus IgG, welches auch für diese Erfindung anwendbar ist, ist in J. Immunoassay 4 (1983), 209-327 beschrieben.
• Das so erhaltene Fab'-Fragment wird mit einem Enzym konjugiert. Das zu konjugierende Enzym schließt alkalische Phosphatase, β-D-Galctosidase, Peroxidase, Glucoseoxidase u. s. w. ein. Für das vorliegende Verfahren wird bevorzugt Merrettich-Peroxidase angewendet. Ein Verknüpfungsmittel, welches für die Konjugation verwendet wird, schließt N,N-o-Phenylendimaleimid, 4-(Nmaleimidomethyl)-Cyclohexansäure-N-succinimidester, 6-Maleimidohexansäure- N-succinimidester, 3-(2-Pyridylthio)-Propionsäure-N-succinimidester, 4,4'-Dithiopyridin und andere gut bekannte Verknüpfungsmittel ein. Diese Verknüpfungsmittel können verwendet werden, um einen Antikörper nach herkömmlichen Verfahren, die für die Eigenschaften der Mittel geeignet sind, mit einem Enzym zu konjugieren.
• Der vorliegende Immuntest ist hochempfindlich, mit der unteren Nachweisgrenze von 1 pg/ml, und extrem spezifisch für hBNP, wodurch der direkte Test von hBNP im Blutplasma ohne eine Extraktion ermöglicht wird. Die vorliegende Erfindung ist im folgenden Beispiel ausführlich dargestellt.
• Abkürzung in dem Beispiel; Boc: t-Butyloxycarbonyl, Tos: Tosyl, PAM: 4- (Oxymethyl)-phenylacetamidomethyl, CI-Z: 2-Chlor-benzyloxycarbonyl, Br-Z: 2- Brom-benzyloxycarbonyl, Bom: Benzyloxymethyl, Bzl: Benzyl, cHex: Cyclohexyl, Maleimid-Monoiod-['251]-Tyramin: N-[2-4[-Hydroxy-3 ([1251] 10d) Phenyl] Ethyl]-4- (maleimidomethyl)-1-cyclohexancarboxamid.
Beispiel I. Herstellung eines Hybridoms welches einen monoclonalen Antikörper gegen hBNP produziert und Produktion des Antikörpers (1) Herstellung eines Konjugats zur Immunisierung
• Synthese des hBNP-Fragmentes (27-32)
• Boc-Lys(Cl-Z)-Val-Leu-Arg(Tos)-His(Tos)-PAM-Harz, wobei die geschützten Aminosäuren von Applied Biosystems gekauft wurden, wurde mit einem Aminosäuresyntheseautomaten, wie SHIONOGI SRL-02, aus Boc-His(Tos)-PAM- Harz (Applied Biosystems) (0,25 mmol) nach dem üblichen Festphasenverfahren hergestellt. Die Schutzgruppe wurde mit HF/Anisol entfernt. Das so erhaltene rohe Peptid wurde zur Reinigung einer Umkehrphasen-Chromatographie (Säule: Wako Pure Chemical RO-2, 24 · 360 mm) mit einem linearen Gradienten von 0- 50% CH&sub3;CN/0,1% CF&sub3;COOH unterworfen, wobei 59 mg des gewünschten Peptids erhalten wurden.
• Die erhaltene Präparation ergab einen einzelnen Peak, Verweilzeit: 6,04 min. in einer analytischen HPLC unter Verwendung einer Nucleosil 5C&sub1;&sub8; -Säule (4,6 · 150 mm, Shinwa Chemical Industries Ltd.), mit folgendem Lösungsmittel: 5% CH&sub3;CN/0,1% CF3COOH, Durchflußrate: 1,8 ml/min und Nachweis: 220 nm.
• Das Peptid wurde 24 Stunden bei 110ºC mit 6M HCl mit einem HITACHI- Aminosäurean-Analyseautomaten vom Typ 835 hydrolysiert und das Ergebnis der Aminosäureanalyse des Hydrolysats ist nachstehend beschrieben. Val 0,95(1); Leu 1,00(1); Lys 0,90(1); His 0,95(1); Arg 2,00(2)
Konjugat-Herstellung
• Eine wässrige Lösung aus Rinderthyreoglobulin (40 mg/2,0 ml) wurde mit einer wässrigen Lösung hBNP-Fragment (27-32) (16 mg/l,0 ml) vermischt. Zu dem Gemisch wurde eine wässrige Lösung 1-Ethyl-3(3-Dimethylaminopropyl)- Carbodiimidhydrochlorid (46 mg/0,6 ml) zugegeben und zwei Stunden bei 0ºC gerührt.
• Das Reaktionsgemisch wurde zwei Tage bei 4ºC gegen destilliertes Wasser dialysiert und das Dialysat wurde gefriergetrocknet. Ein Teil des Dialysats wurde zur Berechnung des Konjugationsverhältnisses mit oder ohne Gelfiltration einer Aminosäureanalyse unterzogen, welche 29 Moleküle hBNP-Fragment (27-32) pro Rinderthyreoglobulinmolekül ergab.
(2) Immunisierung
• Eine Suspension des erhaltenen hBNP-Fragment (27-32)-Rinderthyreoglobulin-Konjugats in physiologischer Kochsalzlösung (Konjugatkonzentration: 4 mg/ml) wurde mit einem gleichen Volumen von komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert. Die Emulsion wurde in Intervallen von 3 Wochen, bei einer Dosierung von 0,1 ml, 5 mal subkutan in BALB/c-Mäuse (weiblich, 6 Wochen alt) injiziert. Die injizierte Menge während einer Injektion in eine Maus betrug 200 ug als Konjugat und 5,6 ug als Hapten-hBNP-Fragment (27-32). 3 Wochen nach der letzten Immunisierung wurden 400 ug des hBNP- Fragment (27-32)-Rinderthyreoglobulin-konjugats (11,2 ug des Haptens) in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und 0,1 ml der Suspension wurde jeder der Mäuse, einmal am Tag an zwei aufeinanderfolgenden Tagen als Auffrischungsimpfung injiziert.
(3) Zellfusion
• Drei Tage nach der Auffrischungsimpfung wurden die Milzen der Mäuse entnommen und die Milzzellen wurden zur Zerstörung der Erythrocyten 5 min unter Eiskühlung in 0,17 M Ammoniumchloridlösung gegeben. Die verbleibenden Zellen wurden in RPMI 1640-Medium suspendiert, um eine Milz-Lymphocyten- Präparation herzustellen, die für die Zellfusion verwendet werden sollte. So erhaltene Milz-Lymphocyten (1,88 · 108) wurden mit 8-Azaguanin-resistenten Myelomzellen gemischt (X63.653, 3,76 · 10&sup8;), suspendiert in RPMI 1640-Medium, gemischt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und zu dem Zellpräzipitat wurden in 1 min 0,8 ml einer 50%igen Polyethylenglykollösung (M.gew. 4.000, Merck) in RPMI 1640-Medium unter Rühren mit einer Pipette hinzugegeben und weitere 1,5 min gerührt. Danach wurden 2 ml des RPMI 1640- Mediums in 2 min und dann 2 ml in 1 min unter Rühren hinzugegeben. Weiterhin wurden 18 ml des RPMI 1640-Mediums tropfenweise unter sanftem Rühren hinzugegeben. Nach einer Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und die präzipitierten Zellen wurden in 100 ml HAT-Medium (20% FCS-RPMI 1640- Medium mit 1 · 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4 · 10&supmin;&sup7; M Aminopterin und 1,6 · 10&supmin;&sup5; M Thymidin) suspendiert, wovon 0,1 m) in jede Vertiefung von sieben Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar Corporation) gegeben wurde. In jede der Vertiefungen wurden zuvor als Nährlösung 5 · 10&sup4; Maus-Milz-Zellen in 0,1 ml HAT-Medium gegeben. Danach wurden die Zellen inkubiert, wobei die halbe Menge HAT-Medium gegen frisches in Intervallen von ein paar Tagen ausgetauscht wurde. Das Wachstum der Hybridome wurde etwa 10 Tage später beobachtet. Die Zahl der Vertiefungen, in welchen Hybridome wuchsen, war insgesamt 670 (99,7%).
(4) Selektion der Hybridome
• Die Überstände der Vertiefungen, in welchen Hybridome wuchsen, wurden gemäß dem kompetitiven Radioimmuntest auf die Herstellung von Anti-hBNP- Antikörper getestet. Kurz, 50 ul eines Überstandes wurde in einem Röhrchen mit 150 ul Testpuffer (wird später in Absatz 5 beschrieben) und 100 ul ¹²&sup5;I-markiertem hBNP (beschrieben in Absatz 5) verdünnt mit Testpuffer zu etwa 15.000 cpm/Gefäß, gemischt und mindestens 16 Stunden bei 4ºC inkubiert. Dann wurden 100 ul 2,5% Rindergammaglobulin und 500 ul 25% Polyethylenglykol 6.000 (Yoneyama Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) dazugegeben, gerührt und 20 min bei 3.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Radioaktivität im Präzipitat wurde mit einem Gammazähler bestimmt (Aloka ARC-600). Eine Radioaktivität von mindestens 5.000 cpm (etwa 5 mal soviel wie die unspezifische Bindung) wurde als positiv bewertet und insgesamt 10 Vertiefungen ausgewählt.
(5) Clonierung
• Die Hybridome, die in Schritt (4) ausgewählt wurden, wurden nach dem Grenzverdünnungsverfahren cloniert. Sie wurden in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen, in einer Konzentration von 1 ZeIle/200 pl/Vertiefung gezüchtet. Die Überstände der Vertiefungen, in welchen Hybridome wuchsen, wurden dem Radioimmuntest von Schritt (4) unterzogen. Die Hybridome der antikörperpositiven Vertiefungen wurden vernehrt. Eine Abfolge dieser Schritte wurde zur Gewinnung der Antikörperproduzierenden Zellinie BC203 mehrmals wiederholt.
(6) Ascites-Herstellung
• Die so gewonnenen Hybridome wurden in eine Bauchhöhle transplantiert, um Ascites mit hoher Antikörperkonzentration herzustellen. Kurz, etwa 1 · 10&sup7; Hybridome, suspendiert in RPM-1640, wurden intraperitoneal in eine Maus injiziiert (männlich BALB/c), welcher zuvor 0,5 ml Pristan intraperitoneal injiziiert worden war. Die Ascites wurden zu geeigneten Zeitpunkten während 1-3 Wochen nach der Injektion gewonnen. Nach dem Entfernen der Zellen im Ascites durch Zentrifugation wurde der erhaltene Überstand, zu dem 0,1% Natriumazid zugegeben wurde, eingefroren. So wurde der Ascites BC203A, enthaltend den monoclonalen Antikörper BC203, welcher vom Hybridom BC203 hergestellt wurde, erhalten.
II. Bestimmung der monoclonalen Antikörperklasse/Subklasse
• Die Klasse/Subklasse des monoclonalen Antikörpers, der von dem Hybridom produziert wird, wurde unter Verwendung spezifischer Antikörper für jede Klasse/Subklasse von Mausimmunogfobulinen (Serotec, Mouse monoclonal antibody-typing kit) durch das Immundiffusionsverfahren bestimmt. Als Ergebnis wurde eine Präzipitationslinie zwischen Ascites-BC203A und Anti-IgG&sub1;-Antikörper beobachtet, was darauf hindeutet daß der Antikörper BC203 zu IgGi gehört.
III. Bestimmung der Affinität (Bindungskonstante) des monoclonalen Antikörpers
• Nach dem in Absatz V beschriebenen Verfahren wurde eine Standardkurve für hBNP erstellt. Gemäß dem Scatchard-Verfahren wurde für jede Konzentration von hBNP auf der vertikalen Achse das Verhältnis der Radioaktivität des Präzipitats zu der Radioaktivität des Überstandes aufgetragen und auf der horizontalen Achse eine molare Konzentration des an Antigen gebundenen Antikörpers aufgetragen. Die Bindungskonstante des Antikörpers wurde anhand der Neigung der so erhaltenen Linie als 1,3 · 10&sup9; M&supmin;¹ bestimmt.
IV. Spezifität des monoclonalen Antikörpers (1) Herstellung von Tyr³³-¹²&sup5;I-markiertem hBNP
• Um die gewünschte Verbindung zu erhalten, wurde gereinigtes Tyr33-hBNP (7,0 mg) aus Boc-Tyr(Br-Z)-PAM-Harz (Applied Biosystems, 0,25 mmol Tyr), gemäß der Synthese von Tyr&sup0;-hBNP-32 im Referenzbeispiel, unter Verwendung eines Aminosäure-Syntheseautomaten Applied Biosystems 430A, hergestellt und in der gleichen Weise wie im Referenzbeispiel markiert.
• Die erhaltene Präparation ergab einen einzelnen Peak (Verweilzeit: 5,98 min) unter den Säuleneigenschaften: YMC A-302 S-5 120A ODS, 4,6 · 150 mm (YMC Co., Ltd.); Lösungsmittel: 19,0% CH&sub3;CN/0,1% CF&sub3;COOH; Durchflußrate: 1,0 ml/min; und Nachweis: 220 nm. Ein Teil der erhaltenen Präperation wurde 20 h bei 110ºC in Gegenwart von Phenol mit 6 M HCl hydrolysiert und einer Aminosäureanalyse unterzogen, wobei folgendes Ergebnis erhalten wurde:
• Asp 1,05(1); Ser 5,46(6); Glu 1,04(1); Gly 5,21 (5); Val 1,97(2); Met 1,94(2); Ile 0,97(1); Leu 2,00(2); Tyr 1,01 (1); Phe 1,00(1); Lys 3,01 (3); His 0,95(1); Arg 3,88(4); Pro 1,05(1)
(2) Spezifität des Antikörpers
• Tyr³³-¹²&sup5;I-markiertes hBNP, worin ein zusätzliches Tyr am C-terminalen His-Rest von hBNP hinzugefügt wurde, zeigte in dem Radioimmuntest aus Absatz I-(4) keine Bindung an den monoclonalen Antikörper dieser Erfindung, was darauf hindeutet, daß der monoclonale Antikörper dieser Erfindung spezifisch an den Cterminalen His-Rest von hBNP bindet.
V. Sandwich-Radioimmuntest für hBNP unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers (Direkt-Verfahren).
• Der Sandwich-Radioimmuntest für hBNP wurde entwickelt unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers BC203, welcher in Absatz I beschrieben ist, und dem ¹²&sup5;I-markierten Fab' des Anti-hBNP (1-32)-Antikörpers (nachstehend als KY-hBNP-11 bezeichnet), welcher durch das Hybridom KYhBNP-11 (Japanische Patentanmeldung Nr. 2-99623) produziert wurde.
(1) Herstellung von ¹²&sup5;I-markiertem KY-hBNP-II-Fab'
• Reinigung des Ascites: Ascites (3 ml) vom Hybridom KY-hBNP-II wurde durch Protein G-Sepharose® 4FF, Mab TrapTM G (Pharmacia) gereinigt. Der Ascites wurde 2-fach mit Bindungspuffer verdünnt (enthalten im Protein G- Sepharose® 4FF, Mab TrapTM G-Kit) und auf eine Protein G-Sepharose® 4FF- Säule (3 ml) aufgetragen, welche vorher mit Bindungspuffer equilibriert wurde. Durch Waschen mit 30 ml Bindungspuffer wurden andere Verunreinigungen als IgG entfernt. Nach der Fraktionierung mit 15 ml Elutionspuffer (enthalten im Protein G-Sepharose® 4FF, Mab TrapTM G-Kit) wobei 1 ml-Fraktionen gewonnen wurden, wurden IgG-Fraktionen mit einer Absorption von mindestens 0,2 bei 280 nm gesammelt und mit Centricon-100T"" (Amicon) konzentriert. Der Puffer wurde gegen 0,1 M Citratpuffer (pH 4,1) ausgetauscht, und es wurden 18 mg IgG- Fraktion erhalten.
• Herstellung von F(ab')2: Zu einer IgG-Lösung von KY-hBNP-11 (4,57 mg/2,19 ml), wie vorstehend erhalten, wurde 2,5% (WN) Pepsin (Schweine- Magenschleimhaut, Sigma) und dann 0,1 M Natriumchlorid zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37ºC wurde das Gemisch mit einer Sephadex®-G-100- Säule (1,5 · 58 cm) (Bio-Rad), welche mit 0,1 M Natriumboratpuffer (pH 8,0) equilibriert worden war, gelfiltriert, wobei F(ab')2 erhalten wurde. Zur Reinigung wurde darin enthaltenes ungespaltenes IgG mit Affigel®-Protein A-MAPS-II (Bio- Rad) entfernt. Kurz, Fraktionen, die nicht an Affigel®-Protein A adsorbiert waren, wurden gesammelt und mit Centricon-30TM (Amicon) konzentriert. Der Puffer wurde gegen 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 5 mM EDTA, ausgetauscht und es wurden 1,4 mg F(ab')&sub2;-Fraktion erhalten.
• Herstellung von Fab': Zu einer F(ab')&sub2;-Lösung von KY-hBNP-11 (0,4 mg/70 ul) wurden zum Erhalt einer Endkonzentration von 10 mM 0,1 M 2-Mercaptoethylaminhydrochlorid (in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 5 mM EDTA) zugegeben. Zum Erhalt einer Fab'-Präparation wurde das Gemisch nach 90 min Inkubation bei 37ºC mit TSK-Gel 2.000XL (0,78 · 30 cm, TOSOH CORPORATION), equilibriert mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 5mM EDTA, filtriert. Zur Herstellung der Fab'-Fraktion (0,2 mg/60 ul) wurde die Fab'-Präparation mit Centricon-30TM (Amicon) auf 60 ul konzentriert. Herstellung von Maleimid-Monoiod('251)-Tyramin: Maleimidotyramin (15 ul, 1 mg/ml DMSO) wurde in ein Glasröhrchen gegeben, in welches 60 ul 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) und 208 Mbq (5, 6 mCi) Na¹²&sup5;I zugegeben wurden. Nach Zugabe von 10 ul 0,5% Chloramin T in 0,2 M Natriumphosphat puffer (pH 7,0), wurde das Gemisch 30 sec heftig geschüttelt und dann zum Sammeln der Maleimid-Monoiod(¹²&sup5;I)-Tyramin-Fraktionen einer Umkehrphasen- HPLC, unter Verwendung einer Nucleosil 10C&sub1;&sub8;-Säule (0,46 · 30 cm), equilibriert mit einem Lösungsmittel für die Umkehrphasen-HPLC-Entwicklung (0,1% TFA CH&sub3;CN: CH&sub3;OH = 5 : 3 : 2), unterzogen. Die Fraktionen wurden in einer Stickstoffatmosphäre bei 60ºC bis zur Trockene eingedampft und dann in 50 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 2% Dimethylsulfoxid (DMSO) und 5 mM EDTA, gelöst.
• ¹²&sup5;I-Markierung von KY-hBNP-II-Fab': KY-hBNP-11-Fab' (70 ug) wurde in ein Glasröhrchen gegeben, in welches 130 Mbq Maleimid-Monoiod(1251)-Tyramin zugegeben wurden, gefolgt von einer 90-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Zu dem Gemisch wurde 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 1% S-Carboxymethyl-BSA, 0,02% N-Ethylmaleimid und 5 mM EDTA, zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde zur Reinigung des markierten Antikörpers mit einer PD-10 (Sephadex® G10, Bio-Rad)-Säule, equilibriert mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 5mM EDTA, und dann mit einer Superose®12-Säule (Pharmacia, 1,0 · 30 cm), equilibriert mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), enthaltend 5 mM EDTA, gelfiltriert. Das Filtrat wurde, zum Erhalt einer Fraktion von gereinigtem ¹²&sup5;I-KY-hBNP-II-Fab' (etwa 26-40 Mbq, i. e., 0,7-1, 1 mCi), in Glasröhrchen mit jeweils 10 ul 1% S-Carboxymethyl-BSA- Lösung gegeben.
(2) Herstellung von immobilisiertem zweitem Antikörper
• Anti-Maus-IgG Fc-Fragment-Kaninchenserum (Rockland) wurde nach dem in der japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 62-132172 beschriebenen Verfahren an eine Immunobead-Matrix (Bio-Rad) immobilisiert.
(3) Reagenzien
• Testpuffer: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), welcher pro Liter 0,372 g Dinatrium-Ethylendiamintetraacetat, 0,063 g Cystin-Dihydrochlorid, 0,1 g Natriumazid, 106 KIU Aprotinin und 1 g Rinderserumalbumin enthält.
• Verdünnter Ascites: BC203A, 1.000-fach verdünnt mit Testpuffer.
• hBNP-Standard: 1, 4, 10, 40, 100, 400 und 1.000 pg hBNP in 1 ml Testpuffer.
(4) Verfahren
• In ein Shionogi-Röhrchen (Handelsname) wurden 100 ul hBNP-Standard, 100 ul ¹²&sup5;I-markiertes KY-hBNP-II-Fab' und 100 ul verdünnter Ascites (BC203A) gegeben. Nach mindestens 16 h Inkubation bei 4ºC wurde eine Suspension (0,1 ml) Anti-Maus-IgG Fc-Fragment-Kaninchenserum, immobilisiert an Immunobeads (2 mg/ml), zugegeben und während 4 h bei 4ºC inkubiert. Nach einer Zentrifugation bei 3000 Upm für 10 min. wurde der Überstand entfernt und das Präzipitat mit 1 ml Waschlösung (0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,1% Tween-80 und 0,9% Natriumchlorid) gewaschen. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 3000 Upm, wurde der Überstand entfernt und die Radioaktivität des präzipitierten ¹²&sup5;I-markierten Antikörpers in einem Gammazähler (Aloka ARC- 600) bestimmt.
(5) Standardkurve
• Eine typische Standardkurve des Sandwich-Radioimmuntests ist in Fig. 1 gezeigt. Sie zeigte eine gute Linearität im Testbereich zwischen 1 pg/ml bis 1.000 pg/ml. Die untere Nachweisgrenze war 1 pg/ml. In Fig. 1 zeigt -O- (Ascites) eine Standardkurve, die nach vorstehend erwähntem Verfahren erhalten wurde, und - Δ-(BC203A) eine Standardkurve, die nach dem gleichen Verfahren wie vorstehend erwähnt erhalten wurde, mit der Ausnahme, daß ein monoclonaler Antikörper vom Überstand einer in vitro-Kultur des Hybridoms BC203 anstelle von verdünntem Ascites (BC203A) verwendet wurde.
(6) Plasma-hBNP-Spiegel in gesunden Personen
• Plasma-hBNP-Spiegel wurden in gesunden Personen mit dem Immuntest (direktes Verfahren) dieser Erfindung bestimmt und lagen, wie in Tabelle 1 gezeigt, zwischen 1 pg/ml bis 15 pg/ml, was genügend innerhalb des Bereiches war, der durch den Immuntest dieser Erfindung nachweisbar war. Tabelle 1
(7) Vergleich zwischen direktem und Extraktions-Verfahren
• Ein Vergleich wurde gemacht zwischen dem direkten Verfahren dieser Erfindung, welches BNP im Plasma direkt testet, und dem Extraktionsverfahren, welches BNP in Plasmaextrakten indirekt testet. Für das Extraktionsverfahren wurde BNP aus Plasma mit einer Sep-pak-C&sub1;&sub5;-Patrone (Handelsname, Waters) extrahiert und danach mit dem gleichen Sandwich-Radioimmuntest-Verfahren, wie vorstehend erwähnt, getestet. Wie in Tabelle 2 gezeigt, korrelierten die durch das direkte Verfahren und das Extraktionsverfahren bestimmten Werte gut (Korrelationakoeffizient: r = 0,98). Das direkte Verfahren dieser Erfindung zeigte auch ohne Extraktion von BNP eine ausreichende Empfindlichkeit und Verlässlichkeit und ist ein sehr einfaches Verfahren im Vergleich zu dem Extraktionsverfahren. Tabelle 2
Referenzbeispiel
• Radioimmuntest unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers
• Der kompetitive Radioimmuntest wurde unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers dieser Erfindung durchgeführt.
• (1) Synthese von ¹²&sup5;I-markiertem hBNP
• Synthese von Tyr&sup0;-hBNP-32
• Da hBNP keinen Tyr-Rest zum Markieren besitzt, wurde Tyr&sup0;-hBNP, i. e. hBNP mit einem zusätzlichen Tyr-Rest am N-Terminus synthetisiert. Das heißt, Boc-Tyr(Br- Z)-Ser(Bzl)-Pro-Lys(Cl-Z)-Met-Val-Gln-Gly-Ser(Bzl)-Gly-Cys(4-CH&sub3;&sub0;Bzl)-Phe-Gly- Arg(Tos)-Lys(CI-Z)-Met-Asp(OcHex)-Arg-Ile-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)- Gly-Leu-Gly-Cys(4-CH&sub3;OBzI)-Lys(CI-Z)-Val-Leu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-His(Bom)- PAM-Harz wurde nach dem üblichen Festphasenverfahren unter Verwendung eines Aminosäure-Syntheseautomaten, Applied Biosystems 430A, aus 0,45 mmol Boc-His(Bom)-PAM-Harz (NOVA Biochem AG) synthetisiert. Die halbe Menge des erhaltenen Peptids wurde nach Entfernung der Schutzgruppen mit HF/p- Kresol/Dimethylsulfid mit destilliertem Wasser verdünnt. Nach Einstellen des pH- Werts auf pH9 mit wässrigem Ammonium wurde das Gemisch 24 h bei Raumtemperatur geschüttelt, um S-S-Brücken einzuführen. Das so erhaltene Rohpeptid wurde zum Erhalt von 3,9 mg des gewünschten Peptids einer Umkehrphasen-Chromatographie (Säule: YMC S-50 120A ODS AM-Typ, 30 · 200 mm) mit einem linearen Gradienten von 0-40% CH&sub3;CN10,1% CF&sub3;COOH, dann einer HPLC-Fraktionierung (Säule: u-Bondasphere 15C18 300 A, 30 · 300 mm (Waters)) mit einem linearen Gradienten von 12-22% CH&sub3;CN/0,1 CF&sub3;COOH unterzogen und unter Verwendung einer YMC 342-5 S-5 120A ODS (20 · 150 mm) Säule mit einem Lösungsmittel aus 19,5% CH&sub3;CN/0,1 CF&sub3;COOH weiter gereinigt.
• Die so erhaltene Präparation des gewünschten Peptids ergab in einer analytischen HPLC (Säule: Cosmosil 5&sub1;&sub8;, 4,6 · 150 mm (NACALAI TESQUE, INC.); Lösungsmittel: 20% CH&sub3;CN/0,1% CF&sub3;COOH; Durchflußrate: 1,0 ml/min. Nachweis: 220 nm) einen einzelnen Peak (Verweilzeit: 9,10 min). Das Peptid wurde 20 h bei 110ºC in Anwesenheit von Phenol mit 6 M HCl hydrolysiert und einer Aminosäureanalyse unterzogen, wobei folgendes Ergebnis erhalten wurde.
• Asp 0,99(1); Ser 4,98(6); Glu 0,97(1); Gly 4,75(5); Val 1,90(2); Met 1,82(2); Ile 0,95 (1); Leu 2,02(2); Tyr 0,85(1); Phe 0,93(1); Lys 2,79(3); His 1,00(1); Arg 3,78(4); Pro 0,89(1). (Theoretische Werte in Klammern und ein unkorrigierter Wert für Ser)
• Markierung mit Na¹²&sup5;I
• Tyr&sup0;-hBNP (10 ug) wurde mit 0,05 ml 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,5) und 18,8 MBq. Na¹²&sup5;I (Amersham) gemischt. Zu dem Gemisch wurden 0,01 ml 0,02 Chloramin T zugegeben und anschließend 30 sec geschüttelt. Das Gemisch wurde mit 1% Natriummetabisulfit, zu welchem 0,01 ml 10%iges Kaliumiodid zugegeben wurde, gemischt. Das resultierende Gemisch wurde einer HPLC (Säule: YMC-A-302 S-5 12A ODS, 4,6 · 150 mm) unterworfen, wobei mit einem Gradienten von CH&sub3;CN/CF&sub3;COOH eluiert wurde. Es wurden 4,2 MBq. des markierten Peptids in Monoiodform, bei einer Verweilzeit von 19 min erhalten.
(2) Reagentien
• Testpuffer: 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), welcher pro Liter 0,372 g Dinatrium-Ethylendiamintetraacetat, 0,063 g Cystindihydrochlorid, 0,1 g Natriumazid, 10&sup5; KIU Aprotinin und 1 g Rinderserumalbumin enthält.
• Verdünnter Ascites: BC203A 42.000-fach verdünnt mit Testpuffer hBNP-Standard: 3-fach serielle Verdünnungen (0,046-99,9 ng/ml) von im Handel erhältlichem hBNP (Peptide Institute, Inc.) mit Testpuffer.
• 2,5% Rindergammaglobulin: Rindergammaglobulin, gelöst in Testpuffer.
• 25% Polyethylenglykol: Polyethylenglykol 6.000 (Yoneyama Yakuhin Kogyo Co., Ltd.), gelöst in Testpuffer ohne Rinderserumalbumin.
(3) Verfahren
• In ein Shionogi-Röhrchen, welches 100 ul hBNP-Standard oder Probe enthält, wurden 100 ul einer ¹²&sup5;I-markiertem hBNP und 100 ul verdünnter Ascites zugegeben, gemischt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Dann wurden 100 ul 2,3%iges auf 4ºC gekühltes Rindergammaglobulin und 500 ul 25% Polyethylen glykol zugegeben und sofort danach geschüttelt. Nach einer 20-minütigen Zentrifugation bei 4ºC und 3.000 Upm wurde der Überstand entfernt und die Radioaktivität des Präzipitats wurde mit einem Gammazähler (Aloka ARC-600) bestimmt.
(4) Standardkurve
• Eine Standardkurve dieses Radioimmuntests wurde in Fig. 2 gezeigt. Die Empfindlichkeiten als 90% und 50% Inhibitorkonzentrationen waren 1,3 ng/ml bzw. 11,8 ng/ml. In Fig. 2 gibt -O- (Ascites) die Standardkurve an, welche nach vorstehendem Verfahren erhalten wurde, und - - (27-32 No. 1-F) diejenige, die nach dem gleichen Verfahren wie vorstehend erwähnt erhalten wurde, mit der Ausnahme, daß an Stelle von verdünntem Ascites das letzte Antiserum einer mit hBNP (27-32) immunisierten Maus verwendet wurde.

Claims (11)

1. Monoclonaler Antikörper, der den C-Terminus von hBNP, bestehend aus dem Bereich von den Aminosäurepositionen 27 bis 32, erkennt.

2. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, der von der Hybridomzellinie BC203 (FERM BP-3515) produziert wird.

3. Hybridomzellinie, die den monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 produziert.

4. Hybridomzellinie nach Anspruch 3, welche die Hybridomzellinie BC203 (FERM BP-3515) ist.

5. Verfahren zur Produktion des monoclonalen Antikörpers nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Züchtung der Hybridomzellinie nach Anspruch 3 oder 4 in einem Medium oder der Bauchhöhle einer Maus und Gewinnung des monoclonalen Antikörpers aus dem Medium oder dem Ascites in der Bauchhöhle.

6. Immuntest für hBNP, umfassend das Einbringen von hBNP zwischen den monoclonalen Antikörpern A nach Anspruch 1 oder 2 und einen Antikörper B, der eine Stelle hBNP erkennt, die sich von der monoclonalen Antikörper A erkannten, unterscheidet.

7. Immuntest nach Anspruch 6, wobei der Antikörper B ein monoclonaler Antikörper ist.

8. Immuntest nach Anspruch 7, wobei der Antikörper B die Ringstruktur von hBNP erkennt.

9. Immuntest nach Anspruch 8, wobei der Antikörper B von der Hybridomzellinie KY-hBNP-II (FERM BP-2863) produziert wird.

10. Immuntest nach einem der Ansprüche 7-9, wobei hBNP im menschlichen Blutplasma, ohne Extraktion von hBNP aus dem Plasma, direkt getestet wird.

11. Kit für den Immuntest nach einem der Ansprüche 6-10, umfassend den monoclonalen Antikörper A nach Anspruch 1 oder 2 und einen Antikörper B, der eine Stelle von hBNP erkennt, die sich von der vom monoclonalen Antikörper A erkannten unterscheidet.