DE69226415T2

DE69226415T2 - Verfahren zur Herstellung eines Thromboplastinreagenzes aus einer Zellkultur zur Bestimmung der Thromboplastinzeit

Info

Publication number: DE69226415T2
Application number: DE69226415T
Authority: DE
Inventors: Ray Francis Derwood Md 20855 Ebert; Rafael Pedro Germantown Md 20874 Valdes-Camin
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Tcoag Ireland Ltd Dublin Ie
Priority date: 1991-10-22
Filing date: 1992-10-20
Publication date: 1999-03-04
Anticipated expiration: 2012-10-21
Also published as: DE69226415D1; FI924774A0; EP0538951A3; DK0538951T3; CA2080428C; AU2717692A; FI924774L; US5413919A; JP3121456B2; KR930008149A; FI104220B; CA2080428A1; EP0538951A2; EP0538951B1; ES2120985T3; FI104220B1; JPH05276995A; AU663121B2; KR100235517B1; ATE169029T1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der klinischen Hämatologie und spezifisch die Überwachung des Koagulationsfaktor in menschlichem Plasma.

Prothrombinzeit-Test

Der Prothrombinzeit-Test ist einer von mehreren klinischen Hämatologie-Assays von Plasma, in dem das Ergebnis auf der für die Bildung eines Fibringerinnsels benötigten Zeit basiert. Es vermittelt diagnostisch nützliche Informationen, was die Durchgängigkeit oder die funktionelle Integrität des beim Gewebefaktorweg (früher als extrinsischer Koagulationsweg bekannt; Rapaport, 1991) involvierten Koagulationsfaktors betrifft, viz. Faktoren I, II, III, V, VII und X. Er eignet sich ebenfalls für die Überwachung von Patienten, die eine Therapie mit oralen Antikoagulantien erhalten. In der Praxis ist dieser Test sehr sensitiv bezüglich Konzentration und/oder Aktivität der Koagulationsfaktoren V, VII und X.
Defektes oder mangelhaftes Plasma bezüglich einem oder mehreren der oben genannten Koagulationsfaktoren ergibt typischerweise eine Prothrombinzeit (PZ) von > 20% länger als die durchschnittliche PZ bei einer Gruppe normaler Plasmaproben. Die Prothrombinzeit stellt somit ein geeignetes Mittel dar, um Defekte bei Gerinnungsfaktoren zu bestimmen und um den Grad der oralen Antikoagulation zu überwachen.

Thromboplastine

Der PZ-Test braucht zur Auslösung der Gerinnungsaktion ein "Thromboplastin". Ein Thromboplastin kann generell als Substanz definiert werden, die gerinnungsauslösende Eigenschaften oder eine solche Aktivität besitzt. Im spezifischen Zusammenhang mit einem PZ-Test enthält das Thromboplastin substantielle Mengen an Gewebefaktor (Koagulationsfaktor III), ein essentieller Kofaktor für die Aktivierung des Koagulationsfaktors VII (Nemerson, 1988). Die Bildung eines aktivierten Faktors VII löst eine Abfolge von zusätzlichen Reaktionen aus, die in der Bildung eines Fibringerinnsels enden. Ein solches Gerinnsel kann manuell, mittels visueller Untersuchung oder automatisch mittels Apparaten zur Überwachung der Lösungsviskosität oder Transluzenz nachgewiesen werden.
Früher stellten viele Laboratorien ihre eigenen Thromboplastine aus menschlichem oder tierischem Gewebe her. Dies führte zu sehr unterschiedlichen Reagenzien, die durchschnittliche normale Plasmagerinnungszeiten von ungefähr 11 bis 20 Sek. ergaben. Da diese lokal produzierten Thromboplastine kein Kalzium enthielten, war der einphasige PZ-Test eigentlich ein Zweischritt-Verfahren, das aus (1) dem Mischen von 0,1 ml zitriertem normalem Plasma mit 0,1 ml Thromboplastin und (2) - nach der Erwärmung des Gemisches auf 37ºC - dem Auslösen der Gerinnungsreaktion mittels Zugabe von 0,1 ml 0,025 M CaCl&sub2; (Biggs, 1976,; S. 330; S. 677).
In den vergangen 20 Jahren fanden im Handel erhältliche Thromboplastine weit verbreitete Verwendung. In der Folge stoppten die meisten klinischen Hämatologie-Laboratorien die Herstellung eigener Thromboplastine, und es wurden mehrere Modifikationen des klassischen Verfahrens für einen PZ-Test entwickelt, insbesondere: (1). Da nun alle handelsüblichen Thromboplastine Kalzium enthalten, wurde das ursprüngliche "Zweischritt"-Verfahren durch ein "Einschritt" oder ein echtes Einschritt-Assay ersetzt, indem 0,1 ml zitriertes normales Plasma mit 0,2 ml mit Kalzium angereichertem Thromboplastin kombiniert wurde; und (2) da handelsübliche Thromboplastine normalerweise weniger veränderlich und aktiver sind als klassische Thromboplastine, verringerten sich die annehmbaren Bereiche für die Gerinnungszeit von normalem Plasma auf 10 bis 14 Sekunden, mit normalen Prothrombinzeiten ungefähr 11 bis 13 Sekunden.
Um besser zwischen einem Thromboplastin, das mittels klassischer Verfahren formuliert und im Zweischrittverfahren verwendet wurde, und den gegenwärtig im Handel erhältlichen Thromboplastinen, die Kalzium enthalten und im Einschrittverfahren verwendet werden, unterscheiden zu können, werden die letzteren als "Thromboplastinreagenz" bezeichnet.
Diese heutige Definition eines Einschritt/Einstufen-PZ-Tests und diese heutige Formulierung eines mit Kalzium angereicherten Thromboplastins definieren und betreffen ganz spezifisch das Ziel dieser Erfindung: Ein Thromboplastin, das sich für die Verwendung in einem PZ-Test eignet.

Gegenwärtige Spezifikationen des Prothrombinzeit-Tests

Es ist wichtig und sehr angemessen für die Voraussetzungen der vorliegenden Erfindung, dass ein neues und nützliches für den PZ- Test geeignetes Thromboplastinreagenz die Leistungscharakteristiken von im Handel erhältlichen Thromboplastinen erfüllen oder überschreiten muss, die zur Zeit von klinischen Laboratorien zu diesem Zweck verwendet werden. Das heisst, (i) wie oben beschrieben, sollte es ein auf der Gerinnung basierendes Einschritt/Einsstufen-Assay sein, (ii) die Gerinnungszeiten für normales Plasma sollten sich zwischen ungefähr 10 bis 14 Sekunden bewegen, mit einer durchschnittlichen normalen PZ von etwa 11 bis 13 Sekunden; (iii) wenn mit einer internationalen Thomboplastin- Referenz gegen eine Auswahl normaler und Coumadin-antikoagulierter Plasmproben, unter Verwendung allgemein anerkannter Verfahren (vide infra) verglichen, sollte ein Streubereichsdiagramm der Logarithmen der Gerinnungszeiten eine hoch-positive Korrelation zeigen; und (iv) ein nützliches Thromboplastin-Reagenz sollte unter Bedingungen einer normalen Anwendung stabil sein. Die zuvorgenannten Eigenschaften und zusätzliche Information, die Verfahren und Leistung der für die Verwendung in einem PZ-Test geeigneten Thromboplastine, sind weiterhin in den Packungsbeilagen der im Handel erhältlichen Thromboplastin-Reagenzien Simplastin® (Organon Teknika Corp., Durham, NC); Dade Thromboplastin C (Baxter Healthcare Corp., Dade Division, Miami, Fl.}; Ortho rabbit brain tissue thromboplastin (Ortho Diagnostics Systems, Raritan, NJ); Thromborel® S (Behringwerke AG, Marburg, Germany), die hier durch Angabe der Referenz miteinbezogen sind.

Verfahren zur Herstellung von Thromboplastin

Das klassische Verfahren zur Herstellung eines Thromboplastins für einen PZ-Test wurde zuerst von Quick et al. (1935, 1938) beschrieben. Das Quick-Thromboplastin (Quick, 1938) wurde von zerkleinerten Hasengehirnen durch ein Verfahren hergestellt, das die Schritte (i) Dehydrierung und teilweise Delipidation des zerkleinerten Gewebes durch wiederholtes Waschen mit Aceton, gefolgt von Trocknen bei 37ºC; (2) Wiederherstellung des Aceton-Puders (0,3 g) in "5 cc einer 0,1 cc Natriumoxalat enthaltenden physiologischen Lösung aus Natriumchlorid" (d. h., 5 ml einer wässrigen Lösung, die ungefähr 0,15 M NaCl plus 0,002 M Na&sub2;C&sub2;O&sub4; enthält); (3) 10- minütige Inkubation der Suspension bei 45ºC; und (4) 3-minütige Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, um grosse Partikel zu entfernen. Die Thromboplastin-Aktivität verbleibt in dem "milchigen Überstand".
Die ursprüngliche Methode von Quick et al. hat, mit kleineren Modifikationen (Biggs, 1976, S. 663-664) als Basis für die heutigen Herstellungsverfahren von Thromboplastin gedient. Alternative Verfahren sind ebenfalls bekannt: Zum Beispiel lehrt Biggs (1976, S. 664) ein Verfahren, das die Mazerierung eines ganzen Gehirns "während etwa 2 Minuten mit warmer 0,85 prozentiger Salzlösung in einem Waring-Mixer" einschliesst. Dieses Verfahren ist, ausser einer leichten Modifikation des Quick-Verfahrens, für das Weglassen des Aceton-Extraktions-/Dehydrierungsschritts bemerkenswert. In einem zweiten Beispiel von Hvatum und Prydz (1966) wird eine Methode gelehrt, die eine Detergenz-Extraktion einer microsomalen Fraktion aus menschlichem Gehirn, gefolgt von einer Dialyse gegen eine gepufferte Salzlösung einschliesst, um das Detergenz durch Dialyse zu entfernen, das Gewebefaktoraktivität inhibiert. Aufgrund der Notwendigkeit, Mikrosome durch Hochgeschwindigkeitszen trifugation herzustellen und das Detergens durch Dialyse zu entfernen, ist diese Methode aufwendig und nicht geeignet für die Herstellung grosser Mengen Thromboplastin, die für kommerzielle Anwendungen erforderlich sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die gegenwärtige Art und Weise zur Herstellung von Thromboplastin (aus menschlichem oder tierischem Gewebe), das für die Verwendung in einem PZ-Test geeignet ist, (1) die Wahl eines geeigneten Gewebes mit hoher Thromboplastin-Aktivität (Gewebefaktor) (z. B. Hasen-, Rinder oder menschliches Gehirn; menschliche Plazenta; oder Hasen- oder Rinderlunge); (2) Dehydrierung und partielle Delipidation des zerkleinerten Gewebes mit Aceton, weiteres Trocknen bei Raum- oder erhöhter Temperatur, um ein Aceton-Puder zu ergeben und Rekonstitution des Aceton-Puders in einer geeigneten Lösung, oder Gewebe-Mazerierung; und (3) Entfernung grosser Partikel durch Zentrifugation einschliesst. Thromboplastine können ebenfalls mittels Modifikationen der Schritte (2) und (3), wie oben beschrieben, erhalten werden.

Verfahrung zur Auswertung des Thromboiilastins

Im Handel erhältliche Thromboplastin-Reagenzien kommen in zwei allgemeinen Varietäten vor: heterologe Thromboplastine wie solche, die von tierischen Geweben (z. B. Hasengehirn oder Rinderlunge) stammen und homolge Thromboplastine wie diejenigen, die von menschlichen Geweben stammen (z. B. menschliche Plazenta). Wie indem Überblick von Kirkwood (Thromb. Haemost. 49, 238-244, 1983) und Hirsh et al. (Chest 95, 5S-11S, 1989) beschrieben, variieren Thromboplastin-Reagenzien in ihrer Fähigkeit die Verringerung einer Gerinnungsfaktoraktivität, die durch orale Antikoagulantien induziert wurde, nachzuweisen. Es ist allgemein bekannt, dass homologe Thromboplastine empfindlicher auf diese Veränderungen der Gerinnungsfaktoraktivität reagieren, als ihre heterologen Gegenüber. Diese erhöhte Sensibilität ist wünschenswert, das sie (1) eine bessere Kontrolle der Antikoagulanz-Therapie erlaubt und dabei die Risiken anormalen Blutens aufgrund einer Über- Antikoagulation reduziert und (ii) die Sensibilität des Reagenz gegenüber geringen Anomalitäten der Koagulationsfaktoren in dem Gewebefaktorpfad erhöht.
Ein Masse der Qualität oder Sensibilität eines Thromboplastins ist der "International Sensitivity Index" (ISI), der eine orthogonalen Regression eines zu testenden Thromboplastins gegen ein Referenz- Thromboplastin (wie von Kirkwood und Hirsh et al. beschrieben) berechnet. Das folgende ist ein Beispiel, wie solche Tests durchgeführt werden: ein Referenz-Thromboplastin mit einem bekannten ISI wird verwendet. Dieses Referenz-Thromboplastin und das zu testende Thromboplastin verwendend, wird ein PZ-Bestimmung mit normalen und Coumadin-antikoagulierten Plasma-Probe durchgeführt. Die Ergebnisse werden als der Logarithmus der Prothrombinzeiten des Referenz-Thromboplastins (Ordinate) und des Test-Thromboplastins (Abszisse) dargestellt. Orthogonale Mindestquadratregressions- Analyse wird angewendet, um die Neigung einer geraden Linie zu bestimmen, die die Daten am besten darstellt. Der ISI des zu testenden Thromboplastins wird durch Multiplizieren des ISI des Referenz-Thromboplastins durch die Neigung der Regressionslinie ermittelt.
Wie von Kirkwood bemerkt, stellt die zuvor beschriebene Methode ein allgemein anerkanntes Verfahren zur Bestimmung der Eignung eines Thromboplastin-Reagenz zur Verwendung in einem PZ-Test dar. Solch ein Test wurde verwendet, um den Wert und die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung darzustellen. Ein neueres Beispiel der Anwendung dieser Methode wurde in einem Artikel von van der Besselaar und Bertina (1991) gefunden.

Thromboplastine aus Zellkulturen

Als Quick et al. ein Verfahren zur Herstellung eines für den PZ- Test geeigneten Thromboplastins beschrieben, war wenig bezüglich der zugrundeliegenden Mechanismen und Reaktionen bekannt. Es ist nun gut begründet, dass das aktive Prinzip der Thromboplastine, die aus aus Tiergeweben wie Gehirn, Lunge und Plazenta hergestellt werden, ein transmembranes, Lipid-assoziiertes Glykoprotein ist, das als "Gewebefaktor" oder Faktor III bekannt ist (Nemerson & Bach, 1982; Spicer et al., 1987; Nemerson 1988. Es ist ebenso weithin anerkannt (wie von Nemerson & Bach 1982 und Drake et al., 1989 beschrieben), dass nahezu alle extravaskulären Gewebe (d. h. alle Gewebe ausser endothelialen Zellen und Blutzellen) Gewebefaktoren enthalten. Darüberhinaus (wie von Nemerson und Bach, 1982 beschrieben) kann Gewebefaktor-/Thromboplastin-Aktivität auch exprimiert werden, wenn normale oder transformierte Zellen aus extravaskulären Geweben in Gewebekulturen gezüchtet werden, und dass endotheliale Zellen oder weisse Blutzellen in vitro durch verschiedene chemische oder biologische Agenzien induziert werden können, um Gewebefaktoren zu exprimieren.
Die Aufmerksamkeit richtet sich nun auf den Stand der Technik bezüglich Verfahren zu Herstellung von Thromboplastinen aus gezüchteten Zellen (zum Unterschied von tierischen Geweben) und die Eignung solcher Thromboplastine zur Verwendung in einem PZ-Test. Ein Überblick über die neuste Literatur offenbart das folgende: (1) Naito et al. (1983) stellte Thromboplastine aus 8 Linien gezüchteter menschlicher Magenkrebszellen durch ein Verfahren her, das "Gefrieren, Tauen und Ultraschallbehandlung" einschliesst, um ein Zelllysat herzustellen, das im Anschluss mit "physiologischer Salzlösung" extrahiert wurde, um eine an Thromboplastinaktivitätreiche Lösung zu ergeben. Eine "Plasma-Recalcifizierungszeit" wurde angewendet, um Gewebefaktoraktivität nachzuweisen und Gerinnungszeiten im Bereich von 21,1 bis 77,4 sec wurden berichtet. Mit Ausnahme des Zelllysis-Verfahrens wurde dieses Thromboplastin gemäss den oben beschriebenen klassischen Verfahren hergestellt; da jedoch die normale Plasma-PZ nicht in dem Bereich von 10-14 Sec angesiedelt war, lehrte Naito et al. kein Verfahren, mit dem ein für die Verwendung in einem PZ-Test geeignetes Thromboplastin- Reagenz herstellbar ist.
(2) Silverberg et al (1989) identifizierten Gewebefaktoren in zwei menschlichen Pankreaskrebszelllinien und stellten Lösungen mit thromboplastischer Aktivität aus "ganzen Zellen, gefrorenengetauten Zellen, Mikrovesikeln und Membranpräparationen" her. Die ses Herstellungsverfahren war in diesem Artikel weder näher spezifiziert noch durch Quer-Referenzen angegeben. Thromboplastin- Aktivität wurde mit einem zweistufigen Rekalzifizierungszeit-Test bestimmt und Gerinnungszeiten von 17 sec wurde berichtet. Da das gegenwärtige PZ-Assay-Verfahren nicht angewendet wurde und da die normale Plasma-PZ nicht innerhalb des Bereiches von 11-14 sec lag, lehrten Silverberg et al. kein Verfahren zur Herstellung eines für die Verwendung in einem PZ-Test geeigneten Thromboplastin-Reagenz.
(3) Andoh et al. (1990) lehrte, was sie als "einstufiges Verfahren" zum Nachweis von Gewebefaktoraktivität in Leukämiezellen beschrieben. Tatsächlich handelte es sich um einen zweistufigen PZ- Test, der (i) eine 3-minütige Inkubation eines Homogenats aus leukämischen Zellen mit menschlichem Plasma einschloss und danach (ii) CaCl&sub2; zugab, um die Koagulation zu initiieren. Es wurden normale Plasmagerinnungszeiten gleich oder höher als 54 sec berichtet. Da die normalen Plasma-PZ nicht innerhalb des Bereichs von 11-14 sec waren, lehrten Andoh et al. kein Verfahren zur Herstellung eines für die Verwendung in einem PZ-Test geeigneten Prothrombinreagenz.
(4) Rehemtulla et al. (1991) transfizierte die Gene eines menschlichen Gewebefaktors in eine Nagetierzelllinie und zeigte, dass das exprimierte rekombinante menschliche Gewebefaktorprotein physikochemische und biologische Eigenschaften zeigte, die die gleich denen des natürlichen menschlichen Proteins sind. Ein Verfahren zur Herstellung des Thromboplastins wurde beschrieben: Zellsuspensionen mit 1 · 10&sup6; Zellen/ml in TBS [20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4] wurden dreimal in einem Trockeneis/Ethanol-Bad gefroren und bei 37ºC aufgetaut, 0,1 ml dieses Lysats wurden in einem Standard- Einstufen-Gerinnungsassay verwendet, um die prokoagulierende Aktivitität zu bestimmen". Ohne die tatsächliche angewendete Methode zu spezifizieren, sagten die Autoren, das die aus diesen gefrorenen/getauten Lysaten aus rekombinanten Zellen hergestellten Thromboplastine gemäss zwei verschiedenen Zweistufen-PZ-Verfahren (Levy & Edgington, 1980, Tsao et al., 1984) ausgewertet wurden. In diesem Beispiel wurden tatsächlich normale Plasmagerinnungszeiten in dem 10-14 Sekunden Bereich erhalten. Da die Assay-Protokolle jedoch signifikante Abweichungen von den allgemein anerkannten Verfahren eines PZ-Tests zeigen, ist es unmöglich zu bestimmen, ob ein geeignetes Thromboplastin mit dieser Gefrier-/Auftaumethode erhalten wurde. Darüberhinaus wurde das Ausgangsmaterial für das Thromboplastin in dem Beispiel von Rehemtulla et al. von rekombinanten Nagetierzellen geliefert, die mehr als normale Mengen des menschlichen Gewebefaktors exprimierten. Es ist daher unmöglich von diesem, dem Stand der Technik entnommenen Beispiel zu bestimmen, ob das Herstellungsverfahren für Thromboplastin für kultivierte nicht-rekombinante Zellen geeignet wäre, dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Wir haben ein Thromboplastin-Reagenz aus gezüchteten nicht-rekombianten Zellen mit der Methode von Rehemtulla et al. hergestellt. Die Ergebnisse dieses Experiments, die in Tabelle 1 dargestellt sind, zeigen, dass dieses Verfahren kein zufriedenstellendes Reagenz liefert.

Zusammenfassung des Stands der Technik

Ein geeigneter Prothrombin-Test muss in einem Einschritt/Einstufen-Format durchgeführt werden, wobei das Thromboplastin-Reagenz sowohl eine an Gewebefaktor reiche Membranpräparation bei annähernd neutralen pH und physiologischer Ionenstärke und Calcium in einer Konzentration von ungefähr 20-30 mM enthält. Es gibt verschiedene Verfahren zur Herstellung von Thromboplastinen aus tierischen Geweben: die klassische Aceton-Extraktions- /Dehydrierungsmethode von Quick et al. (Biggs 1974, S. 663), die Salzextraktionsmethode (Biggs, 1974, S. 664) und eine Detergenz- Extraktionsmethode (Hvatum & Prydz, 1966), die für eine kommerzielle Anwendung ungeeignet ist. Eine Unterscheidung wurde gemacht zwischen Thromboplastinen, die mittels dieser Verfahren hergestellt werden und "Thromboplastin-Reagenzien", die zugegebenes Calcium enthalten und daher in einem Einschritt- /Einstufenverfahren verwendet werden können. Ein aus menschlichem Gewebe isoliertes Thromboplastin ist geeignet und wird bevorzugt, dasolche homologen Thromboplastine eine höhere Sensibilität gegenüber menschlichen Gerinnungsfaktoren aufweisen, als ihre heterologen Gegenüber. Es ist bekannt, dass kultivierte menschliche Zellen extravaskulären Ursprungs menschlichen Gewebefaktor enthalten, und dass Thromboplastine aus solchen Zellen hergestellt werden können. Jedoch waren keine Thromboplastine, die in menschlichen gezüchteten Zellen hergestellt wurden, für die Verwendung in einem PZ-Test geeignet. Daher ist es ein Anliegen der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Thromboplastin-Reagenz unter Verwendung gezüchteter, nicht-rekombinanter menschlicher Zellen zu entwickeln, das für die Verwendung in einem Einschritt-/Einstufen- Prothrombinzeittest geeignet ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Verfahren zur Herstellung eines Thromboplastin-Reagenz aus gezüchteten menschlichen Zellen, das ein für die Verwendung in einem PZ-Test geeignetes Thromboplastin-Reagenz liefert, in welchem (i) der Assay ein Einschritt-/Einstufen-Verfahren ist; (ii) normales menschliches Plasma typischerweise in 10-14 sec gerinnt mit einer mittleren normalen PZ von ungefähr 11 bis 13 sec; (iii) die Ergebnisse in hohem Masse mit einem internationalen Referenz- Thromboplastin korrelieren; und (iv) das Thromboplastin-Reagenz bei 37ºC mindestens 8 Stunden und bei 4ºC mindestens 5 Tage stabil ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt die Prothrombinzeiten in normalen Plasma für eine Anzahl Test-Thromboplastine dar. Drei im Handel erhältliche Thromboplastine, die im wesentlich mittels dem Quick-Verfahren (1938) hergestellt wurden, sind zum Vergleich eingeschlossen. Thr-S: Thromborel ®-S (Behringwerke AG, Marburg, Deutschland) wurde aus menschlicher Plazenta hergestellt. Spl-XLS und Spl-XL: Simplastin® Excel-S und Simplastin® Excel (Organon Teknika Corp., Durham, NC) wurden aus Hasengehirnen hergestellt. Die folgenden menschlichen Zelllinien wurden ausgewertet: H4 (ATCC HTB 148): ein Neurogliom aus menschlichem Gehirn; U-87 MG (ATCC HTB 14): ein menschliches Glioblastom, Astrocytom dritten Grades; HS 683 (ATCC HTB 138): ein menschliches Gliom; WI-38 (ATCC CCL 75): aus menschlicher Lunge;
WI-38 VA13 Sublinie 2RA (ATCC CCL 75.1): durch SV40 transformierte menschliche Lunge; SK-LU-1 (ATCC HTB 57: ein menschliches Lungenadenokarzinom; Calu-1 (ATCC HTB-54): epidermoides Lungenkarzinom Grad III; HS 888 Lü (Lu (ATCC CCL 221): aus menschlicher Lunge; JAR (ATCC HTB 144): Chorionkarzinom aus menschlicher Plazenta; WISH (ATCC CCL 25) aus menschlichem Amnion: FHC:TAC und FHC:KEN: zwei menschliche Histiozytome ("in house"). Alle, ausser den beiden in-house-Zelllinien, wurden vom ATCC, Rockville, MD erhalten.
Fig. 2 zeigt ein Streudiagramm einer durch RELAC durchgeführten ISI-Bestimmung, einem in Leiden, Niederlande angesiedelten Labor für internationale Referenzen. Das Thromboplastin aus gezüchteten Zellen wurde gegen einen internationalen Referenzstandard (BCT/253) kalibriert und orthogonale Mindestquadratregressionsanalyse offenbarte einen ISI von 1,09 (Standardabweichung 0,019; N = 80) mit einer mittleren normalen PZ-Zeit von 12,6 Sekunden (Standardabweichung 0,7 sec; N = 20).
Fig. 3 zeigt ein Streudiagramm einer durch die Erfinder durchgeführten ISI-Bestimmung, in der das Thromboplastin aus gezüchteten Zellen (durchgezogenen Linie, geschlossene Dreiecke) mit einem im Handel erhältlichen menschlichen Thromboplastin®-S(Thromborel® - S; Behringwerke Marburg, Deutschland), hergestellt aus menschlicher Plazenta (gestrichelte Linie, offene Kreise), verglichen wurde. Die Ergebnisse stimmten in hohem Masse überein (r = 0,995) und zeigten dabei die Eignung von Thromboplastin aus gezüchteten Zellen für die Verwendung in einem PZ-Test.
Fig. 4 zeigt eine mittlere PZ, die von einer Anzahl von 6 normalen Plasma-Proben (jede wurde im Doppel bestimmt) gegen die Konzentration des Thromboplastin-Proteins (mit dem BCA verstärkten Protein-Assay bestimmt, vide infra) bestimmt wurde. Diese Balken zeigen Standardabweichungen von der mittleren PZ der 6 Proben an.

Verfahren zur Herstellung eines Thromboplastins aus gezüchteten menschlichen Zellen

Zellwachstum und Ernte. Eine menschliche Zelllinie, vorzugsweise mit hoher konstitutiver Expression einer Thromboplastin/Gewebe- Faktor-Aktivität, wird unter optimalen Zellkulturbedingungen bis zu hohen oder maximalen Zelldichten wachsen gelassen und durch herkömmliche Mittel geerntet. Empfohlene Zellkulturbedingungen wurden von der ATCC, Rockville, MD in dem ATCC-Katalog der Zelllinien und Hybridome, 7. Ausgabe (1992) zur Verfügung gestellt, die hiermit durch Angabe der Referenz eingeschlossen ist. Da Säugetierzellen normalerweise für maximales Wachstum an ein festes Substrat binden müssen, schliesst das Ernten typischerweise eine Behandlung der Kulturen mit Trypsin und/oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ein, um die Zellen im Kulturmedium zu suspendieren. Es ist jedoch auch möglich und nicht ausserhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung, dass eine Zelllinie, die ausreichend Gewebefaktor exprimiert, in einer Suspensionskultur gezüchtet und geerntet werden kann, wobei die Notwendigkeit des Ablösens der Zellen von einem Substrat umgangen wird.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einem Pellet konzentriert und das Überstandsmedium verworfen. Die Zellen wurden dann in einer isotonischen gepufferten Salzlösung (Dulbecco's mit Phosphat gepufferte Salzlösung; D-PBS; ungefähr 3 bis 5 Volumen Überschuss D-PBS zum Zellpellet) resuspendiert und nochmals zentrifugiert, um restliche Spuren an Kulturmedium, Trypsin oder EDTA zu entfernen. Das Zellpellet wurde in D-PBS resuspendiert und nocheinmal, wie oben, zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in einem Überschuss von 1 bis 2 Volumen D-PBS resuspendiert und die Mischung bei -20 bis -70ºC eingefroren.

Zelllysis und Rekonstitution in einem Thromboplastin- Verdünnungsmittel

Die gefrorenen Zellen wurden aufgetaut, D-PBS wurde zugegeben (ungefähr 1,5 ml pro 0,1 g Nassgewicht Zellen) und 30 Minuten durch Zentrifugation mit ungefähr 10'000 · g pelletiert. Die Zel len wurden in einer NaHCO&sub3; (10 mM), NaEDTA (2 mM) und bovines Serumalbumin (BSA; 0,5 mg/ml) enthaltenden hypotonischen Pufferlösung in einer Konzentration von ungefähr 1,5 ml Puffer/0,1 g Nassgewicht der Zellen resuspendiert. Die Suspension wurde gründlich gemischt und bei 10'000 · g, wie oben, zentrifugiert. Die Zellen wurden nochmals in einer hypotonischen Lösung resuspendiert, gemischt und bei 10'000 · g, wie oben, zentrifugiert. Obwohl die hypotonische Lysis unsere bevorzugte Methode ist, kann jedes andere physikalische Mittel zum Aufbrechen der Zellen angewandt werden.
Das endgültige Zellpellet wurde in einem Thromboplastin- Verdünnungsmittel suspendiert, das Polyethylenglycol 1450 (1,5%), NaCl (103 mM), Ca-Glukonat (30 mM), NaN&sub3; (0,025%), BSA (0,25 mg/ml) und Imidazol (10 mM, pH 7,2) in einer Konzentration von ungefähr 1 ml Puffer pro 0,05 g Nassgewicht der Zellen enthielt.
Es wurde innerhalb des Rahmens der Erfindung erwogen, die ungefähren Konzentrationen der einzelnen Komponenten dieses Verdünnungsmittels zu variieren, solange das Reagenz eine Einstufen- Prothrombinzeit von ungefähr 10 bis 15 Sekunden mit einer mittleren normalen Prothrombinzeit von 11 bis 13 Sekunden produziert, wenn es zu normalem zitriertem Plasma in einem Volumenverhältnis Reagenz zu Plasma von ungefähr 2 : 1 gegeben wird. Der bevorzugte Variationsbereich beträgt plus oder minus 50%, jedoch bezieht sich die Limitierung, wie oben ausgeführt, nur auf die Aktivität in Bezug auf die Prothrombinzeit. Ausserdem kann das Ca-Glukonat durch jedes andere lösliche Calcium-Salz und NaCl durch jedes andere Salz, das eine vergleichbare Ionenstärke besitzt, ersetzt werden. Die Zusammensetzung des Lösungsmittel kann variiert werden, so lange es eine ungefähre ionische Stärke innerhalb des Bereichs von 0,1 bis 0,25 und eine ungefähren pH-Bereich von ungefähr 6,8 bis 7,8 aufweist. BSA kann auch durch ein anderes Albumin, wie menschliches Serumalbumin (HSA), ersetzt werden. Alle diese Variationen werden innerhalb des Rahmen er Erfindung erwogen.
Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA verstärkten Protein- Assay (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois) bestimmt und die Endkonzentration des Thromboplastins wurde auf 0,5 bis 1.2 mg/ml eingestellt.

Vergleich menschlicher Zelllinien zur Herstellung von Thromboplastin

Die allgemeine Anwendbarkeit des oben beschriebenen Verfahrens zur Herstellung eines menschlichen Thromboplastins konnte durch Herstellen von Thromboplastin aus verschiedenen menschlichen Zelllinien gezeigt werden. Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, zeigen die drei im Handel erhältlichen Thromboplastine Prothrombinzeiten von ungefähr 12-14 Sekunden. Thromboplastine, die aus sechs der getesteten Zelllinien (U-87 MG, Hs683, WI-38, WI-38 VA13, Calu-1 und Hs888Lu) hergestellt wurden, zeigten normale Gerinnungszeiten in dem Bereich von 10 bis 14 Sekunden und erfüllen daher alle Kriterien eines geeigneten menschlichen Thromboplastins. Dies zeigt die generelle Anwendbarkeit und Eignung des Verfahrens. Die übrigen Zelllinien (H4, SK-LU-1, JAR, WISH, FHC:TAC und FHC:KEN) zeigten längere Gerinnungszeiten, was vermutlich auf ein geringere Expression des Gewebefaktors zurückzuführen ist. Diese zuletzt genannten Thromboplastine sind für eine Verwendung in einem PZ-Test nicht geeignet.

Herstellung eines Thromboplastinreagenz aus gezüchteten Zellen mit der ursprünglichen Quick-Methode (1938): Ungeeignet für den Prothrombinzeittest.

Eine der in Fig. 1 beschriebenen Zelllinien, WI-38 VA13 Sublinie 2RA, wurde als Ausgangsmaterial für die Herstellung eines Thromboplastins geäss dem ursprünglichen Verfahren nach Quick (1938) hergestellt, wie oben beschrieben die Schritte einer Aceton- Extraktion, Trocknen und Wiederherstellen in einer wässrigen Salzlösung einschliessend. Dieses Thromboplastin erzielte eine Gerinnungszeit von 28,9 Sekunden in normalen gepooltem Plasma (als eine menschliche Plasmapräparation definiert, die mit Zitrat antikoaguliertes Plasma von 20 gesunden Spendern enthält). Wie oben bemerkt, muss ein für die Verwendung in einem PZ-Test geeignetes Thromboplastin normales Plasma in ungefähr 10 bis 14 Sekunden zur Gerinnung bringen, dieses Thromboplastin war für die Verwendung in dem PZ-Test nicht geeignet.

Vergleich des Thromboplastins aus gezüchteten Zellen mit einem internationalen Referenz-Thromboplastin

Eine der in Fig. 1 beschriebenen Zelllinien, WI-38 VA13 Sublinie 2RA, wurde für eine Herstellung von Thromboplastin in grossem Umfang ausgewählt. Dieses Thromboplastin wurde gemäss den für diese Erfindung oben beschriebenen Ernte-, Zelllysis- und Rekonstitutionsverfahren hergestellt. Nach einer Kalibrierung gegen ein internationales Referenz-Thromboplastin aus menschlichem Gehirn (BCT/253) durch RELAC, einem internationalen Referenz-Labor, unter Verwendung etablierter und allgemein anerkannter Verfahren, wurden die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse erzielt. Diese Ergebnisse, die von 20 normalen und 60 Langzeit antikoagulierten Plasmaproben erhalten wurden, zusammenfassend, zeigte das Thromboplastin, das aus gezüchteten Zellen hergestellt wurde, eine normale Plasmagerinnungszeit von 12,6 ± 0,7 Sekunden und einen ISI von 1,09 ± 0,019 (mittlere ± Standardabweichung). Daher entspricht dieses menschliche Thromboplastin den oben beschriebenen Spezifikationen eines für die Verwendung in einem PZ-Test geeigneten Thromboplastins.

Vergleich des Thromboplastins aus gezüchteten Zellen mit einem im Handel erhältlichen menschlichen Thromboplastin

Das ISI-Bestimmungsverfahren wurde angewendet, um das erfingsgemässe, aus gezüchteten Zellen hergestellte Thromboplastin mit einem im Handel erhältlichen Theromboplastin (Thromborel®-S; Behringwerke AG, Marburg, Germany) zu vergleichen, das aus menschlicher Plazenta hergestellt wurde. In diesem Beispiel bestanden die Plasmaproben aus frisch-gefrorenem normalem Plasma, zwei lyophilisierten anomalen Plasmapräparationen (Verify Abnormal I, Verify Abnormal II, Organon Teknika Corp., Durham, NC) und drei Plasmaproben von Patienten, die eine orale Langzeit-Antikoagulation erhielten.
Die Ergebnisse (Fig. 3) waren sehr ähnlich (r = 0,995), was wiederum die Eignung des Thromboplastins aus gezüchteten Zellen für die Verwendung in einem PZ-Test zeigt.

Vergleich eines Thromboplastinreagenz, das gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, mit Thromboplastinreagenzien, die gemäss der Acetonextraktions-Dehydrierungs- oder Salzextraktionsverfahren, wie in Biggs (1976), S. 663-664 beschrieben und der Gefrier-Auftau-Methode von Rehemtulla et al. (1991) hergestellt wurden

Die oben aufgeführten Verfahren, die eine Aceton- oder Salzextraktion von Gewebe oder Lysis durch Gefrieren und Auftauen gezüchteter Zellen einschliessen, zeigen Annäherungen Thromboplastine herzustellen, die noch im Stand der Technik beschrieben sind. Ein Thromboplastin wurde aus gezüchteten, nicht-rekombinanten, menschlichen Lungenzellen unter Verwendung dieser drei Verfahren hergestellt. Gemäss diesen anerkannten Verfahren (Biggs 1976; S. 677), wurde jedes Thromboplastin auf 25 mM in Calciumchlorid gebracht, um ein wie oben definiertes Thromboplastin-Reagenz zu liefern. Die PZ-Testergebnisse der Thromboplastinreagenzien, die gemäss der drei, dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren hergestellt wurden, wurden mit denjenigen eines Thromboplastinreagenz verglichen, das gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde.
Für jedes der vier Thromboplastinreagenzien wurde eine Proteinkonzentration (mit den oben zitierten Verfahren) in einem Bereich von 0,5 bis 3,0 mg/ml bestimmt. Tabelle 1 und Fig. 4 zeigen die Prothrombinzeit für jede Proteinkonzentration. Die Ergebnisse zeigen, dass Prothrombin, das mittels den dem Stand der Technik entsprechenden Verfahren hergestellt wurde, für eine Verwendung in einem PZ-Test nicht geeignet sind, da die normalen Plasma-PZ-Ergebnisse über dem annehmbaren Bereich von 10 bis 14 Sekunden liegen. Tabelle 1 Vergleich von mittels verschiedenen Verfahren hergestellten Thromboplastinen Prothrombinzeiten für normales, gepooltes Plasma
1 Rehemtulla et al. (1991)
2 Biggs et al. (1976; S. 663)
3 Biggs et al. (1976; S. 664)
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass innerhalb der untersuchten Proteinkonzentrationsbereiche, alle Prothrombinzeiten der Thromboplastinreagenzien, die gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, unter 13 Sekunden liegen, und dass daher dieses Thromboplastinreagenz für die Verwendung in dem Prothrombinzeittest geeignet ist. Keine der Prothrombinzeiten der Thromboplastine, die aus den gleichen gezüchteten menschlichen Lungenzellen gemäss den im Stand der Technik offenbarten Verfahren hergestellt wurden, lagen unter 14 Sekunden. Diese Thromboplastin- Reagenzien wären daher für die Verwendung in einem PZ-Test nicht geeignet. Der Schluss aus diesem Experiment ist, dass der Stand der Technik kein geeignetes Verfahren zur Herstellung eines Thromboplastinreagenz aus gezüchteten menschlichen Zellen offenbart, das für die Verwendung in einem PZ-Test geeignet ist.
Dieser Schluss wird von den Ergebnissen eines zweiten Experiments unterstützt, in dem die vier oben beschriebenen Thromboplastinrea genzien in einem PZ-Test gegen eine Auswahl von 6 normalen Plasmaproben bewertet wurden. In diesem Experiment wurde eine mittlere normale PZ für jedes Thromboplastin bei jeder der 5 Proteinkonzentrationen erhalten. Wie oben bemerkt, sollte die mittlere PZ eines geeigneten Thromboplastin-Reagenz bei 11-13 Sekunden liegen. Die mittlere normale PZ des gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Thromboplastins wurde mit den entsprechenden Werten der drei Thromboplastinreagenzien verglichen, die gemäss den in dem Stand der Technik beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Die Ergebnisse (Fig. 4) offenbarten, dass (i) das gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellte Thromboplastin-Reagenz bei jeder Proteinkonzentration eine signifikant niedriegere PZ (p < 0,001, Studenten t-Test) aufwiesen, als ihre Gegenüber, die mittels der anderen Verfahren hergestellt wurden; und (ii) die mittlere normale PZ für das gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Thromboplastin-Reagenz betrug 11,6 bis 13,7 Sekunden, wohingegen diejenige der anderen drei Thromboplastine von 14,3 Sekunden bei der höchsten Konzentration (3 mg/ml) bis 45 Sekunden bei der niedrigsten Proteinkonzentration (0,5 mg/ml) rangierten. Es ist nicht unmöglich, dass ein Thromboplastinreagenz, dass gemäss den Verfahren des Stands der Technik hergestellt wurde und mit Proteinkonzentrationen von über 3 mg/ml formuliert wurde, für eine Verwendung in einem PZ-Test geeignet wäre, jedoch wäre eine solche Formulierung ausserhalb des Rahmens und der Ansprüche der vorliegenden Erfindung. Zusammenfassend veranschaulicht dieses Experiment, dass in dem Thromboplastinkonzentrationsbereich von 0,5 bis 3,0 mg/ml ein gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestelltes Thromboplastinreagenz signifikant kürzere Thromboplastinzeiten zeigt, als Thromboplastinreagenzien, die gemäss den im Stand der Technik offenbarten Verfahren hergestellt wurden. Diese kurze Prothrombinzeit ermöglicht die Erfindung eines neuen und geeigneten Thromboplastin Reagenz aus gezüchteten Zellen.

Stabilität des Thromboplastins aus gezüchteten Zellen

Wenn hergestellt wie oben beschrieben, ist das aus menschlichen gezüchteten Zellen hergestellte Thromboplastin 1 bis 3 Tage bei 37ºC und für mindestens 3 Monate in flüssiger Form bei 4ºC stabil. Die Stabilität wurde durch Messen der Gerinnungszeiten von normalen und anomalen Plasmaproben während der angezeigten Intervalle bestimmt. Die Stabilität dieses Thromboplastinreagenz unter diesen Bedingungen unterstützt den Schluss, dass es für die Verwendung in einem PZ-Test geeignet ist.
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Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Thromboplastinreagenz aus menschlichen Zellen, welches Waschen der Zellen mit isotonischer wässriger Salzlösung, Lysierung der Zellen in einer gepufferten Lösung, die EDTA und Albumin enthält, Isolieren von Membranmaterial aus den lysierten Zellen und Resuspendieren des isolierten Membranmaterials in einer wässrigen Lösung, mit einer ungefähren physiologischen Ionenstärke im Bereich von ungefähr 0,1 bis 0,25, umfasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen mittels eines hypotonischen Schocks lysiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das isolierte Membranmaterial in einer Lösung resuspendiert wird, die Polyethylenglykol, Kalziumsalze, Serumalbumin und Imidazol umfasst.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Lösung Polyethylenglykol in einer Menge von ungefähr 0,5 bis 2,5 Gew.-%, NaCl in einer Konzentration von etwa 50 bis 150 mM, Ca-Glukonat in einer Konzentration von etwa 10 bis 50 mM, NaN&sub3; in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 0,1 Gew.-%, Rinderserumalbumin in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 mg/ml und Imidazol in einer Konzentration von etwa 5 bis 75 mM umfasst und worin die Lösung einen pH-Bereich von 6,8 bis 7,8 aufweist.

5. Thromboplastinreagenz, das durch Waschen gezüchteter menschlicher Zellen mit isotonischer wässriger Salzlösung, physikalischer Lysierung der Zellen in einer gepufferten EDTA und Albumin enthaltenden Lösung, Isolieren von Membranmaterial der lysierten Zellen und Resuspendieren des isolierten Membranmaterials hergestellt wird, wobei das genannte Reagenz eine Thromboplastinprotein-Konzentration, ohne zugegebenes Albumin, im Bereich von ungefähr 0,5 bis 3,0 mg/ml aufweist.

6. Thromboplastinreagenz nach Anspruch 5, worin das genannte Thromboplastinreagenz eine einstufige Prothrombinzeit in etwa 11 bis 15 Sekunden produziert, mit einer mittleren normalen Prothrombinzeit von 11 bis 13 Sekunden, wenn es in einem Volumenverhältnis von etwa 2 : 1, Reagenz:Plasma, zu normalem mit Zitrat versetztem Plasma gegeben wird.

7. Thromboplastinreagenz nach Anspruch 6, worin das genannte Thromboplastinreagenz bei 37ºC während mindestens 8 Stunden und bei 4ºC während mindestens 5 Tagen stabil ist.