DE69222947T2

DE69222947T2 - Reinigung von faktor xiii

Info

Publication number: DE69222947T2
Application number: DE69222947T
Authority: DE
Inventors: Paul Bishop; Jin-Jyi Chang; Gerald Lasser; Mads Laustsen
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1991-08-07
Filing date: 1992-08-07
Publication date: 1998-05-07
Anticipated expiration: 2012-08-08
Also published as: EP0603215A1; DE69222947D1; AU2478292A; EP0603215B1; CA2115136A1; WO1993003147A1; JP3415148B2; DK0603215T3; ATE159756T1; GR3025944T3; CA2115136C; JPH07506479A; ES2110515T3

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Proteinreinigung im allgemeinen und, genauer gesagt, gereinigten Faktor XIII und Verfahren zur Reinigung von Faktor XIII aus einer Vielzahl biologischer Flüssigkeiten.

Hintergrund der Erfindung

Faktor XIII (auch bekannt als Fibrin stabilisierender Faktor, Fibrinoligase oder Plasmatransglutaminase) ist ein Plasma-Glycoprotein, das in Blut als ein Zymogen (Mr = 320 kD), komplexiert mit Fibrinogen, zirkuliert (Greenberg und Shuman, J. Biol. Chem. 257: 6096-6101, 1982). Plasma-Faktor-XIII-Zymogen ist ein Tetramer, das aus zwei a-Untereinheiten (Mr = 75 kD) und zwei b- Untereinheiten (Mr = 80 kD) besteht (Chung et al., J. Biol. Chem. 249: 940-950, 1974), mit einer Gesamtstruktur, die als a&sub2;b&sub2; bezeichnet wird. Die a-Untereinheit enthält die katalytische Stelle des Enzyms, während die b-Untereinheit vermutlich die a- Untereinheit stabilisiert oder die Aktivierung von Faktor XIII steuert (Folk und Finlayson, Adv. Prot. Chem. 31, 1-133, 1977; Lorand et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 56, 914-922, 1974). Die Aminosäuresequenzen der a- und b-Untereinheiten sind bekannt (Ichinose et al., Biochemistry 25: 6900-6906, 1986; Ichinose et al., Biochemistry 25: 4633-4638, 1986). Faktor XIII kommt in Plazenta und Blutplättchen als ein a&sub2;-Homodimer vor.
In vivo katalysiert aktivierter Faktor XIII (Faktor XIIIa) Vernetzungsreaktionen zwischen anderen Proteinmolekülen. Während der abschließenden Stufen der Blutgerinnung wandelt Thrombin Faktor XIII-Zymogen in eine Zwischenform (a'&sub2;b&sub2;) um, die anschließend in der Gegenwart von Calcium-Ionen dissoziiert, um Faktor XIIIa zu erzeugen, ein Homodimer von a'-Untereinheiten. Plazenta-Faktor XIII wird bei Spaltung durch Thrombin aktiviert. Faktor XIIIa ist eine Transglutaminase, die die Vernetzung von Fibrinpolymeren durch die Bildung intermolekularer ξ(γ-Glutamyl)-Lysin-Bindungen katalysiert, wodurch die Gerinnselfestigkeit erhöht wird (Chen und Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66: 472-479, 1970; Pisano et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 202: 98- 113, 1972). Diese Vernetzungsreaktion erfordert das Vorhandensein von Calcium-Ionen (Lorand et al., Prog. Hemost. Throm. 5: 245-290, 1980; Folk und Finlayson, Adv. Prot. Chem. 31: 1-133, 1977). Faktor XIIIa katalysiert auch die Vernetzung der γ-Kette von Fibrin an α&sub2;-Plasmin-Inhibitor und Fibronectin sowie die Vernetzung von Collagen und Fibronectin, die in Zusammenhang gebracht werden kann mit der Wundheilung (Sakata und Aoki, J. Clin. Invest. 65: 290-297, 1980; Mosher, J. Biol. Chem. 250: 6614-6621, 1975; Mosher und Chad, J. Clin. Invest. 64: 781-787, 1979; Folk und Finlayson, aaO.; Lorand et al., aaO.). Der kovalente Einbau von α&sub2;-Plasmin-Inhibitor in das Fibrin-Netzwerk kann die Widerstandsfähigkeit des Gerinnsels gegen Lyse erhöhen (Lorand et al., aaO.).
Faktor XIII-Mangel führt zu "verzögerter Blutung", beeinträchtigt aber nicht die primäre Hämostase (Lorand et al., aaO.). Gegenwärtige Behandlungspraktiken für Patienten mit Faktor XIII- Mangel umfassen im allgemeinen Substitutionstherapie mit Plasma oder Plasmaderivaten oder mit einem rohen Plazenta-Faktor-XIII- Konzentrat (Lorand et al., aaO.; Forbisch et al., Dtsch. med. Wochenschr. 97: 449-502, 1972; Kuratsuji et al., Haemostasis 11: 229-234, 1982).
Faktor XIII ist auch nützlich bei der Behandlung von Patienten mit Störungen bei postoperativer Wundheilung (Mishima et al., Chirurg 55: 803-808, 1984; Baer et al., Zentrabl. Chir. 105: 642-651, 1980), Sclerodermie (Delbarre et al., Lancet 2: 204, 1984; Guillevin et al., La Presse Medicale 14: 2327-2329, 1985; Guillevin et al., Pharmatherapeutica 4: 76-80, 1985; und Grivaux und Pieron, Rev. Pnemnol. Clin. 43: 102-103, 1987), Colitis ulcerosa (Suzuki und Takamura, Throm. Haemostas. 58: 509, 1987), Colitis pseudomembranacea (Kuratsuji et al., Haemostasis 11: 229-234, 1982) und als ein Prophylaktikum gegen erneute Blutung bei Patienten mit subarachnoidalem Hämatom (Henze et al., Thromb. Haemostas. 58: 513, 1987). Außerdem ist Faktor XIII als eine Komponente von Gewebeklebern verwendet worden (U.S. Patents Nos. 4,414,976; 4,453,939; 4,377,572; 4,362,567; 4,298,598; 4,265,233 und U.K. Patent No. 2 102 811 B).
Eine Anzahl von Reinigungsschemata für Faktor XIII ist beschrieben worden. Chung und Folk (J. Biol. Chem. 247: 2798-2807, 1972) stellten Faktor XIII aus mit Blutplättchen konzentriertem Plasma oder aus einer Fibrinogen-Zubereitung her. Cooke und Holbrook (Biochem. J. 141: 79-84, 1974) beschreiben die Reinigung von Faktor XIII aus der Cohn-I-Fraktion. Das Verfahren umfaßt mehrere Ammoniumsulfat-Fällungsschritte und Fraktionierung auf DEAE- Cellulosechromatographie, um Faktor XIII aus Plasma zu reinigen. Skrzynia et al. (Blood 60: 1089-1095, 1985) reinigten die a- Untereinheit von Faktor XIII aus einem Plazenta-Konzentrat durch Chromatographie und Ammoniumsulfat-Fällung. Zwisler et al. (U.S. Patent 3,904,751) und Bohn et al. (U.S. Patent 3,931,399) beschreiben mehrstufige Isolierungsverfahren, die auf der Verwendung von Diaminoethoxyacridinlactat beruhen, um Faktor XIII auszufällen. Dieses Fällungsmittel wäre eine unannehmbare Verunreinigung in einer therapeutischen Zusammensetzung. Falke (U.S. Patent 4,597,899) beschreibt die Isolierung von Faktor XIII aus einem Plazenta-Extrakt durch Alkohol-Fällung.
Viele der früher beschriebenen Verfahren zur Reinigung von Faktor XIII sind darauf gerichtet gewesen, ihn aus Plasma, Serum oder Fraktionen davon zu isolieren. Diese Ausgangsmaterialien sind bereits an Faktor XIII angereichert, und die verunreinigenden Proteine sind im allgemeinen gut charakterisiert und mit bekannten Verfahren entfernbar. Überdies sind viele der bekannten therapeutischen Zusammensetzungen auf der Basis von Faktor XIII Plasmafraktionen, die an Faktor XIII angereichert worden sind und weitere Plasmaproteine enthalten, wie etwa Fibrinogen und Fibronectin. Folglich sind früher beschriebene Reinigung- oder Anreicherungsschemata schlecht geeignet, hochgereinigten Faktor XIII aus heterogenen Ausgangsmaterialien herzustellen, einschließlich rohen Zell-Lysaten, in denen die verunreinigende proteolytische Aktivität hoch sein kann oder unannehmbare Verunreinigungen vorhanden sein können. Außerdem wurden viele dieser Verfahren für die Reinigung im Labormaßstab entwickelt und sind schwierig im Maßstab zu erhöhen für wirtschaftliche Herstellung therapeutischer Mengen von Faktor XIII.
Es besteht daher ein Bedürfnis in der Technik nach einfachen, wirtschaftlichen Verfahren zur Reinigung von Faktor XIII. Es besteht ein weiteres Bedürfnis in der Technik nach Reinigungsverfahren, die Faktor XIII-Zubereitungen mit niedrigen Gehalten an Faktor XIIIa liefern. Solche Verfahren sollten sich selbst anbieten zur Großmaßstabsproduktion von hochgereinigtem Faktor XIII aus rohen Ausgangsmaterialien, wie etwa Lysaten von rekombinanten Zellen. Die vorliegende Erfindung stellt solche Verfahren, zusammen mit anderen, verwandten Vorteilen, zur Verfügung.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt hochgereinigte Faktor XIII- Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem Faktor XIII zur Verfügung. Unter Verwendung der offenbarten Verfahren kann Faktor XIII erhalten werden, der wenigstens 99% rein im Hinblick auf verunreinigende Proteine ist. Diese Verfahren sind besonders geeignet zur Reinigung von rekombinantem Faktor XIII, einschließlich von durch Hefe produziertem rekombinanten menschlichen Faktor XIII. In einer Ausführungsform werden Zusammensetzungen von durch Hefe produziertem rekombinanten Faktor XIII erhalten, die weniger als 100 Teile pro Million (ppm) Hefeprotein enthalten. In verwandten Ausführungsformen werden Zusammensetzungen erhalten, die weniger als 50 ppm, weniger als 20 ppm, weniger als 10 ppm und weniger als 1 ppm Hefeprotein enthalten. In zusätzlichen Ausführungsformen werden Zusammensetzungen erhalten, in denen 1% oder weniger des Faktors XIII Faktor XIIIa ist, sowie Zusammensetzungen, in denen 0,5% oder weniger des Faktors XIII Faktor XIIIa. Diese hochgereinigten Faktor XIII-Zusammensetzungen sind geeignet zur Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie etwa Gewebekleber.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind allgemein gekennzeichnet durch die Verwendung eines oder mehrerer Kristallisationsschritte, in denen Faktor XIII aus einer biologischen Flüssigkeit durch die Bildung eines kristallinen Faktor XIII-Niederschlags isoliert wird, der anschließend gewonnen wird. In einer Ausführungsform umfaßt die Reinigung die Schritte: (a) Fraktionieren einer biologischen Flüssigkeit durch Anionenaustauschchromatographie, um eine an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen, (b) Zugeben von Na-Acetat zur angereicherten Fraktion, um einen kristallinen Niederschlag zu bilden, (c) Lösen des Niederschlages, um eine Lösung zu bilden, (d) Fraktionieren der Lösung durch hydrophobe Chromatographie, um eine zweite an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen, (e) Fraktionieren der zweiten angereicherten Fraktion durch Anionenaustauschchromatographie, um eine dritte an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen, (f) Einstellen des pHs der dritten angereicherten Fraktion auf pH 5,2-6,5, um einen Faktor XIII enthaltenden Niederschlag herzustellen, (g) Gewinnen besagten Niederschlages, (h) Lösen des Niederschlages, um eine Lösung zu bilden, und (i) Fraktionieren der Lösung durch Gelfiltration und Sammeln einer Faktor XIII enthaltenden Peakfraktion. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Schritt des Einstellens des pHs das Zugeben von Bernsteinsäure zur angereicherten Fraktion. In einer verwandten Ausführungsform wird Faktor XIII aus einer biologischen Flüssigkeit mit einem Verfahren gereinigt, das die Schritte umfaßt: (a) Fraktionieren einer biologischen Flüssigkeit durch Anionenaustauschchromatographie, um eine an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen, (b) Zugeben von Na-Acetat zur angereicherten Fraktion, um einen kristallinen Niederschlag zu bilden, (c) Lösen des Niederschlages, um eine Lösung zu bilden, (d) Fraktionieren der Lösung durch Anionenaustauschchromatographie, um eine zweite an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen, (e) Fraktionieren der zweiten angereicherten Fraktion durch hydrophobe Chromatographie, um eine dritte an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen, (f) Fraktionieren der dritten angereicherten Fraktion durch hydrophobe Chromatographie, um eine vierte an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen, und (g) Fraktionieren der vierten angereicherten Fraktion durch Gelfiltration und Sammeln einer Faktor XIII enthaltenden Peakfraktion.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die anliegenden Zeichnungen deutlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 veranschaulicht das Plasmid pD16.
Figur 2 ist ein Flußdiagramm, das ein Reinigungsprotokoll für rekombinanten Faktor XIII, hergestellt in Hefezellen, zusammenfaßt.
Figur 3 veranschaulicht ein typisches Elutionsprofil von Faktor XIII aus DEAE-fast-flow-Sephadex. Der Balken zeigt die Fraktionen, die für anschließende Piperazin-Fällung gepoolt wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Vor der Darstellung der Erfindung kann es für ein Verständnis derselben von Nutzen sein, bestimmte hierin im weiteren verwendete Begriffe zu definieren.

Faktor XIII:

Der Begriff "Faktor XIII" schließt das vollständige Faktor-XIII-Zymogen-Tetramer, die a'&sub2;b&sub2;-Zwischenstufe und Faktor XIIIa ein, sowie Untereinheiten davon, einschließlich der a- Untereinheit, der a'-Untereinheit und a&sub2;-Dimeren.

Biologische Flüssigkeit:

Jede Flüssigkeit, die gewonnen ist aus Zellen, Zellkomponenten oder Zellprodukten oder diese enthält. Biologische Flüssigkeiten schließen Zellkultur-Überstände, Zell- Lysate, geklärte Zell-Lysate, Zell-Extrakte, Gewebe-Extrakte, Blut, Plasma, Serum und Fraktionen derselben ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.

Fällungsmittel:

Eine Verbindung, die, wenn sie zu einer Lösung zugegeben wird, bewirkt, daß eine andere Verbindung aus der Lösung ausfällt. Die Fällung kann auf der Bildung eines Komplexes zwischen dem Fällungsmittel und der anderen Verbindung oder einer Phasenveränderung, die zu Unlöslichkeit führt, beruhen. Fällungsmittel schließen organische Modifikatoren, z.B. Ethanol, Propanol, Polyethylenglykol und Salze, wie etwa Ammoniumsulfat, ein.

Puffer:

Eine Substanz, die merkbare pH-Änderungen in Lösungen verhindert, zu denen geringe Mengen Säuren oder Basen zugegeben werden. Ein Puffer umfaßt im allgemeinen eine Kombination der Protonendonator- und Protonenakzeptor-Formen einer schwachen Säure oder schwachen Base. Zugabe von geringen Mengen Säure oder Base zu einer gepufferten Lösung verschiebt das Gleichgewicht zwischen dem Protonendonator und Protonenakzeptor. Diese Gleichgewichtsverschiebung stabiliert den pH.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen von Faktor XIII zur Verfügung, die mehr als 99% rein im Hinblick auf verunreinigende Proteine sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Faktor XIII aus einer Vielzahl von biologischen Flüssigkeiten gereinigt, einschließlich Lysaten oder Extrakten von Zellen, die natürlicherweise Faktor XIII in gewinnbaren Mengen produzieren wie etwa Plazenta-Zellen, sowie Blut und Blutfraktionen. Lysate und Extrakte solcher Zellen und Gewebe können mit einer Vielzahl von in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Aufgrund des Risikos viraler Kontamination von Blut und Geweben sind jedoch Flüssigkeiten, die aus virusfreien Zellen oder Zell-Linien, die genetisch modifiziert worden sind, um Faktor XIII zu produzieren, gewonnen worden sind, bevorzugte Quellen. Besonders bevorzugte biologische Flüssigkeiten in dieser Hinsicht schließen Lysate und geklärte Lysate von Hefezellen ein, die transformiert worden sind, um Faktor XIII zu produzieren, obgleich im Prinzip jeder Zelltyp verwendet werden kann, der in der Lage ist, klonierte DNA-Sequenzen zu exprimieren. Zum Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Zubereitungen von rekombinantem Faktor XIII aus Hefezell-Lysaten herzustellen, wobei die Zubereitungen signifikant weniger als 10 ppm Hefeprotein enthalten. Solche Gehalte an Verunreinigungen liegen innerhalb der für Medikamente für den Menschen etablierten Grenzen. Gehalte an verunreinigenden Proteinen werden mit herkömmlichen Techniken (z.B. ELISA) untersucht. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind somit besonders gut geeignet für die Herstellung von Faktor XIII zur Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen.
Die Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung stellen den zusätzlichen Vorteil bereit, daß aktivierter Faktor XIII (Faktor XIIIa) entfernt wird. Im Labor der Erfinder ist festgestellt worden, daß Zubereitungen von Faktor XIII, die 5-6% Faktor XIIIa enthalten, letal sind, wenn sie Labortieren injiziert werden. Es ist daher wichtig, daß Zubereitungen von Faktor XIII für systemische Therapie nicht mehr als 1% Faktor XIIIa enthalten, vorzugsweise nicht mehr als 0,5% Faktor XIIIa. Solche Zusammensetzungen sind für systemische Langzeitverabreichung in hoher Dosis an Patienten geeignet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist festgestellt worden, daß Faktor XIII geringe Löslichkeit in Lösungen mit niedriger Ionenstärke mit einem pH bei oder um seinen isoelektrischen Punkt herum (d.h. ungefähr 5,8) besitzt, was die Abtrennung von Faktor XIII aus einer Lösung ohne die Notwendigkeit von Fällungsmitteln ermöglicht. So wird Faktor XIII aus einer biologischen Flüssigkeit gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert, indem der pH der Flüssigkeit auf etwa 5,2 bis 6,5 eingestellt wird, etwa durch Pufferaustausch oder Ansäuerung, um einen kristallinen Niederschlag zu bilden. Es ist festgestellt worden, daß ein solcher Fällungsschritt einen überraschend hohen Grad an Reinigung von Faktor XIII bereitstellt. Es ist festgestellt worden, daß Fällung bei oder um den isoelektrischen Punkt herum, wenn verwendet in Kombination mit einem oder mehreren chromatographischen Trennschritten, zu Zubereitungen von Faktor XIII führt, die mehr als 99% rein sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der oben beschriebene Fällungsschritt mit einem Kristallisationsschritt kombiniert, in dem Na-Acetat zu einer Faktor XIII enthaltenden Lösung zugegeben wird, was die Kristallisation des Faktors XIII bewirkt. Die Kristalle werden mit herkömmlichen Mitteln gewonnen, wie etwa Zentrifugation oder Filtration.
Wie oben angemerkt, sind rekombinante Zellen und Zell-Linien bevorzugte Quellen für Faktor XIII. Faktor-XIII-cDNA-Klone vom Menschen und Rind und Produktion von Faktor XIII in rekombinanten Zellen, einschließlich Bakterien, Hefe und kultivierten Säugerzellen, ist beschrieben worden von Grundmann et al. (veröffentlichte Australische Patentanmeldung 69896/87) und Davie et al. (EP 268,772). Besonders bevorzugte Wirtszellen zur Produktion von rekombinantem Faktor XIII schließen Hefen ein, wie etwa Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) und Spezies von Pichia und Kluyveromyces. Verfahren zum Exprimieren klonierter DNA-Sequenzen sind in der Technik gut bekannt. Kurz gesagt wird eine DNA- Sequenz, die Faktor XIII codiert, operabel verknüpft mit geeigneten Promotor- und Terminatorsequenzen in einem mit der ausgewählten Wirtszelle kompatiblen Vektor. Der Vektor wird anschließend in die Wirtszelle inseriert und die resultierenden rekombinanten Zellen werden kultiviert, um Faktor XIII zu produzieren. In Abhängigkeit von der besonderen Wirtszelle und der verwendeten Expressionseinheit kann der Faktor XIII entweder aus der Zelle sekretiert oder im Zytoplasma zurückgehalten werden.
Wenn man Zellen verwendet, die den Faktor XIII nicht sekretieren, werden die Zellen aus dem Kulturmedium entfernt (z.B. durch Zentrifugation) und behandelt, um ein Lysat herzustellen. Typischerweise werden Hefezellen durch mechanisches Aufbrechen unter Verwendung von Glasperlen behandelt, um ein rohes Lysat herzustellen. Vorzugsweise wird das rohe Lysat zentrifugiert und die Überstandsfraktion wird gewonnen. Der Überstand wird behandelt, um ein geklärtes Lysat herzustellen, typischerweise durch Zentrifugation bei mäßiger Geschwindigkeit (z.B. 10.000 x g) oder Filtration durch eine Membran mit einem Schnitt bei hohem Molekulargewicht.
Wenn man mit rohen Zell-Lysaten arbeitet, bei denen wahrscheinlich ist, daß sie hohe Gehalte an Proteasen enthalten, ist es bevorzugt, die Zeit, in der das Lysat sich in einer konzentrierten Form befindet, zu minimieren. Dies kann leicht erreicht werden, indem das Lysat schnell verdünnt wird, vorzugsweise in kaltem (2-5ºC) Wasser. Im allgemeinen wird das Lysat relativ zur Ausgangszllaufschlämmung etwa 3- bis 10-fach verdünnt werden. Faktor XIII kann auch aus Zellen erhalten werden, die ihn in das Kulturmedium hinein sekretieren. Zellen werden transformiert, um Faktor XIII-Unterheiten mit einer daran gebundenen sekretorischen Signalsequenz zu exprimieren, die vom Faktor XIII-Protein durch Proteolyse entfernt wird, wenn es den sekretorischen Weg der Wirtszelle durchläuft. Zur Reinigung des Faktors XIII werden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, das Medium wird fraktioniert und der Faktor XIII wird gewonnen.
Wenn man mit biologischen Flüssigkeiten arbeitet, die komplexe Mischungen von Proteinen enthalten, ist es im allgemeinen bevorzugt, zunächst die biologische Flüssigkeit durch Anionenaustauschchromatographie zu fraktionieren, um eine angereicherte Fraktion herzustellen. Typischerweise wird eine geklärte biologische Flüssigkeit über eine Säule aus einem Anionenaustauschmedium bei neutralem bis leicht alkalischem pH geleitet und unter Verwendung eines geeigneten Elutionspuffers eluiert. Geeignete Anionenaustauschmedien schließen derivatisierte Dextrane, Agarose, Cellulose, Polyacrylamid, Spezial-Silicas, etc. ein. PEI-, DEAE-, QAE- und Q-Derivate sind bevorzugt, wobei DEAE fast-flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) besonders bevorzugt ist. Wie die Fachleute anerkennen werden, kann Fraktionierung auch in einem Batchverfahren durchgeführt werden. Peakfraktionen (wie bestimmt durch Überwachen der Extinktion des Eluats bei 280 nm) werden für anschließende Ausfällung von Faktor XIII gepoolt.
Obgleich die angereicherte Fraktion aus dem Anionenaustauschchromatographieschritt einer Fällung bei pH 5,2-6,5 unterzogen werden kann, ist es bevorzugt, mehrere dazwischenliegende Reinigungsschritte anzuwenden, einschließlich Kristallisation, Fraktionierung durch hydrophobe Chromatographie und einen zweiten Anionenaustauschchromatographieschritt. Kristallisation wird durchgeführt, wie oben beschrieben, indem Natriumacetat bis zu einer Konzentration von 9-18%, vorzugsweise etwa 11 Gew.-%, bei einem pH von etwa 6,2 bis etwa 7,5 zugegeben wird. Kristallisation wird bei einer Temperatur von 4-25ºC, vorzugsweise etwa 15ºC, durchgeführt. Der kristalline Niederschlag wird gewonnen, in einem leicht alkalischen Puffer gelöst und durch hydrophobe Chromatographie fraktioniert. Geeignete Chromatographiemedien in dieser Hinsicht schließen diejenigen Medien ein, die mit Phenyl-, Butyl- oder Octylgruppen derivatisiert sind, wie etwa Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearlbutyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) und dergleichen; oder Polyacrylharze wie etwa Amberchrom CG 71 (Toso Haas) und dergleichen. In einem typischen Reinigungsprotokoll wird eine Faktor XIII-Lösung auf eine Säule aus Phenyl-Sepharose FF aufgebracht, die Säule wird mit 20mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, der 60 mS/cm NaCl und 2mM EDTA enthält, gewaschen. Der Faktor XIII wird aus der Säule mit einem absteigenden Salzgradienten bis 10mM Glycin, 1 mM EDTA, pH 7,4, eluiert. Peakfraktionen werden gewonnen, gepoolt und auf eine Anionenaustauschsäule aufgebracht. Eine Vielzahl von Anionenaustauschmedien kann verwendet werden, wobei Harze vom Q-Typ bevorzugt sind. In einem typischen Verfahren werden die Peakfraktionen aus der hydrophoben Chromatographie auf eine Säule aus Q-Sepharose FF (Pharmacia) aufgebracht. Diese Säule wird mit 10 mM Glycin, 20 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH 7,4, NaCl bis 11 mS/cm, gewaschen. Faktor XIII wird unter Verwendung eines Salzgradienten bis 10 mM Glycin, 20 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, 0,25 M NaCl, pH 7,4, eluiert.
Faktor XIII wird anschließend durch Einstellen des pHs der Faktor XIII-Zubereitung, wie oben beschrieben, ausgefällt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Faktor XIII-Zubereitung bis zu einem pH von 5,2-6,5, vorzugsweise etwa pH 5,4 bis 6,2, am bevorzugtesten etwa pH 5,8, durch die Zugabe von Säure, wie etwa Bernsteinsäure, Zitronensäure, Phosphorsäure oder Essigsäure, angesäuert. 0,2-0,5 M Bernsteinsäure ist besonders bevorzugt. Der Niederschlag wird anschließend bei pH 5,2 bis 6,5, vorzugsweise etwa pH 5,4 bis 6,2, am bevorzugtesten etwa pH 5,8, gewaschen und anschließende Zentrifugation, oder durch Diafiltration gegen einen Puffer mit pH 5,2 bis 6,5 unter Verwendung eines 0,5 mm Hohlfaserfilters. Bevorzugte Puffer schließen 20-500 mM Ammoniumsuccinat-Lösungen ein. Es ist bevorzugt, in dieser Stufe in den Puffer EDTA einzubeziehen. Bevorzugte Puffer schließen 0,05 M Ammoniumsuccinat pH 5,8, 1,0% Polyethylenglykol (PEG) 8000 USP, 0,005 M EDTA, 5 mM NA-Ascorbat; und 0,05 M Ammoniumsuccinat, 2mM EDTA, 5 mM Natriumascorbat, pH 5,8 ein. Der Puffer wird allgemein der im Ansäurungsschritt verwendeten Säure entsprechen (z.B. Bernsteinsäure-Succinat-Puffer, Zitronensäure-Citrat-Puffer).
In einer alternativen Ausführungsform wird die angereicherte Fraktion aus der Anionenaustauschchromatographie durch Fällung mit 40% gesättigtem (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; konzentriert. Der Niederschlag wird in einem kleinen Volumen Puffer bei einem pH zwischen etwa 7,0 und 8,0 gelöst. Die resultierende Lösung wird anschließend gegen einen Puffer mit niedriger Ionenstärke bei pH 5,2 bis 6,5 dialysiert, um einen kristallinen Niederschlag herzustellen. Puffer werden im allgemeinen bei einer Konzentration von zwischen etwa 10 mM und 400 mM, vorzugsweise etwa 50 mM, verwendet. Geeignete Puffer in dieser Hinsicht schließen Lösungen mit niedriger Ionenstärke von heterozyklischen Polyaminen, wie etwa Piperazin, Spermidin, Cadaverin und Derivaten derselben, sowie MES, Phosphat, ADA und Bis-Tris-Puffer, eingestellt auf den gewünschten pH, ein. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "niedrige Ionenstärke" Lösungen ein, die weniger als etwa 200 mM NaCl enthalten. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen, wieder gelöst und ein zweites Mal gegen den Fällungspuffer dialysiert.
Fällung von Faktor XIII bei pH 5,2 bis 6,5 wird erleichtert, indem die Lösung zunächst konzentriert wird. Obgleich die optimale Konzentration in gewissem Maße vom Puffersystem abhängen wird, ist es allgemein gewünscht, mit Faktor XIII-Lösungen mit wenigstens 0,2 mg/ml, vorzugsweise mehr als 0,5 mg/ml, bevorzugter 2-25 mg/ml zu arbeiten.
Wie den Fachleuten deutlich sein wird, wird Fällung von Faktor XIII aus anderen biologischen Flüssigkeiten in im wesentlichen derselben Art und Weise durchgeführt werden, d.h. durch Ansäurung oder durch Dialyse der Flüssigkeit gegen den Fällungspuffer, um einen Niederschlag herzustellen.
Zusätzliche Reinigung wird erreicht durch die Verwendung herkömmlicher chromatographischer Trenntechniken, einschließlich Ionenaustauschchromatographie, hydrophober Chromatographie, Immobilized-Metal-Chromatographie und Gelfiltration. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der ausgefällte Faktor XIII in Puffer gelöst, um eine Lösung herzustellen, typischerweise in einem Puffer mit niedriger Ionenstärke bei leicht alkalischem pH, anschließend Fraktionieren der Lösung durch Gelfiltration, wie etwa durch Gelfiltration auf Sephacryl-S-200 (Pharmacia) oder dergleichen. In einem typischen Protokoll wird eine 20 g/l- Lösung von Faktor XIII in 10 mM Glycin, 20 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl auf eine Sephacryl S-200-Säule geladen. Faktor XIII wird unter Verwendung desselben Puffers, eingestellt auf 0,1 M NaCl, von der Säule eluiert. Peakfraktionen werden gesammelt, konzentriert (z.B. durch Diafiltration), sterilisiert und lyophilisiert. Vor der Lyophilisation ist es bevorzugt, den Faktor XIII in einer phosphatgepufferten Lösung zu formulieren, die ungefähr 10 mM Glycin oder Arginin, 0,1 mM EDTA und 2 Gew.-% Saccharose, Mannose oder einen anderen nicht-reduzierenden Zukker enthält und die bei Rekonstitution einen pH von ungefähr 7,8 liefert. Auf diese Weise hergestellter Faktor XIII ist typischerweise mehr als 99% rein und pyrogenfrei.
In der Alternative kann der Fällungsschritt bei pH 5,2-6,5 ersetzt werden durch einen hydrophoben Chromatographieschritt. Geeignete chromatographische Medien in dieser Hinsicht schließen diejenigen ein, die mit Phenyl-, Butyl- oder Octylgruppen derivatisiert sind und Acrylharze. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Faktor XIII teilgereinigt in einer Art und Weise, die ähnlich ist zu derjenigen, die oben beschrieben worden ist, unter Verwendung einer Kombination von Anionenaustauschchromatographie, Natriumacetat-Kristallisation, einem zweiten Anionenaustauschchromatographieschritt und hydrophober Chromatographie. Peakfraktionen aus dem hydrophoben Chromatographieschritt werden gepoolt und auf einer zweiten hydrophoben Chromatographiesäule fraktioniert, wie etwa einer Säule aus Amberchrom CG 71 (Toso Haas) oder dergleichen. Faktor XIII wird von der Säule unter Verwendung eines abnehmenden Salzgradienten eluiert. Peakfraktionen werden gesammelt, filtriert, konzentriert und für die Lagerung lyophilisiert, wie oben beschrieben. Faktor XIII-Zusammensetzungen, die auf diese Art und Weise hergestellt worden sind, enthalten minimale Mengen von Faktor XIIIa, typischerweise weniger als 0,3% des gesamten Faktors XIII.
Im Rahmen der oben beschriebenen Verfahren ist es bevorzugt, Faktor XIII-Lösungen vor jedem der verschiedenen Chromatographieschritte zu filtrieren. Filtration wird durchgeführt unter Verwendung von Filtern mit 0,45 µm oder 0,2 µm.
Die Reinheit von Faktor XIII-Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wird mit herkömmlichen Verfahren überwacht. Im Anschluß an einzelne Trennschritte können Peakfraktionen durch Extinktion bei 280 nm identifiziert werden. Gereinigter Faktor XIII kann durch Aminosäureanalyse, Aktivitätstest oder dergleichen quantifiziert werden. Der Gehalt an Faktor XIIIa kann gemessen werden durch Durchführung von Aktivitätstests mit und ohne Thrombinbehandlung. Die Verunreinigung von Zubereitungen von rekombinantem Faktor XIII durch Wirtszellprotein kann mit immunologischen Verfahren untersucht werden, wie etwa enzymverknüpften Immuntests (ELISA). Solche Tests werden mit solchen Empfindlichkeitsniveaus entwickelt werden, die zur Verwendung innerhalb der Pharmazie geeignet sind. Zum Beispiel kann ein ELISA-Test vom Sandwich-Typ mit hoher Empfindlichkeit durch Optimierung von Antikörperproduktion und Testbedingungen entwickelt werden. Wenn man auf heterogene Antigene testet, wie etwa Wirtsantigene, die in einem rekombinanten Protein vorhanden sein würden, ist es bevorzugt, polyklonale Antiseren zu verwenden. Antigen wird aus dem Wirtsproduktionsorganismus durch Fermentation nicht-transformierter Zellen und Gewinnung von Antigen hergestellt. Typischerweise wird ein Hefeantigen durch Fermentieren nicht-transformierter Zellen desselben Stammes hergestellt, wie er für die Produktion von Faktor XIII verwendet wird. Die Zellen werden geerntet und einer Lyse unterzogen, wie bei der Isolierung von Faktor XIII, und das Lysat wird als ein Immunogen in weiblichen Kaninchen verwendet. Antiseren werden anschließend gewonnen und gepoolt. Wenn man auf reine Antigen-Verunreinigungen testet, sind monoklonale Antikörper bevorzugt. Die Antiseren oder Antikörper werden gereinigt, wie etwa durch Reinigung auf Protein A, gefolgt von Reinigung auf entweder einer Antigen-Säule (um die gewünschten Antikörper zurückzuhalten) oder einer Produkt-Säule (um kreuzreagierende Antikörper zu entfernen). Antikörper oder Antiseren werden anschließend gescreent und auf Titer und Selektivität charakterisiert. Um das Verhältnis von Signal zu Hintergrund innerhalb des Tests zu optimieren, werden die verschiedenen Komponenten und Bedingungen des Tests untersucht. Diese Komponenten und Bedingungen schließen den Typ der zu verwendenden Platte; Beschichtungsbedingungen für die Antiseren; Lagerbedingungen für die beschichtete Platte; Bedingungen für das Blockieren und Waschen, einschließlich Blockierungsmittel, Blockierungszeit und Waschlösung; Probenfangbedingungen, einschließlich pH, Ionenstärke, Temperatur, Inkubationszeit und Puffer; Bedingungen für das Aufbringen des zweiten Antikörpers, einschließlich Markierung, Inkubationszeit, pH und Ionenstärke; Entwicklungsbedingungen, einschließlich Typ des Entwicklungsmittels (z.B. Meerrettich- Peroxidase oder alkalische Peroxidase), Temperatur, Zeit, optimale O.D.; und übrige Waschschritte und Bedingungen ein. Wenn erst einmal Bedingungen entwickelt worden sind, wird das Verfahren unter Verwendung von Spike-Recovery-Studien von Proben validiert, um die Genauigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Auswahl und Entwicklung geeigneter Tests liegt im Durchschnittskönnen des Fachmannes.
Faktor XIII, der mit den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, kann verwendet werden, um pharmazeutische Zubereitungen herzustellen, wie etwa Gewebekleber, gemäß in der Technik bekannten Verfahren. Solche Zubereitungen sind zum Beispiel in U.S. Patent 4,265,233 und der veröffentlichten Au-stralischen Patentanmeldung 75097/87 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme mit einbezogen werden.
Die folgenden Beispiele werden zu Veranschaulichungszwecken angeboten und nicht zu Zwecken der Beschränkung.

BEISPIELE

Eine cDNA, die die a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII co-diert, wurde kloniert wie zuvor beschrieben (Ichinose et al., Biochemistry 25: 6900-6906, 1986; Davie et al., EP 268,772). Die a-Untereinheits-cDNA wurde verwendet, um einen Hefeexpressionsvektor, pD16, zu konstruieren (Figur 1). Kurz gesagt ist pD16 ein Vektor auf der Basis des 2-Mikron-Plasmids von S. cerevisiae, abgeleitet von pCPOT (ATCC No. 39685), wie offenbart in Bishop (WO91/16931). Er umfaßt eine Expressionseinheit, die den S. cerevisiae ADH2-4c-Promotor (veröffentlichte Europäische Patentanmeldung EP 284,044) und TPI1-Terminator (U.S. Patent 4,931,373) einschließt, und einen selektionierbaren Marker POT1 (U.S. Patent No. 4,931,373), der Plasmidselektion in glucosehaltigen Medien erlaubt. Die Faktor XIII- und POT1-Sequenzen werden in den Vektor in entgegengesetzten Transkriptionsorientierungen inseriert (Figur 1).

Beispiel 1

A. Fermentation and Up-Stream-Verarbeitung

Ein beispielhaftes Verfahren zur Reinigung von Faktor XIII aus rekombinanten Hefewirtszellen ist in Figur 2 zusammengefaßt. Kurz gesagt werden die Zellen geerntet und einer Lyse unterzogen, und das Lysat wird geklärt. Das geklärte Lysat wird anschließend konzentriert und durch Chromatographie fraktioniert. Faktor XIII wird aus den Faktor XIII enthaltenden Fraktionen unter Verwendung von Piperazin ausgefällt, und ein abschließender Blankfiltrierschritt wird verwendet, um Spurenverunreinigungen zu entfernen.
Saccharomyces cerevisiae-Stamm ZM118 (ein MATa/MATα-Diploid , homozygot für leu2-3,112 ura3 tpil::URA3&spplus; bar1 pep4::URA3&spplus; [cirº]) wurde mit pD16 transformiert. Die transformierten Zellen wurden mit ungefähr 0,1 g/l eingeimpft und in einem Medium mit pH 5,5 kultiviert, das 25 g/l Hefeextrakt, 22,5 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 6,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3 g/l MgSO&sub4; und 0,5% Glucose enthielt, mit einer Glucose-Zufuhr von 0 bis 24 oder 40 Stunden und einer Ethanolzufuhr von 0 bis 12 oder 20 Stunden. Die Kulturen (10 bis 60 Liter) wurden bei 30ºC bis zu einer abschließenden Zelldichte von ungefähr 60 g/l wachsen gelassen.
Zellkulturen wurden durch Konzentration unter Verwendung einer 0,2 µ-Cellulose-Ester-Hohlfaserpatrone (Microgon, Laguna Hills, CA) geerntet. Das endgültige Konzentrat enthielt typischerweise 600-3000 g Naßgewicht Hefezellen (Konzentration > 50% Naßgewicht) in entionisiertem H&sub2;O.
Die konzentrierten Zellen wurden anschließend einer Lyse unterzogen. Ein Maximum von 400 g (Naßgewicht) Zellen wurde auf 40% Naßgewicht in Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 15 mM EDTA, 5 mM 2-ME, 1 mM PMSF) verdünnt. Die Zellen wurden in kontinuierlichem Durchflußmodus unter Verwendung einer Dynomill (Glen Mills, Inc., Maywood, NJ) einer Lyse unterzogen. Die Zellsuspension wurde mit 0,5 Litern von mit Säure gewaschenen 500 µ- Glasperlen in einem 0,6 Liter-Behälter vereinigt und unter Verwendung einer Durchflußrate von 60-100 ml/ min., um eine mittlere Verweilzeit von 3-5 Minuten zu ergeben, bei 3000 UPM einer Lyse unterzogen. Ein zusätzlicher Liter Puffer wurde durch den Behälter gepumpt.
Das Lysat wurde anschließend durch Zentrifugation geklärt. Ein- Liter-Flaschen Lysat wurden in einer Zentrifuge Sorvall RC-3B bei 5000 UPM in einem Rotor H-6000A für 45 Minuten zentrifugiert und die Pellets wurden verworfen. Die Überstandfraktionen wurden anschließend durch die Zugabe von PMSF auf eine Endkonzentration von 1 mM und 0,3 Volumenteilen 7% Streptomycinsulfat konditioniert. Die Mischung ließ man anschließend für 12 Stunden bei 4ºC stehen. Endgültige Klärung wurde erreicht durch Zentrifugation in einer Zentrifuge Sorvall RC-5B unter Verwendung von 500 ml- Flaschen in einem Rotor GS-3 bei 7500 UPM für 90 Minuten und/oder 250 ml-Flaschen in einem Rotor GSA bei 12000 UPM für 60 Minuten. Das resultierende geklärte Lysat war anschließend bereit zur Down-Stream-Verarbeitung.

B. Down-Stream-Verarbeitung

Das geklärte Lysat wurde durch Zugabe von Polyethylenglykol 1000 (PEG-1000) auf eine Endkonzentration von 12% oder PEG-8000 auf eine Konzentration von 8% fraktioniert. Die Mischung wurde bei 4ºC für 1 Stunde inkubiert, anschließend unter Verwendung von 500 ml-Flaschen in einem Rotor Sorvall GS-3 bei 7500 UPM für 90 Minuten und/oder 250 ml-Flaschen in einem Rotor GSA bei 12000 UPM für 60 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde gewonnen.
Der PEG-Niederschlag wurde in Ausgangspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 5 mM EDTA, 5 mM 2-ME, 0,5 mM PMSF) gelöst und die resultierende Lösung wurde auf eine 6 x 27 cm(500 ml)-Säule aus DEAE- fast-flow Sephadex (Pharmacia) geladen. Die Säule wurde mit 1 l Ausgangspuffer gewaschen, und der Faktor XIII wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von jeweils 1 l Puffer A (50 mM Imidazol, pH 6,3, 5 mM EDTA, 5 mM 2-ME) und Puffer B (Puffer A, der 150 mM NaCl enthält) eluiert. Ein typisches Elutionsprofil ist in Figur 3 dargestellt. Fraktionen wurden untersucht durch Messung des Einbaus von ³H-Histamin in N,N-Dimethylcasein oder durch ELISA. Gepoolte Faktor XIII enthaltende Fraktionen wurden durch Zugabe von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bis 70% Sättigung ausgefällt.
Faktor XIII wurde anschließend unter Verwendung von Piperazin- Puffer ausgefällt. Die (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Mischung wurde zentrifugiert und die Überstandfraktion wurde verworfen. Der Pellet wurde in 50 mM Tris, pH 8,0, 200 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 1 mM 2-ME gelöst und in 50 mM Piperazin, pH 6,0, 5 mM EDTA, 5 mM 2-ME, 0,02 % NaN&sub3; bei 4ºC für etwa 5-12 Stunden dialysiert. Die Mischung wurde anschließend bei 5000 UPM für fünf Minuten in einer Zentrifuge Sorvall RC-5B unter Verwendung eines Rotors SS-34 zentrifugiert. Der resultierende Pellet wurde mehrmals in frischem Piperazin- Puffer gewaschen.
Endreinigung wurde durch Gelfiltration erreicht. Der Piperazin- Pellet wurde in Laufpuffer (50 mM Tris HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 1 mM 2-ME) bei einer Konzentration von < 100 mg Niederschlag pro 20 ml Puffer erneut suspendiert. Die Lösung wurde in Laufpuffer für 5 Stunden bei 4ºC dialysiert und zentrifugiert, um jeglichen Rückstand zu entfernen. Die dialysierte Lösung wurde dann auf eine 4,5 x 80 cm(1270 ml)-Sephadex-S-200- Säule geladen. Die Säule wurde mit Laufpuffer bei 0,17 ml/Minute eluiert. Faktor XIII-Peakfraktionen wurden gepoolt.
Tabelle 1 faßt die Reinigungsschritte, die oben beschrieben sind, zusammen. Ausbeuten wurden mit einem Sandwich-ELISA unter Verwendung eines monoklonalen Mäuse-Antikörpers gegen Plazenta- Faktor XIII und einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper bestimmt. Ausbeuten können unterschätzt sein. Aktivität wurde durch ³H-Histamin-Einbau bestimmt. TABELLE 1
Rohes Lysat durch ELISA ... 480 mg insgesamt FXIII Gesamtausbeute bei Piperazin ppt ... 65%

Beispiel 2

Faktor XIII, gereinigt wie oben beschrieben, wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 1 mM 2-ME bei einer Konzentration von ungefähr 5,8 mg/ml gelöst. 0,5 ml-Aliquote der resultierenden Lösung wurden in Dialysebeutel pipettiert und für zwei Tage bei 4ºC in folgenden Puffern dialysiert:
50 mM MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure), pH 6,1
50 mM PIP (Piperazin), pH 6,2
50 mM Phosphat, pH 6,0
50 mM ADA (N-[2-Acetamido]-2-iminodiessigsäure), pH 6,0
50 mM Bis-Tris (Bis 2-hydroxyethyl]-imino-tris- [hydroxymethyl]methan), pH 6,1
Puffer wurden erhalten von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
Im Anschluß an die Dialyse wurden die Inhalte der Dialysebeutel zentrifugiert und die Pellets und Überstände wurden mit der Bradford-Methode unter Verwendung von Protein Assay Reagent 23200 (Pierce Chemical Co.), wie beschrieben vom Hersteller, auf Faktor XIII getestet. Die Ergebnisse, zusammengefaßt in Tabelle 2, zeigen, daß Faktor XIII in einer Vielzahl von Puffern bei oder um seinen isoelektrischen Punkt herum unlöslich ist. Tabelle 2

Beispiel 3

Saccharomyces cerevisiae-Stamm ZM118 wurde mit pD16 transformiert. Die transformierten Zellen wurden bei ungefähr 0,1 g/l eingeimpft und in einem Medium mit pH 5,5 kultiviert, das 22,7 g/l Hefeextrakt, 22,5 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 6,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,5% Glucose, Spurenelemente und Vitamine enthielt, mit einer Glucosezufuhr für 39 Stunden. Nach 39 Stunden wurden 3,75 g/l Ethanol über 1 Stunde zugegeben, gefolgt von einer Ethanol-Zufuhr, beginnend bei 2,5 g/l/Std. und über 23 Stunden auf eine Endrate von 3,75 g/l/Std. ansteigend. Der pH der Kultur wurde bei ungefähr 5,5 durch die Zugabe von 2M NaOH gehalten. Die Kultur (ungefähr 60 Liter) wurde bei 30ºC für 63 Stunden bis zu einer endgültigen Zelldichte von ungefähr 50 g/l wachsen gelassen.
Zellkulturen wurden durch Konzentration unter Verwendung einer 0,2 µ-Celluloseester-Hohlfaserpatrone (Microgon, Laguna Hills, CA.) geerntet. Das Endkonzentrat enthielt typischerweise 600- 3000 g Naßgewicht Hefezellen (Konzentration > 50% Naßgewicht) in entionisiertem H&sub2;O.
Die konzentrierten Zellen wurden anschließend einer Lyse unterzogen. Ein Maximum von 400 g (Naßgewicht) Zellen wurde bis 40% Naßgewicht in Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM 2-ME) verdünnt. 0,5 M PMSF in absolutem Ethanol wurden zur Zellaufschlämmung bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Die Zellen wurden unter Verwendung einer Dynomill (Glen Mills, Inc., Maywood, NJ) in kontinuierlichem Durchflußmodus einer Lyse unterzogen. Die Dynomill wurde auf 0ºC oder weniger vorgekühlt, und alle Lösungen lagen bei 0-8ºC. Die Zellsuspension wurde mit 0,5 Litern säuregewaschenen 500 µ-Glasperlen in einen 0,6-Liter-Behälter zusammengegeben und unter Verwendung einer Durchflußrate von 150 ml/min. bei 3000 UPM einer Lyse unterzogen. Ein weiterer Liter Lyse-Puffer wurde durch den Behälter gepumpt und zum Zell-Lysat zugegeben. 0,5 M PMSF wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und der pH des Lysats wurde mit 2 M NaOH auf 7,8 eingestellt.
Das Lysat wurde anschließend durch Zentrifugation geklärt. Der pH wurde mit 2 M HCl auf 7,0 eingestellt. Das Lysat wurde anschließend bei 3895 x g bei 4ºC für wenigstens 40 Minuten zentrifugiert, und die Pellets wurden verworfen. Die Überstandfraktionen wurden anschließend konzentriert und gegen drei Volumenteile 1x Äquilibrationspuffer (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM 2-Me, 5 mM EDTA) bis zu einer Leitfähigkeit von weniger als 5 mS/cm unter Verwendung eines Tangentialströmungssystems (Pellicon, Millipore, Bedford, MA) und 10 ft² Polysulfonmembran (PTHK, Millipore) mit einem nominalen Schnitt bei einem Molekulargewicht von 100 kD dialysiert. Dialyse wurde durchgeführt bei 10ºC unter Verwendung eines Einlaßdruckes von 20-25 psi, einem mittleren Transmembrandruck von 4 psi, einem Fluß von 400-500 ml/Minute und einer Querströmungsrate von ungefähr 20 Litern/Minute.
Das konzentrierte, dialysierte Lysat wurde anschließend durch Chromatographie auf einer Säule aus DEAE Sepharose fraktioniert.
Eine DEAE-Säule, 23,5 cm hoch x 5,25 cm Radius (2,0 Liter), wurde mit Äquilibrationspuffer äquilibriert, bis die Leitfähigkeit geringer war als 4,5 mS/cm, unter Verwendung einer Durchflußrate von ungefähr 45 ml/Minute. Die Probe wurde bei einer Durchflußrate von 16 ml/Minute auf die Säule geladen, anschließend wurde die Säule mit Äquilibrationspuffer gewaschen, bis die Extinktion des Eluats bei 280 nm geringer war als 10% der Extinktion im Vollmaßstab (Vollmaßstab = 0,5 AU). Faktor XIII wurde aus der Säule mit 0,12 M Imidazol, pH 5,8, eluiert, das 5 mM PMSF, 10 mM 2-ME und 5 mM EDTA enthielt. Peakfraktionen wurden gepoolt, auf 5 mM PMSF eingestellt und bei 4ºC gehalten. Gepoolte, Faktor XIII enthaltende Fraktionen wurden durch Zugabe von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bis 40% Sättigung ausge-fällt.
Faktor XIII wurde anschließend unter Verwendung von Piperazin- Puffer ausgefällt. Die (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Mischung wurde bei 3958 x g zentrifugiert, und die Überstand-Fraktion wurde verworfen. Der Pellet wurde in einem minimalen Volumen von kaltem 25 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM 2-ME, 0,19 M Glycin, 0,02% NaN&sub3; (TAGS) gelöst. Der pH der Lösung wurde zwischen 7,0 und 8,0 durch die Zugabe von 2 M Tris pH 7,5 gehalten. Die Lösung wurde bei 7649 x g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Der Überstand wurde anschließend gegen 50 mM Piperazin, pH 5,8, 5 mM EDTA, 10 mM 2-ME, 0,02% NaN&sub3; über Nacht bei 4ºC unter Verwendung von Dialyseschlauch mit einem Schnitt bei einem Molekulargewicht von 50.000 kD (Spectra/Por) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde anschließend bei 7649 x g für dreißig Minuten zentrifugiert. Der resultierende Pellet wurde in einem minimalen Volumen von kaltem TAGS wieder gelöst, wobei der pH erforderlichenfalls durch Zugabe von 2M Tris pH 7,8 gehalten wurde. Die Lösung wurde erneut zentrifugiert, und der resultierende Überstand wurde gewonnen und gegen Piperazin-Puffer über Nacht bei 4ºC dialysiert. Die Lösung wurde erneut zentrifugiert, und der Pellet wurde in einem minimalen Volumen von TAGS wie oben gelöst.
Endreinigung wurde durch Gelfiltration erreicht. Faktor XIII in TAGS (30 ml) wurde auf eine 1,5 Liter(95cm hoch x 2,25 cm Radius)-Säule aus Sephacryl S-400 (Pharmacia) geladen. Trennung wurde erreicht durch Verwendung von TAGS als dem Laufpuffer bei einer Durchlfußrate von 3,0 ml/min.. Extinktion des Säuleneluats wurde bei 280 nm überwacht. Der größte-Faktor XIII-Peak eluierte zwischen 1100 - 1350 ml. Die Peakfraktionen wurden gepoolt und durch mehrfache Zentrifugationen in einem Membrankonzentrator (Centriprep, Amicon, Danvers, MA) auf eine Endkonzentration von ungefähr 20 mg/ml konzentriert. Das Konzentrat wurde anschließend über Nacht bei 4ºC gegen 0,19 M Glycin pH 7,4, das 2% Saccharose enthielt, unter Verwendung von Dialyseschlauch mit einem Schnitt bei einem Molekulargewicht von 50.000 kD (Spectra/Por) dialysiert.
Zur Aufbewahrung wurde das dialysierte Material durch einen 0,2 µ-Filter gegeben und in aliquoten Teile in Ampullen abgefüllt. Die Proben wurden auf einer Schicht aus Trockeneis schnell eingefroren und bei -80ºC gelagert. Lyophilisation der eingefrorenen Proben wurde durchgeführt bei -20ºC für 48 Stunden. Der lyophilisierte Faktor XIII wurde unter Argon versiegelt und entwässert bei -20ºC gelagert.

Beispiel 4

Der transformante S. cerevisiae-ZM118/pD16-Stamm wurde als ein eingefrorener Impfvorrat in 2 ml-Aliquoten gelagert. Ein Aliquot wurde verwendet, um 0,7 1 FXIII S zu beimpfen (Tabelle 3). Die Kultur wurde für 26 Stunden bei 30ºC unter Rütteln bei 300 UPM wachsen gelassen. TABELLE 3 Medien für Faktor XIII-Fermentationen Tabelle 3 Fortsetzung
Die Inoculum-Kultur wurde verwendet, um 7 l (nominales Volumen) Fermentationsmedium (Tabelle 3) zu beimpfen. Fermentation wurde für 63,5 Stunden unter Verwendung einer Glucose-Zufuhr (21 ml/1 Stunde 50% Glucose/5% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; für 19 Stunden, dann ansteigend über 7 Stunden auf 142,6 ml/Stunde), gefolgt von einer Ethanol- Zufuhr (58,7 ml/Stunde 95% EtOH), beginnend bei 31 Stunden, durchgeführt. Der pH wurde durch Zugabe von 4 M NH&sub4;OH bei 5,5 gehalten. Schaumbildung wurde mit PPG-2000 (Union Carbide) kontrolliert. Die Kultur wurde bei 550-600 UPM bewegt. Das Gefäß wurde bei 7,5 psi, einem maximalen O&sub2;-Partialdruck von 40% und DO&sub2;> 15% gehalten.
Die Kultur wurde auf 20ºC abgekühlt und geerntet, wie beschrieben in Beispiel 3. 3375 kg nasse gepackte Zellen wurden gewonnen.
Die konzentrierten Zellen wurden anschließend einer Lyse unterzogen. Das Konzentrat wurde auf 40% Naßgewicht in 50 mM Tris- HCl pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM 2-ME eingestellt. Die Zellen wurden anschließend in einer Dynomill (Glen Mills, Inc.) einer Lyse unterzogen, im wesentlichen wie beschrieben in Beispiel 3. Das Lysat wurde anschließend mit entionisiertem H&sub2;O im Verhältnis 1:5 verdünnt und durch Zentrifugation bei 9500 x g in einer Zentrifuge Sharples A3 geklärt.
Anfängliche Fraktionierung wurde durchgeführt auf DEAE Fast Flow Sepharose (Pharmacia). Das Lysat wurde eingestellt auf < 3 mS/cm Leitfähigkeit und pH 7,2 durch Verdünnung mit entionisiertem Wasser. Die Säule (2,5 l) wurde äquilibriert mit Waschpuffer (0,005 M EDTA, 0,05 M Tris-HCl pH 7,4, 0,01 M 2-ME), das Lysat wurde auf die Säule geladen und die Säule wurde mit Waschpuffer gewaschen. Die Säule wurde mit 0,005 M EDTA, 0,01 M 2-ME, 0,12 M Imidazol pH 5,8 eluiert. Peakfraktionen aus der DEAE-Säule, die bei einem pH von ungefähr 7,0 eluierten, wurden gepoolt. Ein Niederschlag, der sich spontan bildete, wurde gewonnen, in TAGS bis 20 mg/ml wieder suspendiert und gegen TAGS über Nacht bei 4ºC dialysiert. Dieses Material wurde anschließend bei 12000 x g für 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und auf einer Säule Sephacryl S-400 (Pharmacia) fraktioniert, wie zuvor beschrieben. Der gereinigte Faktor XIII wurde anschließend zur Aufbewahrung lyophilisiert.
10 mg des lyophilisierten Faktors XIII wurden in 1 ml 10 mM Kaliumphosphat pH 7,8, das 200 mM NaCl, 10 mM Glycin und 10 mM 2-ME enthielt (Puffer A), gelöst. Die Lösung wurde auf eine 10 ml-Säule aus Phenyl-Sepharose (Pharmacia) geladen. Die Säule wurde für 12 Minuten mit Puffer A gewaschen. Protein wurde von der Säule mit einem 40-minütigen linearen Gradienten von Puffer A und Puffer B (10 mM Glycin pH 7,8, 10 mM 2-ME) eluiert. Fraktionen (1,75 ml) wurden gesammelt. Der Faktor XIII-Peak war enthalten in den Fraktionen 35-38. Fraktionen 36-38 (5,25 ml, die 5 mg Faktor XIII enthielten) wurden gepoolt. Faktor XIII in 4 ml des Pools wurde durch Dialyse in 0,05 M Ammoniumsuccinat pH 5,8, 1,5% PEG 8000, 5 mM Na-Ascorbat auskristallisiert. Der Faktor XIII wurde pelletiert und in 1 ml 10 mM Glycin pH 8 plus 20 µl 2 M Tris pH 8 wieder gelöst.

Beispiel 5

Transformierte Hefezellen werden fermentiert, wie im wesentlichen beschrieben in Beispiel 4. Die Zellen werden konzentriert und einer Lyse unterzogen, und das Lysat wird durch Zentrifugation geklärt.
Anfängliche Fraktionierung wird durchgeführt auf DEAE Fast Flow Sepharose (Pharmacia), wie beschrieben in Beispiel 4. Peakfraktionen (wie bestimmt durch A&sub2;&sub8;&sub0;) werden gepoolt und der pH wird durch die Zugabe von 0,5 M Bernsteinsäure auf 5,8 eingestellt. Der resultierende Faktor XIII-Niederschlag wird gewonnen, mit 0,05 M Ammoniumsuccinat, pH 5,8, 1,0% PEG 8000 USP (Union Carbide), 0,005 M EDTA, 0,01 M 2-ME gewaschen, und die Mischung wird homogenisiert. Die Mischung wird anschlies-send bei 10.500 x g in einer Zentrifuge Sorvall RC-5B, ausgestattet mit einem Rotor HB-4, zentrifugiert.
Der Niederschlag wird in 0,02 M Phosphat-Puffer, pH 7,4, 0,3 M NaCl gelöst und auf eine Säule aus Phenyl-Sepharose (Pharmacia) geladen. Die Säule wird mit demselben Puffer gewaschen und mit 0,01 M Glycin pH 7,4 eluiert.
Der A&sub2;&sub8;&sub0;-Peak aus der Phenyl-Sepharose-Säule wird gepoolt und in TAGS dialysiert. Die dialysierte Lösung wird anschließend durch Gelfiltration auf Sephacryl S-400 (Pharmacia) gereinigt, wie oben beschrieben. Die Faktor XIII enthaltenden Peakfraktionen werden gesammelt, gepoolt, konzentriert und dialysiert gegen 0,01 M Glycin pH 7,4, 2% Saccharose, 5 mM EDTA, wie beschrieben in Beispiel 3. Proben werden eingefroren, lyophilisiert und entwässert und unter Argon bei -20ºC aufbewahrt. Im Anschluß an die Gelfiltration liegt die Hefeprotein-Verunreinigung nach ELISA typischerweise bei etwa 30 ppm oder weniger.

Beispiel 6

Eine 1000 Liter-Kultur S. cerevisiae-ZM118/pD16 wird fermentiert, wie im wesentlichen beschrieben in Beispiel 4.
Die Zellen werden durch Zentrifugation unter Verwendung einer Zentrifuge mit kontinuierlichem Durchfluß Westfalia CSA-19 (Westfalia Separator AG, Oelde, Deutschland) bei einer Durchflußrate von 11 Litern/Minute, 8150 UPM und einer Temperatur von ungefähr 15ºC geerntet. Die Zeit zwischen dem Shooting be-trägt 180 Sekunden. Das Gefäß wird vor jedem Shot mit reinem Wasser gespült.
Die resultierende Zellaufschlämmung wird auf 35-40% Zellen pro Volumenteil mit reinem Wasser eingestellt, anschließend auf 30 mM Na-Phosphat, 15 mM EDTA, 0,1 M NaCl, pH 7,8, eingestellt. Die Aufschlämmung wird anschließend in einem Homogenisator Dynomill KD 20 B (Willy A. Bachofer AG, Basel) unter Verwendung von 0,5 mm-Perlen einer Lyse unterzogen. Der Homogenisator wird bei 1200 UPM bei einer Produkt-Durchflußrate von 4,8 Litern/Minute betrieben, wobei die Einlaßtemperatur unter 10ºC gehalten wird. Das Lysat aus dem Homogenisator wird direkt zu vorgekühltem (2- 5ºC) reinen Wasser bis zu einer Endleitfähigkeit von 4,5 +/- 0,2 mS/cm, pH 7,2 zugegeben.
Das verdünnte Zell-Lysat wird unter Verwendung einer Zentrifuge Westfalia CSA-19 bei einer Durchflußrate von 7 Litern/Minute, 8150 UPM und einer Temperatur unter 15ºC geklärt. Die Zeit zwischen dem Shooting beträgt 600 Sekunden. Der resultierende Überstand wird durch einen Filter Cuno Modell 12 ZP 3, ausgestattet mit einer Patrone 45115-12-50S (Cuno, Inc., Meriden, CN), filtriert.
Das geklärte Lysat wird anschließend durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer 10 cm langen Säule aus DEAE-Sepharose FF (Pharmacia, Piscataway, NJ), 100 Liter Volumen, fraktioniert. Die Säule wird bei einer Durchflußrate von 6,5 Liter/Minute betrieben. Nach dem Beladen wird die Säule mit 800 Litern 4,2 mS/cm Na-Phosphat-Puffer, pH 7,2, der 2 mM EDTA enthält, gewaschen. Faktor XIII wird aus der Säule mit 10 mS/cm Natriumphosphat-Puffer, pH 6,3, der 6 mM EDTA enthält, eluiert. Die Extinktion des Eluats bei 280 nm wird überwacht, und Peakfraktionen werden gepoolt.
Faktor XIII wird aus dem gepoolten Peak durch Zugabe von 12% w/v festem Natriumacetat bei pH 6,7 auskristallisiert. Man läßt die Lösung für 5-9 Stunden bei 15-20ºC stehen. Der resultierende kristalline Niederschlag wird durch Zentrifugation auf einer Zentrifuge Sharples (Alfa-Laval Separation, Inc., Warminster, PA) AS-12V bei 15000 UPM unter Verwendung einer Durchflußrate von 25-40 Litern/Stunde gesammelt. Der Niederschlag wird gewaschen, indem er in 10 mM Na-Phosphat, pH 6,7, 2 mM EDTA, 11% w/v Na-Acetat für eine Stunde suspendiert wird, gefolgt von Zentrifugation in einer Zentrifuge Sharples AS-12V bei 15000 UPM und einer Durchflußrate von 15-25 Litern/Stunde. Der gewaschene Niederschlag wird in 100 Litern 10 mM Na-Phosphat, 2 mM EDTA, 10 mM Glycin, pH 8,0 bei 5ºC über einen Zeitraum von wenigstens vier Stunden gelöst.
Der gelöste, auskristallisierte Faktor XIII wird anschließend unter Verwendung eines Filters mit 0,45 Mikron filtriert und auf einer 25 cm langen, 60 Liter fassenden Säule aus Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia) fraktioniert. Die Säule wird bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Durchflußrate von 180 Litern/Stunde betrieben. Die Leitfähigkeit der Beladung mit Faktor XIII wird durch Zugabe von NaCl auf 60 mS/cm einge-stellt, und der pH wird durch Zugabe von H&sub3;PO&sub4; auf 7,4 eingestellt. Die Säule wird mit 5 Säulenvolumenteilen 60 mS/cm NaCl, 20 mM Na-Phosphat, 2 mM EDTA, pH 7,4, gewaschen. Faktor XIII wird unter Verwendung eines Gradienten über 240 Liter bis 10 mM Glycin, 1 mM EDTA, pH 7,4, eluiert. Das Eluat wird bei A&sub2;&sub8;&sub0; überwacht.
Die gepoolten Peakfraktionen werden unter Verwendung eines Filters mit 0,2 Mikron filtriert, anschließend durch Chromatographie auf einer 40 cm langen, 30 Liter fassenden Säule aus Q- Sepharose FF (Pharmacia) unter Verwendung einer Durchflußrate von 90 Litern/Stunde weiter fraktioniert. Das Ausgangsmaterial wird auf 11 mS/cm NaCl, pH 7,4 eingestellt. Die Säule wird mit 150 Litern 10 mM Glycin, 20 mM Na-Phosphat, 1 mM EDTA, 11 mS/cm NaCl, pH 7,4, gewaschen. Faktor XIII wird mit einem Gradienten über 240 Liter bis 10 mM Glycin, 20 mM Na-Phosphat, 1 mM EDTA, 0,25 M NaCl, pH 7,4, eluiert. Das Eluat wird bei A&sub2;&sub8;&sub0; überwacht, und Peakfraktionen werden gepoolt.
Der Eluatpeak aus der Q-Sepharose-Säule wird auf einem Filter Hollow Fiber UF mit einem nominalen Schnitt bei einem Molekulargewicht (NMWC) von 10000 (AG Tech, Needham, MA) auf 10-15 g/Liter Faktor XIII konzentriert.
Der konzentrierte Faktor XIII wird durch Einstellen des pHs der Lösung auf 5,8 unter Verwendung von 0,3 M Bernsteinsäure auskristallisiert. Die Lösung wird über Nacht bei 5ºC aufbewahrt, anschließend in einer Zentrifuge J 2-MI (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) für 20 Minuten bei 8000 UPM in einem Rotor JA-10 zentrifugiert. Die Kristalle werden gewonnen und in 0,05 M Ammoniumsuccinat, 2 mM EDTA, 5 mM Natriumascorbat, pH 5,8, suspendiert. Die Suspension wird in einer Zentrifuge Beckman J 2-MI zentrifugiert, wie oben. Der kristalline Niederschlag wird gewonnen und erneut in 10 mM Glycin, 20 mM Na-Phosphat, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl, pH 7,8, auf eine Konzentration von Faktor XIII von 20 g/Liter wieder löslich gemacht. Die Lösung wird in einer Zentrifuge Beckman J 2-MI zentrifugiert, wie oben, und der Überstand wird gesammelt.
Drei-Liter-Beladungen des Faktor XIII-Konzentrats werden unter Verwendung eines Filters mit 0,2 Mikron filtriert, anschliessend fraktioniert auf 100 Litern Sephacryl S-200 (Pharmacia) (90 cm Säulenlänge), unter Verwendung von 20 mM Na-Phosphat, 1 mM EDTA, 10 mM Glycin, 0,1 M NaCl, pH 7,8. Das Eluat wird bei A&sub2;&sub8;&sub0; überwacht.
Peakfraktionen aus der S-200-Säule werden gepoolt und konzentriert auf 25 g Faktor XIII/Liter durch Ultrafiltration unter Verwendung eines Filters Hollow Fiber UF mit einem NMWC von 10000 von AGT und Diafiltration mit 10 Volumenteilen 10 mM Glycin, 0,1 mM EDTA, 2% Saccharose, pH 7,4. Die filtrierte Lösung wird anschließend durch Filtration durch einen Filter mit 0,2 Mikron sterilisiert und lyophilisiert.
Faktor XIII, im wesentlichen hergestellt, wie oben beschrieben, wurde an verschiedenen Punkten während des Reinigungsverfahrens als Probe gezogen und auf Faktor XIIIa-Gehalt und Hefeverunreinigung untersucht. Faktor XIIIa-Gehalt wurde mittels eines fluorometrischen Tests gemessen. Faktor XIII-Proben wurden hergestellt durch Verdünnen in 0,05 M Bicin-Puffer, pH 9,0, auf ein Gesamtvolumen von 200 µl pro Probe, wobei Gesamtprotein unter 20 µg gehalten wurde. Proben wurden in 10x10x48 mm-Küvetten hergestellt. Zu jeder Küvette wurden 1,25 ml frisch hergestellter MDC-Bicin-Cocktail (0,063 mM Monodan-sylcadaverin (Sigma Chemical Co.) in 0,05 M Bicin (N,N-Bis[2-hydroxyethyl]glycin; Sigma) pH 9,0, hergestellt durch Lösen von 1,34 mg Monodansylcadaverin in 0,5 ml 0,03 M HCl und Mischen mit einem gleichen Volumen von 0,1 M Tris pH 7,4, anschließend Vereinigen von 0,4 ml der Lösung mit 24,0 ml 0,05 M Bicin-Puffer, pH 9,0) und 50 µl 0,4 M CaCl&sub2; zugegeben. Die Lösungen wurden vermischt und für 10 Minuten auf 37ºC vorgewärmt. 50 µl 100 NIHU/ml Thrombin wurden zu jeder Küvette zugegeben, die Lösungen wurden vorsichtig vermischt und die Küvetten wurden 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. 50 µl frisch hergestelltes Dithiothreitol wurden zu jeder Küvette unter vorsichtigem Vermischen zugegeben. 200 µl 2% N,N-Dimethylcasein wurden anschließend unter vorsichtigem Vermischen zu jeder Küvette zugegeben, und die Küvetten wurden 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. 50 µl Stopreagens (1,6 M Ammoniumsulfat, 0,2 M EDTA) wurden anschließend unter vorsichtigem Vermischen zu jeder Küvette zugegeben. Die Fluoreszenz wurde in einem Fluorometer Perkin-Elmer LS-5B mit Anregung bei 360 nm und Emission bei 500 nm unter Verwendung einer Schlitzbreite von 3 nm und einer Wasserbadtemperatur von 39ºC gemessen. Blindprobe wurde gesetzt durch Verwendung von 200 µl Bicin-Puffer anstelle von Faktor XIII und Weglassen von Stopreagens. Zunahme (100%) wurde gesetzt unter Verwendung des Standards von 50 µg rekombinantem Faktor XIII und Weglassen von Stopreagens. Die Ergebnisse wurden mit einer Standardkurve verglichen, konstruiert aus 5, 10 und 25 µg/ml Faktor XIII-Standards, hergestellt durch Verdünnen von rekombinantem Faktor XIII, quantifiziert durch Aminosäureanalyse. Faktor XIIIa-Gehalt von Prozeßproben wurde bestimmt durch Untersuchung von Proben mit und ohne Thrombin. Im Anschluß an Gelfiltration auf Sephacryl S-200 wurde Faktor XIIIa-Gehalt auf 0,3% verringert. Faktor XIIIa-Gehalt des gelösten lyophilisierten Materials betrug ungefähr 0,5%.
Hefe-Verunreinigung wurde untersucht mit ELISA unter Verwendung eines Kaninchen-anti-Hefe-Antikörpers. Sechzehn 1-Liter- Kulturen von nicht-transformiertem S. cerevisiae ZM118 wurden geerntet, die Zellen wurden aufgebrochen und geklärte Lysate wurden hergestellt. 16 Kaninchen wurden mit diesem Material immunisiert, und Antiseren wurden hergestellt und gepoolt. Das gepoolte Antiserum wurde auf 10 µg/ml in ELISA-Puffer A (0,1 M Natriumcarbonat pH 9,6) verdünnt. 100 µl verdünnter Antikörper wurde zu jedem Napf von Platten mit 96 Näpfen zugegeben, die Platten wurden mit Plattensiegler abgedeckt und über Nacht bei 4ºC oder für 2 Stunden bei 37ºC gelagert. Anschließend wurde die Abdeckung von den Platten entfernt und diese fünfmal mit 200 µl pro Wa-schung Puffer C (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die 0,1% Tween-20 enthielt) gewaschen. 10 µl Hefestandard (gepooltes An-tigen) (2,8 mg/ml) wurden in Puffer C auf 2,8 µg/ml verdünnt. 28,6 µl des verdünnten Standards wurden zu 2,0 ml Puffer C zugegeben. Der resultierende Arbeitsstandard wurde reihenverdünnt, um eine Standardkurve von 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 und 0,62 ng/ml zu erhalten. 100 Mikroliter Puffer C wurden zu drei Säulen von jeder der Reihen B-H einer Platte mit 96 Näpfen zugegeben. 100 Mikroliter Hefeantigen-Arbeitsstandard wurden zu jeder von drei Näpfen in Reihe A zugegeben. 100 Mikroliter Arbeitsstandard wurden zu jeder von drei Näpfen in Reihe B zugegeben und, im Anschluß an gründliches Vermischen, wurden 100 µl aus jedem Napf in Reihe C überführt. Reihenverdünnung wurde in den drei Säulen bis hindurch zu Reihe G fortgesetzt, wonach 100 µl des verdünnten Standards aus jedem Napf entnommen und verworfen wurden. 100 µl Puffer C wurden als Blindproben zu jedem Napf von zwei Säulen zugegeben. Testproben wurden in Puffer C verdünnt, und 100 µl verdünnte Proben wurden dreifach zu Näpfen zugegeben. Platten wurden mit Glattensiegler überdeckt und minimal 24 Stunden bei Raumtemperatur inku-biert. Unmittelbar vor Verwendung wurde biotinylierter Kanin-chen-anti-Hefe-Antikörper (0,5 mg/ml Vorratslösung) in einem Verhältnis 1:100 in Puffer C verdünnt. Die Platten wurden ablaufen gelassen und fünfmal mit Puffer C (200 µl pro Napf) gewaschen, und 100 µl verdünnter biotinylierter Antikörper wurden zu jedem Napf zugegeben. Die Platten wurden wenigstens 1,5 Stunden bei 37ºC inkubiert, anschließend fünfmal mit 200 µl/Napf Puffer C gewaschen. Zu jedem Napf wurden 100 µl Streptavidin/HRP (Amersham), frisch verdünnt im Verhältnis 1:1000 in Puffer C, zugegeben. Platten wurden mit Plattensiegler abgedeckt, bei 37ºC für 30-45 Minuten inkubiert, anschließend fünfmal mit 200 µl/Napf Puffer C gewaschen. 2 Tabletten (8 mg) OPD-Substrat (Sigma Chemical Co.) wurden in 10 ml OPD-Verdünnungsmittel (0,1 M Na-Citrat, pH 5,0) gelöst. Unmittelbar vor Verwendung wurden 10 µl H&sub2;O&sub2; zu 10 ml OPD-Substratlösung zugegeben, anschließend wurden 100 µl der Lösung zu jedem Napf zugegeben. Die Platten wurden bei Raumtemperatur inkubiert, bis sich eine gelbe Farbe entwickelte (ungefähr 0,6-0,9 O.D.-Einheiten), anschließend wurden 100 µl 2 M H&sub2;SO&sub4; zu jedem Napf zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Platten wurden in einem Plattenablesegerät von Molecular Devices (Mountain View, CA) bei 490 nm abgelesen. Die Ergebnisse wurden mit der Standardkurve verglichen, unter Verwendung eines Segments mit einer O.D. von mehr als 0,015 bei 490 nm und einem Variationskoeffizienten ≤15%. Hefeprotein-Gehalt war auf weniger als 1 ppm verringert.

Beispiel 7

Faktor XIII wurde hergestellt, wie im wesentlichen beschrieben in Beispiel 5, durch Kristallisation mit Natriumacetat. Der gelöste Niederschlag wurde mit H&sub3;PO&sub4; auf pH 7,4 und mit NaCl auf 11,2 mS/cm Leitfähigkeit eingestellt.
Die Faktor XIII-Lösung wurde anschließend auf einer 11 cm langen Säule aus Q-Sepharose FF (Pharmacia) fraktioniert. Die Säule wurde mit 9 g Faktor XIII pro Liter Harz beladen, anschließend mit 5 Säulenvolumenteilen 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 10 mM Glycin, 1 mM EDTA, pH bis 7,4 mit H&sub3;PO&sub4;, 11,2 mS/cm NaCl, gewaschen. Faktor XIII wurde unter Verwendung von 6 Säulenvolumenteilen 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 10 mM Glycin, 1 mM EDTA, pH 7,4 mit H&sub3;PO&sub4;, 0,25 M NaCl, eluiert.
Der A&sub2;&sub8;&sub0;-Peak aus der Q-Sepharose-Säule wurde anschließend auf einer 25 cm-Säule aus Toyopearl Butyl 650 bei Raumtemperatur weiter fraktioniert. Die Faktor XIII-Lösung wurde auf pH 7,4 und 52 mS/cm mit Na&sub2;SO&sub4; eingestellt, und die Säule wurde mit 10 g Faktor XIII pro Liter Harz beladen. Die Säule wurde anschließend mit 20 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 10 mM Glycin, 1 mM EDTA, pH 7,5 mit H&sub3;PO&sub4;, 52 mS/cm mit Na&sub2;SO&sub4;, gewaschen. Faktor XIII wurde mit einem Gradienten bis 36 mS/cm von 1,5 Säulenvolumenteilen desselben Puffers, eingestellt auf pH 7,4, eluiert.
Peakfraktionen wurden aus der Butyl 650-Säule gewonnen und auf Faktor XIIIa-Gehalt und Hefeprotein untersucht, wie beschrieben in Beispiel 5. Faktor XIIIa-Gehalt betrug 0,37%. Hefeprotein- Verunreinigung betrug 20 ppm.
Peakfraktionen aus der Butyl 650-Säule wurden gepoolt und auf einer 25 cm-Säule aus Amberchrom CG 71-Harz weiter fraktioniert. Die Säule wurde bei Raumtemperatur betrieben. Das Eluens aus der Butyl 650-Säule wurde mit reinem Wasser bis 15 mS/cm verdünnt, und der pH auf 7,5 eingestellt. Etwa 12 g Faktor XIII wurden pro Liter Harz aufgeladen. Die Säule wurde mit vier Säulenvolumenteilen 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 10 mM Glycin, 1 mM EDTA, pH 7,5 mit H&sub3;PO&sub4;, Leitfähigkeit eingestellt auf 5,8 mS/cm mit NaCl, gewaschen. Faktor XIII wurde aus der Säule mit einem Gradienten aus zwei Säulenvolumenteilen aus 10 mM Glycin, 1 mM EDTA, pH 7,8 mit H&sub3;PO&sub4;, auf eine Leitfähigkeit von 0,5 mS/cm, eluiert.
Die Peakfraktionen aus der Amberchrom-Säule wurden auf Faktor XIIIa-Gehalt untersucht, von dem sich herausstellte, daß er 0,06% betrug, und Hefeprotein, das < 2,1 ppm betrug.

Claims

1. Ein Verfahren zur Reinigung von Faktor XIII aus einer biologischen Flüssigkeit, welches die Schritte umfaßt:

a) Fraktionieren einer biologischen Flüssigkeit durch Anionenaustauschchromatographie, um eine an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen;

b) Zugeben von Na-Acetat zur angereicherten Fraktion, um einen kristallinen Niederschlag zu bilden;

c) Lösen des Niederschlages, um eine Lösung zu bilden;

d) Fraktionieren der Lösung durch hydrophobe Chromatographie, um eine zweite an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen;

e) Fraktionieren der zweiten angereicherten Fraktion durch Anionenaustauschchromatographie, um eine dritte an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen;

f) Einstellen des pHs der dritten angereicherten Fraktion auf pH 5,2-6,5, um einen Faktor XIII enthaltenden Niederschlag herzustellen;

g) Gewinnen besagten Niederschlages;

h) Lösen des Niederschlages, um eine Lösung zu bilden; und

i) Fraktionieren der Lösung durch Gelfiltration und Sammeln einer Faktor XIII enthaltenden Peakfraktion.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Einstellens des pHs das Zugeben von Bernsteinsäure zu besagter dritten angereicherten Fraktion umfaßt.

3. Ein Verfahren zur Reinigung von Faktor XIII aus einer biologischen Flüssigkeit, welches die Schritte umfaßt:

c) Lösen des Niederschlages, um eine Lösung zu bilden;

d) Fraktionieren der Lösung durch Anionenaustauschchromatographie, um eine zweite an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen;

e) Fraktionieren der zweiten angereicherten Fraktion durch hydrophobe Chromatographie, um eine dritte an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen;

f) Fraktionieren der dritten angereicherten Fraktion durch hydrophobe Chromatographie, um eine vierte an Faktor XIII angereicherte Fraktion herzustellen; und

g) Fraktionieren der vierten angereicherten Fraktion durch Gelfiltration und Sammeln einer Faktor XIII enthaltenden Peakfraktion.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei besagte biologische Flüssigkeit ein Hefezell-Lysat ist.

5. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei besagter Faktor XIII rekombinanter menschlicher Faktor XIII ist.

6. Eine Faktor XIII umfassende Materialzusammensetzung, die im Hinblick auf verunreinigende Proteine zumindest 99% rein ist, wobei 0,5% oder weniger von besagtem Faktor XIII Faktor XIIIa ist.

7. Die Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei besagter Faktor XIII rekombinanter menschlicher Faktor XIII ist.

8. Die Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei besagter rekombinanter menschlicher Faktor XIII von Hefe produzierter rekombinanter menschlicher Faktor XIII ist.

9. Die Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei besagte Zusammensetzung weniger als 50 ppm Hefeprotein enthält.

10. Die Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei besagte Zusammensetzung weniger als 20 ppm Hefeprotein enthält.

11. Die Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei besagte Zusammensetzung weniger als 10 ppm Hefeprotein enthält.

12. Die Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei besagte Zusammensetzung weniger als 1 ppm Hefeprotein enthält.