DE69216385T2

DE69216385T2 - Gekoppelte transkription und translation in zellfreien eukaryoten-extrakten

Info

Publication number: DE69216385T2
Application number: DE69216385T
Authority: DE
Inventors: Gregory S Beckler; David Thompson; Herwynen John F Van; Oosbree Thomas Van
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1992-10-07
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2012-10-08
Also published as: ES2097363T3; AU2792192A; WO1993007287A1; AU660329B2; DE69216385D1; US5324637A; GR3022719T3; EP0566714A1; JP2904583B2; EP0566714A4; ATE147104T1; JPH06503477A; EP0566714B1; DK0566714T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die molekulare Biologie und, mehr speziell, auf eine neue Methode, die die Kopplung der Transkription von RNA von einer DNA-Matrize und die Translation der RNA in eukaryotischen zellulären Lysaten oder anderen Extrakten erlaubt.
Die bei der Transkription und Translation (Expression) von Genen in Zellen beteiligten Schritte sind sehr komplex und bis heute nicht vollständig verstanden. Es gibt jedoch ein Grundmuster, das befolgt werden muß, damit aus DNA Protein gebildet wird. Die DNA wird zuerst in RNA transkribiert und dann die RNA durch Zusammenwirken von verschiedenen zellulären Bestandteilen in Protein translatiert. In prokaryotischen Zellen (Bakterien) sind Transkription und Translation "gekoppelt", was bedeutet, daß RNA, während es von der DNA transkribiert wird, gleichzeitig zu Protein translatiert wird. In eukaryotischen Zellen (Tiere, Pflanzen) sind beide Vorgänge getrennt, was den Gesamtprozeß verkompliziert. DNA wird im Zellkern zu RNA transkribiert, aber die RNA wird weiter zu mRNA bearbeitet und dann aus dem Kern in das Cytoplasma transportiert, wo es zu Protein translatiert wird.
Die Fähigkeit von Molekularbiologen, Gene zu isolieren und zu klonen, wie auch deren Fähigkeit, einzelne mRNAs oder "Botschaften" ("messages") aus Zellen zu isolieren, hat die Notwendigkeit für Systeme, die für die Expression dieser Gene oder Botschaften verwendet werden können, mit sich gebracht. Die Expression eines Gens ist für das Gesamtverständnis seiner Funktion und Regulation von Wichtigkeit. Es stehen nunmehr Methoden für die schnelle Expression von Proteinen zur Verfügung, die es ermöglichen, Gene zu manipulieren und dann die Wirkung der Manipulation auf deren Funktion zu studieren. Der Anteil an gebildetem Protein, ob das Gen prokaryotisch oder eukaryotisch ist und die relativen Vorzüge eines zellfreien invitro- oder eines in vitro-Systems mit ganzen Zellen sind einige der von Forschern bei der Wahl des Expressionssystems in Betracht gezogenen Faktoren. Die Wahl eines Systems wird durch das zu untersuchende Gen beeinflußt. In der Regel wird ein prokaryotisches Gen am besten in einem prokryotischen System und ein eukaryotisches Gen wird wirksamer und genauer in einem eukaryotischen System exprimiert. Den Grund dafür bilden die zahlreichen Regulationssequenzen und Promotoren, die in einem ähnlichen System wirksamer erkannt werden. Die Genexpression kann sowohl in in vitro-Systemen mit ganzen Zellen als auch in zellfreien in vitro-Systemen erreicht werden.
In vitro-Transkriptionssysteme, die prokaryotische oder eukaryotische Zellen benutzen, stehen zur Verfügung; jedoch ist mit diesen Systemen schwer zu arbeiten, wenn intakte Zellen verwendet werden. Andererseits werden zellfreie in vitro-Systeme aus zellfreien Extrakten gebildet, die aus prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, die alle notwendigen Bestandteile für die Translation von DNA oder RNA in Protein enthalten, gebildet. Zellfreie Extrakte können aus prokaryotischen Zellen, wie E. coli, und aus eukaryotischen Zellen, wie Kaninchenretikulocyten und Weizenkeimen, hergestellt werden. Zellfreie Systeme sind sehr verbreitet, weil Standardprotokolle für ihre Herstellung zur Verfügung stehen und weil sie aus einer Anzahl von Quellen kommerziell verfügbar sind.
E. coli-S30 zellfreie Extrakte wurden als erstes von Zubay, G. (1973, Ann. Rev. Genet., Vol. 7, S. 267) beschrieben. Diese können dann verwendet werden, wenn das zu exprimierende Gen in einen die geeigneten prokaryotischen regulatorischen Sequenzen, wie Promotor und Ribosomenbindestelle, enthaltenden Vektor kloniert wird. Prokaryotische zellfreie Systeme von E. coli werden als "gekoppelt" betrachtet, weil Transkription und Translation nach Zugabe von DNA zum Extrakt gleichzeitig erfolgen. Der Gebrauch von RNA als Matrize in E. coli-Extrakten führt zur Proteinbildung, aber eine solche Reaktion ist nicht gekoppelt. Kaninchenretikulocytlysate und Weizenkeimextrakte werden vorzugsweise für die Expression von eukaryotischen Genen oder mRNA verwand. Beide Systeme benötigen den Gebrauch von RNA als Matrize zur Proteintranslation, weil, wie bereits oben erwähnt, eukaryotische Systeme nicht gekoppelt sind.
Kaninchenretikulocytenlysat wurde von Pelham, H.R.B. und Jackson, R.J. (1976, Eur.J. Biochem., Vol. 67, S. 247) beschrieben. Dieses Expressionssystem ist vermutlich das am meisten verbreitete zellfreie System für in vitro-Translation, und wird bei der Identifizierung von mRNA-Arten, der Charakterisierung ihrer Produkte, der Untersuchung der transkriptionalen und translationalen Kontrolle verwendet. Processing- Ereignisse, wie Schneiden des Signalpeptids und Core-Glykosylierung, werden durch Zugabe von mikrosomalen Membranen aus Hunden zu einer Standard- Translationsreaktion untersucht (Walter, P. und Blobel, G. (1983), Meth.Enzymol. 96, 84). Kaninchenretikulocytenlysat enthält auch eine Vielfalt an posttranslationalen Processing-Aktivitäten, einschließlich Acetylierung, Isoprenylierung, Proteolyse und einige Phosphorylierungsaktivitäten (Glass, C.A. und Pollard, K.M. (1990), Promega Notes 26).
Weizenkeimextrakt wurde von Roberts, B.E. und Paterson, B.M. (1973), Proc.Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 70, S. 2330) beschrieben. Zellfreie Extrakte von Weizenkeimen unterstützen die Translation in vitro von einer Vielfalt viraler und anderer prokaryotischer RNAs, wie auch eukaryotischer mRNAs. (Anderson, C., et al. (1983), Meth.Enzymol. 101, 635). Im allgemeinen wird es als notwendig befünden, einen Ribonuklease-Hemmstoff in das Reaktionsgemisch eines Weizenkeim- Translationssystems einzubeziehen, weil Ribonukleaseaktivitäten im Weizenkeimextrakt vorhanden sind.
Für Translationsuntersuchungen wird RNA entweder durch Isolierung von mRNA oder Herstellung von in vitro-RNA-Transkripten von DNA, die in einen Vektor mit einem RNA-Polymerasepromotor geklont wurde, erhalten. Die erste Methode isoliert mRNA oder die "message" direkt von Zellen.
Die zweite erhält RNA von in vitro-Translation durch in vitro-Transkription. In vitro- Transkription von geklonter DNA hinter Phagen-Polymerasepromotoren wurden durch Krieg, P. und Melton, D. (1984, Nucl. Acids Res., Vol. 12, S.7057) beschrieben. Dies wurde eine Standardmethode zum Erhalt von RNA von geklonten Genen für den Gebrauch in in vitro-Translationsreaktionen. Diese Methode setzt voraus, daß die DNA oder das Gen von Interesse in einen Vektor, der einen Promotor der folgenden RNA- Polymerasen, SP6, T7 oder T3, enthält, geklont wird. Der Vektor wird dann am 3'-Ende des geklonten Gens unter Gebrauch eines Restriktionsenzyms, linearisiert, gefolgt von einer in vitro-Transkriptionsreaktion zur Herstellung von RNA-Transkripten. Eine Anzahl von Vektoren, die die SP 6-, T 7- und T 3-RNA-Polymerasepromotoren enthalten, sind kommerziell erhältlich und werden zur Klonierung von DNA weit verbreitet genutzt.
In jedem Fall führt der Prozeß zum Erhalt von RNA-Transkripten für den Gebrauch in Kaninchenretikulocytlysaten oder Weizenkeimsystemen eine Variable ein, die die Wirksamkeit der Translationsreaktion beeinträchtigen kann. Extra Sorgfalt muß immer bei der Arbeit mit RNA aufgebracht werden, weil es leicht durch Ribonukleasen abgebaut wird. DNA-Matrizen sind sehr viel stabiler.
Nachdem Kaninchenretikulocytlysat und Weizenkeimextrakt als zellfreie Translationssysteme entwickelt worden waren, wurden Versuche zur Kopplung von Transkription und Translation unternommen. Ein System, das entwickelt wurde, war ein "verbundenes" ("linked") Transkriptions- und Translationssystem (Roberts, B.E., et al. (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, 1922-1926). Dieses System schloß den Gebrauch von Weizerikeimextrakten ein und diente zur Untersuchung der Transkription und Translation von SV40 viraler DNA unter Gebrauch von E. coli-RNA-Polymerase. In diesem System erfolgt die Transkription in einem 15 Minuten-Inkubationsschritt, gerade vor Zugabe des Weizenkeimextraktes. Die Schritte sind aufgrund der Unverträglichkeit der für die Transkription und der für die Translation notwendigen Pufferbedingungen und auch wegen des unterschiedlichen Temperaturbedarfs für beide Prozesse voneinander getrennt. Dieses System hat eine Reihe von Nachteilen. Ein Nachteil ist der Mangel an Kontrolle darüber, welches Proteinprodukt gebildet wird, da eine Anzahl unterschiedlicher Proteine von derselben SV40-DNA-Matrize gleichzeitig gebildet werden. Obwohl die Autoren dieser Untersuchung darauf hinwiesen, daß ein gekoppeltes System entwickelt worden war, wurden keine Daten für ein gekoppeltes System gezeigt.
Ein anderes System wurde von Pelham, H.R.B., et al. (1978), Eur. J. Biochem., Vol. 82, 199-209, entwickelt, bei dem gekoppelte Transkription und Translation nach Einführung von vakziniaviraler Hüllpartikel in das Kaninchenretikuloytlysat erfolgte. Die Bildung von Vakziniaprotein von viraler DNA war vermutlich auf die Transkription durch die endogene Vakzinia-RNA-Polymerase und auf die nachfolgende Translation durch das Lysat zurückzuführen. Dieses System war dadurch begrenzt, daß nur Vakziniaproteine gebildet wurde, während endogene DNA aus anderen als Vakziniaquellen durch die RNA-Polymerase nicht erkannt wurde, so daß keine Transkription oder Translation erfolgen konnte. Virale Hüllpartikel mußten isoliert werden, und die Autoren waren nicht in der Lage, ausschließlich ein einziges Protein zu bilden.
Es wurde auch über Arbeiten berichtet, je "kontinuierliche" zellfreie in vitro- Translationssysteme mit Schwerpunkt auf Proteinproduktion im Großmaßstab benutzten. Ein Beispiel einer solchen Methode ist in WO-A-91/02076 offenbart. Kontinuierliche Systeme sind von dem mehr gebräuchlichen Batchtyp oder den statischen zellfreien in vitro-Translationsreaktionen, die in eine enthaltenen Reaktionsvolumen erfolgen, sehr verschieden. Kontinuierliche Translation involviert einen Bioreaktor (wie eine Amicon 8MC Ultrafiltrationseinheit), in dem Reaktionen im Großmaßstab hochgefahren werden und "fortwährend" über eine ausgedehnte Zeitspanne Protein translatiert wird. Die Reaktion erfordert, daß bei fortschreitender Reaktion ein Puffer zugeführt und auch, daß die Translationsprodukte von der Reaktionsfiltereinheit entfernt werden. Dieser Systemtyp arbeitet gut mit E. coli-S30- und Weizenkeimextrakten, wenn eine RNA- Matrize eingeführt wird. Vgl. Spirin, et al. (1988) Science, Vol. 242, 1162-1164. Das System arbeitet ebenso bei Gebrauch von RNA-Matrizen in Kaninchenretikulocytlysaten. Vgl. Ryabova, et al. (1989) Nucl. Acid Res., Vol. 17, Nr.11, 4412. Das System ist auch dafür bekannt, daß es gut mit DNA-Matrizen in E. coli-S30-Extrakten arbeitet. Vgl. Baranov, et al. (1989) Gene, Vol. 84, 463-466.
Der in WO-A-91/02076 beschriebene kontinuierliche Prozeß bildet von DNA-Matrizen in eukaryotischen zellfreien Extrakten Protein. Der Prozeß verwendet ein Reaktionsbehältnis, umfassend eine Membran, und beinhaltet eine kontinuierliche Zugabe von Reagenzien und Entfernen von Produkten. Die Konzentrationen der für die Transkription und Translation benötigt Reagenzien verändern sich im Verlaufe der Reaktion. Zusätzlich benötigt dieser Prozeß hohe Anteile an RNA-Polymerase.
Kontinuerliche Reaktionen werden verschiedentlich von zehn Stunden bis zu etwa hundert Stunden durchgeführt und benötigen für das Hochfahren und den Ablauf eine beträchtliche Investition an Zeit und Resourcen. Translation in einem "kontinuierlichen" System ist auch auf die Bildung großer Proteinmengen gerichtet und ist von (statischen) Standard-in vitro-Translationsreaktionen wesentlich verschieden. Statische Reaktionen können in einem geringen Reaktionsvolumen, typischerweise im Mikrolitermaßstab, durchgeführt werden und sind häufig in ein oder zwei Stunden beendet. Eine statische Translationsreaktion ist nicht auf die Bildung präparativer Mengen (milligramm) an Protein gerichtet. Vielmehr wird eine statische Reaktion im allgemeinen für die Proteinbildung zwecks wissenschaftlicher Untersuchungen, wie Identifizierung und Charakterisierung von mRNA-Arten oder Studien von transkriptionaler und transiationaler Kontrolle, verwendet. Keines der bisher für in vitro-Translation bekannten Kaninchenretikulocyten- oder Weizenkeimsysteme sorgt für eine gekoppelte Transkription und Translation in einem statischen Reaktionsgemisch.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Erfindungsgegenstand ist daher die Bereitstellung einer einfachen Methode für die Bildung von Protein von einer DNA-Matrize in einer Standard-in vitro- Translationsreaktion unter Verwendung eines eukaryotischen zellulären Lysats.
Ein mehr spezifischer Erfindungsgegenstand ist die Bereitstellung einer solchen Methode für den Gebrauch zur Kopplung von Transkription und Translation eines einzigen, durch die DNA-Matrize kodierten Proteins.
Ein anderer Gegenstand ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur erhöhten in vitro- Proteinbildung aus DNA-Matrizen durch gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktionen unter Verwendung eukaryotischer, zellfreier Lysate.
Ein weiterer Gegenstand ist die Bereitstellung einer Methode zur Herstellung eukaryotischer, zellulärer Lysate für die Verwendung in gekoppelten Transkriptions- und Translationsexperimenten.
Ein anderer Gegenstand ist die Bereitstellung einer solchen Präparation für den Gebrauch in gekoppelten Transkriptions- und Translationsexperimenten.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Bereitstellung eines Kits mit einem vorbereiteten Kaninchenretikulocytenlysat oder Weizenkeimextrakt, der weitere, für die Herstellung einer Reaktionsmischung zur Kopplung von Transkription und Translation einer DNA-Matrize benötigte Bestandteile und Reagenzien enthält.
Ein mehr spezifischer Gegenstand ist die Bereitstellung eines Kits, der als mindestens einen Bestandteil eine vorbereitete Kaninchenretikulocytlysat- oder Weizenkeimextrakt- Aufbereitung mit ein oder mehrere, für die Kopplung von Transkription und Translation benötigte Reagenzien aufweist.
Für den Erhalt dieser und anderer Gegenstände stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von Transkription und Translation von DNA in einem eukaryotischen, zellfreien Extrakt zur Verfügung, bei dem die Magnesiumkonzentration des Extraktes auf einen solchen Level eingestellt wird, daß die Transkription und Translation in dem Sinne miteinander gekoppelt sind, daß RNA von DNA transkribiert und, gleichzeitig damit, RNA in Protein translatiert wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Bildung von Protein mittels einer DNA- Matrize mit einer spezifischen Polymerase-Promotorsequenz durch gekoppelte Transkription und Translation in einer Lösung zur Verfügung. Dies wird durch Herstellen einer Standardpräparationslösung eines eukaryotischen zellfreien Extraktes, enthaltend die DNA-Matrize, Modifizieren der Extraktlösung mit ausreichenden Konzentrationen an Ribonukleotidtriphosphaten, Aminosäuren und der der Promotorsequenz der DNA-Matrize entsprechenden Polymerase zur Unterstützung der Transkription und Translation, und Einstellen der Magnesiumendkonzentration der Extraktlösung auf einen Level, bei dem mit der Transkription der DNA-Matrize in RNA gleichzeitig die Translation der so transkribierten RNA in Protein erfolgt, erreicht. Nur das Protein, das dem an die Promotorsequenz in der DNA angrenzenden Gen entspricht, wird gebildet.
Die Erfindung stellt zusätzlich ein modifiziertes eukaryotisches zelluläres Lysat bereit, das in Übereinstimmung mit dem Verfahren vorbereitet ist, wobei die Magnesiumkonzentration auf einen solchen Level erhöht ist, daß, wenn das Lysat in einem Verfahren gemäß der Erfindung benutzt wird, die Magnesiumendkonzentration in der Reaktionsmischung derart ist, daß RNA von DNA transkribiert und RNA in Protein tanslatiert wird. Das Lysat kann seine so bereits während der Fertigung angepaßte Magnesiumkonzentration aufweisen. Die Erfindung stellt ebenfalls einen Kit bereit, der einen Behälter, enthaltend vorbereitetes eukaryotisches zelluläres Lysat für gekoppelte Transkription und Translation, umfaßt. Zusätzlich zur angepaßten Magnesiumkonzentration kann dieses Lysat eine Reihe zusätzlicher, für die gekoppelte Transkription und Translation benötigte Bestandteile enthalten. Ein zusätzlicher Bestandteil, der enthalten sein kann, ist eine RNA-Polymerase. Andere sind verschiedene Puffer oder Salze oder andere Bestandteile oder Reagenzien zur Optimierung der gekoppelten Transkriptions- und Translations-Reaktionsbedingungen, wie Spermidin, das für die Stimulierung der Leistungsfähigkeit der Kettenverlängerung bekannt ist.
Die Kopplung von Transkription und Translation in Kaninchenretikulocyt- oder Weizenkeimsystemen erhöht die Proteinbildung im Vergleich zur Standard-in vitro- Translation mit RNA-Matrizen signifikant, und für die gekoppelte Transkription und Translation wurde gezeigt, daß diese für eine Vielfalt an unterschiedlichen Proteinen über einen weiten Bereich an Molekulargewichtsgrößen fünktionieren.
Das zu translatierende Gen oder die DNA wird vorzugsweise hinter einen RNA- Polymerasepromotor, wie SP6-, T7- oder T3-Promotoren, oder irgendeinen RNA- Polymerasepromotor, für den eine Polymerase zur Verfügung steht, kloniert. Die DNA- Matrize kann in die gekoppelte Transkription- und Translationsreaktion in Form einer geschlossenen, zirkulären Plasmid-DNA oder als eine lineare Plasmid-DNA eingeführt werden. RNA-Polymerasepromotor-Sequenzen können auch an spezifische DNA- Fragmente durch den thermozyklischen Amplifikationsprozeß geheftet werden; diese linearen DNA-Fragmente können in gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen verwendet werden.
Standard-in vitro-Translationsreaktionen benötigen sehr wenig Zeit und Resourcen und sind eine gut eingeführte Methode zur qualitativen Proteinbildung. Durch Kopplung von Transkription und Translation in Standard-in vitro-Translationsreaktionen unter Verwendung von Kaninchenretikulocytlysat oder Weizenkeimextrakt wird die Notwendigkeit für eine getrennte in vitro-Transkriptionsreaktion ausgeschaltet und die Proteinbildung signifikant erhöht. Damit stellt die gekoppelte Transkription und Translation unter Verwendung von Kaninchenretikulocytlysat oder Weizenkeimextrakt eine signifikante Verbesserung bisheriger Standard-in vitro-Translationsreaktionen bereit. Ein unerwarteter Vorteil ist, daß die Bildung des gewünschten Proteinproduktes sich dramatisch (zigfach) erhöht, gegenüber dem, was bei der Zugabe von RNA zu Standard- in vitro-Translationsreaktionen beobachtet wird. Zusätzlich besteht bei gekoppelter Transkription und Translation keine Notwendigkeit für eine getrennte Capping- Modifikationsreaktion.
Ein anderer Vorteil ist, daß die Proteinbildung von einer geklonten oder amplifizierten DNA-Matrize, die einen spezifischen RNA-Polymerasepromotor enthält, erhalten wird. Auf diese Weise kann die RNA-Synthese von einem einzigen Gen vom Promotor aus stromabwärts gerichtet werden; nur die von dieser RNA translatierten Proteine werden gebildet. Wenn diese RNA nur auf ein Protein ausgerichtet ist, wird auch nur ein Protein durch die Reaktion gebildet. Plasmidvektoren für einen solchen Gebrauch sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und von verschiedenen Quellen erhältlich, so daß dem Forscher die Bildung von Protein von jeglichem geklonten Gen nach Belieben erlaubt ist.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden für den gewöhnlichen Fachmann durch die Übersicht über die folgende detaillierte Beschreibung und durch die Ansprüche ersichtlich.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Für die Zwecke der Erfindung können jegliche eukaryotische zelluläre Lysate verwendet werden; für deren Herstellung gibt es eine Anzahl gebräuchlicher Techniken. Eukaryotische zellfreie Lysate sind aus mehreren Gründen bevorzugte Expressionssysteme, teilweise zumindest weil sie eine Vielfalt posttranslationaler Processing-Aktivitäten enthalten. Mit der Zugabe mikrosomaler Membranen aus Hunden können Processing-Ereignisse, wie Schneiden des Signalpeptids und Core- Glykosilierung, untersucht werden. Eukaryotische zelluläre Lysate unterstützen ebenfalls die in vitro-Translation einer breiten Vielfalt von viraler und anderer, prokaryotischer RNAs wie auch eukaryotischer mRNAs.
Während andere eukaryotische Systeme geeignet sind, werden Kaninchenretikulocytlysate und Weizenkeirnextrakte bevorzugt. Diese eukaryotischen Lysate sind bei Forschern allgemein beliebt und weit verbreitet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Kaninchenretikulocytlysat durch eine von Pelham, H. und Jackson, R.J. (1976, Eur. J.Biochem. 67, 247-256) beschriebenen Methode hergestellt und gemäß dem Herstellungsprotokoll LA15/L416, Promega Corp., Madison, WI, abgeändert.
Retikulocytlysat wird von neuseeländischen Weißkaninchen, denen Phenylhydrazin injiziert wurde, das in jeder Charge eine zuverlässige und gleichmäßige Retikulocytbildung gewährleistet. Die Retikulocyten werden zum Entfernen kontaminierender Zellen, die sonst die translationalen Anteile des Endextraktes verändern, gereinigt. Nachdem die Retikulocyten lysiert sind, wird der Extrakt mit mikrokokkaler Nuclease und CaCl&sub2; zur Zerstörung endogener mRNA und damit zur Reduzierung der Hintergründtranslation auf ein Minimum behandelt. Anschließend wird EGTA zur CaCl&sub2;-Chelatbildung und damit zur Inaktivierung der Nuclease zugegeben.
Das Lysat enthält für die Proteinsynthese notwendige Bestandteile. Diese umfassen tRNAs, rRNAs, Aminosäuren und Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Das Lysat wird ferner für die mRNA-Translation durch Zugabe eines energieerzeugenden Systems, bestehend aus vorgetesteter Phosphokreatinkinase und Phosphokreatin, optimiert. Ebenso wird eine Mischung aus tRNAs, die den Bereich an mRNAs, die translatiert werden können, erweitert, und Hämin, um die Hemmung der Initiation zu verhindern, zugefügt. Hämin ist im Retikulocytenlysat deshalb enthalten, weil es als Suppressor eines Hemmstoffes für den Initiationsfaktor BIF2a wirkt. In Abwesenheit von Hämin endet die Proteinsynthese in Retikulocytlysaten bereits nach einer kurzen Inkubationszeit (Jackson, R. und Hunt, T. 1983 Meth. in Enzymol. 96, 50). Kaliumacetat und Magnesiumacetat wird in solcher Höhe zugegeben, die für die Translation der meisten mRNA-Arten empfohlen wird. Dies ist das für in vitro- Translationen verwendete Standard-Kaninchenretikulocytenlysat. Die Endmagnesiumkonzentrationen für Standard-Kaninchenretikulocytlysat, wie in der folgenden Tabelle beschrieben, liegen typischerweise in dem Bereich von etwa 4.2 bis 5.0 mM, das in gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen bei einem 50%- Verhältnis benutzt wird.

Endkonzentrationsverteilung zugefügter Bestandteile zu einer Kaninchenretikulocytenlysat-Translationsreaktion mit 50% Lysat

Kreatinphosphat 7 mM
Kreatinphosphokinase 35µg/ml
DTT 1.4mM
Kalbsleber-tRNA 35µg/ml
Kaliumacetat 56 mM
Magnesiumacetat 350µM
Hämin 14.3µM
Eine andere bevorzugte Ausführungsform verwendet Weizenkeimextrakt. Dieser kann durch eine Methode, wie von Roberts, B.E. und Paterson, B.M. (1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 70, Nr.8, S. 2330-2334) beschrieben, mit den von Anderson, C.W., et al. (1983, Meth.Enzymol., Vol. 101, S. 635) beschriebenen Modifizierungen und wie gemäß Herstellungsprotokoll L418, Promega Corp. Madison, WI abgeändert, hergestellt werden. Im allgemeinen wird Weizenkeimextrakt durch Zermahlen von Weizenkeim in einem Extraktionspuffer und anschließender Zentrifugation zum Entfernen der Zelltrümmer hergestellt. Der Überstand wird dann durch Chromatographie von endogenen Aminosäuren und Pflanzenpigmenten, die auf die Translation hemmend wirken, gereinigt. Der Extrakt wird auch mit mikrokokkaler Nuclease zum Abbau endogener mRNA behandelt, um die Hintergrundtranslation auf ein Minimum zu reduzieren. Der Extrakt enthält die für die Proteinsynthese notwendigen zellulären Bestandteile, wie tRNA, rRNA und Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Der Extrakt wird ferner durch Zugabe eines energieerzeugenden Systems, bestehend aus Phosphokreatinkinase und Phosphokreatin, optimiert, und Magnesiumacetat wird auf einem, für die Translation der meisten mRNA-Arten empfohlenen Level zugefügt. Die Magnesiumendkonzentration für Standard-Weizenkeimextrakt, wie in der folgenden Tabelle beschrieben, liegt typischerweise in dem Bereich von etwa 6.0 mM bis 7.5 mM.

Endkonzentrationsverteilung zugefügter Bestandteile zu einer Weizenkeimextrakt- Translationsreaktion mit 50%

Kreatinphosphat 10mM
Kreatinphosphokinase 50µg/ml
DTT 5 mM
Kalbsleber-tRNA 50µg/ml
Magnesiumacetat 3.0 - 3.75 mM
Kaliumacetat 50 mM
Spermidin 0.5 mM
ATP 1.2mM
GTP 0.1 mM
HEPES (pH 7.6) 12mM
Für gekoppelte Transkription und Translation muß die Magnesiumkonzentration des eukaryotischen zellulären Lysats durch einen zusätzlichen Magnesiumbestandteils, vorzugsweise einem Salz, angepaßt werden. Bevorzugte Salze umfassen Magnesiumchlorid und Magnesiumacetat. Die Zugabe einer Puffersubstanz kann zur Stabilisierung des pH-Wertes erfolgen, obwohl dies nicht notwendig ist. Zur Kopplung von Transkription und Translation wird dem Lysat eine ausreichende Menge an Magnesiumchlorid oder -acetat zugefügt, um die Endmagnesiumkonzentration auf einen Level zu bringen, auf dem RNA von DNA transkribiert und RNA in Protein translatiert wird. Dieser Level wird in Abhängigkeit von dem verwendeten Lysat variieren.
Die einfache Zugabe einer prokaryotischen RNA-Polymerase und von Ribonukleotidtriphosphat zu einem Standard-Kaninchenretikulocytlysat oder Weizenkeimextrakt erlaubt keine in vitro-Proteinbildung von einer DNA-Matrize. Die vereinzelte Angleichung der Salzkonzentrationen im System, das beschrieben werden wird, erlauben jedoch Proteinbildung durch Schaffung von Bedingungen innerhalb des Lysats, die sowohl Transkription der DNA in RNA als auch Translation von RNA zu Protein zulassen.
Magnesium ist dafür bekannt, daß es zur Optimierung der Translation wichtig ist, da es die Stabilität der angeordneten Ribosomen erhöht und bei deren Zusammenhalt während der Translation wirkt. Magnesium scheint auch die Polymerasebindung zu fördern. Kalium ist ebenfalls für die Optimierung der Translation wichtig, aber im Unterschied zu Magnesium ist für die gekoppelte Transkription und Translation die Änderung der Konzentration der Kaliumionen über die Standard-Translationszubereitungslevel hinaus nicht notwendig.
Kalium und Magnesium sind im Standard-Kaninchenlysat enthalten. Deren Level stammen teilweise vom endogenen Lysatlevel und teilweise von dem während der Herstellung des Lysats zugefügten Level, wie bei der Herstellung von Translationslysaten. Das Lysat wird während der Herstellung etwas verdünnt, und das zubereitete Lysat wird dann nur zu 50% für die gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen benutzt.
Da die Magnesiumkonzentration innerhalb eines relativ nahen optimalen Bereiches angeglichen werden sollte, wird der Lysatmagnesiumlevel vorzugsweise direkt durch den Gebrauch eines Magnesiumassays vor Zugabe von Extramagnesium bestimmt, so daß der Magnesiumanteil in einer Reaktion von einer Lysatcharge zur nächsten standardisiert werden kann. Der Lancer "Magnesium Rapid Stat Diagnostic Kit" (Oxford Lab Ware Division, Sherwood Medical Co., St. Louis, MO) ist ein solcher Assay, der genau die Magnesiumlevel in biologischen Flüssigkeiten bestimmen kann. Wenn einmal die Magnesiumionenkonzentration für eine gegebene Lysatcharge bekannt ist, kann zusätzliches Magnesium, zum Beispiel in Form einer konzentrierten Magnesiumsalzlösung, in bekannter Weise zugefügt werden, um die Magnesiumkonzentration des Lysats innerhalb des optimalen Bereiches oder, im Falle einer abgeänderten Lysatherstellung für den Gebrauch als halbe Reaktionsmischung, innerhalb des zweifachen optimalen Bereiches zu bringen.
Damit wurde gefunden, daß, wenn die Magnesiumendkonzentration von Kaninchen- Retikulocytlysat auf eine Konzentration größer als 2.5 mM, aber weniger als 3.5 mM, vorzugsweise zwischen 2.6 und 3.0 mM, angeglichen wird, wie durch Zugabe einer konzentrierten Lösung von Magnesiumchlorid oder -acetat, gekoppelte Transkription und Translation stattfindet. Für die gekoppelte Transkription und Translation unter Verwendung von Weizenkeimextrakt wird Protein bei einer Endkonzentration an Magnesiumchorid oder -acetat größer als etwa 3.0 mM, aber weniger als etwa 5.25 mM, vorzugsweise angeglichen auf ungefähr 4.0 mM bis 4.75 mM, gebildet.
Reaktionsbedingungen für gekoppelte Transkription und Translation müssen die Zugabe von Ribonukleotidtriphosphaten (ATP, GTP, CTP, UTP) und Aminosäuren, für Kaninchen-Retikulocytlysat zu Endkonzentrationen von jeweils 0.4 mM bzw. jeweils 20 uM umfassen. Reaktionsbedingungen für Weizenkeimextrakt werden durch die Zugabe von Ribonukleotidtriphosphaten zu Endkonzentrationen von 0.4 mM an CTP und UTP, 0.5 mM an GTP und 1.6 mM an ATP modifiziert, während Aminosäuren zu einer Endkonzentration von 20-80 uM zugegeben werden. Wenn eine radioaktiv markierte Aminosäure, wie ³&sup5;S-Methionin oder ³H-Leucin, in der gekoppelten Reaktion benutzt wird, wird die entsprechende Aminosäure in der Aminosäuremischung ausgelassen. Eine RNA-Poymerase, entweder SP6, T7 oder T3, wird dann, vorzugsweise zu einer Endkonzentration von etwa 80-160 Einheiten pro 50 ul Reaktion, zugefügt. Die DNA- Matrize mit dem zu translatierenden Gen wird in einer Konzentration von 1 µg zugegeben, und das Reaktionsvolumen auf 50 µl durch Zugabe von Wasser aufgefüllt. Der Reaktionsansatz wird dann bei 30ºC für 1-2 Stunden inkubiert.
Obwohl Kalium dem Reaktionsgemisch in der bevorzugten Ausführungsform zugegeben wird, erhöht zusätzliches Kalium, im Gegensatz zu Magnesium, im großen und ganzen nicht die Proteinbildung, leistet aber eine nur leichte Verbesserung, wenn angemessene Magnesiumlevel bereits vorhanden sind. Kaliumacetat wird in einer optimalen Endkonzentration von etwa 59 mM zugegeben. Obwohl Kaliumchlorid oder -acetat aufgrund der größeren zugegebenen Anteile als im Falle des Magnesiums zugefügt werden kann, wird Kaliumacetat bevorzugt. Es kann der Standard-Translationslysatlevel, eine Konzentration von ungefähr 56 mM, verwendet werden, während soviel Spermidin zugefügt wird, daß sich eine Endkonzentration von etwa 0.2 mM ergibt. Die Endkonzentration an Kaliumchlorid oder -acetat ist ebenfalls eine auf den Anteil dieses Bestandteils im Standardlysat basierende Schätzung, jedoch muß berücksichtigt werden, daß diese Konzentration, wie auch die Magnesiumkonzentration, aufgrund endogener Bestandteile leicht variieren kann.
Zusätzliche Bestandteile können dem Lysat, falls erwunscht, zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit oder Stabilität der gekoppelten Transkription- und Translationsreaktion zugegeben werden. Eine übliche Zugabe zu gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen ist ein Anteil eines Polyamin, der ausreicht, um die Leistungsfähigkeit der Kettenverlängerung zu stimulieren. Obwohl nicht absolut notwendig, ist für die gekoppelte Transkription und Translation eine Endkonzentration an Spermidin von etwa 0.2 mM in der Mischung optimal, zumal mit dieser Konzentration eine erhöhte Proteinbildung beobachtet wird. Ebenso beeinflussen Polyamine optimale Magnesiumlevel und sind dafür bekannt, die wirksame Magnesiumkonzentration für Translationsreaktionen etwas zu verringern. Es scheint, daß die Polyamine bis zu einem gewissen Grad Magnesium ersetzen können, was eine Rolle für die Optimierung des Magnesiumbedarfs spielen würde, wenn auch nur möglicherweise eine gewisse Herabsetzung der optimalen Magnesiumlevel für die gekoppelte Transkription und Translation erlaubt ist.
Optimale Magnesiumkonzentrationen werden in der in vitro-Umgebung auch durch andere Bedingungen und Betrachtungen beeinflußt. Wenn beispielsweise die Ribonukleotidtriphosphat-Konzentration hoch geht, erfolgt eine gleichzeitige Erhöhung der optimalen Magnesiumkonzentration, da die Ribonukleotidtriphosphate mit Magnesium in Lösung zur Assoziierung oder Chelatbildung neigen. Wenn deshalb die für die obigen Reaktionen angegebenen Ribonukleotidtriphosphat-Konzentrationen auf 0.6 mM erhöht werden, wird die Proteinbildung aus den gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen größtenteils reduziert. Die optimale Magnesiumkonzentration variiert ebenso mit dem zellulären Lysat, ob Weizenkeimextrakt oder Retikulocytlysat verwendet wird. Der Anteil an Magnesium, der als Zugabe zum Erreichen eines optimalen Levels benötigt wird, variiert mit der Konzentration des in der Reaktionsmischung verwendeten Lysats, da eine Steigerung der Lysatkonzentration die Magnesiumverteilung durch das Lysat selbst erhöht.
Aufgrund der großen Anzahl der Bestandteile im Lysatgemisch kann nicht mit Sicherheit gesagt werden, ob die Proteintranslation von RNA, die Transkription der RNA von DNA oder beides durch andere als optimale Salzkonzentrationen ungünstig beeinflußt werden. Das Ergebnis ist in jedem Fall dasselbe, nämlich daß signifikante Anteile an Protein in der Reaktion nicht gebildet werden. Mit einer geringfügigen Angleichung an die Magnesiunikonzentration, möglicherweise durch die Angleichung der Polyaminkonzentration und Überwachung, daß Ribonukleotidtriphosphat- Konzentrationslevel kein Problem werden, wird eine gekoppelte Transkription und Translation beobachtet, aber nur innerhalb eines relativ schmalen Bereiches.
Dithiothreitol (DTT) wird der Reaktionsmischung vorzugsweise zugegeben. Wenn DTT an gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen beteiligt ist, wird es vorzugsweise in einer Endkonzentration von etwa 1.45 mM zugegeben. Optimales DDT liegt für Weizenkeim bei etwa 5.1 mM. Auch ein Ribonuklease-Hemmstoff, wie RNasin, kann dem Lysat zugefügt werden, um endogene Ribonukleasen wirksam zu inaktivieren. Es wurde gezeigt, daß Konzentrationen von 40 Einheiten pro 50 µl Reaktion die Reaktion zu verlängern helfen. RNasin ist keine absolute Notwendigkeit für die gekoppelte Transkription und Translation in Kaninchen-Retikulocytenlysat, wird aber für die gekoppelte Transkription und Translation bei Gebrauch von Weizenkeimextrakt benötigt. Das Weglassen von RNasin aus letzterem hat zur Folge, daß keine Proteintranslation erfolgt, da im Lysat aktive Ribonukleasen vorhanden sind.
Die für gekoppelte Transkription und Translation für Kaninchen-Retikulocytenlysat bevorzugten Konzentrationen an Kaliumchlorid oder -aeetat, Magnesiumchlorid oder - acetat und Spermidin können durch Zugabe von 2.5 µl eines optimierten Tris/Acetat- Puffers (1xTA-Puffer =33 mM Tris/Acetat pH 7.8, 65 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 4 mM Spermidin, 1mM DTT) erhalten werden. Wenn einer Standard- 50µl-in vitro-Translationsreaktion zugegeben, erhöht dieser Puffer den Magnesiumlevel im Lysat um insgesamt 0.5 mM.
Kaninchen-Retikulocytenlysat kann während der Herstellung abgeändert werden. Das Lysat wird bei einer Konzentration von 50% (typischerweise 25 µl pro 50 µl Reaktion) verwendet, so daß eine bevorzugte Modifizierung die Angleichung der Kaliumacetatkonzentration auf 118 mM, die Magnesiumacetatkonzentration auf etwa 5.2 bis 6.0 mM und Spermidin auf 0.4 mM umfaßt. Dies ergibt optimale Endkonzentrationen von 59 mM Kaliumacetat, 2.6 bis 3.0 mM Magnesiumacetat und 0.2 mM Spermidin, wenn 50% Lysat in einer gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktion verwendet wird. Das Lysat kann ferner durch die Zugabe von einer der RNA- Polymerasen (SP 6, T7 oder T3) zum Lysat abgeändert werden, vorzugsweise bei einer Konzentration von 80-160 Einheiten pro 50 µl Reaktion. Solch ein modifiziertes Lysat kann bis zum Gebrauch gefroren aufbewahrt werden.
Spermidin wird auch vorzugsweise Weizenkeimextrakt zugefügt, optimalerweise bis zu einer Endkonzentration von etwa 0.9 mM. Kaliumacetat wird vorzugsweise bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 56.5 mM zugegeben. Diese Konzentrationen können durch Zugabe von 5.0 µl eines 1xTA-Puffers zu einer 50 µl-in vitro-Translation unter Verwendung von Standard-Weizenkeimextrakt erreicht werden, obwohl diese Konzentrationen auf Schätzungen der Anteile dieser Komponenten in Standard- Weizenkeimextrakt beruhen und aufgrund endogener Bestandteile im Lysat selbst leicht variieren können.
Weizenkeimextrakt kann ebenfalls während des Herstellungsprozesses so modifiziert werden, daß die Endkonzentrationen an Kaliumacetat, Magnesiumacetat und Spermidin gleich den oben für Reaktionsbedingungen für Weizenkeim beschriebenen entspricht, wenn das Lysat bei einer 50%-Konzentration verwendet wird. Weizenkeimextrakt kann während der Herstellung weiterhin durch Zugabe einer der RNA-Polymerasen bis zu einer Endkonzentration von 80-160 Einheiten pro Reaktion abgeändert werden. Der modifizierte Extrakt wird bis zum Gebrauch gefroren aufbewahrt.
Werden Magnesiumkonzentrationen auf einem, im Standardlysat üblichen Level gelassen, erfolgt keine Proteinbildung. Die Zugabe aller anderen Bestandteile des 1xTA- Puffers zum Reaktionsgemisch, nur ohne Magnesium, resultiert in eine, kein Protein bildende Reaktion. Andererseits führt die Zugabe von überschüssigem Magnesium zur vollständigen Einstellung der Translation. Beispielsweise wird in einer ähnlichen Reaktionsmischung unter Verwendung von Kaninchen-Retkulocytlysat, allerdings mit einer Magnesiumendkonzentration von etwa 3.5 mM, die Proteintranslation wieder eingestellt. Diese obere Grenze wird vermutlich in Abhängigkeit von anderen Parametern, wie Kalium- und Spermidinkonzentrationen wie auch Ribonukleotidtriphosphat-Konzentrationen, leicht variieren, wobei von beiden bekannt ist, daß sie die optimale Magnesiumkonzentration für die Translation von RNA in Protein verändern.
Sowohl modifizierter Weizenkeimextrakt wie auch modifiziertes Kaninchen- Retikulocytlysat können beide als Teil eines Kits zur Förderung der Erhöhung gekoppelter Transkriptions- und Translationsreaktionen enthalten sein. Solch ein Kit verbessert für den Forscher den Gebrauch, da das eukaryotische zelluläre Lysat vorbereitet und fertig zum Gebrauch vorliegt. Zusätzlich zum Kaninchen- Retikulocytlysat oder Weizenkeimextrakt kann solch ein Kit die zur Durchführung gekoppelter Transkription und Translation notwendigen Bestandteile, Reagenzien, enschließlich Enzyme, und Puffer über die Einführung einer DNA-Matrize beinhalten. Das Lysat kann Standard oder eines Typs sein, bei dem die Angleichungen an die Salzkonzentrationen bereits während der Herstellung erfolgt sind oder zusätzlich bei dem ein oder mehrere, für die gekoppelte Transkription und Translation notwendigen Bestandteile, Reagenzien oder Puffer eingeschlossen wurden.
Der Anteil an gebildetem Protein in einer gekoppelten in vitro-Transkription und -Translation kann auf verschiedener Weise bestimmt werden. Eine Methode bezieht sich auf die Verfügbarkeit eines Bestimmungsansatzes, der die Aktivität des speziellen, translatierten Proteins bestimmt. Ein Beispiel eines Bestimmungsansatzes für die Bestimmung der Proteinaktivität ist das in Technical Bulletin 101, Promega Corp., Madison, WI beschriebene Luciferase-Assaysystem. Diese Assays bestimmen den Anteil fünktionell aktiven, aus gekoppelter Transkriptions- und Translationsreaktion gebildeten Proteins. Aktivitätsassays bestimmen nicht die volle Länge an Protein, das aufgrund falscher Proteinfaltung oder des Mangels anderer posttranslationaler Modifizierungen, die für die Proteinaktivität notwendig sind, inaktiv ist.
Eine andere Methode zur Bestimmung des in gekoppelten in vitro-Transkriptions- und Translationsreaktionen gebildeten Proteinanteils ist, die Reaktionen unter Verwendung einer bekannten Menge an radioaktiv markierter Aminosäure, wie ³&sup5;S-Methionin oder ³H-Leucin durchzuführen und nachfolgend den in das neu translatierte Protein eingebauten Anteil an radioaktiv markierter Aminosäure zu bestimmen. Zur Beschreibung dieser Methode vgl. den in vitro Translation Technical Manual, Promega Corp., Madison, WI. Diese Assays bestimmen den Anteil an eingebauten, radioaktiv markierten Aminosäuren in allen, in einer in vitro-Translationsreaktion gebildeten Proteinen, einschließlich unvollständiger Proteinprodukte. Es ist wichtig, das radioaktiv markierte Protein auf einem Proteingel zu trennen und durch Autoradiographie zu bestätigen, daß das Produkt die passende Größe aufweist und Sekundärproteinprodukte nicht gebildet wurden. Die genaueste Bestimmung der Proteinbildung ist, die Bestimmung der Aktivität mit den Bestimmungen des Einbaus aufeinander zu beziehen.
Wie oben beschrieben benötigen gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktionen die Enführung einer DNA-Matrize. Weitere Erhöhungen von in vitro- Proteintranslationen wurden unter Verwendung eines Vektors, der eine Poly-A-Sequenz an einem Ende der multiplen Klonierungsregion enthält, erreicht. Ein bevorzugter Vektor enthält auch einen SP6-, T7- oder T3-RNA-Polymerasepromotor am entgegengesetzten Ende der multiplen Klonierungsregion, so daß die Klonierung in einen Vektor ein Gen bildet, das am 5'-Ende von einem RNA-Polymerasepromotor und am 3'-Ende von einer Poly-A-Sequenz flankiert ist. Viele kommerziell erhältliche Klonierungsvektoren enthalten einen oder mehrere der Promotoren SP6, T7 oder T3, da diese für den Gebrauch in Standard-in vitro-Transkriptionsreaktionen weit verbreitet sind. Der Vektor pSP64 (Poly-A) ist kommerziell erhältlich von Promega Corp., Madison, WI. Dieser Vektor wurde zur Klonierung des Luciferasegens, das nachfolgend in einer gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktion unter Verwendung von Kaninchen- Retikulocytenlysat translatiert wurde, benutzt. Das gleiche Luciferasegen wurde in einen anderen Vektor ohne Poly-A-Sequenz kloniert und anschließend in einer gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktion translatiert. Die Durchführung von Aktivitätsassays an den in diesen Reaktionen gebildeten Produkten ergaben einen offensichtlichen signifikanten Aktivitätsanstieg in der das Poly-A-Konstrukt enthaltenden Reaktion.
Zur Untersuchungen kotranslationaler und anfänglicher posttranslationaler Modifikationen von Proteinen, können gekoppelte Transkriptions- und Translations- reaktionen in Gegenwart von pankreatischen, mikrosomalen Membranen von Hunden durchgeführt werden. Schneiden des Signalpeptids, Membraninsertion, Translokation und Core-Glykosylierung sind einige der Modifizierungen, die untersucht werden können. Eine gekoppelte Transkriptions- und Tranlationsreaktion unter Verwendung eines Klons des B-Lactamase-Vorläufers in Gegenwart mikrosomaler Membrane führte zur Bildung der erwarteten Form des Proteins, das zeigte, daß ein Signalprocessing stattgefunden hatte. Ännlich bildete eine gekoppelte Transkriptions- und Translations- reaktion unter Verwendung eines Klons der Vorstufe desα-Faktors von S.cerevisiae in Gegenwart mikrosomaler Membranen die erwartete prozessierte Form des Proteins, das Glykosylierung aufwies.
Gekoppelte Transkription und Translation können in jeglicher Methode, die die in vitro- Translation von Proteinen benötigt, eingesetzt werden. Diese Methoden beinhalten in vitro-Mutagenese von Genen zur Untersuchung der Struktur und Funktion der resultierenden Proteine. Andere Methoden sind in vitro-Translation von modifizierten Proteinen zwecks Isolierung oder Reinigung des Proteins aus dem Rest des Reaktionsansatzes und die in vitro-Translation von Protein mit der Absicht der Bildung von Antikörpern zu diesem Protein. Die Methode der gekoppelten Transkription und Translation im Kanichen-Retikulocytlysat oder Weizenkeimextrakt bietet gegenüber geläufigen Methoden der in vitro-Translation dahingehend Vorteile, daß diese Systeme weniger Zeit erfordern und erhöhte Proteinlevel ergeben.
Es gibt ebenfalls eine Anzahl von Vorteilen bei Benutzung einer solchen statischen, gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktion bei kontinuierlichen oder Durchströmungsreaktionen. Zunächst gibt es einen großen Unterschied bei den Anwendungsmöglichkeiten beider Systeme. Das kontinuierliche System wird für die industrielle Proteinproduktion im Großmaßstab verwendet, wohingegen die statischen Systemreaktionen eher für den täglichen Gebrauch des aktuell mit in vitro-Translation beschäftigten Forschers passen. Es ist viel teuerer, eine kontinuierliche Translation durchzuführen, da dies eine Investition an Ausstattung (eine einfache Amiconeinheit kostet ungefähr 2,000 Dollar) wie auch eine bemerkenswerte Menge an Reagenzien verlangt. Im einzelnen sind die Level an RNA-Polymerasen, die für den Ablauf kontinuierlicher eukaryotischer Reaktonen verwendet werden, für einfache Forschungsanwendungen unerschwinglich (20,000-30,000 Einheiten/Reaktion). Kontinuierliche Reaktionen sind dazu bestimmt, in relativ großen Volumen durchgeführt zu werden, während statische Reaktionen keine Extraaustattungen und nur geringe Anteile an Reagenzien benötigen, da das Reaktionsvolumen typischerweise nur in einer Größenordnung von 50 µl oder weniger liegt.
Die für die kontinuierliche Reaktion benötigte Zeit ist signifikant, irgendwo zwischen 24 und 100 Stunden, während statische Reaktionen nur 1 bis 2 Stunden bis zum Abschluß benötigen. Für die gegenwärtig mit in vitro-Translation befaßten Forscher bietet das statische System durch Umgehung des in vitro-Transkriptionsschrittes bedeutsame Zeiteinsparungen für die meisten analytischen oder anderen Forschungsanwendungen. Aufgrund der benötigten Zeit sowohl für den Aufbau wie auch für den Lauf kontinuierlicher Reaktionen ergibt sich für den typischen Forscher keine Netto- Zeiteinsparung, selbst für gekoppelte Translation und Transkription in solch einem System. Weiterhin werden mit dem statisch gekoppelten Transkriptions- und Translaüonssystem bedeutsame Erhöhungen bei der Proteinbildung im Vergleich zur Standard-in vitro-Translation unter Gebrauch von RNA-Matrizen beobachtet. Ein weiterer Anstieg bei der Proteinproduktion wird in dem statischen System beobachtet, wenn die DNA-Matrize eine 3'-Poly-A-Sequenz enthält.
Im allgemeinen stellt das statische System dem alltäglichen Forscher die gekoppelte Transkription und Translation zur Verfügung, nicht nur aufgrund der Kostenersparnis und des leichten Gebrauchs, sondern auch aufgrund der bedeutenden Zeitersparnis und der, verglichen mit anderen bekannten eukaryotischen Systemen, gesteigerten Proteinbildung.

Beispiel 1

Gekoppelte Transkription und Translation wurde mit einem, das Luciferasegen enthaltendem DNA-Konstrukt durchgeführt. Die Reaktion wurde über die Bildung des Luciferaseenzyms mit Hilfe des Luciferase-Bestimmungssystems (Promega, Corp., Madison, WI) überprüft. Luciferaseaktivität wird in Turner-Lichteinheiten unter Gebrauch eines Turner-Luminometers gemessen. Gekoppelte Transkription und Translation wurde unter den folgenden Reaktionsbedingungen erhalten:
* 1xTA-Puffer besteht aus 33 mM Tris/Acetat pH 7.8, 65 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 4 mM Spermidin ünd 1 mM DTT.
Die Reaktion wurde bei 30ºC für 1.5 Stunden inkübiert. Nach 1.5 Stunden wurde eine 2.5 µl Probe der obigen Reaktion in dem Luminometer mit einem plazierten 100x Lichtfilter bestimmt. Die Probe ergab mehr als 30,000 Turner-Lichteinheiten. Kontrollexperimente, bei denen entweder DNA in der Reaktion weggelassen wurde oder bei denen kein 1xTA enthalten war, bildeten keine Turner-Lichteinheiten.

Beispiel2

Gekoppelte Transkription und Translation wurde auf ännliche Weise in einer Reaktion, die Weizenkeimextrakt enthielt, durchgeführt. Wieder enthielt das verwendete DNA- Konstrukt das Luciferasegen. Gekoppelte Transkription und Translation wurde durch folgende Reaktionsbedingungen erhalten:
Die Reaktion wurde für 1 Stunde bei 30ºC inkubiert. Nach 1 Stunde wurde eine 2.5 µl Probe in dem Luminometer mit einem plazierten 100x Lichtfilter gemessen. Die Probe bildete mehr als 5,000 Turner-Lichteinheiten.

Beispiel 3

Gekoppelte Transkription und Translation wurde auch mit während der Herstellung durch Zugabe bestimmter Bestandteile oder Reagenzien modifizierten Lysaten durchgeführt. Wänrend der Herstellung eines Kaninchen-Retikulocytenlysates wurde ein Aliquot zur Seite gestellt und dem Lysat wurde vor dem Einfrieren SP6-RNA- Polymerase zugegeben. SP6 wurde in einer Größenordnung von 160 Units an SP6 pro 25 µl Lysat zugefügt. Das Lysat wurde schnellgefroren und bis zum Gebrauch bei -70ºC gelagert. Gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktionen wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß kein zusätzliches SP6 zugegeben wurde, in Gang gebracht. Die mit Kaninchen-Retikulocytlysat, dem während der Herstellung SP6-RNA-Polymerase zugefügt worden war, durchgeführten Reaktionen, bildeten Protein. Weitere Experimente haben gezeigt, daß die anderen Bestandteile (zum Beispiel Puffer und Aminosäuren), die für die gekoppelte Transkription und Translation notwendig sind, dem Lysat während seiner Herstellung zugesetzt werden können. Das Lysat mit den zugefügten Bestandteilen kann zur Proteinbildung in gekoppelten Reaktionen bei der Einführung der DNA-Matrizen verwendet werden.

Beispiel 4

DNA-Konstrukte mit Genen für eine Vielzahl von Proteinen wurden in gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen getestet. Die gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 wurden benutzt, mit der Ausnahme, daß eine radioaktiv markierte Aminosäure (³&sup5;S-Methionin) in der Reaktionsmischung enthalten war. Methionin wurde aus der Aminosäuremischung entfernt. Reaktionen wurden unter Verwendung von hinter den SP6- oder T7-RNA-Polymerasepromotoren geklonten Plasmid-DNA-Konstrukten durchgeführt. Für Luciferase kodierende pGEMLuc-Plasmid-DNA wurde in gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen verwendet und ergab einen 15.3%igen Einbau von radioaktiv markierter Aminosäure. Dies wurde mit einer Standard-in vitro- Translation unter Verwendung einer transkribierten RNA-Matrize des Luciferaseklons, welche einen 0.8%igen Einbau ergab, verglichen. Proben dieser Reaktionen wurden SDS/PAGE-Gelläufen ausgesetzt, zur Bestatigung, daß das Proteinprodukt die für Luciferase entsprechende Größe aufwies. Weitere Experimente wurden unter Verwendung von Klonen des B-Lactamasegens und desα-Faktors von S. cerevisiae hinter dem SP6-Promotor durchgeführt. Standard in vitro-Translation unter Gebrauch einer RNA-Matrize von B-Lactamase erreichte einen Einbau von 3% der markierten Aminosäure, während eine gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktion unter Verwendung einer DNA-Matrize einen Einbau von 26.8% ergab. Eine Standard-in vitro- Translationsreaktion unter Benutzung einer RNA-Matrize desα-Faktorgens ergab einen 0.8%igen Einbau, während eine gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktion mit einer DNA-Matrize 12.4% Einbau erreichte. Wieder wurden Proben der Reaktionen einem SDS/PAGE-Gellauf ausgesetzt, um die Größe der gebildeten Proteine zu bestätigen. Andere, von DNA-Matrizen in gekoppelten Transkriptions- und Translationsreaktionen gebildeten Proteine enthielten: TFIID-Transkriptionsfaktor, hinter dem T7-Promotor, ergab einen Einbau von 5%; Cjun-Transkriptionsfaktor, hinter T7, ergab einen Einbau von 13.4%; B-Galaktosidase, hinter dem SP6-Promotor, ergab einen Einbau von 28% und Poy-A-luc, ein Luciferasegen in einem Poly-A-Vektor, hinter SP6, ergab einen 25.9%igen Einbau.

Beispiel 5

Gekoppelte Transkription und Translation wurde in Kaninchen-Reticulocytenlysat unter Verwendung eines DNA-Konstruktes eines B-Lactamasevorläufers in Gegenwart und Abswesenheit von mikrosomalen Membranen aus Hunden durchgeführt, um die posttranslationale Modifizierung von Proteinen zu testen. Zum Sichtbarmachen der Produkte durch Autoradiographie enthielten die Reaktionen eine markierte Aminosäure. Produkte aus den Reaktionen wurden SDS/PAGE-Gelläufen unterworfen. Das Proteinprodukt aus der Reaktion ohne mikrosomalen Membranen wanderte bis etwa 31.5 Kilodalton (kDa), während das Proteinprodukt aus der Reaktion mit mikrosomalen Membranen bis etwa 28.9 kDa wanderte, was darauf hinwies, daß die Signalsequenz prozessiert worden war.
In einem ähnlichen gekoppelten Transkriptions- und Translationsexperiment wurde ein DNA-Konstrukt des α-Faktors von S. cerevisiae sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit mikrosomaler Membranen aus Hunden translatiert. Wieder wurden die radioaktiv markierten Produkte einem Gellauf unterworfen und die Ergebnisse wiesen daraufhin, daß der 18.6 kDa-Vorläufer zu einem, bis 32.0 kDa wandernden Protein prozessiert worden war, was auf eine Glykosylierung des α-Faktors hinwies.

Beispiel 6

Gekoppelte Transkription und Translation wurde bei DNA, hergestellt aus einem thermocyclischen Amplifikationsprozeß, durchgeführt. Das einzige Erfordernis für eine solche DNA ist, daß das amplifizierte Fragment einen RNA-Polymerasepromotor enthält. Das Experiment wurde unter Gebrauch eines vom pGEMLuc-Plasmid amplifizierten DNA-Fragments durchgeführt. Das resultierende Fragment enthielt die Sequenz für den SP6-RNA-Polymerasepromotor und die Sequenz für das Luciferasegen. Wenn dieses DNA-Fragment in eine gekoppelte Reaktion unter den von Beispiel 1 ähnlichen Bedingungen eingeführt wurde, wurde Luciferaseprotein gebildet. Andere amplifizierte DNA-Fragmente wurden in gekoppelten Reaktionen translatiert, die ein PGEMEX/Gen- 10-Fragment hinter dem T7-Promotor und ein B-Galaktosidasefragment hinter dem SP6- Promotor enthielten.

Claims

1. Verfahren zur Durchführung von Transkription und Translation von DNA in einem eukaryotischen, zellfreien Extrakt, bei dem die Magensiumkonzentration des Extraktes auf eine solche Höhe eingestellt wird, daß die Transkription und Translation in dem Sinne miteinander gekoppelt sind, daß RNA von DNA transkribiert und, gleichzeitig damit, RNA in Protein translatiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Extrakt ein Retikulocytenlysat von Kaninchen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Magnesiumendkonzentration etwa 2.5 mM bis etwa 3.5 mM beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Magnesiumendkonzentration etwa 2.6 mM bis etwa 3.0 mM beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem dem Lysat ein Polyamin zugesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Polyamin Spermidin ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Spermidin dem Lysat in einer Konzentration von etwa 0.2 mM bis etwa 0.4 mM zugefügt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Kaliumkonzentration des Lysats auf etwa 40 mM bis etwa 100 mM eingestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem dein Lysat zur wirksamen Inaktivierung endogener Ribonucleasen zusätzlich eine ausreichende Menge eines Ribonucleasehemmstoffes zugesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der Ribonucleasehemmstoff RNasin ist.

11. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem dem Lysat eine RNA- Polymerase zugesetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Polymerase aus der Gruppe, bestehend aus SP6-, T7- und T3-RNA-Polymerasen ausgewählt ist.

13. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem dem Lysat eine DNA- Matrize zugesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die DNA-Matrize über einen multiplen Klonierungsabschnitt verfügt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem an einem Ende des multiplen Klonierungsbereiches eine Polymerase-Promotorsequenz lokalisiert ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Matrize am entgegengesetzten Ende des multiplen Klonierungsabschnittes eine Poly-A-Sequenz aufweist, so daß Klonierung im multiplen Klonierungsbereich zu einem Gen führt, das am 5'-Ende von einem RNA-Polymerase-Promotor und am 3'-Ende von einer Poly-A-Sequenz flankiert ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem dem Lysat die der Promotorsequenz entsprechende Polymerase zugesetzt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Art der DNA-Matrize aus der Gruppe, bestehend aus einem superhelikalen Molekül, einem kovalent geschlossenen, ringförmigen Molekül, einem linearen Molekül oder einem DNA-Segment, hergestellt nach dem als Polymerase-Kettenreaktion bekannten Prozeß, ausgewählt ist.

19. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem zusätzlich dem Lysat ein Anteil an Ribonucleotidtriphosphaten zugesetzt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem dem Lysat jeweils 0.4 mM der Ribonucleotidtriphosphaten zugesetzt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Extrakt Weizenkeimextrakt ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Magnesiumendkonzentration etwa 3.0 mM bis etwa 5.25 mM beträgt.

23. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Magensiumendkonzentration etwa 4.0 mM bis etwa 4.75 mM beträgt.

24. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem dem Extrakt ein Polyamin zugesetzt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem das Polyamin Spermidin ist.

26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das Spermidin dem Extrakt in einer Konzentration von etwa 0.2 mM bis etwa 0.9 mM zugesetzt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Kaliumkonzentration des Extraktes auf etwa 50 mM bis etwa 150 mM eingestellt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem dem Lysat zur wirksamen Inaktivierung endogener Ribonucleasen zusätzlich eine ausreichende Menge eines Ribonucleasehemmstoffes zugesetzt wird.

29. Verfahren nach Anspruch 28, bei dem der Ribonucleasehemmstoff RNasin ist.

30. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem dem Extrakt eine RNA- Polymerase zugesetzt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, bei dem die Polymerase aus der Gruppe, bestehend aus SP6-, T7- und T3-RNA-Polymerasen ausgewählt ist.

32. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem dem Extrakt eine DNA- Matrize zugesetzt wird.

33. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem die DNA-Matrize über einen multiplen Klonierungsbereich verfügt.

34. Verfahren nach Anspruch 33, bei dem eine Polymerase- Promotorsequenz an einem Ende des multiplen Klonierungsbereiches lokalisiert ist.

35. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem die Matrize am entgegengesetzten Ende des multiplen Klonierungsabschnittes eine Poly-A-Sequenz aufweist, so daß Klonierung im multiplen Klonierungsbereich zu einem Gen führt, das am 5'-Ende von einem RNA-Polymerase-Promotor und am 3'-Ende von einer Poly-A-Sequenz flankiert ist.

36. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem dem Extrakt die der Promotorsequenz entsprechende Polymerase zugesetzt wird.

37. Verfahren nach Anspruch 32, bei dem die Art der DNA-Matrize aus der Gruppe, bestehend aus einem superhelikalen Molekül, einem kovalent geschlossenen, ringförmigen Molekül, einem linearen Molekül oder einem DNA-Segment, hergestellt nach dem als Polymerase-Kettenreaktion bekannten Prozeß, ausgewählt ist.

38. Verfahren nach Anspruch 21, bei dein zusätzlich dem Extrakt ein Anteil an Ribonucleotidtriphosphaten zugesetzt wird.

39. Verfahren nach Anspruch 38, bei dem dem Extrakt die Ribonucleotidtriphosphate in Höhen von 0.4 mM CTP, 0.4 mM UTP, 0.5 mM GTP und 1.6 mM ATP zugesetzt werden.

40. Verfahren zur Herstellung von Proteinen von einer DNA- Matrize, enthaltend eine spezifische Polymerase- Promotorsequenz, durch gekoppelte Transkription und Translation in einer Lösung, bei dem das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

- Herstellen einer Standardpräparationslösung eines eukaryotischen, zellfreien Extrakts, enthaltend die DNA- Matrize,

- modifizieren der Extraktlösung mit ausreichenden Konzentrationen an Ribonucleotidtriphosphaten, Aminosäuren und die der Promotorsequenz der DNA-Matrize entsprechende Polymerase zur Unterstützung der Transkription und Translation, und

- einstellen der Magensiumendkonzentration in der Extraktlösung in einer Höhe, bei der mit der Transkription der DNA-Matrize in RNA gleichzeitig die Translation der so transkribierten RNA in Protein erfolgt.

41. Verfahren nach Anspruch 40, bei dem die Magnesiumendkonzentration in der Extraktlösungsmischung durch etwa 0.5 mM erhöht wird.

42. Verfahren nach Anspruch 40, bei dem der Extrakt ein Retikulocytenlysat von Kaninchen ist.

43. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem die Magnesiumendkonzentration etwa 2.5 mM bis etwa 3.5 mM beträgt.

44. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem die Magnesiumendkonzentration von etwa 2.6 mM bis etwa 3.0 mM beträgt.

45. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem der Lösung ein Polyamin zugesetzt wird.

46. Verfahren nach Anspruch 45, bei dem das Polyamin Spermidin ist.

47. Verfahren nach Anspruch 46, bei dem der Lösung das Spermidin in einer Konzentration von etwa 0.2 mM bis etwa 0.4 mM zugesetzt wird.

48. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem die Kaliumkonzentration der Lösung auf etwa 40 mM bis etwa 100 mM eingestellt wird.

49. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem der Lösung zur wirksamen Inaktivierung endogener Ribonucleasen zusätzlich eine ausreichende Menge eines Ribonucleasehemmstoffes zugesetzt wird.

50. Verfahren nach Anspruch 49, bei dem der Ribonucleasehemmstoff RNasin.

51. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem die Polymerase aus der Gruppe, bestehend aus SP6-, T7- und T3- RNA-Polymerasen ausgewählt ist.

52. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem die Art der DNA-Matrize aus der Gruppe, bestehend aus einem superhelikalen Molekül, einem kovalent geschlossenen, ringförmigen Molekül, einem linearen Molekül oder einem DNA-Segment, hergestellt nach dem als Polymease-Kettenreaktion bekannten Prozeß, ausgewählt ist.

53. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem die DNA-Matrize über einen multiplen Klonierungsbereich verfügt.

54. Verfahren nach Anspruch 53, bei dem an einem Ende des multiplen Klonierungsabschnittes eine Polymerase- Promotorsequenz lokalisiert ist.

55. Verfahren nach Anspruch 54, bei dem die Matrize am entgegengesetzten Ende des multiplen Klonierungsabschnittes eine Poly-A-Sequenz aufweist, so daß Klonierung im multiplen Klonierungsbereich zu einem Gen führt, das am 5'-Ende von einem RNA-Polymerase-Promotor und am 3'-Ende von einer Poly-A-Sequenz flankiert ist.

56. Verfahren nach Anspruch 42, bei dem jeweils 0.4 mM der Ribonucleotidtriphosphate der Lösung zugesetzt werden.

57. Verfahren nach Anspruch 40, bei dem der Extrakt Weizenkeimextrakt ist.

58. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem die Magnesiumendkonzentration etwa 3.0 mM bis 5.25 mM beträgt.

59. Verfahren nach Anspruch nach 58, bei dem die Magnesiumendkonzentration etwa 4.0 mM bis etwa 4.74 mM beträgt.

60. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem der Lösung ein Polyamin zugesetzt wird.

61. Verfahren nach Anspruch 60, bei dem das Polyamin Spermidin ist.

62. Verfahren nach Anspruch 61, bei dem das Spermidin der Lösung in einer Konzentration von etwa 0.2 mM bis etwa 0.9 mM zugesetzt wird.

63. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem die Kaliumkonzentration der Lösung auf etwa 50 mM bis etwa 150 mM eingestellt wird.

64. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem der Lösung zur wirksamen Inaktivierung endogener Ribonucleasen zusätzlich eine ausreichende Menge eines Ribonucleasehemmstoffes zugesetzt wirdc

65. Verfahren nach Anspruch 64, bei dem der Ribonucleasehemmstoff RNasin ist.

66. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem die Polymerase aus der Gruppe, bestehend aus SP6-, T7- und T3-RNA-Polymerasen ausgewählt ist.

67. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem die Art der DNA-Matrize aus der Gruppe, bestehend aus einem superhelikalen Molekül, einem kovalent geschlossenen, ringförmigen Molekül, einem linearen Molekül oder einem DNA-Segment, hergestellt nach dem als Polymerase-Kettenreaktion bekannten Prozeß, ausgewählt ist.

68. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem die DNA-Matrize über einen multiplen Klonierungsabschnitt verfügt.

69. Verfahren nach Anspruch 68, bei dem die Polymerase- Promotorsequenz an einem Ende des multiplen Klonierungsabschnittes lokalisiert ist.

70. Verfahren nach Anspruch 69, bei dem die Matrize am entgegensetzten Ende des multiplen Klonierungsbereiches eine Poly-A-Sequenz aufweist, so daß Klonierung im multiplen Klonierungsbereich zu einem Gen führt, das am 5'-Ende von einem RNA-Polymerase-Promotor und am 3'-Ende von einer Poly-A-Sequenz flankiert ist.

71. Verfahren nach Anspruch 57, bei dem der Lösung die Ribonucleotidtriphosphate in Höhen von 0.4 mM CTP, 0.4 mM UTP, 0.5 mM GTP und 1.6 mM ATP zugesetzt werden.

72. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Transkription und Translation in einer Batch-Reaktion gekoppelt werden.

73. Verfahren nach Anspruch 40, bei dem die Transkription und Translation in einer Batch-Reaktion gekoppelt werden.

74. Verfahren zur Durchführung von Transkription und Translation in einem eukaryotischen, zellfreien Extrakt zur Herstellung von Protein, bei dem das Verfahren umfaßt

Zugabe einer DNA-Matrize zum Extrakt,

Zugabe von Ribonucleotidtriphosphaten zum Extrakt,

Zugabe einer RNA-Polymerase zum Extrakt, und

Einstellen der Magnesiumkonzentration des Extraktes auf eine solche Höhe, daß Transkription und Translation derart miteinander gekoppelt werden, daß RNA von der DNA-Matrize trankribiert und gleichzeitig damit so transkribierte RNA in das Protein translatiert wird.

75. Kit zur Herstellung von Protein von einer DNA-Matrize durch gekoppelte Transkription und Translation, bei dem der Kit folgende Komponenten umfaßt:

eukaryotischen, zellfreien Extrakt, Ribonucleotidtriphosphate, RNA Polymerase und Magnesium in einer solchen Konzentration, daß, wenn die Kit-Komponenten fertig für den Gebrauch in einem Verfahren gemäß Anspruch 1 gemischt werden, die Magnesiumendkonzentration in der Mischung in einer Höhe vorliegt, bei der RNA von DNA transkribiert und RNA in Protein translatiert wird.

76. Kit gemäß Anpruch 75, bei dem der Extrakt ein Retikulocytenlysat von Kaninchen ist

77. Kit gemäß Anspruch 76, bei dem die Magnesiumkonzentration etwa 2.5 mM bis etwa 3.5 mM beträgt.

78. Kit gemäß Anspruch 75, bei dem der Extrakt Weizenkeimextrakt ist.

79. Kit gemäß Anspruch 78, bei dem die Magnesiumkonzentration etwa 3.0 mM bis etwa 5.25 mM beträgt.

80. Kit gemäß Anspruch 75 und weiterhin enthaltend ein Polyamin.

81. Kit gemäß Anspruch 75 und weiterhin enthaltend Aminosäuren.

82. Eukaryotischer, zellfreier Extrakt zur Herstellung von Proteinen von einer DNA-Matrize durch gekoppelte Transkription und Translation, enthaltend:

lysierte Zellen, ausgewählt aus der Gruppe von eukaryotischen Zellen,

Ribonucleotidtriphosphate,

RNA-Poylmerase und

eine solche Magnesiumkonzentration, daß, wenn der Extrakt zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 benutzt wird, die Magnesiumendkonzentration derart ist, daß RNA von der DNA-Matrize transkribiert und RNA in Protein translatiert wird.