DE69212447T3 - Verfahren zur Herstelllung von Säften aus Früchten und Gemüse - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Säften und pektinhaltiger Früchte- und Gemüsetrester. Genau gesagt offenbart die Erfindung die Verwendung gereinigter Pektinesterase im Fruchtsaftherstellungsverfahren.
Hintergrund der Erfindung
• Die Herstellung von Saft und dessen Ertrag ab den Früchten oder Gemüsen kann bei Berücksichtigung der verschiedenen im Verfahren enthaltenen Bestandteile verstanden werden. Die für die vorliegende Erfindung wichtigen Bestandteile sind Pektin, Protopektin, Calciumionen und Pektinasen.
• Pektine sind Hauptbestandteile der Zellwände in den essbaren Anteilen von Früchten und Gemüsen. Die zwischen den Zellwänden gelegenen Mittellamellen bestehen zur Hauptsache aus Protopektin, das die unlösliche Form des Pektins darstellt. Pektine werden als interzelluläre Haftmittel angesehen, und aufgrund ihrer kolloidalen Natur spielen sie auch eine wichtige Rolle in der Regulierung des Wasserhaushalts der Pflanzen. Das Wasserbindungsvermögen wird aufgrund der Menge hydrophiler Hydroxyl- und Carboxylgruppen beträchtlich vergrössert. Die Pektinmenge kann sehr gross sein. Es wird berichtet, dass z. B. Zitronenschalen bis zu 30% Pektin in ihrer Trockenmasse enthalten, Orangenschalen 15 bis 20% und Apfelschalen ungefähr 10% (K. Norz, 1985. Zucker und Süsswarenwirtschaft 38, Seiten 5 und 6).
• Pektine setzen sich aus einem Rhamnogalacturonan- Grundgerüst zusammen, in dem 1,4-verknüpfte α-D-Galacturonanketten in Abständen durch eingefügte 1,2-verknüpfte α-L- Rhamnopyranosylreste unterbrochen sind (W. Pilnik und A. Voragen, 1970, in "The Biochemistry of Fruits and Their Products", Band 1, Kapitel 3, Seite 53, Academic Press). Weitere Zucker wie D-Galactose, L-Arabinose und D-Xylose sind als Seitenketten vorhanden. Ein grosser Teil der Galacturonanreste liegt an den C2- und C3-Stellungen als Methylester vor. Apfelpektin ist zu ungefähr 90% methyliert (G. Aspinall und Fanous, 1984. Carbohydrate Polym. 4, Seite 193). Pektin kommt in zwei Formen, als Pektin und als Protopektin, vor. Protopektin ist in Wasser unlösliches Pektin, das fest an die Zellwand gebunden ist (M. Joslyn, 1962, Food Research Band 11, Seiten 1 bis 107. Academic Press).
• In Früchten wie dem Apfel kann während der Reifung eine Zunahme des löslichen Pektingehalts und eine Abnahme des unlöslichen Protopektingehalts beobachtet werden. Das Freiwerden von Apfelpektin ist auf eine teilweise Auflösung des Protopektins aus den Lamellen zurückzuführen. Diese Auflösung oder Pektinolyse wird durch die in der Frucht vorhandenen endogenen Pektinasen bewirkt. Das Ergebnis dieses Vorgangs ist ein mit der Lagerdauer der Frucht zunehmender Pektingehalt im Saft nach dem Auspressen, während der in der Fruchtmasse verbleibende Protopektingehalt abnimmt.
• Calciumionen sind in freier Form oder als an die Pektinsäure gebundenes Calciumpectat im Fruchtfleisch der Äpfel vorhanden und erhöhen dessen Festigkeit (M. Walkinshaw und S. Arnott, 1981. J. Mol. Biol. 153, Seite 1075). Das gebundene Calcium wird nach der Ernte und wenigstens teilweise aufgrund der Pektinolyse und der Entwässerung der Äpfel freigesetzt und wandert in die Äpfel. Dieses Freisetzen von Calcium erhöht die Auflösung des Protopektins weiter (A. Perring et al., 1985. J. Sci. Food Agric. 36, Seite 1035). Gleichzeitig führt dieser Prozess zu einer Abnahme der Festigkeit des Fruchfleisches.
• Sowohl die endogenen Apfelpektinasen als auch das endogene Calcium haben einen deutlichen Effekt auf die in den Fruchttrestern verbleibende Restmenge Protopektin. Bei Beginn der Erntezeit enthalten die Apfeltrester einen hohen Anteil Protopektin, der aufgrund der Einwirkung der Pektinasen und der Wanderung des Calciums abnimmt. Das ist der Hauptgrund, warum der Pektinhersteller zur Sicherung eines hohen Verfahrensertrags bevorzugt Trester aus dem Anfang der Erntezeit verwendet.
• Apfel- oder Citruspektine werden wegen ihrer Gelierfähigkeit in der Lebensmittelherstellung verwendet. Apfelpektin wird für die Herstellung von Gelee oder Marmelade verwendet, da es unter sauren Bedingungen in Gegenwart von Zuckern geliert.
• Im herkömmlichen Saftherstellungsverfahren wird Apfelsaft nach dem Zerkleinern und Pressen, das die Flüssigphase von den verbleibenden Feststoffen trennt, erhalten. In pektinreichen Früchten wie dem Apfel ergibt mechanisches Zerquetschen einen Apfelsaft von hoher Viskosität, die mit der Reifezeit der Früchte zunimmt. Ausserdem verbleibt ein wesentlicher Teil des Safts im Fruchtfleisch in Form eines Gels. Nach längerem Lagern der Äpfel wird es aufgrund des steigenden Anteils löslichen Pektins immer schwieriger, den Saft durch Pressen oder andere mechanische Mittel dem Fruchtfleisch zu entziehen. Daher nimmt der Ertrag an Apfelsaft mit der Zeit ab. Der nach enzymatischem Abbau und Pressen erhaltene Apfelsaft wird mit exogenen Pektinasen entpektinisiert, mit Klärungshilfsmitteln oder Ultrafiltra tion geklärt, pasteurisiert und in Flaschen abgefüllt oder durch Vakuumverdampfen eingeengt. In DD 202620 wird ein Verfahren zur kontinuierlichen Entpektinisierung von pektinhaltigen Säften mittels eines Polygalacturonase/Pektinesterase-Enzymgemisches beschrieben. Das Enzymgemisch wird auf einem Träger fixiert, wobei das Verhältnis Polygalacturonase zu Pektinesterase vorzugsweise 0,5 bis 1,0 ist. Sowohl bei dem diskontinuierlichen wie auch dem kontinuierlichen Verfahren können die von der Apfelsaftherstellung übrigbleibenden Trester zur Pektinextraktion verwendet werden. In diesem Verfahren werden keine Abbauenzyme verwendet.
• In einem verbesserten Verfahren zur Saftherstellung wird der Saftertrag wesentlich erhöht, indem den Äpfeln vor dem Pressen exogene Pektinasen zugegeben werden (A. Endo, 1965. Agric. Biol. Chem. 29(2), Seite 137). Die für den Fruchtabbau am meisten verwendeten Pektinasepräparate sind zu einem schnellen Abbau hochveresterter Pektine fähig (A. Voragen und W. Pilnik, 1989, in "Biocatalysis in Agricultural Biotechnology", ACS-Symposiumserie 389, Kapitel 7, Seite 93). Die Pektinasepräparate bestehen im allgemeinen aus einer Mischung von Aktivitäten. Die Aktivitäten in diesen Mischungen hängen von der Quelle ab, von der sie stammen. Die Pektinasen lassen sich hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität in zwei Gruppen einteilen: Verseifende Enzyme (Pektin-Methylesterase PME und Pektin-Acetylesterase PAE), und Depolymeraseenzyme, welche die Polygalacturonketten digerieren. Die Enzyme der zweiten Gruppe sind eine Pektinlyase (PL) und Polygalacturonasen (PG) (exo oder endo).
• Die Verwendung dieser Enzyme hängt von dem Substrat, dem Ausmass der Methylierung und dem Molekulargewicht des Pektins ab. PE und PG oder PL bewirken zuerst die Auflösung des Protopektins zu Pektin und hydrolysieren dann das Pektin von den Zellwänden, wobei sie damit gleichzeitig den in den Zellvakuolen enthaltenen Saft freisetzen.
• Die erhöhte Pressbarkeit des Fruchtfleisches und der verbesserte Saftertrag sind darauf zurückzuführen, dass abgebaute Pektine ihre Wasserbindungsfähigkeit verloren haben. Die enzymatische Behandlung verbessert den Saftertrag aus Äpfeln, die schwierig zu pressen sind oder auch für längere Zeit gelagert wurden.
• Die durch Zugabe exogener Pektinasen angeregte Pektinhydrolyse ergibt eine schnelle Abnahme der Viskosität, eine Verbesserung der Pressbarkeit des Fruchtfleisches, eine Auflösung der Geleestruktur und ein erhöhter Apfelsaftertrag. Die aus einer Mischung enzymatischer Aktivitäten (so z. B. PE, PG und PL) bestehenden exogenen Pektinasen setzen aber auch den grössten Teil des in den Trestern gebundenen Protopektins frei und bauen ihn ab. Die Trester können nicht mehr wirtschaftlich für die Pektinherstellung verwendet werden. Ausserdem führt dieser angeregte enzymatische Abbau des Pektins zu einer Zunahme der Abbauprodukte wie Uronsäure, oder allgemeiner Oligogalacturonide, im Saft. Diese Abbauprodukte bewirken eine unerwünschte nicht- enzymatische Bräunung während der Lagerung (A. Voragen et al., 1988. Z. Lebensm. Forsch. 187, Seiten 315 bis 320).
• Zusammenfassend kann geschlossen werden, dass im herkömmlichen Saftherstellungsverfahren der Saftertrag relativ niedrig, der Saft trübe, und die aus den Trestern ausziehbare Pektinmenge hoch ist. Zugabe von Pektinasen führt zu einem erhöhten Saftertrag, einem niedrigeren Protopektingehalt der Fruchtmasse und unerwünschten Nebenreaktionen, die eine anschliessende Bräunung des Saftes bewirken.
• Offensichtlich besteht ein Bedarf an einem Enzympräparat, das die Vorteile eines erhöhten Saftertrags und ei ner verbesserten Pressbarkeit mit dem Fehlen unerwünschter Nebenreaktionen der Enzyme und dem Ausbleiben der unerwünschten Hydrolyse des in den Zellwänden enthaltenen Protopektins verbindet.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung ergibt ein Verfahren zur Herstellung von Säften und pektinhaltigen Trestern aus Früchten oder Gemüsen, wobei eine im wesentlichen reine Pektinesterase verwendet wird, welche vor oder während der Zerkleinerungsstufe zugegeben wird. Bevorzugt ist die Pektinesterase frei von Pektindepolymerase-Aktivität, besonders bevorzugt ist sie im wesentlichen frei von Polygalacturonase-, Pektinlyase- und anderen Depolymerase- Aktivitäten.
• Die erfindungsgemässe Pektinesterase kann irgend eine zum Abbau von Apfelpektin geeignete Pektinesterase aus Pflanzen, Bakterien oder Pilzen sein. Bevorzugt stammt die Pektinesterase von einem Pilz. Eher bevorzugt wird die Pektinesterase von Aspergilli, besonders bevorzugt von Aspergillus niger, erhalten.
• Die vorliegende Erfindung offenbart im weiteren die enzymatische Demethylierung ohne Depolymerisation des Apfelpektins durch ein Pektinesterase E. C. 3.1.1.11. Bevorzugt wird die Pektinesterase während der Stufe des Zerkleinerns des Fruchtfleisches angewendet. Zugabe dieses Enzyms zum Fruchtfleisch der Äpfel ergibt einen erhöhten Saftertrag und eine verbesserte Pressbarkeit bei gleichzeitiger Zunahme der Pressgeschwindigkeit.
• In einem anderen Aspekt beschreibt die vorliegende Erfindung, wie die Verwendung einer gereinigten Pektinesterase einen grösseren Anteil in den Trestern zurückbleibenden Pektins ergibt. Ausserdem verringert die Verwendung ge reinigter Pektinesterase unerwünschte Nebenreaktionen (d. h. Bräunung).
• In noch einem anderen Aspekt der Erfindung werden die wertvollen Eigenschaften des nach der Behandlung mit gereinigter Pektinesterase aus der Trestern erhaltenen Pektins offenbart.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
• Für alle Figuren: R. PRESS bedeutet RAPIDASE PRESS; R.C80 h bedeutet RAPIDASE C80L; PE bedeutet Pektinesterase; Ca²&spplus; wird als CaCl&sub2; zugeführt.
• Fig. 1 zeigt den prozentualen Ertrag an frei fliessendem Saft, der nach der Fruchtfleischzerkleinerung und vor dem Pressen aus frischen und gelagerten Äpfeln ohne Enzym, mit R. PRESS und einer festen PE- Aktivität und zunehmenden Calciummengen erhalten wurde.
• Fig. 2 zeigt den prozentualen Ertrag an frei fliessendem Saft, der vor dem Pressen aus gelagerten Äpfeln unter Verwendung steigender PE-Aktivitäten und einer festen Calciummenge erhalten wurde.
• Fig. 3 zeigt den erforderlichen Druck, um ein konstantes Saftgewicht aus gelagerten Äpfeln nach der Fruchtfleischzerkleinerung, ohne Enzym, mit R. PRESS und mit einer festen PE-Aktivität bei zunehmenden Calciummengen zu erhalten.
• Fig. 4 zeigt den prozentualen Ertrag an ausgepresstem Saft, der aus gelagerten Äpfeln nach der Frucht fleischzerkleinerung, ohne Enzym, mit R. PRESS und mit zunehmenden PE-Aktivitäten bei einer festen Calciummenge erhalten wurde.
• Fig. 5 zeigt den prozentualen Ertrag an ausgepresstem Saft, der aus frischen Äpfeln nach der Fruchtfleischzerkleinerung, mit zunehmenden PS-Aktivitäten und zunehmenden Calciummengen erhalten wurde.
• Fig. 6 zeigt den prozentualen Ertrag an ausgepresstem Saft, der aus gelagerten Äpfeln nach der Fruchtfleischzerkleinerung mit einer festen PE-Aktivität bei zunehmenden Calciummengen erhalten wurde.
• Fig. 7 zeigt den prozentualen Ertrag an ausgepresstem Saft, der aus frischen Äpfeln nach der Fruchtfleischzerkleinerung, mit einer festen PE-Aktivität bei zunehmenden Calciummengen erhalten wurde.
• Fig. 8 zeigt den prozentualen Ertrag an ausgepresstem Saft, der aus frischen Äpfeln nach der Fruchtfleischzerkleinerung, mit zunehmenden PS-Aktivitäten und einer festen Calciummenge erhalten wurde.
• Fig. 9 zeigt den prozentualen Ertrag an ausgepresstem Saft, der aus frischen Äpfeln nach der Fruchtfleischzerkleinerung, mit einer festen PE-Aktivität bei zunehmenden Calciummengen erhalten wurde.
• Fig. 10 zeigt den prozentualen Ertrag an ausgepresstem Saft, der aus frischen Äpfeln nach der Fruchtfleischzerkleinerung mit zunehmenden PE-Aktivitäten erhalten wurde.
Genaue Beschreibung der Erfindung
• In einem Aspekt offenbart die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Säften und pektinhaltigem Trester aus Früchten und Gemüsen, das die Verwendung einer im Wesentlichen reinen Pektinesterase (E. C. 3.1.1.11) beinhaltet, welche vor oder während der Zerkleinerungsstufe zugegeben wird. Die gereinigte Pektinesterase ist im Wesentlichen frei von Polygalacturonase, Pektinlyase und anderen Pektindepolymerasen.
• Die Verwendung der erfindungsgemässen Pektinesterase ergibt eine enzymatische Demethylierung ohne Depolymerisation des Pektins. Das Pektin kann verschiedenen Ursprungs sein. Bevorzugt wird Apfelpektin verwendet. Die Pektinesterase kann während mehrerer Stufen im Saftherstellungsverfahren eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Pektinesterase während der Stufe des Zerkleinerns des Fruchtfleisches eingesetzt.
• Gereinigte Pektinesterase ist dadurch gekennzeichnet, dass die im Enzympräparat enthaltene, als kombinierte Wirkung von Pektinlyase und Polygalacturonase bestimmte Depolymerase- Aktivität niedriger als eine endo-PG-Einheit, niedriger als 20 exo-PG-Einheiten und niedriger als 0,4 PL-Einheiten pro 100 PE-Einheiten ist, und dass sie bevorzugt niedriger als 0,1 endo-PG-Einheiten, niedriger als 2 exo-PG-Einheiten und niedriger als 0,04 PL-Einheiten pro 100 PE-Einheiten ist.
• Die Pektinesterase kann irgend eine zum Abbau von Pektinen geeingnete, aus Pflanzen, Bakterien oder Pilzen stammende Pektinesterase sein. Die Erfindung wird unter Verwendung von Apfelpektin veranschaulicht. Die zum erfindungsgemässen Gebrauch geeignete Pektinesterase ist in einem Medium aus Fruchtfleisch oder Saft von Äpfeln stabil und behält ihre Aktivität während der Bearbeitung des Apfelsafts (pH 2,5 bis 6,0, Temperatur 10 bis 68ºC, organische Säuren, Tannine). Wegen ihrer günstigen Eigenschaften werden bevorzugt fungale Pektinesterasen verwendet. Besonders bevorzugt wird die Pektinesterase von den Aspergilli, und darunter bevorzugt von Aspergillus niger erhalten.
• Die rohe, aus einem Kulturmedium stammende Pektinesterase kann auf verschiedene Weise gereinigt werden. Bevorzugt ergibt die Reinigung ein Produkt, das im wesentlichen frei von Polygalacturonase(PG)- und Pektinlyase(PL)-Aktivitäten ist. Das rohe Enzym kann zum Beispiel durch Flüssigchromatographie (Tonenaustausch, Gelfiltration, Affinität) (Ishii et al., Auslegeschrift 2843351/C07G7//028 des deutschen Patentamtes, 1980), oder durch selektive Inhibition der Pektindepolymerasen (pH-Schock, Hitzeschock, chemische Inhibitoren, Extraktion durch chemische oder organische Lösungsmittel) (Smythe C. et al. United States Patent US 2599531, 1952) gereinigt werden. Eine andere Quelle für gereinigte Pektinesterase, wie für die vorliegende Anwendung definiert, ist Pektinesterase, die durch rekombinante DNA-Techniken erhalten wird. Ein Beispiel ist die Expressionsklonierung der Pektinesterase von Aspergillus niger, für den die cDNA-Sequenz bestimmt worden ist (Khanh et al., Nucl. Acids Res. 18, 4262 (1990)). Als Expressionswirt könnte Aspergillus niger verwendet werden. Angesichts der möglichen Kontamination der Pektinesterase durch Polygalacturonase, Pektinlyase und andere Pektindepolymerasen erscheint es wünschenswert, einen heterologen Wirtsorganismus zur Bildung der Pektinesterase heranzuziehen. Geeignete Wirtsorganismen beinhalten die Bakterien und Pilze. Bevorzugte Arten wären Bacilli, Escherichia, Saccaromyces, Kluyveromyces und Aspergilli.
• Die gereinigte Pektinesterase kann bei der Zerkleinerung des Fruchtfleisches von sowohl frischen als auch gelagerten Äpfeln verwendet werden. Als frische Äpfel werden Äpfel definiert, die zwischen einem und drei Monaten nach der Ernte verarbeitet werden. Als gelagerte Äpfel werden Früchte definiert, die in einem Kühlraum und/oder unter kontrollierten atmosphärischen Bedingungen gelagert wurden und bis zu sechs Monate nach der Ernte verarbeitet werden.
• Verschiedene Apfelsorten aus verschiedenen Ländern werden sofort oder nach einer Lagerung bei 4ºC während mehreren Monaten verarbeitet. Die Wahl der Äpfel hängt hauptsächlich von deren Verfügbarkeit ab und ist nicht kritisch. In den zur Veranschaulichung der Erfindung gezeigten Beispielen wurden folgende Apfelsorten verwendet: Granny Smith, Golden Delicious, Red Delicious und Akane aus Europa, Ozargold und Primrouge aus Frankreich und Granny Smith, Golden Delicious, Red Delicious und Braeburn aus Südamerika (Chile) und Neuseeland. Die südamerikanischen und neuseeländischen Äpfel sind im März geerntet worden und wurden bei 4ºC gelagert. Die nachfolgende Verarbeitung geschah zwischen Juni und August. Die Experimente wurden sowohl mit frischen als auch gelagerten Äpfeln wie beschrieben durchgeführt. Die Experimente wurden im weiteren im Labor-, Pilot- und Grossmasstab wie beschrieben durchgeführt.
• Nach dem Zerkleinern der Früchte wird die Pektinesterase in variablen Mengen zugegeben. Das Enzym ist unter den Verfahrensbedingungen ziemlich stabil. Daher gibt die Zugabe einer kleinen PE-Menge bei einer längeren Einwirkzeit dieser kleinen PE-Menge im allgemeinen das gleiche Ergebnis wie die Zugabe einer grösseren Menge PE bei kürzerer Einwirkungszeit. Die während dem Aufweichen zugegebene PE- Menge (X Einheiten) kann daher am besten abhängig von der Einwirkungszeit (Y Stunden Zeit) angegeben werden. Ein brauchbarer Bereich ist wie folgt:
• 20000 < X (PE-Menge) · Y (Stunden) < 500000 pro Tonne Äpfel. Bei einer Aufweichzeitzeit von einer Stunde entspricht das zwischen 20000 und 500000 PE-Einheiten pro Tonne Äpfel.
• Gereinigte Pektinesterase kann, abhängig von der Reife der Äpfel, mit oder ohne zusätzliches Calcium in Form von Calciumchlorid für den Abbau des Apfelfruchtfleisches eingesetzt werden. Die verwendete Menge Calcium liegt zwischen 0 und 500 g Calciumionen pro Tonne Äpfel. Im allgemeinen werden geringere Mengen Calcium verwendet, wenn die Äpfel kürzer nach der Ernte verarbeitet werden. Die Definition der PE-Einheiten wird im experimentellen Teil aufgeführt.
• Während der Stufe des Pressens mit hydraulischen Pressen wurden die angelegten Drücke und das Saftgewicht aufgezeichnet, worauf mittels der Dichte des Safts sein Ertrag berechnet wurde.
• Der Gebrauch einer Pektinesterase, entweder mit oder ohne zugesetztes Calcium, ergibt im Vergleich zur Saftherstellung ohne Enzymzugabe die folgenden Verbesserungen:
• - Zunahme des frei fliessenden Saftes vor dem Pressen sowohl bei frischen als auch bei gelagerten Äpfeln,
• - Verbesserung der Pressbarkeit des Fruchtfleisches durch Binden des (exogenen oder endogenen) Calciums an das demethylierte Pektin,
• - kürzere Presszeit und daher ein höherer Durchsatz,
• - Abnahme des Wasserbindungsvermögens des Fruchtfleisches,
• - Zunahme des gesamten Saftertrags,
• - Zunahme der Filtrierungs-/Ultrafiltrierungsgeschwindigkeit und Zunahme der Einengbarkeit des Saftes,
• - Die Menge an extrahiertem Pektin ist bei behandelten Trestern dieselbe wie bei Trestern, die ohne jede enzymatische Behandlung erhalten werden,
• - Die Zusammensetzung des Pektins, das aus den Trestern extrahiert wird, ergibt ähnliche Geliereigenschaften wie das aus den Trestern ohne jede enzymatische Behandlung extrahierte Pektin.
• Im Vergleich zur Verwendung herkömmlicher Pektinasen bewirkt der Gebrauch einer gereinigten Pektinesterase vor dem Pressen folgendes:
• - Abnahme des Gehaltes an Oligogalacturoniden im Saft, was das nichtenzymatische Bräunen des Saftes, der weniger oxidierbar und haltbarer während der Lagerung wird, teilweise verhindert. Der nach enzymatischer Depektinisierung erhaltene Saft ist schwächer gefärbt und sauberer,
• - Abnahme des Pektingehaltes im Saft nach dem Pressen,
• - Das Protopektin bleibt unversehrt in den Trestern, und diese können an die Pektinhersteller verkauft werden, vor allem wenn die Apfeltrester kurz nach der Ernte erhalten wurden und noch einen hohen Protopektingehalt aufweisen.
• Wenn man den Gebrauch einer gereinigten Pektinesterase nachvollzieht, kommt man zu dem Schluss, dass mit einer gereinigten Pektinesterase die Saftherstellung aus Früchten und Gemüsen wirtschaftlich interessanter wird. Der Saftertrag und die Pressbarkeit des Fruchtfleisches werden er höht. Die Presskapazität wird vergrössert, und daher wird es möglich, eine höhere Tonnage von Äpfeln in kürzerer Zeit zu verarbeiten, so dass mehr Trester mit noch intaktem Pektin anfallen. Im Weiteren wird das Ausmass an Nebenreaktionen verringert, was zu einem Erzeugnis führt, das weniger nachbräunt.
• Mehrere Aspekte der Verwendung von gereinigter Pektinesterase sind in den Beispielen veranschaulicht. Die Beispiele dienen nur dazu, die Erfindung zu erläutern, und sind in keiner Weise als Grenzen des Anwendungsgebietes gedacht.
Experimenteller Teil Bestimmung der Aktivität der Pektinesterase
• Eine PE-Einheit wird als diejenige Menge Enzym definiert, die ein Mikromol Carboxymethyl in einer Minute unter den Reaktionsbedingungen bei 30ºC und pH 4,5 hydrolysiert. Das Substrat ist 0,5% Apfelpektin Ruban Brun, mit einem Methylierungsgrad von über 70%, in Wasser.
• Eine PE-Einheit entspricht 0,98 internationalen Einheiten PE.
• Die hier und weiter unten beschriebenen Reaktionsbedingungen sind für diese Bestimmungen üblich. Im allgemeinen handelt es sich um Lösungen des angegebenen Substrates, die auf den gewünschten pH gepuffert wurden.
Bestimmung der Aktivität der Pektinlyase (PL)
• Eine PL-Einheit wird als diejenige Menge Enzym definiert, die ein Mikromol ungesättigtes 4,5-Uronprodukt in einer Minute ergibt. Die molare spezifische Absorption des Produktes beträgt 5,55 · 10³ mol&supmin;¹. Die Reaktion wird bei 45ºC und pH 5,5 durchgeführt und das Substrat ist hochmethyliertes Pektin (1% g/v). Die optische Dichte wird bei 235nm nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten gemessen.
Bestimmung der Aktivität der endo-Polygalacturonase (endo-PG)
• Eine endo-PG-Einheit wird als diejenige Menge Enzym in einem ml enzymatischer Lösung definiert, die die Viskosität des Substrates unter den Reaktionsbedingungen bei 45ºC und pH 4,5 mit einer Geschwindigkeit reduziert, die einer scheinbaren Geschwindigkeitskonstante von 0,0053 pro Minute entspricht. Das Substrat ist 0,5% Natrium-Polygalacturonat.
Bestimmung der Aktivität der exo-Polygalacturonase (exo-PG)
• Eine exo-PG-Einheit wird als diejenige Menge Enzym definiert, die bei der katalytischen Hydrolyse der &alpha;-1,4- Bindung im Polygalacturonat ein Mikromol Galacturonsäure pro Minute bei 30ºC und pH 4,5 bildet (Schaeffer und Somogyi, J. Biol. Chem. 195,19 (1952)).
Trübheit
• Die Trübheit des Saftes wird mittels Nephelometrie gemessen und in NTE (Nephelometrische Trübheits-Einheiten) angegeben.
Farbe
• Die Absorption des Saftes wird mittels Spektrophotometrie bei den Wellenlängen 420 und 520 nm gemessen.
Trocknen der Trester
• Die gewünschte, etwa 150 g betragende Menge feuchter Trester wird in ein Becherglas gegeben. 900 ml destilliertes Wasser werden zugegeben und die Mischung wird 15 Minuten stehengelassen. Anschliessend wird eine Vakuumfiltratien über Supra 2600 durchgeführt. Nach einer Nacht bei 60ºC unter Belüftung werden die trockenen Trester zu einem Pulver gemahlen.
Gehalt an Trockensubstanz der Apfeltrester
• Eine abgewogene Menge Trester, im Bereich von etwa 4 g, wird für 15 Minuten unter Infrarotlicht bei 105ºC gestellt. Das Gewicht der übrigbleibenden Trockensubstanz wird bestimmt und in Prozenten der Einwaage angegeben.
Chemische Extraktion des Apfelpektins aus den Trestern
• - 200 g Apfeltrester einwägen und 900 ml destilliertes Wasser zugeben.
• - Die Mischung für 15 Minuten zur Auflösung der Zucker stehenlassen.
• - Filtration unter Vakuum über Karton Supra 2600.
• - Die Trester nach der Filtration wägen.
• - Die Trester für eine Nacht bei 60ºC unter Belüftung halten.
• - Die Trester wägen.
• - Die Trester mahlen.
• - 5 g zur Bestimmung des Gehalts an Trockensubstanz während 4 Stunden bei 105ºC halten.
• - 10 g in einen Kolben geben und 190 ml destilliertes Wasser zugeben.
• - Unter Rühren auf 100ºC aufheizen.
• - Vorsichtig 1,75 ml 2 N H&sub2;SO&sub4; zugeben, den Kolben zudecken und für 2,5 Stunden in einem Ölbad bei 90ºC halten.
• - Abkühlen und Filtration über ein Nylontuch.
• - Mit Wasser spülen.
• - Ausfällen mit Methanol, das alkohol-unlösliche Material (AUM) mit 1,5 l Methanol waschen.
• - Das ADN für eine Nacht bei 60ºC unter Belüftung halten.
• - Das zurückbleibende Material wägen.
• Der prozentuale Anteil AUM ist wie folgt definiert:
• %AUM = Gewicht trockenes AUM · 100/Feuchtgewicht · Gehalt an Trockensubstanz
• Der Gehalt an ADN ist ein Mass für den Pektingehalt in den Trestern. Der prozentuale ADN-Gehalt wird als Kriterium zur Bestimmung des Preises der Trester verwendet.
Bestimmung des Veresterungsgrades (VG) des Pektins
• - 400 g gewaschenes Pektin in ein 250 ml-Becherglas einwägen,
• - 100 ml destilliertes und aufgekochtes, auf 50 bis 60ºC abgekühltes Wasser zugeben,
• - Das Becherglas abdecken und bis zur völligen Auflösung des Pektins rühren,
• - 4 Tropfen Phenolphtalein zugeben,
• - Mit 0,1 N NaOH bis zum Auftreten einer rosa Farbtönung titrieren (V&sub1; ml),
• - 20 ml 0,5 N NaOH zugeben (rosa Farbe),
• - Für 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Kolben halten,
• - Mit 20 ml 0,5 N HCl neutralisieren (farblos),
• - Mit 0,1 N NaOH bis zum Auftreten einer rosa Farbtönung titrieren (V&sub2; ml),
• - Einen Blindversuch mit 100 ml destilliertem Wasser durchführen (&beta;&sub1; ml).
• Der Veresterungsgrad kann nun wie folgt bestimmt werden:
• % VG = (V&sub2; - &beta;&sub1;) · 100/Vt wobei Vt = V&sub1; + (V&sub2; - &beta;&sub1;)
Bestimmung des Molekulargewichtes des Pektins
• - Ungefähr 90 g einer einprozentigen Natriumhexametaphosphat(HMP-)-Lösung (pH 4,5) in ein 250 ml- Becherglas einwägen,
• - Die Lösung auf 40 bis 45ºC erwärmen,
• - 100 mg Pektin zugeben,
• - Bis zur völligen Auflösung des Pektins rühren,
• - Abkühlen und HMP-Lösung bis zu einem Gesamtgewicht von 100 g zugeben,
• - Durch eine 0,45u-Membran (Swinnex-25) filtrieren,
• - Die Viskosität in einem Oswald-Rohr bei 25ºC messen.
• Das Molekulargewicht (MG) kann mittels der folgenden Formel berechnet werden:
• MG = 1,277 · 10&sup6; (ur1/6 - 1)
• ur = to - k/to/th - k/th
• wobei
• to: Zeit in s zwischen zwei Markierungen auf dem Rohr für die HMP/Pektin-Lösung,
• th: Zeit in s für die HMP-Lösung.
• wobei
• Q: Volumen zwischen zwei Markierungen auf dem Rohr (3,58 ml),
• tv: Zeit zwischen zwei Markierungen auf dem Rohr (94,15 s),
• L: Länge zwischen zwei Markierungen auf dem Rohr (4,2 cm),
• das ergibt k = 343,571.
Gehaltsbestimmung des Pektins
• Es wurde das MHDP-Verfahren (MHDP = meta-Hydroxydiphenol) angewendet (A. Ahmed und J. Labavitch, 1977, J. Food Biochem. 1).
Apfelsorten
• Es wurden verschiedene Apfelsorten aus Europa, Südamerika und Neuseeland verwendet.
Zugabe des Enzyms
• Die gereinigte Pektinesterase und Calcium in Form von wasserfreiem CaCl&sub2; wurden dem Fruchtfleisch nach dem Zerkleinern zugegeben, wobei das Produkt aus X (PE-Einheiten) und Y (Stunden) zwischen 20000 und 500000 PE-Einheiten pro Tonne Äpfel lag und das Ca²&spplus; zwischen 0 und 500 g pro Tonne Äpfel. Die Pektinesterase alleine oder zusammen mit Calcium wurde mit dem Apfelfruchtfleisch vermischt.
Enzymatischer Aubbau
• Der enzymatische Abbau wurde während 10 bis 75 Minuten und bei 15 bis 25ºC ausgeführt.
Beispiele Beispiel 1
• Eine Mischung der Apfelsorten Golden Delicious, Granny Smith und Red Delicious (1 : 1 : 1), alle aus Europa, wurde zerkleinert und das Enzym wurde vor dem Pressen zugegeben.
• Die verwendeten Enzyme waren: 25 g Rapidase PressTM pro Tonne Apfelfruchtfleisch und 45000 PE-Einheiten gereinigte Pektinesterase (PE) ohne oder mit 100 resp. 240 g Calciumionen pro Tonne Apfelfruchtfleisch. Nach einer Stunde bei 20ºC wurde das behandelte Fruchtfleisch unter Verwendung einer hydraulischen Presse gepresst. Der frei fliessende Saft wurde gemessen (Fig. 1).
• Gereinigte PE ergibt das grösste Volumen an frei fliessendem Saft bei frischen Äpfeln, was eine höhere Presskapazität ergibt. Bei gelagerten Äpfeln ergibt die Verwendung von gereinigter PE ein grösseres Volumen an frei fliessendem Saft als ohne Enzymzugabe erhalten wird.
• Calciumionen spielen bei gelagerten Äpfeln eine grössere Rolle bei der Zunahme des Volumens an frei fliessendem Saft als bei frischen Äpfeln, und diese Zunahme hängt mit der Bemessung des Calciums ab.
• Fig. 2 zeigt die Abhängigkeit der Volumina an frei fliessendem Saft von der Bemessung der gereinigten PE. Bei gelagerten Äpfeln und einer bei 240 g pro Tonne konstant gehaltenen Menge Calciumionen liefert die Anwendung der gereinigten PE ein Volumen an frei fliessendem Saft, das dem Volumen ähnelt, das mit 25 g Rapidase Presse pro Tonne erhalten wird, und das Ergebnis ist immer besser als beim Kontrollversuch ohne Pressenzym.
• Tabelle 1 zeigt die schwächere Farbe und Trübheit der Säfte, die von mit PE abgebautem Fruchtfleisch stammen, gegenüber Säften ohne Enzymzugabe. Der Unterschied ist noch deutlicher, wenn PE zusammen mit Calcium verwendet wird. Tabelle 1
• Fig. 3 zeigt den an das Apfelfruchtfleisch angelegten Druck, um bei Verwendung verschiedener Enzyme eine immer gleiche Saftbildung von 400 g zu erzielen. Bei gelagerten Äpfeln wird der geringste Druck benötigt, wenn 50000 PE-Einheiten gereinigte PE zusammen mit 240 g Calciumionen pro Tonne Apfelfruchtfleisch verwendet werden.
• Die Abnahme des Drucks hängt mit der Pressbarkeit des Fruchtfleisches zusammen und ist proportional zum Gehalt an Calciumionen bei gleichbleibender PE-Aktivität pro Pressversuch.
• Fig. 4 zeigt die Endausbeute an Apfelsaft, die ohne Enzym, mit Rapidase PressTM und mit verschiedenen PE-Aktivitäten unter gleichzeitiger Zugabe einer festen Menge Calciumionen von 240 g pro Tonne erzielt wird. Die mit Rapidase PressTM erzielte Ausbeute ist sehr hoch und immer noch höher als beim Vergleichsexperiment mit gereinigter PE und Calcium.
Beispiel 2
• Die Apfelsorten waren Golden Delicious, Granny Smith, Red Delicious und Breaburn zu gleichen Teilen, aus Südamerika (Chile) und Neuseeland stammend. Sie wurden im März geerntet und bei 4ºC gelagert, um zwischen Juni und August verarbeitet zu werden. Als frische Äpfel bezeichnen wir Früchte, die zwischen einem und drei Monaten nach der Ernte verarbeitet wurden, gelagerte Äpfel sind Früchte, die bei 4ºC gelagert wurden und bis zu 6 Monaten nach der Ernte verarbeitet wurden.
• Das Enzympräparat wird zum zerkleinerten Apfelfruchtfleisch (12 kg pro Versuch) gemischt. Der enzymatische Abbau findet während einer Stunde in einem Tank bei 25ºC statt. Das behandelte Fruchtfleisch wird in eine Bucher HP14-Presse eingefüllt, die einen Druck von ungefähr IG bar erzeugt. Der Saft fliesst aus einer Öffnung am Fuss der Presse. Die Presszeit und das Gewicht des Saftes werden aufgezeichnet. Die Dichte des Saftes wird gemessen und die ausgepresste Zuckermenge mittels der Tabelle von Goldiner & Klemann berechnet. Das Endgewicht des Saftes wird um den Gehalt an Trockenmasse von 13,32% korrigiert (Dichte = 1,052 bei 20ºC). Der Saftertrag wird ins Verhältnis zur Ausgangsmenge Fruchtfleisch (12 kg) gesetzt.
• Die gereinigte Pektinesterase PE wurde in Aktivitäten von 43500 bis 130000 PE-Einheiten und ohne oder mit Calcium in Mengen von 100 bis 500 g pro Tonne Apfelfruchfleisch eingesetzt. Der Ertrag an Apfelsaft ist in Prozent des gesamten Saftgehalts angegeben (Fig. 5). Der Ertrag ist bei frischen Äpfeln nach Einsatz von gereinigter PE immer höher als ohne Enzymzugabe. 3 Monate alte Äpfel dagegen liefern einen höheren Saftertrag nach Zugabe von Calciumionen zur gereinigten PE. Der Ertragsunterschied kann bis zu 5% betragen.
• Tabelle 2 zeigt, dass der Gehalt an Pektin im Saft geringer ist, wenn das Fruchtfleisch mit PE behandelt wurde, als wenn es mit Rapidase PressTM oder sogar überhaupt nicht enzymatisch behandelt wurde. Tabelle 2
• Fig. 6 zeigt die Wirkung der zur gereinigten PE zugegebenen Calciumionen. Bei gleichbleibender PE-Aktivität von 50000 PE-Einheiten pro Tonne Apfelfruchtfleisch nimmt der Saftertrag mit von 0 bis 500 g pro Tonne Apfelfruchtfleisch zunehmender Calciumzugabe zu. Der Gebrauch der gereinigten PE alleine ergibt einen höheren Saftertrag als das Vergleichsexperiment ohne Enzym.
Beispiel 3
• Die Apfelsorten waren Golden Delicious und Akane aus Frankreich. Sie wurden im September geerntet und sofort im Laboratoriumsmasstab verarbeitet. Das Enzympräparat wurde mit dem zerkleinerten Apfelfruchtfleisch (750 g pro Versuch) vermischt. Der enzymatische Abbau findet während 60 Minuten in einem Tank bei 20ºC statt. Das behandelte Fruchtfleisch wurde in einen Stoffsack gefüllt und in den Pressbehälter gegeben. Das Fruchtfleisch wurde mit einer hydraulischen Laboratoriumspresse von Adamel Lhomargy unter einem Druck von 6 bis 1000 deka-Newton (6 · 10&supmin;&sup5; bis 1 · 10&supmin;² bar) gepresst. Der Saft floss aus einer Öffnung am Fuss der Presse. Die Presszeit und das Gewicht des Saftes wurden aufgezeichnet. Die Dichte des Saftes wurde gemessen und die ausgepresste Zuckermenge mittels der Tabelle von Goldiner & Klemann berechnet. Das Endgewicht des Saftes wurde um den Gehalt an Trockenmasse von 13,32% korrigiert (Dichte = 1,052 bei 20ºC). Der Saftertrag wurde ins Verhältnis zur Ausgangsmenge Fruchtfleisch (750 g) gesetzt.
• Fig. 7 zeigt den Einfluss der zur gereinigten PE zugegebenen Calciumionen auf den Ertrag an Apfelsaft. Bei einer gleichbleibenden PE-Aktivität von 50000 PE-Einheiten pro Tonne Apfelfruchtfleisch nimmt der Saftertrag proportional zu den zugegebenen Calciumionen-Mengen im Bereich von 0 bis 400 g pro Tonne zu. Der Gebrauch der gereinigten PE alleine ergibt schon einen höheren Saftertrag als der Vergleichsversuch ohne Enzym.
• Fig. 8 zeigt den Einfluss der gereinigten PS-Aktivität auf den Saftertrag bei frischen Äpfeln. Es ist ersichtlich, dass der Saftertrag bei Zugabe von gereinigter PE von 79 auf 84% steigt.
Beispiel 4
• Die Apfelsorten waren Ozargold und Primrouge aus Frankreich. Sie wurden im August geerntet und sofort im Laboratoriumsmasstab verarbeitet. Das Enzympräparat wurde mit dem zerkleinerten Apfelfruchtfleisch (750 g pro Versuch) vermischt. Der enzymatische Abbau findet während 60 Minuten in einem Tank bei 20ºC statt. Das behandelte Fruchtfleisch wurde in einen Stoffsack gefüllt und in den Pressbehälter gegeben. Das Fruchtfleisch wurde mit einer hydraulischen Laboratoriumspresse von Adamel Lhomargy unter einem Druck von 6 bis 1000 deka-Newton (6 · 10&supmin;&sup5; bis 1 · 10&supmin;² bar) gepresst. Der Saft floss aus einer Öffnung am Fuss der Presse. Die Presszeit und das Gewicht des Saftes wurden aufgezeichnet. Die Dichte des Saftes wurde gemessen und die ausgepresste Zuckermenge mittels der Tabelle von Goldiner & Klemann berechnet. Das Endgewicht des Saftes wurde um den Gehalt an Trockenmasse von 13,32% korrigiert (Dichte = 1,052 bei 20ºC). Der Saftertrag wurde ins Verhältnis zur Ausgangsmenge Fruchtfleisch (750 g) gesetzt.
• Fig. 9 zeigt den Einfluss der gereinigten PE auf den Saftertrag. Zugabe von 60000 PE-Einheiten pro Tonne Apfelfruchtfleisch ergaben eine Zunahme von 2,6% im Apfelsaftertrag. Eine Zugabe von 60000 PE-Einheiten und 100 bis 200 g Calciumionen pro Tonne Apfelfruchtfleisch ergeben eine Zunahme des Saftertrags von 3 bis 3,5%. Der zur Erreichung eines gleichen Saftertrags anzulegende Druck ist geringer, wenn PE zum Fruchtfleisch gegeben wird. Sowohl die Pressbarkeit des Fruchtfleisches als auch die Produktivität der Presse nehmen zu.
• Fig. 10 zeigt, dass es nicht absolut notwendig ist, der PE Calcium zuzugeben, wenn frisch geerntete Äpfel behandelt werden sollen, da 94500 PE-Einheiten fast genau denselben Saftertrag liefern wie 63000 PE-Einheiten und 100 g Calcium pro Tonne Äpfel. Tabelle 3
• Aus Tabelle 3 können die folgenden Schlüsse gezogen werden:
• - Zugabe einer reinen PE zum Apfelfruchtfleisch ergibt einen höheren Saftertrag als ohne Enzym.
• - Bei frischen Äpfeln verbessert die Zugabe von 60000 bis 65000 PE-Einheiten pro Tonne den Saftertrag um etwa 2,5 bis 3%.
• - Zugabe von Calciumionen zusätzlich zur PE erhöht den Ertrag um etwa 1 bis 2,5%.
• - Zugabe von 94500 PE-Einheiten pro Tonne liefert dasselbe Ergebnis wie 63000 Einheiten pro Tonne und 200 g Calcium pro Tonne.
• - Der Pektingehalt der Trester nach der Behandlung mit PE ist mindestens 95% des Anfangsgehalts. Das von den Pektinherstellern geforderte Minimum ist 14%. Mit Werten von über 20% (siehe Tabelle 3) gehören diese Trester zu der Gruppe pektinhaltiger Rohmaterialien mit dem höchsten Gehalt.
• - Der VG und das MG sind nicht wesentlich verschieden gegenüber dem Vergleichsversuch (max. -5% VG und max. -7% MG).
• Die PE baut das unlösliche Protopektin der Fruchtmasse nicht ab (Menge/VG/MG), aber ermöglicht höhere Erträge für den Safthersteller.
Beispiel 5
• Die Apfelsorten waren Golden Delicious, Jonathan, Gloster und Starking. Sie wurden im September geerntet und innert einer Woche verarbeitet (pH des Safts 3,4). Das Enzympräparat wurde unter Verwendung einer Dosierpumpe mit dem zerkleinerten Fruchtfleisch vermischt. Der enzymatische Abbau fand während einer Stunde in einem Tank (12 Tonnen) bei 17ºC statt. Das behandelte Fruchtfleisch wurde in eine Bucher-Presse eingefüllt. Das Gewicht des Saftes wird aufgezeichnet. Der Zuckergehalt des Saftes betrug immer 12% (Messung mit Hydrometer nach Brix). Die gereinigte PE wurde in Mengen von 42000 bis 126000 PE-Einheiten pro Tonne zusammen mit 0 bis 50 g Calcium pro Tonne eingesetzt. Tabelle 4 Tabelle 5
• - Der Saftertrag wird durch Zugabe von PE verbessert.
• - Der Gehalt an Trockensubstanz der Trester nimmt mit der zugegebenen Menge der PE zu.
• - Die Farbe des Saftes ist nach der Behandlung mit PE schwächer.
• - Die Flussgeschwindigkeit bei der Ultrafiltration wird um einen Drittel verbessert.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von Säften und Pektin enthaltender Trester aus Früchten oder Gemüsen, gemäss welchem eine Pektinesterase verwendet wird, welche von Polygalacturonase-, Pektinlyase- und anderer Pektindepolymerase-Aktivität nahezu frei ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Pektinesterase vor oder während des Zerkleinerungsstufe zugegeben wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausmass der Depolymeraseaktivität, gemäss Bestimmung durch die kombinierte Wirkung der Pektinlyase und der Polygalacturonase, niedriger als 1 endo-PG-Einheit und niedriger als 20 exo-PG-Einheiten und niedriger als 0,4 PL-Einheiten per 100 PE-Einheiten, vorzugsweise niedriger als 0,1 endo-PG-Einheit und niedriger als 2-exo-PG-Einheiten und niedriger als 0,04 PL-Einheit per 100 PE-Einheiten ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Pektinesterase aus Bakterien oder Pilzen, vorzugsweise aus Aspergillus, noch bevorzugter aus Aspergillus niger erhalten werden kann.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, in welchem die Früchte Äpfel sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die Pektinesterase in einem Ausmass von 20000 < X (Einheiten) · Y (Stunden) < 500000 PE-Einheiten per Tonne Apfelfruchtfleisch in Kombination mit Calciumionen in einem Ausmass von 0 bis 500 g per Tonne Apfelfruchtfleisch verwendet wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, in welchem die Trester zur Extraktion des Pektins verwendet werden.

7. Verwendung einer Pektinesterase, welche von Polygalacturonase-, Pektinlyase- und anderer Pektindepolymerase-Aktivität nahezu frei ist, zur Konservierung von Pektin in Trestern.