DE69130136T2

DE69130136T2 - Automatisiertes Verfahren zur Spaltung von Biomolekülen

Info

Publication number: DE69130136T2
Application number: DE1991630136
Authority: DE
Inventors: James Eynsham Oxon Ox8 1Ly Bruce; Antonis Chris Sittingbourne Kent Ioannides; Anthony Hugh Charlbury Oxon Ox7 3Hb Merry; Rajesh Bhikhu Kirtlington Oxon Ox5 3Jr Parekh; Albert Edward Abingdon Oxon Ox14 3Xb Platt
Original assignee: Oxford Glycosciences UK Ltd
Current assignee: Oxford Glycosciences UK Ltd
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1991-06-18
Publication date: 1999-03-11
Anticipated expiration: 2011-06-19
Also published as: DE69130136D1; EP0462794B1; JPH0687906A; EP0462794A2; EP0462794A3

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung, die beim Durchführen einer Folge von chemischen Reaktions- und Reinigungsverfahren auf automatisierte Art verwendet werden kann.
Die US-A-4 865 811 offenbart eine Vorrichtung mit einem Probenkanal in einer Trägerleitung, in der ein unter Druck stehendes Trägerfluid verwendet wird, um eine Probe zur Analyse durch einen Rohrverteiler mit Ventilen zu befördern, durch welche Reagenzien aus Reservoirs zugeführt werden können. Es gibt dort einen einzelnen, linearen Pfad für Probe und Trägerfluid zum Reaktionsgefäß und zu einem Detektor.
EP-A-0 215 766 offenbart ein Verfahren zur Isolation von nicht reduzierten Oligosacchariden von Glyco-Verbindungen mit einem N-verknüpften Oligosaccharid- Anteil. Im wesentlichen wasserfreie, salzfreie Glyco-Verbindung wird mit wasserfreiem Hydrazin zur Reaktion gebracht, wobei das resultierende ent-N-acetylierte Hydrazonoligosaccharid-Derivat N-acetyliert und anschließend saurer Katalyse ausgesetzt wird, und das unreduzierte N-Glycan durch Zellulose-Säulenchromatographie wiedergewonnen wird. Die wahlweise Freisetzung von N-Glycans, O-Glycans und deren Mischungen und deren Wiedergewinnung sind im EP-A-0 462 795, EP- A-0 462 796, EP-A-0 462 797 und EP-A-0 462 798 beschrieben.
Nach der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur Verwendung beim Wiedergewinnen und/oder Freisetzen von N-Glycans und/oder O-Glycans aus einer Glyco-Verbindung ausgestattet mit:
einer Edelgasquelle,
einer Leitung, in die das Edelgas unter Druck zu einer Vielzahl von Auslässen leiten kann wobei die Leitung bezüglich der Atmosphäre abgedichtet ist,
mindestens einem Flüssigkeits-Flußdetektor zum Detektieren von Flüssigkeitsfluß in der Leitung und
in sukzessiver Verbindung mit der Leitung über geeignete Ventile:
einer Vielzahl von Reagenzgefäßen für flüssige Reagenzien, die in die Leitung durch selektives Dirigieren des Edelgases dort hindurch eingebracht werden können, mindestens einem Reaktionsgefäß, in welches die flüssigen Reagenzien wahlweise dirigiert werden können und aus welchem Reaktionsprodukte die Leitung entlang passieren können, und mindestens einer Säule, durch die die Reagenzien oder die Reaktionsprodukte selektiv dirigiert und dann entweder zu dem mindestens einen Reaktionsgefäß zurückgeführt oder zu mindestens einem der Auslässe geführt werden können.
Mittels der Erfindung können unter Gasdruck gemessene Flüssigkeitsabgaben ausgeführt werden, ein Reinigen des Wegs kann mit minimaler Kontamination durchgeführt werden, wasserfreie Reaktionsbedingungen können aufrechterhalten werden, Reagenzien können in genau bestimmten Verhältnissen, entweder im Flüssigkeitsfluß oder in einem Gefäß, gemischt werden und chemische Reaktionen können durchgeführt werden sowohl, indem ein immobilisiertes Substrat einem Reagenzienfluß ausgesetzt wird, als auch durch Beschicken eines Gefäßes, welches das Substrat enthält, mit Reagenzien. Einige dieser Reaktionen umfassen, das Aufnahmegefäß präzise gesteuerten Nicht-Umgebungstemperaturen auszusetzen, in diesem Fall kann eine Vorrichtung enthalten sein, die diese Temperatursteuerung vornimmt und die Änderungsgeschwindigkeit der Temperatur reguliert. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung können purifizierte Saccharide an einen bestimmten Abgabepunkt geliefert werden.
Die Erfindung umfaßt grob vorzugsweise ein System, welches unter im wesentlichen sauerstofffreier und feuchtigkeitsfreier Umgebung gehalten wird, was durch die Verwendung eines Edelgases erreicht wird, mindestens ein Reaktionsgefäß, in welches zu Anfang eine Probe plaziert wird, sowie zusätzlich zwischengeschaltete Aufnahmegefäße, welche für aufeinanderfolgende Derivationen des Substrats verwendet werden können. Diese Gefäße sind derart positioniert, daß Flüssigkeitsabgaben von einem Gefäß zum anderen entweder über eine Säule oder eine Packung von Säulen oder direkt gestattet sind. Dieser Transfer kann mehrere Male ausgeführt werden. Mittel sind vorgesehen, um die Gefäße unter Druck zu setzen und zu ventilieren. Diese sind derart aufgebaut, daß sie ein vollständiges Waschen der Montage erleichtern. Ein Merkmal der Erfindung besteht darin, daß die Vorrichtung wenn nötig Operationen in zwei oder mehr Reaktionsgefäßen gleichzeitig durchführen kann, wobei jedes eine andere Probe einer Glyco-Verbindung enthält, auf eine Weise, die in einer minimalen Querkontamination und einem Minimum an Variation zwischen jedem Reaktionsgefäß resultiert.
Die Vorrichtung hat die Fähigkeit, in einer Anzahl von Modi zu operieren, um Saccharide in unmodifizierter, unreduzierter Form wiederzugewinnen. Solche Modi können Verfahren umfassen, welche in der selektiven Wiedergewinnung von N-verbundenen oder O-verbundenen Sacchariden oder beidem resultieren.
Die Erfindung umfaßt auch einen Aufbau zum Purifizieren von Medien, welcher die nötigen Purifikationsverfahren bewirkt, einen Druckregulator zum Halten eines konstanten Arbeitsdrucks, und eine Drossel an verschiedenen Punkten im Prozeß, um eine langsame Gas-Fließgeschwindigkeit sicherzustellen.
Die Erfindung weist außerdem Heizungen für die Aufnahmegefäße auf. Diese haben Mittel zum automatischen Anheben, um die Aufnahmegefäße während des Temperatursteuerprozesses zu umgeben und einzuschließen, sowie zum automatischen Absenken an anderen Punkten im Prozeß.
Eine Steuerung zum Ausführen der automatischen Schaltung von Ventilen, Zeitsteuerung, Steuerung der Temperatur und Überwachung der Flüssigkeitsdetektoren ist ebenfalls vorgesehen.
Eine Ausführungsform der Erfindung wird nun, ausschließlich beispielhaft, mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung beschrieben, worin,
Fig. 1a und Fig. 1b ein Diagramm der Vorrichtung zum Ausführen der vorliegenden Erfindung zeigen,
Fig. 2 eine Vorderansicht der Vorrichtung ist und zwei Sätze chromatographischer Säulenaufbauten zeigt,
Fig. 3 ein Schnitt entlang der Linie A-A in Fig. 2 ist,
Fig. 4 ein Schnitt entlang der Linie B-B in Fig. 2 ist,
Fig. 5 eine Teilansicht der Heizungsbaugruppen der Vorrichtung ist,
Fig. 6 dieselbe Ansicht ist, wie Fig. 5, wobei die Heizungen teilweise abgesenkt sind,
Fig. 7 ein Diagramm des Mechanismus zum Heben und Senken der Heizungsbaugruppen ist und
Fig. 8 eine Teilansicht einer Überlauf-Baugruppe für ein Aufnahmegefäß der Vorrichtung ist.
Mit Bezug auf Fig. 1 hat die Vorrichtung die Form eines Instruments, welches Ausrüstung aufweist, die in der Lage ist, gleichzeitig an zwei separaten Proben Glyco- Verbindung zu arbeiten und so die jeweiligen Saccharide automatisch aus den Glyco-Verbindungen freizusetzen und jedes der Saccharidmateriale zu isolieren. Es gibt zwei Reaktionsgefäße 60, 61, die jeweils so angeordnet sind, daß sie eine Probe halten, um mit einer jeweiligen Heizung 70, 71 und einem jeweiligen Satz chromatographischer Säulen 68 (C1, C2 & C3), 69 (C4, C5 & C&) und einem jeweiligen Aufnahmegefäß 62, 63 zusammenzuwirken. Reagenzien aus einem gemeinsamen Satz Reagenzflaschen 33 bis 40 können jeder Probe zugeführt werden. Das Instrument kann programmiert werden, um an jeder Probe verschiedene Prozesse gleichzeitig auszuführen und die geeigneten Bedingungen zum Freisetzen von Sacchariden aus Glyco-Verbindungen und zur Isolation des Saccharidmaterials zu gewährleisten, ohne daß die Materiale sich einer Probe der anderen Probe beimischen oder sie kontaminieren, während beide Proben gemeinsame Verbindungen und Ventile nutzen, wiederum ohne daß Kontamination stattfindet.
In Fig. 1a enthalten Reservoirs 33 bis 40 verschiedene Reagenzien, welche, wie oben erwähnt, in dem Operationen mit der jeweiligen Probe verwendet werden können:
Reservoir 33 - Wasser
Reservoir 34 - Ethanol
Reservoir 35 - Essigsäureanhydrid
Reservoir 36 - Butanol/Ethanol (Verhältnis 4 : 1 - im folgenden mit BE bezeichnet)
Reservoir 37 - essigsaures Acetat (0,2 molar, pH 8 mit Natriumhydroxid)
Reservoir 38 - Kupferacetat (0,1 M, 0,1 M in Essigsäure)
Reservoir 39 - BE
Reservoir 40 - Hydrazin (destilliert, < 0,5% Wasser)
Die Vorrichtung hat eine Zuführung zum Eingeben von Edelgas - in der bevorzugten Ausführungsform ist dies Argon - welches über einen Regulator (nicht dargestellt) mit einem Satz Ventile 14, 15 und 16 verbunden ist, die bewirken, die Reservoirs 33 bis 40 unter Druck zu setzen oder zu ventilieren, um Abgaben der Reagenzien, wie unten beschrieben, vorzunehmen. Das Ventil 14 ist mit dem Reservoirs 33, 34, 37 und 38 verbunden, das Ventil 15 ist mit den Reservoirs 35, 36 und 39 verbunden, und das Ventil 16 ist nur mit Reservoir 40 verbunden. Diese Anordnung isoliert alle Reagenzien, die inkompatibel sind.
Die Argon-Gaszuführung kommt entlang Leitung 26 hinzu, geht durch ein Ventil 4, einen Flußbegrenzer 5, ein Ventil 6 und ein Ventil 11 zum Instrument. Die Argonzuführung kommuniziert durch einen Filter 8 mit einem Drucksensor 9, wenn ein Ventil 7 geöffnet ist. Ein Ventil 10 kann eingesetzt werden, um Gas aus den Teilen des Systems stromauf vom Ventil 11 strömen zu lassen, so daß dann, wenn Flüssigkeit entlang der Leitung 26 zu einem Bestimmungsort gedrückt werden soll, der Druckaufbau graduell durch Schließen des Ventils 10 und Öffnen des Ventils 11 vorgenommen werden kann. Der Flußbegrenzer 5 kann durch Öffnen eines Ventils 12 umgangen werden.
Ein Ventil 13 kann geöffnet werden und so Argon in den Bereich bringen, der die Reaktionskammern umgibt, wenn die Reaktionsgefäße vorbereitet werden, um Luft soweit wie möglich auszuschließen. Entsorgungstank wird in einer Entsorgungstankflasche (nicht dargestellt) gesammelt, und Argon wird entlang Leitung 31 zu dieser Abgasflasche geleitet. Das Instrument führt eine Serie von Schritten (in der Folge A bis L) aus, die unten detailliert beschrieben sind und die folgendermaßen zusammengefaßt werden können:
A - Überprüfen des Instruments
B - Edelgasreinigung
C - Hydrazin-Abgabe
D - Hydrazin-Reaktion
E - Hydrazin-Entfernung K - Sammeln
F - Re-N-Acetylieren L - Waschen des Systems
G - Entfernen von Verbindungen
H - Elution
I - Entsalzen/Acetohvdrazon-Spaltung (i)
J - Acetohydrazon-Spaltung (ii)

A) Überprüfen des Instruments

Zu Beginn führt das Instrument eine Anzahl von Selbsttests durch:
a) Um zu überprüfen, daß die Heizungssteuerung arbeitet, wird die Steuertemperatur beider Reaktionsgefäße 60, 61 auf eine Temperatur über Umgebung gesetzt und dort für die Dauer des Selbsttests gehalten.
b) Um den Druck der Edelgasquelle zu überprüfen, wird das Ventil 10 geöffnet und das System so gelüftet. Das Ventil 10 wird dann geschlossen und Ventil 7 geöffnet, und nach einer vorbestimmten Zeit wird der Druck abgelesen. Ein niedriges Ergebnis bewirkt, daß die Steuerung einen Fehler registriert und niedrigen Edelgasdruck anzeigt. Jedes andere Ergebnis außerhalb eines tolerierbaren Arbeitsbereichs bewirkt, daß die Steuerung mit dem Bediener kommuniziert, um den Druck auf 6 psi zu ändern und den Test erneut zu starten. Das niedrige Ergebnis ist auf ein 1 psi festgesetzt und der tolerierbare Arbeitsbereich auf 6 psi ± 0,5 psi.
c) Um zu überprüfen, daß es in den Leitungen/Ventilen in der Hauptflüssigkeitsleitung keine Lecks gibt, werden zu Beginn die Ventile 11, 52 und 54 geöffnet.
Der Drucksensor 9 sollte einen Wert zwischen den obigen Grenzen registrieren. Falls nicht, registriert die Steuerung einen Fehler und beendet den Test, und alle Ventile werden geschlossen, was die Hauptedelgaszufuhr beendet. Nach einem Zeitintervall wird der Druck abgelesen, und wenn dieser Druck signifikant gefallen ist (typischerweise um > 0,2 psi), wird erneut ein Fehler registriert, und die Steuerung stoppt den Test.
Das Ventil 82 wird nun geöffnet und somit wird eine Belüftung der Ableitung geöffnet, und nach einer bestimmten Zeit wird der Druck überprüft. Wenn dieser oberhalb einer bestimmten Grenze liegt (typischerweise 1 psi), dann zeigt dies an, daß es eine Blockade gibt, und die Steuerung wird das Instrument wiederum herunterfahren. Das obige Verfahren wird dann wiederholt, dieses Mal unter Verwendung des Ventils 83 anstelle von Ventil 82. Die Messungen des Drucksensors 9 werden verwendet, um sicherzustellen, daß jedes Ventil seiner Spezifikation entsprechend funktioniert.
d) Um zu überprüfen, daß das Flüssigkeitsreservoir und die Reservoirventile leckagefrei sind, werden die Reservoirs unter Arbeitsdruck gesetzt, und dieses Mal werden die Ventile 14, 15 und 16 geöffnet. Jedes Mal wird die Zeit aufgenommen, welche der Druck braucht, um einen bestimmten Anteil des Arbeitsdrucks (typischerweises 60%) zu erreichen. Wenn diese Zeit eine bestimmte Grenze überschreitet, registriert die Steuerung eine Gasleckage "keine Flasche"-Fehler. Das Gas wird abgeschaltet und nach einer bestimmten Zeit wird der Druck gelesen. Wenn dieser signifikant gefallen ist (typischerweise um > 0,2 psi), wird ein Fehler angezeigt. Das obige Verfahren wird mit den Aufnahme- /Sammelbehältern 62, 63 wiederholt.
Alle Abgaben an den Entsorgungstank gehen zu einer Entsorgungstankflasche, welche nicht spezifisch dargestellt ist. Diese Entsorgungstankflasche wird auf dieselbe, oben beschriebene Weise überprüft, und ebenfalls wird die Zeit, die gebraucht wird, um sie unter 60% des Versorgungsdrucks zu setzen, verwendet, um anzuzeigen, wie voll sie ist.
e) Um sicherzustellen, daß die chromatographischen Aufbauten installiert sind, werden die Ventile 52, 81, 84, 85, 86, 90, 91, 92 und 80 geöffnet und die Zeit aufgenommen, welche benötigt wird, damit der Druck einen Anteil (typischerweise 60%) des Arbeitsdrucks erreicht. Wenn diese Zeit einen bestimmten Wert überschreitet, wird der Bediener gewarnt, zu überprüfen, ob die Säulen an ihrem Ort sind. Die Gasversorgung wird abgeschnitten und der Druck nach einer bestimmten Zeit überprüft. Wenn der Druck signifikant (typischerweise um > 0,2 psi) gefallen ist, dann wird ein Fehler angezeigt. Die Ventile 82 und 83 werden zum Lüften des Systems geöffnet und der Druck erneut überprüft. Wenn dieser über einer bestimmten Grenze liegt (typischerweise > 1 psi), wird ein Fehler angezeigt. Dies wird für den zweiten Satz Säulen wiederholt, wenn das zweite Reaktionsgefäß 61 verwendet werden soll.
Zusätzlich werden Optosensoren (nicht dargestellt) verwendet, um sicherzustellen, daß der korrekte Satz Säulen in seiner Packung angebracht worden sind.
f) Um sicherzustellen, daß der Heizungsantrieb arbeitet, werden die Heizungen 70, 71 auf und abwärts gefahren. Die Temperaturen der Heizungsblocks werden nun überprüft, ob sie sich innerhalb eines tolerierbaren Bereichs (typischerweise ±2ºC) der eingestellten Temperatur befinden. Falls nicht, wird der Test gestoppt.
Dies schließt das Überprüfen des Instruments ab.

Generell

Die weitere Arbeitsweise des Instruments wird nun mit nur einer Probe beschrieben. Die Probe Glyco-Verbindung, die von dem Instrument bearbeitet werden soll, wird zunächst dialysiert und im Reaktionsgefäß 60 trocken gefroren, welches dann auf das Instrument aufgeschraubt wird.
B) Edelgasreinigung
Edelgas wird für 1 Minute durch das Reaktionsgefäß 60 geschickt, um die Probe zu reinigen und Luft und Feuchtigkeit aus dem Reaktionsgefäß zu eliminieren.
C) Hydrazin-Abgabe
Dieser Schritt wird ausgeführt, um das nötige Volumen pures, wasserfreies Hydrazin an die Probe wie folgt abzugeben,
bevor das Hydrazin an das Reaktionsgefäß abgegeben wird, werden die Leitungen entsprechend dem unten dargestellten Leitungsreinigungsverfahren gereinigt. 2 Einheiten von 100 ul Hydrazin werden unter Einsatz der Abgabe von Typ A (siehe unten für die Beschreibungen der jeweiligen Abgabetypen) an den Entsorgungstank abgegeben. Hydrazin wird dann an das Reaktionsgefäß abgegeben, wiederum unter Verwendung einer Abgabe Typ A von 100 ul.
Um Hydrazin aus den Leitungen zu eliminieren, wird dann Wasser mittels Leitung 59 an den Entsorgungstank 97 abgegeben (Typ E) und dann über die Leitungen 51 und 57 an den Entsorgungstank 97.
D) Hydrazin-Reaktion
Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Probe einem bestimmten Temperaturzyklus auszusetzen und so Reaktion mit dem Hydrazin zu bewirken, wodurch die Saccharide von der Stamm-Glyco-Verbindung abzuspalten, während wasserfreie Bedingungen innerhalb des Reaktionsgefäßes wie folgt aufrechterhalten werden,
i) Die zu setzenden Parameter für die Hydrazin-Reaktion sind die Geschwindigkeit der Temperturerhöhung, die Temperatur, unter der das Reaktionsgefäß während der Reaktion zu halten ist, und die Dauer dieser Reaktion, und diese hängen von der jeweilig vorliegenden Probe ab. Diese Parameter werden vom Bediener in die Instrumentensteuerung eingegeben.
Zu Anfang wird die Heizung 70 physisch angehoben und umgibt dann das Reaktionsgefäß 60, und die Instrumentensteuerung initiiert den Temperaturanstieg, der nötig ist, um das erforderliche Temperaturprofil im Reaktionsgefäß 60 zu produzieren. Während der Temperaturerhöhung wird die Kammer 72 belüftet, um einen Druckaufbau in dem Reaktionsgefäß zu verhindern. Wenn die Höchsttemperatur erreicht ist, wird die Kammer 72 geschlossen, und die Steuerung hält dann die Temperatur für die erforderliche Zeit aufrecht.
Während dieses Reaktionsprozesses kann ein Waschen der Säulen stattfinden. Der Zweck dieses Prozesses ist, die Säulen und Säulenmateriale schließlich frei von irgendwelchen erworbenen Kontaminierungen zurückzuführen und außerdem das Bindematerial der Säulen in der geeigneten Lösungszusammensetzung abzugleichen. Die folgende Prozedur schließt daran an,
6 ml Wasser wird über Leitung 51 an die Säule C1 und an Entsorgungstank 99 abgegeben (Typ A), und dann wird 3 ml Wasser an die Säulen C2 und C3 an den Entsorgungstank 97 abgegeben. 6 ml BE wird dann über die Säule C1 an Entsorgungstank 99 abgegeben (alles Abgabentyp A). Eine Reinigung mit Argon nach der letzten Abgabe wird über Weg 64 an Entsorgungstank 98 durchgeführt. Dadurch wird die Säule C1 mit BE gesättigt.
Wenn die Reaktionszeit abgelaufen ist, wird die Heizung abgesenkt und die Steuertemperatur auf Umgebung gesetzt. Einige Zeit (typischerweise 20 Minuten) läßt man vergehen, bevor der nächste Schritt ausgeführt wird, so daß die Inhalte des Reaktionsgefäßes kühlen können.
E) Hydrazin entfernen
Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Saccharide (in ent-N-acetylierter Hydrazon- Form) vom Hydrazin zu separieren, und hinterläßt die Saccharide in immobilisiertem Zustand. Dies wird, wie folgt, ausgeführt,
a) 3 ml BE werden an das Reaktionsgefäß abgegeben (Abgabetyp F). Eine Flüssigkeitsmischung wird dann durchgeführt. Die Inhalte des Reaktionsgefäßes 60 werden dann an die Säule C1 transferiert, welche Cellulose enthält. Die freigesetzten Saccharide binden sich an die Cellulose in der Säule C1, während das Hydrazin und außerdem Butanol/Ethanol zum Entsorgungstank 99 abfließen (Typ D - Nullverzögerung). Dieser Prozeß wird zweimal mehr wiederholt.
b) Um das Reaktionsgefäß 60 seinem oberen Aufbau und die Belüftungskammer 72 für spätere Reaktionen in diesem Gefäß frei von Hydrazin zurückzuführen, müssen sämtliche Spuren Hydrazin entfernt werden. Dies wird vollführt, indem 6 ml Wasser in das Reaktionsgefäß abgegeben werden (Abgabetyp F). Das Wasser überfüllt das Reaktionsgefäß in eine Belüftungskammer 72. Eine Flüssigkeitsmischung wird durchgeführt, und die Flüssigkeiten werden durch den Entsorgungstank 97 abgeführt. Dies wird mit Ethanol dann dreimal wiederholt. Die Heizung wird dann angehoben und die Temperatur auf 100ºC gesetzt. Die Heizung wird zu Beginn des Hydrazin Entfernungsprozesses auf 50ºC gesetzt, um den Aufbau vorzuheizen. Während des Heizungsprozesses wird Edelgas vom Ventil 55 über Leitung 59 zum Entsorgungstank 97 geblasen, um das Entfernen der Lösungen zu erleichtern. Dies setzt sich für 1 Stunde fort.
F) Re-N-Acetylierung
Verbleibendes Hydrazin wird zunächst aus der Säule C1 durch geeignetes Lösungswaschen entfernt. Jedwede N-acetylierbare Gruppe auf dem freigesetzten Nicht- Kohlehydratmaterial wird dann in eine N-acetylierte Form konvertiert. In dieser Form kann das Nicht-Kohlehydrat-Material chromatographisch von den Sacchariden separiert werden. Teilweise N-Acetylierung der Saccharide kann auch stattfinden. Die obigen Prozesse werden wie folgt ausgeführt,
a) Lösungswaschen wird bis zum Entfernen übrigen Hydrazins durch Abgabe von 3 ml Ethanol an das Reaktionsgefäß 60 (Typ F) ausgeführt, was dann vom Reaktor zur Säule C1 und zum Entsorgungstank 99 über die Leitung 57 geht (Typ D -2,5 sec. an, 2,5 sec. aus). Dies wird wiederholt.
b) 0,4 ml Essigsäureanhydrid wird zusammen mit einem Volumen BE an das Reaktionsgefäß 60 abgegeben (Typ A). Die Inhalte werden mit Argon verrührt und dann unter bestimmter Flußgeschwindigkeit an die Säule C1 geleitet, welche Acetylierung der Verbindung zuläßt.
G) Entfernung der Verbindung
Die Verbindung kann nun von den an die Cellulosesäule gebundenen Sacchariden getrennt werden, indem ein Volumen Wasser mit BE wiederum im Reaktionsgefäß 60 gemischt wird. Dies wird wie folgt ausgeführt,
a) 0,5 ml Wasser wird an das Reaktionsgefäß 60 abgegeben, gefolgt von 5 ml BE (Abgabetyp F). Die Inhalte des Reaktionsgefäßes 60 werden unter Verwendung von Edelgas gemischt und werden dann an die Säule C1 und wiederum an den Entsorgungstank 99 über die Leitung 57 abgegeben (Typ D -2,5 sec. an, 2,5 sec. aus).
b) Eine Säulenreinigung wird durchgeführt, wobei Spuren Butanol aus der Säule C1 entfernt werden. Dies wird durch Abgabe von 3 ml Ethanol an das Reaktionsgefäß ausgeführt (Typ F), wobei dann die~·Inhalte des Reaktionsgefäßes an die Säule C1 und am Entsorgungstank 99 über die Leitung 57 abgegeben werden (Typ D -2,5 sec. an, 2,5 sec. aus). Dies wird dann wiederholt.
In dieser Ausführungsform ist das Freisetzen und die Wiedergewinnung des Glycans beschrieben. Es ist aber erkennbar, daß das gerade beschriebene Instrument auch eingesetzt werden kann, um entweder Freisetzung oder Wiedergewinnung, oder beides, des Glycans auszuführen. Auf dieselbe Art können entweder ein N-Glycan oder ein O-Glycan von einer Glyco-Verbindung freigesetzt oder wiedergewonnen werden, oder es können gleichzeitig Operationen ausgeführt werden, um sowohl N- Glycan als auch O-Glycan von einer Glyco-Verbindung freizusetzen oder wiederzugewinnen.
H) Elution
Dieser Schritt wird ausgeführt, um die teilweise re-N-acetylierten Saccharide aus ihren Bindungsorten zu eluieren, und zwar in ein Gefäß, woraufhin die re-N-Acetylierung vervollständigt werden kann. Dies wird wie folgt ausgeführt,
a) Edelgas wird vom Ventil 81 über die Säule C1 zum Entsorgungstank 99 geleitet, um sämtliche Flüssigkeit zu entfernen (für I Minute).
b) Elution wird mit 0,25 ml Natriumacetat ausgeführt, welches an das Reaktionsgefäß 60 über die Leitung 51, die Säule C1 und die Leitung 59 abgegeben wird (Typ A). Dies wird 9 Mal wiederholt. Schließlich wird vom Ventil 80, der Leitung 65, der Leitung 59 zum Reaktionsgefäß 60 eine Edelgasreinigung vollführt, um sicherzustellen, daß keine der Proben in einer Leitung bleibt.
c) Die eluierten Saccharide in der Natriumacetat-Mischung werden acetyliert durch Zugabe von 0,5 ml Essigsäureanhydrid an das Reaktionsgefäß 60 (Typ A). Die Inhalte des Reaktionsgefäßes 60 werden unter Verwendung von Edelgas gemischt, und die Reaktion wird für 20 Minuten sich fortsetzen gelassen.
I) Entsalzen/Acetohydrazon-Abspaltung (i)
Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Saccharide zu konvertieren, welche gegenwärtig im frei reduzierenden Zucker in der Acetohydrazon-Form vorliegen. Der Schritt wird wie folgt ausgeführt,
a) die in der re-N-acetylierten Saccharid-Mischung vorliegenden Natriumionen werden entfernt, indem sie durch eine Säule Dowex AG50 oder eine andere geeignete Ionenaustauschmasse, gehen, die in der Säule C2 enthalten ist. Die Inhalte des Reaktionsgefäßes 60 werden daher über einen Weg und abwärts durch die Säule C2 geleitet, wobei Natriumionen gegen Wasserstoffionen ausgetauscht werden. Dieser Prozeß spaltet außerdem teilweise die Acetohydrazon-Verbindungen von den freigesetzten Sacchariden. Die Saccharide, mit den teilweise abgespaltenen Acetohydrazon-Verbindungen, werden nach der Passage durch die Dowex Säule C2 im Sammelgefäß 62 gesammelt. 0,5 ml Wasser wird an das Reaktionsgefäß 60 abgegeben (Typ A), und der erste Schritt wird wiederholt.
b) Die Inhalte des Sammelgefäßes 62 werden an das Reaktionsgefäß 60 abgegeben (Abgabetyp C).
c) 0,5 ml Wasser werden an das Sammelgefäß abgegeben, und der vorhergehende Schritt wird wiederholt.
J) Acetohydrazonabspaltung (ii)
Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Acetohydrazon-Umwandlung zu vervollständigen. Dies geschieht, indem die Probe einer milden Lewis-Säure-Hydrolyse ausgesetzt wird, indem 0,03 ml 0,1 M Kupfer (II) Acetat (0,1 M in Essigsäure) dem Reaktionsgefäß 60 zugeführt werden und man die Reaktion für eine Stunde unter Umgebungstemperatur weiterlaufen läßt.
K) Sammeln
Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Probelösung zu entsalzen und sie an den gewünschten Sammelpunkt abzugeben. Die Inhalte des Reaktionsgefäßes werden über den Weg 57 und die Säule C3 entweder zum Sammelgefäß im Instrument oder zu einem entfernten Sammelpunkt überführt. 0,5 ml Wasser wird dann dem Reaktionsgefäß zugegeben und der vorhergehende Schritt wiederholt.
L) Waschen des Systems
6 ml Ethanol wird durch jedes Reaktionsgefäß geschickt, und die Reaktionsgefäße werden auf 100ºC aufgeheizt. Argon wird dann durch die Reaktionsgefäße geschickt, um sie zu trocknen. Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Leitungen zu säubern und um das Reaktionsgefäß und das zugeordnete Druck-/Belüftungssystem im wesentlichen wasserfrei zu bekommen. Anschließend sollte das System sich in einem Zustand befinden derart, daß eine anschließende Abgabe von Hydrazin in eines der Reaktionsgefäße reines, wasserfreies Hydrazin als Abgabe ergeben würde.

Allgemeines

Die Übergabe von Reagenzien zwischen Reservoirs, Säulen oder Entsorgungstank umfaßt eine Anzahl von Typen,
Abgabetyp A - genaue Abgabe
Dieser Abgabetyp wird ausgeführt, indem zu Beginn das Quellenreservoir unter Druck gesetzt wird und die entsprechenden Ventile aktiviert werden, einen Weg zum Entsorgungstank zu öffnen. Dieser Weg umfaßt beliebige Detektoren, die bei der Abgabe verwendet werden. Edelgas wird für eine bestimmte Zeit diesen Weg entlanggespült, um sämtliche Flüssigkeitstropfen hinauszutreiben, die das Detektorsystem stören könnten. Das entsprechende Ventil (18-25, 76-79), das das Reservoir mit der Leitung 51, 57, 59, 64 oder 65 verbindet, wird dann aktiviert.
Das Steuerungssystem des Instruments gibt das am erforderlichen Bestimmungsort erforderliche Flüssigkeitsvolumen über den erforderlichen Flußweg ab.
Abgabetyp B - kontinuierlich
Diese Abgabe wird eingesetzt, wenn es erforderlich ist, sämtliche Inhalte eines Reservoirs an ein anderes abzugeben, und zwar entlang eines Weges, der keinen Flüssigkeitsdetektor aufweist, zum Beispiel zwischen dem Sammelgefäß 62 und dem Reaktionsgefäß 60 über den Weg 65.
Der hierbei spezifizierte Parameter ist die Zeit, für welche das Abgabeventil offengelassen wird. Diese Zeit ist genügend lang, um bei niedrigstem toleriertem Arbeitsdruck sämtliche Inhalte dem Bestimmungsort zuzuführen. Wie in Typ A wird eine Edelgasspülung ausgeführt, bevor die Abgabe startet, aber in diesem Fall wird der Weg zum Bestimmungsort geöffnet und nicht zum Entsorgungstank.
Abgabetyp C - kontinuierlich
Diese Abgabe ist ähnlich Typ B, wird aber verwendet, wenn es sich um eine Abgabe über die chromatographischen Aufbauten 68, 69 handelt.
Abgabetyp D - langsame Abgabe
Diese Abgabe wird unter denselben Umständen wie Typ C verwendet, sie gibt aber die Flüssigkeit in einer Serie von Pulsen ab. Das Abgabeventil wird zum Zeitpunkt "Puls an" geöffnet und. zum Zeitpunkt "Puls aus" geschlossen. Dies ergibt wirkungsvoll eine langsamere Durchflußgeschwindigkeit.
Abgabetyp E - Flüssigkeits-/Edelgasmischung
Um die Abgabeleitungen nach einer Abgabe zu reinigen, werden Volumina eines passenden Lösungsmittels die Leitungen entlang zum Entsorgungstank abgegeben mit Volumina von Edelgas dazwischen. Das Wasserreservoir 33 wird am weitesten entfernt von den Reaktionsgefäßen und den chromatographischen Geräten positioniert, so daß jede Abgabe von Wasser alle Flüssigkeitsleitungen wäscht.
Abgabetyp F - Hybridabgabe
Diese Abgabe wird eingesetzt, wenn es erforderlich ist, große Volumina schnell an das Reaktionsgefäß abzugeben.
Nach einer anfänglichen Edelgaswäsche wird der Weg zum Bestimmungsort geöffnet, und das Abgabeventil wird geöffnet, um die erforderliche Flüssigkeitsmenge abzugeben. Nach der Abgabe wird das Abgabeventil geschlossen, und die Flüssigkeit wird vom Edelgas an den Bestimmungsort gedrückt.
Der Detektor 30 ist stromaufwärts des Ventils 50 angeordnet und hauptsächlich für Abgaben kleinen Volumens, typischerweise < 500 ul an das Reaktionsgefäß verwendet. Der Detektor 53 ist zwischen dem Ventil 50 und dem Ventil 52 angeordnet, und zwar so nahe zum Ventil 52 wie möglich. Dies ist hauptsächlich für große Abgaben (typischerweise > 2,5 ml) an das Reaktionsgefäß 60 oder die Säulen 68 verwendet.
Der Detektor 58 ist zwischen dem Ventil 96 und dem Ventil 54, so nahe am Ventil 54 wie möglich, plaziert. Dies ist hauptsächlich für Abgaben vom Reaktionsgefäß an die Säulen verwendet. Im Fall der Abgabe eines Reagens, das vollständig frei von anderen Reagenzien gefordert ist, kann eine Testabgabe dieses Reagens vor der endgültigen Abgabe ausgeführt werden. Zum Beispiel werden vor der Abgabe von Hydrazin an das Reaktionsgefäß 60 kleine Volumina von Hydrazin aus dem Reservoir zum Entsorgungstank über den Weg 59 abgegeben.
Um das gründliche Waschen des Reaktionsgefäßes zu gewährleisten und so verbliebenes Hydrazin zu beseitigen, umfaßt das System die Kammern 72, 73, welche es ermöglichen, daß die Reaktionsgefäße 60, 61 mit Flüssigkeit überfüllt werden, wobei der Überfluß in den Kammern 72, 73 gesammelt wird. Diese Gefäße werden später detailliert beschrieben. Um sicherzustellen, daß das Reaktionsgefäß vollständig sauber und trocken ist, wird es mit Wasser und Ethanol gewaschen und dann erhitzt. Während es erhitzt ist, wird Edelgas aus der Druck-/Belüftungsleitung 55, 56 zum Entsorgungstank durchgeblasen.
Die im Instrument verwendeten Flüssigkeitsabgabeventile umfassen Ventilblocks und individuelle Wechselventile, welche zum Schaffen von Wegen zur Flüssigkeitsabgabe tätig sind. Diese Ventile verwenden solenoidbetätigte Membranen, die aus Werkstoffen, zum Beispiel PTFE aufgebaut sind, welche gegen die verwendeten Chemikalien widerstandsfähig sind.
Die Ventilblöcke umfassen multiple Membranen, die jeweils einen Anschluß von einer gemeinsamen Durchgangsleitung trennen. Die Wechselventiltypen verwenden die Membran, um zwischen einem gemeinsamen (stets offenen) Anschluß und einem von zwei anderen Anschlüssen zu verbinden. In seinem deaktivierten Zustand ist der Weg vom gemeinsamen zum üblicherweise offenen Anschluß geschaltet. Betätigt ist der Weg vom gemeinsamen zum üblicherweise geschlossenen Anschluß geschaltet.
Die im Instrument verwendeten Flüssigkeitsdetektoren arbeiten mit einem Lichtstrahl, der durch das Rohr geschickt wird und so den Flußweg zu einem Photosensor passiert. Die Detektoren detektieren Flüssigkeit, indem sie die Brechung des Lichtstrahls aufgrund der Anwesenheit von Flüssigkeit im Rohr erkennen.
Chromatographische Säulen
Die chromatographischen Säulen sind in zwei Einheiten angeordnet, die jeweils drei in einer Packung montierte Säulen umfassen. Die Säulen sind im Diagramm von Fig. 1 und in der Vorderansicht in Fig. 2 als Säulen C1 bis C3 und Säulen C4 bis C6 bezeichnet. Die Säulen C1 bis C3 sind in einer Packung CT 1 montiert und können eingesetzt werden, um eine Probe zu arbeiten, während die Säulen C4 bis 6 in der Packung CT2 montiert sind und eingesetzt werden können, um eine weitere Probe bearbeiten. In Abhängigkeit von den übrigen Erfordernissen für die zwei Proben können die Inhalte der Säulen C1 bis C3 identisch mit den Inhalten der Säulen C4 bis C6 sein.
Die Packungen CT1 und CT2 sind Kunststoffblöcke mit Löchern zum Halten der Säulen, was die Montage und Demontage der Säulen im Instrument erleichtert. Im vorliegenden Beispiel ist die Säule C1 (und die Säule C4) mit mikrokristalliner Cellulose oder anderem Material gefüllt, an welches Saccharide sich binden. Die Säule C2 (und die Säule C5) haben die Form eines Betts aus Dowex AGSO-Masse (H+ Form), welche in der Lage ist, Kationen aus dem Eluens zu entfernen, und außerdem in der Lage ist, eine milde saure Hydrolyse der Saccharide zu bewirken. Die Säule C2 kann außerdem C18 Silikamasse aufweisen, die als Bett unter dem AG50-Bett angeordnet ist. Dieses Material ist in der Lage, die N-Glycopeptidanteile zu entfernen, die in einem der Betätigungsmodi produziert werden.
Diese Säule C3 (und Säule C6) hat die Form eines gemischten Betts aus Chelexmasse (Na+ Form) und Dowex AG50-Masse (H+ Form). Dieses Material ist in der Lage, divalente Kationen gegen Natriumkationen auszutauschen, und ist außerdem in der Lage, diese Natriumkationen zu entfernen.
Fig. 2, 3 und 4 zeigen den Aufbau, in dem die chromatographischen Säulen C1 bis C6 montiert sind. Fig. 3 ist ein Schnitt durch die Säule C6, welche ein zylindrisches Rohr 101 aufweist, das aus Glas oder einem anderen geeigneten Werkstoff hergestellt ist. Das Rohr 101 kann in seiner Packung zusammen mit den Rohren für die Säulen C5 und C4 angeordnet sein. Die Packung wird dann in das Instrument eingesetzt, so daß die Säule C6 sich in einer zylindrischen Öffnung 102 im Rahmen 103 des Instruments befindet und dort auf einem unteren O-Ring 104 sitzt. Die Säulen C4 bis C6 können in dieser Position sicher verbleiben, da die Seiten der Öffnungen, z. B. Öffnung 102, sie daran hindern herauszufallen.
Wiederum mit Bezug auf die Säule C6 ist der O-Ring 104 in einem ringförmigen Rezeß 105 in einem gleitenden Teil 106 angeordnet, und wenn das Teil 106 aufwärts gebracht wird (wie unten beschrieben), wird das Rohr 101 zusätzlich in Kontakt mit einem oberen O-Ring 107 gebracht, so daß beide Enden des Rohres 101 abgedichtet sind.
Das gleitende Teil 106 wird aufwärts gebracht, wenn ein Arm 108 (Fig. 4) auf in die in Fig. 4 dargestellte Position geschwungen wird. Dieses bewirkt, daß ein Sockel 109, der sich über alle sechs chromatographischen Säulen erstreckt, aufwärts gebracht wird und das Rohr 101 in festen Kontakt mit den zwei O-Ringen 104, 107 bringt. Die oberen und unteren Enden aller Säulen C1 bis C6 werden dadurch gegen ihr jeweiliges Paar 0-Ringe gedichtet.
Wie in Fig. 4 gezeigt, hat der Arm 108 eine Oberfläche 110, die exzentrisch bezüglich seiner Schwenkachse 111 gestaltet ist, so daß dann, wenn der Arm 108 in die in Fig. 4 gezeigte Position rotiert ist, der Sockel 109 aufwärts gegen die Kompression einer Feder 112 gebracht wird, welche in der Mitte des Sockels 109 zwischen den zwei Gruppen der Säulen C1 und C3 und C4 bis C6 angeordnet ist. Bezüglich der Säule C6 bewirkt die Bewegung des Arms 108, daß der Körper 106 zum Aufwärts- · gleiten im Rahmen 103 gebracht wird.
Weil es kleine Verschiedenheiten zwischen den einzelnen Längen der Glasrohre der Säulen C1 bis C6 geben kann, stellt eine Feder 113, angeordnet in einem Rezeß 114 im gleitenden Teil 106 eine Art Federkissen zwischen dem Sockel 109 und der Kompressibilität der O-Ringe 104 und 107 dar. Alle sechs Säulen sind auf ähnliche Weise abgedämpft.
Der gleitende Körper 106 und ein entsprechender Einsatz 115 im Rahmen 103 haben Durchgangsöffnungen 116 bzw. 117, die das Fließen von Reagenzien und Probenmaterial aus der Säule C6 gestatten.
Fig. 2 zeigt alle sechs Säulen in Seitenansicht, und es ist erkennbar, daß die Bewegung des Arms 108 bewirkt, daß alle sechs Säulen gleichzeitig in dichtendem Kontakt mit den jeweiligen O-Ringen gebracht werden.
Heizen der Proben
Die Probe oder die Proben, die im Instrument analysiert werden, sind in Reaktionsgefäßen 60, 61 angeordnet und werden in diesen Reaktionsgefäßen in Anwesenheit von Reagenzien erhitzt, die alle oben beschrieben sind.
Fig. 5 und 6 zeigen den Aufbau zum Durchführen dieser Heizzyklen. Das Reaktionsgefäß 60 wird, wenn es mit Probenmaterial befüllt ist, in einen Halter 150 geschraubt, in welcher Position ein Heizungsaufbau 151 unter Steuerung der Systemsteuerung angehoben werden kann und so das Reaktionsgefäß, wie in Fig. 5 gezeigt, umgibt. Es gibt einen separaten Heizungsaufbau 151, 152 für jedes Reaktionsgefäß, wobei der Aufbau 151 auf der rechten Seite der Figur im Querschnitt gezeigt ist.
Fig. 5 und 6 zeigen nur ein Reaktionsgefäß 60 in Benutzung.
Der Heizungsaufbau 151 umfaßt ein elektrisches Heizungselement 153 und einen Temperatursensor 154. Der Aufbau 151 umgibt das Reaktionsgefäß 60 und leitet Wärme aus dem Element 153 und heizt so das Reaktionsgefäß 60. Der Aufbau 151 ist von einem zylindrischen Isolator 155 umgeben. Die zwei Heizungsaufbauten sind auf einer Plattform 157 montiert, welche auf den Säulen 159 und 160 angehoben und abgesenkt werden kann.
In Fig. 6 ist die Heizungsbaugruppe teilweise angehoben/abgesenkt dargestellt. Die Plattform 157 kann auf und abwärts durch Rotation eines Tragarms 180 um eine Achse 181 bewegt werden. Wie in Fig. 7 gezeigt, hat der Arm 180 eine Rolle 182 an seinem Ende, die in einen länglichen Schlitz 183 in der Plattform 157 eingreift, wobei Rotation des Arms 180 um 360º bewirkt, daß die Plattform angehoben und abgesenkt wird.
Wenn der Kragarm 180 zum Anheben und dort Halten des Heizungsaufbaus rotiert wird, ist es sehr schwierig sicherzustellen, daß der Arm genau in vertikaler Position stoppt, und er wird dann dazu neigen unter Einfluß von Schwingung oder anderer Bewegung des Instruments aus der Vertikalen auszuwandern. Dies würde es ermöglichen, daß der Heizungsaufbau sich unter seinem eigenen Gewicht absenkt.
Um sicherzustellen, daß der Kragarm 180 stabil in aufrechter Position gehalten wird, wird die in Fig. 7 dargestellte Anordnung eingesetzt. Der Schlitz 183 in der Plattform 157 hat einen kleinen Rezeß 184 in seiner oberen Oberfläche in der Position des oberen Totpunkts. Wenn der Arm 180 den oberen Totpunkt erreicht, gerade wenn die Rolle 182 in den Rezeß 184 hineinrollt, betätigt dies Detektoren (nicht dargestellt), welche den Antrieb von Arm 180 stoppen. Weil der Radius R1 des Rezesses 184 kleiner ist als der Radius R2 der Drehung des Arms 180, wird die Rolle 182, wenn sie in den Rezeß 184 hineingerollt ist, in die Mitte des Rezesses gezwungen. Weil die Rolle 182 am Arm 180 befestigt ist, kann sie sich nur entlang dem Radius R2 bewegen, während die Gestalt des Rezesses 184 die Bewegung der Rolle 182 auf den Radius R1 begrenzt. Dadurch bewegt sich die Rolle immer zum oberen Totpunkt, und irgendwelche Schwingungen oder Bewegungen des Instruments wer den das Zentralisieren der Rolle nur unterstützen. Der Arm 180 wird stabil in der aufrechten Position gehalten.
Die Breite des Rezesses 184 ist abhängig von der Trägheit des Aufbaus, die den Arm 180 antreibt, sowie von den Toleranzen der Detektoren, so daß sichergestellt ist, daß der Arm immer im Rezeß 184 anhalten kann.
Während die gerade beschriebene spezifische Anordnung die Heizung anhebt, um das Gefäß zu umgeben, ist leicht verständlich, daß sie auch für Relativbewegung zwischen der Heizung und dem Gefäß eingerichtet sein kann, welche bewirkt wird, indem beide bewegt werden.
Reaktionsgefäß
Im Zuge der Durchführung von Reaktionen mit den Proben, werden verschiedene Reagenzien an die Reaktions-/Aufnahmegefäße abgegeben, und es ist dann wesentlich, daß zu verschiedenen Prozeßzeiten das Reagens und das Probenmaterial vollständig aus den Reaktionsgefäßen entfernt werden. Es hat sich herausgestellt, daß ein einfaches Füllen der Reaktionsgefäße mit rinnender Flüssigkeit eine vollständige Entfernung von Kontaminanzien nicht garantiert.
Um das Reaktions-/Reaktionsgefäß 60 vollständig zu reinigen, wird es bis oben mit einem Waschungsreagens gefüllt. Argon wird dann durch die Leitung 172 injiziert, und dies bewirkt, daß Argon und Flüssigkeit in das Überlaufgefäß 72 gezwungen werden. Weil das Gefäß 72 um einen Winkel schräg ist, fließt die in dieses Gefäß gezwungene Flüssigkeit nicht aus seiner Oberseite, sondern zurück ins Gefäß 60. Die Flüssigkeit wird dann durch die Leitung 172 zum Entsorgungstank entfernt.
Flüssigkeitsmischung
An verschiedenen Punkten im Prozeß ist es erforderlich, daß die Inhalte des Reaktions-/Aufnahmegefäßes bewegt werden, entweder um ein Zweiphasensystem zu homogenisieren oder um sicherzustellen, daß die Seiten des Gefäßes optimal gereinigt sind. Dies wird bewirkt, indem ein Weg von der Edelgasquelle zum Gefäß geöffnet wird, wobei anfänglich das Ventil zum Gefäß geschlossen bleibt.

Claims

1. Eine Vorrichtung zur Verwendung beim Wiedergewinnen und/oder Freisetzen von N-Glycans und/oder O-Glycans aus einer Glyco-Verbindung mit:

einer Edelgasquelle, einer Leitung (26, 51, 57, 64, 65), in die das Edelgas unter Druck zu einer Vielzahl von Auslässen (97, 98, 99) unter Druck strömen kann, wobei die Leitung bezüglich der Atmosphäre abgedichtet ist,

mindestens einem Flüssigflußdetektor (30, 57, 58) zum Detektieren von Flüssigkeitsfluß in der Leitung und

in sukzessiver Verbindung mit der Leitung über geeignete Ventile (18 bis 25, 76, 77):

einer Vielzahl von Reagenzgefäßen (33 bis 40) für flüssige Reagenzien, die in die Leitung durch selektives Dirigieren des Edelgases durch diese hindurch eingebracht werden können,

mindestens ein Reaktionsgefäß (60, 61), in das die flüssigen Reagenzien wahlweise dirigiert werden können und aus dem Reaktionsprodukte die Leitung entlang strömen können, und mindestens eine Säule (C 1 bis C6), durch die die Reagenzien oder die Reaktionsprodukte selektiv dirigiert und dann entweder zu dem mindestens einen Reaktionsgefäß zurückgeführt oder zu mindestens einem der Auslässe geführt werden können.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, mit einem Detektor (38) zum Detektieren von Flüssigkeitsfluß zwischen dem mindestens einen Reaktionsgefäß und der mindestens einen Säule.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 mit einem ersten Detektor (30) zum Detektieren von Flüssigkeitsfluß in der Leitung zwischen den Reaktionsgefäßen und dem mindestens einen Reaktionsgefäß und mit einem zweiten Detektor (58) zum Detektieren von Flüssigkeitsfluß zwischen dem mindestens einen Reaktionsgefäß und einem oder mehreren der Auslässe.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zusätzlich mit einer Temperatursteuerung (154) zum Steuern der Temperatur des mindestens einen Reaktionsgefäßes innerhalb eines Bereiches von Nicht-Umgebungstemperaturen und zum Steuern der Temperaturänderungsgeschwindigkeit des mindestens einen Reaktionsgefäßes.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, zusätzlich mit einer Heizung (151) für jedes Reaktionsgefäß und Mitteln (180, 181) zum Bewirken von Relativbewegung derart, daß die Heizung das Reaktionsgefäß während des Temperatursteuerungsvorgangs umgibt und einschließt sowie zum automatischen Umkehren der Relativbewegung beim Verwenden der Vorrichtung.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5 zusätzlich mit einem Endlagensperrmechanismus (182 bis 184) zum sicheren Halten des zum Umgeben des Reaktionsgefäßes aktivierten Heizungsmittels.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zusätzlich mit Mitteln zum Unterdrucksetzen und Ventilieren des mindestens einen Reaktionsgefäßes.