DE69126915T2

DE69126915T2 - Test für Barbiturate, Tracer, Immunogene, Antikörper und Testsatz dafür

Info

Publication number: DE69126915T2
Application number: DE69126915T
Authority: DE
Inventors: Maciej Adamczyk; Luis A Cantarero; Robert Edward Dubler; Jonathan Grote; Patrick J Jonas; Jane Ann Nelson
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-05-16
Filing date: 1991-05-10
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2011-05-11
Also published as: AU7708191A; AU644871B2; EP0457213A3; KR910020436A; EP0457213B1; JP3096487B2; DE69126915D1; ATE155893T1; JPH04231873A; ES2106040T3; CA2042640A1; CA2042640C; EP0457213A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Reagenzien für ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassayverfahren zur Bestimmung der Menge an Barbiturat in Flüssigkeiten, insbesondere in biologischen Flüssigkeiten wie etwa Serum, Plasma oder Urin, und sie betrifft ein Verfahren zur Herstellung der Reagenzien. Insbesondere betrifft die Erfindung (1) Reagenzien (bevorzugte Tracer und ein Kit, das Tracer und Antikörper) einschließt zur Bestimmung der Menge von Barbiturat in einer Probe; (2) synthetische Verfahren (zur Herstellung der bevorzugten Tracerverbindungen); und (3) analytische Verfahren zur Durchführung des Assays.

Stand der Technik

Barbiturate sind Depressiva des zentralen Nervensystems. Therapeutisch werden sie als Sedativa, Hypnotika und Antikonvulsantien verwendet. Obwohl die legale Verfügbarkeit von Barbituraten abgenommen hat, sind sie häufig mißbrauchte sedative oder hypnotische Drogen, und sie werden oft verwendet, um Selbstmord zu begehen.
Die physiologische Absorption, die Wirkung und die Toxizität der Barbiturate schwankt stark und ist von der Natur der 5-substituierten Gruppen und der Imino-Wasserstoffe abhängig. Ungefähr 35% des Barbiturates im Blutplasma ist proteingebunden. Die Barbiturate werden in verschiedenen Geweben und Organen verteilt. Die Barbiturate werden in erster Linie in der Leber abgebaut, und mit wenigen Ausnahmen werden sie allgemein im Urin hauptsächlich als nicht-aktive Metaboliten ausgeschieden.
Die am häufigsten mißbrauchten Barbiturate sind die kurzbis mittelfristig wirksamen Secobarbital, Pentobarbital, Amobarbital usw. Sie werden in weitverbreiter Weise verwendet, um die Erregungszustände abzuschwächen, die auf der Verwendung von Stimulantien beruhen. Aus der chronischen Anwendung dieser Wirkstoffe kann Toleranz entstehen, und es kann der Tod eintreten, sowohl bei einer Überdosis als auch bei einem plötzlichen Abbruch der Wirkstoffeinnahme.
In der Vergangenheit sind die Barbituratpegel im Urin typischerweise mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLO), Gaschromatographie (GO), Enzymimmunoassay (EIA), substratgebundenem Fluoreszenzimmunoassay (SLFIA) und Radioimmunoassay (RIA) gemessen worden. Diese Verfahren sind in vernünftiger Weise spezifisch, um die Wirkstoffkonzentrationen nachzuweisen; jedoch sind sie nicht ohne Nachteile. HPLC- und GO-Verfahren benötigen Probenextraktionsverfahren und die Untersuchungszeit ist lang. Sowohl EIA als auch SLFIA umfassen Enzymreaktionen und weisen die folgenden Nachteile auf: 1) die Reagenzien sind relativ instabil; 2) alle Bestandteile in den biologischen Proben, die die Enzymreaktion beim EIA oder SLFIA beeinflussen können (wie etwa Enzyminhibitoren oder Enzyme, die ähnliche Reaktionen katalysieren), beeinträchtigen die Assayergebnisse; und 3) EIA und SLFIA messen die Extinktion oder Fluoreszenz, und alle Verbindungen in der biologischen Probe, die die Extinktion oder Fluoreszenz beeinträchtigen konnen (wie etwa Lipid, Hämoglobin, Bilirubin oder andere Chromophore oder Fluorophore) beeinträchtigen die Genauigkeit der Ergebnisse, die mit diesen Assays erhalten werden. RIA-Reagenzien weisen die folgenden Nachteile auf: 1) kurze Lagerungsdauer; 2) Gefahren aufgrund der Strahlung; und 3) Probleme, die mit der Lagerung und der Entsorgung von radioaktiven Materialien im Zusammenhang stehen.
Typischerweise werden konkurrierende Bindungsimmunoassays verwendet, um Liganden in einer Testprobe zu messen. (Für die Zwecke dieser Offenbarung ist ein "Ligand" eine Substanz von biologischem Interesse, die mittels einem konkurrierenden Bindungsimmunoassayverfahren guantitativ bestimmt werden soll). Die Liganden konkurrieren mit einem markierten Reagenz oder "Ligandenanalogon" oder "Tracer" um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen auf Antikörpern, die für den Liganden und das Ligandenanalogon spezifisch sind. Die Konzentration an Ligand in der Probe bestimmt die Menge an Ligandenanalogon, das an den Antikörper bindet: die Menge an Ligandenanalogon, die bindet, ist zu der Konzentration des Liganden in der Probe umgekehrt proportional, weil der Ligand und des Ligandenanalogon jeweils im Verhältnis ihrer jeweiligen Konzentrationen an den Antikörper binden.
Die Fluoreszenzpolarisation liefert ein quantitatives Mittel zur Messung der Menge von Tracer-Antikörperkonjugat, das bei einem konkurrierenden Bindungsimmunoassay entstanden ist. Die Fluoreszenzpolarisationsverfahren beruhen auf dem Prinzip, daß eine fluoreszent markierte Verbindung, wenn sie mit planar polarisiertem Licht angeregt wird, eine Fluoreszenz emittiert, die ein Ausmaß an Polarisation aufweist, das umgekehrt zur Geschwindigkeit ihrer molekularen Rotation in Beziehung steht. Wenn demgemäß ein Tracer-Antikörperkonjugat, das eine fluoreszente Markierung trägt, mit planar polarisiertem Licht angeregt wird, verbleibt das emittierte Licht hochgradig polarisiert, weil das Fluorophor durch den Antikörper daran gehindert wird, in dem Zeitraum zwischen der Lichtabsorption und der Lichtemission zu rotieren. Wenn im Gegensatz dazu ein ungebundener Tracer durch planar polarisiertes Licht angeregt wird, ist dessen Rotation wesentlich schneller als diejenige des entsprechenden Tracer-Antikörperkonjugates. Das Ergebnis ist, daß das Licht, das von den ungebundenen Tracermolekülen emittiert wird, depolarisiert ist.
Eine Schwierigkeit, die bisher die genaue Bestimmung von Barbituraten und anderen "Mißbrauchsdrogen" im Urin mittels Fluoreszenzpolarisationsverfahren verhindert hat, ist diejenige der Riboflavininterferenz. Riboflavin oder auch Vitamin B&sub2; ist ein verbreiteter Bestandteil von vielen Nahrungsmitteln und von handelsüblich erhältlichen Vitaminzusätzen. Riboflavin wird in erster Linie im Urin ausgeschieden und weist ein Fluoreszenzspektrum auf, das demjenigen des Fluoresceins sehr ähnlich ist. Als Ergebnis schafft die Anwesenheit von Riboflavin sogar in moderaten Mengen in Urinproben eine Interfernz, die zu irrtümlichen Ergebnissen führen kann. Obwohl normaler Riboflavinverbrauch wahrscheinlich nicht mehr als Spurenmengen von Riboflavin im Urin erzeugt, können die Testergebnisse leicht durch die Einnahme von überschüssigen Mengen an Vitaminzusätzen durch Personen verfälscht werden, die den Nachweis der Barbituratverwendung ausschließen möchten.
Die vorliegende Erfindung ist durch eine einheitlichere Kreuzreaktivität in Bezug auf die allgemein verwendeten Barbiturate gekennzeichnet. Darüberhinaus liefert die Erfindung einen Fortschritt in Bezug auf den Stand der Technik, insofern als daß Tracer, ein Verfahren zur Herstellung der Tracer und ein Assay, der die Tracer verwendet, spezifisch für die Bestimmung von Barbituraten ohne Riboflavininterferenz zur Verfügung gestellt werden.
EP-A-0 373 508, die als Stand der Technik gemäß den Bestimmungen von Artikel 51(3) und (4) EPÜ betrachtet wird, offenbart einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für Barbiturate ohne Riboflavininterferenz und Tracer zur Verwendung darin.
GB-A-2 111 476-offenbart substituierte Carboxyfluoresceine und deren Verwendung bei Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays.
FR-A-2 518 096 offenbart Aminofluoresceinderivate und deren Verwendung bei Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays.
EP-A-0 110 186 offenbart Aminomethylfluoresceinderivate und deren Verwendung bei Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays.
EP-A-0 218 010 offenbart substituierte Piperazinocarboxyfluoresceintracer und deren Verwendung in Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays.
GB-A-2 081 257 offenbart Verbindungen, die mit Chlortriazinyl-Aminofluorescein markiert sind, als Fluoreszenztracer.
Sidki, A.M., Therapeutic Drug Monitoring, 4:397-403 (1982) offenbart einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay zum Nachweis von Phenobarbital in Serum oder Plasma unter Verwendung von fluoreszenzmarkiertem Phenobarbital.
Colbert, D.L., Olin. Chem., 30/11, 1765-1769 (1984) offenbart einen Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay für Barbiturate in Urin unter Verwendung von fluoresceinmarkiertem Phenobarbital und fluoresceinmarkiertem Secobarbital.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Fluoreszenzpolarisationsassay für Barbiturate gerichtet, auf bevorzugte Tracer zur Verwendung in dem Assay, auf ein Reagenzienkit, und auf Verfahren zur Herstellung der bevorzugten Tracer der Erfindung. Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein stabilisiertes Reagenzienkit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von üblicherweise verwendeten Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten in einem einzigen Assay, der einen Tracer oder Salze davon, wie in der Strukturformel nach Figur 27 dargestellt, umfaßt, und einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der zur spezifischen Erkennung und Bindung der üblicherweise verwendeten Barbiturate befähigt ist, und der gegen ein Immunogen gezüchtet worden ist, das in der Strukturformel nach Figur 2 dargestellt ist.
Bei den Tracern:
(1) ist W gleich Sauerstoff oder Schwefel;
(2) ist R¹ eine Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Alkinylgruppe, die insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die 0 bis 1 Halogenatome umfaßt, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu einer aliphatischen oder aromatischen Ringstruktur umfaßt;
(3) ist R³ gleich R&sup4;-Fl;
(4) ist Fl gleich Fluorescein oder ein Fluoresceinderivat;
und ist
(5) R&sup4; eine Linkergruppe, die:
(a) eine -CH=CH- Linkergruppe enthält und insgesamt 2 bis 15 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu einer aliphatischen oder aromatischen Ringstruktur umfaßt, wobei die Heteroatome gleich O, N, S, P oder F sind; und
(b) insgesamt 0 bis 5 Heteroatome aufweist;
und für die Immunogene:
(1) ist W gleich Sauerstoff oder Schwefel;
(2) ist R¹ eine Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Alkinylgruppe, die insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, die 0 bis 1 Halogenatome umfaßt, und die bis zu einer aliphatischen oder aromatischen Ringstruktur umfaßt;
(3) ist R² gleich R-Q;
(4) ist Q eine Poly(Aminosäure), ein Poly(Aminosäure)derivat oder ein anderer immunogen aktiver Träger; und ist
(5) R eine Linkergruppe, die:
(a)ein -CH-, ein -CH=, ein -C(0)- oder ein -NH- an demjenigen Ende der Linkergruppe aufweist, das an Q gebunden ist;
(b) insgesamt 1 bis 20 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu einer aliphatischen oder aromatischen Ringstruktur umfaßt, wobei die Heteroatome gleich O, N, S, P oder F sind; und
(c) insgesamt 0 bis 7 Heteroatome aufweist.
Das am meisten bevorzugte Reagenzienkit der vorliegenden Erfindung, ist dasjenige, das einen Antikörper enthält, der als Antwort auf den das neue Immunogen hergestellt worden ist, das in Figur 29 gezeigt ist.
Ein Immunogen, das zur Züchtung der obigen Antikörper verwendet werden kann, kann nach einem Verfahren synthetisiert werden, das den Schritt der Kupplung einer Verbindung, die durch die in Figur 2 gezeigte Strukturformel dargestellt ist, wobei:
W gleich Sauerstoff oder Schwefel ist;
R¹ gleich Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Alkinyl ist, das insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, das in einer geraden oder verzweigten Kette angeordnet ist, das 0 bis 1 Halogenatome umfaßt, und das bis zu einer aliphatischen oder aromatischen Ringstruktur enthält;
R² gleich CH&sub2;-R-X ist;
X gleich NH&sub2;, Cl, Br, I, OH, CO&sub2;H, O-C-Cl,
ist; und
R eine Linkergruppe ist, die bis zu 7 Heteroatome umfaßt, und die insgesamt 0 bis 20 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in einer geraden oder verzweigten Kette angeordnet ist, und die bis zu einer aliphatischen oder aromatischen Ringstruktur enthält;
mit einer Poly(Aminosäure), einem Poly(Aminosäure)derivat oder einem anderen immunologisch aktiven Träger umfaßt.
Die Tracer, die in den Kits der Erfindung enthalten sind, können hergestellt werden, indem eine Verbindung, die durch die Strukturformel, die in Figur 27 gezeigt ist, in der
W gleich Sauerstoff oder Schwefel ist;
R¹ gleich Alkyl-, Alkenyl-, oder Alkinyl mit insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatomen ist und 0 bis 1 Halogenatome umfaßt, das in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist und das bis zu einer aliphatischen oder aromatischen Ringstruktur enthält;
R³ gleich CH&sub2;-R-Y ist;
Y gleich -NH&sub2;, COOH, -COCl, SO&sub3;H, SO&sub2;Cl, SH, CHO, CN, OH oder I ist; und
R eine Linkergruppe ist, die bis zu 10 Heteroatome umfaßt, die insgesamt 0 bis 20 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu einer aliphatischen oder aromatischen Ringstruktur enthält;
mit Fluorescein oder einem Derivat des Fluoresceins gekuppelt wird.
Vorzugsweise wird der Tracer hergestellt, indem ein Vorläufer der Strukurformel, die in Figur 27 gezeigt ist, worin:
W und R³ die oben definierte Bedeutung haben;
R¹ gleich Alkyl mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen ist, das in verzweigter Kette angeordnet ist, und das keine Ringstruktur enthält;
Y gleich NH&sub2; oder COOH ist; und
R eine Linkergruppe ist, die bis zu 3 Heteroatome umfaßt, die insgesamt 3 bis 5 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die keine Ringstruktur enthält, gekuppeltwird.
Bevorzugte Derivate von Fluorescein umfassen Amino-, Amido-, Amidino-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Carbamido-, Thiocarbamido- oder Triazinylaminoderivate. Die derzeitig am meisten bevorzugten Derivate sind die Aminoderivate, insbesondere Aminomethylfluorescein.
Die Kits der vorliegenden Erfindung können die Ausschaltung der möglichen Fluoreszenzinterferenz durch Riboflavin bewirken. Demgemäß kann ein Bestandteil des Reagenzienkits eine Lösung sein, die eine Menge an Riboflavinbindungsprotein (RBP) enthält, die entweder direkt zu jeder Probe oder zu einem oder mehreren der Reagenzien zugesetzt werden kann, die bei dem Assay verwendet werden, wobei sie das ganze vorhandene Riboflavin als RBP-Riboflavinkomplexe bindet, wodurch die Fluoreszenzinterferenz ausgeschaltet wird. Andere fluoreszenzlöschende Substanzen können ebenfalls zu diesem Zweck verwendet werden.
Insbesondere werden Reagenzienkits zur Verfügung gestellt, bei denen im Tracer:
(1) R¹ gleich einem Alkyl ist, das insgesamt 2 bis 7 Kohlenstoffatome aufweist; und
(2) R&sup4; gleich einer Linkergruppe ist, die insgesamt 2 bis 10 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden die unten beschriebenen Verfahren zum Nachweis oder zur Messung der Konzentration von Barbituraten zur Verfügung gestellt. Eine Probe wird mit einem Barbituratantiserum in Kontakt gebracht und mit einem fluoresceinhaltigem Barbituratderivat, das zur Erzeugung einer nachweisbaren Fluoreszenzpolarisationsantwort auf die Anwesenheit von Barbituratantiserum in der Lage ist. Es wird dann planar polarisiertes Licht durch die Lösung hindurchtreten lassen, um eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu erhalten, und diese Antwort wird als Maß für die Menge an Barbiturat in der Probe aufgezeichnet.
Ein erstes Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten umfaßt folgende Schritte:
(a) In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem Barbituratantiserum, wobei das Barbituratantiserum monoklonale oder polyklonale Antikörper enthält, die gegen ein Immunogen nach der Formel von Figur 29 gezüchtet worden sind, und mit Tracerverbindungen der Formel nach Figur 27, worin W, R¹ und R³ die oben für die Tracerverbindungen, die in den Kits der Erfindung verwendet werden, angegebene Bedeutung haben, wobei die Tracerverbindungen zur Erzeugung einer nachweisbaren Fluoreszenzpolarisationsantwort auf die Gegenwart des Barbituratantiserums in der Lage sind;
(b) Hindurchtreten-Lassen von planar polarisiertem Licht durch die resultierende Lösung aus Schritt (a) unter Erhalt einer Fluoreszenzpolarisationsantwort; und
(c) Nachweisen der Fluoreszenzpolarisationsantwort der Lösung nach Schritt (b) als Maß für die Anwesenheit der Menge an Barbiturat in der Probe.
Insbesondere ist im Tracer des Verfahrens:
(1) R¹ ein Alkyl mit insgesamt 2 bis 7 Kohlenstoffatomen; und
(2) R&sup4; eine Linkergruppe, die insgesamt 2 bis 10 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist Ein zweites Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten weicht im Umfang von obigem ersten Verfahren -insofern ab, als daß die Antikörper gegen ein Immunogen nach der Formel von Figur 2 gezüchtet worden sind, wobei W, R¹ und R² die oben für die Immunogenverbindungen, die zur Züchtung der Antikörper verwendet werden, die in den Kits der Erfindung enthalten sind, angegebene Bedeutung haben, und es weicht darüberhinaus von dem ersten Verfahren insofern ab, als daß die Tracerverbindung die Formel nach Figur 30 oder Figur 31 aufweist. Insbesondere kann das Immunogen die Formel nach Figur 29 aufweisen.
Ein drittes Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten weicht im Umfang vom obigen. ersten Verfahren insofern ab, als daß die Antikörper gegen ein Immunogen nach: der Formel von Figur 2 gezüchtet worden sind, wobei W, R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung für die Immunogenverbindungen haben, die zur Züchtung der Antikörper verwendet werden, die in den Kits der Erfindung enthalten sind, mit der Ausnahme, daß R in der Definition von R² nur -CH= ist.
Als weiterer Aspekt der Erfindung werden neue Tracer zur Verfügung gestellt. Die Tracer der Erfindung sind in den Formeln der Figur 30 und der Figur 31 dargestellt.
Weitere Aufgaben und erzielte Vorteile der Erfindung werden am besten aus der Lektüre der folgenden eingehenden Beschreibung zusammen mit den Figuren und den Beispielen offensichtlich.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

In den folgenden Figuren stellt das Symbol "Fl" eine Fluoresceingruppe dar, und die verschiedenen anderen Symbole sind in der eingehenden Beschreibung der Erfindung bezeichnet.
Figur 1 zeigt die allgemeine Struktur einiger der Barbiturate, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung semi-quantitativ bestimmt werden.
Figur 2 zeigt eine allgemeine - Strukturformel für die Immunogene, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie auch für die Klassen der Reaktanten, die zu ihrer Herstellung verwendet werden.
Figur 3 zeigt die alternative Strukturformel und die Namen der Fluoresceingruppe, die von den Tracern der vorliegenden Erfindung umfaßt wird.
Figur 4 zeigt verschiedene Bindungen, die die Fluoresceingruppe an den Vorläufer in Figur 2 kuppeln, wenn Figur 2 für einen Tracervorläufer steht.
Die Figuren 5 bis 19 zeigen verlschiedene Beispiele für Tracerstrukturen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Figuren 20 bis 26 zeigen verschiedene Beispiele von Strukturen von Haptenreaktanden, die zur Ausbildung der Immunogene verwendet werden, die bei der vorliegenden Erfindung zum Einsatz gelangen.
Figur 27 zeigt eine allgemeine Strukturformel für die Tracer, die in Ubereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie auch der Klassen der Reaktanden, die zu deren Herstellung verwendet werden.
Figur 28 zeigt ein bevorzugtes Immunogen, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Figur 29 zeigt das am meisten bevorzugte Immunogen, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Figur 30 zeigt den am meisten bevorzugten Tracer der vorliegenden Erfindung.
Figur 31 zeigt einen bevorzugten Tracer der vorliegenden Erfindung.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden nun mit Bezugnahme auf die Figuren eingehend diskutiert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung von Fluorescein und von Fluoresceinderivaten. Insbesondere ist die Fluoreszenz des Fluoresceins eine notwendige Eigenschaft des Fluoresceins und seiner Derivate für deren Nützlichkeit als Tracerverbindungen für die vorliegende Erfindung. Fluorescein existiert in zwei tautomeren Formen, die in Figur 3 dargestellt sind, in Abhängigkeit von der Säurekonzentration (pH) der Umgebung. In der offenen (sauren) Form liegt eine Anzahl konjugierter Doppelbindungen vor, die dieser Form des Fluoresceins (und Verbindungen, die eine Fluoresceingruppe enthalten) die Fähigkeit zur Absorption von blauem Licht und zur Emission von grünem Fluoreszenzlicht nach einer Lebensdauer des angeregten Zustandes von ungefähr vier Nanosekunden erteilen.
Wenn die offene und die geschlossene Form nebeneinander vorliegen, kann die relative Konzentration der Moleküle in der offenen und in der geschlossenen Form leicht durch Einstellung des pH-Wertes verändert werden. Im allgemeinen existieren die Tracerverbindungen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, in Lösung als biologisch verträgliche Salze, wie etwa als Natrium-, Kalium-, Ammoniumsalz und dergleichen, so daß die Verbindungen in der offenen fluoreszenten Form vorliegen können, wenn sie bei den analytischen Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Das besondere anwesende Salz hängt von dem Puffer ab, der verwendet wird, um den pH-Wert einzustellen. Zum Beispiel liegen in Anwesenheit eines Natriumphosphatpuffers die Verbindungen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Verwendung verwendet werden, im allgemeinen in der offenen Form, als Natriumsalz, vor.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "Fluorescein" sowohl als einzelne Verbindung oder auch als Bestandteil einer größeren Verbindung, daß sowohl die offene als auch die geschlossene Form umfaßt wird, wenn diese für ein besonderes Molekül existieren, außer im Kontext mit der Fluoreszenz. Es ist eine offene Form notwendig, damit die Fluoreszenz auftritt.
Die Numerierung der Kohlenstoffatome des Fluoresceinmoleküls variiert in Abhängigkeit davon, ob die offene oder geschlossene Form des Moleküls betrachtet wird. Infolgedessen ist die Literatur in Bezug auf Fluorescein und seine Verbindungen im Hinblick auf die Numerierung der Kohlenstoffatome nicht einheitlich. In der geschlossenen Form wird der para-Kohlenstoff in Bezug auf das Carbonyl des Lactons am Phenylring mit 6 bezeichnet. In der offenen Form wird das para-Kohlenstoffatom an der Carbonsäuregruppe am Phenylring mit 5 bezeichnet (siehe Figur 3). Im Rahmen dieser Offenbarung wird die Numerierung der geschlossenen Form angewendet, weil die Ausgangsmaterialien, die bei den Synthesen verwendet werden, zumeist nach diesem System numeriert werden. Das Kohlenstoffatom des Fluoresceins und seiner Verbindungen, das der Carboxylgruppe gegenüber liegt, wird daher für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung mit "6" bezeichnet.
Ein Tracer in Lösung, der nicht an Antikörper komplexiert ist, kann in weniger als der Zeit, die für die Absorption und die Reemission von Fluoreszenzlicht benötigt wird, rotieren. Als Ergebnis ist das reemittierte Licht relativ zufällig orientiert, sodaß die Fluoreszenzpolarisation eines Tracers, der nicht an Antikörper komplexiert ist, niedrig, nahezu Null ist. Bei der Komplexierung mit einem spezifischen Antikörper nimmt der so ausgebildete Tracer-Antikörperkomplex die Rotation des Antikörpermoleküls an, die langsamer als diejenige des relativ kleinen Tracermoleküls ist, wodurch die beobachtete Polarisation zunimmt. Wenn daher ein Ligand mit dem Tracer um Antikörperstellen konkurriert, nimmt die beobachtete Polarisation der Fluoreszenz der resultierenden Mischung von freiem Tracer und Tracer-Antikörperkomplex einen Mittelwert zwischen demjenigen des Tracers und demjenigen des Tracer- Antikörperkomplexes an. Wenn eine Probe eine hohe Konzentration des Liganden enthält, ist der beobachtete Polarisationswert demjenigen des freien Tracers näher, das heißt, er ist niedrig. Wenn die Testprobe eine niedrige Konzentration des Liganden einschließt, ist der Polarisationswert demjenigen des gebundenen Tracers näher, d. h. er ist hoch. Indem die Reaktionsmischung eines Immunoassays mit vertikal und dann mit horizontal polarisiertem Licht angeregt wird, und indem allein die Vertikalkomponente des emittierten Lichtes analysiert wird, kann die Polarisation der Fluoreszenz in der Reaktionsmischung genau bestimmt werden. Das genaue Verhältnis zwischen Polarisation und Konzentration des Liganden, der bestimmt werden soll, wird durch Messung der Polarisationswerte von Eichlösungen mit bekannten Ligandkonzentrationen bestimmt. Die Konzentration des Liganden in einer Probe kann aus einer Standardkurve, die auf diese Weise erhalten wurde, extrapoliert werden.
Es ist festgestellt worden, daß die besonderen Antikörper und Tracer, die hierin offenbart sind, sehr gute Assays ergeben.
Vor der hier beschriebenen Erfindung wurde das Problem der Entwicklung eines immundiagnostischen Tests mit breiter Barbituratspezifität (d.h. mit Spezifitätsmangel oder mit einer einheitlicheren Kreuzreaktivität des Antikörpers, der im Immunoassay verwendet wird, und der für den Liganden und den Tracer für gemeinhin verwendete Barbiturate, wie diejenigen, die in Figur 1 gezeigt sind, spezifisch ist) dadurch gelöst, daß viele Antiseren von denen jedes für ein Barbiturat spezifisch ist, mit einer Patientenprobe vermischt wurden. Diese Vermischung von Antikörpern mit unterschiedlichen Barbituratspezifitäten führt zu einem Assay, der den wesentlichen Nachteil einer geringeren Sensitivität, einer geringen Kreuzreaktivität und einer großen Schwankung von Ansatz zu Ansatz in Bezug auf die Antiserummischung aufweist.
Die hierin beschriebene Erfindung hat die oben beschriebenen Probleme gelöst. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß ein immundiagnostischer Test mit breiter Barbituratspezifität entwickelt werden konnte, wenn man monoklonale oder polyklonale Antikörper, die gegen nur eine Barbituratstruktur gezüchtet worden waren, in einer immunkompetitiven Umgebung in einer geeigneten Kombination mit Tracern (fluoreszenzmarkierten Barbituratderivaten) verwendete. Es wurde herausgefunden, daß die optimale Kombination ein Immunogen und ein Tracer mit fünfgliedrigen Ringstrukturen war. Bei dem Assay der vorliegenden Erfindung wurde diese breite Barbituratspezifität dadurch erzielt, daß der Tracer und die Immunogene, die zur Erzeugung der Antikörper verwendet wurden, die im Antiserum enthalten sind, derart ausgelegt wurden, daß (1) die Tracer und die Immunogene beide chemische Strukturen aufweisen, die in Bezug auf gemeinhin verwendete Barbiturate ähnlich sind; und daß (2) die Antikörper, die in dem Antiserum enthalten sind, eher kreuz-reaktiv als spezifisch für den Tracer sind, und daher mit geringerer Affinität an den Tracer binden, so daß die Bindung der Antikörper an den Tracer verdrängt zu werden vermag. Die verschiedenen Barbiturate in der Probe weisen die Fähigkeit zur ähnlichen Verdrängung des Tracers vom Antikörper auf, was zu einem gleichwertigeren Nachweissystem für die verschiedenen gemeinhin verwendeten Barbiturate führt. Es war völlig unvorhersehbar, welche Kombination aus Antikörper und Tracer zu einem immundiagnostischen Test mit breiter Barbituratspezifität führen würde. Daher waren die günstigen Ergebnisse, die aus gewissen Experimenten, welche derartige Kombinationen und nicht etwa andere umfaßten, infolgedessen völlig unerwartet.
Infolgedessen weicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung signifikant von der verwandten Technik ab, die im Stand der Technik beschrieben ist, insofern, als daß die Polyspezifität der immunologischen Reagenzien des Immunoassays im allgemeinen dadurch erzielt wird, daß zwei unterschiedliche Barbituratderivate verwendet werden, um die beiden wesentlichen immunologischen Reagenzien des Assays, d. h. den Tracer und den Antikörper zu erzeugen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugt ein einheitlicheres Barbituratnachweissystem, insofern als daß es die unübliche Fähigkeit aufweist, in ähnlicherer Weise auf ein großes Barbituratspektrum anzusprechen. Darüberhinaus überwindet das Verfahren die Ungewißheit der im Stand der Technik beschriebenen Assays in Bezug auf die oben beschriebene immunologische Reaktivität, die aus der Vermischung vieler immunologischer Reagenzien resultiert. Darüberhinaus ist die breite Spezifität des Immunoassays der vorliegenden Erfindung derjenigen der Assays überlegen, die in gewissen Kits enthalten sind, die derzeit auf dem Markt erhältlich sind, und mit denen Barbiturate in biologischen Proben untersucht werden. Infolgedessen liefert der Immunoassay der vorliegenden Erfindung ein schnelleres und genaueres Barbituratassayverfahren als die Verfahren, die im Stand der Technik beschrieben oder andersartig der Öffentlichkeit offenbart sind, insofern als daß er: (1) keine Probenbehandlung vor der Analyse erfordert; (2) eine Breitspektrumbarbituratspezifität aufweist; (3) die Anwesenheit eines oder mehrerer Barbiturate in einer Probe genau bestimmt, weil die Antikörperspezifität den Nachweis von anscheinend allen Verbindungen, die von barbituratartigen Verbindungen verschieden sind, ausschließt; (4) die weitere Analyse von Proben mit nichtverifizierbaren Barbituratkonzentrationen aufgrund von hohen Konzentrationsüberschätzungen aufgrund geringer Kreuzreaktivität unter den gemeinhin verwendeten Barbituraten ausschließt; und als daß (5) er ein homogener Assay ist und daher im Gegensatz zu heterogenen Immunoassayverfahren der gebundene Tracer nicht von dem ungebundenen Tracer vor der Aufnahme der Endpolarisationsablesungen abgetrennt werden muß.
Der Immunoassay der vorliegenden Erfindung ist daher besonders vorteilhaft, insofern, als daß er zum Nachweis eines breiten Spektrums an Barbituratwirkstoffen in Körperflüssigkeiten verwendet werden kann, ohne daß die im Stand der Technik beschriebenen Probleme (geringere Sensitivität, geringe Kreuzreaktivität und eine große Ansatz-zu-Ansatz- Variabilität der Antiserummischungen) auftreten. Solch ein Immunoassay ist zur Verwendung als Screeningassay wünschenswert, weil es bei einem Barbituratscreeningassay wünschenswert ist, daß der darin verwendete Antikörper mit jeder barbituratartigen Verbindung auf äquivalente Weise reagiert, und weil er eine breite Anwendbarkeit in der forensischen Medizin, in der klinischen Medizin und bei industriellen Bestimmungen aufweist.
Die Reagenzien und das Reagenzienkit.
Die Immunogene und Tracer, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch die allgemeine Strukturformel dargestellt werden, die in der Zusammenfassung der Erfindung angegeben ist.
Eine Aufgabe des neuen Verfahrens der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge an Barbiturat in einer Probe ist die Errichtung von Konkurrenz zwischen dem Barbiturat und dem Tracer um die Erkennungsstellen des Antikörpers. Es sind große Strukturveränderungen bei den Haptenen und Tracern zum Lösen dieser Aufgabe erlaubt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die "Haptene" die Vorläufer der Immunogene, die allgemein ein substituiertes Barbituratderivat umfassen, das eine Gruppe trägt, die zur Bindung an einen immunologisch aktiven Träger geeignet ist.
Das neue Reagenzienkit der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten umfaßt ein Salz eines ersten Tracers der Formel, die in Figur 27 gezeigt ist, worin W, R¹, R³, Fl und R&sup4; die in der Zusammenfassung der Erfindung angegebene Bedeutung haben, und Antikörper, die monoklonal oder polyklonal sind, die gegen ein Immunogen gezüchtet worden sind, das die Struktur aufweist, die in Figur 2 gezeigt ist, worin W, R¹, R², Q und R ebenfalls definiert sind, wie in der Zusammenfassung der Erfindung. Im allgemeinen werden die Antikörper gegen ein Immunogen gezüchtet, das eine Struktur aufweist, die derjenigen der gemeinhin verwendeten Barbiturate ähnelt, und der Tracer weist eine Struktur auf, die derjenigen der gemeinhin verwendeten Barbiturate ähnelt, dessen Struktur aber derjenigen des Immunogens unähnlich ist. Vorzugsweise umfaßt das Reagenzienkit ebenfalls eine Menge an Riboflavinbindungsprotein, die zur Verminderung der Fluoreszenz-interferenz durch Riboflavin wirksam ist. Obwohl der am meisten bevorzugte Tracer zur Verwendung im Reagenzienkit der Tracer ist, der in Figur 30 gezeigt ist, sind die am meisten bevorzugten Antikörper zur Verwendung in dem Kit diejenigen, die gegen das Immunogen gezüchtet worden sind, das in Figur 29 gezeigt ist. Die am meisten bevorzugte Kombination von Tracer und Antiseren zur Verwendung in dem Kit sind die Kombination von Tracer, der in Figur 30 gezeigt ist, mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die gegen das in Figur 29 gezeigte Immunogen erzeugt wurden.

Die Struktur der Immunopene.

Verwendbare Antikörper können aus einer Vielzahl von Barbituratderivaten erzeugt werden Immunogene, die aus Verbindungen hergestellt sind, die in der 5-Position am Ring funktionalisiert sind, können Antikörper in Tieren erzeugen; solche Antikörper sind in einem Barbituratassay gemäß der Erfindung nützlich, wenn sie mit dem geeigneten Tracer vereinigt werden.
Die Immunogene, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weisen die allgemeine Strukturformel auf, die in Figur 2 gezeigt ist, und in der bevorzugten Form der Erfindung sind die Immunogene ebenfalls aus der allgemeinen Strukturformel abgeleitet, die in Figur 2 gezeigt ist. Das am meisten bevorzugte Immunogen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist in Figur 29 gezeigt. Die Immunogene können hergestellt werden, indem eine Verbindung der in Figur 2 gezeigten Klasse mit einer Poly(Aminosäure) oder einem Derivat einer Poly(Aminosäure) oder einem anderen immunologisch aktiven Träger gekuppelt wird, wie dies im Zusammenhang mit dem synthetischen Verfahren und den Beispielen unten diskutiert wird.
Obwohl Thyroglobulin die Poly(Aminosäure) ist, die in der am meisten bevorzugten Form des Immunogens verwendet wird, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist offensichtlich, daß verschiedene Proteinträger verwendet werden können, einschließlich Albuminen, Serumproteinen, beispielsweise Globulinen, Augenlinsenproteinen, Lipoproteinen und dergleichen. Beispielhafte Proteinträger umfassen zusätzlich zum Thyroglobulin, Thyroxinbindungsglobulin, Rinderserumalbumin, Napfschneckenhemocyanin ("Keyhole limpet hemocyanin"), Ei-Ovalbumin, Rindergammaglobulin usw.. Alternativ können synthetische Poly (Aminosäuren) mit einer ausreichenden Anzahl von verfügbaren Carboxylatgruppen wie etwa Aspartate verwendet werden, wie ebenfalls viele andere synthetische oder natürliche polymere Substanzen, die reaktive funktionelle Gruppen tragen. Zusätzlich können Kohlenhydrate, Hefen, Polysaccharide oder jede andere Substanz, die als immunologischer Träger verwendet werden kann, an das Hapten konjugiert werden, um ein Immunogen zu erzeugen.
Die meisten der Immunogene, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen eine
-CH&sub2;-, -CH= oder eine -O NH- Gruppe, die das Hapten an den immunogen aktiven Träger bindet, derart daß die Bindung, die direkt die R-Variable an die Q-Variable in der in Figur 2 gezeigten chemischen Formel bindet, eine andere als eine Peptidbindung ist. Ein Vorteil dieser Immunogene, der im Stand der Technik noch nicht offenbart ist, ist daß die nichtpeptidischen Bindungen, die den Haptenbestandteil der Immunogene direkt an den immunogen aktiven Trägerbestandteil der Immunogene der vorliegenden Erfindung binden, extrem stabil sind. Infolge dessen sind die Immunogene wesentlich stabiler als die Immunogene, die im Stand der Technik offenbart sind, wie etwa von Yamaoka et al., J. Immunological Methods 28:51 (1979). Anders als die von Yamaoka et al., beschriebenen Peptidbindungen sind die bei vielen der neuen Immunogene der vorliegenden Erfindung verwendeten Bindungen in einer biologischen Umgebung wesentlich weniger hydrolyseempfindlich. Beispielsweise zeigen die Figuren 21, 22 und 23 der Zeichnungen neue funktionalisierte Haptene, die eine chemische Jodacetamidgruppe enthalten, und die an immunogen aktive Träger bei einem basischen pH angekuppelt werden können, so daß eine nicht-peptidische Bindung ausgebildet wird. Die Figuren 24, 25 und 26 zeigen jeweils Haptene, die an immunogen aktive Träger mittels dem Verfahren der reduktiven Aminierung gekuppelt werden können, mit dem Ergebnis, daß eine nicht-peptidische Bindung ausgebildet wird.
Ein bevorzugtes Immunogen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung weist die in Figur 28 gezeigte Struktur auf. Das am meisten bevorzugte Immunogen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist das in Figur 29 gezeigte.

Die Struktur der Tracer.

Die möglichen Varianten bei den Strukturen der Tracer, die in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden, sind sogar noch zahlreicher als die möglichen Varianten bei der Struktur der Haptene. Die Tracer, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, weisen die allgemeine Strukturformel auf, die in Figur 27 gezeigt ist, worin W, R¹, R³, Fl und R&sup4; so definiert sind, wie dies in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben ist. Bei einer bevorzugten Form der Kits Strukturformel auf, die in Figur 5 gezeigt ist. Ein bevorzugter Tracer der vorliegenden Erfindung ist in Figur 31 gezeigt. Der am meisten bevorzugte Tracer der vorliegenden Erfindung ist in Figur 30 gezeigt.
Der Tracer ist ein Barbituratderivat, das an ein Fluoresceinderivat mittels beispielweise einer Amino-, Amidino-, Triazinylamino-, Carbamido-, Thiocarbamido-, Carbamoyl-, Thiocarbamoyl- oder Sulfonylcarbamoylgruppe, wie in Figur 4 gezeigt, gebunden ist. Die Tracer werden hergestellt, indem das geeignete Fluoresceinderivat an ein Barbituratderivat gebunden wird, das eine Amino-, Carboxylsäure-, Sulfonsäure-, Mercapto-, Hydroxy-, Imidat-, Hydrazid-, Isocyanat-, Thioisocyanat-, Chlorformat-, Chlorthioformat-, Carboxylchlorid-, Chlorsulfonylcarbamoylgruppe oder eine ähnliche Gruppe enthält, wie dies im Zusammenhang mit dem synthetischen Verfahren und den Beispielen unten diskutiert wird.
Beispielsweise können alle die folgenden Fluoresceinderivate verwendet werden:
Fl-CH&sub2;-NH&sub2; Aminomethylfluorescein
Fl-NH&sub2; Fluoresceinamin
Fl-CO&sub2;H Carboxyfluorescein
Fl-NHCOOH&sub2; 1 α-Jodacetamidofluorescein
Fl-NHCOCH&sub2;Br α-Bromacetamidofluorescein
2,4-Dichlor-1,3,5- triazin-2-ylaminofluorescein (DTAF)
4-Chlor-6-methoxy-1,3,5-triazin-2-ylaminofluorescein
Fl-NCS Fluoresceinthioisocyanat
Es wurde unerwarteterweise gefunden, daß die Anwesenheit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung zwischen der Fluoresceingruppe und den Barbituratringanteilen des Tracers, der in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, in vorteilhafter Weise den Tracer zur optimalen Wechselwirkung mit dem Antikörper ausrichtet. Daher haben die Tracer, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eine Ethylen- (-CH=CH-) Bindung zwischen dem Fluorescein und dem Ligandenbestandteil des Tracers, und daher besitzen sie zwei unerwartete und vorteilhafte Eigenschaften: (1) eine größere Stabilität; und (2) eine verminderte Wechselwirkung zwischen dem Fluorescein (oder dem Fluoresceinderivat) und der Ligandenkomponente des Tracers und infolgedessen eine gesteigerte Fähigkeit zur Bindung an Antikörper.
Die erste Eigenschaft, nämlich daß die Tracer überraschenderweise hochstabil sind, was anscheinend von der Doppelbindung in der Linkergruppe hervorgerufen wird, wird durch die Werte bewiesen, die in Tabelle 1 gezeigt sind. Tabelle 1
(Keine Ethylenbindung)
(Ethylenbindung)
Die oben gezeigten Werte zeigen an, daß ein Tracer, der eine Ethylen- (-CH=CH-) Linkergruppe- zwischen dem Fluorescein und der Ligandkomponente des Traqers aufweist (untere Hälfte der Tabelle) eine wesentlich größere Stabilität bei wechselnden Temperaturen als - ein Tracer besitzt, dem eine solche Ethylenbindungsgruppe fehlt (obere Hälfte der Tabelle). Während die Stabilität des Tracers, der eine Ethylenlinkergruppe enthält, an den Tagen 1 und 7 bei beiden Temperaturen von 2-8º und 45º C ungefähr äquivalent ist, ist der Tracer, dem eine solche Linkergruppe fehlt, am 7. Tag bei einer Temperatur von 2-8º C um 30% weniger stabil, und im wesentlichen die gesamte Bindungskapazität ist am 7. Tag bei einer Temperatur von 45º C verloren gegangen (über 80% der Polarisation).
Während Verbindungen, denen eine Doppelbindung fehlt, eine Lebensdauer von ungefähr 12 Stunden aufweisen, so daß sie 12 Stunden nach ihrer Synthese instabil sind, bleiben Verbindungen, die eine Doppelbindung enthalten, für einen wesentlich längeren Zeitraum stabil. Die in den Tabellen 2(a) und 2(b) gezeigten Werte unten zeigen an, daß ein Tracer, der eine Ethylen- (- CH=OH-) Linkergruppe zwischen dem Fluorescein und der Ligandkomponente des Tracers aufweist, bei wechselnden Temperaturen für einen Zeitraum von wenigstens eineinhalb Jahren stabil bleibt. Während ein Tracer mit der chemischen Struktur, die in Figur 5 gezeigt ist, zur Erzeugung der Werte verwendet worden ist, die in Tabelle 2(a) gezeigt sind, wurde ein Tracer mit der in Figur 30 gezeigten chemischen Struktur zur Erzeugung der Werte verwendet, die in Tabelle 2(b) gezeigt sind. Diese Werte zeigen an, daß der Tracer über diesen langen Zeitraum stabil ist. Tabelle 2(a) Tabelle 2 (b)
Esgibt einen zweiten wesentlichen Vorteil im Hinblick auf die Verbindungen, die eine Doppelbindung enthalten, verglichen mit denjenigen, welchen eine solche Doppelbindung fehlt. Bei den Verbindungen, die keine Doppelbindung enthalten, tritt ein wesentliches Ausmaß an Wechselwirkung zwischen dem Fluorescein (oder dem Fluoresceinderivat) und dem Ligandenbestandteil der Verbindung ein, mit dem nachteiligen Ergebnis, daß die Fähigkeit der Ligandenkomponente, an den Antikörper in einem Immunoassay zu binden, erniedrigt wird. Im Gegensatz dazu besitzen die Verbindungen, die eine Doppelbindung enthalten, eine daraus resultierende starre Stereochemie. Daher kommt es zu wenig Wechselwirkung zwischen dem Fluorescein (oder dem Fluoresceinderivat) und dem Ligandenbestandteil, so daß der Ligandenbestandteil frei bleibt, um an den Antikörper in einem Immunoassay zu binden.

Die Antikörper.

Die Antikörper, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden hergestellt, indem eine Immunantwort in Schafen auf die oben beschriebenen Immunogene hervorgerufen wird. Das Immunogen wird den Tieren oder in vitro Kulturen immunkompetenter Zeller mittels einer Reihe von Animpfungen auf eine dem Fachmann gut bekannte Weise verabreicht. Es ist offensichtlich, daß, obwohl Schafe die bevorzugten Immunwirte für Barbituratimmunogene in den hier beschriebenen Experimenten waren, jeglicher in vivo- oder in vitro-Wirt verwendet werden kann, der zur Erzeugung von Antikörpern gegen die hierin vorgestellten Strukturen fähig ist.
Die am meisten bevorzugten Antikörper zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die gegen das Immunogen gezüchtet sind, das in Figur 29 gezeigt ist.

Die Synthese der Immunopene.

Die Immunogene, die hier offenbart sind, werden hergestellt, indem ein Hapten, wie etwa das durch die allgemeine Struktur nach Figur 2 gezeigte, in dem X gleich Chlorformat, Aldehyd, Carbonsäure, Amino, Chlorid, Bromid, Jodid oder Hydroxy ist, an eine Poly(Aminosäure) oder einen anderen immunologisch aktiven Träger gekuppelt wird. Die Poly(Aminosäure) oder die andere Trägergruppe kann an das Hapten über eine Carbamat-, Amido-, Thioether-, Ether-, Diazo- oder Aminobindung gebunden werden. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Poly(Aminosäure) Thyroglobulin, und das Immunogen weist die in Figur 29 aufgezeigte Struktur auf.
Die Immunogene werden hergestellt, indem ein Hapten, das eine Aldehyd-, Carbonsäure-, Amino-, Chlor-, Brom-, Jod-, Hydroxid- oder Jodacetonylgruppe enthält, an eine Poly(Aminosäure) oder einen anderen immunologisch aktiven Träger gekuppelt wird. Der Aldehyd kann gekuppelt werden, indem eine Schiff'sche Base mit der Poly(Aminosäure) oder der Aminogruppe eines anderen immunologisch aktiven Trägers ausgebildet wird. Die Schiff'sche Base wird unmittelbar mit Natriumcyanoborhydrid reduziert, wobei sich die stabile Aminomethylbindung ausbildet. Die Aktivierung der Carboxylsäuregruppen auf der Poly(Aminosäure) kann mittels Vermischen des Haptens und der Poly (Aminosäure) mit 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDO), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DDC), 1- Oyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid; Methyl-p- toluolsulfonat oder dergleichen erreicht werden. Die Hydrazidvariante wird auf die gleiche Weise gekuppelt wie die nicht-aromatische Aminovariante. Alkyl-, Chlor-, Brom- und Jodderivate und Sulfonatester alkylieren die phenolischen Hydroxylgruppen von Tyrosinresten auf dem Trägerprotein unter stark alkalischen Bedingungen unter Ausbildung von Alkylarylethern, und sie alkylieren den Schwefel freier Sulfhydrylgruppen von Cystein unter Ausbildung von Thioethern. Die für diese Reaktionen bevorzugten Derivate sind die Jodacetonyle und Jodide.
Die Synthesen der obigen Haptene (Immunogenvorläufer) werden auf eine von zwei allgemeinen Weisen vollzogen. Figur 2 zeigt eine Immunogenvorläuferklasse in Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens.
Die Herstellung geht von der Alkylierung eines geeigneten substituierten Malonats oder Cyanoacetatesters mit einem Bromalkylalkohol aus, der eine geschützte Alkoholfunktion aufweist, vorzugsweise Tetrahydropyranylether. Die Zyklisierung einer solchen Zwischenstufe mit Harnstoff kann vollzogen werden, indem die Reaktantenmischung in Lösung mit einer Base wie etwa Magnesiummethoxid, Magnesiumethoxid, Natriummethoxid, Natriumethoxid oder Kalium-t-butoxid behandelt wird. Die geschützte Funktion wird entschützt und die Verbindung wird an die Poly(Aminosäure) oder einen anderen Träger gekuppelt.
5-Jodacetonylbarbituratvorläufer von Immunogenen werden aus geeigneten 5,5-disubstituierten Barbituraten (wie in Figur 2 gezeigt) hergestellt, die eine 5-Alkengruppe mit einer terminalen Doppelbindung tragen, indem sie mit Jodid in Wasser umgesetzt werden. Die 3-Hydroxyjodbarbiturate werden auf diese Weise hergestellt. Die entsprechenden α-Jodacetonylbarbiturate werden aus diesen mittels Oxidation mit auf Chrom beruhenden Oxidantien wie etwa Jones' Reagenz oder dergleichen erhalten.
Die Aldehyde können aus geeigneten 5-Alkenylbarbituraten (Figur 2), die eine terminale Doppelbindung tragen, durch Ozonolyse in Methanol bei -78º C hergestellt werden. Ein anderer bevorzugter Weg zum Erhalt der Aldehyde (Figur 2) ist die Umsetzung eines geeignet substituierten Malonatesters oder Cyanoacetatesters mit einem Bromalkylaldehyd, der eine geschützte Aldehydfunktion, vorzugsweise als Acetal, aufweist. Die Zyklisierung einer solchen Zwischenstufe mit Harnstoff kann mittels Behandlung der Mischung der Reaktanten in Lösung mit einer Base wie etwa Natriumethoxid, Natriummethoxid, Kaliummethoxid oder Kalium-t-butoxid erreicht werden. Die geschützte Funktion wird freigesetzt, und die Verbindung wird an die Poly(Aminosäure) öder den anderen Träger gekuppelt.
Die Carbonsäuren werden durch Oxidation geeigneter Aldehyde mit auf Chrom beruhenden Oxidationsmitteln wie etwa Jones Reagenz oder dergleichen erhalten.
Ein bevorzugter Weg zur Synthese von Carboxyalkylbarbituraten oder Carboxyalkenbarbituraten ist die Umsetzung geeigneter 5-substituierter Barbiturate (Figur 2) mit Halogenalkylestern oder Halogenalkenylestern in der Anwesenheit von Basen wie etwa Triethylamin, Natriumhydrid, Kalium-t-butoxid und gefolgt von der Hydrolyse von geeigneten Barbituratestern mit einer Mineralsäure wie etwa konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, 40%iger Schwefelsäure oder dergleichen.
Die Alkylhalogenide können durch Behandlung von Alkoholen mit Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Jodwasserstoff oder mittels Behandlung mit halogenierenden Reagenzien wie etwa Thionylchlorid hergestellt werden. Diese Halogenide kuppeln sich unter relativ neutralen Bedingungen direkt an freie Sulfhydrylgruppen oder an Träger oder, unter stark basischen Bedingungen, an Phenole, wie etwa diejenigen der Tyrosylreste in einer Poly(Aminosäure).

Die Synthese der Tracer.

Die Struktur eines bevorzugten Tracers zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist in Figur 5 gezeigt. Ein bevorzugter Tracer der vorliegenden Erfindung ist in Figur 31 gezeigt. Die Struktur des am meisten bevorzugten Tracers der vorliegenden Erfindung ist in Figur 30 gezeigt.
Die Tracer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden durch Kupplung einer Fluoresceingruppe oder eines Derivates von Fluorescein an die allgemeine Struktur, die in Figur 27 gezeigt ist, worin W, R¹, R³, Fl und R&sup4; die in der Zusammenfassung der Erfindung definierte Bedeutung haben, hergestellt.
Die Fluoresceingruppe kann an die funktionelle Amino-, Carboxyl-, Aldehyd-, Säurechlorid-, Imidat- oder Alkoxygruppe mittels einer Amid-, Amin-, Harnstoff-, Thiohärnstoff-, Carbamat-, Thiocarbamat, Triazinylamino- oder Sulfonylcarbamatbindung gebunden sein, wie dies in Figur 4 gezeigt ist. Bei der derzeitig bevorzugten Ausführungsform ist das Fluoresceinderivat Aminomethylfluorescein, und dieses wird an einen Vorläufer gekuppelt, der in Figur-27 gezeigt ist, worin R¹ gleich (Methyl)butyl oder 1-Methylpropyl yst, und worin R³ gleich -CH&sub2;, -COOH oder -OH&sub2;-CH=CH-CO&sub2;H ist. Das geeignete Carboxyalkenylbarbiturat wird an Aminoethylfluorescein gekuppelt, indem zuerst ein gemischtes Anhydrid der Carbonsäure des Barbiturates ausgebildet wird. Das gemischte Anhydrid wird mit Isobutylchlorformat hergestellt. Das bevorzugte Verfahren verwendet Dimethoxyethan.
Andere Aktivierungsgruppen wie Säurechlorid, 1- Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol und 2- Ethyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat können verwendet werden; und andere Lösungsmittel wie etwa Tetrahydrofuran, N,N- Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Hexamethylenphosphoramid können verwendet werden. Die Reaktanten werden vorzugsweise unter Bedingungen zur Ausbildung von Amidbindungen gekuppelt, und es wird am meisten bevorzugt, daß das "gemischtes-Anhydrid- Verfahren" verwendet wird. Verwendungsfähige Tracer können aus einer Vielzahl von Barbituraten hergestellt werden.
Alle Barbiturate, die eine terminale Aminogruppe aufweisen, wie etwa Amino, Hydrazinyl, Hydrazido oder dergleichen werden an Carboxyfluorescein gemäß dem "aktivierter-Ester-Verfahren" oder dem "gemischtes-Anhydrid-Verfahren" gekuppelt, und sie werden an Fluoresceinisothiocyanat, DTAF oder Alkoxy-DTAF einfach durch Mischen der beiden Substanzen in Lösung gekuppelt. Die Aminogruppe kann in eine Isocyanat- oder Thioisocyanatgruppe überführt werden, indem sie mit Phosgen bzw. Thiophosgen umgesetzt wird. Diese werden dann mit Aminomethylfluorescein unter Erzeugung des Tracers kondensiert.
Alle Barbiturate, die eine terminale Aldehydgruppe aufweisen, werden an Aminomethylfluorescein mittels reduktiver Aminierung mit Natriumborhydrid gekuppelt.
Alle Barbiturate, die eine terminale Hydroxygruppe aufweisen, können an Fluorescein mittels Reaktion mit Phosgen, gefolgt von Aminomethylfluorescein, DTAF, α-Jodacetamidofluorescein, α-Bromacetamidofluorescein oder Fluoresceinisothiocyanat in Lösung gekuppelt werden. Alle Barbiturate, die eine 5-Jodacetonylgruppe aufweisen, werden an Aminomethylfluroescein unter Erzeugung des Tracers gekuppelt.
Es sollte beachtet werden, daß ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Entdeckung umfaßt, däß die Anwesenheit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung zwischen der Fluoresceingruppe und dem Barbituratring den Tracer in vorteilhafter Weise für die optimale Wechselwirkung mit dem Antikörper ausrichtet.

Der Assay.

Die besonderen Tracer und Antikörper, die hierin offenbart sind, erzeugen überraschend gute Resultate in Fluoreszenzpolarisationsassays für Barbiturate.
Figur 1 zeigt die allgemeine Struktur einiger der Barbiturate, die quantitativ oder qualitativ in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung bestimmt werden sollen.
Der Assay der vorliegenden Erfindung liefert ein schnelleres und genaueres Barbituratassaysverfahren als die meisten Verfahren nach dem Stand der Technik, da er keine Probenbehandlung vor der Analyse erfordert und auch aufgrund der Breitspektrum-Barbituratsspezifität, die von dem Assay gezeigt wird. Das Assaysytem bestimmt genau die Anwesenheit von Barbituraten in einer Probe, weil die Antikörperspezifität den Nachweis der meisten Verbindungen verhindert, die keine barbituratartigen Verbindungen sind.
Die neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten sind in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben worden.
Die am meisten bevorzugte Form dieser Verfahren verwendet monoklonale oder polyklonale Antikörper, die gegen ein Immunogen hergestellt worden sind, das die Struktur aufweist, dia in Figur 29 gezeigt ist, mit einem Tracer, der die Struktur aufweist, die in Figur 30 gezeigt ist. Jedoch ist ein anderer bevorzugter Tracer zur Verwendung mit diesen Antikörpern ein Tracer mit der Struktur, die in Figur 31 gezeigt ist.
In Übereinstimmung mit den analytischen Verfahren der vorliegenden Erfindung, d. h. den Verfahren zur Bestimmung von Barbituraten mittels einem Fluoreszenzimmunoassayverfahren unter Verwendung der Tracerverbindungen und Immunogene, die hier offenbart sind, wird eine Probe, die Barbiturate einschließt, oder von der dies vermutet wird, mit einem biologisch verträglichen Salz eines Tracers und mit einem Antikörper, der für Barbiturate spezifisch ist, vermischt. Der Antikörper wird unter Verwendung des wie oben beschriebenen Immunogens erzeugt. Die Barbiturate und der Tracer konkurrieren um zahlenmäßig beschränkte Antikörperbindungsstellen, was zur Ausbildung von Komplexen führt. Indem die Konzentration an Tracer und Antikörper konstant gehalten wird, ist das Verhältnis von Barbiturat-Antikörperkomplex zu Tracer-Antikörperkomplex, das sich ausbildet, direkt zu der Menge an Barbituraten in der Probe porportional. Daher kann man bei Anregung der Mischung mit planar polarisiertem Licht und Messung der Polarisation der von einem Tracer und einem Tracer-Antikörperkomplex emittierten Fluoreszenz die Anwesenheit von Barbituraten in der Probe bestimmen.
Die Ergebnisse können in Einheiten von Nettomillipolarisationseinheiten und Bereichsbreite (in Millipolarisationseinheiten) angegeben werden. Die Messung der Nettomillipolarisationseinheiten gibt das Maximum der Polarisation an, wenn eine maximale Menge von Tracer an Antikörper gebunden ist, d.h. in der Abwesenheit jedweden Barbiturates. Je höher die Nettomillipolarisationseinheiten sind, umso besser ist die Bindung des Tracers an den Antikörper. Die Bereichsbreite ist die Differenz zwischen der Nettomillipolarisation, wenn der Tracer in Abwesenheit von Barbituraten maximal an den Antikörper gebunden ist und der Nettomillipolarisation, wenn der Tracer in Anwesenheit einer spezifischen Barbituratkonzentration an den Antikörper gebunden ist. Die Bereichsbreite definiert den Bereich an Ligandenkonzentration, den der Assay nachzuweisen vermag. Eine größere Bereichsbreite liefert eine bessere numerische Analyse der Werte. Die bevorzugte Antikörper-Tracerkombination weist eine Bereichsbreite von wenigstens 80 Millipolarisationseinheiten auf. Kleinere Bereichsbreiten können in Abhängigkeit von den Umständen annehmbar sein.
Der pH, bei dem das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, muß ausreichend sein, um der Fluoresceingruppe der Tracer zu erlauben, in ihrer offenen Form vorzuliegen. Der pH kann von ungefähr 3 bis 12 reichen, üblicher ist der Bereich von ungefähr 5 bis 10, und bevorzugt wird der Bereich von ungefähr 6 bis 9. Es können verschiedene Puffer verwendet werden, um den pH während des Assayverfahrens einzustellen und zu erhalten. Beispielhafte Puffer umfassen Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der besondere Puffer, der verwendet wird, ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, aber Tris und Phosphatpuffer werden bevorzugt. Der Kationenanteil des Puffers bestimmt im allgemeinen den Kationenanteil des Tracersalzes in Lösung.
Riboflavinbindungsprotein (RBP) kann zu der Probe oder zu einem oder mehreren der Assayreagenzien zugesetzt werden, um alles Riboflavin, das in der Probe vorhanden ist, als RBP- Riboflavinkomplexe zu binden, wodurch die mögliche Fluoreszenzinterferenz durch Riboflavin ausgeschaltet wird. RBP- ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 32 000, das normalerweise aus Eiweiß isoliert wird. Bei der Isolation aus dem Eiweiß enthält jedes REP-Molekül ein Riboflavinmolekül. Diese, die Holoproteinform von RBP, muß mittels Dialyse in das Apoprotein überführt werden, und zwar unter sauren Bedingungen, um das gebundene Riboflavin zu entfernen. Das RBP-Apoprotein, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist von der Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, handelsüblich erhältlich. Die verwendete Menge ist nicht kritisch, sofern eine ausreichende Menge verwendet wird, um offensichtlich alles freie Riboflavin in der Probe zu binden.
Das bevorzugte Verfahren des verbesserten Assays der vorliegenden Erfindung wird nun eingehend diskutiert. Der Assay ist ein "homogener Assay", was bedeutet, daß die Endpolarisationsablesungen aus einer Lösung vorgenommen werden, in der der gebundene Tracer nicht von dem ungebundenen Tracer abgetrennt wird. Dies ist ein deutlicher Vorteil gegenüber heterogenen Immunoassayverfahren, wie etwa solchen, bei denen der gebundene Tracer von dem ungebundenen Tracer abgetrennt werden muß, bevor eine Ablesung vorgenommen werden kann.
Die Reagenzien für das Fluoreszenzpolarisationsassay der vorliegenden Erfindung umfassen Antikörper für Barbiturate und Barbiturattracer. Zusätzlich werden wünschenswerter Weise herkömmliche Lösungen einschließlich einer Vorbehandlungslösung, einem Verdünnungspuffer, Barbiturateichlösungen und Barbituratkontrollösungen hergestellt. Typische Lösungen dieser Reagenzien, von denen einige unten beschrieben sind, sind handelsüblich in Assaykits von Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois erhältlich.
Für den am meisten bevorzugten Assay der vorliegenden Erfindung, sind alle hier angegebenen Prozentsätze in Gewicht/Volumen ausgedrückt, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Tracerformulierung, die derzeitig bevorzugt wird, ist 150 nanomolar an Tracer in: 0,1 molar Phosphatpuffer bei pH 6,2; 5% Natrium-5-sulfosalicylat; 0,1% Natriumazid; und 0,01% Rindergammaglobulin. Die Antiserumformulierung umfaßt Schafantiserum, das mit folgendem verdünnt ist: 0,1 molar Trispuffer bei pH 7,5; 0,1% Natriumazid; 0,1% Rindergammaglobulin; und 2% Ethylenglycol (Volumen/Volumen). Der Verdünnungspuffer umfaßt folgendes: 0,1 molar Natriumphosphat bei pH 7,5; 0,1% Natriumazid; und 0,01% Rindergammaglobulin. Die Vorbehandlungslösung umfaßt folgendes: 0,01% Rindergammaglobulin; 0,1 molar Trispuffer bei pH 7,5; 0,1% Natriumazid und 10mg/ml Riboflavinbindungsprotein. Barbiturateichlösungen, die Secobarbital in Normalhumanurin bei Konzentration von 0,0, 200, 400, 700, 1200 und 2000 Nanogramm pro Milliliter mit 0,1% Natriumazid als Konservierungsstoff umfassen, sind nützlich. Barbituratkontrollösungen, die Secobarbital in Nomalhumanurin umfassen, werden in Konzentrationen von 300, 800 und 1500 Nanogramm pro Milliliter mit 0,1% Natriumazid als Konservierungsstoff zur Verfügung gestellt und sind ebenfalls nützlich.
Das bevorzugte Verfahren ist insbesondere zur Verwendung in Zusammenhang mit dem Abbott TDx Clinical Analyzer und dem Abbott ADx Drugs of Abuse System ausgelegt, die beide von Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois erhältlich sind. Eine minimale Menge von fünfzig Mikroliter Urin ist notwendig. Die Eichlösungen, Kontrollösungen oder unbekannten Proben werden direkt in die Probenvertiefung der TDx - oder ADx -Probepatrone einpipettiert. Einer der Vorteile dieser Vorgehensweise ist, daß die Probe keiner besonderen Vorbereitung bedarf. Das Assayverfahren ist von diesem Punkt an völlig automatisiert.
Wenn ein manueller Assay durchgeführt wird, wird die Probe mit der Vorbehandlungslösung in Verdünnungspuffer vermischt und es wird eine Hintergrundablesung vorgenommen. Der Tracer und der Antikörper werden dann in der Testlösung vermischt. Nach der Inkubation wird eine Fluoreszenzpolarisationsablesung vorgenommen.
Der Nettofluoreszenzpolarisationswert einer jeder Eichlösung, Kontrollösung oder Probe wird bestimmt und wird auf dem Ausgabeband eines Instrumentes wie etwa dem Abbott TDx Analyzer ausgedruckt. Zuvor ist in der Vorrichtung eine Standardkurve erzeugt worden, indem die Polarisation einer jeden Eichlösung gegenüber ihrer Konzentration unter Anwendung einer nicht-linearen Regressionsanalyse aufgetragen wurde. Die Konzentration einer jeden Kontrollösung oder Probe wird aus der gespeicherten Eichkurve abgelesen und auf dem Ausgabeband ausgedruckt.
Unter Bezugnahme auf das obige bevorzugte Verfahren sollte bemerkt werden, daß der Tracer, der Antikörper, die Vorbehandlungslösung, die Eichlösungen und die Kontröllösungen zwischen ungefähr 2º C und ungefähr 8º C gelagert werden sollten, während der Verdünnungspuffer bei Raumtemperatur aufgehoben werden sollte. Eine Standardkurve und Kontrollösungen sollten alle zwei Wochen durchgemessen werden, wobei jede Eichlösung und jede Kontrollösung zwei mal gemessen werden sollte. Alle Proben können doppelt gemessen werden.
Es ist offensichtlich, daß die obige eingehende Beschreibung der Erfindung und die folgenden Beispiele als die Erfindung veranschaulichend, aber nicht als diese einschränkend zu betrachten sind, was den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung angeht. Viele Abwandlungen sind für den Fachmann offensichtlich und daher wird beabsichtigt, den Schutzumfang der Erfindung allein durch die beigefügten Ansprüche zu definieren.

BEISPIELE

Beispiele 1 bis 3 beschreiben Experimente, die in Übereinstimmung mit den Konzepten der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden sind. Beispiele 1 bis 3 und 25 sind auf die Herstellung auf Immunogenen gerichtet, die zur Herstellung von Antikörpern nützlich sind; die Beispiele 4 bis 8 sind auf die Synthese von Vorläufern für Immunogene und Tracer gerichtet; und die Beispiele 9 bis 24 und 26 sind auf die Herstellung von Tracern gerichtet. Beispiel 24 beschreibt die Herstellung des am meisten bevorzugten Tracers der vorliegenden Erfindung; und Beispiel 25 beschreibt die Herstellung des am meisten bevorzugten Immunogens zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

5-(1-Methylbutyl)-5-(β-hydroxy-γ-jodpropyl)barbitursäure

5g (0,022mol) 5-(1-Methylbutyl)-5-(allyl)barbitursäure in 180ml Wasser wurden unter Rückflußkühlung auf 75-85º C erwärmt. Zu der Reaktionsmischung wurde 6g Jodid während eines Zeitraums von 2 Stunden in kleinen Mengen zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde gerührt und 7 Stunden lang erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und ausgefällt. Die Kristalle wurde auf einer Büchnerfritte abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde aus Ethanol (50ml) umkristallisiert, wobei man 5,57g des gewünschten Materials erhielt.

5-(1-Methylbutyl)-5-jodacetonylbarbitursäure

1 g 5-(1-Methylbutyl)-5-(β-hydroxy-γ-jodpropyl)barbitursäure wurde in 75ml Aceton gelöst. 30ml einer 0,33 molaren Lösung an Kaliumdichromat in 10% Schwefelsäure wurden zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und danach mit 200ml Ethylacetat extrahiert, mit gesättigter wässeriger Kochsalzlösung und Wasser gewaschen und die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Ethylacetat wurde im Vakuum entfernt und der rohe Feststoff wurde aus 70%igem Ethanol umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 519mg an farblosen Kristallen des gewünschten Produktes.

Kupplung von 5-(1-Methyl)jodacetonylbarbitursäure an Rinderserumalbumin

226mg BSA ("Rinderserumalbumin, Bovine Serum Albumin") wurden in 4,7ml Phosphat (Puffer 0,1 molar, pH 8) und 520µl N,N'-Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 152mg 5- (1-Methylbutyl)-5-jodacetonylbarbitursäure in 530µl DMF zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 36 Stunden lang gerührt. Die resultierende Lösung wurde erschöpfend gegenüber Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei man 208mg des gewünschten Konjugates erhielt.

Beispiel 2

1-Bromethyltetrahydropyranylether

Zu 2-Bromethanol (1259, 1,0 Äquivalente), das auf einem Eisbad gekühlt wurde, wurde p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (katalytische Menge) zugesetzt. Dihydropyran (939, 1,1 Äquivalente) wurde tropfenweise unter Rühren unter einer Argonatmosphäre zugesetzt. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktion 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Rückstand wurde mittels Destillation über eine kurze Kolonne gereinigt, wobei man ungefähr 125g Produkt erhielt.

Phenyltetrahydropyranyloxyethyldiethylmalonat

Zu Diethylphenylmalonat (76ml, 1,0 Äquivalente) in DMF wurde NaH (13,1g, 1,0 Äquivalente, 64,14%ige Mineralöldispersion) zugesetzt. Die Reaktion wurde ½ Stunde bei 50º C gerührt und dann wurde 1-Brom-2-tetrahydropyranylethanol (80ml, 1,5 Äquivalente) zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde bei 60º C 18 Stunden lang geruhrt. Die Reaktionsmischung wurde neutralisiert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mittels Destillation über eine kurze Säule gereinigt, wobei man ungefähr 469 Produkt erhielt.

THP-Hydroxyethylphenobarbital

Magnesiumspäne (3,7g, 1,2 Äquivalente) wurden in trockenem Methanol unter einer Argonatmosphäre gelöst. Das THP-Malonat (46g, 1,0 Äquivalente) und Harnstoff (9,9g, 1,3 Äquivalente) wurden zusammen in trockenem Methanol gelöst und dann zu der Magnesiumlösung hinzugegeben. Nach 48-stündigem Kochen am Rückfluß wurde zusätzlicher Harnstoff (9,9g, 1,3 Äquivalente) und Magnesiummethoxid (3,79 Mg 1,2 Äquivalente) zugesetzt. Nach weiterem 24-stündigem Kochen unter Rückfluß wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in 5%iger wässeriger HCl aufgenommen und dann mit Ether extrahiert. Das Produkt wurde aus der etherischen Phase entfernt und aus Ether/Hexan umkristallisiert, wobei man ungefähr 139 Substanz erhielt.

5-Phenyl-5-hydroxyethylbarbitursäure

THP-Hydroxyethylphenobarbital (19g) wurde in Essigsäure:Wasser (50/50) unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wurde am Rückfluß gekocht und die Entschützung wurde dünnschichtchromatographisch ("TLC", thin layer liquid chromatography) (Silicagel, 10:90, Methanol:Methylenchlorid) beobachtet. Als sich die Reaktion vervollständigt hatte, wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde aus Ethanol:Wasser auskristallisiert. Die Ausbeute betrug 8,7Gramm des Produkts als weißes Pulver.

Konjugation von 5-Phenyl-5-hydroxyethylbarbitursäure an BSA

Hydroxyethylphenylbarbital (500mg) wurde in trockenem frisch destilliertem THF (10ml) suspendiert. Phosgen wurde unter Rühren 15 Minuten lang in die Lösung eingeleitet, gefolgt von Argon, das in die Lösung eingeleitet wurde, um das überschüssige Phosgen zu entfernen. Nach 15 Minuten wurde das THF unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde mit Ethylether zerrieben. Nach dem Trocknen betrug die Ausbeute ungefähr 520mg an Produkt als weißes Pulver.
Zu einer Lösung von BSA.(500mg, 1,0 Äquivalente) in 0,1N, (pH 8) Phosphatpuffer (7ml) wurde zunächst DMF (3ml) zugesetzt, und dann wurde zu der resultierenden Lösung das Chlorformat von Hydroxyethylphenobarbital (50mg) zugesetzt, das in THF (1ml) aufgelöst worden war. Das Chlorformat wurde unter heftigem Rühren zugesetzt, und die Reaktion wurde zusätzliche 3 Stunden lang gerührt.
Die Lösung wurde gereinigt, indem eine PID-Säule verwendet wurde, wobei mit destilliertem Wasser eluiert wurde. Es wurden zwei Peaks gesammelt, wobei der erste loomg an Produkt enthielt, und der zweite 400mg. Eine Untersuchung mit ultraviolettem Licht zeigte an, daß beide Proben Protein und Phenobarbital enthielten.

Beispiel 3

Diethyl-2-(1-methylbutyl)malonat

Natriummetall (5,24g, 0,23g-Atome) wurde mit 25ml absolutem Ethanol umgesetzt. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise unter Rühren Diethylmalonat (36,0ml, 0,24mol) zugesetzt. Die Lösung wurde zum Rückfluß erhitzt und 2-Brompentan (29,0ml, 0,23mol) wurde tropfenweise zugesetzt. Nach dem Kochen am Rückfluß über Nacht wurde die Reaktion gekühlt und das Ethanol wurde an einem Rotavapor entfernt. Das- Produkt wurde mit Wasser gewaschen, mit MgSO&sub4; getrocknet und fraktioniert destilliert, wobei man 35,7g des gewünschten Produktes erhielt.

Diethyl-2-(1-methylbutyl)-2-(5-pentenyl)malonat

Kaliummetall (1,719, 0,049-Atome) wurde mit 30ml wasserfreiem t-Butylalkohol umgesetzt. Die Reaktion wurde dann auf 75º C erhitzt und Diethyl-2-(1-Methylbutyl)-malonat (10,03g, 0,04mol) wurde tropfenweise zugesetzt. Nach 4-stündigem Kochen am Rückfluß wurde 1-Brom-5-Penten (6,4g, 0,04mol) tropfenweise unter Rühren zugesetzt. Die Reaktion wurde über Nacht am Rückfluß gekocht und sie wurde dann in Wasser eingegossen und mit Ether extrahiert. Die etherischen Extrakte wurden mit MgSO&sub4; getrocknet und der Ether wurde an dem Rotavapor verdampft, wobei man das gewünschte Material erhielt.

5-(1-Methylbutyl)-5-(pentenyl)barbitursäure

Natriummetall (0,98g, 0,04g-Atome) wurde mit Methanol (15ml) umgesetzt, gefolgt von der Zugabe von Harnstoff (5,14g, 0,09mol). Diethyl-2-(1-methyl-butyl)-2-(5-pentenyl)malonat (6,08g, 0,02mol) wurde dann zugesetzt. Nach zweitägigem Kochen am Rückfluß wurde das Methanol abdestilliert. Der Rückstand wurde in 1N Natriumhydroxidlösung gelöst, mit Ether extrahiert und dann mit Chlorwasserstoffsäure sauer gemacht, wobei ein weißer Niederschlag der Barbitursäure entstand.

5-(4-Butanal)-5-(1-methylbutyl)barbitursäure

Ozon wurde durch eine Lösung obigen Barbiturats in Methanol bei -78º C hindurchgeleitet. Nachdem die Lösung blau geworden war, wurde Stickstoff eingeleitet, um überschüssiges Ozon zu entfernen. Dimethylsulfid wurde dann zugesetzt, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden dann unter Vakuum unter Erzeugung von 0,62g des gewünschten Aldehyds entfernt.

Konjugation obigen Aldehyds an BSA

Zu einer Lösung von 25ml Wasser wurden 5ml Dimethylformamid und 5ml Ethanol wurden 188mg BSA zugesetzt. Der pH der Lösung wurde auf 6,2 eingestellt, und obiger Aldehyd (18,6mg, 0,07mmol) wurde zugesetzt. Nach einstündigem Rühren wurde Natriumcyanoborhydrid (472mg, 7,5mmol) zugesetzt, und die Reaktion wurde über Nacht gerührt. Die Substanz wurde dann bei einem pH von 9 gegen Wasser dialysiert, und dann gegen Wasser mit einem pH von 7. Das Material wurde dann gefriergetrocknet, wobei man 113mg des Barbitursäure - BSA-Konjugates erhielt.

Beispiel 4

5-(1-Methylbutyl)-5-formylmethylbarbitursäure

In eine Lösung von Natriumsecobarbital (5,30g, 22,2mmol) in Methanol wurde eine Ozonstrom; eingeleitet, bis die Lösung eine Einleiten von Stickstoff in die Reaktion entfernt worden war, wurde Dimethylsulfid (14ml) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, bevor die Lösungsmittel an einem Rotavapor entfernt wurden. Der Aldehyd wurde dann auf präparativen Silicagelplatten gereinigt, wobei Ethylacetat:Hexan (1:1) verwendet wurde.

Beispiel 5

Dimethyl-2-(3-methylcyclohexyl)malonat

Natriummetall (7,02g, 0,30g-Atome) wurde mit wasserfreiem Methanol (250ml) umgesetzt. Dazu wurde dann Dimethylmalonat (70ml) tropfenweise zugesetzt, während die Reaktionstemperatur bei 50º C gehalten wurde Zu dieser Lösung wurde dann tropfenweise 3-Methylcyclohexylbromid (54,0g, 030mol) zugesetzt, und die Reaktion wurde über Nacht am Rückfluß gekocht. Das Metanol wurde an einem Rotavapor entfernt und das verbleibende Material wurde zwischen Ether und Wasser verteilt. Die etherische Phase wurde abgetrennt, mit MgSO&sub4; getrocknet und verdampft, wobei man ein gelbes Öl erhielt. Die Destillation der Substanz bei 95-106º C und 1,2mm Hg Druck ergab ein klares Öl.

Dimethyl-2-(5-hexenyl)-2-(3-methylcyclohexyl)malonat

Zu einer Aufschlämmung von Natriumhydrid (2,53g, 0,06mol) in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (50ml) wurde tropfenweise Dimethyl-2-(3-methylcyclohexyl)malonat (14,46g, 0,06mol) zugesetzt. Nach der Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktion weitergerührt, bis keine Wasserstoffgasentwicklung mehr stattfand. Nach dieser Reaktion wurde dann tropfenweise 1-Brom- 6-hexen zugesetzt (10,33g, 0,06mol), gefolgt von Rühren. Der Reaktionsforschritt wurde mittels analytischer Chromatographie unter Verwendung von Silicaplatten und Ethylacetat:Hexan (40:60) verfolgt. Nachdem sich die Reaktion vervollständigt hatte, wurde Wasser (20ml) zugesetzt, und der Großteil der Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt. Die verbleibende Substanz wurde zwischen Wasser und Ether verteilt, und die etherische Phase wurde zweimal mit Wasser gewaschen. Die etherische Lösung wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und verdampft, wobei man ein dickes gelbes Öl erhielt. Das Produkt wurde dann bei 127-134º C und 0,4mm Druck destilliert, wobei man ein klares Öl erhielt.

5-(3-Methylcyclohexyl)-5-(5-hexenyl)barbitursäure

Natriummetall (1,249, 0,05g-Atome) wurde mit absolutem Ethanol (75ml) umgesetzt. Nachdem die Reaktion vervollständigt war, wurde Harnstoff (5,16g, 0,08mol) gefolgt von der Zugabe obigen Malonats (6,67g, 0,02mol) zugesetzt. Nach sechzigstündigem Kochen am Rückfluß wurde das Ethanol verdampft und die Substanz wurde zwischen Wasser (pH 4) und Ethylacetat verteilt. Das Ethylacetat wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und verdampft, wobei man eine weiße gummiartige Substanz erhielt. Die Substanz wurde dann an präparativen Silicaplatten gereinigt, wobei Ethylacetat/Hexan (40/60) verwendet wurde, und wobei man die gereinigte Barbitursäure erhielt.

5-(3-Methylcyclohexyl)-5-formylbutylbarbitursäure

Ozon wurde in eine Lösung obiger Barbitursäure (40mg, 0,13mmol), die in Methanol (20ml) gelöst war, eingeleitet, bis die Lösung blau wurde. Stickstoff wurde in die Lösung eingeleitet, um uberschüssiges Ozon zu entfernen, und es wurde Dimethylsulfid (2ml) zugesetzt. Nach dem Rühren über Nacht wurden die Lösungsmittel entfernt, wobei man den gewünschten Aldehyd als weißes gummiartiges Material erhielt.

Beispiel 6

Sec-Butyldimethylmalonat

Natriummetall (6,9g) wurde mit 120ml wasserfreiem Methanol umgesetzt. Zu dieser Lösung wurde 39,6g (0,3mol) Dimethylmalonat zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde am Rückfluß gekocht und 2-Brombutan (41,1g, 0,3mol) wurde zugesetzt. Nach 16-stündigem Kochen am Rückfluß wurde die Reaktionsmischung gekühlt und das Methanol wurde im Vakuum entfernt. Das Produkt wurde mit Ethylether extrahiert und dann mit Wasser und mit zur Hälfte gesättigter wässeriger Kochsalzlzsung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach der Entfernung des Ethylethers mittels Verdampfung im Vakuum wurde das rohe Öl destillativ fraktioniert, wobei man 249 des gewünschten Produktes (Siedepunkt 95-105º C/15mm Hg) erhielt.

5-sec-Butylbarbitursäure

110ml wasserfreies Ethanol wurde mit 7,72g Natriummetall umgesetzt. Danach wurden 17,6g (0,1mol) Dimethyl-sec Butylmalonat zugesetzt, gefolgt von (nach ungefähr 5 Minuten) Harnstoff (6,729). Die Reaktionsmischung wurde 15 Stunden lang am Rückfluß gekocht, und es wurden 60ml Ethanol abdestilliert. 200ml Wasser wurden zum Rückstand zugesetzt, gefolgt von 20ml konzentrierter Schwefelsäure. Die ausgefallenen Kristalle wurden abfiltriert. Das Produkt wurde dann aus Wasser umkristallisiert, wobei man 8g an farblosen Kristallen erhielt.

5-sec-Butyl-5-(carbethoxy-1-propylen)barbitursäure

In einem 100ml 2-Halskolben wurden 265mg (6,625mmol) Natriumhydrid (60%ige ölige Suspension) eingebracht. Das Natriumhydrid wurde mit Hexan gewaschen, und dann wurden 1219mg 5 sec-Butylbarbitursäure in 5ml THF zugesetzt, gefolgt von 50ml Dimethylformamid. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden lang gerührt, und dann wurden 912µl Ethylbromcrotonat zugesetzt, gefolgt von 900mg wasserfreiem Kaliumjodid. Die Reaktionsmischung wurde 48 Stunden lang am Rückfluß gekocht und danach am Rotavapor zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat extrahiert, mit Wasser gewaschen, mit 5%igem Natriumbisulfit und mit gesättigter wässeriger Kochsalzlösung, und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das Rohmaterial wurde mittels Säulenchromatographie an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat als Laufmittel gereinigt. Die Ausbeute betrug 78% des gewünschten Produktes.

5-sec-Butyl-5-(carboxy-1-propylen)barbitursäure

152mg 5-sec-Butyl-5-carbethoxy-1-propylenbarbitursäure in 15ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure wurde 45 Minuten lang am Rückfluß gekocht. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockne eingedampft, wobei man das gewünschte Produkt als farblose Kristalle erhielt. (Ausbeute 95%, Smp. 168-171º C).

Beispiel 7

250mg 5-(1-Methylbutyl)-5-carbethoxymethylbarbitursäure in 25ml konzentrierter Ohlorwasserstoffsäure wurde 45 Minuten lang am Rückfluß gekocht. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und dann wurden die ausgefällten Kristalle abfiltriert. Die Umkristallisation aus Wasser ergab lgomg an farblosen Kristallen (Smp. 238-240º C)

Beispiel 8

200mg 5-(1-Methylbutyl)-5-carbethoxypropylbarbitursäure wurde 1 Stunde lang am Rückfluß mit 25ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure gekocht. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der feste Rückstand wurde aus Wasser umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 120mg an farblosen Kristallen, Smp. 189-192º C.

Beispiel 9

Kupplung von 5-sec-Butyl-5-carboxy-1-Dreoyienbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

26,8mg (0,1mmol) 5-sec-Butyl-5-carboxy-1-propylenbarbitursäure wurde in 0,3ml wasserfreiem DMF gelöst, und zu dieser Lösung wurde 20mg von Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 0,3ml DMF zugesetzt, gefolgt von 11,5mg N-Hydroxysuccinimid in 0,3ml DMF. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach 30 Minuten wurden 42mg Aminomethylfluorescein zugesetzt. Nach 20 Stunden wurde die Reaktionsmischung am Rotavapor zur Trockne eingedampft und mittels Säulenchromatographie an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 10

Kupplung von 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxy-1-propylenbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, indem von 28,2mg (0,1mmol) 5-(1-Methylbutyl)-5- carboxycrotonoylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 11

Kupplung von 5-Isopropyl-5-(carboxy-1-propylen)barbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 21,4mg 5-Ethyl-5-carboxymethylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimd und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde.
Das Produkt wurde mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 12

Kupplung von 5-Ethyl-5-carboxymethylbarbitursäure an Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 21,4mg 5-Ethyl-5-carboxymethylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde chromatographisch an Silicagel gereinigt, wobei Ethylacet:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel verwendet wurde.

Beispiel 13

Kupplung von 5-sec-Butyl-5-carboxymethylbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 24mg 5-sec-Butyl-5-carboxymethylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde mittels präparativer Dünnschichtchromatographie (PTLC, "preparative thin layer chromatography") an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 14

Kupplung von sec-Butyl-5-carboxyethylbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese verbindung wurde gemäß dem verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 26mg 5-sec-Butyl-5-carboxyethylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde mittels PTLC an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 15

Kupplung von 5-sec-Butyl-5-carboxypropylbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 28mg 5-sec-Butyl-5-carboxypropylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde mittels PTLC unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 16

Kupplung von 5-sec-Butyl-5-carboxybutylbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 29mg 5-sec-Butyl-5-carboxybutylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde.
Das Produkt wurde mittels PTLC an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 17

Kupplung von 5-1-(Methylbutyl)-5-carboxymethylbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 24mg 5-(1-Methylbutyl)-5- carboxymethylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde mittels PTLC an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 18

Kupplung von 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxyethylbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 25g 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxyethylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde mittels PTLC an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 19

Kupplung von 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxypropylbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 26,5mg 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxypropylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexylcarbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde mittels PTLC an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 20

Kupplung von 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxybutylbarbitursäure mit Aminomethylfluorescein

Diese Verbindung wurde gemäß dem Verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 28mg 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxybutylbarbitursäure, 11,5mg N-Hydroxysuccinimid, 20mg Dicyclohexyl carbodiimid und 42mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde. Das Produkt wurde mittels PTLC an Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 21

Konjugation von 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxymethylbarbitursäure an Fluoresceinamid (Isomeres)

Zu 5-(1-Methylbutyl)-5-carboxymethylbarbitursäure (58,3mg) wurde Thionylchlorid (2ml) zugesetzt, und die Lösung wurde 1,5 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Überschüssiges Thionylchlorid wurde im Vakuum entfernt und das Öl wurde gekühlt. Zu diesem wurde eine Losung von Fluoresceinamid (Isomer 1) in trockenem Pyridin (1ml) zugesetzt. Die Chromatographie der Substanz an präparativen Silicagelplatten unter Verwendung von Ethylacetat:Essigsäure (100:0,2) ergab den gewünschten Tracer.

Beispiel 22

Konjugation von 5-(3-Methylcyclohexyl)-5-carboxybutyl barbitursäure

Diese verbindung wurde gemäß dem verfahren nach Beispiel 9 hergestellt, wobei von 21mg 5-(3-Methylcyclohexyl)-5- carboxybutylbarbitursäure, 6,9mg N-Hydroxysuccinimid, 19,9mg Dicyclohexylcarbodiimid und 24mg Aminomethylfluorescein ausgegangen wurde.

Beispiel 23

Konjugation von 5-(1-Methylbutyl)-5-formylmethylbarbitursäure an Aminomethylfluorescein

Zu einer Lösung von 2ml Wasser und 2ml Methanol bei pH 6 wurde 5-(1-Methylbutyl)-5-formylmethylbarbitursäure (141mg, 0,58mmol) und Aminomethylfluorescein (210mg, 0,58mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde durch die tropfenweise Zugabe von N,N-Dimethylformamid vervollständigt. Wacht 1-stündigem Rühren wurde Natriumcyanoborhydrid (38,8mg) auf einmal zugegeben. Nach nächtlichem Rühren wurden die Lösungsmittel verdampft und die Substanz wurde an präparativen Umkehrphasenplatten (Silicagel) unter Verwendung von Methanol/Wasser/Trifluoressigsäure als Laufmittel gereinigt.

Beispiel 24

Diethylcyclopentylmalonat (Herstellung des am meisten bevorzugten Tracers nach Figur 30)

Zu einer Lösung von 4,69 (0,2mol) Natriummetall in 80ml absolutem Ethanol wurde 30,4ml (0,2mol) Diethylmalonat zugesetzt. Nach kurzem Rühren der resultierenden Mischung erschien ein dicker weißer Niederschlag. Zu dieser Suspension wurde 21,4ml (0,2mol) Cyclopentylbromid zugesetzt. Die Mischung wurde 12 Stunden lang erwärmt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Der größte Teil des Ethanols wurde am Rotavapor entfernt, und der resultierende Rückstand wurde mit 250ml Wasser verdünnt und mit 3 X 100ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Destillation über eine 6'' Vigreux-Kolonne bei 6mm Hg lieferte 32,2329 einer farblosen Flüssigkeit mit einem Siedepunkt von 122-125º C.

5-Cyclopentylbarbitursäure

Zu einer Lösung von 3,48g (151mmol) Natrium in 50ml absolutem Ethanol wurden 3,02g (50mmol) Harnstoff und 10g (44mmol) Diethylcyclopentylmalonat, wie oben hergestellt, zugesetzt. Die dicke weiße Aufschlämmung, die sich ausbildete, wurde 12 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Der größte Teil des Ethanols wurde am Rotavapor entfernt, und der Rückstand wurde mit 100ml Wasser verdünnt und mit 10ml 98%iger H&sub2;SO&sub4; angesäuert. Der resultierende weiße Feststoff, der sich ausbildete, wurde mittels Filtration abgetrennt und an einer Pumpe getrocknet. Der Feststoff wurde aus Wasser umkristallisiert, dann wurde er ein zweites Mal aus 5% Wasser/Ethanol umkriställisiert, wobei man 7,006g farbloser plättchenartiger Kristalle mit einem Smp. von 222-223º C erhielt.

5-Cyclopentyl-5-Fethoxycarbonyl)-2-propenyl]barbitursäure

Eine Lösung,von 200mg (1,02mmol) der Barbitursäure, die in dem unmittelbar oben beschriebenen Experiment hergestellt worden war, in einer Mischung von 1,0ml Tetrahydrofuran und 1,0ml Dimethylformamid wurde zu einer Suspension von 32mg (80%ige Dispersion in Mineralöl, 1,07mmol) Natriumhydrid zugesetzt, das zuvor mit 3 X 5ml Pentan gewaschen worden war, in 1,0ml Dimethylformamid. Nach 1-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde 168µl (1,22mmol) Ethyl-4-bromcrotonat, zugesetzt, die Reaktion wurde auf 70º C aufgewärmt und 12 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt, am Rotavapor aufkonzentriert, mit Ethylacetat verdünnt und mit 2 × 1ml Wasser gewaschen. Die Lösung wurde über MgSO&sub4; getrocknet und aufkonzentriert. Die Chromatographie an einer 1 × 18cm Säule, die mit Hexan gepackt worden war und jeweils mit 50ml 10%ig, 20%ig, 30%ig, 50%ig und 70%ig Ethylacetat/Hexan eluiert wurde, lieferte 297mg eines klaren blaß-gelben Öls.

5-Cyclodentyl-5-[3-carboxy-2-propenyl]barbitursäure

Zu einer Lösung von 292mg (0,94mmol) des in dem Experiment zuvor hergestellten Esters in 1,0ml Dimethoxyethan wurde 5,0ml einer 15%igen H&sub2;SO&sub4; Lösung in Wasser zugesetzt. Die Mischung wurde 45 Minuten lang am Rückfluß erhitzt und gekühlt. Die Lösung wurde zu einem dicken Öl aufkonzentriert, mit Ethylacetat verdünnt, und mit 2 × 1ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über MgSO&sub4; und nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhielt man 246mg eines blaß-weißen Feststoffes. Der Feststoff wurde in 6ml Wasser gekocht und gekühlt, wobei man 132mg eines weißen Feststoffes mit einem Smp. von 226-227º C erhielt, der auskristallisierte und mittels Filtration abgetrennt wurde.

5-[3-[(2a-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxyl-2-propenyl]-5- cyclopentylbarbitursäure

Zu einer gekühlten Lösung (0º C) von 7,8mg (27µmol) der im vorigen Experiment hergestellten Säure in 300µl Dimethoxyethan wurden 3,6µl (27µmol) Isobutylchlorformat zugesetzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur aufgewärmt und 1,3 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde erneut auf 0º C abgekühlt und eine zweite Lösung von 10,9mg (27µmol) Aminomethylfluorescein hydrochlorid und 7,6µl (54µmol) Triethylamin in 200µl Dimethylformamid wurde zugesetzt, und die Lösung wurde auf Raumtemperatur aufgewärmt und 12 Stunden lang gerührt. Die Lösungsmittel wurden abgepumpt und der Rückstand wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie mit 80% Methanol/Chloroform als Laufmittel gereinigt. Die Elution der Hauptfluoreszenzbande mit 10% Methanol/Chloroform lieferte nach der Aufkonzentrierung 10,2mg eines orangen Feststoffes.

Beispiel 25

Diethylcyclodentenylmalonat (Herstellung des am meisten bevorzuaten Immunogens - nach Figur 29)

Zu 1749 (2,63mol) an frisch depolymerisiertem Cyclopentadien, das bei -78º C gekühlt und erhalten wurde, wurden 87,59 (2,Smol) gasformige HCl zugesetzt. In der Zwischenzeit wurden 152ml (1,0mol) Diethylmalonat zu einer Lösung von 21,49 (0,93mol) Natrium in 400ml absolutem Ethanol zugesetzt. Nachdem die HCl-Zugabe vervollständigt war wurde das rohe gelbe Chlorid, das auf -78º C gehalten wurde, in Portionen von 1ml zu der Malonatlösung zugesetzt. Es fand eine beträchtliche Wärmeentwicklung statt, die gelbe Farbe verschwand, und bei der Zugabe einer jeden Portion bildete sich reichlich weißer Niederschlag. Die Suspension wurde dann 17 Stunden lang gerührt, der größte Teil des Ethanols wurde am Rotavapor entfernt, und die Reaktion wurde mit 200ml Wasser gelöscht und mit 5 × 10mml Diethylether extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und zu einem klaren gelben Öl aufkonzentriert. Die Destillation eines Teils dieser Substanz bei 0,5mm Hg ergab 19,091g eines klaren grünen Öls mit einem Siedepunkt von 91-94º C.

5-(2-Cyclopentenyl)barbitursäure

Diese Barbitursäure wurde gemäß dem Verfahren hergestellt, das oben für 5-Cyclopentylbarbitursäure beschrieben ist.

5-(2-Cyclopentenyl)-5-[3-(ethoxycarbonyl)propyllbarbitursäure

Zu einer Suspension von 434mg (3,79mmol) Kaliumhydrid, das zuvor mit 3 × 5ml Hexan gewaschen worden war, in einer Mischung von 4ml Tetrahydrofuran und 17ml Dimethylformamid wurde 700mg (3,60mmol) der oben hergestellten 5-(2-Cyclopentenyl)barbitursäure zugesetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt, wonach 0,51ml (3,96mmol) Ethyl-2-brompropionat und 178mg (1,18mmol) wasserfreies Natriumjodid zugesetzt wurden. Die Lösung wurde 12 Stunden lang am Rückfluß erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlen lassen und dann 72 Stunden lang gerührt. Der Großteil der Lösungsmittel wurde am Rotavapor entfernt, und die Reaktion wurde mit Wasser gelöscht und 4 × mit 10ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Nach der Chromatographie an Silicagel unter Elution mit 5% Methanol/Chloroform erhielt man 917mg eines blaß-gelben Öls.

5-(2-Cyclopentenyl)-5-(3-carboxypropyl)barbitursäure

Zu einer Lösung von 737mg (2,51mmol) des im vorhergehenden Versuch hergestellten Esters in 2ml Tetrahydrofuran wurde eine 5%ige Schwefelsäure/Wasserlösung zugesetzt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur mehrere Tage lang gerührt. Die Reaktion wurde an einem Rotavapor aufkonzentriert, und der Rückstand wurde an Silicagel chromatographiert, wobei mit 2%, 5% und 10% Methanol/Chloroform eluiert wurde, wobei man 215mg eines weißen kristallinen Materials erhielt.

Kupplung von 5-(2-Cyclopentenyl)-5-carboxypropylbarbitursäure an Thyroglobulin

5-(2-Cyclopentenyl)-5-carboxypropylbarbitursäure wurde an Thyroglobulin als gemischtes Anhydrid gekuppelt, indem 12,65mg (4,7 x 10&supmin;&sup5;mol) an 5-(2-Cyclopentenyl)-5-carboxypropylbarbitursäure in 1,0ml p-Dioxan gelöst wurden. Zu dieser Mischung wurden 8 × 10&supmin;&sup5; Mol Triethylamin und 8 × 10&supmin;&sup5; Mol Isobutylchlorformat zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperaur 2 Stunden lang gerührt, wobei während dieser Zeit ein feiner weißer Niederschlag entstand. Diese Suspension wurde zu einer schnell gerührten Suspension von Rinderthyroglobulin (2oomg) zugesetzt, das in 11,0ml 0,05M Natriumborat, pH 9,5 gelöst war. Nach 2- stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung gegen 4 Austauschsätze (je 2 Liter) an 0,05M Natriumphosphat, pH 7,5, dialysiert. Die Dialyse wurde bei 2-8º C durchgeführt, und es vergingen wenigstens 8 Stunden zwischen jedem Wechsel des Dialysepuffers. Nach der Dialyse wurde die Endproteinkonzentration nach dem Lowry-Verfahren (J. Biol. Chem., Band 193, Seite 265-275 (1951)) bestimmt, und das Ausmaß der Substitution wurde mittels TNBS (Trinitrobenzolsulfonat-)Titration bestimmt.

Beispiel 26

Diethyl[3-methyl-2-butenyl]malonat (Herstellung eines bevorzugten Tracers - nach Figur 31)

Zu einer gekühlten Suspension (0º C) von 422mg Natriumhydrid (80%ige Dispersion in Mineralöl, 14,1mmol, zuvor mit 3 × 3ml Pentan) gewaschen in einer Mischung von 10ml Tetrahydrofuran und 5ml Dimethylformamid wurde 2,04ml Diethylmalonat (13,4mmol) zugesetzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur aufgewärmt und 0,6 Stunden lang gerührt. Prenylbromid (2,00g, 13,4mmol) wurde dann injiziert, und die Lösung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur erwärmt und dann 1 Stunde lang bei Rückfluß Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen und 12 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser gekühlt mit 10%iger wässeriger Schwefelsäure auf pH 3 angesäuert, und mit 2 × 10ml Ether extrahiert. Die vereinigten Waschflüssigkeiten wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Die Chromatographie an Silicagel bei Elution mit 4%, 7% und 10% Ether/Hexan lieferte 2,734g eines klaren farblosen Öls bei Aufkonzentration.

5-[3-Methyl-2-butenyl]barbitursäure

Zu einer Lösung von 70mg Natrium (3,03mmol) in 1,0ml absolutem Ethanol wurde 61mg Harnstoff (1,01mmol), gefolgt von 200mg Diethylprenylmalonat (0,88mmol) zugesetzt, das im vorigen Experiment erhalten worden war. Die Lösung wurde 12 Stunden lang leicht am Rückfluß gekocht. Der Großteil des Ethanols wurde am Rotavapor entfernt, und der Rückstand wurde mit Wasser verdünnt. Die Lösung wurde auf pH 3 angesäuert und mit 2 × 10ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und auf 214mg eines blaß-weißen Feststoffes aufkonzentriert.

5-[3-Methyl-2-butenyl]-5-allylbarbitursäure

Der in der vorhergehenden Reaktion hergestellt Feststoff wurde in einer Misöhung aus 0,5ml Tetrahydrofuran und 1,0ml Dimethylformamid gelöst, und es wurden 33mg Natriumhydrid (80%ige Dispersion in Mineralöl, 1,09mmol) zugesetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt. Allylbromid (0,11ml, 1,13mmol) wurde dann zugesetzt, und die Lösung wurde 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure gelöscht und auf pH 3 eingestellt und mit 3 × 10ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und aufkonzentriert. Die Chromatographie an Silicagel bei Elution mit 20%, 30% und 40% Ethylacetat/Hexan lieferte 100mg eines farblosen Öls.

5-[4-Hydroxy-3-methyl-2-butenyl]-5-allylbarbitursäure

Zu einer Lösung des Barbitursäurederivates, das im vorhergehenden Experiment hergestellt worden war (100mg, 0,42mmol) in 1,0ml Dichlormethan wurden 6mg (42µmol) Salicylsäure und 9mg (84µmol) Selendioxid zugesetzt. Die Suspension wurde auf ein Wasserbad gestellt und 0,29ml (3,8M, 1,09mmol) einer wasserfreien Lösung von tert-Butylhydroperoxid in Benzol wurde zugesetzt. Die suspension wurde dann 12 Stunden lang heftig bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde aufkonzentriert und direkt an einer Silicagelsäule chromatographiert, wobei mit 40%, 50%, 60% und 70% Ethylacetat/Hexan eluiert wurde. Zusätzlich zu ein wenig Ausgangssubstanz wie auch zu anderen Produkten wurden 21mg eines farblosen Öls isoliert.

5-[4-[(2a-Fluoresceinyl)methylaminocarbonyloxyl-3-methyl-2- butenyl]-5-allylbarbitursäure

Zu einer gekühlten (0º C) kalten Lösung von 5mg (20µmol) des Öls, das im vorhergehenden Experiment hergestellt worden war, in 200µl Tetrahydrofuran wurden 200µl einer 12%igen Lösung von Phosgen in Benzol zugesetzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur aufwärmen lassen und 0,6 Stunden lang gerührt. Die Lösungsmittel wurden am Rotavapor entfernt, und der Rückstand wurde erneut in 100µl Dimethylformamid aufgelöst, und eine Lösung von 8mg (20µmol) Aminomethylfluoresceinhydrochlorid in einer Mischung von 200µl Dimethylformamid und 5,6µl (40µmol) Triethylamin wurde zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt. Die Lösungsmittel wurden abgepumpt und der Rückstand wurde mittels Dünnschichtchromatographie gereinigt, wobei mit 10% Methanol/Chloroform eluiert wurde. Die Elution der Hauptbande mit 80% Methanol/Chloroform lieferte nach dbr Aufkonzentration 6,6mg eines orangen Feststoffes.
Von den Antikörpern gegen Barbiturate, die gegen ein Immunogen mit der in Figur 28 gezeigten Struktur gezüchtet wurden und von dem Barbiturattracer, der in Figur 5 gezeigt ist, ist herausgefunden worden, daß sie überraschend gute Ergebnisse bei Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays für Barbiturate ergeben. Die am meisten bevorzugte Kombination von Tracer und Antikörper ist jedoch die Kombination eines Tracers mit der in Figur 30 gezeigten Struktur mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die gegen ein Immunogen gezüchtet worden sind, das die in Figur 29 gezeigte Struktur aufweist.
Ein zusätzlicher Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist derjenige, daß die Sensitivität des Assays, die als die niedrigste meßbare Konzentration an Analyt definiert ist, welche von Null unterschieden werden kann, bei 95%iger Vertrauensgrenze bei ungefähr 60 ng/ml liegt, wie gegenüber Secobarbital ermittelt.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Kreuzreaktivität gegenüber einer großen Anzahl von gemeinhin verwendeten Barbituraten.
Die Kreuzreaktivität wurde gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung für gemeinhin verwendete Barbiturate überprüft. In jedem Fall wurden die Verbindungen einem Assay auf dem Abbott Laboratories TDx Olinical Analyzer oder dem ADx Drugs of Abuse System unterzogen, nachdem eine bekannte Menge (200ng/ml) der Barbiturattestverbindung einem wirkstofffreien Normalhumanurin zügesetzt worden war.
Repräsentative Kreuzreaktivitätswerte für die gemeinhin verwendeten Barbiturate unter Verwendung des Assays der vorliegenden Erfindung, wobei der Tracer die in Figur 5 gezeigte Struktur aufweist, und wobei die Antikörper gegenüber einem Immunogen mit der unten in Figur 28 gezeigten Figur gezüchtet worden sind, sind in Tabelle 3(a) unten gezeigt. Die fünf Spalten geben folgende Information:
(1) Spalte 1 - zeigt das besondere Barbiturat an, das einem Assay unterzogen wird;
(2) Spalte 2 - zeigt die Menge der Barbiturattestverbindung an, die zu dem wirkstofffreien Urin zugesetzt wurde;
(3) Spalte 3 - zeigt die Menge der Barbiturattestververbindung an, die im resultierenden Humanurin aufgefunden wurde;
(4) Spalte 4 - zeigt den Faktor an, um den das besondere Barbiturat, das getestet wird überschätzt (bei einer Zahl größer als 1,0 wie etwa 1,33) oder unterschätzt wird (bei einer Zahl kleiner als 1,0, wie etwa 0,83); und
(5) Spalte 5 - zeigt den Prozentsatz der Kreuzreaktivität an. Tabelle 3(a)
Jedes der aufgelisteten Barbiturate ist mit Secobarbital verglichen, das als Standard verwendet wurde, und von dem festgestellt worden ist, daß es eine Kreuzreaktivtität von 100% (einen Faktor von 1,0) aufweist. Ein Faktor von 1,0 zeigt an, daß der Assay die tatsächliche Konzentration der Testverbindung, die zuvor dem wirkstofffreien: Normalhumanurin zugesetzt worden war, weder überschätzte noch unterschätzte. Mit anderen Worten, wenn 2oong Secobarbital zu wirkstoffreiem Normalhumanurin zugesetzt worden waren, wurden ungefähr 200ng Secobarbital in der resultierenden Urinprobe nachgewiesen. Das bedeutet, je näher der Faktor am Wert 1,0 ist, umso genauer ist der Assay in Bezug auf die besondere analysierte Testverbindung. Dieser Faktor und der Prozentsatz an Kreuzreaktivität, die beide aus einer Ablesung vom Abbott Laboratories TDx Clinical Analyzer oder ADx Drugs of Abuse System erhalten werden können, können verwendet werden, um die Menge an Barbiturat zu ermitteln, die tatsächlich während des Assays nachgewiesen worden ist, unter Verwendung der folgenden mathematischen Formel:
Der Prozentsatz an Kreuzreaktivität, der in Spalte fünf angegeben ist, wurde gemäß der folgenden mathematischen Formel erhalten:
Prozentsatz an Kreuzreaktivität = 100x Konzentration der Testverbindung, die im resultierenden Humanurin nachgewiesen wurde / Konzentration der Testverbindung, die zu normalem wirkstofffreiem Humanurin zugegeben wurde.
Jedoch sind für die am meisten bevorzugte Ausführungsform des Assays gemäß der vorliegenden Erfindung die respräsentativen Kreuzreaktivitätswerte für die üblicherweise verwendeten Barbiturate, in denen der Tracer die in Figur 30 gezeigte Struktur aufweist, und in denen die Antikörper gegenüber einem Immunogen gezüchtet wurden, das die in Figur 29 gezeigte Struktur aufweist, in Tabelle 3(b) unten gezeigt. Tabelle 3(b)
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die niedrige Kreuzreaktivität mit nicht-Barbituratverbindungen. Die Kreuzreaktivität wurde ebenfalls mit Verbindungen getestet, die ähnliche chemische Strukturen wie die gemeinhin verwendeten Barbiturate aufweisen. Repräsentative Kreuzreaktivitätswerte, die eine geringe Kreuzreaktivität für die Verbindungen anzeigen, die ähnliche chemische Strukturen in Bezug auf gemeinhin verwendete Barbiturate aufweisen, sind in den Tabellen 4(a) (für einen Tracer mit der in Figur 5 gezeigten Struktur) und 4(b) (für einen Tracer mit der in Figur 30 gezeigten Struktur) unten gezeigt. Die fünf Spalten in den Tabellen 4(a) und 4(b) zeigen die gleiche Information an, wie dies oben für die Tabelle 3(a) beschrieben ist. Tabelle 4(a)
NN= Nicht nachgewiesen: Die Konzentration war geringer als die Sensitivität des Assays (60ng/ml) Tabelle 4(b)
Repräsentative Kreuzreaktivitätsdaten, die für Verbindungen, die ähnliche Strükturen aufweisen, wie viele der gemeinhin verwendeten Barbiturate, eine geringe Kreuzreaktivität anzeigen, wie auch gegenüber anderen Barbituraten und gegenüber barbituratartigen, Strukturen, sind in der Tabelle 5 unten für ein Immunogen gezeigt, das die Struktur nach Figur 29 aufweist und für Tracer, die Strukturen aufweisen, wie sie in den Figuren 30 und 31 gezeigt sind. Tabelle 5
NE = Nicht erhältlich Tabelle 5 (Fortsetzung) UNERWÜNSCHTE VERBINDUNGEN FÜR DIE KREUZREAKTIVITÄT
Zusätzlich wiesen die in Tabelle 6(a) gezeigten Verbindungen Kreuzreaktivitätsergebnisse für einen Tracer mit der in Figur 5 gezeigten Struktur auf, die geringer als 0,06µg/ml waren, wenn bei 1,0, 10,0 und 100,0µg/ml getestet wurde. Tabelle 6(a)
Die in Tabelle 6(b) gezeigten Verbindungen zeigten Kreuzreaktivitätsergebnisse für einen Tracer mit der Struktur nach Figur 30, die geringer als 60ng/ml waren, wenn bei 100,0µg/ml getestet wurde. Tabelle 6 (b)
* - Getestet bei 500µg/ml
** - Getestet bei 1000µg/ml
*** - Getestet bei 10µg/ml
Ein zusätzlicher Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist der Mangel an Interferenz durch Verbindungen, die üblicherweise im Urin aufgefunden werden. Der Assay der vorliegenden Erfindung (die Tracer-Struktur ist in Figur 5 gezeigt, Antikörper die gegenüber einem Immunogen mit der in Figur 28 gezeigten Struktur gezüchtet wurden), führte zu einem geringeren als 10%igen Fehler beim Nachweis von zugesetztem Wirkstoff (Verbindungen bei Konzentrationen, wie sie in Tabelle 7 angegeben sind, Verbindungen, die üblicherweise im Urin aufgefunden werden und die die Fähigkeit zur Interferenz mit allen Immunoassays wie auch demjenigen der vorliegenden Erfindung aufweisen, und die daher möglicherweise die Ergebnisse des Assays ungenau machen) wenn Wirkstoffe zu barbiturathaltigem Normalhumanurin zugesetzt wurden. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform des Assays der vorliegenden Erfindung (Tracerstruktur, wie sie in Figur 30 gezeigt ist, Antikörper, die gegen ein Immunogen mit der in Figur 29 gezeigten Struktur gezüchtet wurden), zeigten einen ähnlichen Interferenzmangel gegenüber Verbindungen auf, wie sie üblicherweise in Urin aufgefunden werden. Tabelle 7
Ein zusätzlicher Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist die geringe Verschleppung, die für Wirkstoffe zwischen den Proben (d.h. von einer Probe zur anderen) eintritt. Die Verschleppung wurde gemäß der folgenden mathematischen Formel bestimmt, nach dem eine Secobarbitallösung in Normalhumanurin bei 1195µg/ml unter Verwendung eines Tracers mit der in Figur 5 gezeigten Struktur und von Antikörpern, die gegen ein Immunogen gezüchtet worden waren, das die in Figur 28 gezeigte Struktur aufweist, auf dem Abbott Laboratories ADx Drugs of Abuse System getestet worden waren, gefolgt von einer Probe wirkstofffreien Normalhumanurins auf dem gleichen Karussel des Clinical Analyzer:
Prozentsatz an Verschleppung = 100x gemessene Konzentration an Secobarbital, das im wirkstofffreien Urin aufgefunden wurde / Konzentration der Secobarbitallösung
Es wurde festgestellt, daß die Verschleppung geringer als 0,02% war. Wenn man die Verschleppung in ähnlicher Weise nach dem Test einer ähnlichen Lösung in Normalhumanuran bei 500µg/ml mit einem Tracer bestimmte, der die in Figur 30 gezeigte Struktur aufweist, und mit Antkörpern, die gegen ein Immunogen gezüchtet wurden, das die in Figur 29 gezeigte Struktur aufweist, so war die bestimmte Verschleppung geringer als 0,03%.
Daher ist ein zusätzlicher Vorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung die Genauigkeit der Wirkstoffbestimmung. Die Genauigkeit des Assays gemäß der vorliegenden Erfindung, das einen Tracer verwendet, der die in Figur 5 gezeigte Struktur hat, und das Antikörper verweltndet, die gegen ein Immunogen gezüchtet worden sind, das die in Figur 2B gezeigte Struktur hat, war nachgewiesenermaßen ebenfalls sehr günstig. Die Reproduzierbarkeit des Assays wurde in 13 verschiedenen Durchgängen des Assays während eines Zeitraumes von 2 Wochen untersucht, indem vier wiederholte Proben jeweils von Secobarbital in Normalhumanurin bei 0,4, 0,6 und 1,0µg/ml getestet wurden. Die Konzentration jeder dieser wiederholten Proben wurde aus einer Standardkurve ermittelt, die einzeln am ersten Tag der Untersuchung aufgenommen worden war. Die Ergebnisse aus diesen Untersuchungen ergaben typischerweise Variationskoeffizienten von weniger als 6%. Repräsentative Werte sind in der Tabelle 8(a) unten gezeigt. Tabelle 8(a)
Die Reproduzierbarkeit des Assays, der einen Tracer verwendet, der die in Figur 30 gezeigte Struktur aufweist, und der Antikörper verwendet, die gegen ein Immunogen gezüchtet wurden, das die in Figur 29 gezeigte Struktur aufweist, wurde im Rahmen von 10 unterschiedlichen Assaydurchgängen während einer Zeitspanne von 2 Wochen ermittelt, indem fünf wiederholte Proben von jeweils Secobarbital in Normalhumanurin bei 300, 800 und 1500ng/ml gemessen wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen ergaben typischerweise Variationskoeffizienten von weniger als 7%. Repräsentative Werte sind in Tabelle 8(b) unten angegeben. Tabelle 8(b)
Zusätzlich wurde die Genauigkeit bestimmt, indem Abbott Laboratories ADx Systems Multiconstituent Low Control for Abused Drug Assays in jeweils dreimal wiederholten Versuchen sowohl im Kombinationsmodus als auch im Panelmodus durchgeführt wurde.
Repräsentative Werte sind in Tabelle 9(a) vorgestellt (Tracerstruktur gemäß der in Figur 5 gezeigten; Antikörper, die entgegen einem Immunogen gezüchtet wurden, das die in Figur 28 gezeigte Struktur aufweist) und in 9(b) (Tracerstruktur wie in Figur 30 gezeigt; Antikörper, wie sie entgegen Immunogenen gezüchtet wurden, die die in Figur 29 gezeigte Struktur aufweisen). Tabelle 9(a) Tabelle 9(b)
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Genauigkeit des Assays. Die Genauigkeit der Bestimmung des Assays der vorliegenden Erfindung wurde bestimmt, indem zwei Sätze an Eichlösungen hergestellt wurden, indem bekannte Menge an Secobarbital zu Normalhumanurin zugesetzt wurden, und indem.Verdünnungspuffer auf Pegel von 0,2, 0,4, 0,7, 1,2 und 2,0µg/ml bei Tabelle 10(a) und auf Pegel von 200, 400, 700, 1200 und 2000ng/ml für Tabelle 10(b) zugesetzt wurde. Es wurde eine Eichung mit den Urineichlosungen durchgeführt, und beide Eichlösungssätze wurden auf dem Abbott Laboratories TDx Clinical Analyzer unter Bezug auf diese Eichung untersucht. Der Prozentsatz an Bestimmung wurde gemäß der folgenden mathematischen Formel ermittelt:
Bestimmter Prozentsatz = 100x gemessene Konzentration in Urin / gemessene Konzentration in Puffer
Repräsentative Werte sind in Tabelle 10(a) (Tracerstruktur, wie in Figur 5 gezeigt; Antikörper gezüchtet entgegen einem Immunogen mit der in Figur 28 gezeigten Struktur) und in Tabelle 10(b) unten (Tracerstruktur wie in Figur 30 gezeigt; Antikörper, gezüchtet entgegen einen Immunogen mit der in Figur 29 gezeigten Struktur) gezeigt. Tabelle 10(a) Tabelle 10(b)
Der Assay der vorliegenden Erfindung wurde ebenfalls mit anderen Verfahren zum Nachweis von Barbituraten, wie etwa Gaschromatographie/Massenspektroskopie, Radioimmunoassay (RIA) und EMIT verglichen, indem wirkstofffreie Urinproben und Urinproben, die Barbiturate und Barbituratmetabolite enthielten, getestet wurden. Repräsentatvie Werte sind unten in Tabelle 11(a) (Tracerstruktur wie in Figur 5 gezeigt; Antikörper gezüchtet gegen einem Immunogen mit der in Figur 28 gezeigten Struktur), in Tabelle 11(b) (Tracerstruktur wie in Figur 30 gezeigt; Antikörper, gezüchtet gegen ein Immunogen mit der in Figur 29 gezeigten Struktur, verglichen mit EMIT ) und Tabelle 11(c) unten (Tracerstruktur wie in Figur 30 gezeigt, Antikörper gezüchtet gegen ein Immunogen mit der in Figur 29 gezeigten Struktur verglichen mit RIA) angegeben. Tabelle 11(a) Tabelle 11(b) Tabelle 11(c)

Claims

1. Ein Tracer nach folgender Formel:

2. Ein Tracer nach folgender Formel:

3. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem Barbituratantiserum, wobei das Barbituratantiserum monoklonale oder polyklonale Antikörper enthält, die gegen ein Immunogen nach folgender Formel gezüchtet worden sind:

und mit Tracerverbindungen nach folgender Formel:

worin

(1) W gleich Sauerstoff oder Schwefel ist;

(2) R¹ eine Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Alkinylgruppe ist, die insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die 0 bis 1 Halogenatome einschließt, und die in einer geraden oder verzweigten Kette angeordnet ist, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt;

(3) R³ gleich R&sup4;-Fl ist;

(4) Fl gleich Fluorescein oder einem Fluoresceinderivat ist; und

(5) R&sup4; eine Linkergruppe ist, die

(a) eine -CH=CH- Linkergruppe enthält, und die insgesamt 2 bis 15 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in einer geraden oder verzweigten Kette angeordnet ist, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt, wobei die Heteroatome gleich O, N, S, P oder F sind; und

(b) insgesamt von 0 bis 5 Heteroatome aufweist, wobei die Tracerverbindungen zur Erzeugung einer nachweisbaren Fluoreszenzpolarisationsantwort auf die Anwesenheit von Barbituratantiserum befähigt sind;

(b) Durchtreten-Lassen von planar polarisiertem Licht durch die aus Schritt (a) resultierende Lösung, um eine Fluoreszenzpolarisationsantwort zu erhalten; und

(c) Nachweisen der Fluoreszenzpolarisationsantwort der Lösung nach Schritt (b) als Maß für die Anwesenheit oder Menge an Barbiturat in der Probe.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei

(1) R¹ gleich einem Alkyl mit insgesamt 2 bis 7 Kohlenstoffatomen ist; und

(2) R&sup4; gleich einer Linkergruppe ist, die insgesamt 2 bis 10 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist.

5. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten, das folgende Schritte umfaßt:

wobei

(1) W gleich Sauerstoff oder Schwefel ist;

(2) R¹ gleich einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Alkinylgruppe ist, die insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die 0 bis 1 Halogenatome einschließt, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt;

(3) R² gleich R-Q ist;

(4) Q gleich einer Poly(aminosäure), einem Poly(aminosäure)derivat oder gleich einem anderen immunogen aktiven Träger ist; und

(5) R gleich einer Linkergruppe ist, die:

(a) ein -CH&sub2;-, ein -CH=, ein - -

oder ein -NH- an demjenigen Ende der Linkergruppe aufweist, das

an Q gebunden ist;

(b) die insgesamt 1 bis 20 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in einer geraden oder verzweigten Kette angeordnet ist, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt, wobei die Heteroatome gleich O, N, S, P oder F sind; und

(c) die insgesamt 0 bis 7 Heteroatome aufweist; und mit einer Tracerverbindung nach folgender Formel:

wobei die Tracerverbindungen zur Erzeugung einer nachweisbaren Fluoreszenzpolarisationsantwort auf die Anwesenheit des Barbituratantiserums befähigt sind;

(b) Hindurchtreten-Lassen von planar polarisiertem Licht durch die aus Schritt (a) resultierende Lösung, wobei eine Fluoreszenzpolarisationsantwort erhalten wird; und

(c) Nachweisen der Fluoreszenzpolarisationsantwort der Lösung nach Schritt (b) als Maß für die Anwesenheit oder Menge von Barbiturat in der Probe.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Antikörper gegen ein Immunogen mit der folgenden Struktur gezüchtet worden sind:

7. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten, das folgende Schritte umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem Barbituratantiserum, wobei das Barbituratantiserum monoklonale oder polyklonale Antikörper enthält, die gegen ein Immunogen mit folgender Formel gezüchtet worden sind:

worin:

(1) W gleich Sauerstoff oder Schwefel ist;

(2) R¹ eine Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Alkinylgruppe ist, die insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, die in einer geraden oder verzweigten Kette angeordnet ist, die 0 bis 1 Halogenatome einschließt, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt;

(3) R² gleich R-Q ist;

(4) Q gleich einer Poly(aminasäure), einem Poly(aminosäure)derivat oder gleich einem anderen immunogen aktiven Träger ist; und

(5) R gleich-einer Linkergruppe ist, die

(a) ein -CH= an denjenigem Ende der Linkergruppe aufweist, das an Q gebunden ist;

(b) insgesamt 1 bis 20 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt, wobei die Heteroatome gleich O, N, S, P oder F sind; und

(c) die insgesamt 0 bis 7 Heteroatome aufweist; und mit Tracerverbindungen nach folgender Formel:

worin:

(1) W gleich Sauerstoff oder Schwefel ist;

(2) R¹ gleich einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Alkinylgruppe ist, die insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die 0 bis 1 Halogenatome einschließt, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt;

(3) R³ gleich R&sup4;-Fl ist;

(4) Fl gleich Fluorescein oder einem Fluoresceinderivat ist; und

(5) R&sup4; eine Linkergruppe ist, die:

(a) eine -OH=CH- Linkergrupper enthält, und die insgesamt 2 bis 15 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt, wobei die Heteroatome gleich 0, N, S, P oder F sind; und

(b) insgesamt 0 bis 5 Heteroatome aufweist, wobei die Tracerverbindungen zur Erzeugung einer nachweisbaren Fluoreszenzpolarisationsantwort auf die Anwesenheit des Barbituratantiserums befähigt sind;

(b) Durchtreten-Lassen von planar polarisiertem Licht durch die resultierende Lösung aus Schritt (a) unter Erhält einer Fluoreszenzpolarisatiönsantwort; und

8. Reagenzienkit zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Barbituraten in biologischen Flüssigkeiten, das folgendes umfaßt:

(a) einen Tracer nach folgender Formel:

worin:

(1) W gleich Sauerstoff oder Schwefel ist;

(3) R³ gleich R&sup4;-Fl ist;

(4) Fl gleich Fluorescein oder ein Fluoresceinderivat ist; und

(5) R&sup4; gleich einer Linkergruppe ist, die:

(a) eine -CH=CH- Linkergruppe enthält, und die insgesamt 2 bis 15 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt, wobei die Heteroatome gleich O, N, S, P oder F sind; und

(b) insgesamt 0 bis 5 Heteroatome aufweist;

und

(b) einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der gegen ein Immunogen nach folgender Formel gezüchtet worden ist:

worin:

(1) W gleich Sauerstoff oder Schwefel ist;

(2) R¹ gleich einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, oder Alkinylgruppe ist, die insgesamt 1 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, einschließlich 0 bis 1 Halogenatomen, und die bis zu eine aliphatische oder aromatische Ringstruktur einschließt;

(3) R² gleich R-Q ist;

(5) R gleich einer Linkergruppe ist, die

(a) ein -OH-, ein -CH=, ein - -

oder ein -NH- an demjenigen Ende deü Linkergruppe aufweist, das an Q gebunden ist;

(b) die insgesamt 1 bis 20 Kohlenstoffatome und Heteroatome aufweist, die in gerader oder verzweigter Kette angeordnet ist, und die bis zu eine aliphatische oder aromatischen Ringstruktur einschließt, wobei die Heteroatome gleich 0, N, S, P oder F sind; und

(c) die insgesamt 0 bis 7 Heteroatome aufweist.

9. Reagenzienkit nach Anspruch 8, wobei im Tracer:

(1) R¹ gleich einem Alkyl ist, das insgesamt 2 bis 7 Kohlenstoffatome aufweist; und

10. Reagenzienkit nach Anspruch 8, das desweiteren eine Menge an Riboflavinbindungsprotein umfaßt, die zur Verminderung der Fluoreszenzinterferenz durch Riboflavin wirksam ist.

11. Reagenzienkit nach Anspruch 8 oder 10, wobei die Antikörper gegen ein Immunogen mit der folgenden Struktur gezüchtet worden sind:

12. Reagenzienkit nach Anspruch 8 oder 10, wobei der Tracer die folgende Struktur aufweist: