DE69126592T2

DE69126592T2 - Nicht-lineare Peptide, die hydropatisch komplementär zu bekannten Aminosäuresequenzen sind, Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon

Info

Publication number: DE69126592T2
Application number: DE69126592T
Authority: DE
Inventors: Angelo Corti; Giorgio Fassina
Original assignee: Tecnogen SpA
Current assignee: Tecnogen SpA
Priority date: 1990-10-15
Filing date: 1991-10-14
Publication date: 1998-01-08
Anticipated expiration: 2011-10-15
Also published as: EP0481930A2; EP0481930A3; EP0751225A1; DE69126592D1; DE69132567D1; EP0751225B1; ATE200107T1; ATE154609T1; EP0481930B1

Description

Die Erfindung betrifft nicht-lineare Peptide, die hydropathisch komplementär zu bekannten Aminosäuresequenzen sind, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung.
Im besonderen betrifft die Erfindung zwei oder mehrere Peptide, die hydropathisch komplementär zu bekannten Aminosäuresequenzen sind, wobei diese Peptide nicht linear an einen Aminosäurekern geknüpft sind, der zumindest eine Aminosäure mit zwei endständigen Aminofunktionen umfaßt, die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Synthese dieser Peptide sowie die Immobilisierung solcher Moleküle auffesten Trägern für die Verwendung in der in-vitro- Diagnostik, für Auftrennungen mittels Affinitätschromatographie, für analytische Verfahren zur Bestimmung von Peptidanalyten in Komplexmatrices, zum Identifizieren von Reaktionsaktivitäten mit diesen Peptiden, im besonderen proteolytische Aktivitäten, zum Identifizieren von Aktivitäten, die diese proteolytischen Aktivitäten inhibieren, in biologischen Flüssigkeiten, Fermentierungsbrühen, konditionierten Kulturnährböden, Zellextrakten, Pflanzenextrakten.
Die Hypothese, daß Interaktionsstellen zwischen Paaren von miteinander in Wechselwirkung tretenden Proteinen durch komplementäre DNA-Sequenzen codiert werden, wurde erstmals von Biro formuliert (Biro, Medical Hypothesis 7:669,1981) und dann experimentell von Blalock et al. bestätigt (Bost et al., PNAS 82: 1372,1985). Letztere konnten eine beachtliche hydropathische Komplementarität zwischen Aminosäuren zeigen, die von komplementären Codons abgeleitet sind (Blalock and Smith, BBRC, 121: 203, 1984) und zwar in den 3'-5'- oder in den 5'-3'-Richtungen (Elalock and Bost, Biochem. J., 234:679, 1986). Die ursprünglichen Beobachtungen wurden dann experimentell in einer großen Zahl von anderen biologisch bedeutenden Systemen bestätigt, die sowohl ein ex-novo-Design ermöglichen, das für Peptide durchgeführt wird, die die Fähigkeit aufweisen, mit Targetpeptiden oder Proteinen zu assoziieren, wie dies bei Fibronectin (Brentani et al., PNAS, 85:364, 1988), Insulin (Knutson, J. Biol. Chem., 263:14146, 1988) , Arg8-Vasopressin (Fassina et al., Biochemistry, 28:8811, 1989), der P-Substanz (Bost und Blalock, Methods in Enzymology, 168:16, 1989), Ribonuclease Peptid S (Shai et al., Biochemistry, 28:8804, 1989) , dem C-raf-Protein (Fassina et al., J. Biol. Chem., 264:11252, 1989) der Fall ist, als auch ermöglichen, die Kontaktstellen zwischen Proteinen und ihrem Rezeptor vorherzusagen, wie im Fall von Interleukin 2, dem Transferring und dem EGF oder Epidermalen Wachstumsfaktor (Bost et al., BBRC 28:1375, 1985).
Vor kurzem haben die Autoren der vorliegenden Erfindung ein computerunterstütztes Verfahren bereitgestellt (italienische Patentanmeldung Nr. 21396 A/89 und Nr. 20755 A/90), das die Herstellung von hydropathisch komplementären Peptidketten ermöglicht, die die Fähigkeit haben, mit vorgegebenen Aminosäuresequenzen zu interagieren, wobei lediglich die Primärsequenzinformation dieser Sequenzen eingegeben werden muß. Es zeigt sich, daß derart erhaltene Peptide eine höhere Bindungsaffinität aufweisen als solche, die mittels komplementärer DNA erhalten werden, und daß sie besonders vorteilhaft in diagnostischen und analytischen Verfahren angewendet werden können, die oft in einer festen Phase durchgeführt werden.
Die bereits bekannten Methoden zum Immobilisieren von niedermolekularen Peptiden (M.G. 1000-4000) auffesten Trägern können im westlichen in zwei Methoden aufgeteilt werden, und zwar auf solche, die auf kovalenten Bindungen zwischen Peptid und dem Trägermaterial beruhen und den Methoden, bei denen das Peptid in einer nicht-kovalenten Art und Weise verknüpft oder adsorbiert ist. Im ersten Fall wird im allgemeinen die chemische Reaktivität der Amino- oder Carboxylgruppen in den Peptiden für Veresterungsreaktionen mit geeigneten Gruppen ausgenützt, die auf dem festen Träger vorliegen. Oft können die Peptide jedoch mehr als nur eine reaktive Gruppe aufweisen (z. B. Amino-oder Carboxylgruppen), weshalb bei der Immobilisierung nur schwer zwischen den betreffenden Gruppen unterschieden werden kann, so daß diese nicht homogen und unvorhersehbar ist. In den Fällen, in denen das Peptid eine einzelne funktionelle Gruppe aufweist, ergibt sich eine orientierte Immobilisierung, jedoch verursacht die Nähe zur Festphase sehr oft einen teilweisen oder vollständigen Verlust der Fähigkeit zur Initialerkennung. Die Einführung von geeigneten Spacern zwischen der Festphase und dem Peptid verhindert etliche derartige Nachteile, jedoch erhöht eine derartige Vorgehensweise die Kosten für den Träger oder das Peptid beträchtlich, vermindert beträchtlich die Gesamtkapazität und muß darüber hinaus für jedes einzelne Peptid detailliert angepaßt werden und darüber hinaus werden dadurch einige Veränderungen eingeführt, die auf nicht spezifischen Interaktionen zwischen Spacer und anderen Molekülen beruhen. Die Immobilisierung von Peptiden mittels nicht-spezifischen Interaktionen auf festen Trägern sind ebenfalls in der Literatur beschrieben (Geerligs et al., J. Immunol. Methods, 106:239, 1988). In diesem Fall ist die Orientierung des Peptides jedoch völlig unbestimmbar, da viele Molekülgruppen in einer nicht vorhersehbaren Art und Weise an der Interaktion beteiligt sind.
Darüber hinaus haben die gleichen Autoren eine beachtliche Beschränkung der Verwendung von hydropathisch komplementären Peptiden gefunden, die Gegenstand der italienischen Patentanmeldung Nr. 20755 A/90 sind, und zwar aufgrund von Affinitätsverlust oder -verminderung, wenn die beschriebenen Verfahren angewendet werden und sie an einer Festphase immobilisiert werden, und zwar unabhängig davon, ob dies eine Festphase ist, die zuvor für die Herstellung als Affinitätschromatographiesäule derivatisiert wurde, oder ob dies eine Kunststoffplatte ist, die auf geeignete Weise angepaßt wurde, um analytische Tests durchzuführen.
Vor kurzem (Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409, 1988) wurde ein Verfahren für die Herstellung von Antipeptid- Antikörpern bereitgestellt, wobei multiple Peptide als Antigene eingesetzt wurden, wobei die Peptide kovalent an einen Oktadentat-Polylysinkern gebunden wurden. Die resultierenden Moleküle zeigten eine erhöhte immunogene Aktivität, und zwar bis zu einem wesentlich höheren Grad als von den gleichen linearen Peptiden.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise gefunden, daß die kovalente oder nicht-kovalente Immobilisierung an Festphasen von Peptiden, die hydropathisch komplementär zu bekannten Peptiden sind und die in einer multiplen und nicht-linearen Form entsprechend einem Verfahren, das ähnlich dem Tam'schen Verfahren (siehe oben) für die Herstellung von antigenischen multiplen Peptiden synthetisiert wurden, es erlaubt, viele der zuvor beschriebenen Nachteile zu vermeiden. Während des Immobilisierungsverfahrens werden tatsächlich einige der Peptidketten eines multimeren Moleküls statistisch an den Interaktionen mit der Festphase beteiligt, wohingegen andere sich vollständig zugänglich erweisen und richtig orientiert sind, um hydropathisch komplementäre Peptidsequenzen zu erkennen. Daher ist es möglich, die Affinität von hydropathisch komplementären Peptiden in diagnostischen Tests und analytischen und präparativen Verfahren, die vom Auftrennen mittels Affinitätschromatographie Gebrauch machen, und generell auf dem Gebiet der Immobilisierung von Peptidliganden zu verwenden. Insbesondere können hydropathisch komplementäre Peptide verwendet werden, um damit Reaktionsaktivitäten zu identifizieren. Im industriellen pharmazeutischen Bereich wird tatsächlich die Suche nach neuen pharmakologisch aktiven Molekülen derart durchgeführt, daß die biologische Aktivität von Fermentationsbrühen, konditionierten Kulturnährböden, von Zellextrakten, Pflanzenextrakten und anderen Produkten aus der Fermentation studiert werden, die eine große Anzahl bioorganischer Moleküle enthalten, die nicht charakterisiert sind und die Aktivitäten der unterschiedlichsten Art aufweisen.
Es gibt eine Vielzahl von Peptiden und Proteinen, darunter auch solche mit hormonellen Wirkungen, die mit pharmakologischen Aktivitäten ausgestattet sind und die, da sie aus hochmolekularen Vorstufen ursprünglich biologisch synthetisiert werden, eine Aktivierung mittels sequenzspezifischen proteolytischen Enzymen benötigen. Dementsprechend ist im pharmazeutischen Bereich die Forschung auf derartigen Enzymen und Molekülen, die derartige Konversionen inhibieren können, um deren Wirkung entgegenzusteuern, besonders wichtig.
Im allgegeinen ist die Suche nach Enzymen und dementsprechend nach ihren spezifischen Inhibitoren durch die Verfügbarkeit von chromogenen synthetischen Substraten, die das natürliche Substrat nachahmen erleichtert, wodurch es ermöglicht wird, die enzymatische Aktivität von biologischen Extrakten zu beobachten, ohne daß diese gereinigt werden müssen, sowie die Wirkung von Molekülen zu beobachten, die möglicherweise eine inhibierende Wirkung aufweisen. In vielen Fällen sind jedoch solche synthetischen Substrate nicht verfügbar und enzymatische Umwandlungsreaktionen müssen direkt mit dem natürlichen Substrat beobachtet werden, wobei beachtliche Probleme auftreten, die oft mit den niedrigen Nachweisgrenzen und der Komplexität der verwendbaren Tests einhergehen. Jedoch selbst im Fall von chromogenen Substraten zeigen die Tests zur Bestimmung proteolytischer Aktivitäten oder dem Vorliegen von Inhibitoren, daß sie schwer an die schnellen, bequemen und empfindlichen Verfahren an der Festphase adaptierbar sind, die im diagnostischen Bereich mehr und mehr eingesetzt werden, jedoch bis jetzt noch nicht für Tests auf Proteaseaktivitäten eingesetzt wurden, oder auf Aktivitäten, die diese inhibieren.
Kürzlich wurde ein 21 Aminosäuren großes Peptid identifiziert und charakterisiert, das als "Endothelin" (EI) bezeichnet wurde, und das eine sehr starke vasokonstringierende Wirkung zeigt (Yanagisawa et al., 1988, Nature 332:411-415). Endothelin wird von den endothelialen Zellen in Form einer Vorstufe synthetisiert, die 200 Aminosäuren aufweist (Preproendothelin), das zunächst in Pro-Endothelin (38 Aminosäuren) umgewandelt wird und das dann, mittels einem oder mehreren spezifischen Enzymen, die noch nicht charakterisiert wurden und die als "ECE" (endothelin converting enzymes) bezeichnet werden, durch proteolytischen Abbau in das reife Endothelin (1-21) umgewandelt wird. Pro-Endothelin ist pharmakologisch unwirksam, jedoch kann es ebenso durch ein großes Spektrum an proteolytischen Enzymen wie Chymotrypsin und Cathepsin sowohl in vitro als auch in vivo aktiviert werden. Darüber hinaus konnte auch gezeigt werden, daß die Gegenwart von Proteaseinhibitoren wie Phosphoramidon nicht nur verhindert, daß Pro-endothelin in Endothelin umgewandelt wird, sondern auch verhindert, daß in Ratten der Blutdruck erhöht wird, wenn ihnen Pro-Endothelin mittels Injektion verabreicht wird. Es ist außerordentlich wichtig, daß ein derartiger Inhibitor auch den Blutdruck in solchen Ratten stufenweise reduziert, die an einer spontanen Hypertension leiden (McMahon et al., 1990, Proc. 2nd Internat. Meeting on Endothelin, Tsukuba City, Japan).
Chromogene ECE-Substrate, die bei der Identifizierung derartiger oder ähnlicher proteolytischer Aktivitäten sowie als Inhibitoren solcher Aktivitäten eingesetzt werden, sind zur Zeit nicht verfügbar.
Es ist daher offensichtlich, daß Bedarf besteht für ein schnelles, empfindliches und automatisierbares Verfahren, das schnell zur Identifizierung und Charakterisierung von proteolvtischen Aktivitäten oder von solchen Aktivitäten durchgeführt werden können, welche diese inhibieren, und zwar in biologischen Flüssigkeiten, Fermentationsbrühen, konditionierten Kulturnährböden, Zellextrakten, Pflanzenextrakten, wobei das Verfahren im besonderen zur Erforschung von ECE-Inhibitoren durchgeführt werden kann, die spezifischer und aktiver sind als diejenigen, die bereits zur Verfügung stehen, um neue Moleküle mit hypotensiver Aktivität zu erhalten sowie für die Isolierung und Charakterisierung von ECE selber, um synthetische Moleküle in vitro zu entwerfen und in vitro zu synthetisieren, die eine inhibierende Wirkung auf proteolytische Aktivitäten aufweisen.
In der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß auch das Pro-Endothelin-Fragment 16-32 einen proteolytischen Abbau bis zum Level der 21-22 Reste unterläuft, und zwar durch Einwirkung von Enzymen wie Clivmotrypsin, wobei die kinetische Charakteristik ähnlich derjenigen ist, die für das ganze Pro-Endothelin beobachtet wird. Das 8ΔET (16-29)-Molekül erkennt das 16-32- Fragment von Pro-Endothelin, und zwar sowohl in Lösung als auch in der Festphase, selbst wenn dies mittels Biotin derivatisiert ist, wohingegen es nicht fähig ist, mit den Fragmenten 16-21 und/oder 22-32 zu assozueren, welche mittels chymotryptischem Abbau erhalten werden. Dementsprechend ist es möglich, die Immobilisierung des 8ΔET (16-29)-Moleküls auf Kunststoffplatten auszunützen, um einen Festphasentest zum Nachweis von derivatisiertem Biotin ET (16-32) zu entwickeln. Mit solchen Tests können viele der Nachteile vermieden werden, die bei der Suche nach proteolytischen Enzymen bislang entstanden, und zwar im besonderen bei speziellen Aktivitäten bezüglich Pro-ET und Aktivitäten, die dieses inhibieren.
Die Erfindung betrifft daher nicht-lineare Peptide, die hydropathisch komplementär sind zu Proteinen, Peptiden oder Teilen davon, wobei zumindest ein Teil ihrer Aminosäuresequenz bekannt ist, umfassend:
einen Aminosäurekern mit mindestens einer Aminosäure, die mindestens zwei terminale Aminofunktionen und eine lineare Aminosäuresequenz aufweist, die hydropathisch komplementär zu dem Teil der bekannten Aminosäuresequenz ist, die mittels einer Carboxyaminoverbindung mit jeder dieser terminalen Aminofunktionen verbunden ist.
Der erfindungsgemäße Aminosäurekern weist die folgende Formel auf:
worin X eine Aminosäure mit mindestens zwei funktionellen Aminoresten ist, Y eine Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Glycin oder Arginin; m eine Zahl zwischen 0 und 1 ist; n&sub1; , n&sub2; , n&sub3; , und n&sub4; Zahlen zwischen 0 und 10 bedeuten und worin die Verknüpfungen Carbamido-Bindungen sind.
Vorzugsweise werden die linearen hydropathisch komplementären Aminosäureteile aus 10 bis 20 Aminosäuren gebildet.
Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weisen die Aminosäuren mindestens zwei terminale Aminofunktionen auf und sind ausgewählt aus Lysin und Ornitin.
Durch die Verwendung von erfindungsgemäßen Molekülen in Trennungsverfahren an Festphasen wird die Verwendung von synthetisch eingeführten Spacern vermieden, um niedermolekulare Peptide einer Interaktion mit hochmolekularen Proteinmakromolekülen besser zugänglich zu machen.
Tatsächlich wirken die Ketten, die direkt an den Festphasenträger geknüpft sind wie interne Spacer, da sie aus linearen Polyatomreihen von 3n Atomen aufgebaut sind, worin n die Zahl der Aminosäurereste bedeutet, die einen Teil der Peptideinheit der multimeren Verbindung bilden. Nicht-spezifische Interaktionen, die oft bei der Verwendung von aliphatischen Spacern mit 6-12 C-Atomen auftreten, werden nicht eingeführt.
Erfindungsgemäß werden die multimeren Peptide ohne vorherige Manipulationen an preaktivierten Trägermaterialien, wie sie im Handel erhältlich sind, direkt immobilisiert, wodurch die schwierigen und teuren Immobilisierungsverfahren, die oft geringe Ausbeuten am Endprodukt ergeben, vermieden werden.
Die Erfindung wird im folgenden unter dem Gesichtspunkt der Synthese von hydropathisch komplementären Peptiden (die mit dem Symbol Δ gekennzeichnet werden) bezüglich Teilen der Aminosäuresequenz, die aus zwei Proteinen hergestelll ist, beschrieben: dem "Großen Endothelin" (Big Endothelin) (Big ET, Itoh et al., Febs. Lett., 231, 440) von Aminosäure 16 bis Aminosäure 29 und dem "Tumor Necrosis Faktor" (TNFα, Beutler und Cerami, Ann. Rev. Immunolog. 7, 625, 1989) von Aminosäure 144 bis Aminosäure 157, die in nicht-linearer Art wid Weise kovalent an einen Lysinnudeus unter Bildung eines Oktadentatmoleküls gebunden sind; bezüglich ihrer Verwendung bei der Herstellung von Affinitiätschromatographiesäulen und zur relativen Reinigung des Big ET-Peptids sowie des TNFα- Proteins; bezüglich der Immobilisierung dieser Moleküle an einer Festphase zur quantitativen Bestimmung von Big ET und TNFα.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten, wobei das Verfahren die Reaktion
umfaßt, worin
E die proteolytische Aktivität bedeutet, die die Konversion eines Substrates A katalysiert, welches mindestens ein Proteinfragment aufweist, das mit mindestens einer Stelle eines proteolytischen Angriffs markiert ist, zu den Fragmenten C und D, wobei I Inhibitoren einer solchen Konversion darstellen, B einen Ligand bedeutet, der die Fähigkeit hat, das Substrat A, nicht jedoch die Fragmente C und D zu erkennen und zu binden; wobei B aus Molekülen besteht, die aus einem Aminosäurenukleus gebildet sind, der zumindest eine Aminosäure aufweist, die mindestens zwei terminale Aminofunktionen und eine lineare Aminosäuresequenz aufweist, welche hydropathisch komplementär zu diesem Proteinfragment ist und der mittels einer Carbamidoverknüpfung mit jeder der terminalen Aminofunktion verknüpft ist und wobei die Sterne bedeuten, daß das Substrat A markiert ist.
Erfindungsgemäß ist das Fragment mittels Radioisotopen, mittels Enzymen, mittels fluoreszierenden Verbindungen oder Chromophoren oder Biotin markiert.
Vorzugsweise ist das Fragment durch Biotin markiert und kann durch Inkubation mit an Streptavidin konjugierter Peroxidase nachgewiesen werden.
Erfindungsgemäß umfaßt das Verfahren Mittel für die Trennung des Proteinfragment-Ligandkomplexes von nichtverknüpften Proteinfragmenten und von proteolysierten Derivaten.
Diese Trennmittel werden auf einfache Weise durch Immobilisierung dieses Liganden an einer Festphase hergestellt, wobei die nicht-gebundenen Proteinfragmente und die proteolysierten Derivate weggewaschen werden.
Erfindungsgemäß umfaßt die Festphase Kunststoffplatten, die in Kompartimente aufgeteilt sind.
Erfindungsgemäß umfaßt das Verfahren einen Schritt, bei dem die markierten Proteinfragmente, die mit an der Festphase immobilisierten Liganden verknüpft sind, gemessen werden.
Die Erfindung hat auch ein Verfahren zum Gegenstand, bei dem das Proteinsubstrat ein Fragment des Pro-Endothelin umfaßt und der Ligand Aminosäuresequenzen umfaßt, die hydropathisch komplementär zu dem Fragment des Pro- Endothelins sind.
Vorzugsweise besteht das Fragment des Pro-Endothelins aus der Aminosäure 16 bis Aminosäure 32 der Formel HLDIIWVNTPEHIVPYG und das Detektionsmolekül umfaßt das Molekül 8ΔET (16-29).
Gemäß der Erfindung liegt die Stelle des proteolytischen Angriffs zwischen den Aminosäuren 21-22 des Pro- Endothelin-Fragmentes 16-32 und zwar derart, daß beim Vorliegen proteolytischer Aktivität zwei Fragmente ET (16-21) und ET (22-32) entstehen, die nicht mit dem 8ΔET (16-29)-Molekül verknüpft werden.
Das Auftreten von proteolytischen Aktivitäten, die geeignet sind, das Substrat ET (16-32) zu ET (16-21) und zu ET (22-32) zu konvertieren, kann leicht nachgewiesen werden, indem geeignete Mengen des Biotin-derivatisierten Substrates in der Testprobe inkubiert werden und die Menge an biotinvliertem Derivat bestimmt wird, das an den Platten gebunden ist. Auf eine ähnliche Weise kann das Vorliegen von Inhibitoren der Konversionsreaktion nachgewiesen werden, indem man geeignete Mengen von biotinylierten Derivaten und Chymotrypsinlösungen oder Rohpräparaten von ECE mit der Testprobe inkubiert und dann die Menge des an die Platte gebundenen biotinylierten Substrates bestimmt.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele erläutert, die sie jedoch nicht beschränken sollen, wobei auf die folgenden Figuren Bezug genommen wird, wobei
Fig. 1A die Struktur des Polylysinkernes bedeutet, der für die Synthese von 8ΔET (16-29) verwendet wird;
Fig. 1B die Struktur des nicht-linearen Peptides 8ΔET (16-29) bedeutet;
Fig. 1C die Struktur des Peptids ET (16-29) bedeutet;
Fig. 1D die Struktur des nicht-linearen Peptides 8ET (16-29) bedeutet;
Fig. 2 die unterschiedliche Wirkungsweise der Säulen veranschaulicht, die mit ΔET (16-29) und 8ΔET (16-29) präpariert sind;
Fig. 3A die Reinigung des biotinvlierten Derivates von ET (1-32) an einer Affinitätssäule veranschaulicht, die mit dem Peptid 8ΔET (16-29) präpariert ist;
Fig. 3B eine Analyse veranschaulicht, die mittels RP-HPLC am Biotin-ET (1-32)-Produkt durchgeführt wurde, das mittels Affinitätschromatographie gereinigt wurde;
Fig. 4 die Bindung des biotinvlierten Derivats von ET (1-32) mit Kunststoffmikrocontainern veranschaulicht, die mit 8ΔET (16-29) derivatisiert wurden;
Fig. 5 die Spezifität der Wechselwirkung zwischen ET (1-32) und 8ΔET (16-29) veranschaulicht, die auf Kunststoffmikrocontainern immobilisiert wurden;
Fig 6 die verschiedenen Affinitäten der Peptide ET (16-29) (A) und 8ET (16-29) (B) an 8ΔET (16-29) veranschaulicht;
Fig. 7A die Struktur des Polylysinkernes, der zur Synthese 8ΔTNF (144-157) verwendet wird, veranschaulicht;
Fig. 7 die Struktur des Peptids 8ΔTNF (144-157) veranschaulicht;
Fig. 8A die Bindung von TNFα mit einer Affinitätssäule darstellt, die mit den Peptiden 8ΔTNF (144-157) präpariert wurde;
Fig. 8B eine Analyse darstellt, die mittels RP-HPLC am TNFα durchgeführt wurde, der mittels Affinitätschromatographie gereinigt worden ist und
Fig. 9 die Spezifität der Wechselwirkung zwischen TNFα und 8ΔTNF (144-157), das an Kunststoffmikrocontainern immobilisiert ist, veranschaulicht;
Fig. 10 einen kinetischen Kurvenverlauf des Abbaues von Pro-Endothelin und Pro-Endothelin (16-32) durch Einwirkung des Enzyms Alpha-Chymotrypsin zeigt;
Fig. 11 die Bindung des biotinylierten Derivats von ET (16-32) mit Platten zeigt, die mit 8ΔET (16-29) sensibilisiert wurden, in Gegenwart und in Abwesenheit von Alpha-Chymotrypsin und
Fig. 12 die Bindung des biotinylierten Derivats von ET (16-32) mit Platten zeigt, die mit 8ΔET (16-29) sensibilisiert wurden, die zuvor mit Alpha-Chymotrypsin, und zwar in Gegenwart und in Abwesenheit von Inhibitoren behandelt worden sind.
Die Erfindung ist dazu verwendet worden, Sequenzen von nicht-linearen Peptiden zu synthetisieren, die hydrophathisch komplementär zu der 16-29 Stelle des Big Endothelins sind (Yanagisawa et al., Nature 322, 411 (1988)) [1-38] sind, und zu der 144-157 Stelle des TNFα sind (Bentler und Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7:625, 1989), wodurch eine bessere Ausbeute bei der Immobilisierung an Festphasen erhalten wurde. Die Peptide können auf der Basis von dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden, und zwar in Lösung oder mittels Festphasensynthese, wobei von einem Polylysinnukleus ausgegangen wird, der aus einer kovalenten Einheit von sieben Lysinresten gebildet ist, wie in Fig. 1A angegeben. Das Peptid 8ΔET [16-29] , dessen Struktur in Fig. 1B angegeben ist, wurde mittels Festphasensynthese gemäß einem Fmoc-Verfahren synthetisiert (Dryland and Sheppard, TH 44, 859 (1988)), wobei als Lösungsmittelsystem N-Methylpyrrolidon/Dichlormethan unter Verwendung eines automatischen Synthesizers Applied Biosystem 431A verwendet wurde und den Vorschriften der Hersteller gefolgt worden ist. Auf ähnliche Weise wurde das nicht-lineare Peptid 8ΔNF [144-157] synthetisiert, dessen Sequenz in Fig. 7B angegeben ist. Die Synthese- und Reinigungsverfahren für die Peptide sind im wesentlichen in der Literatur angegeben und veranschaulicht, und diese Verfahren sind dem Fachmann bestens bekannt. Das Peptid 8ΔET [16-29] wurde dazu verwendet, eine Affinitätssäule für die Reinigung von Big ET aus Mischungen herzustellen, die 20 verschiedene Peptide enthalten, und zwar jede bei einer Konzentration von 1 mg/ml. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird, zeigen Affinitätssäulen, die mit dem 8ΔET [16-29] Peptid hergestellt wurden eine höhere Bindungskapazität, d. h. daß sie größere Mengen von Big ET reinigen können als Säulen, die durch Immobilisierung von äquimolaren Mengen des Peptids ΔET [16-29] (RKFLAGLRARRLKF) hergestellt wurden, wobei das Peptid die Peptideinheit darstellt, die achtfach wiederholt im 8 ΔET [16-29] vorliegt. Die höhere Kapazität, die durch Immobilisierung von 8ΔET [16-29] erhalten wird, beruht auf der Tatsache, daß nur einige der acht Peptidketten an der kovalenten Interaktion mit der Festphase teilnehmen, wohingegen die anderen frei vorliegen, um nicht-kovalent mit dem Big ET zu interagieren. Im Gegensatz dazu sind bei der Säule, die unter Verwendung von ΔET [16-29] hergestellt wurde, die Peptide an der Festphase entweder durch die N-terminale alpha-Aminogruppe oder durch die Epsilon-Aminogruppen der Lysinreste gebunden, die in den Positionen 2 und 13 in der Peptidsequenz vorliegen. In beiden Fällen ist das Peptid nicht homogen immobilisiert und die Nähe zur Festphase kann eine beachtliche Abnahme der Bindungskapazität für das Big ET bewirken. Solche Effekte sind auch für andere Affinitätssysteme recht häufig und sie sind weit verbreitet in der Literatur beschrieben. Die Verwendbarkeit der vorliegenden Erfindung kann bei der Bereitstellung von analytischen Methoden zur quantitativen Bestimmung des Big ET, wie dies in den folgenden Beispielen beschrieben ist, noch weiter bewertet werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Peptid 8ΔET [16-29] an geeigneten Kunststoffmikrocontainern nicht-kovalent immobilisiert werden, die in diesem Fall mit einer geeigneten Proteinlösung behandelt werden, um jedmögliche, nicht-spezifische Interaktionsstellen zu entfernen, wobei diese dann mit geeigneten Lösungen gewaschen werden. Big Endothelin [1-38] oder [16-29] , das mit geeigneten Reaktanten markiert ist, kann dann zu jedem Mikrocontainer gegeben werden, und das Ganze wird inkubiert, um die Interaktion zu bewirken Die Container können dann gewaschen werden, um überschüssiges, nicht-reagiertes Big Endothelin [1-38] oder [16-29] zu entfernen, wobei diese dann untersucht werden, um die Menge an reagiertem Big ET oder dessen Derivats [16-29] zu bestimmen. In der technischen Literatur sind sowohl die Markierungsmethoden beschrieben, die durch die Einführung von Radioisotopen, Enzymen, fluoreszierenden oder chromophoren Verbindungen oder Biotin erreicht werden können, als auch die Methoden zur Bestimmung solcher markierten Verbindungen, wobei all diese Methoden dem Fachmann bestens bekannt sind. Die Stärke der nicht-spezifischen Interaktion kann dadurch bestimmt werden, daß man markiertes Big Endothelin [1-38] in Gegenwart von nicht-markierten überschüssigen Big ET inkubiert und die erhaltenen Werte mittels einem Scatchard-Verfahren analysiert. Die Spezifität der Wechselwirkung zwischen den Peptiden, die Gegenstand dieser Erfindung sind, kann dadurch bestimmt werden, daß man mit 8ΔET [16-29] derivatisierte Mikrocontainer mit verschiedenen markierten Peptiden und Proteinen in Gegenwart oder in Abwesenheit von nicht-markiertem Material inkubiert. Weitere Hinweise zur Spezifität können durch Inkubation der Fragmente 16-21 oder 22-32 des Big Endothelins [1-38] erhalten werden, die eine sehr geringe Aktivität bezüglich des Peptids 8ΔET [16-29] aufweisen. Ähnlich wie das Peptid 8ΔET [16-29] wurde das Peptid 8ΔTNF [144-157] immobilisiert und zwar sowohl an einer Festphase zur Herstellung von Affinitätssäulen für die Reinigung von TNFα, als auch an Mikroplatten zur Bereitstellung eines Tests zur quantitativen Bestimmung von TNF.
Die Verwendbarkeit der Erfindung ist, wie in den Beispielen 5, 7 und 8 veranschaulicht, auch in dem Fall evident, wenn das betreffende Mikromolekül, das gereinigt oder analysiert werden soll, mehr als nur eine Stelle enthält, welches die gleiche Sequenz aufweist, die mit dem immobilisierten multimeren Liganden hydropathisch komplementär ist. In diesem Fall wird die Polyvalenz des multimeren Liganden durch eine Erhöhung der Bindungsaffinität des betreffenden Moleküls charakterisiert. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung kann eine besondere Situation entstehen, wenn Proteine verwendet werden, die aus verschiedenen Untereinheiten aufgebaut sind, die bezüqlich der Aminosäuresequenz und der Struktur alle gleich sind. Ein Peptid, das hydropathisch komplementär zu einer exponierten Stelle eines solchen Proteins ist, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren in der oktameren Form synthetisiert werden, die an einer Festphase immobilisiert ist, und die zur Reinigung und zur quantitativen Bestimmung des betreffenden oligomeren Proteins verwendet wird. Das Vorliegen einer Mehrzahl von Bindungsstellen erhöht tatsächlich die Affinität exponentiell, wie dies bei bivalenten Antikörpern der Fall ist, was weitgehend in der Literatur beschrieben ist. Die beobachtete Zunahme der Bindungsaffinität der komplementären multimeren Peptide wird natürlich nicht nur auf dem Gebiet von Reinigungsverfahren angewendet, die mittels Affinitätschromatographie durchgeführt werden, oder auf das Gebiet der Durchführung von analytischen Verfahren. Es ist dem Fachmann geläufig, daß die Möglichkeit, synthetische Moleküle zu kreieren, die fähig sind, mit Proteinmakromolekülen (Proteine, Rezeptoren, Antikörper usw.) mit hoher Affinität (d. h. mit niedrigen Werten der Dissoziationskonstanten) zu assozueren, im pharmazeutischen Bereich weitgehend angewendet wird, um neue synthetische Arzneistoffe zu entwerfen, die Aktivitäten aufweisen, die so direkt als möglich in Richtung auf ein bestimmtes Makromolekül mit einer wichtigen biologischen Funktion gerichtet sind. Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung solcher multimerer Verbindungen, bezogen auf die Verwendung von einzelnen Peptiden, liegt in der erhöhten Affinität und in der höheren Stabilität bezogen auf die Wirkung der proteolytischen Enzyme, die normalerweise in biologischen Flüssigkeiten vorliegen. Das hohe Molekulargewicht, das aus der Vereinigung von vielen Peptideinheiten resultiert, verleiht der Verbindung, bezogen auf die aktive Proteolysestelle des Enzyms, eine größere sterische Hinderung. Darüber hinaus ist es für den Fachmann offensichtlich, daß es gemäß den verschiedenen Fallgestaltungen und den verschiedenen speziellen Anwendungen möglich ist, sowohl die Anzahl der mit dem Polylysinnukleus verknüpften Peptideinheiten zu verändern, als auch weitere Reste einzuführen, um die Peptidkette noch weiter in Abstand zu halten, ohne vom Gegenstand der Erfindung abzukommen.

Beispiel 1

Festphasensynthese von 8ΔET [16-29]

Die Sequenz des hydropathisch komplementären Peptids zur Sequenz 16-29 des menschlichen Big Endothelins [1-38] (HLDIIWVNTPEHIV) wurde auf der Basis des AMINOMAT- Verfahrens erhalten, das zuvor von den gleichen Autoren (italienische Patentanmeldung Nr. 20755 A/90) beschrieben wurde und wurde als ΔET [16-29] (RKFLAGLRARRLKF) bezeichnet. Das Peptid ΔET [16-29] wurde dann mittels einer Festphasensynthese synthetisiert, wobei die Fmoc-Methode angewendet wurde und Standard-Kupplungsverfahren von einzelnen Aminosäuren durch Ausbildung von aktiven Estern mit Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol [DCC/HOBt] eingesetzt wurden. Auf ähnliche Weise wurde die Sequenz 16-29 des Big Endothelins synthetisiert. Nach der Synthese der Peptide wurden die Schutzgruppen entfernt und die Peptide gemäß Standard-Verfahren von der Festphase gelöst und gereinigt, bis mittels RP-HPLC eine chromatographische Homogenität erreicht wurde. Der Oktadentat-Polylysinnukleus, der zur Synthese des multiplen Peptids 8ΔET [16-29] (Fig. 1A) verwendet wurde, wurde durch sukkessive Kupplungsvorgänge in drei Zyklen mit Alpha-Fmoc-Lysin (Epsilon-Fmoc) an einer Initialfestphase (Harz Fmoc- Glycin-HMP) erhalten. Die Sequenz ΔET [16-29] wurde dann auf dem Initialpolylysinkern (Fig. 1B) synthetisiert, wie dies zuvor beschrieben wurde. Nach der Entfernung der Schutzgruppen und nach dessen Ablösen vom Harz wurde das multiple Peptid von niedermolekularen Verunreinigungen mittels einer zweitägigen Dialyse gegen 0,1 M Essigsäure gereinigt. Schließlich wurde das dialysierte Material gefroren und lyophilisiert. Auf gleiche Weise wurden die Peptide ET [16-29] und 8ET [16-29] hergestellt, dessen Strukturen jeweils in den Fig. 1C und D dargestellt sind.

Beispiel 2

Herstellung einer Festphase für Affinitätschromatographie

Die Peptide ΔET [16-29] und 8ΔET [16-29] wurden auf einem Träger immobilisiert, der zuvor durch Einführung von Epoxidgruppen (EUPERGIT C30 N) aktiviert wurde, wobei das gleiche Peptid/Trägerverhältnis verwendet wurde. Die Peptide 8ΔET [16-29] (2 mg) und ΔET [16-29] (2 mg) wurden getrennt in 10 ml von 0,1 M NaH&sub2;CO&sub3;, 0,5 M NaCl, pH 8,5 gelöst und getrennt zu zwei Aliquots von 1 g EUPERGIT C30N gegeben. Die Mischungen wurden dann 24 Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur inkubiert. Die Einführung der Peptide in das Harz wurde mittels RP-HPLC verfolgt und nach 24 Stunden war eine Menge von etwa 80% des ursprünglich in den beiden Präparationen vorliegenden Peptids kovalent an den Träger gebunden. Diese Inkorporationsmengen wurden dann durch eine Analyse der Aminosäuren bestätigt, wobei die Analyse mit abgewogenen Mengen der beiden derivatisierten Harze durchgeführt wurde.
Zwei Glassäulen für die Affinitätschromatographie (80 x 6,6 mm I. D., Gesamtvolumen 2,3 ml) wurden dann mit den beiden derivatisierten Peptidträgern gefüllt und mit 0,1 M TRIS*HCL bei einem pH von 6,8 und einer Fließrate von 1 ml/min equilibriert. Das Eluat wurde kontinuierlich mittels optischer Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nni beobachtet. Zur Bestimmung der Säulenkapazität wurden 500 µl ET [16-29] eingespritzt, das mit einer Konzentration von 1 mg/ml in dem Elutionspuffer gelöst war. Unter den gleichen Elutionsbedingungen wird das eingespritzte Material vollständig von der Säule, die mit dem Peptid 8Δ ET [16-29] hergestellt war (Fig. 2A) , zurückgehalten, wohingegen die Säule, die mit ΔET [16-29] hergestellt wurde, nur 50% hiervon zurückhält (Fig. 2B).

Beispiel 3

Herstellung und Reinigung von Biotin ET [1-32]

Die Markierung von ET [1-32] zur Durchführung von analytischen Tests auf Kunststoffmikrocontainern wurde mittels Derivatisierung des Peptids mit Biotin gemäß folgendem Verfahren durchgeführt:
1) 2, 5 mg ET [1-32] wurden in 1 ml von 20mM NaAc bei pH 6,0 durchgeführt, 400 µl einer Lösung bei einer Konzentration von 2 mg/ml Biotin-Aminocaproat- N-Hydroxysuccinimidester in Ethanol/Wasser 1/1 hinzugefügt. Die Mischung wurde dann unter Rühren 5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
2) Die Reaktionsmischung wurde dann im Verhältnis 1/1 mit 50 mM TRIS mit pH 6,8 verdünnt und wurde dann in die Affinitätssäule eingespritzt, die mit dem Peptid 8ΔET [16-29] hergestellt und mit 50 mM TRIS mit pH 6,8 bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min equilibriert wurde. Das Eluat wurde mittels optischer Absorption bei 280 nm verfolgt. Nach der vollständigen Elution des Materials, das nicht festgehalten wurde und aus den überschüssigen Reagentien sowie Reaktionsnebenprodukten zusammengesetzt war, wurde zum Eluat 0,1 M HAc, pH 3,0 gewechselt, wie dies in Fig. 35 gezeigt ist. Das gereinigte Produkt, das als Biotin ET [1-32] bezeichnet wurde, wurde dann gefriergetrocknet und direkt für die folgenden Versuche eingesetzt.

Beispiel 4

Wechselwirkung von Biotin-ET [1-32] mit 8 ΔET [16-29]-sensibilisierten Mikroplatten

Einige Polystyrolplatten mit 96 Näpfchen (96-well) (NUNC) wurden mit 100 µl/well mit 8ΔET [16-29] Lösungen in 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,6 bei verschiedenen Konzentrationen (210; 0,5; 0,2; 0,1; 0,0 µg/ml) über Nacht bei 4ºC sensibilisiert. Die Platten wurden dann dreimal mit einer 0,15 M Natriumchlorid, 0,5 M Natriumphosphatlösung bei pH 7,3 (PBS) durch wiederholtes Auffüllen und Entleeren gewaschen. Am Ende dieser Vorgänge wurde jedes Well mit 200 µl einer Rinderserum-Albuminlösung (BSA) gefüllt, die 3% PBS enthielt und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann nochmal dreimal mit PBS gewaschen und in jedes Well wurden 100 µl einer Biotin-ET [1-32]-Lösung gegeben, und zwar bei verschiedenen Konzentrationen (0,2; 0,1; 0,05; 0,0 µg/ml), die durch Verdünnung in PBS bei einem Verhältnis von 1/1 mit destilliertem Wasser erhalten wurde, das 0,5% BSA (PES-B) enthielt und anschließend wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Schluß wurden die Platten nochmals mit PBS gewaschen (achtmal) und mit 100 µl/well einer Streptavidin-Peroxidase-Lösung (Sigma Chemical Company) versetzt, die im Verhältnis 1/1000 mit einer PBS-B-Lösung verdünnt wurde, die 0,05% Tween 20 enthielt. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurden die Platten mit PBS achtmal gewaschen und mit 100 µl/well einer Lösung versetzt, die 1 mg/ml Phenylendiamin, 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 5 und 5 mM Wasserstoffperoxid enthielt. Die homogene Reaktion wurde 30 Min. lang bei 37ºC durchgeführt und durch Zugabe von 25 µl einer 4,5 M Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte jedes Wells wurde dann mittels einer Mikroplattenlesevorrichtung (Modell 3550 Mikroplate Reader, Biorad) bestimmt. Die erhaltenen Resultate, die in Fig. 3 angegeben sind, zeigen die effektive Bindung zwischen dem Biotin-ET [1-32] und den 8ΔET [16-289] sensibilisierten Wells Wie erwartet zeigte es sich, daß die Bindung sowohl von den Biotin-ET [1-32]- und den 8ΔET [16-29]- Konzentrationen abhängt. Im besonderen scheint es, daß die Verwendung von 8ΔET [16-29] bei der einer Konzentration von 0,5 mg/ml zur Sensibilisierung der Platten und Biotin-ET [1-32] bei einer Konzentration von 0,2 microg/ml ausreicht, um ein meßbares Signal bei der Entwicklung eines kompetitiven Tests mit ET [1-32] zu bilden.

Beispiel 5

Test auf kompetitive Bindung für ET [1-32]

Um die Spezifität der Bindung zwischen Biotin-ET [1-32] und den 8ΔET [16-29]-sensibilisierten Wells zu bewerten, wie dies in Beispiel 4 angegeben ist, wurde ein kompetitiver Bindungstest von Biotin-ET [1-32] mit ET [1-32] und mit zwei Peptiden C1 und C2 zur Negativkontrolle durchgeführt, wobei die Bindung mit 8ΔET [16-29]-beschichteten Wells durchgeführt wurde. Das Experiment wurde gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Vorgehensweise mit festen Konzentrationen von 8ΔET [16-29] (0,5 microg/ml) und Biotin-ET [1-32] (0,2 microg/ml) und in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Kompetitorpeptiden zwischen 1 und 1000 microg/ml durchgeführt.
Die so erhaltenen Resultate, die in Fig. 5 angegeben sind, zeigen die effektive Kompetition der Bindung zwischen Biotin-ET [1-32] und 8 ΔET [16-29] mit ET [1-32] und bei Konzentrationen zwischen 5 und 250 microg/ml, jedoch nicht mit C1 und C2. Dies legt nahe, daß die beobachtete Wechselwirkung zwischen den Komplementärpeptiden spezifisch ist. Die Spezifität der Interaktion wurde zusätzlich durch Kompetitivexperimente mit ET [16-21] bestätigt. In diesem Falle konnte bei den in den Tests verwendeten Konzentrationen keine merkbare Kompetition bei der Bindung bemerkt werden. Dies kann bisher leicht dahingehend interpretiert werden, daß eine drastische Abnahme der Affinität stattgefunden hat aufgrund des Fehlens von elf Resten in der hydropathisch komplementären Region, die notwendig zum Stabilisieren der Wechselwirkung sind. Es wurde in Übereinstimmung mit der Hypothese beobachtet, daß das Peptid ET [16-29], welches die gesamte Komplementärregion enthält, im Gegensatz dazu zur Kompetition fähig ist. Hieraus folgt, daß die Bindung zwischen Biotin-ET [1-32] und 8ΔET [16-29], die auf den Polystyrolplatten beobachtet wird, spezifisch ist und von den hydropathisch komplementären Regionen der beiden Peptide abhängt und daß diese zur Bestimmung von Molekülen, die diese Regionen enthalten, wie beispielsweise Big Endothelin und Pro-Endothelin, einsetzbar ist.

Beispiel 6

Bestimmung der relativen Affinität von ET [16-29] und 8ET [16-32] zum 8ΔET [16-29]

Die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellte Säule, die das Peptid 8ΔET [16-29] enthält, wurde bei einer Fließrate von 1,0 ml/min mit 1 M NH&sub4;Ac bei pH 5,7 equilibriert. Unter solchen Bedingungen mit hoher Ionenstärke werden die Wechselwirkungen zwischen den komplementären Peptiden beachtlich verringert, wie dies in der Literatur beschrieben ist (Fassina et al., J. Biol. Chem. 264:11252, 1989) und es ist möglich, daß, bezogen auf das Totvolumen der Säule, anstatt einer vollständigen Absorption lediglich eine Verzögerung des im Elutionsvolumen der interagierenden Verbindung beobachtet wird, anstatt einer vollständigen Adsorption. Es ist möglich, aus dem Elutionsvolumen die Interaktions-Dissoziationskonstante Km/p mittels folgender Gleichung zu beredinen:
wobei V das Elutionsvolumen, V&sub0; das Totvolumen der Säule, MT die Säulenkapazität und P die Menge der eluierten Verbindung bedeutet (Fassina und Chaiken, Adv. in Chromatogr., 27:247, 1987). Unter solchen Bedingungen unterliegt das Peptid ET [16-29] einer Elutionsverzögerung von 3 ml (Fig. 6A) wohingegen das Peptid SET [16-29] selbst nach 100 Min. nicht eluiert wird und es zur vollständigen Elution (Fig. 6B) notwendig ist, auf das Fluat 0,1 M HAc überzuwechseln. Es zeigt sich, daß die Dissoziationskonstante des Peptids ET [16-29] mindestens fünfzigmal so hoch ist wie diejenige, die mit dem Peptid 8Δ ET [16-29] erhalten wird. Dies bedeutet, daß die Polyvalenz in der Wechselwirkung zwischen 8ΔET [16-29] und 8ET [16-29] die Assoziation um etwa 2 Potenzen erhöht.

Beispiel 7

Design und Festphasensynthese von 8ΔTNF [144-157]

Die Sequenz des Peptides, das der Sequenz 144-157 des Tumor-Nekrose-Faktors (TNFalpha) (FAESGQVYFGIIAL) hydropathisch komplementär ist, wurde mittels des AMINOMAT- Verfahrens erhalten, das, wie bereits zuvor beschrieben wurde (italienische Patentanmeldung Nr. 21396 A/89 und Nr. 29755 A/90), als ΔTNF [144-157] [DYLAGFKAHGKKYR] bezeichnet wurde. Das Peptid 8ΔTNF [144-157] wurde dann mittels einer Festphasensynthese gemäß der Fmoc-Methode hergestellt, wobei vom Oktadentatpolylysinnukleus ausgegangen wurde, der mit Glycin- und Argininspacern versehen war, wie dies in Fig. 7A veranschaulicht ist. Ähnlich wie dies zuvor beschrieben wurde, wurde das Peptid 8ΔTNF [144-157] (Fig. 7B) entschützt, vom Harz abgelöst und mittels einer zweitägigen Dialyse gegen 0,1 M Essigsäure gereinigt. Schließlich wurde das Dialysat gefroren und gefriergetrocknet. Das Peptid 8ΔTNF [144-157] (5 mg) wurde dann auf einen zuvor aktivierten Träger (1 g) mittels Epoxidgruppen (EUPERGIT C30 N) immobilisiert, wobei die gleichen Bedingungen verwendet wurden, wie zuvor beschrieben. Der derivatisierte Peptidträger wurde dann in eine Glassäule zur Affinitätschromatographie (80 x 6,6 mm I. D., Gesamtvolumen 2,3 ml) gefüllt, mit 0,1 M TRIS HCl bei pH 6,8 und einer Fließrate von 2,0 ml/min equilibriert. Um die Erkennungseigenschaften der Säule bezüglich TNF-alpha zu bestimmen, wurden 100 µl TNF-alpha, das im Elutionspuffer bei einer Konzentration von 0,5 mg/ml gelöst war, injiziert. Nach etwa 10 Min. wurde der Puffer auf 0,1 M Essigsäure gewechselt, um die Elution des adsorbierten Materials zu ermöglichen (Fig. 8A). Das mit der Essigsäure eluierte Material wurde dann mittels einer RP-HPLC analysiert um nachzuweisen, daß sich TNF-alpha und 8ΔTNF [144-157] (Fig. 8B) erkannt haben.

Beispiel 8

Wechselwirkung zwischen Biotin TNF und 8ΔTNF [144-157]-sensibilisierten Mikroplatten

50 µl einer Lösung von 8ΔTNF [144-157] wurden in einer Konzentration von 0,04 mg/ml in einem 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6, in jedes Well der 96-Well PVC-Platten gegeben. Die Platten wurden dann eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal mit PBS gewaschen. In jedes Well wurden dann 200 µl einer 3%igen Rinderserumalbumin- (BSA)-Lösung in 0,025 M Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 gegeben, der noch 0,075 M NaCl (PBS) enthielt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten mit PBS gewaschen und mit einer TNF/TNF-Biotinmischung in verschiedenen Verdünnungen von 1%iger w/v PBS-BSA versetzt, die noch 0,05% v/v Tween 20, 10 KIU/ml Aprotinin, 10 µM PMSF, 10 µM EDTA (PBS-TAPE) und zwar in Gegenwart und in Abwesenheit von 1% normalem Ziegenserum. Die Platten wurden dann nochmals eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit PES gewaschen. Jedes Well wurde dann mit 100 µl einer Streptavidinperoxidaselösung (Sigma) mit PBS-TAPE im Verhältnis 1/2000 verdünnt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Platten gewaschen, mit einer Chromogen-ABTS (KPL)-Lösung versetzt (100 µl/Well) und 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption bei 405 nm wurde dann in jedem Well mittels einer Mikroplattenlesevorrichtung (Biorad, Modell 25550 EIA Reader) bestimmt. Wie in Minute 8 gezeigt, ist die Bindung zwischen dem an den Wells immobilisierten 8ΔTNF [144-157] und dem TNF-alpha-Biotin spezifisch und kann mit dem TNF-alpha sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von normalem Ziegenserum in Kompetition treten.

Beispiel 9

Bestimmung der Proteolysekinetik des Substrates ET (16-32) und dem Pro-Endothelin durch Alpha-Chymotrypsin

Das Peptid Pro-Endothelin 1-38 wurde aus handelsüblichen Quellen erhalten (Novabiochem, CH). Es wurden Lösungen dieses Peptids und des Peptides ET 16-32 mit Konzentrationen von 0,1 mg/ml in 50 mM TRIS bei pH 6,8 hergestellt, wozu Aliquots von Alpha-Chymotrypsin zugegeben wurden, so daß ein Enzym-Substrat-Verhältnis von 1/1000 erhalten wurde. Die Proteolysereaktion wurde dann durch Probenentnahme bei verschiedenen Inkubationszeiten bei 20ºC durchgeführt und Aliquots von 50 µl wurden mittels einer RP-HPLC einer chromatographischen Analyse unterworfen, wobei eine reversed-phase Säule ABI RP-300 30 x 2,1 mm I. D verwendet wurde, die bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min mit H&sub2;O/CH&sub3;CN/TFA 97/3/C equilibriert wurde und wobei der folgende lineare Elutionsgradient verwendet wurde:
wobei das Eluat bei einer Wellenlänge von 225 nm beobachtet wurde. Unter obigen Bedingungen waren die Elutionszeiten der Peptide und der relativen Fragmente wie folgt:
Der Abbau wurde dann in Prozent gemäß der folgenden Formel berechnet:
% Abbau = Aτ=0 - Aτ=x/Aτ=0 x 100
worin Aτ=0 der Fläche unter dem RP-HPLC-Peak des ET (16-32) oder ET (1-38) in Abwesenheit von Chymotrypsin entspricht, wohingegen A=x der Fläche des Fragments ET (16-21) oder ET (1-21) entspricht, das nach einer Behandlungszeit x mit Alpha-Chymotrypsin bei 20ºC bestimmt wurde Die Werte der Abbaukinetik der beiden Peptide ET (16-32) und Pro-ET (1-38) sind in Fig. 10 angegeben. Die gute Übereinstimmung der beiden kinetischen Kurven, die beim Abbau der beiden Peptide erhalten wurden, bestätigen, daß das Fragment 16-32 von Pro-Endothelin ein optimales Alternativsubstrat für das Studium der Wirkung von proteolytischen Enzymen sind, die für Pro-Endothelin spezifisch sind.

Beispiel 10

Test zur Bestimmung von in biologischen Flüssigkeiten vorliegenden pro-endothelinspezifischen proteolytischen Aktivitäten

A) Herstellung und Reinigung von Biotin ET (16-32). Die Markierung von ET (16-32) für die Durchführung analytischer Tests auf Kunststoffmikrocontainern wurde gemäß dem folgenden Verfahren dadurch durchgeführt, daß das Peptid mit Biotin derivatisiert wurde:

1) 2,5 mg ET (16-32) wurden gelöst in 1 ml 20 mM NaAc, pH 6,0, und es wurden 400 µl einer Lösung von Biotin-Aminocaproat-N-Hydroxysuccinimidester mit einer Konzentration von 2 mg/ml in Ethanol/Wasser 1/1 zugesetzt. Die Mischung wurde dann 5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert.
2) Die Reaktionsmischung wurde dann im Verhältnis 1/1 mit 50 mM TRIS, pH 6,8, verdünnt und 1 ml wurde in eine Affinitätssäule injiziert, die mit dem Peptid 8Δ ET (16-29) hergestellt wurde. Das gereinigte Produkt, das als Biotin-ET (16-32) bezeichnet wird, wurde gefriergetrocknet und direkt für die folgenden Stufen bzw. Schritte verwendet.

B) Herstellung von sensibilisierten Platten

Es wurden etliche 96-Well Polystyrolplatten (NUNC) mit 100 µl/Well einer Lösung mit einer Konzentration von 200 µg/ml 8ΔET (16-29) in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer bei pH 9,6 fur eine Stunde bei 20ºC sensibilisiert. Die Platten wurden dann durch wiederholtes Füllen und Entleeren mit einer Lösung von 0,15 M Natriumchlorid, 0,5% Natriumphosphat mit pH 6,5 (PBS) gewaschen. Zum Schluß wurde jedes Weil mit 200 µl einer 3%igen Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung in PBS versetzt, die 0,1 mM PMSF, 0,1 mM EDTA, 50 µg/ml Aprotinin enthielt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann achtmal mit PBS gewaschen.

C) Standardbehandlung

Jedes Weil wurde mit 100 µl einer Biotin-ET (16-32)-Lösung bei verschiedenen Konzentrationen (10; 1; 0,1; 0,001 und 0,0 microg/ml) PBS versetzt, die mit destilliertem Wasser, das mit 0,5% BSA (PBS-B) im Verhältnis 1/1 verdünnt wurde und zuvor mit verschiedenen Konzentrationen von Alpha- Chymotrypsin (10; 5; 1; 0,1; 0,0 µg/ml) vorbehandelt wurde und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde.

D) Entwicklung der Platten

Am Ende der Arbeitsgänge wurden die Platten mit 100 µl/Well einer Streptavidin-Peroxidaselösung (Sigma Chemical Company) versetzt, die im Verhältnis 0/1000 mit PES-B verdünnt wurde, das Tween 20 in 0,05%iger Konzentration enthielt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten mit PBS (achtmal) gewaschen und mit 100 µl/Well einer Lösung von 1 mg/m] o-Phenylendiamin in 0,1 M Natriumcitratpuffer bei pH 5 versetzt, das 6 mM Wasserstoffperoxid enthielt. Die chromogene Reaktion wurde für 30 Min. bei 20ºC durchgeführt und dann durch Zugabe von 100 µl einer 0,1 M Salzsäure gestoppt. Die optische Dichte in jedem Weil wurde mittels einer Mikroplattenlesevorrichtung (Biorad, Modell 3550 Microplate Reader) gemessen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt und zeigen, daß Biotin-ET (16-32) an das sensibilisierte Weil in einer Art und Weise bindet, die proportional zu seiner Konzentration ist, wenn es jedoch zuvor mit Chymotrypsin behandelt wurde, verliert es seine Fähigkeit zur Bindung. Daher ist es sofort offensichtlich, daß die Gegenwart von Enzymen, die ET (16-32) proteolysieren, sehr leicht dadurch entdeckt werden kann, daß die Probe unter Testbedingungen mit einer Standard-Biotin-ET (16-32)-Lösung inkubiert wird und dann die Menge an Biotin-ET (16-32) bestimmt wird, die an die sensibilisierten Wells bindet.

Beispiel 11

Test zum Auff inden von Inhibitoren von Droendothelinsspezifischen Droteolytischen Aktivitäten in biologischen Flüssigkeiten

A) Herstellung von sensibilisierten Platten

Etliche 96-Weil Platten wurden mit dem 8ΔET (16-29)- Peptid sensibilisiert, wie dies im vorhergehenden Beispiel 10 beschrieben ist.

B) Standardbehandlung

Einige Proben, die Inhibitoren von pro-endothelinspezifischen proteolytischen Aktivitäten enthielten (100 µl) wurden zu 50 µl einer Lösung gegeben, die eine Konzentration von 1 µg/ml Alpha-Chymotrypsin enthielt, das in 0,5% BSA PBS bei pH 6,8 enthielt und dann wurden 50 µl einer Lösung von Biotin-ET (16-32) bei einer Konzentration von 1 ug/ml zugegeben. 100 µl dieser Lösung wurden dann auf ein sensibilisiertes Well nach einer Inkubation von einer Stunde gegeben.

C) Entwicklung der Platten

Die Entwicklung wurde, wie zuvor in Beispiel 10 beschrieben, durchgeführt. Die hierbei erhaltenen Werte sind in Fig. 12 dargestellt und zeigen eindeutig, daß die Gegenwart von Inhibitoren in der analysierten Probe mit pro-endothelinspezifischen Enzymen leicht durch die positiven Werte in den Wells festgestellt werden kann. Wenn der Abbau von Biotin-ET (16-32) inhibiert ist, ist die Menge an biotinyliertem Substrat, das an die Wells binden kann, höher als diejenige von Proben, die keine solche inhibitorische Aktivität aufweisen.

Claims

1. Nicht-lineare Peptide die hydropathisch komplementär zu Peptiden oder Proteinteilen mit einer bekannten Aminosäuresequenz sind, wobei die Peptide dadurch gekennzeichnet sind, daß sie:

einen Aminosäurekern enthalten, welcher mindestens eine Aminosäure mit mindestens zwei terminalen Aminofunktionen enthält und daß sie

eine lineare Aminosäuresequenz aufweisen, die zur vorgenannten bekannten Aminosäuresequenz komplementär ist und die mittels einer Carbamido-Verknüpfung an jede der vorgenannten terminalen Aminofunktionen gebunden ist.

2. Nicht-lineare Peptide nach Ansrruch 1, worin die vorgenannte hydropathisch komplementäre Aminosäuresequenz aus einer Anzahl zwischen 10 und 20 Aminosäuren besteht.

3. Nicht-lineare Peptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der vorgenannte Aminosäurekern im zentralen Teil die folgende Formel aufweist:

wobei

X eine Aminosäure mit mindestens zwei funktionellen Aminoresten ist; Y eine Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Glycin oder Arginin; m eine Zahl im Bereich von 0 und 1 ist; n&sub1; , n&sub2;, n&sub3; und n&sub4; eine Zahl zwischen 0 und 10 bedeutet und wobei die Bindungen Carbamidbindungen sind.

4. Nicht-lineare Peptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die vorgenannte Aminosäure mit mindestens zwei terminalen Aminofunktionen (X) Lysin ist.

5. Nicht-lineare Peptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 3, worin die vorgenannte Aminosäure mit mindestens zwei terminalen Aminofunktionen (Y) Ornithin ist.

6. Nicht-lineare Peptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die vorgenannte Aminosäuresequenz hydropathisch komplementär zu einem Teil von "Big Endothelin" ist.

7. Nicht-lineare Peptide nach Anspruch 6, worin die vorgenannte Sequenz hydropathisch komplementär zu dem Teil von "Big Endothelin" mit Aminosäure 16 bis Aminosäure 29 ist.

8. Nicht-lineare Peptide nach Anspruch 7, worin die vorgenannte Sequenz die folgende Formel aufweist.

RKFLAGLRARRLKF.

9. Nicht-lineare Peptide nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 5, worin die vorgenannte Aminosäuresequenz hydropathisch komplementär zu einem Teil von TNF-alpha ist.

10. Nicht-lineare Peptide nach Anspruch 9, worin die vorgenannte Sequenz hydropathisch komplementär zum Teil 144-157 von TNF-alpha ist.

11. Nicht-lineare Peptide nach Anspruch 10, worin die vorgenannte Sequenz die folgende Formel aufweist:

DYLAGFKAHGKKYR.

12. Verfahren zur Synthese von nicht-linearen Peptiden nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das die folgenden Schritte umfaßt.

- Immobilisieren des Carboxylrestes einer Aminosäure an einer Festphase;

- Bilden einer Carbamidbindung zwischen dem Aminorest der vorgenannten Aminosäure und dem Carboxylrest einer Aminosäure mit mindestens zwei terminalen Aminofunktionen;

- Zugeben einer Aminosäure, die selbst mindestens zwei terminale Aminofunktionen aufweist, zu jeder der vorgenannten terminalen Aminofunktionen

- 0- bis zweimalige Wiederholung dieses Schrittes;

- Synthetisieren von linearen Peptiden, die mit jeder der vorgenannten terminalen Aminofunktionen kovalent verbunden sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Glycin, Alanin oder Arginin derart eingebaut sind, daß sie als Spacer zwischen den Aminosäuren mit mindestens zwei terminalen Aminofunktionen wirken;

14. Verfahren nach Anspruch 12, worin die vorgenannten Peptide hydropathisch komplementär zu mindestens einem Teil des vorgenannten Big Endothelin sind.

15. Verfahren nach Anspruch 12, worin die vorgenannten Peptide hydropathisch komplementär zu mindestens einem Teil des vorgenannten TNF-alpha sind.

16. Verfahren zur Herstellung von Affinitätschromatographiesäulen unter Verwendung von nicht-linearen Peptiden nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-11, umfassend die Schritte:

- Immobilisierung des derivatisierten Trägers auf einer chromatographischen Säule und Equilibrierung der vorgenannten Säule mit einem Salzpuffer;

- Injizieren einer Menge einer Rohverbindung, die das zu reinigende Protein oder Peptid enthält, in die Säule, wobei diese Menge mit der Trennkapazität der Säule kompatibel ist;

- Waschen der Säule mit einem Elutionspuffer, bis Fremdstoffe verschwunden sind, und Eluieren des vorgenannten an die Säule gebundenen Proteins oder Peptids durch Wechsel des Eluats, um der Bindung entgegenzuwirken.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das zu reinigende Protein Big Endothelin ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16, worin das vorgenannte zu reinigende Protein Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-alpha) ist.

19. Verfahren zur Bestimmung von Peptiden oder Proteinen aus sowohl natürlicher, als auch rekombinanter Herkunft in Proben, wobei das Verfahren umfaßt:

- Behandeln eines in Kompartimente aufgeteilten Behälters mit nicht-linearen Peptiden nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-11;

- Markieren eines gereinigten Aliquots des zu bestimmenden Peptids oder Proteins;

- Inkubieren des markierten Peptids oder Proteins im vorgenannten Behälter;

- Inkubieren der das vorgenannte zu bestimmende Peptid oder Protein enthaltenen Probe im vorgenannten Behälter;

- Bestimmen der Anwesenheit des vorgenannten zu bestimmenden Peptids oder Proteins in der vorgenannten Probe durch differentielle Bestimmungen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die vorgenannte Markierung mit Radioisotopen oder durch enzymatische Reaktionen oder mit einer fluoreszierenden oder chromophoren Gruppe oder mit Biotin durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, worin das zu bestimmende Protein Big Endothelin ist.

22. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, worin das vorgenannte Protein Tumor-Nekrose-Faktor (TNF-alpha) ist.

23. Verfahren zur Identifizierung von proteolytischen Aktivitäten und/oder von Inhibitoren dieser Aktivitäten, wobei das Verfahren

umfaßt, worin E die vorgenannte proteolytische Aktivität darstellt, die die Umwandlung eines Substrats A in Fragmente C und D katalysieren kann, wobei das vorgenannte Substrat A mindestens ein mit mindestens einer proteolytischen Angriffsstelle markiertes Proteinfragment enthält; I die vorgenannte inhibitorische Aktivität gegenüber E darstellt;

B einen Ligand darstellt, der das vorgenannte Substrat A, aber nicht die vorgenannten Fragmente C und D erkennen kann, wobei B aus Molekülen besteht, die aus einem Aminosäurekern bestehen, der mindestens eine Aminosäure mit mindestens zwei terminalen Aminofunktionen und einer linearen Aminosäuresequenz enthält, die hydropathisch komplementär zum vorgenannten Proteinfragment ist und über eine Carbamidbindung mit jeder der vorgenannten terminalen Aminofunktionen verbunden ist;

* angibt, daß das vorgenannte Substrat markiert ist.

24. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder von Inhibitoren solcher Aktivitäten nach Anspruch 23, worin die proteolytischen Aktivitäten und/oder Aktivitäten, die diese hemmen, in biologischen Flüssigkeiten oder Fermentationsbrühen oder Zellextrakten vorliegen.

25. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Aktivitäten, die diese hemmen können, nach einem der vorhergehenden Ansprüche 23 oder 24, worin das Proteinfragment mittels Radioisotopen oder Enzymen oder fluoreszierenden Verbindungen oder Chromophoren oder Biotin markiert ist.

26. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten nach Anspruch 25, worin das Proteinfragment mittels einer Derivatisierung durch Protein markiert ist und durch Inkubation mit einer an Streptavidin konjugierten Peroxidase nachgewiesen wird.

27. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 23 bis 26, wobei das Verfahren auch Vorrichtungen zum Trennen des Komplexes aus Protein- Ligandfragmenten, die nicht gebunden sind, und von proteolysierten Derivaten umfaßt.

28. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten nach Anspruch 27, worin das Trennungsmittel dadurch bereitgestellt wird, daß der Ligand an der Festphase immobilisiert wird und die ungebundenen Proteinfragmente und die proteolysierten Derivate abgewaschen werden.

29. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten nach Anspruch 28, worin die Festphase Kunststoffplatten umfaßt, die in Kompartimente aufgeteilt sind.

30. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 27 bis 29, umfassend die Bestimmung des markierten Proteinfragmentes, das an den an der Festphase immobilisierten Liganden gebunden ist.

31. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten nach einem der Ansprüche 23 bis 30, worin das Substrat ein Fragment von Pro-Endothelin umfaßt und der Ligand eine Aminosäuresequenz umfaßt, die hydropathisch komplementär zu dem Pro-Endothelinfragment ist.

32. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten nach Anspruch 31, worin das Fragment von Pro-Endothelin aus der Sequenz von Aminosäure 16 bis Aminosäure 32 aufgebaut ist und die Formel

HLDIIWVNTPEHIVPYG

aufweist und der Ligand das Molekül 8ΔET (16-29) ist.

33. Verfahren zum Nachweis von proteolytischen Aktivitäten und/oder Inhibitoren solcher Aktivitäten nach Anspruch 32, worin die Stelle des proteolytischen Angriffs zwischen der Aminosäure 21 und 22 des Fragmentes 16 bis 32 von Pro- Endothelin liegt, so daß beim Auftreten von proteolytischen Aktivitäten zwei Fragmente ET (16-21) und ET (22-32) gebildet werden, die nicht mit dem Molekül 8ΔET (16-29) binden können.