DE69123411T2

DE69123411T2 - 2-Benzothiazolyl tetrazolium salts as indicators

Info

Publication number: DE69123411T2
Application number: DE69123411T
Authority: DE
Inventors: Robert P Hatch; Nan-Horng Lin; Scott Ruetten
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1990-09-19
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2011-09-07
Also published as: EP0476457A2; AU626498B2; JPH04288076A; ATE145905T1; JP3157560B2; AU8341891A; EP0476457B1; ES2095892T3; GR3022399T3; DE69123411D1; CA2049230A1; CA2049230C; DK0476457T3; EP0476457A3

Abstract

2-Benzothiazolyl tetrazolium salt compounds have been found to be characterized by a reflectance spectrum exhibiting an extended plateau above about 600-650 nm. Such compounds are useful as chromogenic indicators for reducing substances such as NADH. The reflectance plateau confers improved accuracy to analytical assays, particularly for the determination of analytes of medical diagnostic significance, in which a colorimetric response on a reagent carrier matrix is measured by reflectance.

Description

DESCRIPTION

Die vorliegende Erfindung betrifft chromogene Tetrazoliumsalz- Indikatorverbindungen zur Verwendung bei der Bestimmung reduzierender Substanzen, insbesondere von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) Tetrazoliumsalze sind als chromogene Indikatoren, die gegenüber reduzierenden Substanzen eine Reaktion zeigen, wohlbekannt. Bei Reduktion werden Tetrazoliumsalze in Formazan-Farbstoffprodukte überführt. Diese Indikatoren haben auf vielen Gebieten ihre Anwendung gefunden, insbesondere auf dem Gebiet der medizinischen Diagnose, wo sie, u.a., bei der Färbung von Zellen sowie der Bestimmung von Analyten in Körperflüssigkeiten wie Urin, Milch, Serum und Plasma verwendet worden sind. Im allgemeinen ist bei der Bestimmung von Körperflussigkeitsanalyten eine NAD-abhangige enzymatische Reaktion involviert, wobei NADH als eine Funktion der Menge von in der getesteten Probe vorhandenem Analyt gebildet wird. Die Menge an erzeugtem NADH kann durch reduktive Überführung eines entsprechenden Tetrazoliumsalz-Indikators in sein Formazan-Farbstoffprodukt ermittelt und bestimmt werden.The present invention relates to chromogenic tetrazolium salt indicator compounds for use in the determination of reducing substances, in particular nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). Tetrazolium salts are well known as chromogenic indicators which react with reducing substances. Upon reduction, tetrazolium salts are converted into formazan dye products. These indicators have found application in many fields, in particular in the field of medical diagnosis where they have been used, among other things, in the staining of cells and the determination of analytes in body fluids such as urine, milk, serum and plasma. In general, the determination of body fluid analytes involves an NAD-dependent enzymatic reaction, with NADH being formed as a function of the amount of analyte present in the sample being tested. The amount of NADH produced can be determined by reductive conversion of a corresponding tetrazolium salt indicator into its formazan dye product.

Auf dem Gebiet medizinischer Diagnose-Testververfahren eignen sich Tetrazoliumsalz-Indikatoren für eine Vielzahl unterschiedlicher Produkttypen. Ein besonderer Typ ist der Reagensstreifen. Dieses Produkt stellt gewissermaßen eine Vorrichtung in festem Zustand dar, die eine Matrix aus Papier oder einem anderen porösen Träger umfaßt die mit chemischen Reagentien imprägniert oder auf sonstige Weise beaufschlagt ist, wobei die Reagentien gegenüber einem besonderen Analyt, z.B. Glucose oder Cholesterol, eine Reaktion zeigen. Das ein- bzw. aufgebrachte Reagenssystem enthält einen chromogenen Indikator, durch welchen eine Farbe als Funktion der Menge eines Analyt in einer auf die Matrix aufgebrachten Probe entwickelt oder verändert wird. Die sich ergebende kolorimetrische Reaktion kann in Augenschein genommen werden, um cualitative oder halb-quantitative Ablesungen zu ermöglichen. Quantitative Ergebnisse sind erhältlich, indem die Reflexion oder entsprechende Werte der Matrix-Oberfläche bei einer oder mehreren definierten Wellenlängen mit einem geeigneten Gerät (Reflexionsmeßgerät) abgelesen werden.In the field of medical diagnostic testing, tetrazolium salt indicators are useful in a variety of different types of products. One particular type is the reagent strip. This product is essentially a solid state device comprising a matrix of paper or other porous support impregnated or otherwise coated with chemical reagents which are reactive toward a particular analyte, e.g., glucose or cholesterol. The applied reagent system contains a chromogenic indicator which develops or changes color as a function of the amount of analyte in a sample applied to the matrix. The resulting colorimetric response can be observed to provide qualitative or semi-quantitative readings. Quantitative results are available by reading the reflection or corresponding values of the matrix surface at one or more defined wavelengths using a suitable device (reflection meter).

Es besteht ein anerkanntes Interesse an der Entwicklung von Tetrazoliurn-Indikatoren, die eine starke Absorption bei Wellenlängen aufweisen, die in einem längeren Wellenlängenbereich liegen als die Absorption der hauptsächlichen Störagentien, die in der Testprobe vorliegen können. Beispielsweise stellt eine Störung bzw. Interferenz aus bzw. durch Hämoglobin-Färbung ein besonderes einschlägiges Problem dar, wenn die Probe beispielsweise Gesamtblut ist. Indikatoren mit signifikanter Absorption bei ca. 640 nm sind erforderlich, um eine Hämoglobin-Interferenz im wesentlichen zu überwinden. Die allgemein verwendeten Tetrazoliumsalz-Indikatoren sind 2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid (INT), 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumchlorid (MTT) sowie 2,2',5,5-Tetraphenyl-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylen)ditetrazoliumchlorid (NBT). Diese Verbindungen zeigen Maximalabsorption (UVmax) im Bereich von 465 bis 605 nm.There is recognized interest in developing tetrazole indicators that exhibit strong absorption at wavelengths that are in a longer wavelength range than the absorption of the major interfering agents that may be present in the test sample. For example, interference from hemoglobin staining is a particularly relevant problem when the sample is, for example, whole blood. Indicators with significant absorption at approximately 640 nm are required to substantially overcome hemoglobin interference. The commonly used tetrazolium salt indicators are 2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride (INT), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium chloride (MTT) and 2,2',5,5-tetraphenyl-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)ditetrazolium chloride (NBT). These compounds show maximum absorption (UVmax) in the range of 465 to 605 nm.

Ein weiterer Mangel bei den gewöhnlich verwendeten Tetrazoliumsalz- Indikatoren des Standes der Technik betrifft die Entwicklung der Instrumentierung, die zur Messung der entsprechenden kolorimetrischen Reaktion heranzuziehen ist. Rasche Fortschritte werden bei der Entwicklung kleinerer, billigerer Reflexionsmeßgeräte erzielt. Eine der teureren Komponenten derartiger Meßgeräte ist das optische System, das eine Lichtquelle, einen Filter oder weitere Spektralelemente zur Auswahl oder Eingrenzung der Wellenlänge des ein- oder austretenden Lichts sowie einen Sensor umfaßt. Deutliche Kosteneinsparungen könnten realisiert werden, indem man Funktionen der Elemente des optischen Systems wegläßt oder kombiniert oder billigere Komponenten, z.B. LEDs als Lichtquellen mit entsprechender Leuchtkraft, verwendet. Allerdings emittieren handelsübliche LEDs Licht, das eine Zentralwellenlänge aufweist, die wegen Herstellungsabweichungen und Temperaturabhängigkeit deutlich schwanken kann. Die gewöhnlich verwendeten Tetrazoliumsalz-Indikatoren INT, MTT und NBT weisen Reflexionsspektren auf, die eine starke Neigung im Bereich oberhalb von deren tvmax aufweisen. Demzufolge können, wenn man nicht jeweils einzeln sowohl ein jedes Gerät zum Abgleich der Herstellungsvariabilität in der LED als auch einen jeden Testlauf zum Abgleich der aufgrund der Temperatur eintretenden Varianz kalibriert, große Fehler bei den Ergebnissen des Assay-Verfahrens entstehen.Another deficiency in the commonly used tetrazolium salt indicators of the prior art concerns the development of the instrumentation to be used to measure the corresponding colorimetric response. Rapid progress is being made in the development of smaller, cheaper reflectance meters. One of the more expensive components of such meters is the optical system, which includes a light source, a filter or other spectral elements for selecting or limiting the wavelength of the incoming or outgoing light, and a sensor. Significant cost savings could be realized by eliminating or combining functions of the elements of the optical system or by using cheaper components, e.g. LEDs as light sources with corresponding luminosity. However, commercially available LEDs emit light that has a central wavelength that can vary significantly due to manufacturing variations and temperature dependence. The commonly used tetrazolium salt indicators INT, MTT and NBT have reflectance spectra that slope strongly above their tvmax. Consequently, failure to calibrate each instrument individually to compensate for manufacturing variability in the LED and each test run to compensate for variability due to temperature can introduce large errors in the assay results.

Die folgenden Angaben sind repräsentativ für die jeweilige technische Lehre des Standes der Technik, betreffend die Verwendung verschiedener Tetrazoliumsalze in kolorimetrischen Analyseverfahren. Tanaka et al., JP 61000084 (Chem. Abst. 104:203469y), beschreiben den Nachweis von Glucose unter Verwendung eines Formazan-Chelat, erhalten durch Reduktion von 2-(2- Benzthiazolyl)-3-(carboxyphenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumhalogenid in der Gegenwart von Nickel(II). Limbach et al., DE 3 247 894 (Chem. Abst. 101:125929v), beziehen sich auf die Verwendung von INT in Glucose-Assayverfahren. Rittersdorf et al., DE 2 147 466, beschreiben die Verwendung von sieben 2-(2-Benzthiazolyl)-3-phenyl-5-(4-[trimethylammoniumiphenyl)tetrazoliumsalzen bei der Bestimmung reduzierender Substanzen wie reduzierender Zucker, von Ascorbinsäure und Ketosteroiden.The following information is representative of the respective technical teaching of the state of the art concerning the use of various tetrazolium salts in colorimetric analysis methods. Tanaka et al., JP 61000084 (Chem. Abst. 104:203469y), describe the detection of glucose using a formazan chelate obtained by reduction of 2-(2-benzthiazolyl)-3-(carboxyphenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium halide in the presence of nickel(II). Limbach et al., DE 3 247 894 (Chem. Abst. 101:125929v), refer to the use of INT in glucose assay procedures. Rittersdorf et al., DE 2 147 466, describe the use of seven 2-(2-benzthiazolyl)-3-phenyl-5-(4-[trimethylammoniumiphenyl)tetrazolium salts in the determination of reducing substances such as reducing sugars, ascorbic acid and ketosteroids.

Die in der Literatur bekannte Vielzahl von 2-Thiazolyltetrazoliumsalzen und/oder von deren entsprechenden Formazanen wird nun im folgenden kurz erörtert. Serebryakova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 10.1403 - 1405 (1970), beschreiben die Synthese und chromatischen Eigenschaften von Benzthiazolyl-3-phenyl(methyl)-5-p-nitro(dimethylamino)phenylformazanen. Die Autoren stellen fest, daß sowohl eine Elektronen-abziehende Nitro-Gruppe in der para-Position der N-5-Phenyl- Gruppe als auch eine Benzthiazolyl-Gruppe in der N-1-Position eine batochrome Verschiebung ergeben. Bednyagina et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 2:342 - 345 (1967), beschreiben die Synthese von 1-Benzthiazolyl- und 1-Benzoxazolyl-3-methyl-(oder phenyl)-5-arylformazanen. Die Beziehung zwischen der Farbtiefe und Basizität des Heterocyclus wird ebenfalls diskutiert. Gulemina et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 6:774 - 777 (1974), beschreiben den Effekt einer o-Nitro-Gruppe auf die Struktur und Eigenschaften von Benzthiazolylformazanen. Die Ionisierungskonstanten und IR- und UV-Spektren wurden bestimmt bzw. ermittelt und auf die Struktur bezogen. Lipunova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 4:493 - 499 (1974), beschreiben die Herstellung von 3-(Methyl, Isopropyl, Phenyl)-1-benzthiazolyl-5-nitrophenylformazanen sowie deren spektrale Eigenschaften. Gulemina et al., Zh. Prikl. Spektrosk. 22(5) :941 - 943 (1975), beschreiben die Beobachtung eines sowohl positiven als auch negativen UV-Thermochromismus in Abhängikeit von Lösungsmittel und Temperaturänderungsbedingungen für 1-Benzthiazolyl-, 1-Thiazolyl- und 1-(5-Bromthiazolyl)-3- methyl-5-(p-nitrophenyl)formazane. Ponyaev et al., Zh. Obshch. Khim. 55(11) :2615 - 2617 (1985), beschreiben kinetische Studien einer Interkonversion der photoinduzierten Formen von 1-Benzthiazolyl-3-methyl-5- phenylformazan-Analoga. Es wurde aufgezeigt, daß diese Formen tiefer gefärbt als Triphenylformazan sind Lipunova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin (1971) 831 - 835, vergleichen den bathochromen Effekt einer 5- Naphthyl- oder o-Tolyl-Gruppe auf das sichtbare Spektrum von 1-Benzthiazolylformazanen.The variety of 2-thiazolyltetrazolium salts and/or their corresponding formazans known in the literature will now be briefly discussed below. Serebryakova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 10.1403 - 1405 (1970), describe the synthesis and chromatic properties of benzthiazolyl-3-phenyl(methyl)-5-p-nitro(dimethylamino)phenylformazanes. The authors state that both an electron-withdrawing nitro group in the para position of the N-5-phenyl group and a benzthiazolyl group in the N-1 position result in a batochromic shift. Bednyagina et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 2:342 - 345 (1967), describe the synthesis of 1-benzothiazolyl- and 1-benzoxazolyl-3-methyl-(or phenyl)-5-arylformazanes. The relationship between the color depth and basicity of the heterocycle is also discussed. Gulemina et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 6:774 - 777 (1974), describe the effect of an o-nitro group on the structure and properties of benzthiazolylformazanes. The ionization constants and IR and UV spectra were determined and related to the structure. Lipunova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin. 4:493 - 499 (1974), describe the preparation of 3-(methyl, isopropyl, phenyl)-1-benzothiazolyl-5-nitrophenylformazanes and their spectral properties. Gulemina et al., Zh. Prikl. Spektrosk. 22(5) :941 - 943 (1975), describe the observation of both positive and negative UV thermochromism depending on solvent and temperature change conditions for 1-benzthiazolyl-, 1-thiazolyl- and 1-(5-bromothiazolyl)-3- methyl-5-(p-nitrophenyl)formazanes. Ponyaev et al., Zh. Obshch. Khim. 55(11) :2615 - 2617 (1985), describe kinetic studies of interconversion of the photoinduced forms of 1-benzthiazolyl-3-methyl-5-phenylformazan analogues. These forms were shown to be more deeply colored than triphenylformazan. Lipunova et al., Khim. Geterotsikl. Soedin (1971) 831 - 835, compare the bathochromic effect of a 5-naphthyl or o-tolyl group on the visible spectrum of 1-benzthiazolylformazanes.

Verschiedene 2-Benzthiazolyltetrazoliumsalze und verwandte Verbindungen sind auf photographischem Gebiet ebenfalls angewandt worden, wie dies gemäß der Beschreibungen in US 3 655 382 und 4 221 864 dargestellt ist.Various 2-benzthiazolyltetrazolium salts and related compounds have also been used in the photographic field, as shown in the descriptions in US 3,655,382 and 4,221,864.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden 2-Benzthiazolyltetrazoliumsalze bereitgestellt, die bei Reduktion Formazane ergeben, welche neue und verbesserte optische Eigenschaften aufweisen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus:According to the present invention, there are provided 2-benzthiazolyltetrazolium salts which upon reduction yield formazans having new and improved optical properties. The compounds of the present invention are selected from the group consisting of:

2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz, 2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz, 2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz, 2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitro-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitro-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(8-chinolyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz, 2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(8-quinolyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazoliumsalz, 2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-nitrophenyl)tetrazoliumsalz, 2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-nitrophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(2-methyl-4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(2-methyl-4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,2-(6-ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-chlor-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-chloro-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(4-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz,2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(4-methoxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(3,4-methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(3,4-methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(4-fluorphenyl)tetrazoliumsalz,2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5-(4-fluorophenyl)tetrazolium salt,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)- 5-(4-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz,2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)- 5-(4-methoxyphenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,2-(6-methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4,5- trimethoxyphenyl)tetrazoliumsalz,2-(6-methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4,5- trimethoxyphenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Methylbenzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,2-(6-methylbenzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Carboxybenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,2-(6-Carboxybenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxy-4-carboxyphenyl-5-[4-(2- (2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl]tetrazoliumsalz,2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxy-4-carboxyphenyl-5-[4-(2- (2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl]tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-acetamidophenyl)-5-(methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz, 2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-acetamidophenyl)-5-(methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(8-chinolyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)tetrazoliumsalz, 2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(8-quinolyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)tetrazolium salt,

2-tnaphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxyphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,2-tnaphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxyphenyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5- phenyltetrazoliumsalz,2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5- phenyltetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)-5-[4-(2,3- dihydroxypropylthio)phenyl]tetrazoliumsalz,2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)-5-[4-(2,3- dihydroxypropylthio)phenyl]tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-]-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazoliumsalz,2-[Naphtho(1,2-d)thiazole-]-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-ylj-3-(4-carboxyphenyl)-5-[4-(2-(2-(2- hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl)tetrazoliumsalz,2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-ylj-3-(4-carboxyphenyl)-5-[4-(2-(2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-carboxphenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz,2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-carboxphenyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-nitrophenyl)-5-(3,4- methylendioxyphenyl)tetrazoliumsalz und aus2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-nitrophenyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt and from

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-cyanophenyl)-5-(3-methoxyphenyl)tetrazoliumsalz. 2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-cyanophenyl)-5-(3-methoxyphenyl)tetrazolium salt.

Die vorliegenden Verbindungen sind durch ein Reflexionsspektrum gekennzeichnet, das eine ausgedehntes Plateau oberhalb 600, vorzugsweise oberhalb ca. 650, um aufweist. Ein derartiges Plateau bei den Reflexionswerten gibt eine verbesserte Genauigkeit bei analytischen Assayverfabren auf Basis von Reflexions-Ablesungs-Streifen, insbesondere wenn das optische Meßsystem schwankende Zentralwellenlängen aufweist bzw. erzeugt.The present compounds are characterized by a reflectance spectrum that has an extended plateau above 600, preferably above about 650, µm. Such a plateau in the reflectance values provides improved accuracy in analytical assay methods based on reflectance reading strips, especially when the optical measuring system has or generates varying central wavelengths.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, vorzugsweise von NADH.The compounds of the present invention are suitable for detecting a reducing substance, preferably NADH.

Somit betrifft die Erfindung außerdem ein Verfahren zum Nachweis einer reduzierenden Substanz, wobei man eines oder mehrere der Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung in ein Medium einbringt, von dem angenommen wird, daß es die reduzierende Substanz enthält, und man das Vorhandensein der reduzierenden Substanz durch eine Farbänderung im Tetrazoliumsalz ermittelt und bestimmt.Thus, the invention also relates to a method for detecting a reducing substance, which comprises introducing one or more of the tetrazolium salts of the present invention into a medium suspected of containing the reducing substance and detecting and determining the presence of the reducing substance by a color change in the tetrazolium salt.

Schließlich wird durch die vorliegende Erfindung ein Teststreifen zum Nachweis einer reduzierenden Substanz bereitgestellt, welcher eine oder mehrere der Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthält.Finally, the present invention provides a test strip for detecting a reducing substance which contains one or more of the compounds of the present invention.

Figuren 1 bis 4 zeigen die Reflexionsspektren der Formazane, die durch Reduktion der Tetrazoliumsalze INT, MTT, NBT sowie 2-(Benzthiazol-2- yl)-3-(1-naphthyl)-5-phenyltetrazoliumsalz (USSR) des Standes der Technik bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose erzeugt sind.Figures 1 to 4 show the reflection spectra of the formazans produced by reducing the tetrazolium salts INT, MTT, NBT and 2-(benzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-phenyltetrazolium salt (USSR) of the state of the art at different concentrations of glucose.

Figuren 5 bis 10 zeigen die entsprechenden Spektren für Formazane aus besonderen Indikatorverbindungen der vorliegenden Erfindung (siehe Liste am Anfang der Tabelle im die Beispiele betreffenden Abschnitt).Figures 5 to 10 show the corresponding spectra for formazans from particular indicator compounds of the present invention (see list at the beginning of the table in the Examples section).

Die Auswahl des Gegenanions beruht vorrangig auf Überlegungen bezüglich Stabilität und Löslichkeit des besonderen Tetrazoliumsalzes von Interesse. Im allgemeinen wird aus solchen Gegenanionen eine Auswahl getroffen, wie sie durch die anorganischen Anionen Chlorid, Bromid, Jodid, Nitrat, Fluoroborat, Perchlorat und Sulfat sowie durch organische Anionen wie Acetat, Oxalat, Tartrat und Arylsulfonate (Benzolsulfonat, Tosylat) dargestellt sind.The choice of counteranion is based primarily on considerations of stability and solubility of the particular tetrazolium salt of interest. In general, a selection is made from such counteranions as represented by the inorganic anions chloride, bromide, iodide, nitrate, fluoroborate, perchlorate and sulfate, as well as organic anions such as acetate, oxalate, tartrate and arylsulfonates (benzenesulfonate, tosylate).

Tetrazoliumsalze werden durch in der Literatur wohlbekannte Verfahren hergestellt (Hooper, W.D., Rev. Pure and Appl. Chem., 1969, 19, 221; Putter, R., in Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl-Müller ed., Thieme Verlag, Stuttgart, 1965, Bd. 10/3, S. 633; Nineham, A. W. Chem. Rev., 1955, S. 355 - 483). Im allgemeinen werden die Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man zuerst ein 2-Hydrazinothiazol mit einem Aldehyd reagieren läßt und dann das entstandene Hydrazon mit einem diazotierten Anilin behandelt. Das sich ergebende Formazan wird dann zum Tetrazoliumsalz durch wohlbekannte Verfahren oxidiert. Demnach beinhaltet die Synthese drei grundsätzliche Ausgangsmaterialien, und zwar den Aldehyd, das Anilin und das 2-Hydrazinothiazol. Aldehyd 2-Hydrazinothiazol Hydrazon diazotiertes Anilin Formazan TetrazoliumsalzTetrazolium salts are prepared by methods well known in the literature (Hooper, WD, Rev. Pure and Appl. Chem., 1969, 19, 221; Putter, R., in Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl-Müller ed., Thieme Verlag, Stuttgart, 1965, vol. 10/3, p. 633; Nineham, AW Chem. Rev., 1955, pp. 355 - 483). In general, the tetrazolium salts of the present invention are prepared by first reacting a 2-hydrazinothiazole with an aldehyde and then treating the resulting hydrazone with a diazotized aniline. The resulting formazan is then oxidized to the tetrazolium salt by well known methods. Accordingly, the synthesis involves three basic starting materials, namely the aldehyde, the aniline and the 2-hydrazinothiazole. Aldehyde 2-hydrazinothiazole hydrazone diazotized aniline formazan tetrazolium salt

Preparation of 2-hydrazinothiazoles

Die entsprechend substituierten 2-Hydrazinobenzthiazole werden aus 1- Halo-2-nitroarenen (1) hergestellt, indem man zuerst das Halogenid durch Thiocyanat ersetzt um das Nitrothiocyanat (2) zu erzeugen. Dieses wird dann mit reduzierenden Mitteln wie Zinn reduziert, und es wird das entstandene Aminothiocyanat (3) zum 2-Aminobenzthiazol (4) cyclisiert. The corresponding substituted 2-hydrazinobenzothiazoles are prepared from 1-halo-2-nitroarenes (1) by first replacing the halide with thiocyanate to generate the nitrothiocyanate (2). This is then reduced with reducing agents such as tin, and the resulting aminothiocyanate (3) is cyclized to the 2-aminobenzothiazole (4).

Das gleiche Aminothiocyanat (3) kann auch synthetisiert werden, indem man das Amin mit Thiocyanogen behandelt (Metzger, J. V., in Comprehensive Heterocyclic Chemistry, A. R. Katritzky, C. W. Rees ed.; Peragamon: New York, 1984; Vol. 6, Teil 4, S. 324). The same aminothiocyanate (3) can also be synthesized by treating the amine with thiocyanogen (Metzger, JV, in Comprehensive Heterocyclic Chemistry, AR Katritzky, CW Rees ed.; Peragamon: New York, 1984; Vol. 6, Part 4, p. 324).

Das 2-Hydrazinothiazol (5) wird dann hergestellt, indem man Hydrazin mit dem 2-Aminothiazol (4) in Ethylenglykol bei 140ºC zur Reaktion bringt (Liu, K-C., Shih, B-J., Arch. Pharm., 1985, 18, 283). The 2-hydrazinothiazole (5) is then prepared by reacting hydrazine with the 2-aminothiazole (4) in ethylene glycol at 140ºC (Liu, KC., Shih, BJ., Arch. Pharm., 1985, 18, 283).

Weitere Verfahren zur Herstellung von 2-Aminobenzthiazolen (4) beruhen darauf, daß man das aromatische Amin (6) mit Mineralsäure und Thiocyanat reagieren läßt, um den Thioharnstoff (8) zu erzeugen (Org. Synth., Coll. Vol. IV, 180), oder indem man das aromatische Amin N- Benzoylthiocyanat reagieren läßt um den N-Benzoylthioharnstoff (7) zu bilden, und man dann die Benzoyl-Gruppe hydrolysiert, um die entsprechende Thioharnstoff-Verbindung zu erzeugen (Org. Synth., Coll. Vol., III, 635). Weitere Verfahren zur Thioharnstoff-Herstellung können ebenfalls in diesen Literaturstellen aufgefunden werden. Diese Thioharnstoff-Verbindungen werden dann mit Reagentien wie Brom oxidiert, um 2-Aminobenzothiazole zu erzeugen (Bhargave, P. N., Baliga B. T., J. Ind. Chem., 1958, 5, 807). Other methods for preparing 2-aminobenzothiazoles (4) are based on reacting the aromatic amine (6) with mineral acid and thiocyanate to form the thiourea (8) (Org. Synth., Coll. Vol. IV, 180), or by reacting the aromatic amine N-benzoylthiocyanate to form the N-benzoylthiourea (7) and then hydrolyzing the benzoyl group to form the corresponding thiourea compound (Org. Synth., Coll. Vol., III, 635). Other methods for preparing thioureas can also be found in these references. These thiourea compounds are then oxidized with reagents such as bromine to produce 2-aminobenzothiazoles (Bhargave, PN, Baliga BT, J. Ind. Chem., 1958, 5, 807).

Production of aldehydes

Die Aldehyde werden aus handelsüblichen Quellen bezogen oder können durch Verfahren hergestellt werden, mit denen der auf dem einschlägigen Gebiet tätige Durchschnittsfachmann vertraut ist.The aldehydes are obtained from commercial sources or can be prepared by methods familiar to one of ordinary skill in the relevant field.

Beispielsweise können Aldehyde durch benzylische Oxidation eines Arylmethans (March, J. Advances Organic Chemistry Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, S. 1079) oder durch Reduktion eines Arylsäurechlorids (ibid., S. 396) oder Arylsäurederivats hergestellt werden (Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989, S. 604 - 605).For example, aldehydes can be prepared by benzylic oxidation of an arylmethane (March, J. Advances Organic Chemistry Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, p. 1079) or by reduction of an aryl acid chloride (ibid., p. 396) or aryl acid derivative (Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989, pp. 604 - 605).

Arylhalogenide können ebenfalls zur Synthese von Aldehyden herangezogen werden. Bei diesem Verfahren wird durch eine Transmetallierungsreaktion eine arylmetallische Spezies erzeugt die mit einer Reihe von Reagentien, wie mit Dimethylformamid, zur Erzeugung des Aldehyds behandelt werden kann (ibid., S. 681 - 683).Aryl halides can also be used to synthesize aldehydes. In this process, a transmetalation reaction generates an arylmetallic species that can react with a range of reagents, such as dimethylformamide, to generate the aldehyde (ibid., pp. 681 - 683).

Die vorgenannten Arylaldehyde, -säuren, -methane und -halogenide können mit einer Reihe funktioneller Gruppen vor deren Überführung in Tetrazoliumsalze derivatisiert sein. Dies kann durch aromatische nukleophile Substitution (March, J., Advances Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, S. 576 - 607), durch aromatische elektrophile Substitution (ibid., S. 447 - 511) oder durch Heteroatom-gesteuerte Metallierungsreaktionen (Gschwend, H. W., Rodriguez, H. R., in Organic Reactions, John Wiley and Sons: New York, 1979, Vol. 26, 1) durchgeführt werden.The above-mentioned aryl aldehydes, acids, methanes and halides can be derivatized with a variety of functional groups before their conversion into tetrazolium salts. This can be done by aromatic nucleophilic substitution (March, J., Advances Organic Chemistry, Third Edition; John Wiley and Sons: New York, 1985, pp. 576 - 607), by aromatic electrophilic substitution (ibid., pp. 447 - 511) or by heteroatom-directed metalation reactions (Gschwend, H. W., Rodriguez, H. R., in Organic Reactions, John Wiley and Sons: New York, 1979, Vol. 26, 1).

In Fällen, in denen der Aldehyd-Teil des Tetrazoliumsalzes ein Phenol oder Amin enthält, müssen diese Gruppen geschützt werden, so daß zwischen diesen und dem diazotierten Anilin oder dem zur Herstellung des Tetrazoliumsalzes verwendeten oxidierenden Mittel keine Reaktion eintritt.In cases where the aldehyde portion of the tetrazolium salt contains a phenol or amine, these groups must be protected so that no reaction occurs between them and the diazotized aniline or the oxidizing agent used to prepare the tetrazolium salt.

Dies kann durchgeführt werden, indem man einen Hydroxyarylaldehyd als ein Acetat schützt worauf die Reaktionsfolge zur Herstellung der Formazane abläuft, und man das Acetat bei pH 10 hydrolysiert. Ansäuerung auf pH 5 und anschließende Filtration ergeben das gewünschte Formazan.This can be done by protecting a hydroxyarylaldehyde as an acetate, following the reaction sequence to produce the formazans, and hydrolyzing the acetate at pH 10. Acidification to pH 5 and subsequent filtration yields the desired formazan.

Reagiert das entstandene Phenol-Formazan mit dem oxidierenden Mittel bei der Tetrazoliumsalz-Herstellung, kann das Phenol durch eine im Sauren labile Gruppe wie Dihydropyran geschützt werden (Greene, T. W., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons: New York, 1981, S. 87 - 113), welche dann durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen wieder abgespalten wird.If the resulting phenol formazan reacts with the oxidizing agent during the tetrazolium salt preparation, the phenol can be protected by an acid-labile group such as dihydropyran (Greene, T. W., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons: New York, 1981, pp. 87 - 113), which is then split off again by stirring the tetrazolium salt under acidic conditions.

In ähnlicher Weise müssen Amine am Aldehyd-Teil geschützt werden, um deren Reaktion zu verhindern. Dies wird am besten dadurch bewerkstelligt daß man ein im Sauren labiles Carbamat verwendet (ibid., S. 218 - 247), welches dann durch Rühren des Tetrazoliumsalzes unter sauren Bedingungen wieder abgespalten wird.Similarly, amines must be protected at the aldehyde moiety to prevent their reaction. This is best accomplished by using an acid-labile carbamate (ibid., pp. 218 - 247), which is then cleaved by stirring the tetrazolium salt under acidic conditions.

Production of arylamines

Arylamine können durch Reduktion der entsprechenden Nitro- oder Azid- Verbindung (Larock, P. C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989, S. 412 - 415 oder 409 - 410), durch Reaktion zwischen einer arylmetallischen Verbindung und einem elektrophilen Stickstoff-Reagens (ibid. S. 399 - 400) oder durch Umlagerung von Acylaziden oder oxidierten Amiden (ibid., S. 431 - 432) hergestellt werden.Aryl amines can be prepared by reduction of the corresponding nitro or azide compound (Larock, P. C., Comprehensive Organic Transformations; VCH: New York, 1989, pp. 412 - 415 or 409 - 410), by reaction between an arylmetallic compound and an electrophilic nitrogen reagent (ibid. pp. 399 - 400) or by rearrangement of acyl azides or oxidized amides (ibid., pp. 431 - 432).

Wie im Fall der Aldehyde können eine elektrophile und eine nukleophile aromatische Substitution dazu herangezogen werden, um verschiedene funktionelle Gruppen in das Arylamin oder dessen synthetische Vorstufenverbindung einzuführen.As in the case of aldehydes, electrophilic and nucleophilic aromatic substitution can be used to produce various to introduce functional groups into the arylamine or its synthetic precursor compound.

Die grundsätzliche Verwendung der Tetrazoliumsalz-Verbindungen der vorliegenden Erfindung beruht auf deren Einsatz als chromogene Indikatoren zum Nachweis reduzierender Substanzen. Insbesondere eignen sich die vorliegenden Verbindungen zum vorteilhaften Nachweis von NADH. Insowiet eignen sich, da NADH in Enzym-katalysierten Nachweisreaktionen erzeugt wird, die für verschiedene biochemische Substanzen spezifisch sind, die vorliegenden Verbindungen ganz besonders für Testverfahren in der medizinischen Diagnose. Im allgemeinen können aber auch andere reduzierende Substanzen nachgewiesen werden, wie Schwefelwasserstoffgas, Diboran, Arsenhydrid oder Phosphorhydrid.The basic use of the tetrazolium salt compounds of the present invention is based on their use as chromogenic indicators for detecting reducing substances. In particular, the present compounds are suitable for the advantageous detection of NADH. In this respect, since NADH is generated in enzyme-catalyzed detection reactions that are specific for various biochemical substances, the present compounds are particularly suitable for test procedures in medical diagnosis. In general, however, other reducing substances can also be detected, such as hydrogen sulfide gas, diborane, arsenic hydride or phosphorus hydride.

Bei den vorliegenden Verbindungen ist insbesondere herausgefunden worden, daß sie ein ausgedehntes Plateau in ihren Reflexionsspektren oberhalb ca. 600 nm aufweisen. Die am meisten bevorzugten Indikator- Verbindungen der vorliegenden Erfindung weisen ein Plateau oberhalb ca. 650 nm auf (d.h., der flachste, ca. 50 nm breite Teilbereich beginnt zwischen 640 und 660 nm). Ein derartiges Plateau bei den einschlägigen Reflexionswerten ergibt eine verbesserte Genauigkeit bei analytischen Testverfahren, die auf der Messung der Reflexion aus einem Reagensstreifen beruhen.In particular, the present compounds have been found to exhibit an extended plateau in their reflectance spectra above about 600 nm. The most preferred indicator compounds of the present invention exhibit a plateau above about 650 nm (i.e., the shallowest, about 50 nm wide sub-range begins between 640 and 660 nm). Such a plateau in the relevant reflectance values results in improved accuracy in analytical test procedures that rely on measuring reflectance from a reagent strip.

Reagensstreifen sind im Stand der Technik als analytische Vorrichtungen bekannt, die eine feste Trägermatrix umfassen, welche mit einer Test-Zusammensetzung beaufschlagt ist, die eine Farbänderung in Reaktion auf Kontakt mit einer flüssigen Testprobe erzeugt die den Analyt von Interesse enthält. Eine derartige Test-Zusammensetzung enthält im Fall der vorliegenden Erfindung (a) ein Reagens oder Reagentien, die mit dem Analyt reagieren, um eine reduzierende Substanz zu erzeugen, sowie (b) ein hier beschriebenes 2-Thiazolyltetrazoliumsalz, das sich durch eine derartige reduzierende Substanz reduzieren läßt, um ein chromogenes Formazan- Farbstoffprodukt zu erzeugen. Die Farb-Reaktionsweise derartiger Reagensstreifen kann visuell betrachtet werden, um halb-quantitative Werte zu ergeben. Es werden jedoch quantitative Ergebnisse erhalten, indem man das Reflexionsverhalten der Trägermatrix bei einer vorbestimmten Wellenlänge mißt. Derartige Messungen beinhalten, daß die zur Reaktion gebrachte Trägermatrix mit einer Lichtquelle bestrahlt und die Reflexion der Trägermatrix mit einem Sensor erfaßt werden, indem man das reflektierte Licht mit einem Detektor-Element mißt.Reagent strips are known in the art as analytical devices comprising a solid support matrix coated with a test composition which produces a color change in response to contact with a liquid test sample containing the analyte of interest. Such a test composition in the case of the present invention contains (a) a reagent or reagents which react with the analyte to produce a reducing substance and (b) a 2-thiazolyltetrazolium salt as described herein which can be reduced by such a reducing substance to produce a chromogenic formazan dye product. The color response of such reagent strips can be observed visually to give semi-quantitative values. However, quantitative results are obtained by measuring the reflectance of the support matrix at a predetermined wavelength. Such measurements involve irradiating the reacted carrier matrix with a light source and detecting the reflection of the carrier matrix with a sensor by measuring the reflected light with a detector element.

Das Auffinden von Tetrazoliumsalz-Indikatoren, die ein Reflexionsplateau aufweisen, erweist sich in den Fällen als besonders vorteilhaft, in denen das Reflexionsverhalten aus einem Reagensstreifen mit einem Instrument abzulesen ist, das einer Variabilität bei der Zentralwellenlänge seines optischen Systems (die Kombination von Lichtquelle, Detektor-Element, spektraler Steuerelemente, z.B. Filter, sowie weitere Komponente) unterliegt. Die Schwankung der Zentralwellenlänge des optischen Systems kann durch eine Reihe von Faktoren hervorgerufen werden, z.B. Variabilität bei der Zentralwellenlänge des hauptsächlichen spektralen Steuerelements wie der bestrahlenden Lichtquelle oder der Filter. Bei Verwendung von z.B. Licht-emittierenden Dioden (LEDs) als die Lichtquelle schwankt die Wellenlänge des emittierten Lichts in typischer Weise um ± 4 nm innerhalb eines Instruments und bis zu ± 8 nm zwischen LEDs bei verschiedenen Geräten, und zwar aufgrund der Herstellungsvarianzen. Darüber hinaus unterliegen LEDs einer variablen/schwankenden Zentralwellenlänge auch aufgrund von Temperatureffekten. Bei Verwendung von Breitband-Lichtquellen mit Filtern zur spektralen Steuerung der Zentralwellenlänge liegt die Schwankung innerhalb eines Geräts in typischer Weise unter 1 nm, kann jedoch bei den verschiedenen Geräten bis zu ± 6 nm ausmachen. Somit laßt sich die vorliegende Erfindung auch in jenen Situationen erfolgreich zur Anwendung bringen, in denen die Zentralwellenlänge des das in das entsprechende Gerät eingebaute Detektor-Element erreichenden Lichts Schwankungen im Bereich von ca. ± 5 nm unterliegt.Finding tetrazolium salt indicators that exhibit a reflectance plateau is particularly advantageous in cases where the reflectance behavior is to be read from a reagent strip with an instrument that is subject to variability in the center wavelength of its optical system (the combination of light source, detector element, spectral control elements, e.g. filters, and other components). The variation in the center wavelength of the optical system can be caused by a number of factors, e.g. variability in the center wavelength of the main spectral control element, such as the irradiating light source or filters. When using, for example, light-emitting diodes (LEDs) as the light source, the wavelength of the emitted light typically varies by ± 4 nm within an instrument and up to ± 8 nm between LEDs in different devices, due to manufacturing variances. In addition, LEDs are subject to a variable/fluctuating center wavelength also due to temperature effects. When using broadband light sources with filters for spectral control of the center wavelength, the variation within a device is typically less than 1 nm, but can be up to ± 6 nm in different devices. Thus, the present invention can also be successfully applied in those situations in which the center wavelength of the light reaching the detector element built into the corresponding device is subject to variations in the range of approximately ± 5 nm.

Bei der Herstellung eines Reagensstreifens zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist die Auswahl der Trägermatrix, der Testreagentien, die mit Analyt zur Erzeugung der reduzierenden Substanzen reagieren, sowie des Verfahrens, mit dem solche Reagentien und der Tetrazolium-Indikator in die Trägermatrix eingebracht werden, eine Angelegenheit, die im entsprechenden Stand der Technik wohlbekannt ist. Um nur einige Beispiele zu nennen, sind typische Trägermatrices poröse und absorbierende Materialien wie Papier, Tuch, Glasfaserfilter, polymere Membranen und Filme und dgl. Die entsprechenden Aufbringungsverfahren schließen Imprägnation einer gebildeten Trägermatrix mit einer Lösung, Suspension oder weiteren flüssigen Form der Test-Zusammensetzung, in einer oder mehreren Stufen, und anschließende Trocknung der Matrix, oder Bildung einer Matrix in Gegenwart einer oder mehrerer Komponenten der Test- Zusammensetzung ein, z.B. durch Gießen oder Beschichten von bzw. mit Lösungen film- oder membranbildender Formulierungen.In preparing a reagent strip for use in the present invention, the selection of the support matrix, the test reagents that react with analyte to produce the reducing substances, and the method by which such reagents and the tetrazolium indicator are introduced into the support matrix is a matter well known in the relevant art. To name just a few examples, typical support matrices are porous and absorbent materials such as paper, cloth, glass fiber filters, polymeric membranes and films, and the like. The corresponding application methods include impregnating a formed support matrix with a solution, suspension or other liquid form of the test composition, in one or more stages, and then drying the matrix, or forming a matrix in the presence of one or more components of the test composition, e.g., by casting or coating with solutions of film- or membrane-forming formulations.

Die vorliegende Erfindung wird nun, ohne allerdings darauf eingeschränkt zu sein, anhand der folgenden Beispiele noch weiter erläutert.The present invention will now be further explained, without however being limited thereto, by means of the following examples.

Examples A. Synthesis of the compounds Hydrazone production

Eine Aufschlämmung von 25 mmol des geeigneten Aldehyds und 25 mmol des geeigneten Hydrazins in 125 ml absolutem Ethanol wird 3 h lang am Rückfluß gehalten. Wasser wird mit 3A Molekularsieben in einem Soxhlet- Extraktor entfernt. Die Mischung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und dann filtriert, um das Hydrazon zu ergeben.A slurry of 25 mmol of the appropriate aldehyde and 25 mmol of the appropriate hydrazine in 125 mL of absolute ethanol is refluxed for 3 h. Water is removed using 3A molecular sieves in a Soxhlet extractor. The mixture is cooled to room temperature and then filtered to give the hydrazone.

Formazan production

Es wird zuerst das Diazoniumsalz hergestellt, indem man eine Aufschlämmung oder Lösung von 8,5 mmol des Amins in 60 ml 3 N HCl auf 5ºC abkühlt. Natriumnitrit (0,70 g, 10,15 mmol) in 5 ml Wasser wird dann zugetropft. Nach 30 min Rühren wird die Mischung zu einer kalten (-25ºC) Mischung von 8,5 mmol des Hydrazons in 120 ml von 1:1 (V/V) DMF-Pyridin getropft. Während der Zugabe läßt man die Temperatur der Reaktion nicht über -15ºC ansteigen. Unter 2 h Rühren läßt man die Temperatur der Mischung auf Raumtemperatur ansteigen. Nach Abf iltrieren erhält man das Formazan als schwarzen Feststoff. Verunreinigungen können durch wiederholtes Waschen mit Methanol oder durch Halten des Feststoffs in am Rückfluß siedendem Methanol und Heißfiltration beseitigt werden.The diazonium salt is first prepared by cooling a slurry or solution of 8.5 mmol of the amine in 60 mL of 3 N HCl to 5ºC. Sodium nitrite (0.70 g, 10.15 mmol) in 5 mL of water is then added dropwise. After stirring for 30 min, the mixture is added dropwise to a cold (-25ºC) mixture of 8.5 mmol of the hydrazone in 120 mL of 1:1 (v/v) DMF-pyridine. During the addition, the temperature of the reaction is not allowed to rise above -15ºC. The temperature of the mixture is allowed to rise to room temperature while stirring for 2 h. After filtration, the formazan is obtained as a black solid. Impurities can be removed by repeated washing with methanol or by holding the solid in refluxing methanol and hot filtration.

Tetrazolium salt production

Eine Aufschlämmung von 1,5 mmol des Formazans wird mit 20 ml Essigsäure und 4 ml Isoamylnitrit 16 bis 48 h lang gerührt. Die Mischung wird dann filtriert, um das Tetrazoliumsalz zu ergeben. In Fällen, in denen das Salz nicht niedergeschlagen werden konnte, verursachte eine Verdünnung mit Ether dessen Ausfällung.A slurry of 1.5 mmol of the formazan is stirred with 20 mL of acetic acid and 4 mL of isoamyl nitrite for 16 to 48 h. The mixture is then filtered to give the tetrazolium salt. In cases where the salt could not be precipitated, dilution with ether caused its precipitation.

B. Preparation of reagent strips

Jeder Indikator wurde in einen Reagensstreifen eingebracht und mit einer Lösung getestet, die eine bekannte Menge an Glucose, Cholesterol oder NADH enthielt. Der Reagensstreifen besteht aus einem Griff aus Polystyrol, worauf eine einzelne Reagens-Unterlage fest angeordnet ist. Die Reagens- Unterlage war ein Quadrat von 0,5 cm x 0,5 cm (0,2 x 0,2") und enthält Reagentien, die eine Farbänderung ermöglichen, die instrumentell abgelesen wurde, als eine entsprechende Teilmenge einer Probe mit dem entsprechenden Analyt aufgebracht wurde. Die Trockenphasen-Reagens-Unterlage ist ein fester Träger aus beispielsweise Cellulosefasern oder einer Nylon-Membran. Die Reagens-Unterlage wurde zuerst mit einer Lösung des Tetrazoliumsalzes von Interesse (0,8 M/l) und Detergens (0,3 %) in einem Lösungsmittel wie Methanol imprägniert. Die zweite Lösung zur Imprägnierung der Reagens- Unterlage enthält die folgenden Komponenten:Each indicator was placed in a reagent strip and tested with a solution containing a known amount of glucose, cholesterol or NADH. The reagent strip consists of a polystyrene handle with a single reagent pad firmly attached to it. The reagent pad was a 0.5 cm x 0.5 cm (0.2 x 0.2") square and contained reagents that allowed a color change to occur which was read instrumentally when an appropriate aliquot of a sample containing the corresponding analyte was applied. The dry phase reagent pad is a solid support made of, for example, cellulose fibers or a nylon membrane. The reagent pad was first coated with a solution of the tetrazolium salt of interest (0.8 M/l) and detergent (0.3%) in a solvent such as methanol. The second solution for impregnating the reagent pad contains the following components:

Glucose strips

Glucose-Dehydrogenase (GDH) 0,8 E/lGlucose dehydrogenase (GDH) 0.8 U/l

Diaphorase (DPH) 0,8 E/lDiaphorase (DPH) 0.8 U/l

NAD 0,03 Mol/lNAD 0.03 mol/l

PIPES-Puffer 0,15 Mol/lPIPES buffer 0.15 mol/l

Detergens 0,5 %Detergent 0.5%

Cholesterol strips

Cholesterol-Dehydrogenase (CDH) 0,3 E/lCholesterol dehydrogenase (CDH) 0.3 U/l

Cholesterol-Ester-Hydrolase (CEH) 0,6 E/lCholesterol ester hydrolase (CEH) 0.6 U/l

Diaphorase 0,3 E/lDiaphorase 0.3 U/l

NAD 0,4 Mol/lNAD 0.4 mol/l

PIPES-Puffer 0,2 Mol/lPIPES buffer 0.2 mol/l

Detergens 1 % V/VDetergent 1% V/V

Ca. 0,01 ml verschiedener Test-Lösungen (Serum, Plasma, wäßrig), enthaltend mindestens fünf verschiedene Analyt-Konzentrationen zwischen und 33 mM, wurden auf das Zentrum der getrockneten Reagens-Unterlage aufgebracht. Nach einem Zeitablauf von ca. 60 s wurden die Reflexionsspektren eines jeden Indikators bei Inkrementen von 5 nm über den Wellenlängenhereich von 400 bis 1100 nm gemessen:Approximately 0.01 ml of different test solutions (serum, plasma, aqueous), containing at least five different analyte concentrations between and 33 mM, were applied to the center of the dried reagent pad. After a time elapse of approximately 60 s, the reflection spectra of each indicator were measured at increments of 5 nm over the wavelength range of 400 to 1100 nm:

C. Usage data

Es folgt eine Tabelle mit spektralen und weiteren analytischen Daten, betreffend verschiedene synthetisierte Tetrazoliumsalze der vorliegenden Erfindung sowie verschiedene synthetisierte Vergleichsbeispiele. Die Verbindungen sind durch die allgemeine Formel (A) dargestellt: The following is a table with spectral and other analytical data concerning various synthesized tetrazolium salts of the present invention and various synthesized comparative examples. The compounds are represented by the general formula (A):

Die Verbindungen sind der Reihe nach aufgeführt, und zwar gemäß der Form des. jeweiligen Benzthiazolyl-Rests, dann gemäß ihrem R&sup6;-Substituent und schließlich gemäß ihrem R&sup5;-Substituent.The compounds are listed in order according to the form of the respective benzothiazolyl residue, then according to their R6 substituent, and finally according to their R5 substituent.

Beispielsweise ist die erste Verbindung unter A.1.a) angegeben, und weist die Formel A auf, worin alle Substituenten R¹ bis R&sup4; Wasserstoff (unter Bildung eines unsubstituierten Benzthiazolyl-Rings), R&sup6; 4-Nitrophenyl und R&sup5; 4-Acetamidophenyl sind; die zweite Verbindung A.1.b) weist denselben Benzthiazolyl-Rest und denselben R&sup6;-Substituent wie Verbindung A.1.a) auf, wobei aber R&sup5; Phenyl ist; usw.For example, the first compound is given under A.1.a) and has the formula A, in which all substituents R¹ to R⁴ are hydrogen (forming an unsubstituted benzothiazolyl ring), R⁶ is 4-nitrophenyl and R⁵ is 4-acetamidophenyl; the second compound A.1.b) has the same benzothiazolyl radical and the same R⁶ substituent as compound A.1.a), but R⁵ is phenyl; etc.

Beim Reflexionsspektrum der Tetrazoliumsalze wird davon ausgegangen. daß es von der Umgebung abhängig ist, in der es beobachtet, aufgenommen oder gemessen wird. Für Vergleichszwecke zwischen einzelnen Tetrazoliumsalzen schließen die unten angegebenen Daten eine Messung der relativen Flachheit des flachsten Teilbereichs des Reflexionsspektrums bei Wellenlängen von oberhalb 600 nm ein, wobei das Spektrum mit einem Glucose- oder Cholesterol-Reagensstreifen aufgenommen ist, die gemäß obigem Teilabschnitt B hergestellt sind. Die relative Flachheit des Spektrum ist in den Daten bzw. Meßergebnissen K/S-Einheiten ausgedrückt bzw. angegeben, die bezüglich der Gehaltsmenge an nachgewiesenem Analyt normalisiert sind, wie im folgenden definiert.The reflectance spectrum of tetrazolium salts is expected to be dependent on the environment in which it is observed, recorded or measured. For comparison purposes between individual tetrazolium salts, the data provided below include a measurement of the relative flatness of the flattest portion of the reflectance spectrum at wavelengths above 600 nm, the spectrum being recorded using a glucose or cholesterol reagent strip prepared in accordance with subsection B above. The relative flatness of the spectrum is expressed or reported in the data or measurement results in K/S units normalized to the amount of analyte detected, as defined below.

K/S ist durch die Gleichung definiert:K/S is defined by the equation:

(1-R)²/2R (1-R)²/2R

worin R instrumentell abgelesene Einheiten der Reflexionswerte sind. Eine Prozentänderung bei K/S ist die Anderung, ausgedrückt als ein Prozentsatz über einen Bereich von 50 nm, dividiert durch den Durchschnittswert der hohen und niedrigen K/S-Werte über diesen Bereich.where R are instrumentally read units of reflectance values. A percent change in K/S is the change expressed as a percentage over a range of 50 nm divided by the average of the high and low K/S values over that range.

Die Plateau-Eigenschaft der vorliegenden Erfindungen sollte für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als eine Prozentänderung im Reflexionsspektrum (auf Basis von im vorstehenden Abschnitt definierten KS- Werten) von weniger als ca. 17 % über eine Wellenlängenspanne von 30 bis 50 nm, beginnend bei einer Wellenlänge oberhalb ca. 600 nm, verstanden sein. Die bevorzugteren Verbindungen weisen ein Plateau mit einer Prozentänderung in K/S von weniger als ca. 10 % über eine Wellenlängespanne von 50 nm auf. Am meisten bevorzugt sind diejenigen Tetrazoliumsalz- Indikatoren, die eine Prozentänderung in K/S von ca. 5 % oder weniger über eine Wellenlängenspanne von 50 nm aufweisen. Verbindungen, die ein mehr geneigtes Reflexionsspektrum ergeben, sind dennoch bevorzugt solange der flachste Teilbereich bei Wellenlängen oberhalb 650 nm, vorzugsweise oberhalb 675 nm, liegt.The plateau property of the present inventions should be understood for the purposes of the present invention as a percent change in the reflectance spectrum (based on Ks values defined in the previous section) of less than about 17% over a wavelength span of 30 to 50 nm, starting at a wavelength above about 600 nm. The more preferred compounds exhibit a plateau with a percent change in K/S of less than about 10% over a wavelength span of 50 nm. Most preferred are those tetrazolium salt indicators that exhibit a percent change in K/S of about 5% or less over a wavelength span of 50 nm. Compounds that give a more sloped reflectance spectrum are still preferred as long as the flattest portion is at wavelengths above 650 nm, preferably above 675 nm.

Bezüglich der Zeichnungen, zeigen Figur 1 bis 4 die Reflexionsspektren der Formazane, die durch Reduktion der Tetrazoliumsalze INT, MTT und NBT des Standes der Technik bei verschiedenen Konzentrationen von Glucose erzeugt sind. Zum Vergleich zeigen Figuren 5 bis 10 die entsprechenden Spektren für ausgewählte Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Das Vorliegen eines Plateaus in den Spektren der Formazane aus den vorliegenden Verbindungen und das entsprechende Fehlen bei denjenigen der Formazane aus den Verbindungen des Standes der Technik sind unmittelbar ersichtlich.Referring to the drawings, Figures 1 to 4 show the reflection spectra of the formazans produced by reduction of the prior art tetrazolium salts INT, MTT and NBT at various concentrations of glucose. For comparison, Figures 5 to 10 show the corresponding spectra for selected compounds of the present invention. The presence of a plateau in the spectra of the formazans from the present compounds and the corresponding absence in those of the formans from the prior art compounds are immediately observable.

Die vier oben genannten Verbindungen des Standes der Technik ergeben Prozentänderungen in K/S über den Wellenlängenbereich von 650 bis 700 nm wie folgt:The four prior art compounds mentioned above give percent changes in K/S over the wavelength range of 650 to 700 nm as follows:

INT 71 %INT 71%

MTT 178 %MTT178%

NBT 73 %NBT 73%

USSR 28 %USSR 28%

Je niedriger der entsprechende Prozentwert beim K/S-Wert für das Formazan, desto toleranter ist das Tetrazoliumsalz bezüglich Abweichungen bei der Zentralwellenlänge des zur Messung der Reflexion und somit zur Messung der Analyt-Konzentration verwendeten optischen Systems.The lower the corresponding percentage value of the K/S value for the formazan, the more tolerant the tetrazolium salt is with regard to deviations in the central wavelength of the optical system used to measure the reflection and thus to measure the analyte concentration.

Die folgenden nicht-standardisierten Abkürzungen werden im nachfolgenden Text verwendet:The following non-standard abbreviations are used in the following text:

"UV" - Die Wellenlänge in Nanometern des Maximum-Reflexionspeak im UV- Reflexionsspektrum des Formazans. Der Extinktionskoeffizient und das bei der Messung verwendete Lösungsmittel sind in Klammer angegeben."UV" - The wavelength in nanometers of the maximum reflection peak in the UV reflection spectrum of the formazan. The extinction coefficient and the solvent used in the measurement are given in parentheses.

"nm" - Die Position des flachsten Teilbereichs des Reflexionsspektrums des Formazans über eine Wellenlängenspanne von 50 nm (angegeben als die beginnenden und endenden Wellenlängen in Nanometern)"nm" - The position of the flattest portion of the reflectance spectrum of the formazan over a wavelength span of 50 nm (expressed as the starting and ending wavelengths in nanometers)

"K/S" - Die Prozentänderung bei K/S-Einheiten über den oben genannten flachsten Teilbereich von 50 nm des Reflexionsspektrums. Die Konzentration an zur Erzeugung des Reflexionsspektrums verwendeten Analyt ist in Klammern angegeben. mmol betrifft die Konzentration in mmol/l."K/S" - The percent change in K/S units over the shallowest 50 nm portion of the reflectance spectrum mentioned above. The concentration of analyte used to generate the reflectance spectrum is given in parentheses. mmol refers to the concentration in mmol/L.

Table

Im folgenden ist eine Aufstellung der Verbindungen angegeben, deren Reflexionsspektren in Figuren 5 bis 10 der Zeichnungen gezeigt sind. Deren abgekürzte Bezugsnummer und Anordnung in der folgenden Tabelle, sind in Klammern vor den Verbindungsnamen angegeben. The following is a list of the compounds whose reflection spectra are shown in Figures 5 to 10 of the drawings. Their abbreviated reference number and arrangement in the following table are given in parentheses before the compound name.

Claims

1. 2-Benzthiazoletetrazolium salts selected from the group consisting of:

2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(Benzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-nitro-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(8-quinolyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(1-naphthyl)-5-(4-nitrophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(2-methyl-4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Ethoxybenzthiazol-2-yl)-3-(4-chloro-1-naphthyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(4-methoxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4- nitronaphthyl)-5-(3,4-methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5-(4-fluorophenyl)tetrazolium salt,

2-[(5,6,7,8)-Tetrahydronaphtho(2,3-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)- 5-(4-methoxyphenyl)tetrazolium salt,

2-(6-methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-methylbenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4,5- trimethoxyphenyl)tetrazolium salt,

2-(6-methylbenzthiazol-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-(6-Carboxybenzthiazol-2-yl)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxy-4-carboxyphenyl-5-[4-(2- (2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl]tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-acetamidophenyl)-5-(methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(8-quinolyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methoxyphenyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitronaphthyl)-5- phenyltetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-nitrophenyl)-5-[4-(2',3'- dihydroxypropylthio)phenyl]tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-carboxyphenyl)-5-(4- acetamidophenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-carboxyphenyl)-5-[4-(2-(2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy)ethoxy)phenyl]tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-carboxphenyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt,

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(2-methyl-4-nitrophenyl)-5-(3,4- methylenedioxyphenyl)tetrazolium salt and from

2-[Naphtho(1,2-d)thiazol-2-yl]-3-(4-cyanophenyl)-5-(3-methoxyphenyl)tetrazolium salt.

2. A method for detecting a reducing substance, which comprises introducing one or more of the tetrazolium salts according to claim 1 into a medium which is suspected of containing the reducing substance and determining the presence of the reducing substance by a color change in the tetrazolium salt.

3. Use of the compounds according to claim 1 for detecting a reducing substance, preferably NADH.

4. Reagent for detecting a reducing substance, which contains one or more of the compounds according to claim 1.

5. Test strip for detecting a reducing substance, which contains one or more of the compounds according to claim 1.