DE69114574T2

DE69114574T2 - Bazillus subtilis Mutant und Verfahren zur Herstellung von Surfactin durch Verwendung dieses Mutants.

Info

Publication number: DE69114574T2
Application number: DE69114574T
Authority: DE
Inventors: Paolo Carrera; Paola Cosmina; Guido Grandi
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1990-06-22
Filing date: 1991-05-29
Publication date: 1996-05-09
Anticipated expiration: 2011-05-30
Also published as: DK0463393T3; ATE130314T1; DE69114574D1; EP0463393B1; EP0463393A2; ES2082039T3; GR3018098T3; JP3030789B2; US5227294A; EP0463393A3; JPH04299981A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Mutante von Bacillus subtilis, die Surfactin in hohen Ausbeuten bilden kann, ein Verfahren zur Herstellung von Surfactin unter Verwendung des Stammes und die Verwendung des gebildeten Surfactins zur Lösung pharmazeutischer Probleme und von Energie und Umwelt-Problemen.
In den letzten Jahren hat das Interesse an Biosurfactants (biologisch abbaubaren oberflächenaktiven Agentien) mikrobiellen Ursprungs für die Verwendung als Agentien bei der technischen Gewinnung von Kohlenwasserstoffen, bei der Stabilisierung von Emulsionen und allgemein auf dem Energie- und Umweltgebiet beträchtlich zugenommen, da diese Produkte biologisch abbaubar sind und daher potentiell weniger toxisch sind als die derzeit verwendeten synthetischen Verbindungen.
Ein Biosurfactant von besonderem Interesse, das von Bacillus subtilis gebildet wird, ist Surfactin.
Diese Verbindung, die von Kakinuma et al. ["Agric. Biol. Chem.", 33: 971-972 (1969); "Agric. Biol. Chem", 33: 1523- 1524 (1969); "Agric. Biol. Chem.", 33: 973-976 (1969)] charakterisiert wurde, ist ein cyclisches Lipopeptid, das besteht aus einem Heptapeptid und einem Lipid-Anteil, der besteht aus einer Mischung von β-Hydroxyfettsäuren mit Ketten, die 13 bis 15 Kohlenstoffatome enthalten, und die folgende Struktur hat: L-Leu D-Leu beta-OH L-Asp L-Glu L-Val
Surfactin hat die Eigenschaft, daß es die Bildung von Blutgerinnseln und 3',5'-Monophosphatdiesterase hemmt (inhibiert) und Erythrozyten, Sphäroplasten und bakterielle Protoplasten auflöst.
Darüber hinaus hemmt (inhibiert) Surfactin die Fibrinogen- Thrombin-Reaktion, wodurch die Bildung von Fibrin verlangsamt wird; aufgrund dieser Eigenschaft ist die Substanz geeignet als aktives Element für die Herstellung von Zusammensetzungen, die als Antikoagulantien für die Prophylaxe der Thrombose und allgemein zur Verhinderung von Erkrankungen, wie Myocard-Infarkt, Lungenembolie und dgl., verwendbar sind.
Surfactin weist eine Anticholesterase-Aktivität auf, da es die Cholesterinspiegel in dem Blutplasma und in der Leber senkt, und außerdem weist es eine fungizide und antibiotische Aktivität auf.
Das Lipopetid übt seine bakteriostatischen Funktionen beispielsweise aus beim Wachstum von Mykobakterien, selbst in niedrigen Konzentrationen (5-10 ppm).
Darüber hinaus ist Surfactin ein starkes oberflächenaktives Agens und vermindert bei einer Konzentration von 0,005 % die Oberflächenspannung von Wasser von 72 mN/M auf 27 mN/M.
Aufgrund seiner vielfältigen Aktivität ist das Surfactin von besonderem Interesse, da es in breitem Umfang angewendet werden kann auf dem Gebiet der Pharmazeutika, der Energie und der Umwelt.
K. Arima et al. (US-Patent 3 687 926 und "Biochem., Bioph. Res. Commun.", 31: 488-494 (1968)) beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von Surfactin, das die folgende Struktur hat
das dadurch gekennzeichnet ist, daß der B. subtilis-Stamm ATCC 21331 oder ATCC 21332 verwendet wird.
Dieses Verfahren weist jedoch Nachteile auf, die aus den geringen Ausbeuten an Surfactin resultieren (0,05 bis 0,1 g/l Rohprodukt und 0,04 bis 0,05 g/l gereinigtes Produkt). Daher ist dieses Verfahren vom wirtschaftlichen Standpunkt aus betrachtet ökonomisch nicht sehr vorteilhaft.
Es sind bereits Verfahren zur Verbesserung der Surfactin- Ausbeuten vorgeschlagen worden und diese basieren im wesentlichen auf der Verwendung spezieller Kulturmedien oder Mutanten des B. subtilis-Stammes ATCC 21332 oder spezieller technischer Lösungen.
So beschreiben beispielsweise D.G. Cooper et al. ["Appl. Environ. Microbiol.", 42: 408-412 (1981)] ein Verfahren zur Herstellung von Surfactin durch Kultivierung von B. subtilis ATCC 21332, das unter anderem basiert auf der kontinuierlichen Entfernung des Schaums, der während der Fermentation gebildet wird und 90 bis 99 % des gebildeten Surfactins enthält.
Ziel der Entfernung des Schaums ist es, die Inhibierungswirkung, die hohe Konzentrationen an Surfactin auf das Bakterienwachstum haben, zu verhindern.
Unter diesen Bedingungen wird jedoch eine Surfactin-Ausbeute von 0,7 bis 0,8 g/l erhalten.
Darüber hinaus kann durch die kontinuierliche Entfernung des Schaums das Arbeitsvolumen des Fermentationsmediums, das aus dem Schaum ausgetragen wird, vermindert werden.
J. Sheppard und C. Mulligan ("Appl. Microbiol. Biotechnol.", 27: 110-116 (1987)) beschreiben ein Verfahren, bei dem eine Ausbeute von 0,16 g/l erhalten wird durch das Wachstum von B. subtilis-Zellen in einem Medium, das durch ein hydrolysiertes Torf-Protein ergänzt wird.
Darüber hinaus beschreiben C. Mulligan et al. ["Appl. Microbiol. Biotech.", 31: 486-489 (1989)] ein Verfahren zur Verbesserung der Surfactin-Ausbeute, das gekennzeichnet ist durch die Verwendung einer Mutante des B. subtilis-Wild-Typ-Stammes ATCC 21332.
Die Autoren berichten über eine Surfactin-Ausbeute von 0,562 g/l nach 40 h (S. 488, Tabelle 1), d.h., die um etwa 3,4 mal höher ist als diejenige, die durch das Züchten (Wachsenlassen) des Stammes vom Wild-Typ unter den gleichen Bedingungen erzielt wird.
Trotz des großen Arbeitsaufwandes wurde bisher noch kein Vorschlag gefunden, der wirtschaftlich genug ist, um in einem industriellen Maßstab weiterentwickelt werden zu können, hauptsächlich wegen der geringen Produktivität der bisher zur Verfügung stehenden Mikroorganismen.
Es wurde nun gefunden, daß die Probleme des Standes der Technik gelöst werden können durch eine neue Mutante von B. subtilis, die Surfactin in hohen Ausbeuten bilden kann.
Proben dieses Mutanten-Stammes wurden bei der American Type Culture Collection am 23. April 1990 unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 55033 hinterlegt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher der B. subtilis-Stamm ATCC 55033.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Surfactin in hohen Ausbeuten, bei dem der B. subtilis-Stamm ATCC 55033 verwendet wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des gebildeten Surfactins auf dem pharmazeutischen Gebiet, dem Gebiet der Energie und dem Umwelt-Gebiet.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung und den folgenden Beispielen hervor.
Der erfindungsgemäße B. subtilis-Stamm ATCC 55033 ist insbesondere charakterisiert durch eine gute genetische Stabilität (die Fähigkeit, die erworbene Mutation dauerhaft beizubehalten) und eine gute Beständigkeit gegenüber hohen Surfactin-Konzentrationen.
Dieser Stamm wurde erzeugt durch Mutation des B. subtilis- Wild-Typ-Stammes ATCC 21332, welcher für die Allgemeinheit allgemein zugänglich ist. Zu diesem Zweck ist es möglich, konventionelle Verfahren anzuwenden, die darin bestehen, daß man Zellen des Stammes vom Wild-Typ der Einwirkung von chemischen oder physikalischen mutagenen Agentien aussetzt, die Stämme, in denen die Surfactin-Ausbeute geändert ist, selektioniert (auswählt) und schließlich diejenigen Kolonien isoliert, deren Produktivität erhöht ist.
Chemische mutagene Agentien, können beispielsweise ausgewählt werden aus Diethylsulfat, NMU (Nitrosomethylurethan), NMG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) und physikalische Agentien können ausgewählt werden aus Röntgen- Strahlen, UV-Strahlen (Ultraviolett-Strahlen) und Gamma- Strahlen in mutagenen Dosen.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde der B. subtilis-Wild-Typ-Stamm ATCC 21332 zur Mutation veranlaßt (mutagenisiert) durch Verwendung von NMG in solchen Konzentrationen, die Mutationen in den Genomen der Mikroorganismen induzieren.
Die Mutanten, die Surfactin in hohen Ausbeuten bilden konnten (die Überproduktions-Mutanten) wurden dann ausgewählt (selektioniert) durch Analyse der Größen der Hämolyse-Höfe, die um die B. subtilis-Kolonien herum auftraten, die auf einem Kulturmedium, beispielsweise TBAB (DIFCO), dem Blut zugesetzt worden war, gezüchtet worden waren.
Es ist nämlich bekannt, daß der Durchmesser des Hämolyse- Hofes proportional zur Menge des durch die Zellen von B. subtilis gebildeten Surfactins ist (C. Mulligan und D. Cooper "J. Ferment. Technol.", 62: 158-179 (1984)).
Die Überproduktivität der so isolierten B. subtilis-Mutante ATCC 55033 wurde dann durch Fermentation des fraglichen Stammes in einem Kolben unter Verwendung des Wild- Typ-Stammes als Kontrolle bestätigt.
B. subtilis ATCC 55033 scheint besonders gut geeignet zu sein für die Produktion von Surfactin in hohen Ausbeuten unter Anwendung eines Fermentationsverfahrens.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann beispielsweise darin bestehen, daß man ein Inokulum des der Mutagenese unterworfenen Stammes unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Medium unterwirft, das assimilisierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält. Das Medium wird bei einer Temperatur zwischen 25 und 40ºC, vorzugsweise von 30 bis 37ºC, für eine Zeitspanne von weniger als 20 h, vorzugsweise von 6 bis 10 h, in Bewegung gehalten.
Es wurde nämlich gefunden, daß ein "altes" Inokulum (20 h alt) eine Schaumbildung verursacht, die schwer zu kontrollieren ist, so daß nach 5 h die Fermentation abgestoppt werden muß wegen der großen Verluste an Kulturmedium, das mit dem Schaum ausgetragen wird.
Andererseits ermöglichen "junge" Inokula (6-10 h alt) die allmähliche Schaumbildung mit einem begrenzten Verlust an Kulturmedium.
Dann wird dem Fermentationsmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie verschiedene Kationen, Anionen und möglicherweise Vitamine, wie Biotin oder Thyamin, und eine Aminosäure, die geeignet ist, um das Zellenwachstum und die Bildung von Surfactin zu fördern, ausgewählt aus L-Valin, L-Leucin, D-Leucin und L- Isoleucin, enthält, ein Prozentsatz des Inokulums zwischen 5 und 10 % (Volumen/Volumen) des Arbeitsvolumens zugesetzt.
Die anfängliche Zelldichte der Fermentation entspricht im allgemeinen einer O.D.&sub6;&sub0;&sub0; zwischen 0,025 und 0,040.
Zu assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff gehören Kohlenhydrate, wie Glucose, hydrolysierte Stärken, Melassen, Saccharose oder andere konventionelle Kohlenstoffquellen.
Beispiele für Stickstoffquellen können beispielsweise ausgewählt werden aus mineralischen Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumcarbonat, Harnstoff oder Produkten, die organischen oder anorganischen Stickstoff enthalten, wie Pepton, Hefeextrakt oder Fleischextrakt.
Die folgenden Kationen und Anionen sind ebenfalls geeignet für die Zwecke der vorliegenden Erfindung: Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Calcium, saure Phosphate, Sulfate, Chloride, Mangan und Nitrate.
Erfindungsgemäß ist ein Fermentationsmedium mit der in Beispiel 2 angegeben Zusammensetzung bevorzugt.
Die Fermentation wird in einem Behälter (einem Fermenter oder Bioreaktor) unter Rühren und unter intensiver Belüftung bei einer Temperatur in der Regel zwischen 25 und 40ºC, vorzugsweise zwischen 30 und 37ºC, unter kontinuierlicher Entfernung des gebildeten Schaums, der mehr als 98 % des gebildeten Surfactins enthält, durchgeführt.
Die Mengen an steriler komprimierter Luft, die von 0,2 bis 1,0 Vol./Vol./min variieren können, werden in dem Fermentationsmedium verteilt (diffundiert).
Der pH-Wert des Fermentationsmediums wir zwischen 6,0 und 7,2, vorzugsweise zwischen 6,7 und 6,9, gehalten.
Der pH-Wert kann beispielsweise durch Zugabe einer basischen wäßrigen Lösung, beispielsweise einer wäßrigen Lösung von Ammoniak, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat, eingestellt werden.
Es ist jedoch bevorzugt, den pH-Wert durch Verwendung von 10N Natriumhydroxid (NaOH) auf dem gewünschten Wert zu halten.
Die Rührgeschwindigkeit, die einer der Gründe für die Schaumbildung ist, wird im allgemeinen so gewählt, daß sie ein starkes Bakterienwachstum erlaubt, ohne dramatische Effekte auf die Schaumbildung zu haben.
Die anfängliche Rührgeschwindigkeit liegt in der Regel zwischen 150 und 400 UpM, vorzugsweise zwischen 200 und 300 UpM.
Schließlich wird das Arbeitsvolumen der Fermentation, das ein kritisches Element bezüglich der Bildung des Schaums zu sein scheint, so gewählt, daß die Schaumbildung begrenzt ist und damit die Verluste an zellulärer Biomasse, die zusammen mit dem gebildeten Schaum ausgetragen wird, begrenzt sind.
Die Entfernung des während des Fermentationsverfahrens gebildeten Schaums vermindert das Arbeitsvolumen und führt zu einem Verlust der darin enthaltenen Zellen.
Es gibt zwei mögliche Vorschläge, um dieses Problem zu lösen. In einem Falle kann frisches, steriles Kulturmedium dem Bioreaktor kontinuierlich zugesetzt werden (kontinuierliche Fermentation) und im zweiten Falle kann die Kulturbrühe (welche die Bakterienzellen enthält), die zusammen mit dem Schaum ausgetragen wird, in den Bioreaktor im Kreislauf zurückgeführt werden (Recyclisierung des Kulturmediums).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Kulturmedium, das zusammen mit dem entfernten Schaum eliminiert wird, in den Bioreaktor im Kreislauf zurückgeführt durch Verwendung beispielsweise eines automatischen Systems, wie es in Fig. 8 dargestellt ist.
Eine solche Fermentation könnte Probleme mit sich bringen aufgrund der Tatsache, daß die Konzentration des Surfactins in dem recyclisierten Medium einen nachteiligen Effekt auf die weitere Bildung von Surfactin in dem Bioreaktor haben könnte wegen des Inhibierungseffektes der Substanz auf das Bakterienwachstum (Cooper et al.).
Überraschenderweise haben die erhaltenen Ergebnisse jedoch einen Anstieg der Biomasse und konstante Surfactin-Werte in dem Bioreaktor gezeigt.
Dies deutet darauf hin, daß die Einführung einer konzentrierten Surfactin-Lösung aus dem Sammelbehälter in den Bioreaktor nur einen beschränkten Einfluß auf das Zellwachstum hat und daß das Surfactin keine Inhibierungswirkung auf seine eigene Synthese duch die Mutante B. subtilis vom Stamm ATCC 55033 hat.
Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß anders als bei dem B. subtilis-Wild-Typ-Stamm ATCC 21332 die erfindungsgemäße Mutante gegenüber hohen Surfactin-Konzentrationen beständiger sein kann.
Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können der Schaum und das Kulturmedium, die aus dem Bioreaktor entfernt werden, mittels eines Ultrafiltrations-Systems mit dem in Fig. 12 dargestellten Aufbau behandelt werden. Das Kulturmedium wird dann ohne das Surfactin in den Bioreaktor im Kreislauf zurückgeführt.
Wenn die Fermentation unter den bevorzugten Bedingungen durchgeführt wird, wird eine Konzentration an rohem Surfactin von 2,0 bis 4,0 g/l innerhalb eines Zeitraums von 40 bis 90 h erhalten.
Am Ende des Fermentationsverfahrens wird das Surfactin von dem Schaum und von der acellulären oder cellulären überstehende Flüssigkeit abgetrennt und gereinigt.
Für diesen Zweck können konventionelle Verfahren angewendet werden, beispielsweise die Ausfällung mit einer anorganischen Säure, wie Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure, oder mit einer Verbindung eines bivalenten Metalls, wie Calcium, oder durch Sättigung mit Ammoniumsulfat.
Diese Behandlung ermöglicht die selektive Ausfällung des Surfactins und einiger Lipopeptide und Lipoproteine, die von B. subtilis gebildet werden.
Dieser Ausfällungsstufe kann die Behandlung der acellulären überstehenden Flüssigkeit durch ein Ultrafiltrationssystem zur Entfernung gröberer Verunreinigungen und zur Konzentrierung des Arbeitsvolumens, das gereinigt werden soll, vorhergehen.
Der das Surfactin enthaltende Niederschlag wird dann durch Anwendung eines der bekannten Verfahren, beispielsweise durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform oder Methylenchlorid, oder durch Salzfällung mittels CaCl&sub2; oder NaCl, gereinigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert Mengen von 1,2 bis 2,0 g/l an gereinigtem Surfactin (99 %).
Die chemisch-physikalische Charakterisierung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Surfactins kann unter Anwendung konventioneller Methoden durchgeführt werden durch Anwendung chromatographischer, spektroskopischer oder spektrometrischer Verfahren.
Die durch Massenspektrometrie (FAB), Infrarotspektrometrie (IR), kernmagnetische Resonanz (NMR) und Hochdruck-Flüssigkeitchromatographie (HPLC) erhaltenen Ergebnisse bestätigten die Angaben in der Literatur.
Darüber hinaus wurde die Anwesenheit von Fettsäuremolekülen, die nicht nur in bezug auf die Länge ihrer Kohlenstoffketten (C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub5;), sondern auch in bezug auf ihre Strukturen, die normale, Iso- oder Anteiso-Strukturen sein können, voneinander verschieden sind, bestätigt.
Die Charakterisierung der oberflächenaktiven und aggregativen Eigenschaften des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Surfactins bestätigten die Daten in der Literatur.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Surfactin ist daher besonders gut geeignet als oberflächenaktives Agens, als Stabilisierungsmittel für therapeutische Verbindungen, z.B. als Arzneimittel für die Behandlung von Thrombosen, Embolien und Entzündungen, und auf dem Gebiet der Energie und der Umwelt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1

Eine Photographie einer Platte aus TBAB (DIFCO)-Medium, dem Blut zugesetzt worden war, welche die Hämolyse-Höfe des B. subtilis-Wild-Typ-Stammes ATCC 21332 und der B. subtilis Überproduzenten-Mutante ATCC 55033 zeigt.

Figur 2

Eine Eichkurve, in der das Gewicht (g/l) der festen Biomasse auf der Ordinate und die Extinktion bei 600 nm auf der Abszisse angegeben sind.

Figur 3

Eine Kurve, welche den Durchmesser (cm) des Hämolyse-Hofes, der auf dem TBAB-Medium, dem Blut zugesetzt worden ist, entsteht (auf der Koordinate) in Korrelation setzt zur Surfactin-Menge (mg/ml), die dem Medium zugesetzt wird (auf der Abszisse).

Figur 4

Eine Wachstumskurve der B. subtilis-Mutante ATCC 55033, welche die Zeit als Funktion der bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessenen Extinktion angibt im Vergleich zur Wachstumskurve des Stammes vom Wild-Typ.
Die Zeit ist auf der Abszisse in Stunden angegeben und die Extinktion (O.D.&sub6;&sub0;&sub0;) ist auf der Ordinate angegeben.

Figur 5

Ein Diagramm, welches das Zellenwachstum und die während der Fermentation der B. subtilis-Mutante ATCC 55033 nachgewiesene Surfactin-Bildung in einem Kolben angibt.
Die Zeit ist auf der Abszisse in h angegeben; der Wert für die Extinktion der Zellkultur bei einer Wellenlänge von 600 nm ist auf der Ordinate auf der linken Seite (in einem logarithmischen Maßstab) angegeben und die Menge (g/l) des von B. subtilis ATCC 55033 gebildeten Surfactins ist auf der Ordinate auf der rechten Seite angegeben.

Figur 6

Ein Diagramm, welches das Zellenwachstum zeigt, das während der Fermentation der B. subtilis-Mutante ATCC 55033 in einem Kolben in Gegenwart der Aminosäuren Val, Leu und Ile (*) und von Ile (o) nachgewiesen wurde.
Die Zeit ist auf der Abszisse in h angegeben; die Extinktion der Zellkultur bei einer Wellenlänge von 600 nm ist auf der Ordinate auf der linken Seite (in einem logarithmischen Maßstab) angegeben.

Figur 7

Ein Diagramm, das die Surfactin-Bildung während der Fermentation der B. subtilis-Mutante ATCC 55033 in einem Kolben in Gegenwart der Aminosäuren Val + Leu + Ile (*) und Ile (o) zeigt.
Die Zeit ist auf der Abszisse in h angegeben; die Menge (g/l) des gebildeten Surfactins ist auf der Ordinate auf der rechten Seite angegeben.

Figur 8

Ein Diagramm, das einen 2 l-Fermenter mit Recyclisierung zeigt, wobei bedeuten:
1) den Fermenter, 2) eine Lufteinlaß-Leitung, 3) eine Pumpe, 4) eine Leitung für verbrauchte Luft, 5) einen Schaumsammelbehälter und 6) die Leitung zur Recyclisierung des Kulturmediums.

Figur 9

Diese Zeichnung zeigt die Wachstumsgeschwindigkeit des B. subtilis-Stammes ATCC 55033, die in einem 2-l-Fermenter bei Verwendung von Inokula unterschiedlicher Alter erzielt wurde.
Die Zeit ist auf der Abszisse in h angegeben; die Wachstumsgeschwindigkeit ist auf der Ordinate angegeben.

Figuren 10 und 11

Diagramme, welche das Zellenwachstum und die Surfactin- Bildung zeigen, wie sie während der Fermentation der B. subtilis-Mutante ATCC 55033 "mit Recyclisierung" nachgewiesen wurde.
Die Zeit ist auf der Abszisse in h angegeben; der Wert für die Extinktion der Zellkultur bei einer Wellenlänge von 600 nm ist auf der Ordinate auf der linken Seite (in einem logarithmischen Maßstab) angegeben und die entsprechende Menge, die durch Messung der Flächen der drei chromatographischen Hauptpeaks, in denen die Anwesenheit von Surfactin nachgewiesen wurde, bestimmt wurde, ist auf der Ordinate auf der rechten Seite angegeben.

Figur 12

Ein Diagramm, das die Bildung von Surfactin bei kontinuierlicher Ultrafiltration des Produkts zeigt, wobei bedeuten:
1) den Fermenter, 2) eine Lufteinlaß-Leitung, 3) eine Pumpe, 4) eine Leitung für verbrauchte Luft, 5) einen Schaumsammelbehälter, 6) eine Ultrafiltrations-Patrone und 7) einen Behälter für das recyclisierte Kulturmedium.

Figur 13

A) zeigt Vergleichskurven des Wachstums der B. subtilis- Mutante ATCC 55033 während der Fermentation mit Recyclisierung und mit Ultrafiltration.
Die Zeit ist auf der Abszisse in h angegeben; der Wert für die Extinktion der Zellkultur bei einer Wellenlänge von 600 nm ist auf der Ordinate (in einem logarithmischen Maßstab) angegeben.
B) Vergleich der Surfactin-Mengen, die in dem Bioreaktor in einem Fermentationstest mit Ultrafiltration und in einem Fermentationstest mit Recyclisierung vorhanden sind.
Die Zeit ist auf der Abszisse in h angegeben; die Surfactin-Menge (g/l) ist auf der Ordinate angegeben.

Figur 14

Eine Eichkurve, welche die Surfactin-Menge, ausgedrückt in g/l (auf der Abszisse), in Korrelation setzt zu dem resultierenden Wert für die Summe der Flächen von 6 Peaks, die bei der HPLC-Analyse gebildet wurden (Ordinate).

Figur 15

Ein chromatographisches Profil einer 25 ug-Probe von gereinigtem Surfactin. Die drei Haupt-Peaks stehen für Surfactin, das an Fettsäuren mit variierenden Längen zwischen 13 und 15 Kohlenstoffatomen gebunden ist.

Figur 16

Die chromatographischen Profile dieser Zeichnung sind das Ergebnis der direkten Analyse von 50 ul der acellulären überstehenden Flüssigkeit, die während der Fermentation abgezogen wurde. Die Profile beziehen sich auf Proben, die 3, 4, 27 und 30 h nach Beginn des Versuchs entnommen wurden. Die Anwesenheit des Produkts ergibt sich eindeutig aus dem Auftreten und der nachfolgenden Entwicklung der chromatographischen Peaks, die sich auf die verschiedenen Komponenten von Surfactin beziehen (C13-C14-C15).

Figur 17

Die Charakterisierung einer Probe von gereinigtem Surfactin durch das FAB (Bombardierung mit schnellen Atomen)- Verfahren. Die dargestellten Hauptpeaks beziehen sich auf Produkte mit Molekulargewichten von 1008, 1022 bzw. 1036 und entsprechen Surfactin-Fraktionen, die an β-Fettsäuren mit Ketten variierender Längen gebunden sind.

Figur 18

Ein IR (Infrarot)-Spektrum einer Probe von gereinigtem Surfactin. Die Interpretation des Spektrums ist in Beispiel 6C angegeben.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung der B. subtilis-Mutante, die ein Überproduzent von Surfactin ist

Eine Vorkultur des B. subtilis Wild-Typ-Stammes ATCC 21332 (erhältlich von der American Type Culture Collection) wurde eine Nacht lang bei 37ºC auf einem Schaeffer-Sporenbildungsmedium mit der folgenden Zusammensetzung gezüchtet:
Nährstoff-Brühe (DIFCO) 8.0 g/l
KCl 1.0 g/l
MgSO&sub4; 1.25x10&supmin;¹ g/l
Agar (DIFCO) 16.0 g/l
MnCl&sub2;.4H&sub2;0 1.98x10&supmin;³ g/l
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 2.78x10&supmin;&sup4; g/l
Na&sub2;SO&sub4; 1.42x10&supmin;¹ g/l
H&sub2;O 1 l
pH 7.0
Eine Ösenfüllung der Vorkultur wurde dann verwendet zum Inokulieren von 10 ml DIFCO VY-Medium (Kalbsinfusionsbrühe 25 g/l und Hefeextrakt 5 g/l) und 16 h lang bei 37ºC wachsen gelassen.
Ein Teil (100 ul) der Kultur wurde in einen 100 ml-Kolben überführt, der 10 ml frisches VY-Medium enthielt, und unter langsamem Rühren (200 UpM) bei 37ºC wachsen gelassen (gezüchtet), bis eine optische Dichte (O.D.) von 0,7, bestimmt bei 600 nm mittels eines Beckman-Spektrophotometers (Modell DU70), erzielt war.
Die Bakterienzellen wurden dann von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 5000 UpM unter Verwendung eines Mod. SS. 34-Rotors auf einer Sorvall-Superzentrifuge, mit 5 ml TM-Puffer (0,05M Tris-HCl, 0,05M Maleinsäure, 1 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 g/l MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 5 mg/l Ca(NO&sub3;)&sub2;, 0,25 mg/l FeSO&sub4;.7H&sub2;O) gewaschen, mit 5N NaOH auf pH 6,0 gebracht, durch Zentrifugieren auf die gleiche Weise wie oben erneut abgetrennt und in 5 ml TM-Puffer wieder suspendiert.
Dann wurden 5 ml einer Lösung von hydratisiertem N-Methyl- N'-nitro-N-nitrosoguanidin (1:1 mit H&sub2;O) (Fluka) in einem TM-Puffer (0,3 mg/ml) zu der Zellensuspension zugegeben und danach unter Rühren bei 37ºC inkubiert.
Nach 30 min wurde die Suspension erneut zentrifugiert und die abgetrennten Zellen wurden mit 5 ml TM-Puffer gewaschen und dann in 50 ml frischem VY-Medium wieder suspendiert.
Portionen (1 ml) der Suspension wurden unter langsamem Rühren eine Nacht lang bei 37ºC wachsen gelassen (gezüchtet) und nach der Zugabe von 0,2 ml sterilem Glycerin wurden sie bei -80ºC eingefroren.
Dann wurden die B. subtilis-Mutanten ausgewählt (selektioniert) durch Verteilung (Ausstreichen) von Reihen-Verdünnungen (etwa 2 x 10² Zellen/Platte) der Portionen auf TBAB-Medium-Platten (Tryptose-Blut-Agar-Basis (DIFCO) 33 g/l), denen 5 % defibriniertes RAM-Blut (SCLAVO S.p.A.), das durch sterile Gaze filtriert worden war, nach 20-minütiger Sterilisierung bei 120ºC zugegeben worden war.
Nach der thermostatisch kontrollierten Inkubation bei 37ºC für 16 bis 24 h wurden die Durchmesser der Hämolyse-Höfe, die um die Bakterienkolonien herum auftraten, bestimmt (Fig. 1).
Es ist nämlich bekannt, daß die Größe des Hämolyse-Hofes (-Ringes) proportional zur Menge des von den B. subtilis- Zellen gebildeten Surfactins ist (C. Mulligan und D. Cooper, "J. Ferment. Technol.", 62: 158-179 (1984)).
Eine der Surfactin-Überproduktions-Kolonien, als B. subtilis SMS 274 bezeichnet, wurde als ATCC 55033 hinterlegt.

Beispiel 2

Herstellung von Surfactin in einem Kolben

Zum Inokulieren von 10 ml VY-Medium wurde eine Kolonie von B. subtilis SMS 274 verwendet und 16 h lang bei 37ºC bei 200 UpM wachsen gelassen.
100 ul dieser Vorkultur wurden dann in einen Kolben mit einer Kapazität von 2 l überführt, der 1 l eines Minimum- Mediums mit der folgenden Zusammensetzung enthielt:
Glucose 40.00 g/l
NH&sub4;Cl 4.00 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 4.00 g/l
NaHPO&sub4; 5.64 g/l
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0.20 g/l
CaCl&sub2;.2H&sub2;O 1.00x10&supmin;³ g/l
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 20.00x10&supmin;³ g/l
MnCl&sub2;.4H&sub2;O 1.98x10&supmin;&sup4; g/l
EDTA 1.50x10&supmin;³ g/l
pH 7.0
Die Kultivierung wurde unter Rühren (250 UpM) 24 und 48 h lang bei 37ºC in einem thermostatisch kontrollierten New Brunswick-Inkubator durchgeführt.
Bei allen Versuchen wurde der unter den gleichen Bedingungen gezüchtete B. subtilis-Stamm ATCC 21332 als Kontrolle verwendet.
Das Zellenwachstum (die Biomasse) wurde durch Bestimmung der optischen Dichte der Kulturbrühe bei 600 nm (DU 70- Spektrophotometer, Beckman Instruments, Inc., USA) überwacht unter Verwendung von Schalen mit optischen Durchgängen von 1 cm (Bio-Rad Laboratories, USA). Die O.D.-Werte wurden dann mittels einer Standard-Kurve, die unter Verwendung verschiedener Verdünnungen (mit bekannten Gewichten) der festen Biomasse des Mikroorganismus aufgestellt worden waren (Fig. 2), in g/l umgewandelt.
Das Surfactin wurde bestimmt durch Abscheidung von Portionen der acellulären überstehenden Flüssigkeit, die nach dem 5-minütigen Zentrifugieren von 2 ml Kulturbrühe (Biofuge A, Heraeus Sepatech, FRG) mit 7000 UpM bei 4ºC erhalten worden waren, auf TBAB-Medium-Platten, denen Blut zugesetzt worden war, und durch Bestimmung der Größen der gebildeten Höfe (Ringe).
Die überstehende Flüssigkeit wurde mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1:10 000 verdünnt.
Der Grad der Hämolyse der Blutzellen (die Größe der Höfe) wurde verwendet als Hinweis auf die Surfactin-Produktivitäten der Mikroorganismen.
Bestimmungen (Abschätzungen) der Ausbeuten wurden durchgeführt mittels einer Standardkurve, welche die Größen der Hämolyse-Höfe in Korrelation bringt zu bekannten Konzentrationen von Surfactin (Fig. 3).
Die Fig. 4 zeigt die Wachstumskurven der Mutanten SMS 274 und des Wild-Typ-Stammes ATCC 21332, die durch Bestimmung der O.D.&sub6;&sub0;&sub0;-Werte über einen bestimmten Zeitraum erhalten wurden.
Aus einer Analyse dieser Zeichnung ist zu ersehen, daß das Wachstum der B. subtilis-Mutanten SMS 274 vollständig vergleichbar ist mit demjenigen des Stammes vom Wild-Typ.
Die Fig. 5 zeigt die Surfactin-Wachstums- und -Bildungskurven für die Mutante SMS 274 und für den Stamm vom Wild- Typ.
Aus dieser Zeichnung ist zu ersehen, daß vorherbestimmbare Gehalte an Surfactin 10 h nach Beginn der Fermentation vorhanden sind, d.h. am Beginn der echt logarithmischen Stufe. Die in dem Fermentationsmedium vorhandene Surfactin-Menge steigt linear an im Vergleich zu der stationären Wachstumsphase mit einer Anreichungsgeschwindigkeit (ΔP/Δt) von etwa 0,32 g/lh. Ein Surfactin-Wert von 3,5 g/l wird während der stationären Phase erreicht. In diesem Test wurde nur die Menge an in dem Kulturmedium vorhandenem Surfactin bestimmt, die etwa vergleichbar war mit der Ausbeute an Gesamt-Surfactin.

Beispiel 3

Untersuchung des Effekts der Aminosäuren auf das Wachstum und die Bildung von Surfactin durch B. subtilis SMS 274

Es wurde eine Reihe von Test durchgeführt, um die Effekte (Einflüsse) der Aminosäuren auf das Wachstum und die Bildung von Surfactin durch die Mutante SMS 274 zu prüfen.
Die Tests wurden wie in Beispiel 2 in 2 l-Kolben durchgeführt, die jeweils 1 l Minimum-Medium, ergänzt durch 5 mg/l jeder der folgenden Aminosäuren enthielten: L-Leucin (Leu), L-Valin (Val), L-Isoleucin (Ile) und D-Leucin.
Die Ergebnisse zeigten, daß die Anwesenheit der drei Aminosäuren L-Leu, L-Val und L-Ile in dem Fermentationsmedium einen Anstieg der Biomasse induzierte (Fig. 6).
Während der ersten 20 h war die Surfactin-Bildung ähnlich derjenigen, die in der Kontrolle erhalten wurde (es wurde der gleiche Stamm in einem Medium ohne zusätzliche Aminosäuren gezüchtet), der Surfactin-Gehalt in dem Medium stieg jedoch während der stationären Phase an und am Ende der Fermentation war die Surfactin-Menge um etwa 30 % höher als diejenige, die in der Kontrolle gefunden wurde (Fig. 7 und Tabelle 1).
Wenn nur Ile dem Fermentationsmedium zugesetzt wurde, wurde festgestellt, daß das Zellwachstum gehemmt wurde und es trat eine Verzögerung von 1 h in bezug auf die Bildung von Surfactin ein. 60 h nach Beginn der Fermentation trat jedoch ein Anstieg von etwa 20 % des gebildeten Surfactins auf im Vergleich zur Kontrolle und das Surfactin: Zellen- Verhältnis betrug 1,19, was einen Anstieg der zellulären Bildung von Surfactin anzeigt. Tabelle 1 Aminosäuren Biomasse g/l Kontrolle Fußnote: das Surfactin srf wurde nach 60 h durch HPLC- Analyse bestimmt.

Beispiel 4

Herstellung von Surfactin in einem Fermenter mit Recyclisierung

Ziel des Tests war es, die Einflüsse (Effekte) von Parametern, wie des Alters des Inokulums, des Rührens und des Arbeitsvolumens, auf die Surfactin-Ausbeute zu untersuchen.
Eine Schräg-Vorkultur des Stammes B. subtilis SMS 274 wurde verwendet zum Inokulieren eines 100 ml-Kolbens, der 10 ml VY-Medium enthielt, und es wurde unter langsamem Rühren 16 h lang bei 37ºC inkubiert.
Dann wurden 500 ml-Kolben, die jeweils 100 ml Minimum-Medium enthielten, jeweils mit 1 ml des Vorinokulums inokuliert und einige wurden unter Rühren mit 350 UpM bei 37ºC 6 h lang ("junge" Inokula) und andere 20 h lang ("alte" Inokula) gehalten.
Die Kulturen (100 ml) wurden dann zum Inokulieren eines Fermenters mit einer Kapazität von 2 l, kontrolliert durch eine elektronische Kontrolleinheit (Instrumentation Laboratories) zur Überwachung und automatischen Korrektur der Temperatur, des pH-Wertes, des gelösten Sauerstoffs und der Rührgeschwindigkeit, verwendet.
Die Inokula wurden zu 1 l Minimum-Medium, das direkt in dem Fermenter sterilisiert wurde, zugegeben unter Bildung von End-Arbeitsvolumina von 1,1 bis 1,6 l.
Die anfängliche optische Dichte der Kultur (zum Zeitpunkt t&sub0;), bestimmt bei 600 nm unter Verwendung eines Beckman Spektrophotometer (Modell DU 70), betrug durchschnittlich 0,035.
Die anfänglichen Fermentationsbedingungen waren folgende:
Temperatur 37ºC
Belüftung 0,6-0,7 Vol./Vol./min
Rühren 200 - 700 UpM
pH-Wert 6,8 - 6,9
Diese Parameter wurden während der Fermentationsperiode automatisch konstant gehalten und insbesondere wurde der pH-Wert durch Zugabe von 10N NaOH bei etwa 6,8 gehalten.
Die Fermentationsperiode betrug 10 bis 90 h. Während der Fermentation wurde die anfängliche Rührgeschwindigkeit von 200 bis 220 UpM auf etwa 400 UpM erhöht, um pO2 > 15 % zu halten.
Der während der Fermentation gebildete Schaum wurde unter Verwendung einer Abluft-Auslaßleitung des Fermenters kontinuierlich entfernt (Fig. 8).
Etwa 20 h nach Beginn der Fermentation, d.h. wenn eine merkliche Menge an Surfactin und somit an Schaum gebildet worden war, wurde ein System zur Recyclisierung des aus dem Bioreaktor zusammen mit dem Schaum ausgetragenen Kulturmediums mittels einer Pumpe aktiviert, um das Arbeitsvolumen konstant zu halten.
Während der Fermentation wurde das Zellenwachstum durch Bestimmung der optischen Dichte bei 600 nm überwacht und das Surfactin in der acellulären überstehenden Flüssigkeit wurde durch HPLC-Analyse wie in Beispiel 8 beschrieben bestimmt.
Die erhaltenen Daten zeigten, daß:
- die besten Ergebnisse erhalten wurden bei einem anfänglichen Rühren von 200 bis 220 UpM; ein schnelleres Rühren (500 - 700 UpM) tatsächlich zu einer Schaumbildung führte, die schwer zu kontrollieren war, so daß 5 h nach Beginn der Fermentation der Versuch beendet werden mußte wegen eines übermäßig hohen Verlustes an Kulturbrühe;
- anders als ein "junges" Inokulum (6 h alt) ein "altes" Inokulum (20 h alt) eine schnelle und unkontrollierte Schaumbildung nur 5 h nach Beginn der Fermentation hervorrief (Fig. 9);
- ein Arbeitsvolumen ≤ 1,6 l (von 1,1 bis 1,41) bevorzugt ist.
Unter den bevorzugten Bedingungen wurde ein Zellenwachstum äquivalent zu 12 und 15 Einheiten Extinktion (O.D. 600) entsprechend etwa 4 g/l fester bakterieller Biomasse (für eine End-O.D.&sub6;&sub0;&sub0; von 15) nach 47 h (Fig. 10) bzw. 80 h (Fig. 11) beobachtet. Das Surfactin wurde aus der acellulären überstehenden Flüssigkeit und aus dem Schaum, der aus der Fermentation nach dem in Punkt (b) des Beispiels 7 beschriebenen Verfahrens resultierte, gereinigt.
Die Ergebnisse in bezug auf die Ausbeute des nach 47 und 80 h erhaltenen gereinigten Produkts betrugen 1,20 g/l bzw. 2,0 g/l.

Beispiel 5

Fermentation mit kontinuierlicher Ultrafiltration des Surfactins

Das System enthielt ein On-Line-Ultrafiltrationssystem, das mit dem Fermenter verbunden war (Fig. 12).
Das vorgeschlagene System bewirkte eine kontinuierliche Entfernung des Surfactins, das gebildet wurde während der Fermentation durch die Behandlung des Schaums und eines Teils der Fermentationsbrühe (die als Ergebnis des in dem Fermenter erzeugten Druckes ausgetragen wurde) in der Ultrafiltrations-Apparatur (Amicon Modell CH2A), die bestand aus einem Sammelbehälter, einer peristaltischen Pumpe und einer Hohlfaser-Ultrafiltrations-Patrone (Amicon Modell H1P30-43) mit einer nominellen Ausblendung (Abschnitt) bei 30 000 Dalton.
Wie in Fig. 12 dargestellt, passierte die Flüssigkeit aus dem Fermenter die Patrone (6) und der größte Teil des Surfactins (mehr als 95 %) wurde in dem Ultrafiltrationssystem in Form von Aggregaten zurückgehalten. Ein Pumpensystem (3) führte das Kulturmedium ohne das fragliche Produkt in den Fermenter zurück.
Während der Fermentation wurde das Zellenwachstum (durch Bestimmung der optischen Dichte bei 600 nm) überwacht und die Bildung von Surfactin wurde (durch das in Beispiel 8, Punkt A), beschriebene chromatographische Verfahren) überwacht. Die Tabelle 2 zeigt die Vergleichsdaten aus einem Fermentationstest mit Ultrafiltration und aus einem Fermentationstest ohne ein Recyclisierungssystem, wie es in Beispiel 4 eingebaut war. Tabelle 2 Surfactin Abschnitte Ultrafiltration Recyclisierung Fermenter Schaum filtrierte Flüssigkeit zurückgehaltene Flüssigkeit optische End-Dichte O.D.&sub6;&sub0;&sub0; Surfactin/Biomasse Einheiten
worin bedeuten:
* = Gramm Surfactin pro Gramm Biomasse pro Liter, errechnet nach der folgenden Formel:
g Surfactin/Einheiten (O.D.&sub6;&sub0;&sub0;) x 0,318 (Korrekturfaktor)
65 h nach Beginn der Fermentation entsprach das Zellenwachstum 7,2 Extinktionseinheiten (O.D.&sub6;&sub0;&sub0;) entsprechend etwa 2,3 g/l Gewicht der festen Bakterienbiomasse.
Das in dem Ultrafiltrationssystem konzentrierte Surfactin wurde dann nach dem im Punkt b) des Beispiels 7 beschriebenen Verfahren aus dem acellulären Medium gereinigt. Das Ergebnis in bezug auf die Ausbeute an gereinigtem Surfactin betrug 1,88 g/l.
Die Fig. 13 zeigt die Daten für das Zellwachstum (A) und den Wirkungsgrad der Entfernung des Surfactins (B) im Vergleich zu denjenigen, die bei der Fermentation mit einer Recyclisierung allein erzielt wurden.

Beispiel 6

Herstellung von Surfactin in einem 20-Liter-Fermenter mit Recyclisierung

Es wurde ein SETRIC G.A.-Fermenter, Modell SET.20, mit einer Kapazität von 20 l verwendet und er enthielt 11 l Minimum-Medium mit der in Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung.
Eine 6 h-Vorkultur (1 l) von B. subtilis SMS 274, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde in den Fermenter überführt (ein 10 %-Inokulum). Das End-Arbeitsvolumen betrug somit 12 l.
Bei diesem Versuch wurde auch ein System zur kontinuierlichen Entfernung des gebildeten Schaums und zur Recyclisierung des Fermentationsmediums verwendet.
Die Fermentation wurde unter Belüftung mit 0,5 Vol./- Vol./min bei einem anfänglichen Rühren mit 200 bis 220 UpM und bei einem pH-Wert von etwa 6,8, der durch eine 10N NaOH-Lösung bei diesem Wert gehalten wurde, bei 37ºC durchgeführt. Die übrigen Parameter wurden während der Dauer des Versuchs automatisch konstant gehalten.
17 bis 18 h nach Beginn der Fermentation wurde der in der Oberflächenschicht in dem Reaktior gebildete Schaum zusammen mit einem Teil des Fermentationsmediums in dem Sammelbehälter gesammelt und nach 28 h wurde die Pumpe zur Recyclisierung des Fermentationsmediums aktiviert, um das Arbeitsvolumen in dem Bioreaktor wieder einzustellen.
Während der stationären Phase erreichte das Zellenwachstum eine O.D.&sub6;&sub0;&sub0; von 6,6 mit einem Anstieg auf das 5- bis 6- fache desjenigen, das in einem 2-Liter-Fermenter erzielt worden war. Am Ende der Fermentation erhielt man 21 g (1,8 - 1,9 g/l) gereinigtes Surfactin.

Beispiel 7

Isolierung und Reinigung des Surfactins

Nachdem die Bakterienzellen durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 5000 UpM in einer Sorvall-Zentrifuge unter Verwendung eines Modell GS.3-Rotors entfernt worden waren, konnte das Surfactin aus der acellulären überstehenden Flüssigkeit und aus dem Schaum aus dem Fermentationsverfahren nach zwei alternativen Verfahren abgetrennt (gewonnen) werden:

a) Konzentration durch Ultrafiltration und anschließende Extraktion wie in Punkt (b)

Diese Behandlung hat zum Ziel, (1) das in der nachfolgenden Reinigungsstufe (b) zu behandelnde Volumen zu verringern und (2) aus der überstehenden Flüssigkeit Verbindungen mit niedrigen Molekulargewichten, die zusammen mit dem Surfactin während der nachfolgenden Reinigungsstufe (b) ausfallen könnten, zu entfernen.
Portionen der acellulären überstehenden Flüssigkeit wurden in der Amicon Modell 8101-Ultrafiltrations-Apparatur behandelt. Das System bestand aus einer Patrone (Amicon) mit einer Ausblendung (Abschnitt) von 30 000 Dalton, enthaltend 55 Ultrafiltrations-Hohlfasern, eine peristaltische Pumpe und einen Vorratsbehälter für die Probe.
Die in den Fasern zurückgehaltene Flüssigkeit wurde in den Vorratsbehälter des Ultrafiltrationssystems zurückgeführt, während die Flüssigkeit (welche die Substanzen mit niedrigen Molekulargewichten enthielt) aus dem System entfernt wurde. Das Surfactin wurde aus dem Vorratsbehälter gewonnen (abgetrennt).
Durch HPLC-Analyse wurde festgestellt, daß mehr als 95 % des gebildeten Surfactins in der zurückgehaltenen Flüssigkeit enthalten waren.

b) Ansäuerung und Extraktion mit organischen Lösungsmitteln

Die acelluläre überstehende Flüssigkeit und der Schaum aus der Fermentationsverfahren oder die Flüssigkeit aus der Stufe a) wurden durch Zugabe von 6N HCl auf pH 2,0 gebracht.
Das resultierende ausgeflockte Material wurde durch 15- minütiges Zentrifugieren mit 10 000 UpM in einer Sorval- Zentrifuge (Rotor Modell GS-3) von der Lösung getrennt und unter Vakuum getrocknet unter Verwendung eines Rotationsverdampfers 461 (Büchi, Schweiz).
Das auf diese Weise isolierte rohe Produkt wurde in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform oder Dichloromethan, wieder suspendiert und nach dem Rühren über Nacht wurde die resultierende Mischung durch ein Whatmann Nr. 4- Filterpapier filtriert, um die gröberen Verunreinigungen zu entfernen.
Das dabei erhaltene Filtrat wurde dann 2 mal mit gleichen Volumina an destilliertem Wasser mit einem pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0 unter langsamem Rühren für etwa 15 min extrahiert. Danach wurde die Mischung in einen Scheidetrichter gegeben und mehrere Stunden lang stehen gelassen, um die Auftrennung in zwei Phasen zu ermöglichen. Die das Surfactin enthaltenden wäßrigen Phasen wurden abgezogen, miteinander vereinigt und durch Zugabe von 6N HCl auf pH 2,0 angesäuert. Das Surfactin, das in Form von grauweißen Körnchen ausgefallen war, wurde durch Zentrifugieren mit 10 000 UpM abgetrennt, unter Vakuum getrocknet und möglicherweise gewogen, um die Ausbeute zu bestimmen.

Beispiel 8

Charakterisierung des gereinigten Surfactins

A) HPLC-Chromatographie-Analyse

Proben des gereinigten Surfactins wurden in einem Elutions-Puffer [50 % n-Propanol in 0,1 % TFA (Trifluoressigsäure)] gelöst zur Erzielung einer Endkonzentration zwischen 0,1 und 1,0 mg/ml, und dann durch HPLC analysiert.
Es wurde ein Beckman-Chromatographie-System verwendet und es bestand aus zwei Pumpen vom Modell 110 B, einer Kontrolleinrichtung Modell 421 A, einem UV-Detektor Modell 163 und einem Shimadzu-Integrator Modell C-R3A.
Für die chromatographischen Trennungen wurde eine Licrospher 100 RP-18-Säule (5 um) mit einer Licrospher 100 RP-18-Vorsäule (5 um) (Merck) verwendet. Die chromatographischen Bedingungen waren folgende:
- Temperatur Umgebungstemperatur(20-25ºC)
Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min
- UV-Detektor 220 nm
Eluierungsmittel 50 % n-Propanol in 0,1 % TFA
injiziertes Volumen 100 ul
Trennzeit 30-40 min.
Die HPLC-Analyse wurde angewendet zur Charakterisierung der Reinheit und Menge der chromatographischen Probe und auch zur Verfolgung der Bildung von Surfactin über einen Zeitraum während der Fermentation.
Die in Fig. 14 dargestellte Standardkurve, in der die Summe der Flächen von 6 Peaks als Funktion der Konzentration an Surfactin aufgetragen ist, wurde für diesen Zweck verwendet.
Es wurde ein gleiches Volumen von n-Propanol + 0,1 % TFA zu den Proben der acellulären überstehenden Flüssigkeit (50 ul) zugegeben, die möglicherweise mit destilliertem Wasser verdünnt wurde, und dann in die Säule eingespritzt.
Die Fig. 15 zeigt die Trennung einer 50 ug-Probe von gereinigtem Surfactin und die Fig. 16 zeigt das während der Fermentation mit Recyclisierung gebildete Surfactin, nachdem der Stamm 3, 4, 27 und 30 h wachsen gelassen worden war.

B) Massensepktroskopie

Die Molekulargewichte der getesteten Verbindungen wurden durch Massenspektrometrie ermittelt.
Für die Analyse wurde ein Finnigan-Massenspektrometer, Modell MAT/90, verwendet, das mit einer Iontech Atompistole ausgestattet war, der Xenon-Gas zugeführt wurde, das durch FAB-Ionisierung mit 7KV beschleunigt wurde (Bombardierung mit schnellen Atomen).
Als Matrix wurde entweder Glycerin/Thioglycerin (1:1, Vol./Vol.) oder p-Nitrobenzylalkohol verwendet.
Die Massenspektren wurden durch ein Datenintegrationssystem aufgezeichnet und unter Verwendung eines Perfluorokerosin-Gemisches (PFK) wurde automatisch eine Eichung durchgeführt.
Die Analyse wurde sowohl mit gereinigten Surfactin-Proben als auch mit einzelnen Fraktionen durchgeführt, die durch präparative chromatographie Trennung (HPLC) wie im Punkt (A) beschrieben erhalten wurden.
Die Spektren für die zuerstgenannten Proben zeigten die Anwesenheit von drei Hauptpeaks mit Massen [M+H]&spplus; von 1008, 1022 bzw. 1036 an (Fig. 17).
Diese Ergebnisse stimmen mit denjenigen überein, die von C.N. Mulligan et al. ["Appl. Microbiol. Biotechnol.", 31: 486-489 (1989)] angegeben sind.
Die mit den einzelnen Fraktionen erhaltenen Massenspektren zeigten die Anwesenheit von mindestens sechs verschiedenen Komponenten an, deren Art durch die Anwesenheit von Fettsäuremolekülen mit normalen, iso- und anteiso-Strukturen erklärt werden kann.

c) Infrarotanalyse (IR)

Zur Bestätigung der genauen Struktur des bei Verwendung des mutierten B. subtilis-Stammes SMS 274 erhaltenen Surfactins wurde eine gereinigte Probe unter Anwendung des folgenden Verfahrens einer Infrarotanalyse unterworfen:
Nachdem die Probe in KBr (1 mg Surfactin in 300 mg KBr) dispergiert worden war, wurde die resultierende Suspension in einer Achat-Schale in einer Schwingmühle etwa 5 min lang gemahlen, homogenisiert und dann zu einer Tablette gepreßt. Die Probe wurde einem Druck von 10 t/cm² unterworfen unter Bildung eines transparenten Pellets, das eine Nacht lang unter Vakuum bei 60ºC getrocknet wurde.
Die so behandelte Probe wurde dann mit einem Spektrometer mit einem Digilab-Interferometer, Modell FTS15E, analysiert. Die Daten des Spektrums (Fig. 18) können wie folgt interpretiert werden:

1. C-H-Bereich

Die Absorptionsbanden bei 2958, 2929 und 2856 cm&supmin;¹ überwiegen und zeigen die -CH&sub3;-Gruppe an. Die Daten zeigen auch die Anwesenheit einer großen Anzahl von -CH&sub2;-Gruppen. Die Bande bei 1470 cm&supmin;¹ ist eine Schwingungsdeformation der -CH&sub2;- und -CH&sub3;-Gruppen.

2. C=O-Bereich

Die starke Bande bei 1649 cm&supmin;¹ ist auf sekundäre Amide zurückzuführen. Die zweite starke Bande bei 1539 cm&supmin;¹ entspricht der -CO-NH-R-Gruppe. Eine dritte halbschwache Amid-Bande ist bei 1261 cm&supmin;¹ zu beobachten, während eine bei 1734 cm&supmin;¹ beobachtete starke Bande auf eine Carbonylgruppe zurückzuführen ist.

3. CH&sub2;, CH&sub3;-Knickung

Delta-CH&sub2;-Delta-CH&sub3; zwischen 1470 und 1380 cm&supmin;¹
1470 = Delta-CH&sub2; + Delta-CH&sub3;
1380 = DeltasymCH&sub3; ist stärker und zeigt an, daß CH&sub3; überwiegt, die Anwesenheit von geminalen CH&sub3;-Gruppen und wahrscheinlich der Effekt einer C=O-Gruppe in der β-Stellung.

4. (O-H)- und (N-H)-Absorption

Das Spektrum zeigt Schwingungen der O-H- und N-H-Bindungen bei 3070 und 3300 cm&supmin;¹. Diese entsprechen den folgenden Gruppen:
3070 cm&supmin;¹: -CO-NH
3300 cm&supmin;¹: =N-H
Die erhaltenen Ergebnisse stimmten überein mit denjenigen, die von H. Kratzschmar et al ["J. of Bacteriol.", 170: 5347-5353, (1988)] publiziert wurden.

Claims

1. Bacillus subtilis ATCC 55033.

2. Verfahren zur Herstellung von Surfactin, das umfaßt:

a) das Züchten (Wachsenlassen) des Bacillus subtilis- Stammes ATCC 55033 unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, möglicherweise unter Zugabe von Vitaminen und Aminosäuren, bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 7,2 und bei einer Temperatur zwischen 25 und 42ºC,

b) die Entfernung des gebildeten Schaums aus dem Fermentationsbehälter und schließlich

c) die Abtrennung und Reinigung des erhaltenen Surfactins.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Kulturmedium, das in dem in der Stufe b) entfernten Schaum enthalten ist, in die Stufe a) im Kreislauf zurückgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das in dem Kulturmedium und in dem Schaum enthaltene Surfactin durch ein Ultrafiltrations-System entfernt wird und das Medium ohne das Produkt in die Stufe a) im Kreislauf zurückgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem assimilierbare Quellen für Kohlenstoff Kohlenhydrate, wie Glucose oder Saccharose, hydrolysierte Stärken, Melassen oder andere konventionelle Kohlenstoffquellen sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Kohlenstoffquelle Glucose ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem assimilierbare Quellen für Stickstoff mineralische Ammoniumsalze, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumcarbonat, Harnstoff oder Substanzen, die organischen oder anorganischen Stickstoff enthalten, wie Pepton, Hefeextrakt oder Fleischextrakt, sind.

8. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Kationen und Anionen Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Calcium, saure Phosphate, Sulfate, Chloride, Mangan und Nitrate sind.

9. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Vitamine aus Biotin und Thyamin ausgewählt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Aminosäuren aus L-Leucin, D-Leucin, L-Valin und L-Isoleucin ausgewählt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der pH-Wert zwischen 6,5 und 7,0 liegt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei der pH-Wert zwischen 6,7 und 6,9 liegt.

13. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Temperatur zwischen 30 und 37ºC liegt.