DE69109615T2

DE69109615T2 - Glatter Muskel Mitogen.

Info

Publication number: DE69109615T2
Application number: DE69109615T
Authority: DE
Inventors: Moses Judah Folkman; Yuen Shing
Original assignee: Boston Childrens Hospital
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1991-10-24
Publication date: 1995-11-09
Anticipated expiration: 2011-10-25
Also published as: DE69109615D1; EP0482623A3; EP0482623B1; EP0482623A2; ATE122358T1

Description

Dies ist eine Continuation-in-part-Anmeldung der U.S.-Anmeldung Aktenzeichen 07/604 778, eingereicht am 26. Oktober 1991. Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der U.S.-Regierung gemacht, und die Regierung hat an dieser Erfindung bestimmte Rechte.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Wachstumsfaktor, der das Wachstum von glatten Muskelzellen stimuliert, und dessen Verwendungen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Während die proliferation von glatten Muskelzellen eingehend untersucht worden ist (siehe z.B. Schwartz et al., Circulation Research, Band 58, Nr. 4, Seite 427, wobei auf diese Offenbarung hier ausdrücklich Bezug genommen wird), bleiben die Signale, die die Proliferation von glatten Muskelzellen steuern, im wesentlichen unbekannt. Es ist bekannt daß die Proliferation von Zellen glatter Muskeln bei Krankheiten wie Arteriosklerose (Atherosklerose und Hypertonie) eine zentrale Rolle spielt. Ein Mangel an Proliferation von glatten Muskelzellen bei Säuglingen spielt bei Gefäßmißbildungen ebenfalls eine Rolle. Dieses Versagen der Replikation von Zellen glatter Muskel führt zu nicht behandelbaren Gefäßläsionen, die oft zum Tode führen.
Obwohl jetzt allgemein eingeräumt wird, daß die Replikation von Zellen glatter Muskeln im Verlauf der Bildung von Arteriosklerose-Läsionen auftritt, ist die Rolle dieser proliferativen Reaktion in der Gesamtgeschichte des Arterioskleroseherdes nicht ganz offensichtlich. Einige Forscher schlagen vor, daß die im Verlauf der Entwicklung von Arterien auftretende Replikation das Ursprungsereignis bei der Bildung von Atherosclerose-Läsionen, vorhergehender Lipid-Anhäufung oder Endothelverletzung ist.
Die Haupthypothese zur Erklärung der Replikation von glatten Muskeln in der Gefäßwand ist die Hypothese der Antwort auf Verletzung. Kurzgefaßt besagt die Hypothese, daß Zellen glatter Muskeln in der Wand normalerweise in einem ruhenden Zustand existieren. Wenn das Endothel verletzt wird, setzen Plättchen einen Faktor oder Faktoren frei, der/die die Bewegung von Zellen glatter Muskeln in die arterielle Gefäßinnenhaut und die Replikation darin stimuliert/stimulieren (Ross, Arteriosclerosis 1: 293 - 311, 1981). Ross zeigte auch, daß die kultivierten Zellen glatter Muskeln einen aus Plättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) zur Proliferation benötigen (Ross und Glomset, N. Eng. J. Med. 295; 369-377 und 420-425, 1976). Die einleuchtende Schlußfolgerung besteht darin, daß die Freisetzung von Plättchen für die proliferative Reaktion des glatten Muskels auf Ballon-Denudation erforderlich ist.
Ross' Beobachtung führte nachfolgend zur Reinigung des PDGF, der Identifizierung seines Rezeptors und kürzlich zur Identifizierung des Onkogens c-sis als dem Gen für eine der beiden Peptidketten von PDGF.
Die zweite bekannte Anforderung für die Progression des Zellcyclus ist die Verfügbarkeit von Somatomedin C., auch bekannt als insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF-1). IGF-1 selbst kann durch Zellen glatter Muskeln synthetisiert werden, und Antikörper für IGF-1 hemmen die Progression des Zellcyclus. Diese Daten deuten darauf hin, daß PDGF in der Lage ist, die Produktion seines eigenen Wachstumsfaktors zu stimulieren. Diese Beobachtung ist von beträchtlicher Wichtigkeit mit Hinblick auf die interessante Möglichkeit, daß die Replikation des glatten Muskels durch Faktoren gesteuert werden kann, die der Gefäßwand zu eigen sind.
Andere Substanzen, die abgesehen von PDGF für Zellen glatter Muskeln mitogenetisch sind, sind ebenfalls untersucht worden. Zusätzlich enthalten Plättchen auch einen proteinähnlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) (Oka und Orth, J. Clin. Invest. 72: 249 - 259, 1983, und Assoian et al., 1984) und einen Faktor, der in der Lage ist, das Zellwachstum in Suspension zu fördern, genannt 13 Tumor-Wachstumsfaktor (Tucker et al., Science 226: 705 - 777, 1984). Der relative Beitrag jedes einzelnen davon zur Stimulation der Proliferation ist weitgehend unbekannt.
Die die Replikation von glatten Muskeln bei der Hypertonie steuernden Stimuli bleiben ebenfalls weitgehend unbekannt. PDGF kann eine wichtige Rolle bei mikrovaskulären Veränderungen bei maligner Hypertonie spielen, betrifft aber große Gefäße oder durch milde oder chronischere Formen von hohem Blutdruck beeinflußte Gefäße wahrscheinlich nicht.
Während mit Bezug auf die Rolle von glattem Muskel mit Bezug auf verschiedene Krankheits-Pathologien umfassende Untersuchungen durchgeführt worden sind und mehrere Mechanismen und Rollen von Wachstumsfaktoren wie PDGF untersucht worden sind, besteht eine Notwendigkeit für neue Informationen über Mitogene, die die Proliferation von Zellen glatter Muskeln stimulieren, fort. Die Identifizierung solcher Mitogene erlaubt die Entwicklung verschiedener Behandlungsstrategien wie konkurrierender Bindungsstrategien, wobei Antikörper auf das Mitogen der glatten Muskeln angewandt werden, oder konkurrierender Proteine, die an die Rezeptoren für solche Mitogene gebunden werden. Mitogene für glatte Muskeln können auch bei der Behandlung von Zuständen wie Gefäßmißbildung oder als ein Wachstumsfaktor bei der Wund-/Ulcusheilung verwendet werden.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In Einklang mit der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Wachstumsfaktor (hiernach "BTC-GF") verfügbar gemacht, der aus dem konditionierten Medium von pankreatischen Tumorzellen erhältlich ist, die ursprünglich aus transgenen Mäusen (RIP1- Tag 2) stammen, in denen praktisch jede Betazelle das Onkogen SV40 Groß T exprimierte. Eine Probe der pankreatischen Tumorzellen (hiernach "BTC-3-Zellen"), aus denen BTC-GF ursprünglich identifiziert, isoliert und gereinigt wurde, ist bei der American Type Culture Collection nach dem Budapester Vertrag am 26. Oktober 1990 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 10585 hinterlegt worden. BTC-GF kann auch aus einer Unterlinie von pankreatischen Tumorzellen (hiernach "BTC-JC10-Zellen"), wovon eine Probe bei der American Type Culture Collection nach dem Buderpester Vertrag am 24. September 1991 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 10875 hinterlegt worden ist.
Das BTC-GF der vorliegenden Erfindung ist ein Mitogen für Zellen glatter Muskeln, 3T3-Fibroblasten und retinale epitheliale Pigmentzellen, aber nicht für endotheliale Zellen. BTC-GF wird durch Kochen, 10 mM Dithiothreitol oder durch Einwirken von 1 M Essigsäure nicht inaktiviert. Die biologische Aktivität von BTC-GF ist als ein einzelnes Prpteinband mit einem Molekulargewicht von etwa 32 000 auf SDS-PAGE vorhanden. Die partielle N-terminale Aminosäuresequenz von BTC- GF (SEQ ID Nr.: 1), bestimmt durch Vergleichen der N-terminalen Aminosäuresequenz von BTC-GF, gereinigt sowohl aus BTC-3- als auch aus BTC-JC10-Zellen, beträgt Asp-Gly-Xaa-Thr-Xaa- Arg-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Gly-Ser-Leu-Xaa-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu- Glu-Arg-Thr-Arg (siehe Figur 7).
Bei einer Computer-Recherche durch die übersetzten GENBANK- und NBRF-Protein-Datenbanken wurden keine gleichartigen Proteine gefunden.
Das BTC-GF der vorliegenden Erfindung kann für die Behandlung von Krankheiten wie Gefäßmißbildungen sowie für die Behandlung von Wunden/Geschwüren und dergleichen verwendet werden. BTC-GF kann auch verwendet werden, um Konkurrenzmittel wie Antikörper oder falsche Peptide zu produzieren. Da BTC-GF aus den insulinproduzierenden Zellen der Zellinseln stammt, können solche Konkurrenzmittel für die Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die aus der Proliferation von glatten Zellen resultieren, wie der bei Diabetes beobachteten Atherosklerose und diabetischen Retinopathie sowie bei Hypertonie. Es kann auch als diagnostischer Test verwendet werden, in dem, zum Beispiel, ein Antikörper für den Wachstumsfaktor diesen Faktor im Blut von Diabetis bestimmen kann, in dem sterbende oder regenerierende Betazellen mit Zellinseln den Faktor freisetzen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 veranschaulicht die Aktivität des Zell-Wachstumsfaktors 3T3 von BTC-GF, nachdem ein konditioniertes konzentriertes serumfreies Medium aus Beta-Tumorzellen durch eine Biorex 70-Kationenaustauscher-Säule geleitet wurde.
Figur 2 veranschaulicht die Aktivität des Zell-Wachstumsfaktors 3T3 von gesammelten aktiven Fraktionen aus Figur 1,
wenn sie durch eine Säule mit Phenyl-Sepharose geleitet werden.
Figur 3 veranschaulicht die Aktivität des Zell-Wachstumsfaktors 3T3 von gesammelten aktiven Fraktionen aus der Säule mit Phenyl-Sepharose, wenn sie durch eine FPLC-Säule mit Heparin-Affinität geleitet werden.
Figur 4 veranschaulicht die Aktivität des Zell-Wachstumsfaktors 3T3 von gesammelten aktiven Fraktionen aus der Säule mit Heparin-Affinität, wenn sie durch eine HPLC-Reversed- Phase-Säule C4 geleitet werden.
Figur 5 ist eine Silber-Färbung von BTC-FG auf Gel aus den gesammelten aktiven Fraktionen, die durch Wiederholen der Reinigung an der HPLC-Reversed-Phase-Säule C4 erhalten werden.
Figur 6 veranschaulicht die mitogenetische Aktivität von BTC- GF für Zellen von glatten Rindermuskeln.
Figur 7 veranschaulicht die N-terminale Aminosäure-Sequenz von BTC-GF, das aus BTC-3- bzw. BTC-J10-Zellen gereinigt wurde.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In Einklang mit der vorliegenden Erfindung wird der neue Wachstumsfaktor BTC-GF verfügbar gemacht, der die Proliferation von Zellen glatter Muskeln fördert.
In Einklang mit der vorliegenden Erfindung hergestelltes BTC- GF hat auf SDS-PAGE ein Molekulargewicht von etwa 32 000 und ist, wenn es gekocht wird, hitzestabil. BTC-GF ist darüber hinaus in Gegenwart von 10 mM Dithiothreitol und gegenüber der Einwirkung von Essigsäure mit einer Konzentration von 1 M stabil.
BTC-GF wurde aus dem konditionierten Medium von pankreatischen Tumorzellen BTC-3 (ATCC Nr. CRL 10585) identifiziert und isoliert, die ursprünglich von transgenen Mäusen (RIP1- Tag 2) stammen, in denen praktisch jede Betazelle das Onkogen SV40 T exprimierte. BTC-GF ist auch aus BTC-JC10-Zellen (ATCC Nr. CRL 10875) gereinigt worden.
Während eine Reihe von Verfahren zur Reinigung von BTC-GF verwendet werden kann, sind die bevorzugten Verfahren unten dargestellt und in den Beispielen ausführlicher beschrieben.
Zuerst werden die Beta-Tumorzellen vier Tage lang in Drehflaschen in DMEM mit 5 % Kalbsserum kultiviert. Das Medium wird dann durch serumfreies Medium ersetzt und 48 bis 72 Stunden vor der Ernte kultiviert.
Als nächstes wird serumfreies mit Beta-Tumorzellen konditioniertes Medium konzentriert und durch eine Anzahl von Säulen, wie eine Biorex 70-Säule, eine Phenyl-Sepharose-Säule und eine FPLC-Säule mit Heparin-Affinität und eine Reversed- Phase-HPLC-Säule geleitet.
Die N-terminale Aminosäure-Sequenz von BTC-GF, die durch Vergleichen von BTC-GF aus BTD-3- und BTC-JC10-Zellen wie nachgewiesen mit einer ABI 470A-Protein-Sequenz bestimmt wird, ist wie folgt:
Asp-Gly-Xaa-Thr-Xaa-Arg-Thr-Pro-Glu-Thr-Asn-Gly-Ser-Leu-Xaa- Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Glu-Arg-Thr-Arg (SEQ ID Nr.: 1).
Gereinigtes erfindungsgemäßes BTC-GF kann für die Behandlung von pathologischen Zuständen, wie der Gefäßmißbildung durch intravaskuläre Infusion, oder für die Behandlung von Aterosclerose durch Verabreichung eines Konkurrenz-Ihibitors verwendet werden.
Gereinigtes BTC-GF kann auch für die Behandlung von Wunden, Geschwüren und dergleichen verwendet werden.
Gereinigtes BTC-GF der vorliegenden Erfindung kann auch zur Produktion verschiedener konkurrierender Mittel verwendet werden, die für die Behandlung von Atherosklerose und diabetische Retinopathie sowie für Hypertonie verwendet werden können. Es können konkurrierende Mittel wie Antikörper oder falsche Proteine produziert werden, die mit BTC-GF konkurrieren und/oder sie bei Stimulation der Proliferation von Zellen glatter Muskeln blockieren.
BTC-GF kann auch verwendet werden, um Antikörper gegen sich selbst zu bilden. Der gebildete Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein, abhängig von der jeweiligen Anwendung, für die er entwickelt wurde. Solche Antikörper können durch Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Zum Beispiel kann das Protein oder ein antigener Teil davon mit Hämocyanin aus der Schlitzschnecke (KLH) konjugiert werden und verwendet werden, um einen Antikörper in einem Tier wie einem Kaninchen zu züchten. Normalerweise wird das Peptid-KLH-Konjugat mehrere Male in einem Zeitraum von zwei Monaten injiziert, um Antikörper zu erzeugen. Der Antikörper wird dann durch Standardtechniken aus dem Serum gesammelt.
Wahlweise können monoklonale Antikörper in Zellen produziert werden, die Antikörper für das Protein produzieren, indem standardmäßige Fusionstechniken zur Bildung von Hybridomzellen verwendet werden. [Kohler, G., et al., Nature 256: 495 (1975), worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird.] Normalerweise umfaßt dies das Verschmelzen einer Antikörper produzierenden Zelle mit einer unsterblichen Zellinie wie einer Myelomazelle zur Produktion der Hybridzelle. Wahlweise können monoklonale Antikörper nach dem Verfahren von Huse et al., Science 246: 1275 (1989), worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird, aus Zellen hergestellt werden.
Die Erfindung wird weiterhin mit Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert, die beim Verständnis der vorliegenden Erfindung helfen, die aber nicht als Einschränkung ausgelegt werden dürfen.
Die in den Beispielen und in Tabelle 1 diskutierten Aktivitäten von Wachstumsfaktoren wurden durch Messen der Aufnahme von [Methyl-³H]thymidin in die DNA von inaktiven Maus-Balb/c- 3T3-Zellen untersucht, wie zuvor beschrieben (Shing, Y., Davidson, S., und Klagsbrun, M., Methods in Enzymology, 146B, 42 - 48, 1987), wobei auf diese Offenbarung hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

Beispiel 1

Primäre Kulturen von pankreatischen Beta-Tumorzellen BTC-3 (ATCC Hinterlegungsnummer CRL 10585) wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagle'schem Medium (DMEM), das 10 % Kalbserum enthielt, hergestellt. Diese Kulturen wurden auf Zellkolben mit 162 cm² (Costar Cat #3150) plattiert und in einem angefeuchtetem CO&sub2;-Inkubator bei 37 ºC inkubiert. Diese Zellen wurden als Quelle zur Keimbildung in Drehflaschen mit 900 cm² Wachstumsfläche (Costar Cat #3901), die 125 ml Inkubator enthielten, verwendet. Nach 4 Tagen wurde das Medium in jeder Flasche durch serumfreies Medium ersetzt. Das Medium wurde geerntet und nach einer Inkubation 48 - 72 Stunden lang durch frisches Medium ersetzt. Als Ausgangsmaterialien für die Reinigung von Wachstumsfaktoren wurden sechs Liter konditioniertes Medium wöchentlich gesammelt.

Beispiel 2

Verfahren zur Reinigung von BTC-GF aus BTC-3-Zellen

Stufe 1. Konzentrierung

Zehn Liter serumfreies mit Beta-Tumorzellen conditioniertes Medium wurden bei 4 ºC mit einer Amicon-Hohlfaser-Eindickvorrichtung unter Verwendung eines Filters mit einem Rückhaltevermögen für ein Molekulargewicht von 10 000 auf 500 ml aufkonzentriert. Das konzentrierte Medium wurde anschließend durch kontinuierliche Dialyse auf 50 mM NaCl, 10 mM Tris, einen pH-Wert von 7 äquilibriert.

Stufe 2. Chromatographie mit BioRex 70

Das konzentrierte Medium wurde auf eine BioRex-Säule (Bettvolumen 200 ml) aufgegeben und bei 4 ºC mit 10 mM Tris, ph- Wert 7, äquilibriert. Die Säule wurde mit 400 ml desselben Puffers gespült und anschließend wurde die biologische Aktivität mit einem NaCl-Gradienten von 400 ml mit 0 M bis 400 ml mit 0,6 M bei einer Durchflußrate von 60 ml/h eluiert (Fig. 1).

Stufe 3. Chromatographie mit Phenyl-Sepharose

Die aktiven Fraktionen der Biorex-Kolonne wurden gesammelt, 5 Minuten lang gekocht und durch Zentrifugieren (10 000 x g, 20 Minuten) klargemacht. Die klare überstehende Lösung wurde in 1,5 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; eingebracht und auf eine Phenyl-Sepharose- Säule aufgetragen (25 ml Bettvolumen)&sub1; die bei 4 ºC mit 1,5 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mM Kaliumphosphat-Puffer, einem pH-Wert von 7 äquilibriert war. Die Säule wurde mit 100 ml Äquilibrierungspuffer gespült und die biologische Aktivität wurde anschließend bei einer Durchflußrate von 30 ml/h mit einem (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;- Gradienten von 170 ml mit 1,5 M bis 170 ml mit 0 M in einen Phosphatpuffer mit einem ph-Wert von 7 eluiert (Fig. 2).

Stufe 4. FPLC-Chromatographie mit Heparin-Affinität

Die aktiven Fraktionen aus der Phenyl-Sepharose-Säule wurden gesammelt, dialysiert und bei Raumtemperatur auf eine Glassäule (7,5 cm x 8 mm Innendurchmesser) mit TSK-GEL Heparin 5PW aufgegeben, die mit 10 mM Tris, einem pH-Wert von 7 äquilibriert war. Die Säule wurde mit 10 ml desselben Puffers gespült und die biologische Aktivität wurde bei einer Durchflußrate von 1 ml/Min/Fraktion mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 0,3 M, gefolgt von einem anderen NaCl-Gradienten von 0,3 bis 0,6 M eluiert (Fig. 3).

Stufe 5. HPLC-Chromatographie mit C4-Revered Phase

Die aktiven Fraktionen aus der Heparin-Säule wurden gesammelt und bei Raumtemperatur direkt in eine HPLC-Säule mit der Reversed-Phase C4 injiziert, die mit 10 % Acetonitril in 0,1 % TFA äquilibriert war. Die Säule wurde mit 20 ml derselben Lösung gespült und die biologische Aktivität wurde bei einer Durchflußrate von 2 ml/Min. mit einem Gradienten aus Acetonitril von 10 bis 35 % eluiert und es wurden Fraktionen von 1,5 ml gesammelt (Fig. 4). Dieser Schritt wurde einmal wiederholt, um auf SDS PAGE ein silbern gefärbtes Einzelband- Protein zu erhalten (Fig. 5).
Eine Zusammenfassung des Reinigungsergebnisses ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Tabelle 1. Reinigung von BTC-GF Reinigungsschritt Gesamtprotein Gesamtaktivität Spezifische Aktivität Aktivitäts-Gewinnung Reinigungsfaktor Konditioniertes Medium Bio-Res-Säule Hitze Phenyl-Säule Heparin-Säule C4-Säule Die Werte basierten auf der Verarbeitung von 10 Liter des konditionierten Mediums Die Biologische Aktivität wurde durch DNA-Synthese in Mauszellen 3T3 gemessen. Eine Einheit der Wachstumsfaktor-Aktivität ist als die Menge an Wachstumsfaktor definiert, die benötigt wird, um die Hälfte der maximalen Aufnahme von [Methyl-&sub3;H]thymidin in DNA zu fördern. Die Proteinmasse wurde durch Verwendung von A&sub2;&sub8;&sub0; = 1,0 für eine Lösung mit 1 mg/ml abgeschätzt. *Die Proteinmasse wurde durch die Intensität der Silberfärbung im Vergleich zu der von Protein- Standards und durch Aminosäure-Analyse abgeschätzt.

Beispiel 3

Mitogene Aktivität von BTC-GF auf eine Zelle eines glatten Muskels

Das gereinigte BTC-GF aus Beispiel 2 stimulierte die Proliferation von aortalen Zellen glatter Muskeln vom Rind (SMC) (Fig. 6). Die mitogene Aktivität von BTC-GF wurde an SMC untersucht, die in DMEM kultiviert worden war, das 1 % Kalbsserum enthielt. Vier Tage nach Zugabe der Testproben in die Kulturen wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und die Anzahl von Zellen an jeder Vertiefung der 24 Tüpfelplatten wurden mit einem Coulter-Zähler gezählt.
Das nach dem oben beispielhaft aufgeführten Reinigungsprotokoll hergestellte Protein weist die folgenden Merkmale auf: BTC-GF ist ein Polypeptid mit der N-terminalen Aminosäure- Sequenz:
Asp-Gly-Xaa-Thr-Xaa-Arg-Thr-Pro-Glu-Xaa-Asn-Gly-Ser-Leu-Xaa- Xaa-Gly-Xaa-Ala-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(SEQ ID Nr.: 2). Es weist ein Molekulargewicht von 32 000 auf, wie durch SDS- Elektrophorese mit Polyacrylamid-Gel bestimmt wurde. Seine mitogene Aktivität wird durch die Einwirkung von hohen Temperaturen (100 ºC, 5 Minuten), ein Sulfhydryl-Reduktionsmittel (10 mM Dithiothreitol) oder saure Bedingung (pH-Wert 2,2) nicht inaktiviert.

Beispiel 4

BTC-JC-10 wurde in nach Dulbecco modifiziertem Eagle'schem Medium (DMEM), dem 10 % Kalbsserum zugegeben wurde, gehalten. Zur Bildung eines konditionierten Mediums wurden in einem 8-Liter- Drehkolben (Belco Glass) 10&sup4; Zellen/ml BTC-JC10- Zellen in Suspension in einem Medium aus DMEM/F12 (1:1) gezogen, dem 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin; 0,5 % Insulin, Transferin und Selen (ITS, Sigma) und 0,1 % Polyethylenglycol 400 zugegeben worden waren.
Das konditionierte Medium wurde gesammelt, wenn die Zelldichte 2 x 10 10&sup5; Zellen/ml erreicht hatte.
BTC-GF aus dem konditionierten BTC-JC10-Medium wurde durch Verfahren gereinigt, die denen zur Reinigung des BTC-GF aus BTC-3-Zellen vergleichbar sind. Die N-terminale Teil- Aminosäure-Sequenz von aus BTC-JC10-Zellen gereinigtem BTC-GF ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
Wie aus Figur 7 ersehen werden kann, scheint die N-terminale Aminosäure-Sequenz von BTC-GF aus BTC-3-Zellen und BTC-J10- Zellen identisch zu sein, was darauf hindeutet, daß die beiden Proteine aus beiden Zelltypen dieselben sind.

Claims

1. Gereinigtes Protein mit einer N-terminalen Aminosäure- Sequenz, die SEQ ID NR. 1 umfaßt, wobei das Protein die Vermehrung von glatten Muskelzellen anregt.

2. Gereinigtes Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein aus BTC-JC10 β-Tumorzellen, ATCC-Hinterlegungsnr. CRL 10875, erhältlich ist.

3. Gereinigtes Protein mit einer N-terminalen Aminosäure- Sequenz, die SEQ ID NR. 2 umfaßt, wobei das Protein die Vermehrung von glatten Muskelzellen anregt.

4. Gereinigtes Protein nach Anspruch 3, wobei das Protein aus BTC-3 13-Tumorzellen, ATCC-Hinterlegungsnr. CRL 10585, erhältlich ist.

5. Gereinigtes Protein nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Protein ein Molekulargewicht von ungefähr 32 000 auf SDS-PAGE aufweist.

6. Gereinigtes Protein nach Anspruch 1 oder 3, das nach einem sminütigem Erhitzen bei 100 ºC wenigstens ungefähr 50 % seiner Aktivität hat.

7. Gereinigtes Protein nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Protein stabil ist, wenn es 1 M Essigsäure ausgesetzt ist.

8. Gereinigtes Protein nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Protein stabil ist, wenn es 10 mM Dithiothreitol ausgesetzt wird.

9. Verfahren zur Herstellung des gereinigten Proteins nach Anspruch 1 oder 3, umfassend:

a) Konzentrieren von serumfreiem, mit β-Tumorzellen konditioniertem Medium;

b) Auftragen des konditionierten Mediums aus Schritt a) auf eine Biorex-Säule;

c) Auftragen der aus Schritt b) erhaltenen aktiven Fraktionen auf eine Phenyl-Sepharose-Kolonne;

d) Auftragen der aus Schritt c) erhaltenen aktiven Fraktionen auf eine Säule mit Heparin-Affinität;

e) Auftragen der aus Schritt d) erhaltenen aktiven Fraktionen auf eine Säule mit vertauschter Phase und

f) Sammeln der aus Schritt e) erhaltenen aktiven Fraktionen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das hergestellte gereinigte Protein eine spezifische Akivität von ungefähr 2,9 x 10&sup7; U/mg aufweist.

11. Polypeptid, das die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 2 umfaßt.

12. Gereinigtes Protein nach Anspruch 1 oder 3, das in seiner nativen Form vorliegt.