DE69108716T2

DE69108716T2 - Immunreaktivität gegenüber exprimierten aktivierten oncogenen zur diagnose und behandlung von bösartigen geschwülsten.

Info

Publication number: DE69108716T2
Application number: DE69108716T
Authority: DE
Inventors: Martin A. Mercer Island Wa 98040 Cheever; David J. Seattle Wa 98103 Peace
Original assignee: Washington Research Foundation
Current assignee: Washington Research Foundation
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1991-01-24
Publication date: 1995-08-17
Anticipated expiration: 2011-01-25
Also published as: DE69131255T2; CA2074720C; US20040235070A1; EP0617124A1; AU639311B2; JPH1169976A; US5601989A; JPH08275774A; ES2070492T3; WO1991011719A1; EP0513161B1; US5773230A; AU7329991A; EP0513161A1; CA2074720A1; ES2134294T3; DE69108716D1; DK0617124T3; JPH05503996A; ATE120860T1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf den Nachweis, die Überwachung und die Behandlung von Malignitäten durch die Ausnutzung der eigenen Immunreaktivität eines Krebspatienten gegen das Protein-Expressionsprodukt eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit Malignität assoziiert ist, gerichtet.

Hintergrund der Erfindung

Trotz enormen Einsatzes an Geldmitteln und Menschen, bleibt Krebs eine der Haupttodesursachen. Ein gemeinsames Merkmal von Malignitäten ist unkontrolliertes Zellwachstum. Krebszellen scheinen einen Prozeß der Transformation vom normalen Phänotyp zu einem malignen Phänotyp, der zu autonomem Wachstum in der Lage ist, durchlaufen zu haben. Die Mutation somatischer Zellgene wird als ein gemeinsames Primärereignis angesehen, das zur Transformation von normalen Zellen zu malignen Zellen führt. Die Merkmale des malignen Phänotyps, die durch die mutierten Gene kodiert sind, werden während der Zellteilung an die Nachkommenschaft der transformierten Zellen weitergegeben. Verschiedene Gene, die bei der Transformation involviert sind, sind als Oncogene bezeichnet worden. Oncogene wurden ursprünglich als Komponenten des genetischen Materials oncogener Viren identifiziert. Die homologen Gene auf menschlichen Chromosomen werden im allgemeinen Oncogene oder Proto-Oncogene genannt.
Die gegenwärtige Forschung auf dem Gebiet der Oncogene hat wenigstens vierzig Oncogene identifiziert, die in malignen Zellen operativ und für die Transformation verantwortlich oder mit dieser assoziiert sind. Oncogene sind auf der Grundlage der mutmaßlichen Funktion oder Lokalisierung ihrer Genprodukte (wie etwa des Proteins, das durch das Oncogen exprimiert wird) in verschiedene Gruppen einklassifiziert worden.
Man glaubt, daß Proto-Oncogene wesentlich für bestimmte Aspekte der normalen Zellphysiologie sind. Bestimmte Proto-Oncogene scheinen zu einem zellulären Oncogen durch quantitative Mechanismen aktiviert zu werden, die von erhöhter oder deregulierter Expression eines im wesentlichen normalen Genproduktes herrühren. Zum Beispiel ist die myc-Genfamilie mit der Initiation und/oder Progression bestimmter menschlicher Lymphome und Karzinome assoziiert worden, deren transformierende Aktivierung das Ergebnis von quantitativen Mechanismen ist. Alternativ scheinen andere Proto-Oncogene so aktiviert zu werden, daß sie zelluläre Oncogene durch qualitative Mechanismen transformieren, einschließlich Mutation in der Kodierungsequenz des Gens. Dies schafft ein Genprodukt mit einer geänderten Primärstruktur und biochemischen Eigenschaften als ein Ergebnis einer oder mehrerer Unterschiede in der Aminosäuresequenz des Proteins. Zum Beispiel wird die ras-Genfamilie, die kausal mit den häufigsten Formen menschlicher Malignität (z. B. Dickdarmkrebs) kausal assoziiert wird, als ein Ergebnis von Einzelcodonänderungen aktiviert.
Studien zur Entwicklung von Krebstherapien haben sich im allgemeinen auf die Ausnutzung von charakteristischen Unterschieden zwischen normalen und malignen Zellen konzentriert. Mutierte, translozierte oder in anderer Weise überexprimierte Proto-Oncogene und die Produkte solcher Gene stellen potentielle identifizierbare charakteristische Unterschiede zwischen normalen und malignen Zellen dar. Die identifizierten Unterschiede sind in Versuchen zur Entwicklung diagnostischer Tests oder therapeutischer Vorschriften eingesetzt worden.
Ein Ansatz zur Entwicklung eines diagnostischen Tests ist gewesen, daß versucht wurde, das exprimierte Produkt eines Oncogens in Gewebe oder Körperflüssigkeiten unter Verwendung von Antikörpern, die gegen das einzigartige oder abnorme Oncogen- Produkt gerichtet sind, zu quantifizieren. Im allgemeinen sind xenogene Antikörper gegen das abnorm exprimierte Proto-Oncogen-Produkt gezüchtet worden. Probleme bei der Entwicklung von diagnostischen Tests auf der Grundlage des Nachweises von abnormen Oncogen-Produkten schließen die folgenden Faktoren ein: (1) Fehlen von Antikörpern hoher Spezifität, Affinität und Selektivität für das abnorme Produkt; (2) nur kleine Mengen an abnormem Oncogen-Produkt können durch Tumorzellen freigesetzt werden; (3) oncogene Produkte können nur intermittierend von Tumorzellen freigesetzt werden; (4) das Oncogen-Produkt kann aus der Körperflüssigkeit heraus durch Antikörper absorbiert werden oder kann zu Immunkomplexen umgebildet werden; und (5) das freie Antigen kann schnell ausgeschieden oder abgebaut werden.
Wegen der Schwierigkeiten bei den gegenwärtigen Ansätzen zur Krebsdiagnose und -therapie besteht ein Bedürfnis auf diesem Gebiet nach verbesserten Verfahren und Zusammensetzungen. Die vorliegende Erfindung befriedigt dieses Bedürfnis und stellt außerdem andere verwandte Vorteile bereit.

Zusammenfassung der Erfindung

Kurz gesagt stellt die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweis einer Malignität in einem Warmblüter zur Verfügung, wobei ein aktiviertes Oncogen oder mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gen mit der Malignität assoziiert ist. Die Verfahren können einmalig verwendet werden, wenn eine Malignität vermutet wird, oder periodisch, um eine Person mit einem erhöhten Risiko des Erwerbs einer Malignität zu überwachen. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Schritte: (a) Inkubieren von T-Zellen, die aus einem Warmblüter isoliert sind, mit wenigstens einem Protein-Expressionsprodukt mit einer geänderten Primärsequenz eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit der Malignität assoziiert ist; und (b) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Proliferation der T- Zellen, wodurch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Malignität nachgewiesen wird. In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren: (a) In-Kontakt-Bringen einer Körperflüssigkeit, die im Verdacht steht, Antikörper zu enthalten, die spezifisch sind für ein Protein-Expressionsprodukt mit einer geänderten Primärsequenz eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit der Malignität assoziiert ist, mit wenigstens einem Protein-Expressionsprodukt eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit der Malignität assoziiert ist; (b) Inkubieren der Körperflüssigkeit unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die zur Bildung von Immunkomplexen ausreichend sind; und (c) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer oder mehrerer Immunkomplexe, die zwischen dem Protein-Expressionsprodukt und Antikörpern in der Körperflüssigkeit, die für das Protein-Expressionsprodukt spezifisch sind, gebildet sind, wodurch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Malignität bestimmt wird.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit einer Krebstherapie in einem Warmblüter mit einer Malignität zur Verfügung, wobei ein aktiviertes Oncogen oder mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gen mit der Malignität assoziiert ist. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Schritte: (a) In-Kontakt- Bringen einer ersten Körperflüssigkeitsprobe, die einem Warmblüter vor Beginn der Therapie abgenommen ist, mit wenigstens einem Protein-Expressionsprodukt mit einer geänderten Primärsequenz eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit der Malignität assoziiert ist; (b) Inkubieren der Körperflüssigkeit unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die zur Bildung von Immunkomplexen ausreichend sind; (c) Nachweisen von Immunkomplexen, die zwischen dem Protein-Expressionsprodukt und Antikörpern in der Körperflüssigkeit, die für das Protein-Expressionsprodukt spezifisch sind, gebildet sind; (d) Wiederholen der Schritte (a), (b) und (c) an einer zweiten Körperflüssigkeitsprobe, die dem Tier im Anschluß an den Beginn der Therapie abgenommen ist; und (e) Vergleichen der Anzahl von Immunkomplexen, die in der ersten und in der zweiten Körperflüssigkeitsprobe nachgewiesen sind, wodurch die Wirksamkeit der Therapie im Tier überwacht wird.
In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung therapeutische Anti-Krebszusammensetzungen zur Verfügung, die T-Zellen umfassen, die in der Gegenwart wenigstens eines Protein-Expressionsproduktes mit einer geänderten Primärsequenz eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit einer Malignität assoziiert ist, vermehrt sind, in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Trägerstoff oder Verdünnungsstoff. Solche T-Zellen sind bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Malignität in einem Warmblüter nützlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht graphisch, daß spezifische T-Zell-Reaktionen auf punkt-mutiertes ras-Peptid erzeugt werden können durch in-vivo-Priming an Tag 0 mit 50 ug eines Peptids mit 12 Aminosäuren Länge, das identisch konstruiert ist zu murinem ras-p21 (Aminosäuren 5-16), aber mit der Substitution des normalerweise an Position 12 zu findenden Glycins für Arginin (d.h. Position 12 von ras-p21, aber Position 8 des Peptids). Dieses Peptid wird als ras p5-16[R12] oder als ras-R12 bezeichnet. Mäuse wurden mit ras-R12-Peptid plus Adjuvans oder mit Adjuvans allein immuniziert. Nach 10 Tagen wurden die drainierenden Lymphknoten geerntet und Lymphozyten in vitro mit ras-R12-Peptid oder als Spezifitäts-Kontrollen mit ähnlichen Peptiden, bei denen im Gegensatz zu Arginin mit Serin, Cystein oder Glycin an Position 12 substituiert ist, bezeichnet als ras-S12, ras-C12 bzw. ras-G12, stimuliert. 4 Tage später wurden Kulturen mit [³H]-Thymidin (³HTdR) für 8 Stunden gepulst, wie in Bespiel 1 unten beschrieben. Die Ergebnisse sind als ΔCPM dargestellt.
Fig. 2 zeigt, daß ras-Peptid-spezifische T-Zellen, die langfristig in vitro in Reaktion auf intermittierende Stimulation durch ras-Peptid gezüchtet sind, spezifische Funktion beibehalten. T-Zellen, die aus mesenterischen Lymphknoten von C57BL/6-Mäusen nach Priming gegen ras-R12 (wie definiert für Fig. 1 oben) gewonnen sind, wurden langfristig in vitro in Reaktion auf intermittierende Stimulation mit ras-R12-Peptid (5 ug/ml) auf bestrahlten B6-Milzzellen (3000 rad) als Antigen-präsentierende Zellen kultiviert. Die Spezifität der T- Zellinie wurde an Tag 85 durch Stimulation mit abgestuften Konzentrationen verschiedener ras-Peptide (wie definiert für Fig. 1 oben) oder mit trypsinisiertem OVA (TOVA), das mehrere potentielle immunogene Peptide enthält, getestet. Die Daten sind als ³HTdR-Aufnahme in Impulsen pro Minute (c.p.m.) dargestellt.
Fig. 3 veranschaulicht graphisch, daß T-Zellen, die für ein ras-Peptid spezifisch sind, spezifisch gegen intaktes ras-p21- Protein, das dieselbe Restesubstitution enthält, reagieren. Dieses Peptid, bezeichnet als p5-17[R12], besteht aus 13 Aminosäureresten und wurde identisch zu murinen ras-p21 (Aminosäuren 5-17) konstruiert, aber mit der Substitution des normalerweise an Position 12 von ras-p21 zu findenden Glycins (G) für Arginin (R). Klonierte B6-T-Zellen, die für das Arg-12- ras-Peptid spezifisch sind, wurden mit bestrahlten B6-Milzzellen und entweder p5-17[R12J oder intakten ras-p21-Proteinen, die die bezeichnete Aminosäure an Position 12 tragen, (1 ug/ml) kultiviert. Proliferationsreaktionen wurden nach vier Tagen gemessen (wie beschrieben in Fig. 1). Die Daten stellen den Mittelwert von Dreifachbestimmungen der c.p.m. von eingebautem ³HTdR dar. Die Standardabweichungen betrugen < 10% der c.p.m.
Fig. 4 zeigt daß spezifische T-Zellen-Reaktionen durch in- vltro-Priming mit einem Peptid mit 13 Aminosäuren Länge erzeugt werden können, das identisch zu murinem ras-p21 (Aminosäuren 54-66) konstruiert ist, aber mit der Substitution des normalerweise an Position 61 von ras-p21 zu findenden Glutamins (Q) für Leucin (L). Dieses Peptid wird als p54-66[L61] oder [L61] bezeichnet. C3H/HeN-Mäuse wurden zweimal subkutan in Zwei-Wochenintervallen mit Ribi-Adjuvans allein oder Adjuvans, das mit p54-66[L61]-ras-Peptid emulgiert ist, (100 ug), immunisiert. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden Milzzellen von den Mäusen, denen Adjuvans allein (leerer Balken) oder Adjuvans plus p54-66[L61]-ras-Peptid (schwarzer Balken) injiziert worden war, geerntet und in vitro auf Proliferationsreaktion gegen das angegebene p54-66-Peptid (100 ug/ml) getestet. Das Peptid, das die Substitution von Lysin (K) für Glutamin an Position 61 enthält, wird als [K61] bezeichnet. Die Daten stellen den Mittelwert von Dreifachbestimmungen der c.p.m. von eingebautem ³HTdR ± S.D. dar.
Fig. 5 veranschaulicht graphisch, daß intaktes ras-p21[L61]- Protein von einer ras-Peptid-induzierten T-Zellinie spezifisch erkannt wird. Spezifische T-Zellinien und -klone wurden erzeugt und gehalten, wie in Beispiel 2 unten beschrieben. Eine T-Zellinie, die spezifische Reaktivität gegen das ras-Peptid p54-66[R61] zeigt (Diagramm A), und ein T-Zellklon, der spezifische Reaktivität gegen das ras-Peptid p5-17[R12] zeigt (Diagramm B), wurden mit (a) keinem Antigen, (b) sensibilisierendem ras-Peptid oder (c) intaktem ras-p21[L61]-Protein stimuliert. Die ras-p54-66[L61]-spezifische T-Zellinie stammte aus C3H und der ras-p5-17[R12]-spezifische T-Zellklon stammte aus B6. Proliferationstests wurden durchgeführt mit syngen bestrahlten Milzzellen als Antigen-präsentierende Zellen (wie beschrieben in Fig. 1). Stimulierende Peptide und Proteine wurden in einer Konzentration von 5 ug/ml verwendet. Das ras- p21[L61]-Protein wurde in E. coli HB101 unter Verwendung des prokaryontischen Expressionsplasmids pHR-L9 produziert und durch sequentielle DEAE-Sephacel- und Sephadex-Säulenchromatographie gereinigt. Die Daten stellen die mittleren c.p.m. von eingebautem ³HTdR ± S.D. dar.

Detallierte Beschreibung der Erfindung

Vor der Darlegung der Erfindung kann es für ein Verständnis derselben hilfreich sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke, die hierin im weiteren verwendet werden sollen, anzugeben.
Aktiviertes Oncogen - wie hierin verwendet, betrifft Proto- Oncogene, die aktiviert worden sind, was zur Expression von Proteinprodukten mit anderen Aminosäuresequenzen als denjenigen der Proteinprodukte, die von den normalen Proto-Oncogenen exprimiert werden, führt.
Mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gen - wie hierin verwendet, betrifft jedes geänderte Gen (verschieden von einem Oncogen), das mit der Entwicklung oder Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps assoziiert ist. Beispiele für solche geänderten Gene schließen Mutanten des p53-Tumorsuppressor-Gens ein.
Protein-Expressionsprodukt - wie hierin verwendet, schließt Proteine, Polypeptide und Peptide ein; und kann ein intaktes Molekül, ein Fragment desselben oder ein funktionales Äquivalent desselben sein; und kann durch Gentechnologie hergestellt sein.
Proliferation von T-Zellen - wie hierin verwendet, schließt die Vermehrung von T-Zellen sowie die Stimulation von T-Zellen, die zur Vermehrung führt, ein, d.h. die Initiation von Ereignissen, die zu Mitose führen und Mitose selbst. Methoden zum Nachweis der Proliferation von T-Zellen sind unten diskutiert.
Wie oben angegeben, ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren und Zusammensetzung für die Diagnose, Überwachung und Behandlung von Malignitäten in einem Warmblüter gerichtet, wobei aktivierte Oncogene oder mit Krebs in Zusammenhang stehende Gene mit den Malignitäten assoziiert sind. Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung zeigt, daß die Protein-Expressionsprodukte mit einer geänderten Primärsequenz von aktivierten Oncogenen und mit Krebs in Zusammenhang stehenden Genen durch Thymus-abhängige Lymphozyten (hierin im weiteren "T-Zellen") erkannt werden können und daher die autochthone Immunreaktion ausgenutzt werden kann, um Malignitäten, die solche Protein- Expressionsprodukte exprimieren, zu diagnostizieren und zu behandeln.
Aktivierung von Proto-Oncogenen ist assoziiert mit oder führt zu Transformation und Expression des malignen Phänotyps. Aktivierung durch Mechanismen, wie etwa Mutation oder chromosomale Translokation (Gen-Umordnung), schafft ein Genprodukt mit geänderter Primärstruktur, d.h. ein Protein-Expressionsprodukt mit einem oder mehreren Aminosäuren-Unterschieden relativ zum normalen Protein, das von dem Proto-Oncogen exprimiert wird. Mutationsmechanismen schließen Mutation von Nukleotiden, Rekombination, Deletion und Insertion ein. Beispiele für die Aktivierung von Proto-Oncogenen durch Mutation schließt Aktivierung von ras- und neu-Proto-Oncogenen ein. Chromosomale Translokation führt zu einem fusionierten Protein, wie etwa demjenigen, das mit chronischer myeologener Leukämie assoziiert ist. In ähnlicher Weise exprimieren mit Krebs in Zusammenhang stehende Gene abnorme Proteinprodukte mit geänderten Aminosäuresequenzen. Zum Beispiel führt die Mutation eines p53-Tumorsuppressor-Gens zu Aminosäuresubstitutionen.
Wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, werden Proteinprodukte mit geänderter Primärstruktur, die von aktivierten Oncogenen und mit Krebs in Zusammenhang stehenden Genen exprimiert werden, von T-Zellen erkannt. Solche abnormen Protein- Expressionsprodukte "setzen sich um" in Zellen, d.h. durchlaufen einen Zyklus, in dem ein Protein synthetisiert wird, arbeitet und dann abgebaut und durch ein neu synthetisiertes Molekül ersetzt wird. Die nachfolgenden Peptidfragmente aus dem abgebautem Protein binden sich an Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Antigene. Durch Präsentation eines abnormem Peptids, das an MHC-Antigen gebunden ist, auf der Zelloberfläche und Erkennung durch Wirts-T-Zellen der Kombination von abnormem Peptid plus Selbst-MHC-Antigen, wird eine maligne Zelle gegen T-Zellen immunogen werden. Die herausragende Spezifität des T-Zellrezeptors ermöglicht es einzelnen T-Zellen, zwischen Fragmenten von Proteinen zu unterscheiden, die sich durch einen einzigen Aminosäurerest unterscheiden.
Während der Immunreaktion gegen ein abnormes Peptid, werden sich T-Zellen, die einen T-Zellrezeptor mit hoher Affinitätsbindung des Peptid-MHC-Komplexes exprimieren, an den Peptid- MHC-Komplex binden und dadurch aktiviert und für Proliferation induziert werden. Beim ersten Zusammentreffen mit einem abnormen Peptid werden geringe Anzahlen von Immun-T-Zellen proliferieren und in Effektor- und Erinnerungs-T-Zellen differenzieren. Die primäre Immunreaktion wird in vivo auftreten, wird aber in vitro nicht nachgewiesen. Anschließendes Zusammentreffen mit demselben Antigen durch die Erinnerungs-T-Zelle wird zu einer schnelleren und intensiveren Immunreaktion führen. Die Sekundärreaktion wird entweder in vivo oder in vitro auftreten. Die in-vitro-Reaktion kann durch Messung des Proliferationsgrades der T-Zell-Population, die im Antigen erneut exponiert wird, leicht gemessen werden. Proliferation der T- Zell-Population in Reaktion auf ein besonderes Antigen wird als indikativ für frühere Exposition oder Priming gegen das Antigen angesehen.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine Malignität, in der ein aktiviertes Oncogen oder mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gen mit der Malignität assoziiert ist, nachgewiesen werden. Eine Immunreaktion gegen ein abnormes Protein, das von einem aktivierten Oncogen oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gen exprimiert wird, kann, einmal erzeugt, langlebig sein und kann lange nach der Immunisierung nachgewiesen werden, unabhängig davon, ob das Protein zum Testzeitpunkt im Körper vorhanden oder nicht vorhanden ist. In einer Ausführungsform kann vorherige Exposition eines Warmblüters, wie etwa Menschen, gegenüber Protein-Expressionsprodukt eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens durch Untersuchung auf das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von T-Zell-Proliferationsreaktionen nachgewiesen werden. Genauer gesagt werden T-Zellen, die aus einem Individuum durch Routinetechniken isoliert worden sind, mit einem Protein-Expressionsprodukt eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens inkubiert. Beispiele für Oncogene schließen ras, src, abl, fgr, rel, yes, fes, net, mos, raf, erb B, erb A, fms, neu, ros, kit, sea, sis, myc, myb, fos, ski, jun und ets ein. Alternativ können mehr als ein Protein-Expressionsprodukt mit der T-Zell-Probe untersucht werden. Es kann wünschenswert sein, einzelne Aliquote einer T-Zell-Probe mit nur einem Protein-Expressionsprodukt zu inkubieren, wenn ein solches Protein ein anderes Protein-Expressionsprodukt beeinflußt.
Der Nachweis der Proliferation von T-Zellen kann mit einer Vielzahl von bekannten Techniken erreicht werden. Zum Beispiel kann T-Zell-Proliferation durch Messen der Geschwindigkeit der DNA-Synthese bestimmt werden. T-Zellen, die zur Proliferation stimuliert worden sind, zeigen eine erhöhte Geschwindigkeit der DNA-Synthese. Ein typischer Weg, die Geschwindigkeit der DNA-Synthese zu messen, besteht z. B. in der Pulsmarkierung von Kulturen von T-Zellen mit tritiertem Thymidin, einem Nukleosid-Vorläufer, der in neu synthetisierter DNA eingebaut wird. Die Menge an eingebautem tritierten Thymidin kann unter Verwendung eines Flüssigszintillations-Spektrophotometers bestimmt werden. Andere Wege, um T-Zell-Proliferation nachzuweisen, schließen die Messung von Anstiegen in der Interleukin- 2(IL-2)-Produktion, dem Ca²&spplus;-Fluß oder der Farbstoffaufnahme, wie etwa 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium, ein.
Ein repräsentatives Beispiel für ein aktiviertes Oncogen, das ein Proteinprodukt exprimiert, das in der Lage ist, T-Zellen zu immunisieren, ist das ras-Oncogen. ras-Proto-Oncogene kodieren eine hochkonservierte Familie von 21Kd-Proteinen (189 Aminosäuren in der Länge), die kollektiv als "p21" bezeichnet werden. p21-Proteine binden sich an die Innenseite der Zellmembran, assoziieren mit Guanosin-Nukleotiden und besitzen intrinsische GTPase-Aktivität. p21-Proteine sind als wichtige intermediäre Signalproteine impliziert worden, die Zellwachstum und -differentiation steuern. ras-Oncogene wurden zuerst als genetisches Material in den transformierenden Harvey-Kirsten-Murinsarcom-Retroviren nachgewiesen. In Tieren induzieren Karzinogene sehr spezifische und vorhersagbare Mutationen, die üblicherweise die Codons 12, 13, 59 und/oder 61 betreffen, welche die intrinsische GTPase-Aktivität des p21-Moleküls beeinträchtigen und Transformationsaktivität verleihen. Das menschliche Genom enthält wenigstens drei ras-Proto-Oncogen- Homologe des viralen ras-Oncogens, bezeichnet als K-ras, H-ras und N-ras, die auf drei getrennten menschlichen Chromosomen lokalisiert sind. Jedes der drei ras-Gene kann durch spezifische Mutation aktiviert werden. Mutationen von einem der drei ras-Proto-Oncogene tritt üblicherweise in einer Vielzahl von menschlichen Malignitäten auf, einschließlich Pancreas-Adenokarzinom, Schilddrüsenfollikelkarzinom, Dickdarm-Adenokarzinom, Seminom, Lungen-Adenokarzinom, Leber-Adenokarzinom, Melanom, Knochenmarksleukämie und Myelom. Die Offenbarung der vorliegenden Erfindung zeigt, daß das exprimierte Proteinprodukt irgendeines der drei ras-Gene, wenn es mutiert ist, durch eine einzelne Aminosäuresubstitution von autochtonen T-Zellen erkannt werden kann.
Zum Beispiel wurden in der vorliegenden Erfindung Peptide, die aus 12 oder 13 Aminosäureresten bestehen, die der Aminosäuresequenz von den Resten 5-16, 5-17 oder 4-16 von p21 entsprachen, so konstruiert, daß sie entweder das normale Glycin (bezeichnet mit Gly-12 oder G-12) oder Arginin (bezeichnet mit Arg-12 oder R-12) oder Serin (bezeichnet mit Ser-12 oder S-12) oder Cystein (bezeichnet mit Cys-12 oder C-12) enthielten. C57BL/6-Mäuse wurden mit einer Einzeldosis des Arg-12-Peptids immunisiert. Lymphozyten von immunisierten Mäusen wurden anschließend auf Proliferationsreaktion gegen die obigen Peptide in vitro getestet, und, wie in Fig. 1 dargestellt, wurde festgestellt, daß sie spezifisch in Reaktion auf das Arg-12-Peptid, aber nicht auf die Gly-12-, Cys-12-, oder Ser-12-Peptide proliferierten. Zusätzlich wurde gezeigt (Fig. 3), daß Lymphozyten von Mäusen, die mit dem Arg-12-Peptid immunisiert worden waren, spezifisch in Reaktion auf eine Stimulation durch das intakte p21-Protein, das diese selbe Aminosubstitution enthielt (Oncogene Science, Inc., Manhasset, New York), proliferierten.
Ein anderes Beispiel für ein in der vorliegenden Erfindung geeignetes Peptid ist ras-p54-66[L61]. Dieses Peptid besteht aus 13 Aminosäureresten, die der Aminosäuresequenz von den Resten 54-66 von p21 entsprechen, mit der Ausnahme, daß das üblicherweise an Position 61 zu findende Glutamin (Q) durch Leucin (L) ersetzt worden ist. Es wurde festgestellt, daß Lymphozyten von Mäusen, die mit p54-66[L61] immunisiert worden waren, in vitro, wie in Fig. 4 dargestellt, spezifisch in Reaktion auf das Leu-61-Peptid, aber nicht auf die Gln-61- oder Lys-61-Peptide proliferierten. Zusätzlich wurde gezeigt (Fig. 5), daß die Lymphozyten von Mäusen, die mit dem Leu-61-Peptid immunisiert worden waren, spezifisch in Reaktion auf eine Stimulation durch das intakte p21-Peptid, das dieselbe Aminosäuresubstitution enthielt, proliferierten.
In ähnlicher Weise können andere Proteine als p21 (oder Peptide, die darauf beruhen oder davon abgeleitet sind) mit einer Vielzahl von bekannten Techniken isoliert oder konstruiert werden. Die Fachleute auf diesem Gebiet werden anerkennen, daß es wünschenswert sein kann, die Länge eines Gesamtpeptids oder der nativen Flankenregionen zu erhöhen, um die Induktion von T-Zellreaktionen zu erleichtern. Wie oben diskutiert, sind Protein-Expressionsprodukte von anderen aktivierten Oncogenen als ras oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Genen (d.h. mit einer Aminosäuresequenz, die verschieden ist von derjenigen der Proteine, die durch normale Proto-Oncogene oder normale Gene exprimiert werden) zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren geeignet.
Für therapeutische Zwecke können T-Zellen, die in der Gegenwart von einem oder mehreren Protein-Expressionsprodukten von aktivierten Oncogenen oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Genen proliferieren, entweder in vitro oder in vivo in ihrer Anzahl vermehrt werden. Die Proliferation solcher T-Zellen in vitro kann auf eine Vielzahl von Weisen erreicht werden. Zum Beispiel können die T-Zellen gegenüber einem oder mehreren Protein-Expressionsprodukten erneut exponiert werden. Es kann wünschenswert sein, die Exposition von T-Zellen gegenüber dem Protein zu wiederholen, um Proliferation zu induzieren. Wie in Fig. 2 gezeigt, können Protein-Expressionsprodukt-spezifische T-Zellen in vitro mit Spezifitätsretention in Reaktion auf intermittierende erneute Stimulation mit dem immunisierenden Peptid in großen Mengen gezüchtet werden.
Alternativ können eine oder mehrere T-Zellen, die bei Vorhandensein einer Proteinexpression proliferieren, durch Klonierung in der Anzahl vermehrt werden. Verfahren zur Klonierung von Zellen sind auf diesem Gebiet gut bekannt. Zum Beispiel können T-Zellinien in vitro etabliert und durch Grenzverdünnung kloniert werden. Ansprechende T-Zellen werden aus dem peripheren Blut von sensibilisierten Patienten durch Dichtegradientenzentrifugation und Schaferythtrozyten-Rosettentests gereinigt und in Kultur durch Stimulation mit dem normalen Antigen in der Gegenwart von bestrahlten autologen Filler-Zellen etabliert. Um CD4+-T-Zellinien zu erzeugen, wird intaktes ras- p21-Protein, das die relevante Aminosäuresubstitution trägt als der antigene Stimulus verwendet und autologe Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL) oder lymphoblastoide Zellinien (LCL), die durch Infektion mit Epstein-Barr-Virus immortalisiert sind, werden als Antigen-präsentierende Zellen verwendet. Um CD8+-T-Zellinien zu erzeugen, werden autologe Antigen- präsentierende Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert sind, der relevantes mutiertes ras-p21-Protein produziert, als Stimulatorzellen verwendet. Etablierte T-Zellinien werden 2-4 Tage im Anschluß an die Antigenstimulation durch Plattierung stimulierter T-Zellen mit einer Häufigkeit von 0,5 Zellen pro Vertiefung in Flachboden-Platten mit 96 Vertiefungen mit 1 x 10&sup6; bestrahlten PBL- oder LCL-Zellen und rekombinantem Interleukin 2 (rIL2) (50 U/ml) kloniert. Vertiefungen mit etabliertem klonalen Wachstum werden ungefähr 2-3 Wochen nach der ersten Plattierung identifiziert und erneut mit geeignetem Antigen in der Gegenwart von autologen Antigen-präsentierenden Zellen stimuliert, dann anschließend durch die Zugabe niedriger Dosen von rIL2 (10 U/ml) 2-3 Tage im Anschluß an die Antigenstimulation vermehrt. T-Zellklone werden in Platten mit 24 Vertiefungen durch periodische erneute Stimulation mit Antigen und rIL2 ungefähr alle zwei Wochen gehalten.
Unabhängig davon, wie die T-Zellen eines Individuums in vitro proliferiert werden, können die T-Zellen dem Individuum für therapeutischen Angriff gegen einen Tumor verabreicht werden. So können die eigenen T-Zellen eines Patienten (autochthone T- Zellen) als Reagenzien verwendet werden, um spezifische Tumortherapie zu mediatisieren. Typischerweise werden etwa 1 X 10&sup9; bis 1 X 10¹¹ T-Zellen/M² intravenös oder intrakavitär, z.B. in die Brustfell- oder Bauchfellhöhle, oder im Bett eines resezierten Tumors verabreicht werden. Es wird den Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, daß die Anzahl und Häufigkeit der Verabreichung von der Reaktion des Patienten abhängig sein wird. Geeignete Trägerstoffe oder Verdünnungsstoffe für T-Zellen schließen physiologische Kochsalzlösung oder Seren ein. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird anerkennen, daß die Zusammensetzung in steriler Form hergestellt werden sollte.
T-Zellen können auch in vivo proliferiert werden. Zum Beispiel kann die Immunisierung eines Individuums mit einem oder mehreren Protein-Expressionsprodukten von aktivierten Oncogenen oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Genen eine fortgesetzte Vermehrung in der Anzahl von T-Zellen induzieren, die zum therapeutischen Angriff gegen einen Tumor notwendig sind. Es kann wünschenswert sein, das Protein-Expressionsprodukt wiederholt zu verabreichen.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch, daß die Protein-Expressionsprodukte von aktivierten Oncogenen oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Genen, die eine geänderte Primärsequenz besitzen, zusätzlich dazu, daß sie gegen T-Zellen immunogen sind, B-Zellen zu stimulieren scheinen, um Antikörper zu produzieren, die in der Lage sind, diese Proteine zu erkennen. Der Nachweis solcher Antikörper liefert einen anderen Weg zur Diagnose einer Malignität, in der ein aktiviertes Oncogen oder mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gen mit der Malignität assoziiert ist. Antikörper, die für ein oder mehrere Protein- Expressionsprodukte spezifisch sind (d.h. die eine Bindungsaffinität von etwa 10&sup7; Litern/Mol oder besser zeigen), sind in einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten zu finden, einschließlich Seren und Ascites. Der Nachweis eines oder mehrerer Immunkomplexe, die zwischen einem Protein-Expressionsprodukt und für das Protein spezifischen Antikörpern gebildet sind, kann mit einer Vielzahl bekannter Techniken erreicht werden, wie etwa Radioimmuntests (RIA) und enzymverknüpften Immunsorbenstests (ELISA).
Geeignete Immuntests schließen die Doppel-Antikörper-Sandwich- Immuntesttechnik mit monoklonalen Antikörpern von David et al. (U.S.-Patent 4,376,110); Sandwichtests mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern (Wide et al., in Kirkham und Hunter, Hrg., Radioimmunoassay Methods, E. und S. Livingstone, Edingburgh, 1970); das "Western-Blot"-Verfahren von Gordon et al. (U.S.-Patent 4,452,901); Immunfällung von markierten Liganden (Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980); enzymverknüpfte Immunsorbenstests, beschrieben von z. B. Raines und Ross (J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982); immuncytochemische Techniken, einschließlich der Verwendung von Fluorochromen (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980); und Aktivitätsneutralisation [Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400 (1984)] ein, die alle hierdurch durch Bezugnahme miteinbezogen sind. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Immuntests sind eine Anzahl anderer Immuntests verfügbar, einschließlich derjenigen, die beschrieben sind in U.S.-Patent Nos.: 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; und 4,098,876, die alle durch Bezugnahme hierdurch miteinbezogen sind.
Für Nachweiszwecke können die Protein-Expressionsprodukte ("Antigene") entweder markiert oder unmarkiert sein. Wenn sie unmarkiert sind, finden die Antigene Verwendung in Agglutinationstests. Zusätzlich können unmarkierte Antigene in Kombination mit markierten Molekülen verwendet werden, die mit Immunkomplexen reaktiv sind, oder in Kombination mit markierten Antikörpern (zweiten Antikörpern), die mit dem gegen das Protein-Expressionsprodukt gerichteten Antikörper reaktiv sind, wie etwa Antikörper, die für Immunglobulin spezifisch sind. Alternativ können die Antigene direkt markiert sein. Wo sie markiert sind, kann die Reporter-Gruppe Radioisotope, Fluorophore, Enzyme, Lumineszere oder Farbstoffteilchen einschließen. Diese und andere Markierungen sind auf diesem Gebiet gut bekannt und sind z. B. in den folgenden U.S.-Patenten beschrieben: 3,766,162; 3,791,932; 3,817,837; 3,996,345; und 4,233,402.
Typischerweise in einem ELISA-Test wird Antigen an die Oberfläche einer Mikrotiter-Vertiefung adsorbiert. Übrigbleibende Protein-Bindungsstellen auf der Oberfläche werden dann mit einem geeigneten Mittel blockiert, wie etwa Rinderserumalbumin (BSA), hitzeinaktiviertem normalen Ziegenserum (NGS) oder BLOTTO (gepufferte Lösung von Trockenmagermilch, die auch einen Konservierungsstoff, Salze und ein Antischaummittel enthält). Die Vertiefung wird dann mit einer Probe inkubiert, von der man den Verdacht hat, daß sie spezifische Antikörper enthält. Die Probe kann rein aufgebracht werden oder sie kann - häufiger - verdünnt sein, üblicherweise in einer gepufferten Lösung, die eine geringe Menge (0,1-5,0 Gew.-%) Protein enthält, wie etwa BSA, NGS oder BLOTTO. Nach Inkubieren für einen ausreichenden Zeitraum, um zu ermöglichen, daß spezifische Bindung auftritt, wird die Vertiefung gewaschen, um nicht-gebundenes Protein zu entfernen, und dann mit einem anti-Spezies-spezifischen Immunglobulin-Antikörper inkubiert, der mit einer Reporter-Gruppe markiert ist. Die Reporter-Gruppe kann aus einer Vielzahl von Enzymen ausgewählt sein, einschließlich Meerrettich-Peroxidase, Beta-Galactosidase, alkalischer Phosphatase und Glucose-Oxidase. Man läßt ausreichend Zeit verstreichen, damit spezifische Bindung auftritt, dann wird die Vertiefung erneut gewaschen, um nicht-gebundenes Konjugat zu entfernen, und das Substrat für das Enzym wird zugegeben. Man läßt sich die Farbe entwickeln und die optische Dichte innerhalb der Vertiefung wird visuell oder instrumentell bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Reporter-Gruppe an das Protein- Expressionsprodukt gebunden. Der Immunkomplex-Nachweisschritt umfaßt Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Protein-Expressionsprodukt und anschließend Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Reporter-Gruppe.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Reporter-Gruppe an einen zweiten Antikörper gebunden, der in der Lage ist, sich an die für ein Protein-Expressionsprodukt spezifischen Antikörper zu binden. Der Immunkomplex-Nachweisschritt umfaßt (a) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Antikörper, (b) Zugeben des zweiten Antikörpers, (c) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen zweiten Antikörper und anschließend (d) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Reporter-Gruppe. Wo der für das Protein-Expressionsprodukt spezifische Antikörper von einem Menschen gewonnen ist, ist der zweite Antikörper ein anti-Human-Antikörper.
In einer dritten bevorzugten Ausführungsform zum Nachweisen von Immunkomplexen wird eine Reporter-Gruppe an ein Molekül gebunden, das in der Lage ist, sich an die Immunkomplexe zu binden. Der Nachweisschritt umfaßt (a) Zugeben des Moleküls, (b) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Molekül und anschließend (c) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Reporter-Gruppe. Ein Beispiel eines Moleküls, das in der Lage ist, sich an die Immunkomplexe zu binden, ist Protein A.
Es wird einem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein, daß eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweis der Immunkomplexe innerhalb der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann. Reporter-Gruppen, die zur Verwendung in irgendeinem der Verfahren geeignet sind, schließen Radioisotope, Fluorophore, Enzyme, Lumineszere und Farbstoffteilchen ein.
In einem damit zusammenhängenden Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Nachweis von Immunkomplexen, die zwischen einem Protein-Expressionsprodukt eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens und Antikörpern in Körperflüssigkeit, die für das Protein spezifisch sind, gebildet sind, verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Krebstherapie zu überwachen. Körperflüssigkeitsproben, die von einem Individuum vor dem und im Anschluß an den Beginn der Therapie abgenommen werden, können mit den oben beschriebenen Methodiken auf die Immunkomplexe analysiert werden. Kurz gesagt werden die Anzahl von Immunkomplexen, die in beiden Proben nachgewiesen werden, verglichen. Eine beträchtliche Veränderung in der Anzahl von Immunkomplexen der zweiten Probe (nach Therapiebeginn) relativ zur ersten Probe (vor Therapie) spiegelt erfolgreiche Therapie wider.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.

BEISPIELE

Beispiel 1

Hervorrufen einer spezifischen auf Klasse II beschränkten T- Zell-Reaktion gegen mutierte Ras-Oncogen-Produkte

A. Immunisierung

C57BL/6- und B6.C-H-2bm12-Mäuse (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.) wurden mit einem synthetischen Peptid (Aminosäuresequenz: KLVVVGARGVGK; Microbiological Associates, Bethesda, Md.) beimpft, das Rest 5-16 des p21-Proteinprodukts von mutiertem ras-Proto-Oncogen entspricht, das eine Rest-12-Substitution von Arginin (R) für Glycin (G) kodiert. Das Peptid wurde in destilliertem Wasser bei 1 mg/ml löslich gemacht, in vollständigem Freundschen Adjuvans (Sigma Co., St. Louis, Mo.) in einem Verhältnis von 1:1 emulgiert, dann subkutan in die Schwanzbasis unter Verwendung einer Nadel Nr. 25 injiziert. Alternativ wurde Peptid mit Ribi-MPL+TDM+CWS-Adjuvans (Ribi Immunochem. Res., Hamilton, Mt.) emulgiert und subkutan in beide Hinterteile injiziert. Die Gesamtmenge an injiziertem Peptid betrug 50 ug pro Maus. Sieben Tage später wurden die Tiere geopfert und drainierende periaortale und inguinale Lymphknoten wurden entfernt. Lymphknoten, die in gepufferter Kochsalzlösung in Petrischalen suspendiert wurden, wurden mit Nadeln Nr. 18 auseinandergerissen. Herausgelöste Lymphozyten wurden gesammelt und in gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, dann bei 1 X 10&sup6; Zellen pro ml in Kulturmedium zur Verwendung in Proliferationstests suspendiert.

B. Proliferationstest

Lymphozyten, die von immunisierten Mäusen erhalten wurden, wurden in Kulturmedium suspendiert (bestehend aus RPMI 1640 Gibco, ergänzt mit 10% fötalem Kalbsserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin und 2,5 X 10&supmin;&sup5; M 2- Mercaptoethanol) und wurden in Flachboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Costar Co., Cambridge, Mass.) mit 1 X 10&sup5; Zellen pro Vertiefung plattiert. Syngene Milzzellen, die auf 3000 rads bestrahlt worden waren, wurden mit 2 X 10&sup5; Zellen pro Vertiefung zugegeben, um als Antigen-präsentierende Zellen zu dienen. Das immunisierende Peptid und die angegebenen Kontrollpeptide (50 ug/ml) wurden zu Dreifachvertiefungen zugegeben (Endvolumen von 200 ul/Vertiefung). Die Platten wurden bei 37ºC in befeuchteter Luft, die 5% Co&sub2; enthielt, für 72 Stunden inkubiert, dann für 6 Std. mit 1 uCi pro Vertiefung tritiiertem Thymidin (³H-TdR; 20 Ci/mMol von NEN Products, Boston, Ma.) gepulst. Lymphozyten aus einzelnen Vertiefungen wurden auf Filterpapierscheiben unter Verwendung einer Mehrkanal-Ernteeinrichtung gesammelt, dann in Szintillationsflüssigkeit in einzelnen Zählröhrchen überführt. β-Emission wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillations-Spektrophotometers von Beckmann gemessen. Die in Fig. 1 angegebenen Daten stellen den Mittelwert von Dreifachbestimmungen dar.

Beispiel 2

Erzeugung von T-Zellinien und -klonen mit Spezifität für das Proteinprodukt von mutiertem Ras-Proto-Oncogen

Lymphozyten, die aus drainierenden Lymphknoten von immunisierten Mäusen erhalten wurden, wie oben beschrieben, wurden in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen (Costar Co.) mit bestrahlten syngenen Milzzellen (10.000 rads; 2 X 10&sup6; Zellen pro Vertiefung) und immunisierendem Peptid (5 ug/Vertiefung) plattiert (4 X 10&sup6; Zellen pro Vertiefung), um ein Endvolumen von 2 ml (Kulturmedium) zu ergeben. Die Platten wurden für 5 Tage (37ºC, 5% CO&sub2;) kultiviert, dann 1:2 auf Replikat-Platten aufgeteilt. Nach 10 Tagen wurden Lymphozyten durch Plattieren von 5 X 10&sup5; kultivierten Lymphozyten mit 4 x 10&sup6; bestrahlten syngenen Milzzellen und Peptid mit 5 ug/ml erneut stimuliert. Nach drei Tagen wurden einzelne Vertiefungen neu verteilt in 2-4 Vertiefungen mit Kulturmedium, das 10 Einheiten Interleukin-2 (menschlicher Rekombinant von Hoffmann-LaRoche) enthielt, um Zellvermehrung zu erleichtern. Die Linien wurden mit Antigen und anschließend IL-2, wie oben beschrieben, alle 3-4 Wochen erneut stimuliert.
Immune Lymphozyten, die zweimal in vitro mit Antigen stimuliert worden waren, wurden am Tag 13 im Anschluß an den Kulturstart (3 Tage nach Ag-Restimulation) durch Plattieren immuner T-Zellen mit einer Häufigkeit von 0,5 Zellen pro Vertiefung in Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen mit bestrahlten syngenen Milzzellen (1 x 10&sup6; Zellen pro Vertiefung) und Interleukin-2 mit 50 U/ml kloniert. Vertiefungen mit klonalem Wachstum wurden vermehrt und auf Immunspezifität getestet, wie in Fig. 2 dargestellt. Spezifische T-Zellklone wurden gehalten, wie für T-Zellinien beschrieben.

Claims

1. Ein Verfahren zum Nachweis einer Malignität in einem Warmblüter, wobei ein aktiviertes Oncogen oder mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gen mit der Malignität assoziiert ist, welches die Schritte umfaßt:

(a) Inkubieren von T-Zellen, die aus einem Warmblüter isoliert sind, mit wenigstens einem Protein-Expressionsprodukt mit einer geänderten Primärseqüenz eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gens, das mit der Malignität assoziiert ist; und

(b) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Proliferation der T-Zellen, wodurch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Malignität bestimmt wird.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweisschritt die Messung der Geschwindigkeit der DNA-Synthese der T- Zellen umfaßt.

3. Ein Verfahren zum Nachweis einer Malignität in einem Warmblüter, wobei ein aktiviertes Oncogen oder mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gen mit der Malignität assoziiert ist, welches die Schritte umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen einer Körperflüssigkeit, die im Verdacht steht, Antikörper zu enthalten, die spezifisch sind für ein Protein-Expressionsprodukt mit einer geänderten Primärsequenz eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit der Malignität assoziiert ist, mit wenigstens einem Protein-Expressionsprodukt eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit der Malignität assoziiert ist;

(b) Inkubieren der Körperflüssigkeit unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um die Bildung von Immunkomplexen zu ermöglichen; und

(c) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von einem oder mehreren Immunkomplexen, die zwischen dem Protein-Expressionsprodukt und Antikörpern in der Körperflüssigkeit, die für das Protein- Expressionsprodukt spezifisch sind, gebildet sind, wodurch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Malignität bestimmt wird.

4. Ein Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit einer Krebstherapie in einem Warmblüter mit einer Malignität, wobei ein aktiviertes Oncogen oder mit Krebs in Zusammenhang stehendes Gen mit der Malignität assoziiert ist, welches die Schritte umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen einer ersten Körperflüssigkeitsprobe, die einem Warmblüter vor Beginn der Therapie abgenommen ist, mit wenigstens einem Protein-Expressionsprodukt mit einer geänderten Primärsequenz eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit der Malignität assoziiert ist;

(b) Inkubieren der Körperflüssigkeit unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die ausreichend sind, um die Bildung von Immunkomplexen zu ermöglichen;

(c) Nachweisen von Immunkomplexen, die zwischen dem Protein-Expressionsprodukt und Antikörpern in der Körperflüssigkeit, die für das Protein-Expressionsprodukt spezifisch sind, gebildet sind;

(d) wiederholen der Schritte (a) (b) und (c) an einer zweiten Körperflüssigkeitsprobe, die dem Tier im Anschluß an den Beginn der Therapie abgenommen ist; und

(e) Vergleichen der Anzahl von Immunkomplexen, die in der ersten und der zweiten Körperflüssigkeitsprobe nachgewiesen sind, wodurch die Wirksamkeit der Therapie im Tier überwacht wird.

5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei eine Reporter-Gruppe an einen zweiten Antikörper gebunden wird, der in der Lage ist, sich an die Antikörper zu binden, und wobei der Nachweisschritt umfaßt: (a) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Antikörper, (b) Zugeben des zweiten Antikörpers, (c) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen zweiten Antikörper und (d) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Reporter-Gruppe.

6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei der zweite Antikörper ein anti-Human-Antikörper ist.

. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei eine Reporter-Gruppe an ein Molekül gebunden wird, das in der Lage ist, sich an die Immunkomplexe zu binden, und wobei der Nachweisschritt umfaßt: (a) Zugeben des Moleküls, (b) Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Molekül und (c) Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Reporter-Gruppe.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Molekül, das in der Lage ist, sich an die Immunkomplexe zu binden, Protein A ist.

9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei eine Reporter-Gruppe an das Protein-Expressionsprodukt gebunden wird und wobei der Nachweisschritt umfaßt: Entfernen von im wesentlichen jeglichem nicht-gebundenen Protein-Expressionsprodukt und anschließend Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der Reporter- Gruppe.

10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 7 oder 9, wobei die Reporter-Gruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Radioisotopen, Fluorophoren, Enzymen, Lumineszeren und Farbstoffteilchen besteht.

11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei das Protein-Expressionsprodukt mit einer geänderten Primärsequenz eines aktivierten Oncogens ein Protein ist, das durch ein Oncogen kodiert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus ras, src, abl, fgr, rel, yes, fes, net, mos, raf, erb B, erb A, fms, neu, ros, kit, sea, sis, myc, myb, fos, ski, jun und ets besteht.

12. T-Zellen, die aus einem Warmblüter isoliert sind, wobei besagte T-Zellen in der Gegenwart von wenigstens einem Protein-Expressionsprodukt mit einer geänderten Primärsequenz eines aktivierten Oncogens oder mit Krebs in Zusammenhang stehenden Gens, das mit einer Malignität assoziiert ist, durch Proliferation erhältlich sind, zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimitteis zur Behandlung einer Malignität in dem Warmblüter.

13. Die T-Zellen nach Anspruch 12, wobei das Protein-Expressionsprodukt des aktivierten Oncogens ein Protein ist, das durch ein Oncogen kodiert ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus ras, src, abl, fgr, rel, yes, fes, net, mos, raf, erb B, erb A, fms, neu, ros, kit, sea, sis, myc, myb, fos, ski, jun und ets besteht.