DE69107161T2 - Diterpenverbindung und Verfahren zu ihrer Produktion. - Google Patents
Diterpenverbindung und Verfahren zu ihrer Produktion.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft UCT-4B, ein Diterpen vom Clerodan-Typ, das Antitumor- und antibakterielle Wirksamkeit besitzt, und ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung mit einer Diterpen-Struktur vom Clerodan-Typ unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces.
- Bekannte Beispiele von Antibiotika mit einer Diterpen-Struktur vom Clerodan-Typ umfassen Terpentecin (MF730-N6), erzeugt von einem Mikroorganismus der Gattung Kitasatosporia [vgl. EP-A- 205981; The Journal of Antibiotics 38 (1985) 1664; und ibid. 38 (1985) 1819] und Clerocidin (PR-1350), erzeugt von einem Mikroorganismus der Gattung Oidiodendron [vgl. US-Patent 4576961; The Journal of Antibiotics 36 (1983) 753; und Tetrahedron Letters 25 (1984) 465].
- Beide Diterpen-Antibiotika vom Clerodan-Typ liegen normalerweise als Gleichgewichtsmischung tautomerer Formen vor, die chemisch equivalent sind. Es ist z.B. bekannt, daß Klerocidin in Form einer Gleichgewichtsmischung von Monomeren, wie z.B. als Hydroxyaldehyd (Verbindung A) und Hemiacetal (Verbindung B) oder als Dimeres (Verbindung C), wie in den folgenden Formeln dargestellt, vorliegt. Verbindung
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, UCT4-B mit Antitumor- und antibakterieller Wirkung bereitzustellen, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Diterpen-Derivats vom Clerodan-Typ unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Diterpen-Derivats vom Clerodan-Typ der Formel (I):
- worin R -CH&sub3; (Terpentecin) oder -CH&sub2;OH (UCT4-B) darstellt; nach dem man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der dazu in der Lage ist, das Diterpen-Derivat vom Clerodan- Typ zu bilden, in einem Medium kultiviert, um das Diterpen- Derivat vom Clerodan-Typ in der Kultur anzureichern, und das Diterpen-Derivat vom Clerodan-Typ aus dieser Kultur gewinnt; und UCT4-B der Formel (II):
- sowie chemisch equivalente tautomere Formen davon.
- Fig. 1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von UCT4-B
- Fig. 2 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum von UCT4-B
- Es wird nun ein Verfahren zur Herstellung von UCT4-B und Terpentecin beschrieben.
- UCT4-B und Terpentecin können erhalten werden, indem man einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der dazu in der Lage ist, UCT4-B und Terpentecin zu bilden, kultiviert, um UCT4-B und Terpentecin in der Kultur anzureichern, und UCT4-B und Terpentecin aus dieser Kultur gewinnt.
- Als UCT4-B und Terpentecin-bildender Stamm kann jeder Stamm verwendet werden, solange er zur Gattung Streptomyces gehört und UCT4-B und Terpentecin bilden kann. Ein typisches Beispiel dafür ist der Stamm S-464, der von den Erfindern der vorliegenden Erfindung erstmals isoliert wurde.
- Die mykologischen Eigenschaften des Stammes S-464, die nachfolgend angegeben werden, wurden in Übereinstimmung mit einem Verfahren zur Bestimmung der Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen bestimmt, daß von International Streptomyces Project (ISP) [vgl. E.B. Shirling und D. Gottlib, Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (1966) 313] empfohlen wird. Diaminopimelinsäure-Isomeren im Hydrolysat der ganzen Zellen werden gemäß dem von B. Becker et al. beschriebenen Verfahren identifiziert [vgl. Appl. Microbiol. 12 (1964) 421]. Für die morphologischen Untersuchungen wird ein optisches Mikroskop verwendet, während insbesondere zur Beobachtung der Morphologie der Oberfläche von Sporen ein Rasterelektronenmikroskop verwendet wird. Die Farben werden gemäß dem Color Harmony Manual, Container Co. of America, 4. Auflage (1958) angegeben.
- Die mykologischen Eigenschaften des Stammes S-464 sind die folgenden:
- Aeriale Hyphe: verzweigt
- Submerse Hyphe: verzweigt aber nicht fragmentiert
- Spore: an die Hyphen als lange refractile oder schleifenförmige Kette aus 10 bis 30 oder mehr fragmentierten Sporen gebunden
- Oberfläche der Spore: glatt
- Motilität der Spore: keine
- Form und Größe der Spore: ellipsoid (0.5 x 0.7 um)
- Es wurden weder irgendeine Sklera noch irgendein Sporangium beobachtet.
- Aeriale Hyphe: weiß
- Submerse Hyphe: blaßgelb - gelblich braun
- Lösliches Pigment: blaßgelb
- Melaninpigment: ja
- Stereostruktur von Diaminopimelinsäure: LL-Typ
- Anabolismus der Kohlenstoffquelle:
- Assimilierte Kohlenstoffquelle: Glucose, Xylose, Inositol, Mannit, Arabinose, Rhamnose, Raffinose, Lactose, Sucrose und Galactose.
- Nicht-assimilierte Kohlenstoffquelle: Salicin
- * Gelatin-Verflüssigung: negativ
- Stärkehydrolyse: positiv
- * Fest werden von Magermilch: negativ
- * Peptonisierung von Magermilch: positiv
- * Zersetzung von Cellulose: positiv
- ** Wachstumstemperaturbereich: 16 - 37 ºC (optimale Temperatur: 28 - 32 ºC)
- Anmerkung: * Die Wirkung an Gelatine, Magermilch und Cellulose werden als Ergebnis eines Tests angegeben, der nach einem Monat bei 28 ºC durchgeführt wurde, während ** der Wachstumstemperaturbereich auf 2 Tage lang beobachteten Ergebnissen basiert.
- Der S-464-Stamm wurde in verschiedenen Agar-Medien bei 28 ºC 28 Tage lang kultiviert. Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.
- In Tabelle 1 bedeutet G den Wachstumsgrad, AM die Anbringung und Farbe von aerialen Hyphen, SM die Farbe von submersen Hyphen und P die Farbe eines löslichen Pigments. Tabelle 1 Medium Wachstum Sucrose/Nitrat-Agar-Medium Glucose/Asparagin-Agar-Medium mäßig schlecht, weiß leicht elfenbeinfarbig (2ca) keine gut reich, schwach elfenbeinfarbig (2ca) schwach elfeinbeinfarbig (2ca) Glycerin/Asparagin-Agar Medium Stärke-Agar-Medium Tyrosin-Agar-Medium Agar-Nährmedium Hefe/Malz-Agar-Medium Hafermehl-Agar-Medium Gut reich, perlmuschelrosa (3ba-5ba) fleischfarbig (4gc) ja, schwach gelb reich, natürlich-weiß (3dc). aprikosenfarbig (4gc) ja, ein wenig reich, weiß ja, braun toastfarbig-fleischfarbig (41g-4gc) reich, sandfarbig (3cb) hellbraun (4ng) ja, blaßgelb keine dunkelbraun (4pn) Pepton/Hefeextrakt/Eisen-Agar-Medium mäßig keine magnolienfarbig (41i) ja, braun
- Da aus dem Stamm S-464 die LL-Form der Diaminopimelinsäure festgestellt wird, fällt er unter die Actinomyceten des Zellwand I-Typs [vgl. Int. J. Syst. Bacteriol. 20 (1970) 435]. Die vorstehend angegebenen morphologischen Eigenschaften dieses Stammes lassen außerdem darauf schließen, daß er zur Gattung Streptomyces gehört.
- Die Spezies dieses Stammes S-464 wurde unter denen, die zur Gattung Streptomyces gehören, identifiziert durch Bestimmung von Spezien, deren Eigenschaften ähnlich denen dieses Stammes sind (nämlich weiße Hyphen, refractile oder schleifenförmige Sporenkette, glatte Sporenoberfläche, Bildung des Melaminartigen Pigments, Bildung des löslichen Pigments und Stoffwechselmuster von Kohlenstoffquellen) aus Spezien, die aufgezählt sind in Approved Lists of Bacterial Names im Hinblick auf die Beschreibung von ISP [Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (1968) 69; ibid. 18 (1968) 279; ibid 19 (1969) 391 und ibid. 22 (1972) 265] und Bergey's Manual of Determinative Bacteriology [herausgegeben von R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, 8. Auflage, Williams and Wilkins Co. (1974)].
- Es wurde so festgestellt, daß der Stamm S-464 zu einer neuen Spezies der Gattung Streptomyces gehört. Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan, als Streptomyces sp. S-464, No. FERM BP-3036, am 31. Juli 1990 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.
- Der Stamm S-464 kann gemäß einem Verfahren kultiviert werden, daß allgemein zur Kultivierung von Actinomyceten verwendet wird. Es kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches verwendet werden, solange es eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Materialien enthält, die durch diesen Stamm metabolisiert werden können, Substanzen, die für sein Wachstum erforderlich sind, und Substanzen, die dazu in der Lage sind, die Bildung der angestrebten Verbindungen zu fördern.
- Beispiele für die Kohlenstoffquelle umfassen Glucose, Stärke, Dextrin, Mannose, Fructose, Sucrose, Lactose, Xylose, Arabinose, Mannit, Molasse und Mischungen davon. Außerdem können Kohlenwasserstoffe, Alkohole oder organische Säuren, abhängig vom Stoffwechselvermögen des Stammes, verwendet werden. Beispiele für die Stickstoffquelle umfassen Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, gequollenen Mais, Sojabohnenmehl, Aminosäuren und Mischungen davon. Außerdem können, wenn erforderlich, anorganische Salze, wie z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Eisen(II)-sulfat, Calciumchlorid, Mangansulfat, Zinksulfat und Kupfersulfat dem Medium zugegeben werden. Außerdem können gegebenenfalls Spuren an Komponenten, die dazu in der Lage sind, das Wachstum des Stammes und die Bildung von UCT4-B und Terpentecin zu fördern, zugegeben werden.
- Vorzugsweise wird dieser Stamm nach der Flüssigkulturmethode kultiviert, und insbesondere nach der Eintauchagitation- Kultivierungsmethode. Die Kultivierungstemperatur beträgt 16 bis 37 ºC, vorzugsweise 25 bis 32 ºC, und der pH-Wert des Mediums wird während der Kultivierung durch Zugabe von z.B. Schwefelsäure, wässerigen Ammoniak oder Ammoniumcarbonatlösung bei 4 bis 10, und vorzugsweise 6 bis 8, gehalten.
- Wenn der Stamm mittels der Flüssigkulturmethode 1 bis 7 Tage lang kultiviert wird, werden im allgemeinen UCT4-B und Terpentecin gebildet und im Kulturmedium und den Zellen angereichert. Wenn die Bildung im Kulturmedium das Maximum erreicht, wird die Kultivierung beendet.
- Das UCT4-B und Terpentecin können aus dem Kulturmedium isoliert und durch eine Methode gereinigt werden, die allgemein zur Isolierung und Reinigung von Metaboliten eines Mikroorganismus aus seiner Kultur verwendet wird.
- Z.B. wird das Kulturmedium filtriert und so in ein Kulturfiltrat und Zellen getrennt. Als nächstes werden die Zellen z.B. mit Chloroform oder Aceton extrahiert. Dann wird der Extrakt mit dem Kulturfiltrat vereinigt und durch eine mit einem Polystyrol-Adsorbens, wie z.B. Diaion HP20 (Produkt von Mitsubishi Kasei Corporation) beschickten Säule hindurchlaufen gelassen, um dadurch die darin enthaltenen wirksamen Komponenten zu adsorbieren, die dann nachfolgend mit z.B. Ethylacetat oder Aceton eluiert werden. Das erhaltene Eluat wird aufkonzentriert und durch eine auf diesem Gebiet allgemein übliche Chromatographie, z.B. Silikagel- Säulenchromatographie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, gereinigt. Auf diese Weise können UCT4-B und Terpentecin als weißes Pulver erhalten werden.
- Das so erhaltene UCT4-B kann z.B. in Form einer Gleichgewichtsmischung von chemisch equivalenten Tautomeren der nachfolgenden Formeln vorliegen. Erfindungsgemäß werden alle Isomeren einschließlich dieser Tautomeren umfaßt.
- Wie das nachfolgende Reaktionsschema zeigt, kann durch Umsetzung von UCT4-B mit o-Phenylendiamin eine Gleichgewichtsmischung der Verbindungen 2 und 3, von denen jede eine Chinoxalin-Ring besitzt, erhalten werden. Die Gleichgewichtsmischung wird dann acetyliert und ergibt so eine einzige Verbindung 4, die nicht mit irgendeiner Gleichgewichtsmischung von Tautomeren verunreinigt ist (vgl. die Bezugsbeispiele 1 und 2). UCT4-B Verbindung
- Auf diese Weise wurde die Struktur von UCT4-B noch eindeutiger bestätigt.
- Unter Bezugnahme auf die folgenden Testbeispiele wird nun die biologische Wirksamkeit von UCT4-B veranschaulicht.
- Die antibakterielle Wirksamkeit von UCT4-B an 4 Bakterien (d.h. Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Bacillus subtillis, Klebsiella pneumoniae) wurde mittels der Agar- Verdünnungsmethode (pH = 7.0) untersucht [vgl. "Biseibutsu Jikken Manyuaru (Manual of The Microbial Experiments)" 80, Kondansha (1986)].
- Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 als minimale Wachstumsinhibierungskonzentration (MIC) angegeben. Tabelle 2 Teststamm Staphylococcus aureus ATCC 6538P Enterococcus faecium ATCC 10541 Bacillus subtilis ATCC 10707 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031
- UCT4-B wurde einmal an ddy-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 20 g (jede Gruppe wies 5 Tiere auf) verabreicht und dann die Überlebensrate der Tiere nach der Verabreichung 14 Tage lang beobachtet. Dann wurde die LD&sub5;&sub0; der Verbindung auf der Basis der Sterblichkeit der Mäuse jeder Gruppe gemäß der Methode von Behrens-Kärber berechnet. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die LD&sub5;&sub0; von UCT4-B 50 mg/kg oder größer ist.
- 1 x 10&sup6; Lymphocyten-Leukämie p338-Tumorzellen werden intraperitoneal in männliche CDF&sub1;-Mäuse mit einem Gewicht von 22 g (jede Gruppe umfaßte 5 Tiere) transplantiert. 24 Stunden nach der Transplantation wurden 0.2 ml einer Lösung von UCT4-B in physiologischer Kochsalzlösung oder 0.2 ml physiologische Kochsalzlösung (für die Kontrollgruppe) den Tieren intraperitoneal verabreicht.
- Die Ergebnisse dieses Tests sind als T/C (%) angegeben, berechnet durch Division der durchschnittlichen Überlebenstage jeder Testgruppe (T) durch die der Kontrollgruppe (C).
- Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 3 Testverbindung Dosis (mg/kg) Lebensverlängernde Wirkung (T/C %)
- Zur weiteren Veranschaulichung von erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden die folgenden Beispiele und Bezugsbeispiele angegeben.
- 300 ml eines Zuchtmediums (pH = 7.2 vor Sterilisation), das 5 g/l Bacto Tripton (Produkt von Difco), 5 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Fleischextrakt, 10 g/1 lösliche Stärke, 10 g/l Glucose und 5 g/l Calciumcarbonat in einem 2 l Erlenmeyerkolben enthielt, wurden mit Streptomyces sp. S-464 beimpft und bei 30 ºC unter Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute während 48 Stunden kultiviert.
- Das so erhaltene Kulturmedium wurde dann in in 100 l eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung in einen 100 l-Kulturreaktor in einem Verhältnis von 10 Volumenprozent überführt und bei 28 ºC unter Belüftung mit 15 l/Minute und Rühren bei 200 upm kultiviert.
- Zusammensetzung des Fermentationsmediums: 5 % lösliche Stärke, 3 % KNO&sub3;, 0.5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0.5 g/l MgSO&sub4;.7H&sub2;O und 5 g/l Calciumcarbonat (der pH-Wert des obigen Mediums wurde vor der Sterilisation mit NaOH auf 7.0 eingestellt).
- Die Kultivierung wurde dann 67 Stunden lang fortgesetzt, während der pH-Wert des Mediums mit 4 N H&sub2;SO&sub4; bei 7 gehalten wurde. Dann wurden die Zellen und der Niederschlag aus dem Kulturmedium durch Filtration entfernt und so 100 l eines Filtrates erhalten. Das Filtrat wurde aufkonzentriert, mit Wasser verdünnt und dann über eine mit Polystyrol-Absorbens Diaion HP20 (10 l) beschickte Säule hindurchgeführt, um die aktiven Substanzen zu adsorbieren.
- Nach Elution von Verunreinigungen mit deionisiertem Wasser und 50 % Methanol wurde UCT4-B mit 60 % Methanol eluiert und dann Terpentecin mit 80 % Methanol.
- Die UCT4-B enthaltende 60 % Methanolfraktion wurde aufkonzentriert und auf pH = 4 eingestellt. Dann wurde die Wirksubstanz mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde aufkonzentriert und durch eine mit Silikagel (Lichroprepsi 60, Produkt von Merck Inc.) beschickte Säule hindurchgeführt, um die Wirksubstanz zu adsorbieren. Danach wurde die adsorbierte Substanz mit Chloroform, Chloroform/Methanol (100:1, Volumen) und Chloroform/Methanol (50:1, Volumen) unter einem erhöhten Druck von ca. 10 kg/cm² eluiert. Die erhaltene Fraktion wurde einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH20 unterworfen und mit Methanol eluiert, und ergab eine Wirkstoff-Fraktion. Diese Fraktion wurde dann durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [Säule: YMC-Pack (YMC Ltd.), ODS SH363-5; Entwickler: CH&sub3;OH 0.7 l + H&sub2;O 0.03 l; Durchflußgeschwindigkeit: 20 ml/min; Nachweis: UV- Adsorption bei 230 nm] gereinigt. Die so erhaltene Wirkstoff- Fraktion wurde zur Trockene eingedampft und ergab 100 mg UCT4- B als weißes Pulver.
- Das erhaltene UCT4-B besaß die nach folgenden physikalischchemischen Eigenschaften.
- Wie vorstehend beschrieben, wird angenommen, daß UCT4-B, ähnlich wie Terpentecin und Clerocidin, in Form einer Gleichgewichtsmischung von Tautomeren vorliegt. Deshalb könnten seine physikalisch-chemischen Eigenschaften abhängig von den Bedingungen der Bestimmung und dem Verfahren zur Herstellung der Probe variieren. Nachfolgend sind deshalb die physikalisch-chemischen Eigenschaften der nach der im vorstehenden Beispiel beschriebenen Methode hergestellten Probe angegeben. Zur Bestimmung wurden die folgenden Instrumenten verwendet.
- Schmelzpunkt: Micro Melting Point Meter, hergestellt von Yanagimoto Seisakusho, K.K.
- Optische Drehung: Polarimeter DIP-370, hergestellt von Nippon Bunko Kogyo K.K.
- Massenspektrum: M-80B, hergestellt von Hitachi, Ltd. UV-Absorptionsspektrum: Spektrophotometer 200-20, hergestellt von Hitachi, Ltd.
- IR-Absorptionsspektrum: JIR-RFX 3001, hergestellt von JEOL Ltd., oder IR-810, hergestellt von Nippon Bunko Kogyo K.K. ¹H und ¹³C-NMR-Spektren: AM500 oder AM400, hergestellt von Bruker Co.
- (A) Form: farbloses Pulver
- (B) Schmelzpunkt: innerhalb eines Bereichs von 160 bis 172 ºC
- (C) Optische Drehung:
- In einer Chloroformlösung ist, [α]27D = 27.8º (c = 0.53). In einer 50 %-igen wässerigen Acetonitrillösung beträgt sofort nach der Auflösung [α]27D = + 23.2 º (c = 0.53), und 195 Minuten nach der Auflösung [α]27D = + 1.21 º (c = 0.53), und dieser Wert wurde beibehalten.
- (D) EI-Massenspektrum: m/z 380, 365, 249, 219, 203, 165, 135, 125, 109, 107 und 105.
- (E) Sekundärionenmassenspektrum (Methanollösung, Matrix: Glycerin) m/z 743, 725, 491, 473, 455, 437, 381, 363, 345, 317, 259, 237, 225, 215 und 201.
- (F) UV-Absorptionsspektrum (Acetonitrillösung): außer einer terminalen Absorption wurde nichts beobachtet.
- (G) IR-Absorptionsspektrum (KBr-Methode): 3431, 2966, 1707, 1385, 1016 und 999 cm&supmin;¹.
- (H) Löslichkeit: sehr gut löslich in Methanol, Chloroform und Ethylacetat, löslich in Wasser und Acetonitril, unlöslich in Hexan.
- (I) ¹M-NMR-Spektrum: (500 MHz, CD&sub3;OD-Lösung): dargestellt in Fig. 1.
- (J) ¹³C-NMR-Spektrum: (125 MHz, CD&sub3;OD-Lösung): dargestellt in Fig. 2.
- (K) Farbreaktion: in den Farbreaktionen mit Anisaldehyd, Schwefelsäure, Iod und Phosphomolybdänsäure positiv, und bei der Dragendorff's-Reaktion negativ.
- Die Terpentecin enthaltende 80 % Methanolfraktion wurde ebenfalls aufkonzentriert und in der gleichen Weise, wie sie zur Reinigung von UCT4-B verwendet wurde, gereinigt. Auf diese Weise wurden 90 mg Terpentecin erhalten.
- Das ¹H-NMR-Spektrum und das IR-Spektrum des so erhaltenen Terpentecins stimmte mit den beschriebenen Spektren überein [vgl. The Journal of Antibiotics 38 (1985) 1819].
- Herstellung von o-Phenylendiamin-Addukten von UCT4-B (Verbindungen 2 und 3):
- 13.4 mg UCT4-B wurden in 1 ml 50 %-igem wässerigem Acetonitril gelöst und dazu 8.3 mg o-Phenylendiamin zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt. Das so erhaltene Rohprodukt wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie [Produkt von Merck Inc., Kieselguhr 60F&sub2;&sub5;&sub4; Art 5744; Entwickler: Chloroform/Methanol (9:1, Volumen)] gereinigt. Auf diese Weise wurden 5.2 mg eine Gleichgewichtsmischung der Verbindungen 2 und 3 (1:1) erhalten, die durch TLC oder HPLC nicht aufgetrennt werden konnte.
- Physikalisch-chemische Daten der Gleichgewichtsmischung der Verbindungen 2 und 3:
- Rf: 0.70 [Produkt von Merck Inc., Kieselguhr 60F&sub2;&sub5;&sub4; Art 5719; Entwickler: Chloroform/Methanol (9:1, Volumen)].
- 0.44 [Produkt von Merck Inc., HPTLC CNF&sub2;&sub5;&sub4;S Art 16464; Entwickler: Acetonitril/Wasser (1:1, Volumen)].
- Hochauflösendes EI-Massenspektrum: m/z als C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub2;O&sub5;N&sub2;: gefunden: 452.2298 (M+)
- berechnet: 452.2308
- EI-Massenspektrum: m/z 452 (M+), 434, 201, 185, 173, 157, 144, 129 und 102.
- IR-Absorptionsspektrum: (KBr-Methode) 3425, 2960, 2924, 1385, 1049, 1014 und 763 cm&supmin;¹.
- ¹H-NMR-Spektrum: (500 MHz, CDCl&sub3;-Lösung) δppm
- 8.81 (1H, s), 8.15 (1H, m), 8.01 (1H, in), 7.81 (2H,m), 5.73 (1H, m), 4.48 (1H, in), 4.30 (1H, d, J = 7.5 Hz), 4.29 - 4.20 (2H, m), 3.59 (1H, br. s, verschwand bei Zugabe von D&sub2;O), 3.42 (1H, d, J = 4.6 Hz), 3.13 (1H, d, J = 4.6 Hz), 2.98 (1H, br. d, J = 11.1 Hz), 2.35 - 2.20 (2H, m), 1.96 (1H, d, J = 15.3 Hz), 1.92 (2H, m), 1.76 (1H, m), 1.70 (1H, m), 1.48 (3H, s), 1.09 (3H, d, J = 7.1 Hz) und 1.03 (3H, s).
- 8.79 (1H, s), 8.12 (1H, m), 8.06 (1H, m), 7.80 (2H, m), 5.33 (1H, m), 4.46 (1H, m), 4.13 (1H, m), 4.08 (1H, d, J = 11.0 Hz), 3.89 (1H, d, J = 4.8 Hz), 2.88 (1H, br. s, verschwand bei Zugabe von D&sub2;O), 2.35 - 2.20 (2H, m), 2.15 (1H, dd, J = 9.1, 7.4 Hz), 1.85 (1H, m), 1.84 (2H, m) 1.77 (1H, dg, J = 12.1, 7.3 Hz), 1.58 (1H, dd, J = 15.0, 9.4 Hz), 1.17 (3H, s), 0.99 (3H, s) und 0.88 (3H, d, J = 7.3 Hz).
- Herstellung von acetyliertem o-Phenylendiamin-Addukt von UCT4- B (Verbindung 4):
- 0.5 ml Pyridin und 0.5 ml Essigsäureanhydrid wurden zu 2.4 mg einer Gleichgewichtsmischung (1:1) der Verbindungen 2 und 3 zugegeben und bei Raumtemperatur 15 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde eingeengt und das so erhaltene Rohprodukt wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie [Produkt von Merck Inc., Kieselguhr 60F&sub2;&sub5;&sub4; Art 5729; Entwickler: Hexan/Ethylacetat (1:1, Volumen)] gereinigt. Auf diese Weise wurden 1.9 mg eines einzigen acetylierten Produkts (Verbindung 4) erhalten.
- Physikalisch-chemische Daten der Verbindung 4:
- Rf: 0.41 [Produkt von Merck Inc., Kieselguhr 60F&sub2;&sub5;&sub4; Art 5719; Entwickler: Hexan/Ethylacetat (1:1, Volumen)]
- 0.60 [Produkt von Merck Inc., Entwickler: Chloroform:Methanol (98:2, Volumen)].
- Hochauflösendes EI-Massenspektrum: m/z als C&sub3;&sub2;H&sub3;&sub8;O&sub8;N&sub2;: gefunden: 578.2614 (M+)
- berechnet: 578.2625.
- EI-Massenspektrum: m/z 578 (M+), 536, 518, 494, 476, 460, 260, 235 und 207.
- IR-Absorptionsspektrum: (KBr-Methode) 2925, 1747, 1373, 1232, 1053, 1026 und 768 cm&supmin;¹.
- ¹H-NMR Spektrum: (500 MHz, CDCl&sub3;-Lösung) δppm.
- 8.76 (1H, m), 8.09 (1H, m), 8.02 (1H, m), 7.77 (2H, m), 5.88 (1H, d, J= 10.2 Hz), 5.75 (1H, m), 5.51 (1H, m), 4.87 (1H, dd, J = 12.7, 1.0 Hz), 4.66 (1H, dd, J = 12.7, 0.7 Hz), 3.30 (1H, d, J = 5.0 Hz), 3.10 (1H, d, J = 5.0 Hz), 2.91 (1H, dd, J = 10.5, 3.6 Hz), 2.58 (1H, d, J = 15.1 Hz), 2.19 (2H, m), 2.15 (1H, dq, J = 13.8, 6.9 Hz), 2.13 (3H, s), 2.12 (3H, s), 2.06 (3H, s), 1.79 (1H, dd, J = 15.1, 10.2 Hz), 1.49 (3H, s), 1.16 (3H, s) und 1.01 (3H, d, J = 6.9 Hz).
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung eines Diterpen-Derivates vom
Clerodan-Typ der folgenden Formel (I):
worin R für eine -CH&sub3;- oder -CH&sub2;OH-Gruppe steht; wobei man
den Mikroorganismus Streptomyces sp. S-464, der alle
Merkmale des Mikroorganismus mit der
FRI-Hinterlegungsnummer FERM BP-3036 aufweist, und in der Lage ist, das
Diterpen-Derivat vom Clerodan-Typ herzustellen, in einem
Medium kultiviert, um das Diterpen-Derivat vom Clerodan-
Typ in der Kultur anzureichern, und das Diterpen-Derivat
vom Clerodan-Typ aus der Kultur gewinnt.
2. Verbindung der Formel (II):
erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 1, und
chemisch äquivalente, tautomere und dimere Formen davon.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung
gemäß Anspruch 2, gegebenenfalls zusammen mit einem
pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Adjuvans.
4. Streptomyces sp. S-464 mit den Merkmalen des
Mikroorganismus mit der FRI-Hinterlegungs-Nr. FERM BP-3036.
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