DE69104012T2

DE69104012T2 - Rekombiniebares Hepatitis-Delta-Antigen, Verfahren zu seiner Reinigung und Verwendung.

Info

Publication number: DE69104012T2
Application number: DE69104012T
Authority: DE
Inventors: Fabrizio Bonelli; Antonio Boniolo; Raffaele Calogero
Original assignee: Sorin Biomedica SpA
Current assignee: Diasorin SpA
Priority date: 1990-11-05
Filing date: 1991-11-04
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2011-11-05
Also published as: IT9067865A0; DE69104012D1; ATE111488T1; EP0485347A3; ES2064071T3; HK1004267A1; IT9067865A1; IT1241003B; EP0485347B1; EP0485347A2

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft virales Hepatitis Delta Antigen (HDAg), das von Wirtszellen exprimiert wird, die mit Vektoren, die HDAg kodierende Sequenzen umfassen, transformiert sind, ein Verfahren zu ihrer Reinigung in eine antigene Form und ihre Verwendung auf dem Gebiet der Diagnostik. Im besonderen betrifft die Erfindung HDAg- artige Polypeptide, die von rekombinanten Vektoren exprimiert werden, wobei das exprimierte Polypeptid in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen in einer Weise wirkt, die für das in Leberzellen, die mit dem Hepatitis Delta-Virus (HDV) infiziert sind, gefundene HDAg-Polypeptid charakteristisch sind.

Hintergrund der Erfindung

HDV ist ein bedeutendes Humanpathogen, das von Rizzetto und Mitarbeitern in mit dem Hepatitis B-Virus (HBV) infizierten Patienten, die unter einer schweren Lebererkrankung litten, gefunden wurde (Rizzetto et al., Gut, 18: 997 - 1003, 1977). HDV ist von HBV abhängig, um sich mit einer Hülle zu versehen, und ist demgemäß lediglich in Patienten gefunden worden, die auch mit HBV infiziert waren. Das HDV-Genom besteht aus einer kreisförmigen, einzelsträngigen RNA mit einer Länge von etwa 1,7 kb, die in der Lage ist, durch intramolekulare Basenpaarbildung sich auf sich selbst zu wickeln bzw. zu falten, wobei eine doppelsträngige stäbchenartige Struktur gebildet wird (Kos et al., Nature 323: 558, 1986). Jüngere Untersuchungen haben gezeigt, daß die HDV-Replikation von der Gegenwart von HBV unabhängig ist (Taylor et al., J. Virol. 61: 2891, 1987).
Es ist auch gezeigt worden, daß ein antigenes Protein, das als HDAg bezeichnet, wird durch eines der offenen HDV- Leseraster (ORF5) codiert wird und dazu führt, daß es für die Replikation des HDV-Genoms unerläßlich ist. Die Identifizierung und teilweise Charakterisierung von ORF5 ist in den EP-Anmeldungen Nr. 0234050 und Nr. 0251575 beschrieben. Die Aktivität von ORF5 kann durch das diffusionsfähige HDAg in trans bereitgestellt werden und macht nicht notwendigerweise die physikalische Nähe von ORF5 zu den Replikationskontrollregionen des Virus erforderlich. Die Rolle von HDAg hinsichtlich seiner Rolle in der Virenreplikation ist ausführlich untersucht worden (Luo et al., J. Virol. 64: 1021, 1990; Hsieh et al., J. Virol. 64: 3192, 1990; Chao et al., J. Virol. 64: 5066, 1990). Es wurde gefunden, daß HDAg in einer 24-kd-Form und in einer 27-kd-Form vorliegt (Bergmann et al., J. Infect. Dis. 154: 702, 1986), wobei die größere Form (214 Aminosäuren) eine Verlängerung des carboxylterminalen Endes der kleineren (195 Aminosäuren) Form um 19 Aminosäuren darstellt (Taylor, Cell 61: 371, 1990). Die größere Form, die tatsächlich die Virenreplikation inhibieren kann (Taylor, supra), kann durch Konversion eines UAG-Endcodons für das kleinere HDAg zu UGG hervorgehen, was die Synthese der größeren Polypeptidvariante erlaubt (Luo et al., supra; Taylor, supra).
Die Diagnose einer HDV-Infektion wird üblicherweise durch Nachweis der korrespondierenden gesamten und/oder M (IgM)-Immunglobuline festgestellt, die gegen HDAg gerichtet sind. Um die anti-HDAg-Immunoglobulinaktivität nachzuweisen, sind verschiedene blockierende und kompetitive Enzyminhibierungs-Immunoassays entwickelt worden (Crivelli et al., J. Clin: Microbiol. 14: 173, 1981; Purcell und Gerin, Virology, 2. Ausg., Fields et al. Hrsg., 2275 - 2283, 1990; Farci et al., J. Am. Med. Assoc. 255: 1443,1986). Alle diese Immunoassays machen sich das natürliche Antigen zunutze, das aus der Leber infizierter Menschen oder Schimpansen extrahiert werden kann.
Leider liegt das natürliche Antigen in den Hepatozyten nur in sehr niedriger Konzentration vor und ist unter den relativ scharfen Bedingungen, die bei der Isolierung und Reinigung des Antigens auftreten können (z. B. 6M Guanidin HCl, 8M Harnstoff), äußerst unstabil. Diese Instabilität kann zur Bildung von Peptiden mit relativ niedrigem Molekulargewicht führen, die im Vergleich zu HDAg mit voller Kettenlänge oder nahezu voller Kettenlänge eine verminderte immundiagnostische und immuntherapeutische Verwendbarkeit aufweisen.
Kuo M.Y.P. et al., J. Virol. 1988, S. 1855 - 1861, beschreiben ein Protein, das durch ein β-Galactosidase- HDAg-Gen kodiert ist, das, wenn es in E. Coli exprimiert wird, aus Zellen in einem einzigen Schritt durch Immun- Affinitätschromatographie wiedergewonnen werden kann. Wie aus der folgenden Beschreibung ersichtlich ist, betrifft die vorliegende Erfindung ein Fusionsgen mit einem viel kürzeren β-gal-Bereich, einer längeren HDAg-Sequenz und einer tet-Sequenz am C-Terminus.
Ein hoher Expressionsgrad von rekombinanten Polypeptiden in E. coli führt oftmals zur Bildung von Cytoplasmakörnchen, die mit einem Phasenkontrastmikroskop beobachtbar sind. Solche unlöslichen Körnchen sind als "Einschlußkörper" bezeichnet worden, und es wird angenommen, daß sie makromolekulare Komplexe der heterologen Polypeptide und der bakteriellen äußeren Membran darstellen (Frankel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1192, 1991). Die Einschlußkörper werden häufig als eine Quelle exprimierter Polypeptide verwendet, da die Einschlußkörper durch Zentrifugieren ohne weiteres pelletiert werden können und eine bequeme Polypeptidquelle darstellen. Um jedoch lösliches Protein zu erhalten, müssen die Einschlußkörper unter relativ scharfen Bedingungen, wie 5 - 7 M Guanidin HCl, 6 - 8 M Harnstoff, Natriumdodecylsulfat (SDS), alkalischem pH und/oder Acetonitril/Propanol, löslich gemacht werden. Auf diese Weise ergibt die Isolierung von rekombinantem HDAg oder HDAg-artigen Polypeptiden aus Einschlußkörpern Peptide, die im Vergleich zu nativem HDAg oder zu exprimiertem HDAg eine verminderte immundiagnostische und immuntherapeutische Verwendbarkeit aufweisen.

Beschreibung der Erfindung

Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte von pSORF5.
Figur 2 zeigt eine Restriktionskarte von pHBc27.
Figur 3 zeigt eine Restriktionskarte von pSORINδ.
Bei der Vektorkonstruktion werden allgemein Techniken angewendet, die dem Fachmann bekannt sind. Eine sequenzspezifische DNA-Spaltung wird mittels geeigneter Restriktionsenzyme unter Bedingungen durchgeführt, die im allgemeinen vom Hersteller von im Handel erhältlichen Restriktionsenzymen (siehe z. B. den New England Biolabs Product Catalogue) angegeben werden. Spaltungsfragmente mit klebrigen Enden können unter Verwendung von E. coli DNA- Polymerase 1 (Klenow-Fragment) im Gegenwart von geeigneten Desoxynucleotidtriphosphaten (dTNPs) bei Anwendung von Inkubationsbedingungen, die für die Polymerase geeignet sind, in glatte Enden überführt werden. Die Polymerase füllt überhängende 5'-Enden auf. Alternativ kann eine Behandlung mit S1-Nuklease angewendet werden, wobei jeder einzelsträngige DNA-Teil hydrolysiert wird. Ligationen, mit klebrigen Enden oder mit glatten Enden, werden unter Verwendung unter Standardbedingungen bezüglich Puffer und Temperatur mit T4-DNA-Ligase durchgeführt. Vektorfragmente werden häufig mit bakterieller alkalischer Phosphatase versetzt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und so eine Religation des Vektors zu verhindern. Ligationsgemische können in geeignete Wirte, wie E. coli, transfektiert werden und erfolgreiche Transformanden durch Antibiotikumresistenz oder andere geeignete Mittel ausgewählt und dann für die korrekte Orientierung des Inserts gescreent werden.
Der Ausdruck "Transformation" umfaßt ohne Einschränkung bekannte Verfahren zur Transformation von Wirtszellen durch die Aufnahme von Nukleinsäure, Mikroinjektion, Elektrotransformation, Elektroporation, Pelletbombardement oder jedes andere zum Transfer von exogener Nukleinsäure in Wirtszellen geeignete Verfahren (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning A. Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Im Gegensatz zur Isolierung von exprimierten Polypeptiden aus den allgemein verwendeten Einschlußkörpern haben die Anmelder insbesondere gefunden, daß undenaturiertes HDAg-artiges Polypeptid in multimerer Form aus der Cytosolfraktion von Bakterienzellen unter Verwendung eines einfachen einstufigen Ultrazentrifugierungsverfahrens isoliert werden kann. Diese spezielle Erkenntnis kann wie folgt verallgemeinert werden. Die hier verwendeten Bezeichnungen "Cytosol" oder "Cytosolfraktion" beziehen sich auf prokaryontisches oder eukaryontisches Zellcytoplasma mit Ausnahme von Membranen und membrangebundenen Organellen. Das heißt, das Cytosol oder die Cytosolfraktionen sind durch die intrazellulären Bereiche zwischen membrangebundenen Organellen definiert. Polypeptide im Cytosol bilden im allgemeinen "lösliche" Polypeptide, obwohl solche Polypeptide in monomeren oder multimeren Formen vorliegen können und in der Lage sein können, sich als Aggregate oder Partikel zu organisieren, wenn sie in Multimer-Form vorliegen. Zur Reinigung solcher Cytosolaggregate ist jedoch eine Zentrifugation mit relativ hoher Geschwindigkeit erforderlich, und sie lassen sich im allgemeinen nicht zusammen mit membrangebundenen Organellen oder anderen zellulären Strukturen, wie Einschlußkörpern, die sich ohne weiteres durch Zentrifugieren bei niederer Geschwindigkeit pelletieren lassen, reinigen.
Die Erfindung umfaßt auch die Erkenntnis, daß Multimer-Aggregate von rekombinatem HDAg-Polypeptid eine Antigenizität aufweisen, die im wesentlichen mit der Antigenizität von HDAg-Antigen von mit HDV infizierten menschlichen Leberzellen vergleichbar ist. Das Aggregat wird auf Wirtszellen gewonnen, die mit einem rekombinanten Vektor transformiert worden sind, der in der Lage ist, HDAg-Polypeptid zu exprimieren. Das Aggregat kann darüber hinaus HDV-RNA enthalten, die an das Polypeptid gebunden ist. In dem Fall, daß die Wirtszellen Bakterienzellen sind, können die Aggregate durch Separieren solcher Aggregate von Zellmembranmaterial und Zelleinschlußkörpern gewonnen werden, die aus Schallbehandlung oder anderen Verfahren, Bakterien aufzubrechen, erhalten werden. Diese Abtrennung von Aggregat aus Zellmembranmaterial und Zelleinschlußkörpern kann durch Zentrifugieren erreicht werden. Nach dem Abtrennen durch Zentrifugieren können die Aggregate durch Ultrazentrifugieren, wie Sucrosegradientenfraktionierung, im wesentlichen von Cytosolmaterial getrennt werden.
Die vorliegende Erfindung löst die angesprochenen Probleme durch das Bereitstellen von rekombinanten DNA- Molekülen, die in der Lage sind, nach Transformation in einen geeigneten Wirt rekombinantes HDAg mit einer Antigenizität zu exprimieren, die im wesentlichen mit der Antigenizität von HDAg von HDV aus infizierten menschlichen Leberzellen vergleichbar ist, die nämlich in der Lage sind, Antikörper gegen HDAg zu bilden. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Reinigung des HDAg mit einer Antigenizität bereit, die im wesentlichen mit der Antigenizität von HDAg von HDV infizierter menschlicher Leberzellen und seine Verwendung auf dem Gebiet der Diagnostik vergleichbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Wirtzellen mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformiert werden, der die Kodierungsinformation für HDAg-artige rekombinante Polypeptide trägt, der eine erste Region enthält, die im wesentlichen homolog zu im wesentlichen intaktem HDV-Antigen ist, und der eine aminoterminale zweite Region enthält, die zu der ersten Region benachbart ist, und der eine carboxylterminale dritte Region enthält, die zu der ersten Region benachbart ist, wobei die erste Region HDAg-antigen und die zweite Region und die dritte Region jeweils im wesentlichen heterolog zu HDV-Antigen ist. Die zweite Region und die dritte Region können jeweils durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die im wesentlichen heterolog zu verwandter HDV-RNA sind. Wenn die Wirtszellen Bakterienzellen, vorzugsweise E. coli, sind, können die Aggregate dadurch gewonnen werden, daß man die Aggregate von Zellmembranmaterial und Zelleinschlußkörpern abtrennt und nachfolgend die Aggregate von dem Cytosol aufgebrochener Wirtszellen abtrennt, und zwar entweder durch Ultrazentrifugieren auf Sucrosegradienten oder sequenzielle Immun-Affinitätschromatographie, die spezifisch für die zweite Region und die dritte Region ist. Vorzugsweise umfaßt die zweite Region eine Region von der E. coli-β-Galactosidase kodierenden Region, und die dritte Region umfaßt eine kodierende Region des pBR322-Plasmids. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das HDAg-artige rekombinante Polypeptid B-HDAg-T oder ist im wesentlichen zu diesem homolog, dessen Aminosäuresequenz in Tabelle 1 angegeben ist. TABELLE 1 Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von B- HDAg-T (-): β-Galactosidase; (_): Linker; (> ): HDAg; (*): pBR322 tet-Gen
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt, das die Expression eines HDAg mit nahezu voller Länge und die Wiedergewinnung des exprimierten Polypeptids unter Bedingungen erlaubt, die im wesentlichen die Konformationsepitope des Antigens erhalten, und zwar vorzugsweise ohne Verwendung von Denaturierungsmitteln, wobei das HDAg eine Antigenizität aufweist, die mit dem intakten natürlichen Antigen vergleichbar ist, das in infizierten Leberzellen von Menschen oder Schimpansen vorliegt, und zwar in dem Sinn, daß das rekombinante HDAg-artige Polypeptid mit dem natürlich verkommenden HDAg kreuzreaktiv ist und einen ähnlichen Affinitätsindex wie dieses aufweist. Das erfindungsgemäße rekombinante HDAg-artige Polypeptid ist daher insbesondere im Immunoassay von HDAg in Körpergewebe und -flüssigkeiten oder Antikörpern in Serum, die für solches HDAg spezifische sind, brauchbar. Die rekombinanten HDAg-artigen Polypeptide sind als ein Standard für derartige Assays sowie andere Reagenzien verwendbar, wie im folgenden ausführlicher erläutert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das HDAg-artige Polypeptid durch einen Expressionsvektor kodiert, der eine geeignete Expression und andere Kontrollelemente enthält sowie eine Sequenz, die alles außer den carboxylterminalen sechs Aminosäuren der großen Form von HDAg kodiert. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist der Expressionsvektor das Plasmid pSORINδ, das beider DSM hinterlegt ist, N. 6774.
Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung werden E. coli-Zellen, die HDAg-artiges Polypeptid von pSORINδ exprimieren, zentrifugiert, wobei eine Zellpaste gebildet, in Lysepuffer resuspendiert und unter Bedingungen schallbehandelt wird, bei denen im allgemeinen die äußere Bakterienmembran aufbricht, während im allgemeinen die Einschlußkörper intakt bleiben. Es kann auch jedes andere bekannte Verfahren zum Aufbrechen von Zellen verwendet werden, wenn dabei die Einschlußkörper intakt bleiben, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Im Anschluß an das Aufbrechen der Zellen wurden die Zellmembranen, die Einschlußkörper und andere Zellbruchstücke mittels Zentrifugieren bei niederer Geschwindigkeit (z. B. 30 Min. lang bei 4 C bei 10 000 UpM in einem JA17 Beckman-Rotor) pelletiert. Der Überstand, der die Cytosolfraktion mit löslichen Polypeptiden enthält, wird oben auf einen 10 - 50 %-igen Sucrosegradienten aufgebracht und 16 Stunden lang ultrazentrifugiert. Danach wird das exprimierte HDAg-artige Polypeptid vom Boden des Gradienten in Form von Multimer-Aggregaten isoliert. Obwohl das von Sucrosegradienten isolierte HDAg-artige Polypeptid hervorragend für immundiagnostische und andere Anwendungen geeignet ist, ist es offensichlich, daß andere dem Fachmann bekannte Zentrifugationsmedien, wie Cäsiumsulfat und Cäsiumchlorid, zur Ultrazentrifugierung von HDAg-artigen Polypeptid-Multimeren verwendet werden können.
Als Alternative zur Isolierung von HDAg-artigem Polypeptid durch Ultrazentrifugieren kann das HDAg-artige Polypeptid durch Immun-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Die Anmelder haben ein Doppelsäulenverfahren entwickelt, das sich eine zu ORF5 heterologe Polypeptidsequenz zunutze macht, die der ORF5-Aminosequenz an den aminoterminalen und carboxylterminalen Bereichen des exprimierten Polypeptids benachbart ist. Das heißt, es wurde ein monoklonaler Antikörper (MAB-B) gegen den aminoterminalen Non-ORF5-Bereich des exprimierten Polypeptids gebildet. Auf gleiche Weise wurde ein monoklonaler Antikörper (MAB-T) gegen den carboxylterminalen non- ORF5-Bereich des exprimierten Polypeptids gebildet. MAB-B wurde auf einer ersten Immunaffinitätssäule verwendet, und MAB-T wurde auf einer zweiten Immunaffinitätssäule verwendet.
Das selbe Zell-Lysatmaterial, das oben auf die Sucrosegradienten aufgebracht wurde, wurde auf die erste Immunaffinitätsäule aufgetragen. Das MAB-B-gebundene Material wurde eluiert und auf die zweite Säule aufgetragen. Lediglich exprimierte Polypeptide, die sowohl aminoterminale als auch carboxylterminale Teile aufweisen, die von MAB-B bzw. MAB-T erkannt werden, werden durch die zweite Säule zurückbehalten. Ein derartiges Polypeptidmaterial umfaßt das gesamte durch pSORINδ kodierte ORF5, da sich die ORF5-Aminosäuresequenz zwischen den heterologen Aminosäuresequenzen befindet, die von MAB-B und MAB-T erkannt werden. Auf die Elution von der zweiten Säule folgend kann das exprimierte Polypeptid in einem breiten Spektrum immundiagnostischer und immuntherapeutischer Anwendungen verwendet werden.
Das gereinigte exprimierte HDAg-artige Polypeptid ist in vielfältigen Immunoassayformen verwendbar, die in der Technik bekannt sind. Die Erfindung schließt die Verwendung der zuvor beschrieben gereinigten Multimer-Aggregate zum Nachweis von Analytantikörpern oder Analytantigenen in Proben von Patienten mit ein. Als ein Beispiel können Analytantikörper wie Gesamtimmunglobulin (Ig) oder Immunglobulin M (IgM) nachgewiesen werden.
Als ein Beispiel für einen Immunoassay für anti- HDAg-Ig können Mikrotiterplatten unter Verwendung von Standardverfahren mit MAB-T beschichtet werden. Das exprimierte Polypeptid kann dann zu den Platten unter Bedingungen zugegeben werden, die das Binden das Polypeptids an MAB-T fördern. Ist das exprimierte HDAg-artige Polypeptid an der festen Phase befestigt, kann ein patientenserum- und enzymmarkierter polyklonaler anti- HDAg-Antikörper zu den Platten in einer kompetitiven Immunoassayform, die dem Fachmann allgemein bekannt ist, zugegeben werden. Die Menge von an die Platte gebundenem enzymmarkierten polyklonalen anti-HDAg-Antikörper ist ein Maß für die Menge von anti-HDAg-Ig in der Serumprobe. In einer alternativen Ausführungsform kann biotiniliertes HDAg an die feste Phase via Streptavidin gebunden sein.
Als ein Beispiel für einen Immunoassay für anti-HDAg- IgM können Mikrotiterplatten gemäß Standardverfahren mit monoklonalem anti-Human-IgM-Antikörper beschichtet werden. Dann wird Patientenserum zu der Platte zugegeben, um Patienten-IgM an die feste Phase zu binden. Diese Festphasen-IgM-Antikörper des Patienten werden dann gleichzeitig oder nacheinander mit HDAg-artigem Polypeptid und mit enzymmarkiertem polyklonalen anti-HDAg-Antikörper umgesetzt. Die Menge an Enzymmarker, die an die feste Phase gebunden wird, ist ein Maß für die Menge von anti-HDAg-IgM in der Patientenprobe. In einer alternativen Ausführungsform kann enzymmarkiertes MAB-T anstelle des enzymmarkierten polyklonalen anti-HDAg-Antikörpers verwendet wewrden.
Der Nachweis von Analyt-HDAg in einer Patientenprobe kann mit einer Mikrotiterplatte oder einer anderen festen Phase, an der ein anti-HDAg-Antikörper befestigt ist, erreicht werden. Die Probe des Patienten wird zur Reaktion zu der Platte zugegeben. Das an die Festphase gebundene HDAg aus der Patientenprobe wird dann mit einem markierten anti-HDAg-Antikörper umgesetzt.
Der Nachweis von Analyt-HDAg in der Probe eines Patienten kann auch durch beliebige der kompetitiven bindenden Immunoassayformen erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, wobei das gereinigte HDAg-Polypeptid wie zuvor beschreiben verwendet wird. In solchen Formen konkurriert das in der Patientenprobe vorliegende HDV- Antigen mit dem exprimierten HDAg-artigen Polypeptid um die Bindung an einen anti-HDAg-Antikörper.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, sie jedoch nicht einschränken.

BEISPIEL 1

Konstruktion des Plasmids pSORF5

Es wurde die gesamte RNA aus einer Biopsie einer HDV-infizierten menschlichen Leber wie beschrieben extrahiert (Chirgwin, Biochemistry 18: 5294, 1979). Eine 20-ug-Probe dieser RNA wurde in einer Northern-Blot-Form (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 5201, 1980) durch Hybridisieren der Oligonucleotidsonde M316 (3' CGA ACG GAC CAG ATG GAG GTA GAC TCC GGA CCT AGG AAG AG 3') analysiert (Daten nicht angegeben). 18 ug der gesamten RNA wurden als Matrize zur Synthese eines ersten cDNA-Stranges wie beschrieben (Sambrook et al., supra), verwendet, wobei als Starter das Oligonuclotid M314 (5' ATG AGC CGG TCC GAG TCG AGG AAG 3') verwendet wurde. Das cDNA-Reaktionsgemisch wurde in Experimenten zur PCR-Amplifikation (Kawasaki, In: Innis et al. Hrsg., PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications, Academic Press, S. 21 - 27) verwendet, wobei als Starter die Oligonucleotide M314 und M315 (5' TCA CTG GGG TCG ACA ACT CTG GGG AGA 3') verwendet wurden. Die PCR-Amplifikation wurde mit einem Protokoll von 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus einer Min. bei 95C, einer Min. bei 50C und drei Min 65C bestand. Die Amplifikationsreaktion erzeugte zwei Hauptbanden: eine von 300 bp und die andere von 640 bp (Daten nicht angegeben). Durch Southern-Blot-Analyse wurde gezeigt, daß nur die 640-bp-Bande mit dem Oligonucleotid M316 hybridisierte (Daten nicht angegeben).
Die 640-bp-Bande (200 ng) wurde im SmaI-geschnittenen pTZ18R (50 ng) (Pharmacia, Schweden) geklont, wobei über Nacht bei 15C mit 1 Weiss-Einheit von T4-Ligase (Promega, WI) in 20 ul 1xT4-Ligasepuffer (Promega, WI) ligiert wurde. Das Ligationsgemisch (10 ul) wurde zum Transformieren von Zellen des E. coli-Stamms JM109 verwendet; kompetente JM109-Zellen wurden wie bei Sambrook et al., supra, beschrieben hergestellt. Das rekombinante Plasmid wurde als pSORF5 bezeichnet (Figur 1). Der 640-bp-Insert wurde mit einer Taq-Polymerase-Sequenzierung sequenziert (Promega, WI).

BEISPIEL 2

Konstruktion des Expressionsplasmids pSORINδ

Das Expressionsplasmid pHBc27 (Figur 2) wurde dazu verwendet, um eine geeignete Transkription und andere Kontrollelemente zur Expression von HDAg bereitzustellen. Es ist auch jeder andere äquivalente Expressionsvektor geeignet. pHBc27, ein Derivat von pBR322, enthält eine Sequenz, die das Kernantigen (HBcAG) des Hepatitis B-Virus (HBV) kodiert und ist bei Stahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1601 (1982) beschrieben. Ein lac-Promotor, der die UV5-Mutation (lac UV5-Promotor), die ribosomale Bindungsstelle (RBS) von Beta-Galactosidase und eine Sequenz, die die ersten acht Aminosäuren von Beta-Galactosidase kodiert, trägt, befinden sich unmittelbar flußaufwärts von der EcoR1-Stelle in pHBc27. Die BamH1-Stelle in pHBc27 befindet sich innerhalb des Gens für Tetracyclinresistenz (tet), und zwar etwa 350 Basenpaare (bp) vom 3'-Ende des tet-Gens.
Das Plasmid HBc27 wurde mit EcoR1 und BamH1 geschnitten, und das große Fragment (pLac, etwa 4 500 bp), das die Transkription und andere Kontrollelemente enthält, wurde von dem Kurzen Fragment (1 011 bp), das die HBcAg-Sequenz enthält, gereinigt. Die EcoR1- und BamH1-Enden von pLac wurden mit dem Klenowfragment von E. coli-DNA-Polymerase nach Standardverfahren (Sambrook et al., v. supra) aufgefüllt (in glatte Enden überführt). pSORF5 stellte eine HDAg-Sequenz zur Expression von HDAg-artigem Polypeptid bereit. Ein BamH1/RsaI-Fragment von 627 bp, das alle außer den carboxylterminalen sechs Aminosäuren von ORF5 kodierte, wurde von pSORF5 enthalten und wie zuvor beschrieben mit glatten Enden versehen.
Das 627-bp-Fragment von pSORF5 wurde durch Ligation glatter Enden im pLac geklont (siehe Sambrook et al., supra), und die korrekte Orientierung des ORF5-Inserts hinsichtlich der Transkriptionskontrollelemente wurde durch Restriktionskartieren bestätigt. Das so erhaltene Plasmid, pSORIN (Fig. 3, Tabelle 2, hinterlegt bei DSM, Nr. 6774) wurde zum Transformieren von E. coli-Zellen des Stamms W3 110 verwendet, und Aliquote von 1,0 ml der Kulturen wurden in 15 % Glycerin bei -70C eingefroren. Der E. coli-Stamm W3 110 ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Nr. 27325 hinterlegt. TABELLE 2 Nukleinsäuresequenz von pSORIN Darstellung der Spaltstellen auf der Sequenz (+ LacUV5-Promotor) (* Bgalactosidase S&D) (- orf5-Gen + Trailersequenz)
Mit der gegebenen Struktur von pSORINδ besteht das erwartungsgemäß von pSORINδ zu exprimierende Polypeptid aus der in Tabelle 1 angegebenen Aminosäuresequenz, und zwar beginnend mit dem aminoterminalen Teil und weitergehend mit dem carboxylterminalen Teil des Polypeptids:
a) acht Aminosäuren stammen von Beta-Galactosidase, b) vier Aminosäuren stammen von der zur Konstruktion der jeweiligen Plasmide verwendeten Linkersequenz, c) 209 Aminosäuren stammen von ORF5 (HDAg) und d) 89 Aminosäuren stammen vom tet-Gen von pBR322. Die acht Aminosäuren, die von Beta-Galactosidase stammen, werden im folgenden als die "B"-Region des exprimierten Polypeptids bezeichnet. Die 89 Aminosäuren, die von dem tet-Gen stammen, und von denen erwartet wird, daß sie eine Sekundärstruktur aufweisen, die "turn"- und "extended"-Regionen umfaßt, wird im folgenden als die "T"- oder "Trailer"-Region bezeichnet. Das exprimierte Polypeptid in voller Länge umfaßt daher B-, HDAg- und T-Aminosäuren und wird im folgenden als das "B-HDAg-T"-Polypeptid bezeichnet und ist die bevorzugte Form von HDAg-artigem Polypeptid.

BEISPIEL 3

Wachstum von Zellen, die mit pSORINδ transformiert sind

Ein gefrorenes Aliquot von 1 ml eines Vorrats des E. coli-Stamms W3 110, der mit pSORIN transformiert ist, wurde aufgetaut und bei 37C 16 Stunden lang in Luria-Bertani- Nährlösung mit 50 ug/ml Ampicillin wachsen gelassen. Die Kultur, die über Nacht stehen gelassen worden war, wurde in einem Fermenter mit 14 Liter Arbeitsvolumen (Chemag, F23000) inokuliert und unter den folgenden konstanten Bedingungen wachsen gelassen:
a) Rührgeschwindigkeit: 400 UpM.
b) Luftstromgeschwindigkeit: 2 Liter/min.
c) Temperatur: 37C.
d) pO2: 60 %.
e) pH: 7,4.
Das Bakterienwachstum wurde bei 590 nm überwacht. Wenn die Kultur eine optische Dichte (OD) von 0,5 erreicht hatte, wurde zu der Kultur Isopropyl-B-D-Galactosid (IPTG) bei einer Endkonzentration von 1,0 mM zugegeben, um die Expression von B-HDAg-T unter der Kontrolle des lac UV5-Promotors zu induzieren. Danach wurde die Temperatur auf 30C herabgesetzt, und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 1300 UpM erhöht. Die Zellen wurden drei Stunden nach Induktion mit IPTG durch 10 Minuten langes Pelletieren bei 3000 x g bei 4C geerntet.

BEISPIEL 4

Reinigung des B-HDAg-T-Polypeptids durch Zentrifugieren mit einem Sucrose-Dichtegradienten

Pelletierte E. coli-Zellen wie die zuvor beschriebenen wurden in 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM FMSF und 100 mM NaCl resuspendiert, dann durch Schallbehandlung aufgebrochen (Braun Labsonic Model 1510 Sonicator; drei Stöße von 60 Sek., jeder bei 100W, auf Eis). Auf die Schallbehandlung folgend wurden 8,0 mg/ml Natriumdesoxycholat bei 4C unter Rühren zugegeben. Die Zellmembranen, Einschlußkörper und anderen Zelltrümmer wurden durch 30-minütiges Pelletieren bei 10 000 UpM in einem JA17 Beckman Rotor bei 4C entfernt. Der Überstand wurde auf einen 10 - 50 %-igen Sucrosegradienten aufgebracht, der mit 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, hergestellt war, und der Gradient wurde 16 Stunden lang bei 35 000 UpM in einem SW40 TI Beckman Rotor bei 4C zentrifugiert. Der Inhalt des Gradienten wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,8 ml/min wiedergewonnen und als 0,4-ml-Fraktionen gesammelt. Das B-HDAg-T-Polypeptid wurde auf dem Boden des Gradienten in Form von Multimer-Aggregaten gefunden. Die Reinheit des B-HDAg-T-Materials von dem Gradienten wird mittels Natriumdodecyclsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Färben von Polypeptidbanden mit den Farbstoff Coomassie Brilliant Blau mit 85 - 90 % bewertet. Mit anderen Worten, in den isolierten Fraktionen, die vom Boden des Gradienten entnommen wurden, liegt nicht mehr als 10 - 15 % non-B-HDAg-T-Polypeptid vor.
Eine Probe des B-HDAg-T-Polypeptid-Materials, das wie zuvor beschrieben aus Sucrosegradienten erhalten wurde, wurde mit Uranylacetat gefärbt und mit dem Elektronemikroskop untersucht. Die multimeren Formen von HDAg, die aus den Sucrosegradienten erhalten wurden, sind im allgemeinen größer als 10 Dalton. Die Multimer-Aggregate bestehen aus Nukleoproteinkomplexen von B-HDAg-T und RNA. Es ist bekannt, daß HDAg in der Lage ist, an RNA zu binden. Chang et al., J. Virol. 62:2403 (1988). Darüber hinaus haben die Anmelder festgestellt, daß die Sedimentation von HDAg- Partikeln (Aggregaten) nicht zu beobachten ist, wenn das E. coli-Lysat mit RNAase behandelt wird, bevor es auf den Sucrosegradienten aufgebracht wird (Daten nicht angegeben).

BEISPIEL 5

Reinigung von B-HDAg-T-Polypeptid durch Immunaffinitätschromatographie

Als eine Alternative zur Reinigung von B-HDAg-T durch Sucrosegradienten-Zentrifugation wurde ein Doppelsäulen- Immunaffinitätsverfahren entwickelt, das insbesondere die Selektion von B-HDAg-T-Polypeptid mit voller Länge erlaubt. Die erste Immunaffinitätssäule umfaßte Sepharose-CNBr (Pharmacia, Schweden), die mit einem monoklonalen Antikörper gekoppelt war, der mittels Standardtechniken gegen die ...-Galactosidase (B) Region von B-HDAg-T (MAB-B) gebildet wurde. Die Kopplung der Antikörper an das Sepharose-CNBr wurde gemäß den von Pharmacia empfohlenen Verfahren durchgeführt, und zwar mit einer Kopplungsausbeute von mehr als 95 %. Die zweite Immunaffinitätssäule umfaßte Sepharose- CNBr, das mit einem monoklonalen Antikörper gekoppelt war, der mittels Standardtechniken gegen die T-Region des B-HDAg-T-Polypeptids gebildet wurde (MAB-T). Insbesondere ist MAB-T für die Sequenz WRLYRRH, die in der T-Region von B-HDAg-T vorliegt, spezifisch.
Dasselbe Material, das oben auf die Sucrosegradienten aufgebracht wurde, d. h. das rohe schallbehandelte Lysat, das anschließend 10 Min. lang bei 4C und bei 10 000 UpM wie zuvor beschrieben zentrifugiert wurde, wurde auf die Immunaffinitätssäule aufgebracht, die MAB-B gekoppelt mit Sepharose-CNBr enthielt. MAB-B-gebundenes Material wurde mit einem Puffer mit hohem Salzgehalt eluiert, der 3,5 M MgCl&sub2;, 10 mM Phosphat, pH 7,2, umfaßte, eluiert, dann zweimal gegen 1 Liter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) dialysiert. Das eluierte Material wurde dann auf die zweite Immunaffinitätssäule, die MAB-T enthielt, aufgebracht und wiederum mit einem Puffer mit hohem Salzgehalt eluiert. Es wurde festgestellt, daß das Material, das anschließend an die zweite Immunaffinitätsreinigung eluiert wurde, B-HDAg-T mit voller Länge und einer Reinheit von 98 % war, was mittels SDS-PAGE und Färben mit Coomassie Blau bestimmt wurde.

BEISPIEL 6

Kompetitiver Immunoassay für das gesamte Immunglobulin (Ig) Anti-HDAg

Mikrotiterplatten wurden mit MAB-T (anti-WRLYRRH) beschichtet, wobei Standardverfahren verwendet wurden. Dann wurde HDAg in Form des exprimierten und über Sucrosegradienten gereinigten B-HDAg-T-Polypeptid wie zuvor beschrieben zu den Platten bei einer Konzentration von 0,2 ug/ml zugegeben. Die Platten, die mit B-HDAg-T beschichtet worden waren, wurden 18 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann mit BPS gewaschen. Nach dem Waschen waren die Platten zur Verwendung bei der Bestimmung des gesamten Ig-anti-HDV in Blutserum geeignet.
Jede Vertiefung der wie zuvor behandelten mikrotiterplattenerhielt 10 ul von zu analysierendem Serum. Unmittelbar im Anschlußl an die Zugabe von Testserum wurde zu jeder Vertiefung eine polyklonale anti-HDAg-Antikörper-Zubereitung, die mit Meerettischperoxidase (HRP) markiert war, zugegeben. Nach einer Inkubation von 3 Stunden bei 37C wurden die Reagenzien ausgewaschen und die Menge von an die Platte gebundenem polykonalem anti- HDV-Antikörper wurde durch Zugabe von H&sub2;O&sub2; und Tetramethylbenzidin festgestellt. Die colorimetrische Reaktion wurde mit 1,0 M Schwefelsäure gestoppt, und es wurde die Absorption bei 450 nm und 630 nm gemessen. In dieser kompetitiven Assayform ist die Menge von an die Mikrotiterplatte gebundenem polyklonalem anti-HDAg-Antikörper, gemessen durch die colorimetrische Reaktion mit HRP, zur Menge des anti-HDAg-Antikörpers in der Serumprobe umgekehrt proportional.

BEISPIEL 7

Immunassay zur Bestimmung von IgM-anti-HDV

Mikrotiterplatten wurden mit monoklonalem antihuman-IgM-Antikörper gemäß Standardverfahren beschichtet. Die zu testenden Seren (10 uml) wurden in die Plattenvertiefungen gegeben und 1 Stunde lang bei 37C inkubiert. Im Anschluß wurden polyklonaler anti-HDAg-Antikörper, der mit HRP markiert ist, und das exprimierte, mittels Sucrosegradient gereinigte B-HDAg-T-Polypeptid wie zuvor beschrieben zu den Platten zugegeben und 2 Stunden lang bei 37C inkubiert. Im Anschluß an diese Inkubation wurden die ungebundenen Reagenzien durch Waschen entfernt und die Quantität des an die Platten gebundenen HRP-markierten Antikörpers festgestellt, indem die zuvor beschriebene colorimetrische Reaktion durchgeführt wurde.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend ein Multimer-Aggregat, das in der Lage ist, Antikörper gegen Hepatitis D-Antigen (HDAg) zu bilden, wobei das Multimer-Aggregat rekombinante Polypeptide umfaßt, wobei die Polypeptide umfassen:

eine erste Aminosäuresequenz mit einer HDAg-Antigenizität;

eine zweite Aminosäuresequenz am Aminoterminus der ersten Aminosäuresequenz und eine dritte Aminosäuresequenz, am Carboxyterminus der ersten Aminosäuresequenz wobei die zweite und die dritte Aminosäuresequenz zur Sequenz von HDAg heterolog sind;

die zweite Aminosäuresequenz die folgende Sequenz aufweist:

MTMITDSL

die dritte Aminosäuresequenz die folgende Sequenz aufweist:

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Polypeptide die folgende Aminosäuresequenz umfassen:

3. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Multimer-Aggregat RNA umfaßt.

4. Immunoassaykit, das als spezifisches Reagenz die Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüch umfaßt.

5. Immunoassayverfahren für einen für HDAg spezifischen Analytantikörper in einer Probe, umfassend die Schritte:

Umsetzen der Probe mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, um dessen Bindung mit den Analytantikörper zu erreichen;

Nachweisen der Bindung.

6. Immunoassayverfahren für ein Analyt-HDAg in einer Probe, umfassend die Schritte;

kompetitives Binden des Analytantigens und der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 an einen für HDAg spezifischen Antikörper;

Nachweisen der kompetitiven Bindung.

7. Verfahren zur Wiedergewinnung eines Multimer- Aggregats nach Anspruch 1 bis 3 aus Wirtszellen, umfassend die Schritte:

Aufbrechen der Wirtszellen durch Schallbehandlung;

Separieren der Aggregate von Zellmembranmaterial und Zelleinschlußkörpern durch Zentrifugieren.

8. Verfahren zur Wiedergewinnung eines Multimer- Aggregats nach Anspruch 1 bis 3 aus Wirtszellen, umfassend die Schritte:

Aufbrechen der Wirtszellen durch Schallbehandlung;

Separieren der Aggregate von Zellmembranmaterial und Zelleinschlußkörpern durch Zentrifugieren;

darüber hinaus Separieren der Aggregate von Cytosolmaterial durch sequenzielle Immunaffinitätschromatographie, die für die zweite Aminosäuresequenz und die dritte Aminosäuresequenz spezifisch ist.

9. Nukleinsäure, die das Polypeptid von Anspruch 3 kodiert und die folgende Sequenz aufweist: