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DE69032679T2 - Threo (2R, 3S)-3-amino-2-hydroxypentansäure und threo (2R,3S)-3-(p-methoxy-benzyloxycarbonyl/FMOC) amino-2-hydroxy-pentansäure - Google Patents

Threo (2R, 3S)-3-amino-2-hydroxypentansäure und threo (2R,3S)-3-(p-methoxy-benzyloxycarbonyl/FMOC) amino-2-hydroxy-pentansäure

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DE69032679T2
DE69032679T2 DE69032679T DE69032679T DE69032679T2 DE 69032679 T2 DE69032679 T2 DE 69032679T2 DE 69032679 T DE69032679 T DE 69032679T DE 69032679 T DE69032679 T DE 69032679T DE 69032679 T2 DE69032679 T2 DE 69032679T2
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DE
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acid
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radicals
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DE69032679T
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DE69032679D1 (de
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Takaaki Fujisawa-Shi Kanagawa 251 Aoyagi
Masa Shinjuku-Ku Tokyo 160 Hamada
Yasuhiko Itabashi-Ku Tokyo 175 Muraoka
Machiko Chuocho 1-Chome Meguro-Ku Tokyo 152 Nagai
Hiroshi Tokyo 145 Naganawa
Keiji Hachioji-Shi Tokyo 192 Ogawa
Tomio Tokyo 141 Takeuchi
Makoto 2-102 3-17 Shimo Kita-Ku Tokyo 115 Tsuda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Microbial Chemistry Research Foundation
Original Assignee
Microbial Chemistry Research Foundation
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Description

  • Threo-3-amino-2-hydroxypentansäure und Threo(2R,3S), (2S,3R)- 3-(p-Methoxy-benzyloxycarbonyl)amino-2-hydroxypentansäure.
  • Dies ist eine Teilanmeldung der EP 90 905 686.3 (0 423 358), die Poststatin und verwandte Verbindungen oder Salze davon betrifft, die die Wirkung der Inhibierung der Wirkungen der Endopeptidasen, einschließlich derjenigen, die als Serin- Enzyme oder SH-Enzyme klassifiziert werden, aufweisen, und ein Verfahren zur Herstellung solcher Poststatin-Verbindungen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil die Poststatin-Verbindungen enthalten. Die vorliegende Anmeldung betrifft (2R,3S)-3-Amino-2-hydroxypentansäure und weiter (2R,3S)-3-Amino-2-hydroxypentansäure, worin die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus p-Methoxybenzyloxycarbonyl und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl besteht.
  • Die Veröffentlichung Bull. Chem. Soc. Japan; 1976, Seiten 3181-3184 offenbart als Verbindung 8c eine 2-Amino- 2-hydroxypentansäure, enthält jedoch keine Äußerungen, ob es sich bei dieser Verbindung um die Threo- oder die Erythro- Form handelt. Insbesondere ist kein besonderes Enantiomer offenbart.
  • Prolylendopeptidase ist ein Beispiel für eine Endopeptidase und zeigt eine Wirkung der Inaktivierung der folgenden Substanzen: Substanz P, bei der es sich um eine neuroleitende Substanz handelt; Thyrotropin-freisetzendes Hormon; Neurotensin; und Vasopressin, das in Beziehung zum Gedächtnis zu stehen scheint. Es wird angenommen, daß Prolylendopeptidase- Inhibitor-Substanzen verschiedene physiologische Aktivitäten aufweisen könnten. Insbesondere wird beobachtet, daß eine Prolylendopeptidase-Inhibitor-Substanz eine Wirkung auf die Inhibierung der Inaktivierung des Vasopressins zeigt, so daß erwartet wird, daß diese Substanz nützlich als Medikament zur Behandlung von amnestischen Syndromen nützlich sein könnte. Z. B. offenbart das "Journal of the Japanese Agricultural Chemical Society", 58, 1147-1154 (1984) und die japanischen Patentveröffentlichungen (offengelegt) mit den Nummern 60- 172929 (1985) und 60-188317 (1985), daß bestimmte Prolylendopeptidase-Inhibitor-Mittel eine antiamnesische Wirkung aufweisen. Es besteht daher der starke Wunsch, ein wirksameres Prolylendopeptidase-Inhibitor-Mittel bereitzustellen, das als antiamnestisches Mittel verwendet werden kann.
  • Aoyagi berichtet, daß aus experimentellen Daten, die die Enzymwirkung in der Milz von NZB/WF1-Mäusen, die unter SLE (systemischem Lupus erythematodes) leiden, betreffen, geschlossen werden kann, daß die Menge der Prolylendopeptidase mit dem Voranschreiten der Erkrankung ansteigt (Journal of Applied Biochemistry, 7, 273-281 (1985)). Es wird daher erwartet, daß ein Prolylendopeptidase-Inhibitor-Mittel wirksam für die Behandlung von SLE sein könnte.
  • Es ist auch bekannt, daß es eine Anzahl von niedermolekularen Prolylendopeptidasen mit Endopeptidase-inhibierender Wirkung gibt. Beispiele solcher niedermolekularen Peptidasen sind natürliche Peptidaldehyde wie Leupeptin und Elastatinal. Weiterhin wurde eine Anzahl von Peptid-Aldehyden als Endopeptidase-Inhibitor-Mittel synthetisiert. Gemäß der durch Thompson, R. C. (Biochemistry, 12, 47-51 (1973)) vorgeschlagenen Theorie sind solche Peptid-Aldehyde an Enzyme gebunden, so daß die Aldehydradikale der Peptid-Aldehyde die Stellen der Enzyme einnehmen können, wo sie mit den Carbonylradikalen der (Substrat-)Peptide reagieren können, so daß sie die Enzymaktivität inhibieren.
  • Hori et al. berichten, daß bestimmte Peptide mit einem (RS)-3-Amino-2-oxo-pentansäure-Ethyl- oder Benzylesterradikal am C-Ende durch die Dakin-West-Reaktion hergestellt werden können, und daß diese synthetischen Peptide die Wirkung der Elastase inhibieren, die ein Beispiel der Peptidasen ist (Peptides, Structure and Function, Proceedings of the Ninth American Peptide Symposium, Seiten 819-822 (1985)).
    • Offenbarung der Erfindung
  • Als Ergebnis bei kontinuierlichen Untersuchungen von Substanzen, die eine Endopeptidase-inhibierende Wirkung aufweisen, haben wir nun gefunden, daß der Streptomyces viridochromogenes-Stamm MH534-30F3 eine Substanz erzeugt, die die oben erwähnten Enzyme stark inhibiert. Weiterhin waren wir erfolgreich in der Isolierung und Reinigung der Inhibitorsubstanz und gaben der Substanz den Namen Poststatin. Poststatin besitzt eine neue Struktur, worin die Peptidkette ein Ketonradikal aufweist, und es besitzt außerdem an seinen beiden Enden Aminosäurereste. Zusätzlich stellten wir im Hinblick auf die Struktur des Poststatins eine Anzahl von verwandten Verbindungen her und fanden, daß diese verwandten Verbindungen auch eine Endopeptid-inhibierende Wirkung aufweisen.
  • Im ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher Poststatin und verwandte Verbindungen oder Salze davon mit der Formel:
  • bereitgestellt, worin X einen Peptidrest darstellt, der funktionale Radikale, die wahlweise geschützt sind, aufweist, oder X einen Aminosäurerest darstellt, der wahlweise geschützte Aminoradikale aufweisen kann,
  • R&sub1; ein gesättigtes oder ungesättigtes Kohlenwasserstoffradikal darstellt, mit der Maßgabe, daß die räumliche Konfiguration des Substituenten am Kohlenstoffatom, an das das Radikal R&sub1; gebunden ist, die Konfiguration S oder RS besitzt, und
  • Y einen Peptidrest darstellt, der funktionelle Radikale, die wahlweise geschützt sind, aufweisen kann, oder Y einen Aminosäurerest darstellt, der wahlweise geschützte Carboxylradikale aufweisen kann.
  • Im zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Poststatin mit der allgemeinen Formel:
  • worin die Aminoradikale in geschützter Form vorliegen können, und Esterverbindungen oder Salze davon bereitgestellt.
  • Im dritten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Poststatin der Formel (I) und verwandter Verbindungen oder Salzen davon bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß 3-Amino-2-hydroxy-fettsäurederivate mit einer Einheit der Formel:
  • worin R&sub1; ein gesättigtes oder ungesättigtes Kohlenwasserstoffradikal darstellt, oxidiert wird, so daß ein 3- Amino-2-oxo-fettsäurederivat mit einer Einheit der Formel:
  • worin R&sub1; die oben angegebene Bedeutung besitzt, erhalten wird, und das so gebildete 3-Amino-2-oxo-fettsäurederivat dann wahlweise einer Operation zur Entfernung der Schutzradikale und/oder einer Salzbildungsoperation unterworfen wird.
  • Im vierten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung von Poststatin bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Poststatin-erzeugender Mikroorganismus der zu den Streptomycetaceae gehört, kultiviert wird, und das so hergestellte Poststatin aus dem Kulturmedium isoliert wird.
  • Im fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Endopeptidase-Inhibitor-Mittel bereitgestellt, daß als aktiven Bestandteil Poststatin oder verwandte Verbindungen oder Salze davon mit der Formel (I) umfaßt.
    • Detaillierte Beschreibung der Abbildungen:
  • Fig. 1 zeigt eine infrarotspektroskopische Aufnahme von Poststatin, das in einer Kaliumbromidtablette enthalten ist.
  • Fig. 2 zeigt eine H-NMR-spektroskopische Aufnahme (400 MHz) von Poststatin, die in Deuterium enthaltendem Dimethylsulfoxid aufgenommen wurde.
  • Fig. 3 zeigt eine C-NMR-spektroskopische Aufnahme (100 MHz) von Poststativ, die in Deuterium enthaltendem Dimethylsulfoxid aufgenommen wurde.
  • Bevorzugte Ausführungsformen für die Durchführung der Erfindung:
  • X und Y in der allgemeinen Formel (I) stellen einzeln einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest mit Aminosäureresten dar. Beispiele solcher Aminosäurereste sind α- Aminosäurereste, obwohl Reste, die von α-Aminosäureresten verschieden sind, auch verwendet werden können.
  • Als Beispiele von α-Aminosäureresten können Aminosäurereste der Formel:
  • erwähnt werden, worin R&sub2; Wasserstoff darstellt; oder ein niederes Alkylradikal, das unsubstituiert oder substituiert sein kann durch Amino, Hydroxy, Mercapto, Niederalkylthio, Carboxyl, Phenyl, Hydroxyphenyl, Imidazol oder Indolyl- Radikale; und Aminosäurereste der Formel:
  • worin R&sub3; Wasserstoff oder Hydroxy darstellt.
  • Einzelne Beispiele der Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, Cystein, Methionin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Tryptophan, Prolin, Hydroxyprolin und ähnliche. Die Aminosäurereste, die durch X dargestellt werden, sind bevorzugt die folgenden Aminosäurereste (a) bis (c), worin die Aminoradikale wahlweise geschützt sind.
  • Die Aminosäurereste, die durch Y dargestellt werden, sind bevorzugt die folgenden Aminosäurereste (a), worin die Carboxylradikale wahlweise geschützt sind.
  • Beispiele der Peptidreste, dargestellt durch X oder Y sind niedere Polymer-Typ-Peptidreste mit zwei bis drei Aminosäurenradikalen, die miteinander verbunden sind. Bevorzugte Beispiele der Peptidreste, die durch X dargestellt sind, sind Peptidreste (d) bis (h) mit funktionellen Radikalen wie Aminoradikalen, die wahlweise geschützt sind.
  • Bevorzugte Beispiele der Peptidreste, die durch Y dargestellt sind, sind die Peptidreste (b) und (c) mit funktionellen Radikalen wie Carboxylradikalen, die wahlweise geschützt sind.
  • Die Schutzradikale für die Aminosäurereste oder die Aminoradikale in den Peptidresten, die durch X oder ähnliches dargestellt werden, schließen Acylradikale ein, Phthalyl oder Sulfonylradikale, und Oxycarbonylradikale, die eine schützende Wirkung in Form der Urethane ausüben. Beispiele der Acylradikale sind unsubstituiertes Niederalkylcarbonyl, substituiertes Niederalkyl (der Substituent kann Halogen, Nitro, Niederalkoxy, Phenyl oder ähnliches sein), Benzoyl, Phthalyl, Arylsulfonyl, etc. im Falle der Phenyl-enthaltenden Acylradikale kann das Phenyl Substituenten aufweisen einschließlich Niederalkyl, Halogen, Niederalkoxy, Nitro und ähnlichen. Repräsentative Beispiele der Acrylradikale sind Acetyl, Trifluoracetyl, Phenylacetyl, Phenylbutanoyl, Phenylpropionyl, Benzoyl, etc.
  • Beispiele der Oxycarbonylradikale, die eine Schutzwirkung in Form der Urethane ausüben, sind unsubstituiertes Niederalkoxycarbonyl, substituiertes Niederalkyloxycarbonyl (die Substituenten können die gleichen sein, die zuvor bei der Erläuterung der Acylradikale genannt wurden), z. B. Isopropyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, Isopentyloxycarbonyl, substituiertes Benzyloxycarbonyl (die Substituenten können die gleichen sein, wie diejenigen, die zuvor bei der Erläuterung der Acylradikale erwähnt wurden), und ähnliche.
  • Zusätzlich zu den Acyl- und Oxycarbonylradikalen ist es auch möglich in bestimmten Fällen unsubstituiertes Benzyl, substituiertes Benzyl (die Substituenten können die gleichen sein, wie oben erwähnt), o-Nitrophenylthio, Triphenylmethyl und ähnliche als Schutzradikale zu verwenden.
  • Als gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffradikale, die durch R&sub1; dargestellt sind, können gesättigte oder ungesättigte niedere aliphatische Kohlenwasserstoffradikale, aromatische Kohlenwasserstoffradikale und ähnliches erwähnt werden. Sie können Substituenten aufweisen. Beispiele dieser Radikale sind Niederalkyl, Benzyl, Phenyl, etc. Methyl, Ethyl, Propyl, Benzyl und ähnliche sind besonders bevorzugt.
  • Als Schutzradikale für die Carboxylradikale, die in den Aminosäureresten oder Peptidresten enthalten sind, die durch Y oder andere dargestellt werden, ist es möglich z. B. Ester radikale zu verwenden. Beispiele solcher Ester sind diejenigen, die sich von niederen Alkoholen, Benzylalkoholen und ähnlichem ableiten.
  • Beispiele der niederen Alkylradikale, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind C&sub1;-C&sub5;-Alkylradikale, die Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl und ähnliche einschließen.
  • Als niedere Alkohole können C&sub1;-C&sub5;-Alkohole verwendet werden, einschließlich Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Pentylalkohol und ähnliche. Als niedere Alkoxyradikale ist es möglich C&sub1;-C&sub5;-Alkoxyradikale, einschließlich Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, etc. zu verwenden. Als Halogenatome können z. B. Fluor, Chlor und Brom erwähnt werden.
  • Poststatin-verwandte Verbindungen der Formel (I) können in der Form von Salzen vorliegen. Beispiele solcher Salze sind anorganische Salze einschließlich Chloride, Sulfate, Nitrate und ähnliche, organische Säureadditionssalze einschließlich p-Toluolsulfonate, Citrate, Succinate und ähnliche. Weiterhin ist es auch möglich z. B. Salze von Alkalimetallen wie Natrium, Kalium und ähnliche und Salze von Erdalkalimetallen einschließlich Calcium und ähnliche zu verwenden.
  • Poststatin der Formel (I), worin X L-Valyl-L-valyl, R&sub1; Ethyl, und X-D-Leucyl-L-valin ist, kann durch die folgende chemische Formel gezeigt werden:
  • und kann aus dem Kulturmedium, das die Poststatinerzeugenden Mikroorganismen enthält, abgetrennt werden.
  • Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Poststatins sind die folgenden:
  • (I) Physikalische chemische Natur des Poststatins:
  • (1) Form und Farbe: weißes Pulver
  • (2) Elementaranalyse:
  • C 55,0%
  • H 8,62%
  • N 12,12%
  • (3) Molekulargewicht: 541 (bestimmt auf der Basis des Peaks im Massenspektrogramm)
  • (4) Molekulare Formel: C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub7;N&sub5;O&sub7; (aus den Ergebnissen der Massenspektrographie, der ¹³C-NMR- Spektroskopie und der Elementaranalyse); die elementaranalytischen Daten zeigen die Anwesenheit von 3/2 H&sub2;O.
  • (5) Schmelzpunkt: 169-171ºC.
  • (6) Spezifische Drehung: [a]²&sup0;D + 13,9º (c = 0,5, Essigsäure)
  • (7) UV-Absorptionsspektrum (in 1 mg/ml Methanol): schwache Absorption bei ungefähr 250 nm.
  • (8) IR-Absorptionsspektrum: siehe Fig. 1.
  • (9) H-NMR-Spektrum: siehe Fig. 2.
  • (10) C-NMR-Spektrum: siehe Fig. 3.
  • (11) Farbreaktion: auf einer Silikagel-Dünnschicht ist die Verbindung "positiv" gegenüber den folgenden Reagentien: Ninhydrin-Reagens, Rydon-Smith-Reagens, 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Reagens und 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Reagens.
  • (12) Löslichkeit: löslich in Wasser, Methanol und Dimethylsulfoxid und unlöslich in Aceton, Ethylacetat, Chloroform und Hexan.
  • (13) Dünnschichtchromatographie (Silikagel "Artikel 5715" (Merck); Eluent: n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4 : 1 : 1);
  • Rf = 0,70.
  • ODS-ausgetauschtes Silikagel (Silikagel "Art. 15389" (Merck); Eluierungsmittel: Acetonitril-Pufferlösung A* (7 : 13);
  • Rf 0,54 (* die Pufferlösung A ist eine wäßrige Lösung, die 5%iges Kaliumacetat und 1%iges Zitronensäure-Monohydrat enthält).
  • Poststatin kann erhalten werden durch Kultivieren von Poststatin-erzeugenden Bakterien, die zu den Streptomycetaceae gehören, und Isolierung des gewünschten Poststatins aus dem Kulturmedium.
  • Als Beispiel eines Poststatin-erzeugenden Mikroorganismus kann der Streptomyces-Stamm MH534-30F3 erwähnt werden, der durch die vorliegenden Erfinder in einer Bodenprobe in der Erde von Biseibutsu Kagaku Kenkyusho, Tokyo, Japan gefunden wurde. Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes MH534-30F sind die folgenden.
    • 1. Form
  • Unter dem Mikroskop wird beobachtet, daß der Mikroorganismus des Stammes MH534-30F3 verzweigte primäre Hyphen besitzt, und die Lufthyphen gut aus den primären Hyphen wachsen und eine Spiralform aufweisen. Es wurden keine quirligen Verzweigungen beobachtet. Die Spiralanteile waren relativ lang und schlossen häufig solche mit mindestens achtfachen Windungen ein. Gereifte Sporen hatten die Form einer Ellipse mit einer Größe von ungefähr 0,5-0,7 · 0,9-1,1 Mikron. Die Sporenoberfläche war borstig. Mindestens 20 Sporen bildeten eine Kette.
    • 2. Wachstum im Kulturmedium
  • Zur Identifizierung der Farben wurde das "Color harmony Manual", Container Corporation of America verwendet.
  • (1) Sucrose-Nitrat-Agar-Medium (Kultivierung bei 27ºC):
  • Es wurde beobachtet, daß es Lufthyphen mit der Farbe graulich-weiß (1 dc, Kitt) bis hellgrünlich-grau (24-1/2 dc) gab, die auf Nährsubstanzen mit der Farbe dunkelgelblichbraun (2 nl, Dickichtbraun (Covert Brown)) bis graulich-gelbbraun (3 nl, DK. braun) wuchsen. Die löslichen Pigmente besaßen eine braune Farbe.
  • (2) Glucose-Asparagin-Agar-Medium (Kultivierung bei 27ºC):
  • Die Nährböden besaßen die Farbe hellgelblich-braun (3 ie, Kamel (Camel) bis 3 l g, Adobe-Braun). Es gab keine Lufthyphen. Weiterhin wurden keine löslichen Pigmente gefunden.
  • (3) Glycerin-Asparagin-Agar-Medium (ISP-Kulturmedium 5, Kultivierung bei 27ºC).
  • Es gab Nährböden mit der Farbe graulich-gelb-braun (2 ie, Lt. Senf-Lohfarbe (Mustard Tan) - 2 pl, Senfbraun (Mustard Brown) bis graulich-oliv (1-1/2- pl, oliv) und Lufthyphenwachstum auf den Nährböden, die die Farbe blau (15 ba, Blauton (Blue Tint)) bis hellbläulich-grau (19 dc, "Aquagrau" (Aqua Gray) - 19 fe, Aquagrau (Aqua Gray) - 22 ih, Moosgrau (Mass Gray)) besaßen. Die Rückseitenoberflächen der Nährböden besaßen eine olive Farbe. Die löslichen Pigmente besaßen eine helle Farbe von gelb bis oliv. Gab man HCl hinzu, unterlagen die Nährböden und die löslichen Pigmente einer Farbschattierungsveränderung, so daß sie eine rötliche Schattierung aufwiesen, während, wenn NaOH hinzugegeben wurde, keine Farbveränderung eintrat.
  • (4) Stärke-anorganisches Salz-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 4; Kultivierung bei 27ºC).
  • Es wurden Lufthyphen mit einer Farbe von hellbläulichgrau (19 dc, Aquagrau (Aqua Gray) - 19 fe, "Aquagrau" (Aqua Gray)) bis hellgrünlich-grau (22 in, Moosgrün (Moss Gray)) beobachtet, die auf den Nährböden wuchsen, die farblos waren oder die Farbe hellgelb (2 ec, Biskuit (Biscuit)) aufwiesen. Lösliche Pigmente wurden nicht beobachtet.
  • (5) Tyrosin-Agar-Kulturmedium (SIP-Kultur 7; Kultivierung bei 27ºC)
  • Es wurden Lufthyphen mit der Farbe blau (15 ba, blauer Farbton (Blue Tint)) bis hellgrünlich-grau (22 ih, Moosgrau (Moss Gray)) beobachtet, die auf Nährböden mit der Farbe hellbraun (3 lg, Adobe-braun (Adobe-Brown)) bis dunkelgelblich-braun (3 pn, Sepiabraun (Sepia Brown)) aufwiesen. Die Rückseitenoberflächen der Nährböden besaßen einen oliven Farbton, und die löslichen Pigmente besaßen einen schwach- braunen Farbton. Die Farben der Nährböden und der löslichen Pigmente änderten sich ins rötliche, wenn HCl hinzugegeben wurde. Wenn NaOH hinzugegeben wurde, traten keine Farbänderungen der Nährböden und der löslichen Pigmente ein.
  • (6) Agar-Nähr-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC).
  • Es wurden Lufthyphen mit der Farbe mattweiß (faint white) beobachtet, die auf Nährböden mit der Farbe hellgelb (2 ec, Biskuit (Biscuit)) wuchsen. Lösliche Pigmente wurden nicht beobachtet.
  • (7) Hefe-Malz-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 2; Kultivierung bei 27ºC).
  • Es wurden Lufthyphen mit der Farbe hellbläulich-grau (19 dc, "Aquagrau" (Aqua Gray) -19 fe, "Aquagrau" (Aqua Gray) - 22 fe, Pimentbaum-grau (Bayberry Gray)) beobachtet, die auf Nährböden wuchsen, die die Farbe hellgelblich-braun (2 ie, Lt. Senf-Lohfarbe (Mustard Tan)) besaßen. Die Rückseitenoberflächen der Nährböden besaßen einen Oliv-Ton. Es wurden keine löslichen Pigmente beobachtet.
  • (8) Hafermehl-Agar-Kulturmedium (ISP-Kulturmedium 3; Kultivierung bei 27ºC).
  • Es wurden Lufthyphen mit der Farbe hellbläulich-grau (19 dc, "Aquagrau" (Aqua Gray)) bis hellgrünlich-grau (22 ih, Moosgrau (Moss Gray)) beobachtet, die auf farblosen Nährböden wuchsen. Lösliche Pigmente wurden nicht gefunden.
  • (9) Glycerin-Nitratsalz-Agar-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC).
  • Es wurden Lufthyphen mit der Farbe graulich-weiß (1 dc, Kitt (Putty)) - hellgrau (1 fe, Griege) - hellbräunlich-grau (93 fe, Silbergrau (Silver Gray)) beobachtet, die auf Nährböden wuchsen, die die Farbe dunkelgelblich-braun (3 po, Ebenholz (Ebony) - 3 nl, Dk. Braun (Dk. Brown)) bis dunkeloliv (1-1/2 pn, Dk. Olivin (Dk. Olivine) - 1 ml, Dk. Olivgrau (Dk. Olive Gray)) aufwiesen. Die Rückseitenoberflächen der Nährböden besaßen eine olive Farbe, und die löslichen Pigmente besaßen einen helloliven Ton. Die Nährböden und die löslichen Pigmente färbten sich braun, wenn HCl hinzugegeben wurde, während bei der Zugabe von NaOH keine Änderung der Farbe eintrat.
  • (10) Stärke-Agar-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC).
  • Es wurden Lufthyphen mit der Farbe hellbläulich-grau (19 fe, "Aquagrau" (Aqua Gray)) bis hellgrünlich-grau (922 ih, Moosgrau (Moss Gray)) beobachtet, die auf Nährböden wuchsen, die farblos waren oder die Farbe hellgelb (2 ec, Biskuit (Biscuit)) aufwiesen. Es wurden keine löslichen Pigmente gefunden.
  • (11) Calciummalat-Agar-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC).
  • Es wurden Lufthyphen mit der Farbe bläulich-weiß bis hellbläulich-grau (19 fe, Aquagrau (Aqua Gray)) beobachtet, die auf farblosen Nährböden wuchsen. Ungefähr 20 Tage nach Beginn der Kultivierung wurde beobachtet, daß sich die löslichen Pigmente schwach braun färbten.
  • (12) Cellulose-Kulturmedium (Filterpapier - hinzugegebene synthetische Lösung; Kultivierung bei 27ºC).
  • Es wurden Lufthyphen beobachtet, die die Farbe bläulich- weiß auf 19 dc, Aquagrau (Aqua Gray)) bis hellbläulich-grau aufwiesen, und die dünn auf den farblosen Nährböden wuchsen. Es wurden keine löslichen Pigmente gefunden.
  • (13) Gelatine-Kultivierung
  • In einem einfachen Gelatine-Kultivierungsmedium (15% Gelatine Kultivierung bei 20ºC) wurden Lufthyphen mit der Farbe schwachbläulich-weiß (22 dc) bis hellbläulich-grau (19 fe, "Aquagrau" (Aqua Gray)) beobachtet, die auf farblosen Nährböden wuchsen. Lösliche Pigmente besaßen eine hellbräunliche Farbe. In einem Glucose-Pepton-Gelatine-Kulturmedium (Kultivierung bei 27ºC) wurde beobachtet, daß keine Lufthyphen auf farblosen Matrizen wuchsen, und daß die löslichen Pigmente eine schwachbräunliche Farbe aufwiesen.
  • (14) Entrahmte Milch (Kultivierung bei 37ºC).
  • Es wurde beobachtet, daß keine Lufthyphen auf den Nährböden, die die Farbe hellgelb bis gelblich-braun aufwiesen, wuchsen. Es wurden keine löslichen Pigmente gefunden.
    • 3. Physiologische Eigenschaften
  • (1) Wachstumstemperaturen
  • Ein Test wurde in folgender Weise durchgeführt. Die Kultivierung wurde auf einem Glucose-Asparagin-Agar-Kulturmedium (1% Glucose, 0,05% Asparagin, 0,05% K&sub2;HPO&sub4; und 3,0 % Agar; pH 7,0) bei einer Temperatur von 20ºC, 24ºC, 27ºC, 30ºC, 37ºC oder 50ºC durchgeführt. Es wurde beobachtet, daß der Mikroorganismus bei diesen Temperaturen, ausgenommen bei 50ºC, wuchs, obwohl festgestellt wurde, daß eine Temperatur von ungefähr 27 bis 37ºC die optimale Temperatur darstellt. (2) Verflüssigung von Gelatine-Kulturmedium (15%iges einfaches Gelatine-Kulturmedium, Kultivierung bei 20ºC; oder Glucose-Pepton-Gelatine-Kulturmedium, Kultivierung bei 27ºC).
  • In dem einfachen 15%igen Gelatine-Kulturmedium wurde eine Verflüssigung nach ungefähr 14 Tagen vom Beginn der Kultivierung an beobachtet, obwohl die Verflüssigungswirkung sehr schwach war. In dem Glucose-Pepton-Gelatine-Kulturmedium wurde keine Verflüssigung selbst nach 21 Tagen vom Beginn der Kultivierung an beobachtet.
  • (3) Hydrolyse der Stärke (Stärke - anorganische Salze-Agar- Kulturmedium oder Stärke-Agar-Kulturmedium-Kultivierung bei 27ºC).
  • Sowohl im dem Stärke - anorganisches Salz-Agar-Kulturmedium als auch dem Stärke-Agar-Kulturmedium wurde eine relativ starke Hydrolyse nach ungefähr 3 Tagen vom Beginn der Kultivierung an beobachtet.
  • (4) Gerinnung und Peptonisation von Magermilch (Magermilch, Kultivierung bei 37ºC).
  • Eine schwache Gerinnung begann 2 Tage vom Beginn der Kultivierung an. Vor Abschluß der Gerinnung begann die Peptonisierung nach ungefähr 8 Tagen vom Beginn der Kultivierung an. Die Peptonisierung war nach ungefähr 14 Tagen vom Beginn der Kultivierung an vollständig. Die Peptonisierung war stark.
  • (5) Bildung von Melaminartigen Pigmenten (Trypton-Hefe- Kultur-Brühe-Medium, ISP-Kulturmedium 1; Pepton-Hefe-Fe-Agar- Kulturmedium, ISP-Kulturmedium 6; und Tyrosin-Agar-Kultivierungsmedium, ISP-Kulturmedium 7; Kultivierung bei 27ºC).
  • Die Testergebnisse sind: "positiv" im Trypton-Hefe-Nähr- Kulturmedium und im Pepton-Hefe-Fe-Agar-Medium und "negativ" im Tyrosin-Agar-Kulturmedium.
  • (6) Aufnehmbarkeit von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gottlieb- Agar-Medium, ISP-Kultivierungsmedium 9, Kultivierung bei 27ºC).
  • Die Bakterien wuchsen gut bei Verwendung von D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, D-Fructose, Sucrose, Inositol, L- Rhamnose, Raffinose und D-Manitol.
  • (7) Lösen von Calciummalat (Calciummalat-Agar-Kulturmedium, Kultivierung bei 27ºC).
  • Die Testergebnisse waren "positiv".
  • (8) Nitrat-Reduktionsreaktion (wäßrige Peptonlösung, die 0,1% Kaliumnitrat enthielt, ISP-Kulturmedium 8, Kultivierung bei 27ºC).
  • Die Testresultate waren "positiv".
  • (9) Zersetzung von Cellulose (synthetische Lösung, zu der Filterpapierstücke hinzugegeben wurden; Kultivierung bei 27ºC).
  • Die Testergebnisse waren "negativ".
  • Zusammenfassend kann gesagt werden, daß der Mikroorganismus des Stammes MH534-30F3 Lufthyphen in Spiralform mit fehlenden quirligen Verzweigungen aufwies. Die Oberflächen der Sporen waren brüchig. Die Mikroorganismen wuchsen in verschiedenen Kulturmedien und besaßen viele Lufthyphen, die farblos waren oder die Farbe hellgelb, dunkelgelb-braun oder graulich-oliv besaßen. Die Rückseitenoberflächen der Nährböden besaßen einen Oliv-Ton. Lösliche Pigmente waren nicht vorhanden, oder sie wiesen eine schwachbraune Farbe auf. Die Farbe der Nährböden und der lösllichen Pigmente verfärbte sich leicht Rot, wenn HCl hinzugegeben wurde. Wenn NaOH hinzugegeben wurde, trat keine Farbänderung auf. Die Melaminartigen Pigmente waren "positiv" im Trypton-Hefe-Nährkulturmedium und im Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Kulturmedium und "negativ" im Tyrosin-Agar-Kulturmedium. Die proteinzersetzende Wirkung ist sehr schwach in einem Gelatine-Kulturmedium aber stark in einem Magermilch-Kulturmedium. Die Stärke-Hydrolyse wirkung ist stark. Die Zellwände enthalten LL-2,6-Diaminopimelinsäure.
  • Im Hinblick auf die oben beschriebenen Testdaten wird angenommen, daß der Mikroorganismus des Stammes MH534-30F3 zur Gattung Streptomyces gehört. Aus vorhergehenden Publikationen wird angenommen, daß es die folgenden drei Arten bekannter Mikroorganismen gibt, die MH534-30F3 ähnlich sind.
    • Streptomyces viridochromogenes
  • (International Journal of Systematic Bacteriology, 22, 369 (1972); und Soil Science, 8, 163 (1919)).
    • Streptomyces chartreusis
  • (International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 95 (1968); und Waksman, The Actionomycetes, Band 2, Seite 192 (1961)) und
    • Streptomyces coerulescenes
  • (International Journal of Systematic Bacteriology, 18, 100 (1968); und Gauze, Zur Klassifizierung der Actinomyceten, Seite 93 (1958), veb. Gustav, Fischer Verlag, Jena).
  • Ein Vergleich wurde gemacht mit den oben erwähnten drei Mikroorganismen und MH534-30F3 und die Ergebnisse davon sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)
  • Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß es eine hohe Ähnlichkeit der Eigenschaften unter MH534-30F3, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces chartreusis und Streptomyces coerulescens gibt.
  • Es ist natürlich, daß die drei Spezies der bekannten Mikroorganismen, die oben für Vergleichszwecke erwähnt sind, einander ähnlich sind. Als charakteristische Eigenschaften der Streptomyces viridochromogenes kann erwähnt werden, daß die Rückseitenoberflächen der Nährböden eine olive Färbung besitzen. Im ISP-Kulturmedium 3 erzeugen die Mikroorganismen lösliche Pigmente mit einer grünen Farbe. Die Rückseitenoberflächen der Nährböden und die löslichen Pigmente verfärben sich rot, wenn HCl hinzugegeben wird. Diese Eigenschaften sind in den oben erwähnten Veröffentlichungen offenbart und auch in dem Artikel mit dem Titel "Streptomcyces species comprising the blue-spore series" (Journal of Bacteriology, 85, 676 (1963)). Diese Eigenschaften können auch im oben erwähnten Vergleichstest, der in Tabelle 1 gezeigt ist, gezeigt werden. Im Falle von Streptomyces chartreusis und Streptomyces coerulescens wird beobachet, daß die Rückseitenoberflächen der Nährböden keine olive Farbe besitzen, und daß die pH-Änderungen keine Farbänderung der Pigmente verursacht. Die Mikroorganismen des Stammes MH534-30F3 erzeugen lösliche Pigmente mit einer oliven Farbe in einem Glycerin-Nitrat- Agar-Kulturmedium, obwohl die Mikroorganismen diese Pigmente nicht im ISP-3-Kulturmedium erzeugen. Betrachtet man die Farbe der Rückseitenoberflächen der Nährböden und die Farbänderung, die durch pH-Veränderung verursacht wird, ist der Mikroorganismus des Stammes MH534-30F3 ähnlich zu Streptomyces viridochromogenes. Diese beiden Spezies unterscheiden sich jedoch in der Gerinnungsstärke von Milch und auch im Hydrolysegrad von Stärke. Im International Journal of Systematic Bacteriology, 22, 369 (1972) wird offenbart, daß die Ergebnisse der Tests der Bildung von Melanin-artigen Pigmenten "positiv" in den ISP-Kulturmedien 1 und 6 zeigen und "±" im ISP-Kulturmedium 7 zeigen. Diese Ergebnisse der praktischen Vergleichstests durch uns sind jedoch diejenigen, die oben erwähnt sind, und die anderen Veröffentlichungen zeigen "positiv". Daher wird nicht angenommen, daß in dieser Hinsicht ein wichtiges Problem besteht.
  • Bei Betrachtung der oben erwähnten Fakten, haben wir den Stamm MH534-30F als "Streptomyces viridochromogenes MH534- 30F3" identifiziert.
  • Eine Probe des Stammes MH534-30F wurde am Institute of Applied Microbiology, Tokyo, Japan hinterlegt. Diese Probe erhielt die Zugangsnummer 9446 (FERM P-9446) am 2. Juli 1987. Diese Hinterlegung wurde in eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag überführt und als FERN BP-2848 am 4. April 1990 umnummeriert.
  • Die Natur des Stammes MH534-30F3 is wie im Falle anderer Streptomyces viridochromogenes Mikroorganisment leicht veränderbar. Z. B. können natürliche oder induzierte Mutanten- Mikroorganismen aus dem Stamm MH534-30F3 oder Homologe davon abgeleitet werden. Es ist möglich in einem Verfahren zur Herstellung des Poststatins durch die Erfindung alle Arten von Mikroorganismen von Streptomyces, einschließlich derjenigen, die der Transduktion oder Gen-Rekombinationen unterworfen wurden, zu verwenden, so weit es sich bei diesen Mikroorganismen um Poststatin-erzeugende Mikroorganismen handelt.
  • Durch die vorliegende Erfindung werden die oben erwähnten Mikroorganismen in einem Kulturmedium gezüchtet, das konventionelle Nährstoffe, die für Mikroorganismen verwendet werden, enthält. Als Nährstoffe können z. B. verwendet werden Glucose, Hirsegel, Dextrin, Sucrose, Stärke, Melasse, tierische und pflanzliche Öle und Fette und ähnliches. Beispiele Stickstoff enthaltender Nährstoffe sind Sojabohnenpulver, Embryokeime von Weizen, Getreideeinweichflüssigkeit, Baumwollsamenkuchen, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Harnstoff etc. Als wahlweise Nährstoffe ist es im allgemeinen bevorzugt anorganische Salze zu verwenden, die Natrium-, Kobalt-, Chlorid-, Phosphat- oder Sulfationen, etc. bilden können. Es ist auch möglich verschiedene organische und anorganische Substanzen zu verwenden, die das Wachstum der Mikroorganismen unterstützen, und die die Bildung von Poststatin fördern, welches die physiologische wirksame Substanz ist.
  • Es ist für das Wachstum der Mikroorganismen zweckmäßig ein Kultivierungsverfahren durchzuführen, insbesondere ein Tauchkultivierungsverfahren unter aeroben Bedingungen. Die Kultivierung wird bevorzugt bei einer Temperatur von 15 bis 37ºC, noch bevorzugter bei einer Temperatur von ungefähr 26 bis 30ºC durchgeführt. Die Herstellung des Poststatins, der physiologisch wirksamen Substanz, kann abhängen von dem Kulturmedium und den Kultivierbedingungen. Im Falle der Schüttel- und Tank-Kultivieroperation kann allgemein gesagt werden, daß die Menge des akkumulierten Poststatins (welches die physiologische wirksame Substanz ist) im allgemeinen ihren Maximalwert nach 1 bis 10 Tagen vom Beginn der Kultivierung an erreichen wird. Wenn die Menge des Poststatins, der physiologisch aktiven Substanz, den Maximalwert in der Kultur erreicht hat, wird die Kultivierung unterbrochen, und die Kulturflüssigkeit einer Reinigungsoperation unterworfen, um das gewünschte Produkt zu isolieren.
  • Wenn eine Poststatin enthaltende Kulturflüssigkeit, die entsprechend der Erfindung erhalten wird, gereinigt wird, um das Zielprodukt zu erhalten, ist es möglich, eine Kombination konventioneller Trennverfahren im Hinblick auf die Natur der Kulturflüssigkeit anzuwenden. Z. B. können die folgenden Operationen durchgeführt werden. Eine filtrierte Kulturflüssigkeit wird auf pH 5 eingestellt, und die Flüssigkeit wird dann über eine Kolonne gegeben, die mit "Diaion PH-20" (Mitsubishi Kasei Co., Ltd.) gefüllt ist, mit Wasser gewaschen und der Eluierungsoperation mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol unterworfen. Das resultierende Eluat wird zur Trockene unter vermindertem Druck eingeengt. Die so erhaltene Trocken substanz wird mit einer kleinen Menge Methanol vermischt, und der Anteil, der die lösliche Komponente enthält, wird durch eine Kolonne gegeben, die mit "Sephadex LH-20" (Pharmacia Co., Ltd.) gefüllt ist, und der Elutionsoperation mit Methanol unterworfen. Das resultierende Eluat wird zur Trockene unter reduziertem Druck konzentriert, so daß ein pulverförmiges Rohprodukt erhalten wird.
  • Es ist auch möglich, Poststatin durch Anwendung einer Kombination von Adsorptionschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und ähnlichem zu isolieren. Falls erforderlich können solche Operationen wiederholt durchgeführt werden.
  • In den Kultivierungsschritten und Reinigungsschritten ist es möglich Poststatin durch Messung der Antiprolylendopeptidase-Aktivität zu überwachen. Diese Aktivität kann bestimmt werden durch ein modifiziertes Verfahren, das auf einem bekannten Verfahren von Tadashi Yoshimoto et al. basiert (Biochem. Biophys. Acta, 569, 184-192 (1979)).
  • Alternativ kann das Poststatin durch eine chemische Syntheseoperation hergestellt werden. Auch die Homologen des Poststatins können in ähnlicher Weise durch chemische synthetische Verfahren hergestellt werden.
  • Somit können Poststatin und verwandte Verbindungen oder Salze davon mit der Formel (I) durch ein chemisches Verfahren hergestellt werden, worin 3-Amino-2-hydroxy-fettsäurederivate mit einer Einheit der Formel:
  • worin R&sub1; ein gesättigtes oder ungesättigtes Kohlenwasserstoffradikal darstellt, oxidiert wird, um 3-Amino-2- oxo-Fettsäurederivate mit einer Einheit der Formel:
  • zu erhalten, worin R&sub1; die gleiche Bedeutung wie oben besitzt, und falls erforderlich, eine Operation die durchgeführt wird zur Entfernung von Radikalen und/oder zur Bildung eines Salzes davon.
  • Die 3-Amino-2-hydroxy-Fettsäurederivate mit der Einheit der Formel (11) können hergestellt werden durch ein bekanntes Peptid-Syntheseverfahren, das 3-Amino-2-hydroxy-fettsäuren oder 3-Amino-2-hydroxy-5-aryl-fettsäuren als Aminosäurereaktanten verwendet. Beispiele dieser Verbindungen sind diejenigen mit der Formel:
  • worin X, Y und R die gleichen Bedeutungen, wie zuvor erwähnt, besitzen.
  • Als nächstes werden Erläuterungen für das vorliegende Verfahren gegeben.
  • (I) Wenn dieses Verfahren als Flüssigphasen-Verfahren durchgeführt wird, kann es in der unten gezeigten Weise durchgeführt werden.
  • (1) In diesem Abschnitt wird eine Beschreibung gegeben für eine Ausführungsform des Verfahrens, worin eine katalytische Hydrierungsoperation zur endgültigen Entfernung der Schutzradikale durchgeführt wird.
  • Z. B. wird ein Benzylester einer Aminosäure, dargestellt durch Y, oder ein Benzylester eines Peptids, dargestellt durch Y mit p-Methoxybenzyloxycarbonyl-3-amino-2-hydroxyfettsäuren oder p-Butoxycarbonyl-3-amino-2-hydroxy-fettsäuren oder ähnlichem in einem konventionellen Lösungsmittel (z. B. Dimethylformamid) zur Peptidsynthese in Gegenwart eines konventionellen Kondensationsmittels für die Peptidsynthese (z. B. Carbodiimide oder Salze davon, einschließlich Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid und ähnlichem) oder in Gegenwart einer Kombination eines solchen Kondensationsmittels und eines Hilfskondensationsmittels (z. B. 1-Hydroxy-benzotriazol, N-Hydroxysuccinsäureimid oder ähnlichem) kondensiert. Dann wird das p-Methoxybenzyloxycarbonylradikal oder das t-Butoxycarbonylradikal entfernt unter Anwendung eines Mittels zur selektiven Entfernung des Schutzradikals z. B. Trifluoressigsäure. Anschließend werden die Aminosäuren oder Peptide, die durch X dargestellt sind, nacheinander in konventioneller Weise kondensiert, um das gewünschte Produkt herzustellen.
  • (2) In diesem Abschnitt werden Erläuterungen über ein Syntheseverfahren gegeben, worin Trifluoressigsäure für die endgültige Entfernung der Schutzradikale verwendet wird.
  • Z. B. wird ein t-Butylester einer Aminosäure, die durch Y dargestellt wird, oder ein t-Butylester eines Peptids, das durch Y dargestellt wird, mit p-Methoxybenzyloxycarbonyl-3- amino-2-hydroxy-fettsäure oder einer Benzyloxycarbonyl-3- amino-2-hydroxy-fettsäure in einer Weise kondensiert, die ähnlich der des oben erwähnten Verfahrens (I) ist. Als nächstes wird eine katalytische Hydrierungsoperation durchgeführt, um die Schutzradikale für die Aminoradikale, z. B. die p-Methoxybenzyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonylradikale zu entfernen. Anschließend können die Aminosäuren oder Peptide, die durch X, das in Formel (I) gezeigt sind, dargestellt werden, nacheinander kondensiert werden.
  • (II) Wenn das vorliegende Verfahren in fester Phase durchgeführt wird, kann das Verfahren z. B. in der folgenden Weise durchgeführt werden.
  • Als Ausgangsmaterial kann ein 9-Fluorenylmethyloxycarbonylaminoacyl-p-alkoxybenzylalkohol-Harz verwendet werden. Die 9-Fluorenylmethyloxycarbonylradikale werden durch eine Behandlung mit einer Base entfernt. Die Kondensationsreaktion wird nacheinander unter Verwendung von 9-Fluorenylmethyloxycarbonylaminosäuren, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-3-amino-2- hydroxy-pentansäure und anschließender Verwendung von 9- Fluorenylmethyloxycarbonylaminosäure durchgeführt. Schließ lich werden Benzyloxycarbonyl-Aminosäuren, t-Butoxycarbonylaminosäuren oder geeignete Carbonsäuren kondensiert zur Bereitstellung der Schutzradikale für die Aminoradikale.
  • Das resultierende 3-Amino-2-hydroxy-Fettsäurederivat, das eine Einheit der Formel (II) besitzt, wie die Verbindung, die durch die allgemeine Formel (IV) dargestellt, wird dann unter solch milden Bedingungen oxidiert, daß kein Einfluß auf die anderen Peptidanteile gegeben ist. Die Oxidationsreaktion kann z. B. unter Anwendung einer Kombination von (1) Dimethylsulfoxid, (2) einem Katalysator, z. B. Pyridin-Trifluoracetat und (3) einem Carbodiimid oder Essigsäureanhydrid durchgeführt werden. Die Oxidationsreaktion wird bevorzugt in einem Dimethylsulfoxidlösungsmittel oder einem anderen inerten Lösungsmittel bei einer Temperatur von ungefähr 0 bis 40ºC für ungefähr 3 bis 48 Stunden durchgeführt. Durch diese Oxidationsreaktion ist es möglich 3-Amino-2-oxo-Fettsäurederivate herzustellen, die die Einheit der Formel (III) aufweisen. Falls erforderlich können diese Derivate einer Operation zur vollständigen oder teilweisen Entfernung der Schutzradikale unterworfen werden, wodurch die Verbindung der Formel (I) erhalten wird.
  • Als nächstes wird eine Beschreibung für den wahlweisen Schritt der Entfernung der Schutzradikale gegeben.
  • Z. B. wird im Falle von 3-Amino-2-oxo-Fettsäurederivaten mit einer Einheit der Formel (III), z. B. Verbindungen der Formel (I), wenn X oder Y Hydroxy-enthaltende Aminosäureradikale sind, wie Serin- oder Threoninradikale geschützt in Form der t-Butylether, dann eine Operation zur endgültigen Entfernung der Schutzradikale gewöhnlich unter Verwendung von Trifluoressigsäure durchgeführt. Wenn eine katalytische Hydrierungsoperation zur endgültigen Entfernung der Schutzradikale durchgeführt wird, können die Hydroxylradikale, die in den Aminosäuren wie Serin oder Threonin enthalten sind, dann in Form von Benzylethern geschützt werden.
  • Falls erforderlich, können Poststatin und verwandte Verbindungen davon in Salze durch konventionelle Methoden überführt werden. Z. B. können Poststatin oder Derivate davon mit einer Lösung einer anorganischen oder organischen Säure oder einer Lösung von Kalium oder Natriumhydroxid oder ähnlichem behandelt werden.
  • Poststatin und verwandte Verbindungen oder Salze davon der vorliegenden Erfindung besitzen eine Endopeptidase-inhibierende Wirkung. Insbesondere im Falle des Poststatins und verwandten Verbindungen davon mit der Formel (I), worin Y -D-Leucin, -D-Leucyl-Valin oder ein Esterradikal davon ist, wird beobachtet, daß diese Verbindungen eine hohe Prolylendopeptidase-inhibierende Wirkung aufweisen. Im Falle der Poststatinderivate der Formel (I), worin X ein Valyl-Valylradikal ist, dessen terminales Aminoradikal wahlweise geschützt ist, R&sub1; ein Ethylradikal ist, und Y ein L-Leucyl-Valinradikal, ein Glycyl-Valinradikal oder ein korrespondierendes Esterradikal ist, besitzen sie eine hohe Cathepsin-B-inhibierende Wirkung.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen eine niedrige Toxizität. Im Falle von Mäusen ist der LD&sub5;&sub0; (i. v.) von Poststatin mindestens 200 mg/kg. Daher wird erwartet, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung nützlich sind z. B. als Arzneimittel zur Behandlung von Amnesie und Autoimmunerkrankungen, einschließlich systemischem Erythematosus und ähnlichem.
  • Poststatin und verwandte Verbindungen oder Salze davon können gewöhnlich oral oder parenteral z. B. intravenös, subkutan und intramuskulär verabreicht werden. Die Dosis variiert abhängig vom Zustand des Patienten, der Verabreichungsweise etc. Gewöhnlich beträgt die Dosis 0,5-200 mg/kg/Tag, bevorzugt 1-100 mg/kg/Tag.
  • Die aktiven Verbindungen können in der Form von konventionellen Formulierungen verabreicht werden. Im Falle der oralen Verabreichung können Tabletten, Granulate, Kapseln etc. verwendet werden. Im Falle der parenteralen Verabrei chung können z. B. Formulierungen für die Injektion verwendet werden, die gewöhnlich mit physiologischer Natriumchloridlösung, Auflösungsmitteln, etc. hergestellt werden.
  • In der vorliegenden Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen verwendet.
  • Val: Valin;
  • Pro: Prolin;
  • Asp: Asparaginsäure;
  • Phe: Phenylalanin
  • Leu: Leucin;
  • Gly: Glycin;
  • Lys: Lysin;
  • Thr: Threonin;
  • Z: Benzyloxycarbonyl;
  • Boc: t-Butoxycarbonyl;
  • PB: Penylbutanoyl;
  • PP: Phenylpropionyl;
  • PA: Phenylacetyl;
  • Bz: Benzoyl;
  • QBZl: Benzylester;
  • OBut: t-Butylester;
  • OMe: Methylester;
  • Fmoc: 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl;
  • HOBt: 1-Hydroxy-benzotriazol;
  • EtAhp: 3-Amino-2-hydroxy-pentansäure.
  • Die vorliegende Erfindung wird im folgenden durch die Beispiele detailliert erläutert.
    • Beispiel 1 Biologische Herstellung des Poststatins (Verbindung 1) unter Verwendung des Poststatin-erzeugenden Mikroorganismus
  • Als Kulturmedium für die anfängliche Kultivierung und für die Kultivierung im großen Maßstab wurde ein Kulturmedium verwendet, das 1,0% Bactosoytone, 2,0% Gahactose, 0,5% Getreideeinweichflüssigkeit, 2,0% Dextrin, 0,2% Ammoniumsulfat und 0,2% Calciumcarbonat enthielt. Vor der Sterilisierungsoperation wurde das Medium auf pH 7,4 eingestellt.
  • 110 ml des Start-Kulturmediums wurden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und der Sterilisationsbehandlung bei 120ºC für 20 Minuten unterworfen. Das Kulturmedium wurde mit 1 bis 2 Platinösenvolumen von Streptomyces viridochromogenes EM534-30F3 (FERM P-9446), die in einer Schrägkultur gezüchtet worden waren, inokkuliert.
  • Jeder der anderen 500 ml Kolben wurden mit 110 ml des Produktionsmediums beladen, das für 120ºC für 20 Minuten sterilisiert worden war. Das Produktionsmedium wurde mit 2 ml des Keimmediums inokkuliert und eine Rüttelkultivierung wurde bei 27ºC für 4 Tage durchgeführt. Nach der Kultivierung wurde filtriert von Diatomenerde als Filterhilfsmittel unter Verwendung, so daß ein Feststoff-enthaltender Rückstand und ein Filtrat (das Kultivierungsfiltrat) erhalten wurden.
  • 12,5 l des Kultivierungsfiltrates wurden auf pH 5 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt. Anschließend wurde das Kultivierungsfiltrat durch eine Kolonne, die mit 1 Liter eines kommerziellen Adsorptionsharzes "Diaion HP-20" gepackt war, gegeben, dann mit Wasser gewaschen und der Eluierungsoperation mit 80%igem Methanol (2 l) unterworfen. Das resultierende Eluat, das die aktiven Bestandteile enthaltenden Fraktionen beinhaltete, wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 8 g eines Poststatin enthaltenden braunen pulverförmigen Produktes erhalten wurden.
  • Das resultierende Pulver wurde mit einer kleinen Menge Methanol vermischt und die die lösliche Komponente enthaltende Lösung, die so erhalten wurde, wurde der Chromatographie unterworfen, wobei eine 1 L (Liter)-Kolonne, die mit "Sephadex LH-20" (Pharmacia Co., Ltd.) gefüllt war, und Methanol als Elutionsmittel verwendet wurde. Fraktionen, die jeweils 15 g Gewicht hatten, wurden erhalten. Die aktiven Fraktionen Nr. 20-27 wurden unter vermindertem Druck eingeengt, so daß 1,5 g eines hellbraunen Pulvers erhalten wurden.
  • Das zuvor erwähnte Pulver wurde in einer kleinen Menge von 22%igem Acetonitril gelöst und der Umkehrphasen-Silikagelsäulenchromatographie unter Verwendung einer 1 L-Kolonne, die mit 22%igem Acetonitril und einem Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel ("YMC-Gel ODS60A 60/200 mesh", hergestellt durch Koyama Kagaku Kenkyusho Co., Ltd.) gefüllt war, unter Verwendung von 22%igem Acetonitril als Elutionsmittel unterworfen. Fraktionen, die jeweils ein Gewicht von 15 g hatten, wurden erhalten. Die aktiven Fraktionen Nr. 30-80 wurden unter vermindertem Druck eingeengt, so daß 200 mg eines Poststatin enthaltenden gelben Pulvers erhalten wurden.
  • Das so erhaltene Pulver wurde in 4 ml einer Pufferlösung A gelöst, die Acetonitril-5%iges Kaliumacetat und 1% Zitronensäuremonohydrat (9. 4) enthielt. Die resultierende Lösung wurde unter Verwendung eines Millipore-Filters ("FILTER UNITMILLEX-SE", 0,5 mm, hergestellt durch Millipore Co., Ltd.) filtriert, und das Filtrat wurde einer Reinigungsoperation mit Hilfe einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeits-Chromatographie ("Nucleosil&sub5;-C&sub1;&sub8;-Kolonne", 20 φ · 300 mm, hergestellt durch Senshu Kagaku Co., Ltd.) unterworfen. Ein Mischung von Acetonitril und einer Pufferlösung A (9 : 41) wurde als mobile Phase bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min verwendet. Fraktionen, die jeweils ein Volumen von 8 ml aufwiesen, wurden erhalten. Die aktiven Fraktionen Nr. 52 -60 wurden destilliert, um das Acetonitril daraus zu entfernen, und dann mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 200 ml verdünnt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde über eine Kolonne (920 ml), die mit "Diaion HP-20" gefüllt war, gegeben, die mit Wasser equilibriert war. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen, und die Elution wurde mit 80%igem Methanol durchgeführt. Das Elutionsmittel, das die aktiven Fraktionen enthielt, wurde unter vermindertem Druck eingeengt, um 20 mg eines hellgelben Pulverproduktes zu ergeben, das Poststatin enthielt.
  • Das so erhaltene Poststatin enthaltende Pulver wurde in einer kleinen Menge mit Methanol gelöst und die resultierende Lösung wurde bei 4ºC für 20 Tage stehengelassen. Der so gebildete Niederschlag wurde durch Filtration mit einem Glasfilter abgetrennt, so daß 15 mg reines Foststatin als weißes Pulver erhalten wurde, das einen Schmelzpunkt von 169-171ºC aufwies. Das Infrarotspektrum, das H-kernmagnetische Resonanzspektrum des reinen Poststatins sind in den Fig. 1, 2, 3 gezeigt.
    • Referenzbeispiel 1 Synthese von Boc-D-leucyl-L-valinbenzylester
  • 0,749 g (3,00 mmol) Boc-D-Leucinmonohydrat, 1,252 g (3,30 mmol) L-Valin-benzylester-p-toluolsulfonat und 0,811 g (6,00 mmol) N-Hydroxybenzotriazol wurden in 15 ml Dichlormethan gelöst. Die resultierende Mischung wurde mit Eis gekühlt und mit 0,504 ml (3,60 mmol) Triethylamin und 1,108 g (4,20 mmol) 87%igem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidperchlorat vermischt. Die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden gerührt und dann weiter bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurden 30 ml Wasser und 5 ml einer 1%igen wäßrigen Zitronensäurelösung zur Reaktionsmischung gegeben. Die so abgeschiedenen Kristalle wurden abfiltriert. Die organische Schicht wurde nacheinander mit 20 ml Wasser, 20 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und 10 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wodurch 1,390 g eines Boc-D- Leucyl-L-valinbenzylester-Rohproduktes als weiße Kristalle erhalten wurden.
  • Als nächstes wurde das kristalline Rohoprodukt durch Säulenchromatographie (Silikagel, Ethylacetat: Hexan (5 : 2)) gereinigt, so daß 1,233 g Boc-D-Leucyl-L-valin-benzylester als weiße Kristalle erhalten wurden. Ausbeute: 97,8%; Smp.: 82,0-83,000; [α]D + 35,1º; [α]²&sup9;D + 76,6º (c 1,02, Chloroform).
  • ¹H-NMR (CDCl3)
  • δ. 0.85, 0.92(d, d, 3H, 3H, J = 7 Hz, CH&sub3;);
  • 0.90, 0.98(d, d, 3H, 3H, J = 2.7 Hz, ch&sub3;);
  • 1.36-1.54(m, 10H, (CH&sub3;)&sub3;COCO, (CH&sub3;)&sub2;CH-CHaHb);
  • 1.62-1.76 (m, 2H, (CH&sub3;)&sub2;CH-CHaHb);
  • 2.14-2.27 (m, 1H, (CH&sub3;)&sub2;CHCH);
  • 4.14 (br, 1H, NHCHCONH);
  • 4.57 (dd, 1H, J = 9.2, 4.2 Hz, CONHCHCOO);
  • 4.79(br, 1H, NH);
  • 5.13, 5.19 (d, d, 1H, 1H, J = 12.0 Hz, CH&sub2;Ph);
  • 6.68 (br, 1H, NH);
  • 7.29-7.40(m, 5H, pH).
    • Referenzbeispiel 2 Synthese von Boc-D-Leucyl-L-valinbenzylester
  • Die Verfahren, die in Referenzbeispiel 1 gezeigt sind, wurden wiederholt, ausgenommen, daß 0,693 g (6,02 mmol) N- Hydroxysuccinsäureimid anstelle von N-Hydroxybenzotriazol verwendet wurde. Boc-D-Leucyl-L-valinbenzylester wurde in einer Menge von 0,710 g erhalten.
    • Referenzbeispiel 3 Synthese von Threo(2R,3S), (2S,3R)-3-(p-Methoxybenzyloxycarbonyl)amino-2-hydroxypentansäure
  • 5,99 g (45,0 mmol) Threo (2R,3S), (2S,3R)-3-amino-2- hydroxy-pentansäure wurden mit 15,07 g (49,5 mmol S-4,6- Dimethylpyrimidin-2-yl-thiol-carbonsäure-p-methoxybenzyl- ester, 25 ml Wasser, 25 ml Dioxan und 9,45 ml (67,5 mmol) Triethylamin gemischt, und die resultierende Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 65 ml Wasser vermischt, und zweimal mit 100 ml Ethylacetat gewaschen. Die wäßrige Schicht wurde in einem Eisbad gekühlt und mit 22 ml 5N Salzsäure vermischt, um den pH auf 2 einzustellen. Die wäßrige Schicht wurde einmal mit 65 ml Ethylacetat extrahiert und dann zweimal mit 30 ml Ethylacetat. Die Ölschicht wurde dreimal mit 50 ml 5%iger Salzsäure und zweimal mit 50 ml gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. 9,65 g Threo(2R, 3S), (2S,3R)-3-(p-Methoxybenzyloxycarbonyl)amino-2-hydroxypentansäure wurden erhalten. Ausbeute 72,1%.
  • Das Ausgangsmaterial, nämlich Threo-3-amino-3-hydroxypentansäure kann durch ein Verfahren hergestellt werden, worin optisch inerte 3-Amino-2-hydroxypentansäure in einem Ethanol-Wasser-Lösungsmittel gelöst wird, und die Threo-Form aus der Erythro-Form unter Verwendung der Löslichkeitsdifferenz abgetrennt wird.
    • Referenzbeispiel 4 Synthese von Erythro(2R,3S), (2S,3R)-3-(p-methoxybenzyloxycarbonyl)amino-2-hydroxy-pentansäure
  • Die Verfahren von Referenzbeispiel 3 wurden wiederholt, ausgenommen, daß 5,99 g (45,0 mmol) Erythro (2R,3S), (2S, 3R)-3-amino-2-hydroxy-pentansäure anstelle von Threo(2R,3S), (2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-pentansäure, die in Referenzbeispiel 3 verwendet wurde, angewendet wurde. 10,76 g Erythro- (2R,3S), (2S,3R)-3-(p-methoxy-benzyloxycarbonyl)amino-2- hydroxy-pentansäure wurden erhalten.
    • Referenzbeispiel 5 Synthese von Z(OMe)-(2R,3S)-3-Amino-2-hydroxy-pentanoyl-D- leucyl-L-valin-benzylester
  • 189,2 mg (0,450 mmol) Boc-D-leucyl-L-valin-benzylester wurden mit 2 ml Trifluoressigsäure vermischt. Die so erhaltene Mischung wurde bei Raumtemperatur für 40 Minuten gerührt und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit 2 ml Toluol vermischt, und die resultierende Lösung wurde destilliert, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen. Die Mischungs-Destillationsoperation wurde zweimal wiederholt, so daß D-Leucyl-L-valin-benzylester-trifluoracetat als weiße Kristalle erhalten wurde.
  • Diese Verbindung wurde mit 133,8 mg (0,450 mmol) (2R, 3S)-3-(p-Methoxy-benzyloxycarbonyl)amino-2-hydroxy-pentansäure, 91,2 mg (0,675 mmol) N-Hydroxybenzotriazol und 2 ml DMF gemischt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt und mit 50,4 ml (0,450 mmol) N-Methylmorpholin und 148,3 mg (0,563 mmol) 97%igem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidperchlorat vermischt, für 2 Stunden gerührt und weiter bei Raumtemperatur über Nacht gerührt.
  • Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 30 ml Dichlormethan verdünnt, nacheinander mit 10 ml 1 %iger wäßriger Zitronensäurelösung, 10 ml Wasser, 10 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und 10 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel davon zu entfernen. 316,5 mg rohes Z(OMe)-(2R,3S)-3-Amino-2-hydroxy-pentanoyl-D- leucyl-L-valinbenzylester wurden als Öl erhalten. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Silikagel, Ethylacetat. Hexan (5 : 1)) gereinigt, so daß 197,6 mg Z(OMe)- (2R,3S)-3-Amino-2-hydroxy-pentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester als weiße Kristalle erhalten wurden. Ausbeute: 73,2%; Smp.: 115,0-115,5ºC; [α]²&sup5;D + 45,5º; [α]²&sup5;346 + 102,9º (c 1,04 Chloroform).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;)
  • δ 0.80-1.04 (m, 15H, CH&sub3;x5);
  • 1.51-1.80 (m, 5H, CH&sub2;x2, CH(Leu));
  • 2.19 (m, 1H, CH(Val));
  • 3.70-3.85 (m, 4H, CH&sub3;O, CH(EtAhp));
  • 4.12 (dd, 1H, J = 6.4, 3.0 Hz, CHOH);
  • 4.52 (dd, 1H, J = 8.4, 4.8 H&sub2;, CH(Val));
  • 4.49 (m, 1H, CH(Leu));
  • 4.61 (br d, 1H, J = 6.4 Hz, OH);
  • 4.98(s, 2H, CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;);
  • 5.08, 5.18(d, d, 2H, J = 12.4 Hz, CH&sub2;Ph);
  • 5.31 (br, d, 1H, J = 8.4 Hz, NH(EtAhp));
  • 6.79 (br, d, 1H, J = 8.4 Hz, NH(Val));
  • 6.84-6.92 (m, 2H, C&sub6;H&sub4;);
  • 7.07(br, d, 1H, J = 8.4Fz, NH(Leu));
  • 7.22-7.40(m, 7H, C&sub6;H&sub4;, Ph).
  • Das Ausgangsmaterial, nämlich (2R,3S)-3-(p-Methoxybenzyloxycarbonyl)-amino-2-hydroxypentansäure kann hergestellt werden durch ein Verfahren, worin die Threo-Form, die in Beispiel 3 gezeigt ist, mit (-)-1-(1-Naphthyl)ethylamin vermischt wird, die resultierende Mischung mit Ethanol unter Erwärmen gelöst wird, die so gebildete Lösung bei Raumtemperatur stehengelassen wird, um eine kristalline Substanz auszufällen, die dann durch Filtration abgetrennt wird. Die kristalline Substanz wird gereinigt und umkristallisiert und mit 0,5N Salzsäure zersetzt. Das Zersetzungsprodukt wird mit Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen, so daß die oben erwähnte Ausgangsverbindung erhalten wird.
    • Referenzbeispiel 6 Synthese von Boc-L-valyl-(2R,3S)-3-amino-2-hydroxy-pentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester
  • Zu 190,2 mg (0,317 mmol) Z(OMe)-(2R,3S)-3-Amino-2- hydroxy-pentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester wurden 0,1 ml Anisol und 2 ml Trifluoressigsäure gegeben. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur für 40 Minuten gerührt und destilliert, um das Lösungsmittel davon zu entfernen. Der Rückstand wurde mit 2 ml Toluol vermischt und destilliert, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen. Die Mischungs/Destillationsoperation, die oben erwähnt ist, wurde zweimal durchgeführt, wobei 243,6 mg (2R,3S)-D-Leucyl-L-valinbenzylestertrifluoracetat erhalten wurden.
  • 219,2 mg (ungefähr 0,285 mmol) des so erhaltenen Salzes wurden mit 65,4 mg (0,301 mmol) Boc-L-valin, 58,1 mg (0,430 mmol) N-Hydroxylbenzotriazol und 2 ml DMF vermischt, um eine Lösung zu bilden. Die Lösung wurde mit Eis gekühlt und mit 32 ml (0,286 mmol) N-Methylmorpholin und 94,0 mg (0,357 mmol) 97%igem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidperchlorat vermischt. Die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden gerührt und weiter bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 30 ml Dichlormethan verdünnt, nacheinander mit 10 ml 1%iger wäßriger Zitronensäurelösung, 10 ml Wasser, 10 ml gesättigter wäßriger Natronhydrogencarbonatlösung und 10 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. 520,8 mg rohes Boc- L-valyl-(2R,3S)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester wurden als Öl erhalten.
  • Das rohe Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Silikagel, Dichlormethan. Methanol (24 : 1)) gereinigt, so daß 149,7 mg Boc-L-valyl-(2R,3S)-3-amino-2-hydroxy-pentanoyl-D- leucyl-L-valinbenzylester als weiße Kristalle erhalten wurden. Ausbeute: 82,8%; Smp.: 167,0-168ºC; [α]²&sup6;D + 35,7º;
  • [α]²&sup6;&sub4;&sub3;&sub6; + 81,0º(c 1,00, Chloroform).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;)
  • δ 0.80-1.03(m, 21H, CH&sub3;x7)
  • 1.44 (S, 9H(CH&sub3;)&sub3;COCO);
  • 1.52-1.90 (m, 5H, CH&sub2;x2, CH(Leu));
  • 2.11 (m, 1H, CH(Val));
  • 2.19 (m, 1H, CH(Val)),
  • 3.87 (m, 1H, CHNH(EtAhp));
  • 3.93 (dd, 1H, J = 5.8, 5 Hz, CH(Val));
  • 4.10 (dd, 1H, J = 3.4, 7.0 Hz, CHOH);
  • 4.36 (m, 1H, CH(Leu);
  • 4.58 (dd, 1H, J = 5.0, 6 Hz, CH(Val));
  • 5.09 (br, 1H, NH(Val));
  • 5.10, 5.20 (d, d, 2H, J = 12.2 Hz, CH&sub2;Ph);
  • 5.36 (br, 1H, OH);
  • 6.98 (br, d, 1H, J = 8.6 Hz, NH(Val));
  • 7.04 (br, d, 1H, J = 8.4 Hz, NH(EtAhp));
  • 7.20 (br, d, 1H, J = 8.4 Hz, NH(Leu));
  • 7.30-7.40 (m, 5H, pH).
    • Referenzbeispiel 7 Synthese von Z-L-Valyl-L-valyl-(2R,3S)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester
  • 145,0 mg (0,228 mmol) Boc-L-valyl-(2R,3S)-3-amino-2- hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valin-benzylester wurden mit 2 ml Trifluoressigsäure vermischt. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur für 40 Minuten gerührt und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit 2 ml Toluol vermischt, und dann wurde das Lösungsmittel abdestil liert. Die Mischungs-/Destillationsoperation wurde zweimal durchgeführt um L-Valyl-(2R,3S)-3-amino-2-hydroxy-pentanoyl- D-leucyl-L-valinbenzylestertrifluoracetat als weiße Kristalle zu ergeben.
  • Das so erhaltene Salz wurde mit Ethylacetat vermischt, um 10 ml einer Mischung zu erhalten. 1 ml dieser Mischung wurden als Probe entnommen und die verbleibende Mischung wurde destilliert, um das Lösungsmittel davon zu entfernen.
  • Der Rückstand (0,206 mmol) wurde mit 54,8 mg (0,218 mmol) Z-L-Valin, 42,4 mg (0,314 mmol) N-Hydroxylbenzotriazol und 1,5 ml DMF vermischt, um eine Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde mit Eis gekühlt, und mit 32 ml (0,206 mmol) N- Methylmorpholin und 68,0 mg (0,258 mmol) 97%igem 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimidperchlorat vermischt. Die resultierende Rekationsmischung wurde für 2 Stunden gerührt und weiter bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 15 ml Dichlormethan verdünnt, nacheinander mit 7 ml 1%iger wäßriger Zitronensäurelösung, 7 ml Wasser, 7 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und 7 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. 277,9 mg rohes Z-L-Valyl-L-valyl-(2R,3S)-3-amino-2- hydroxy-pentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester wurden als amorphe Substanz mit partiell kristallinen Anteilen erhalten.
  • Die so hergestellte Rohsubstanz wurde durch Säulenchromatographie (Silikagel, Dichlormethan. Methanol (40 : 1)) gereinigt, um 125,9 mg Z-L-Valyl-L-valyl-(2R,3S)-3-amino-2- hydroxy-pentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester als weiße Kristalle zu ergeben. Ausbeute: 79,7%; Smp.: 222,0- 223,0ºC; [α]²&sup7;D + 9,2º; [α]²&sup7;&sub4;&sub3;&sub6; + 24,4º (c 1,01, Chloroform).
  • SI-MS: m/Z768(M+l+); 790(M+Na+).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;)
  • δ 0.76-1.00 (m, 27H, CH&sub3;x9);
  • 1.37 (m, 1H, CH&sub3;-CHaHb);
  • 1.53-1.85 (m, 4H, (CH&sub3;)&sub3;CHCH&sub2;, CH&sub3;HaHb)
  • 1.93-2.10 (m, 2H, CHx2(Val));
  • 2.17 (m, 1H, CH(Val));
  • 4.13-4.27 (m, 2H, NHCHCH(OH)CO);
  • 4.41-4.64 (m, 4H, CHz3(Val), CH(Leu));
  • 5.06, 5.15 (d, d, 2H, J = 12.0 Hz, COOCH&sub2;Ph);
  • 5.06, 5.09 (d, d, 2H, J = 12.0 Hz, PhCH&sub2;OCHO);
  • 5.49 (br, s, 1H, OH);
  • 5.86 (br, 1H, NH(Val));
  • 7.09 (br, 1H, NH(Val));
  • 7.22 (br, 1H, NH(EtAhp));
  • 7.22-7.39 (m, 10H, Phx2);
  • 7.45 (br, d, 1H, J = 7.8 Hz, NH(Leu));
  • 7.94-8.23 (br, 1H, NH(Val)).
    • Beispiel 2 Synthese von 2-L-Valyl-L-valyl-(3S)-3-amino-2-oxopentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester (Verbindung 2).
  • 106,8 mg (0,141 mmol) Z-L-Valyl-L-valyl-(2R,3S)-3- amino-2-hydroxy-pentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester wurden mit 19,9 mg (0,103 mmol) Pyridintrifluoracetat, 116,2 mg (0,441 mmol) 97%igem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidperchlorat, 0,5 ml DMSO und 2 ml Benzol vermischt, um eine Lösung zu bilden, die dann bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt wurde. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 15 ml Ethylacetat verdünnt, mit 5 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, so daß der rohe Z-L-Valyl-L-valyl-(3S)-3-amino-2-oxo-pentanoyl-D- leucyl-L-valinbenzylester als partiell erstarrte Substanz zu erhalten wurde.
  • Das Rohprodukt wurde durch Dünnschichtchromatographie (Silikagel, Dichlormethan : Methanol (15 : 1) gereinigt, um 63,2 mg Z-L-Valyl-L-valyl-(3S)-3-amino-2-oxo-pentanoyl-D- leucyl-L-valinbenzylester zu ergeben. Ausbeute: 58,6%; Smp.: 201,0-202,0ºC; [α]²&sup6;D + 8,4º; [α]²&sup6;&sub4;&sub3;&sub6; + 50,3º (c 0,90, Chloroform).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;)
  • δ 0.77-1.04 (m, 27H, CH&sub3;x9);
  • 1.50-1.85 (m, 4H, CH&sub2;CH, CH&sub3;-CH&sub3;Hb);
  • 2.00 (m, 1H, CH&sub3;-CHaHb);
  • 2.05-2.25 (m, 3H, CHx3(Val));
  • 4.06 (m, 1H, CH(Val));
  • 4.32 (dd, 1H, J = 7.4 Hz 8.6 Hz, CH(Val));
  • 4.47-4.63 (m, 2H, CH(Val), CH(Leu));
  • 5.08, 5.16 (d, d, 2H, J = 12.0 Hz, CH&sub2;-Ph);
  • 5.10, 5.11 (d, d, 2H, CH&sub2;-Ph);
  • 5.34 (ddd, 1H, J = 4.8, 8.2, 8.2 Hz, CH(EtAop));
  • 5.57 (br, d, 1H, J = 8.6 Hz, NH(Val));
  • 6.69 (br, d, 1H, J = 8.6 Hz, NH(Val));
  • 6.74 (br, d, 1H, J = 9.1 Hz, NH(Val));
  • 6.86 (br, d, 1H, J = 8.2 Hz, NH(EtAop));
  • 7.25-7.40 (m, 10H, Phx2);
  • 7.48 (br, d, 1H, J = 8.8 Hz, NH(Leu)).
    • Beispiel 3 Synthese von Poststatin(L-valyl-L-valyl-(3S)-3-amino-2- oxo-pentanoyl-D-leucyl-L-valyl) (Verbindung 1).
  • 46,8 mg (0,061 mmol) Z-L-Valyl-L-valyl-(3S)-3-amino-2- oxo-pentanoyl-D-leucyl-L-valinbenzylester wurden mit 6,6 mg Palladiummohr und 12 ml Methanol vermischt. Die so gebildete Reaktionsmischung wurde der katalytischen Reduktionsreaktion unter Wasserstoffatmosphäre für 20,5 Stunden unterworfen. Nachdem der Katalysator abfiltriert worden war, wurde das Filtrat destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, so daß 40,0 mg eines weißen kristallinen Materials erhalten wurden.
  • 39,7 mg des so erhaltenen weißen Materials wurden der HPLC-Operation unterworfen (Kolonne: "CAPCELL PAK C18", hergestellt durch Shiseido Co., Ltd., 20 · 250 mm; Elutionsmittel: wäßrige Lösung von I %iger Zitronensäure und 0,65%- igem Kaliumacetat/Acetonitril (8 : 2); Fließgeschwindigkeit: 8 ml/min.; Nachweis Wellenlänge: 254 nm), so daß das gewünschte Produkt vom nichtumgesetzten Material und partiell epimerisierter Substanz, d. h. L-Valyl-L-valyl-(3R)-3-amino-2- hydroxy-pentanoyl-D-leucyl-L-valin abgetrennt wurde. Durch diese Operation wurde eine Fraktion, die L-Valyl-L-valyl- (3S)-3-amino-2-hydroxy-pentanoyl-D-leucyl-L-valin enthielt, isoliert. Diese Fraktion wurde bei 25ºC eingeengt, und die konzentrierte Lösung wurde einer Behandlung mit "CHP20" Harz unterworfen, dann mit Wasser gewaschen und die Elutionsoperation wurde mit 80%igem Methanol durchgeführt. Das resultierende Eluat wurde destilliert, um das Lösungsmittel davon zu entfernen und durch Anwendung einer Vakuumpumpe über Nacht getrocknet, wodurch 15,2 mg Poststatin als weißliches Pulver erhalten wurden.
  • Aus den NMR-Daten wurde gefunden, daß das oben erwähnte Poststatinprodukt eine Verunreinigungsmenge enthielt, die von dem CHP-Harz herrührte. Daher wurden 5,1 mg des Poststatinproduktes erneut einer Behandlung CHP20 unterworfen und eine Elutionsoperation mit 55%igem wäßrigen Methanol durchgeführt. Die Eluatlösung wurde destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der feste Rückstand wurde durch Dekantieren abgetrennt, mit Ether gewaschen und durch Anwendung einer Vakuumpumpe getrocknet, um 2,4 mg gereinigtes Poststatin als weißes Pulver zu erhalten. Ausbeute: 21,7%.
  • SI-MS: m/z 542(M+l+).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;)
  • δ 0.70-0.95 (m, 27H, CH&sub3;x9);
  • 1.40-1.67 (m, 3H, CHaHbCH(Leu), CH&sub3;-CHaCHb);
  • 1.61 (m, 1H, CHaHbCH(Leu));
  • 1.76 (m, 1H, CH&sub3;-CHaHb);
  • 1.86-2.10 (m, 3H, CH(Val));
  • 3.20 (m, 1H, CH(Val));
  • 4.06 (m, 1H, CH(Val));
  • 4.27 (m, 1H, CH(Val));
  • 4.95 (m, 1H, CHCOCO);
  • 7.98 (br, d, 1H, J = 8.4 Hz, NH(Val));
  • 8.10 (br, d, 1H, J = 8.9 Hz, NH(Val));
  • 8.36 (d, 1H, J = 6.6 Hz, NH(EtAop));
  • 8.56 (d, 1H, J = 8.7 Hz, NH(Leu)).
  • Weiterhin wurde ein breiter Peak in der Position (δ) von 2,80-3,90 beobachtet, infolge der Anwesenheit von Wasser (einschließlich der Amino- und Carboxyl-Radikale).
    • Referenzbeispiel 8 Synthese von Z-D-Leucyl-L-valin-t-butylester
  • 1,000 g (3,77 mmol) Z-D-Leucyn, 0,719 g (3,43 mmol) L- Valin-t-butylesterhydrochlorid und 0,927 g (0,600 mmol) N- Hydroxylbenzotriazol wurden in 17 ml Dichlormethan gelöst. Zur resultierenden Lösung wurde 0,530 ml Triethylamin gegeben und 1,265 g (4,80 mmol) 97%iges 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl)carbodiimidperchlorat unter Eiskühlung hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden gerührt und weiter bei Raumtemperatur für 14 Stunden gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung nacheinander mit 7 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, 7 ml Wasser, 7 ml 1%iger wäßriger Zitronensäurelösung und 7 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel davon zu entfernen, wodurch 1,932 g rohes Z-D-Leucyl-L-valin-t-butylester als Öl erhalten wurden.
  • Dann wurde das Rohprodukt mit einer Säulenchromatographie (Silikagel; Dichlormethan. Methanol (400 : 3)) gereinigt, so daß 1,267 g gereinigter Z-D-Leucin-L-valin-t-butylester erhalten wurden. Ausbeute: 87,9%; [α]²&sup8;&sub4;&sub3;&sub6; + 66,3º; [α]²&sup8;D + 31,1º (c 1,06, Chloroform).
    • Referenzbeispiel 9 Synthese von Erythro(2R,3R), (2S,3S)-Z(OMe)-3-amino-2- hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valin-t-butylester
  • Zu 503,9 mg (1,198 mmol) Z-D-Leucyl-L-valin-t-butylester wurden 51,2 mg Palladiummohr und 5 ml Methanol gegeben. Eine katalytische Reduktionsreaktion wurde in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 3 Stunden durchgeführt. Der Katalysator wurde durch Filtration abgetrennt, und das Filtrat wurde destilliert, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen, so daß D-Leucyl-L-valin-t-butylester als Öl erhalten wurden. Diese Esterverbindung wurde mit 391,1 mg (1,318 mmol) Erythro(2R,3R), (2S,3S)-3-(p-methoxy-benzyloxycarbonyl)amino-2-hydroxypentansäure, 324,1 mg (2,399 mmol) N- Hydroxylbenzotriazol und 8 ml Dichlormethan vermischt. Die so gebildete Lösung wurde mit 442,1 mg (1,677 mmol) 97%igem 1- Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidperchlorat unter Kühlen mit Eis vermischt, für 2 Stunden gerührt und weiter bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung nacheinander mit 8 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, 8 ml Was ser, 8 ml 1%iger wäßriger Zitronensäurelösung und 8 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, so daß 728,1 mg rohen Erythro(2R,3R), (2S,3S)-Z(OMe)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valin-t-butylester als Gel zu erhalten. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Silikagel, Dichlormethan; Methanol (100 : 1)) gereinigt, um 666,6 mg gereinigten Erythro(2R,3R), (2S,3S)-Z(OMe)-3-amino-2- hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valin-t-butylester als amorphes festes Material zu ergeben. Ausbeute: 98,4%.
  • SI-MS: m/z 566 (M+1+).
    • Referenzbeispiel 10 Synthese von Z-L-Phenylalanyl-(2RS,3RS)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valin-t-butylester
  • 340,9 mg (0,603 mmol) Erythro(2R,3R), (2S,3S)- Z(OMe)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valin-t-butylester wurden in 4 ml Methanol gelöst. Zur resultierenden Lösung wurden 50,7 ml Palladiumohr auf solche Weise hinzugegeben, daß die Gesamtmenge des Katalysators in drei Portionen geteilt war, die portionsweise zu der Lösung in Intervallen von mehreren Stunden hinzugegeben wurden. Die katalytische Reduktionsreaktion wurde in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 32 Stunden durchgeführt. Nach Abschluß der Reaktion wurde der Katalysator durch Filtration abgetrennt, das Filtrat entfernt, um das Lösungsmittel zu entfernen, so daß Erythro(2R,3R), (2S,3S)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D- leucyl-L-valin-t-butylester erhalten wurden.
  • Die Hälfte der Menge der Esterverbindung, die so hergestellt wurde, wurde mit 100,8 mg (0,337 mmol) Z-L-Phenylalanin, 81,9 mg (0,606 mmol) N-Hydroxybenzotriazol und 10 ml Dichlormethan vermischt. Die resultierende Lösung wurde mit Eis gekühlt und mit 111,3 mg (0,422 mmol) 97%igem 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid vermischt, für 2 Stunden gerührt und weiter bei Raumtemperatur für 8 Stunden gerührt. Nachdem weiter 2,0 ml DMF hinzugegeben worden waren, wurde die Reaktionsmischung für 22,5 Stunden gerührt, nacheinander mit 9 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung, 9 ml Wasser, 9 ml 1%iger Zitronensäurelösung und 9 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wodurch 255,6 mg rohes Z-L-Phenylalanin-(2RS,3RS)-3-amino-2-hydroxypentanoyl- D-leucyl-L-valin-t-butylester als Öl erhalten wurden. Das Rohprodukt wurde im nächsten Reaktionsschritt ohne weitere Reinigung eingesetzt.
    • Beispiel 4 Synthese von Z-L-Phenylalanyl-(RS)-3-amino-2-oxo-pentanoyl-D- leucyl-L-valin-t-butylester (Verbindung 3).
  • 255,6 mg des rohen Z-L-Phenylalanyl-(2RS,3RS)-3-amino- 2-hydroxypentanoyl-D-leucyl-L-valin-benzylester, gezeigt in Referenzbeispiel 10, wurden mit 25, 8 mg (0,134 mmol) Pyridintrifluoracetat, 211,6 mg (0,803 mmol) 97%igem 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimidperchlorat, 0,65 ml DMSO und 2 ml Toluol vermischt. Die so erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die gelbe Reaktionsmischung mit 6,5 ml Ethylacetat verdünnt, mit 7 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, so daß 244,4 mg rohes Z-L-Phenylalanyl- (RS)-3-amino-2-oxopentanoyl-D-leucyl-L-valin-t-butylester als amorphen Feststoff zu erhalten. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Silikagel, Dichlormethan. Methanol (100. 1)) gereinigt, um 113,7 mg des gereinigten Z-L-Phenylalanyl-(RS)-3-amino-2-oxopentanoyl-D-leucyl-L-valin-tbutylester zu erhalten. Ausbeute: 63,5%.
  • SI-MS: m/z 681 (M+1+).
    • Beispiel 5 Synthese von Z-L-Phenylalanyl-(RS)-3-amino-2-oxopentanoyl-D- leucyl-L-valin (Verbindung 4).
  • 105,9 mg (0,156 mmol) Z-L-Phenylalanyl-(RS)-3-amino-2- oxopentanoyl-D-leucyl-L-valin-t-butylester wurden mit 2 ml Trifluoressigsäure vermischt. Die so gebildete Lösung wurde bei Raumtemperatur für 90 Minuten gerührt und destilliert, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen. Dann wurden 2 ml Toluol zur Lösung gegeben, die dann destilliert wurden, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen. Die Toluolzugabe/Destillations-Operation wurde zweimal durchgeführt, um 106,5 mg rohes Z-L-Phenylalanyl-(RS)-3-amino-2-oxopentanoyl-D-leucyl-L-valin als amorphen Feststoff zu ergeben. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie ("LH-20", Methanol) gereinigt. 70,5 mg des gereinigten Z-L-Phenylalanyl-(RS)-3-amino-2-oxopentanoyl- D-leucyl-L-valin wurden als partiell amorphe und partiell kristalline weiße Substanz erhalten. Ausbeute: 72,6%.
  • SI-MS: m/z 625 (M+1+); 647 (M+Na+).
    • Referenzbeispiel 11 Synthese von Z(OMe)-(2RS,3RS)-3-Amino-2-hydroxypentanoyl-D- leucin-t-butylester
  • 0,896 g (4,00 mmol) D-Leucin-t-butylesterhydrochlorid wurden mit 1,309 g (4,40 mmol) (2RS,3RS)-3-(p-Methoxy-benzyloxycarbonyl)amino-2-hydroxy-pentansäure, 1,081 g (8,00 mmol) N-Hydroxy-benzotriazol und 20 ml Dichlormethan vermischt. Die resultierende Lösung wurde mit Eis gekühlt, mit 0,62 ml (4,43 mmol) Triethylamin und 1,476 g (5,60 mmol) 97 %igem 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidperchlorat vermischt. Die Reaktionsmischung wurde für 2 Stunden gerührt und dann weiter bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung nacheinander mit 8 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung, 8 ml Wasser, 8 ml 1%iger wäßriger Zitronensäurelösung und 8 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na triumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, so daß 2,122 g des rohen Z(OMe)-(2RS,3RS)-3- Amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucin-t-butylesters als Gel erhalten wurden. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Silikagel, Dichlormethan. Methanol (100 : 1)) gereinigt, um 1,858 g des gereinigten Z(OMe)-(2RS,3RS)-3- Amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucin-t-butylesters als weiße Kristalle zu ergeben. Ausbeute: 99,6%.
  • IS-MS: m/z 467 (M+1+)
    • Referenzbeispiel 12 Synthese von Boc-L-valyl-(2RS,3RS)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucin-t-butylester
  • 303,9 mg (0,651 mmol) Erythro (2R,3R), (2S,3S)-Z-(OMe)- 3-amino-2-hydroxy-pentanoyl-D-leucin-t-butylester wurden in 4 ml Methanol gelöst.
  • 43,4 mg Palladiummohr wurde in drei Portionen geteilt, die dann portionsweise zur Reaktionsmischung in Intervallen von mehreren Stunden hinzugegeben wurden. Die katalytische Reduktionsreaktion wurde in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 15 Stunden durchgeführt. Danach wurde der Katalysator durch Filtration abgetrennt, und das Filtrat wurde destilliert, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen.
  • Erythro(2R,3R), (2S,3S)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D- leucin-t-butylester wurde erhalten.
  • Die so erhaltene Esterverbindung wurde mit 155,9 mg (0,718 mmol) Boc-L-valin, 176,1 mg (1,303 mmol) N-Hydroxylbenzotriazol und 3,5 ml Dichlormethan vermischt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde mit Eis gekühlt, mit 499,4 mg (2,605 mmol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid vermischt, für 2 Stunden gerührt und weiter bei Raumtemperatur für 16,5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 7 ml Dichlormethan verdünnt, nacheinander mit 6 ml 1%iger wäßriger Zitronensäurelösung, 6 ml Wasser, 6 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und 6 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel davon zu entfernen, so daß der rohe Boc-L-valyl-(2RS,3RS)-3-amino-2- hydroxypentanoyl-D-leucin-t-butylester als amorphes Material erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigungsoperationen im nächsten Reaktionsschritt eingesetzt.
    • Beispiel 6 Synthese von Boc-L-valyl-(RS)-3-amino-2-oxoypentanoyl-D- leucin-t-butylester (Verbindung 5).
  • 0,651 mmol Boc-L-valyl-(2RS,3RS)-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D-leucin-t-butylester wurden mit 69,5 (0,360 mmol) Pyridintrifluoracetat, 408,8 mg (1,982 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid, 1,3 ml DMSO und 2,5 ml Toluol vermischt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Nach Abschluß der, Reaktion wurde die gelbe Reaktionsmischung mit 10 ml Ethylacetat verdünnt. Der so gebildete Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration abgetrennt. Die organische Schicht wurde mit 10 ml Wasser verdünnt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wodurch eine ölige Substanz erhalten wurde. Die ölige Substanz wurde mit 5 ml Ethylacetat vermischt, wodurch eine weitere Menge von Dicyclohexylharnstoff auskristallisierte, die abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, so daß der rohe Boc-L-valyl-(RS)-3-amino-2-ooxypentanoyl-D-leucin-tbutylester erhalten wurde. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Silikagel; und (1) Dichlormethan. Methanol (100 : 1) und (2) Dichlormethan. Ethylacetat (12 : 1 bis 10 : 1)) gereinigt, um 178,2 mg Boc-L-valyl-(RS)-3-amino-2-oxopentanoyl-D-leucin-t-butylester als weiße Kristalle zu ergeben. SI-MS: m/z 534 (M+1+).
    • Referenzbeispiel 13 Synthese von (2R,3S)-3-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-amino- 2-hydroxypentansäure
  • 0,759 g (5,70 mmol) (2R,3S)-3-Amino-2-hydroxyperitansäure wurden mit einer Lösung von 1,199 g (14,28 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 20 ml Wasser und 20 ml Dioxan vermischt. Die resultierende Mischung wurde mit Eis gekühlt. Zu dieser Lösung wurde tropfenweise eine Lösung von 1,623 g (6,27 mmol) Chlorameisensäure-9-fluorenylmethylester in 10 ml Dioxan unter Kühlen mit Eis für 30 Minuten gegeben. Nach Abschluß der Zugabe wurde die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt mit 100 ml Wasser verdünnt und nacheinander mit 150 ml Ether und 75 ml Ether gewaschen. Zu der wäßrigen Schicht wurden 2,8 ml 6 N Salzsäure gegeben, um den pH auf 1,5 einzustellen. Dann wurde die wäßrige Schicht dreimal mit 50 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ölschicht wurde mit 50 ml gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, so daß 1,622 g der rohen (2R,3S)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)amino-2-hydroxypentansäure erhalten wurden.
  • Das Rohprodukt wurde mit 4 ml Ethylacetat und 4 ml n- Hexan vermischt, um Kristall zu bilden, die durch Filtration abgetrennt wurden, mit 2 ml Ethylacetat/n-Hexan (1 : 1) gewaschen und anschließend getrocknet wurden, um 0,999 g (2R, 3S)-3-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)amino-2-hydroxypentansäure als weiße Kristalle zu ergeben.
  • Smp.: 160-161,5ºC.
  • 0,999 g der so erhaltenen geschützten Aminosäuren wurden mit 4 ml Ethylacetat vermischt. Die resultierende Suspension wurde bei 50ºC für 40 Minuten gerührt und dann mit 4 ml n- Hexan vermischt, und die Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt. Die Kristalle wurden mit 2 ml Ethylacetat/n-Hexan (1 : 1) Lösung gewaschen und getrocknet, um 0,866 g (2R,3S)- 3-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)amino-2-hydroxypentansäure als weiße Kristalle zu ergeben. Umkristallisationsausbeute: 86,7%.
  • [α]²&sup6;D -30,2º [α]²&sup6;&sub4;&sub3;&sub6; -63,00 (c 1,01, Methanol): Smp.: 162- 162,5ºC; FAB-MS; m/z 356 (M+1+).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;)
  • δ 0.96(dd, 3H, J = 7.4, 7.4 Hz, CH&sub3;);
  • 1.69(m, 2H, CH&sub2;);
  • 3.25(br, COOH, OH);
  • 4.01(m, 1H, CHNH);
  • 4.18(dd, 1H, J = 6.6, 6.6 Hz, ArCHAr);
  • 4.24(br, s, 1H, CHOH);
  • 4.40, 4.41(d, d, 1H, 1H, J = 6.6, 6.6 Hz, ArC-HCHaHb);
  • 5.13(d, 1H, J = 9.6 Hz, NH);
  • 7.24-7.80(m, 8H, Ar).
  • Das Filtrat und die Waschflüssigkeit der oben erwähnten Kristallisationsoperation wurden destilliert, um 0,548 g eines amorphen Materials zu ergeben, das durch Säulenchromatographie gereinigt wurde (Silikagel; Chloroform: Methanol Essigsäure (95 : 5 : 1)), um weiter 0,307 g (2R,3S)-3-(9- Fluorenylmethoxycarbonyl)amino-2-hydroxypentansäure als weiße Kristalle zu ergeben.
    • Referenzbeispiel 14 Synthese von Boc-L-Val-L-Val-L-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D- Leu-L-val-Harz
  • 0,5 g Fmoc-L-Valyl-p-alkoxybenzylalkoholharz (das 0,345 mmol Valin enthielt) wurde in Dimethylformamid (3 · 6 ml, 1 Minute) gequellt. Dieses Harz war ein kommerzielles Produkt von Watanabe Chemical Co., Ltd.
  • Das gequellte Harz wurde 6 ml 20%igem Piperidin/DMF Mischung vermischt und die resultierende Mischung wurde für 3 Minuten gerührt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt worden war, wurde die oben erwähnte Piperidinbehandlung zweimal wiederholt mit der Maßgabe, daß das Rühren für 3 Minuten und 20 Minuten in der zweiten Behandlung und der dritten Behandlung durchgeführt wurde. Nachdem das Lösungsmittel entfernt worden war, wurde das Harz mit DMF (3 · 6 ml, 1 Minute) gewaschen und dann mit N-Methyl-pyrrolidon (3 · 6 ml, 1 Minute).
  • 366 mg (3 Äquivalente) Fmoc-D-Leu, 140 mg (3 Äquivalente) HOBt und 0,265 ml (3 Equivalente) Diisopropylcarbodiimid wurden in 6 ml N-Methyl-pyrrolidon gelöst. Die resultierende Lösung wurde zu dem Harz gegeben und für 3 Stunden gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das Harz in N- Methylpyrrolidon (3 · 6 ml, 1 Minute) gewaschen. Dann wurde das Lösungsmittel entfernt und das Harz wurde mit DMF (3 · 6 ml, 1 Minute) gewaschen.
  • Als nächstes wurde eine Piperidinbehandlung zur Entfernung der Schutzradikale in der gleichen Weise wie oben erwähnt durchgeführt. 386 mg Fmoc-3-Amino-2-hydroxy-pentansäure, 140 mg HOBt und 0,265 ml (3 Äquivalente) Diisopropylcarbodiimid wurden in 6 ml N-Methylpyrrolidon gelöst. Die resultierende Lösung wurde zu dem Harz gegeben und für 3 Stunden gerührt. Dann wurde das Harz der Waschoperation, der Piperidin-Schutzgruppenentfernungsoperation und weiter der Waschoperation in der oben gezeigten Weise unterworfen. Anschließend wurden 351 mg Fmoc-L-Val und 225 mg Boc-L-Val mit dem Harz in einer Weise kondensiert, die ähnlich der oben erwähnten ist.
    • Referenzbeispiel 15 Oxidation von Boc-L-Val-L-Val-L-3-amino-2-hydroxypentanoyl-D- Leu-L-Val-Harz
  • Das oben erwähnte Harz wurde mit DMF (3 · 6 ml, 1 Minute) und dann mit DMSO (3 · 6 ml, 1 Minute) gewaschen.
  • 125 mg Pyridiniumtrifluoracetat und 125 ml Essigsäureanhydrid wurden in 6 ml DMSO gelöst. Die resultierende Lösung wurde zu dem Harz gegeben und für 18 Stunden gerührt. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das Harz nacheinander mit DMSO (3 · 6 ml, 1 Minute), DMF (3 · 6 ml, 1 Minute) und Methanol (3 · 6 ml, 1 Minute) gewaschen und im Vakuum für 2 Stunden getrocknet.
    • Beispiel 7 Synthese von Poststatin(L-val-L-val-L-3-amino-2-oxopentanoyl-D-Leu-L-val) (Verbindung 1).
  • Das Trockenharz, das in Referenzbeispiel 15 gezeigt ist, wurde mit TFA: Phenol (95 : 5) (2 · 6 ml) behandelt. Die resultierende Lösung wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand wurde in 3 ml Methanol gelöst. Die Methanollösung wurde in eine Kolonne gegeben, die mit 30 ml "Sephadex LH-20" gefüllt war, die in Methanol gequellt war. Die Elutionsoperation wurde mit Methanol durchgeführt. Die Anfangsfraktionen, die UV-Absorption zeigten, wurden gesammelt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand (139 mg) wurde in einer Mischung von n-Butanol, Essigsäure und Wasser auf (100 : 1 : 100) in solcher Weise gelöst, daß der Rückstand in 1 ml der oberen Schicht und 1 ml einer Schicht der Mischung gelöst war. Eine Chromatographie wurde in einer Fliehkraft-Gegenstromchromatographievorrichtung (hergestellt durch Sanki Engineering Co., Ltd.) durchgeführt, worin die oben erwähnte untere Schicht als mobile Phase verwendet wurde. Die Fraktion, die UV-Absorptionszeiten wurden gesammelt und im Vakuum eingedampft um 82,9 mg der Zielverbindung als farbloses Pulver zu ergeben.
    • Beispiel 8 Synthese von L-Valyl-L-prolyl-3-amino-2-oxopentanoyl-D- leucyl-L-valin (Verbindung 6).
  • Eine Syntheseoperation wurde in ähnlicher Weise durchgeführt wie in den Referenzbeispielen 14 und 15 und in Beispiel 7 gezeigt. Als Ausgangsmaterial wurden 0,5 g eines Fmoc-L- Valyl-Harzes verwendet. 3 Äquivalente der Fmoc-Aminosäuren wurden nacheinander der Kondensationsreaktion, der Oxidations- und der Schutzgruppenentfernungsreaktion unterworfen, so daß 124,6 mg L-Valyl-L-prolyl-3-amino-2-oxopentanoyl-D- leucin-L-valin erhalten wurden.
    • Beispiel 9 Synthese von Phenylbutanoyl-L-valyl-L-propyl-3-amino-2-oxopentanoyl-D-leucyl-L-valin (Verbindung 7).
  • 23,6 mg L-Valyl-L-prolyl-3-amino-2-oxopentanoyl-D-leucin-L-valin, hergestellt in der in Beispiel 8 gezeigten Weise, wurden in 2 ml Methanol gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit einer Lösung von 30 mg 4-Phenyl-butansäureanhydrid in 1 ml Methylenchlorid und 0,05 ml Triethylamin vermischt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Essigsäure angesäuert und der Reinigungsoperation unter Verwendung einer Kolonne (300 ml), die mit "Sefadex LH&sub2;O" und Methanol gefüllt war, so daß 20,9 mg Phenylbutanoyl-L-valyl-L-prolyl-3-amino-2-oxopentanoyl-D- leucyl-L-valin erhalten wurden.
    • Beispiel 10
  • Eine Anzahl von homologen Poststatinverbindungen wurden in ähnlicher Weise synthetisiert wie oben gezeigt. Diese Verbindungen sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Verbindungen 8-17, 22 und 24-24 wurden hergestellt aus den entsprechenden Ausgangsmaterialien in einer Weise, die ähnlich der der Referenzbeispiele 14 und 15 und Beispiel 7 ist.
  • Die Verbindungen 18-21 wurden in einer Weise hergestellt, die ähnlich der der Referenzbeispiele 14 und 15 und den Beispielen 7-9 war.
  • Die Verbindung 27 wurde in einer Weise hergestellt, die ähnlich der der Referenzbeispiele 1-7 und der des Beispiels 2 ist.
  • Die physikalischen Konstanten dieser Verbindungen sind auch in Tabelle 2 gegeben.
    • Test 1 Bestimmungen der Anti-Prolylendopeptidaseaktivität
  • Die Bestimmungen der Anti-Prolylendopeptidaseaktivität wurde durch ein modifiziertes Verfahren durchgeführt, das auf dem Verfahren von Yoshimoto et al (Biochim. Biophys. Acta, Band 569, Seiten 184-192 (1979)) basierte.
  • Ein Teströhrchen wurde mit einer Lösungsmischung beladen, die aus (a) 0,2 ml einer Lösung von 0,5 mM N-Benzyloxycarbonyl-L-glycyl-L-prolyl-beta-naphthylamid in 40%igem Dioxan; (b) 0,5 ml einer 0,05 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,8); und (c) 0,25 ml einer wäßrigen Lösung bestand, die das Testmaterial enthielt. Die Lösungsmischung wurde auf 37ºC für 3 Minuten erwärmt und mit 0,05 ml der Prolylendopeptidaselösung vermischt, um eine Reaktion bei 37ºC für 30 Minuten zu bewirken. Die Prolylendopeptidase, die verwendet wurde, war diejenige, die erhalten wurde durch ein modifiziertes Verfahren, das auf dem Enzymreinigungsverfahren von Koida, Walter et al. (J. Biol. Chem. Bd. 251, Seiten 7593-7599 (1976) basierte, worin Schweinenierenproben einer Fraktionierungsoperation mit Ammoniumsulfat unterworfen werden und worin die Reinigung durch eine Säulenchromatographie, die DEAE-Sephadex A-50 Kolonne verwendete, durchgeführt wurde.
  • Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit 1 ml eines 1M Natriumacetatpufferlösung, die 10% Tween- 20 und 0,1% Fast Garnet GBC-Salz enthielt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehenge lassen und dann auf ihre Lichtabsorption bei 525 nm (a) gemessen. Zur selben Zeit wurde eine Kontrollprobe, die frei von den Testverbindungen war und lediglich die Pufferlösung enthielt, auf ihre Lichtabsorption (b) gemessen.
  • Die Prolylendopeptidaseinhibierungsaktivität wurde durch die folgende Formel bestimmt:
  • [(b - a)/b] · 100
  • Die Resultate dieses Tests sind in Tabelle 2 angegeben.
    • Test 2 Bestimmung der Elastaseinhibierungsaktivität und Cathepsin B- Inhibierungsaktivität
  • Die Elastaseinhibierungsaktivität wurde durch das Verfahren von Mumford, R. A. et al (J. Biol. Chem., 225, 2227 (1980)) bestimmt. Die Cathepsin-B-Inhibierungsaktivität wurde durch das Verfahren von Knight, C. G. (Biochem. J., 189, 447- 453 (1980)). Die Testergebnisse sind in Tabelle 2 gegeben.
    • Beispiel 11 Herstellung von Poststatintabletten
  • 30 Gewichtsteile Poststatin, 120 Teile kristalline Lactose, 147 Teile kristalline Cellulose und 3 Teile Magnesiumstearat wurden in einem V-förmigen Mischer vermischt, und die resultierende Mischung wurde in Tabletten formuliert, die jeweils ein Gewischt von 300 mg aufwiesen. Tabelle 2 Tabelle 2 (Fortsetzung) Tabelle 2 (Fortsetzung) Tabelle 2 (Fortsetzung) Tabelle 2 (Fortsetzung) Tabelle 2 (Fortsetzung)
  • ¹Bemerkungen*
  • Die in Tabelle 2 verwendeten Abkürzungen besitzen die unten gezeigten Bedeutungen:
  • Rf1, Rf2 = TLC, Umkehrphase (RP-18), "5% KOAc-1% Zitronensäure": "MeCN" = 65 : 35;
  • Rf3 = TLC, Silikagel F, n-BuOH : AcOH : H&sub2;O = 4 : 1 1;
  • Rf4 = TLC, Silikagel F. CHCl&sub3; : MeOH : AcOH = 90 : 10 : 5;
  • PPCE = Prolylendipeptidase-Inhibierungs-Aktivität IC&sub5;&sub0; (mg/ml);
  • Elast = Elastase-Inhibierungs-Aktivität, IC&sub5;&sub0; (mg/ml);
  • Cat-B = Cathepsin-B-Inhibierungs-Aktivität, IC&sub5;&sub0; (mg/ml).
    • Industrielle Anwendbarkeit
  • Poststatin und homologe Verbindungen oder Salze davon der vorliegenden Erfindung zeigen eine hohe Endopeptidase- Inhibierungswirkung. Diese Verbindungen sind daher nützlich als Arzneimittel zur Behandlung von Amnesie und Autoimmunerkrankungen wie systemischem Erthematosus und ähnlichem.

Claims (2)

1. (2R,3S)-3-Amino-2-hydroxypentansäure.
2. (2R,3S)-3-Amino-2-hydroxypentansäure nach Anspruch 1, worin die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe geschützt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus p-Methoxybenzyloxycarbonyl und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl besteht.
DE69032679T 1989-04-15 1990-04-13 Threo (2R, 3S)-3-amino-2-hydroxypentansäure und threo (2R,3S)-3-(p-methoxy-benzyloxycarbonyl/FMOC) amino-2-hydroxy-pentansäure Expired - Fee Related DE69032679T2 (de)

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