DE69031218T2

DE69031218T2 - Wundheilung

Info

Publication number: DE69031218T2
Application number: DE69031218T
Authority: DE
Inventors: Harry Antoniades; Samuel Lynch
Original assignee: Institute of Molecular Biology Inc; Harvard University
Current assignee: Institute of Molecular Biology Inc; Harvard University
Priority date: 1990-04-10
Filing date: 1990-04-10
Publication date: 1997-12-11
Anticipated expiration: 2010-04-11
Also published as: ATE156363T1; ES2106031T3; JPH05500356A; EP0479799B1; DK0479799T3; CA2060208A1; EP0479799A1; EP0479799A4; WO1991015231A1; DE69031218D1; JPH0768139B2; CA2060208C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Heilen von Wunden und die Förderung von Knochen- oder Periodontalwachstum oder -regeneration.
Wachstumsfaktoren sind Polypeptidhormone, die eine definierte Zielzellenpopulation stimulieren. Beispiele für Wachstumsfaktoren umfassen von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), insulinartige Wachstumsfaktoren (IGF-I und II), Transformationswachstumsfaktor-β (TCF-β), Epidermalwachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF). PDGF ist ein kationisches, wärmestabiles Protein, das in den Granula von im Kreislauf befindlichen Blutplättchen vorkommt und von dem bekannt ist, daß es die in vitro-Proteinsynthese und die Kollagenproduktion durch Fibroblasten stimuliert. Es ist auch bekannt, daß es als in vitro-Mitogen und chemotaktisches Mittel für Fibroblasten, Zellen glatter Muskel und Gliazellen wirkt.
Es ist vorgeschlagen worden, in vivo PDCF zur Förderung der Wundheilung zu verwenden. Beispielsweise beschreibt Grotendorst (1984) "J.Trauma" 24:549-52 die Zugabe von PDGF in Hunt-Schilling-Drahtgitterkammern, die mit einem Kollagengel imprägniert und in die Rücken Kon Ratten implantiert sind; es wurde festgestellt, daß PDGF die Menge an neu synthetisiertem Kollagen erhöht. Leitzel et al. (1985) "J.Dermatol.Surg.Oncol." 11:617-22 ist es jedoch nicht gelungen, die normale Wundheilung bei Hamstern unter Verwendung von PDGF allein oder in Kombination mit FGF und EGF zu beschleunigen.
Michaeli et al. (1984) berichten in "Soft and Hard Tissue Repair ", S.380-394 (Hrsg. Hunt, T.K. et al.), Praeger Publishers, New York, daß die Anwendung eines teilweise gereinigten PDGF-Präparats, das von blutplättchenreichem Plasma erhalten wurde, beim Implantieren in Kaninchenhomhäute die Angiogenese stimuliert. Weil PDGF kein angiogener Wachstumsfaktor ist, meinten die Forscher, daß ein unbekannter Faktor in ihrem teilweise gereinigten PDGF-Präparat für die angiogene Wirkung verantwortlich sei.
Die WO88/03409 offenbart Wundheilung unter Verwendung von PDGF und IGF-I. PNAS 84, 7696-7700 (1987) bezieht sich ebenfalls auf die Wundheilung durch PDGF und IGF-I.
Die EP-A-0280460 offenbart IGF-II als wundheilendes Mittel. Obwohl IGF-I und IGF-II ein gewisses Maß an Aminosäuresequenzhomologie aufweisen (FEBS 89, 283-286 (1987) und bekannt ist, daß sie Mitogene in Säugetierlinsenepithelzellen sind ("Exp. Cell Res. 142, 293-300 (1982)), ist gezeigt worden, daß sie unterschiedliche physiologische Rollen haben ("J.Clin.Invest." 76, 1237-1242 (1985)).
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die gereinigten, von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor und gereinigten, insulinartigen Wachstumsfaktor II umfaßt. Die Zusammensetzung gemäß vorliegender Anmeldung kann zum Heilen einer äußerlichen Wunde bei einem Säugetier, beispielsweise einem menschlichen Patienten, verwendet werden, indem auf die Wunde eine wirksame Menge einer Zusammensetzung aufgetragen wird, die gereinigten PDGF und gereinigten IGF-II umfaßt. Die Zusammensetzung trägt zur Heilung der Wunde zumindest teilweise bei, indem sie das Wachstum von Epithel- und Bindegewebe und die Synthese von Cesamtprotein und Kollagen fördert. Die Wundheilung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist wirksamer als jene, die ohne Behandlung (d.h. ohne das Auftragen exogener Mittel) oder durch die Behandlung mit gereinigtem PDGF allein oder gereinigtem IGF-II allein erzielt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt ist ein Merkmal der Erfindung die Regeneration von Knochen bei einem Säugetier, beispielsweise einem menschlichen Patienten, durch Verabreichung, vorzugsweise durch Auftragen auf den Bereich des verletzten oder fehlenden Knochens, einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die gereinigten PDCF und gereinigten IGF-II enthält, an den Patienten. Die Zusammensetzung unterstützt zumindest teilweise die Regeneration, indem sie das Wachstum von Bindegewebe, Knochen und Zahnzement fördert und indem sie die Protein- und Kollagensynthese stimuliert. Die Regeneration unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist wirksamer als jene, die ohne Behandlung (d.h. ohne das Auftragen exogener Mittel) oder durch Behandlung mit gereinigtem PDGF allein oder mit gereinigtem IGF-II allein erzielt wird.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beider Aspekte der Erfindung wird die Zusammensetzung hergestellt, indem gereinigter PDGF und ICF-II (die beide im Handel erhältlich sind) in einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz, z.B. synthetischen Polymeren oder im Handel erhältlichen inerten Celen oder Flüssigkeiten (z.B. Methylzellulose) kombiniert werden. Am meisten bevorzugt werden gereinigter PDGF und IGF-II in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:25 und 25:1, vorzugsweise zwischen 1:10 und 10:1, und mehr bevorzugt zwischen 1:2 und 2:1 kombiniert. Der gereinigte PDGF kann aus menschlichen Blutplättchen oder durch Festphasenpeptidsynthese oder rekombinante DNA-Technologie erhalten werden. Der IGF-II kann durch rekombinante DNA-Technologie oder Festphasenpeptidsynthese erhalten werden. Somit sind mit den Begriffen "PDGF" und "IGF-II" von Blutplättchen stammende, rekombinante und synthetisierte Materialien, die aus Säugetieren, vorzugsweise Primaten stammen, gemeint; am meisten bevorzugt ist der Primat ein Mensch, kann aber auch ein Schimpanse oder anderer Primat sein. Rekombinanter PDGF kann ein rekombinantes Heterodimer sein, das durch das Einfügen von DNA-Sequenzen, die für beide Untereinheiten des Wachstumsfaktors kodieren, in kultivierte prokaryotische oder eukaryotische Zellen und anschließendes Verarbeitenlassen der translatierten Untereinheiten durch die Zellen zur Bildung von Heterodimeren hergestellt wird. Alternativ dazu kann DNA, die nur für eine der Untereinheiten (vorzugsweise die β- oder "2"-Kette) kodiert, in Zeilen eingefügt werden, die dann kultiviert werden, um PDGF in Homodimerform (PDGF-1- oder PDGF-2-Homodimer) herzustellen.
Der Begriff "gereinigt", wie hierin verwendet, bezieht sich auf PDGF oder IGF-II, der vor dem Mischen mit dem jeweils anderen zu 95 Cew.-% oder mehr aus PDGF oder IGF-II besteht, d.h. im wesentlichen frei von anderen Proteinen, Lipiden und Kohlehydraten ist, mit denen er normalerweise assoziiert ist.
Ein gereinigtes Proteinpräparat ergibt im allgemeinen eine einzelne Hauptbande auf einem Polyacrylamidgel. Am meisten bevorzugt ist der gereinigte PDGF oder IGF-II, der in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet wird, rein, wie dies durch Sequenzanalyse der aminoterminalen Aminosäuren beurteilt wird.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung stellt ein rasches, wirksames Verfahren zur Heilung äußerlicher Wunden bei Säugetieren, z.B. Dekubitus, Rißwunden und Verbrennungen, bereit. Die Zusammensetzung erhöht die Bindegewebebildung im Vergleich zu natürlicher Heilung (d.h. ohne Zugabe exogener Mittel) oder reinem PDGF oder IGF-II allein. Anders als reiner PDGF allein bewirkt die Zusammensetzung eine etwa 90%ige Zunahme an neuem Bindegewebe und etwa 50%ige Zunahme im Wachstum von Epithelgewebe. Die erhaltene Epithelschicht ist dicker als die durch natürliches Heilen erhaltene und enthält auch mehr Epithelvorsprünge, die sie mit dem neuen Bindegewebe verbinden; daher ist sie fester verbunden und schützt besser. Außerdem wird die Narbenbildung minimiert.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung stellt auch ein rasches, wirksames Verfahren zur Regeneration von Bindegewebe und Knochen bei Säugetieren, z.B. Menschen mit einer Krankengeschichte mit Peridontalerkrankungen, bereit. Die Zusammensetzung verstärkt die Bildung von Bindegewebe und Knochen im Vergleich zu natürlichem Heilen (d.h. ohne Zugabe exogener Mittel) oder reinem PDGF oder IGF-II allein.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen klar werden.
Nun werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.
Gemäß vorliegender Erfindung werden mit PDGF/IGF-II-Cemischen, die durch das Kombinieren von reinem PDCF und IGF-II hergestellt wurden, äußerliche Wunden, z.B. Dekubitus und Verbrennungen, behandelt und Knochen und Bindegewebe regeneriert. IGF-II, der auch als multiplikationsstimulierende Aktivität bekannt ist, ist im Handel von ICN Biomedical (Cleveland, Ohio) erhältlich. Gereinigter rekombinanter PDGF und gereinigter PDGF, der von menschlichen Blutplättchen stammt, sind im Handel von PDGF, Inc. (Boston, MA), Collaborative Research (Waltham, MA) und Amgen Corp. (Thousand Oaks, CA) erhältlich. Gereinigter PDCF kann auch wie folgt hergestellt werden.
500 bis 1.000 Einheiten gewaschene menschliche Blutplättchenpellets werden in 1 M NaCl (2ml pro Blutplättcheneinheit) suspendiert und 15 min lang auf 100ºC erhitzt. Der Überstand wird dann durch Zentrifugieren abgetrennt und das Präzipitat zweimal mit 1M NaCl extrahiert.
Die Extrakte werden kombiniert und gegen 0,08 M NaCl-0,01M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) dialysiert und über Nacht bei 4ºC mit diesem Puffer äquilibriertem CM- Sephadex C-50 (Markenname) vermischt. Das Gemisch wird dann in eine Säule (5 × 100 cm) gegossen, ausgiebig mit 0,08M NaCl-0,01M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) gewaschen und mit 1M NaCl eluiert, wobei 10 ml-Fraktionen gesammelt werden.
Aktive Fraktionen werden gepoolt und gegen 0,3M NaCl-0,01M Natriumphosphat- Puffer (pH 7,4) dialysiert, zentrifugiert und bei 4ºC durch eine 2,5 × 25 cm-Blue Sepharose-Säule (Marken name; Pharmacia) geschickt, die mit 0,3M NACI-0,01 M- Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) äquilibriert war. Die Säule wird dann mit dem Puffer gewaschen und teilweise gereinigter PDGF mit einer 1:1-Lösung von 1M NaCl und Ethylenglykol eluiert.
Die teilweise gereinigten PDGF-Fraktionen werden 1:1 mit 1M NaCl verdünnt, gegen 1M Essigsäure dialysiert und lyophilisiert. Die lyophilisierten Proben werden in 0,8M NaCl-0,01M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4) aufgelöst.und durch eine mit dem Puffer äquilibrierte 1,2 × 40 cm-CM-Sephadex C-50-Säule geschickt. PDGF wird dann mit einem NaCl-Cradienten (0,08 bis 1M) eluiert.
Die aktiven Fraktionen werden kombiniert, gegen 1 M Essigsäure dialysiert und in einem kleinen Volumen iM Essigsäure aufgelöst. 0,5 ml-Teilmengen werden auf eine 1,2 × 100 cm-Biogel P-150-Säule (100 bis 200 Mesh) aufgegeben, die mit 1 M Essigsäure äquilibriert wurde. PDCF wird dann mit 1 M Essigsäure eluiert, wobei 2 ml- Fraktionen gesammelt werden.
Jede aktive Fraktion, die 100 bis 200 mg Protein enthält, wird lyophilisiert, in 100 ml 0,4%iger Trifluoressigsäure gelöst und einer Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeitschromatographie auf einer Phenyl-Bondapak-Säule (Waters) unterzogen. Die Elution mit einem linearen Acetonitrilgradienten (0 bis 60%) ergibt reinen PDGF.
Durch rekombinante DNA-Technologie produzierter PDGF kann wie folgt hergestellt werden:
Von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor (PDGF), der aus menschlichen Blutplättchen stammt, enthält zwei Polypeptidsequenzen (PDGF-1- und PDGF-2- Polypeptide; Antoniades, H.N. und Hunkapiller, M. (1983) "Science" 220:963-965). Für PDGF-1 kodiert ein Gen, das sich auf Chromosom 7 befindet (Betsholtz, C. et al., "Nature" 320.695-699), und für PDGF-2 kodiert das sis-Onkogen (Doolittle, R. et al. (1983), "Science" 221:275-277), das sich auf Chromosom 22 befindet (Dalla-Favera, R. (1982) "Science" 218:686-688). Das sis-Gen kodiert für das Transformationsprotein des Simian-Sarkom-Virus (SSV), das eng mit dem PDGF-2-Polypeptid verwandt ist. Das menschliche zelluläre c-sis kodiert auch für die PDGF-2-Kette (Rao, C.D. et al., (1986) "Proc.Natl.Acad.Sci. USA" 83:2392-2396). Weil für die beiden Polypeptidketten von PDGF unterschiedliche Gene kodieren, die sich auf getrennten Chromosomen befinden, besteht die Möglichkeit, daß menschlicher PDGF aus einem über eine Disulfidbindung verbundenem Heterodimer aus PDGF-1 und PDGF-2 oder aus einem Gemisch der beiden Homodimere (Homodimer von PDGF-1 und Homodimer von PDGF-2) oder aus einem Gemisch aus dem Heterodimer und den beiden Homodimeren besteht.
Es wurde gezeigt, daß Säugetierzellen in Kultur, die mit dem Simian-Sarkom-Virus, der das für die PDGF-2-Kette kodierende Gen enthält, infiziert sind, das PDGF-2-Polypeptid synthetisieren und es in ein über eine Disulfidbindung verbundenes Homodimer verarbeiten (Robbins, K. et al. (1983) "Nature" 305:605-608). Außerdem reagiert PDGF- 2-Homodimer mit gegen menschlichen PDGF hergestellte Antiseren. Weiters sind die funktionellen Eigenschaften des ausgeschiedenem PDGF-2-Homodimer jenen von aus Blutplättchen stammendem PDGF insofern ähnlich, als dieser die DNA-Synthese in kultivierten Fibroblasten stimuliert, dass er die Phosphorylierung am Tyrosinrest eines 185 kd-Zellmembranproteins induziert und mit menschlichem (¹²&sup5;I)-PDGF um die Bindung an spezifische Zelloberflächen-PDG F-Rezeptoren konkurrieren kann (Owen, A. et al. (1984) "Science" 225:54-56). Ähnliche Eigenschaften wurden beim sis/PDGF-2- Genprodukt gezeigt, das aus kultivierten, normalen menschlichen Zellen stammt (beispielsweise menschliche, arterielle Endothelzellen) oder von menschlichen malignen Zellen, die das sis/PDGF-2-Gen exprimieren (Antoniades, H. et al. (1985) "Cancer Cells" 3:145-151).
Das rekombinante PDGF-2-Homodimer wird durch das Einbringen von cDNA-Klonen des c-sis/PDGF-2-Gens in Mäusezellen unter Verwendung eines Expressionsvektors erhalten. Der für die Expression verwendete c-sis/PDGF-2-Klon wurde aus kultivierten, normalen menschlichen Endothelzellen erhalten (Collins, T. et al. (1985) "Nature" 216:748-750).
IGF-II kann auch unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie oder Festphasenpeptidsynthese hergestellt werden. Alternativ dazu kann IGF-II aus menschlichem Plasma oder konditinierten Kulturmedien gereinigt werden. Rinderknecht et al., "Proc.Natl.Acad.Sci.USA" 73:2365, (1976); Moses et al., "Eur.J.Biochem." 103:387 (1980). Kurz gesagt wird ein Säure/Ethanol-Extrakt aus dem Acetonpulver einer modifizierten Cohn-Fraktion (Präzipitat B) von menschlichem Plasma hergestellt. Der Säure/Ethanol-Extrakt wird dann mit Essigsäure erneut extrahiert und einer Sephadex G-75- und G50-Chromatographie, einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bei pH 8,6, einer SE-Sephadexchromatographie und schi ießl ich einer Polyacrylamidgelelektrophorese bei pH 4,3 unterzogen.

Wundheilung

Um die Wirksamkeit von PDGF/IGF-II-Gemischen bei der Förderung der Wundheilung zu ermitteln, wurden folgende Versuche durchgeführt.
Junge, weisse Yorkshire-Schweine (Parson's Farm, Hadley, MA) mit einem Gewicht zwischen 10 und 15 kg blieben ab zumindest 6 h vor der Operation nüchtern und wurden dann narkotisiert. Unter aseptischen Bedingungen wurden der Rücken- und der Brustbereich geschoren, rasiert und mit milder Seife und Wasser gewaschen. Der zu verletzende Bereich wurde dann mit 70% Äthanol desinfiziert.
Wunden in der Größe von 1cm × 2cm wurden in einer Tiefe von 0,5 mm unter Verwendung eines modifizierten Castroviejo-Elektrokeratoms (Storz, St. Louis, MO, wie von Brownells, Inc. modifiziert) zugefügt. Die Wunden führten zur vollständigen Entfernung des Epithels sowie eines Teils der darunterliegenden Dermis (vergleichbar mit einer Verletzung durch eine Verbrennung zweiten Grades). Die einzelnen Wunden waren durch zumindest 15 mm unverletzte Haut voneinander getrennt. Wunden, die identische Behandlung erhielten, waren als Gruppe organisiert und von anderen Gruppen durch zumindest 3 cm getrennt. Wunden, die keine Wachstumsfaktorbehandlung erhielten, waren von Wunden, die eine solche Behandlung erhielten, um zumindest 10 cm getrennt.
Die Wunden wurden direkt mit einer einzelnen Anwendung der folgenden Wachstumsfaktoren, die in biokompatiblem Gel suspendiert sind, behandelt: 1) 500 ng reiner menschlicher PDGF (durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt) oder rekombinanter PDGF allein; 2) 500 ng reiner PDGF in Kombination mit unterschiedlichen Mengen von IGF-II; 3) 500 ng reiner IGF-II (rekombinant, ICN Biomedical, Cleveland, Ohio).
Am Tag 7 nach dem Verwunden wurden Biopsieproben entnommen. Biopsieproben zur histologischen Beurteilung wurden als Keile mit etwa 3 mm Tiefe entnommen und in 10% Formalin gelegt. Proben zur biochemischen Analyse und Autoradiographie wurden unter Verwendung eines Elektrokeratoms erhalten. Die Endabmessungen der Proben waren 1,5 mm × 10 mm × 1,5 mm. Drei Proben pro Wunde wurden zur biochemischen Analyse entnommen, während zwei Proben pro Wunde zur Autoradiographie entnommen wurden. Nach der Entnahme wurden die Proben in kalten Eagle's Modifizied Essential Medium (EMEM)-Medien gelagert, die mit 10% fötalem Kalbserum ergänzt waren. Die Biopsieproben wurden wie folgt analysiert.

Histologische Bewertung

Histologische Proben wurden unter Verwendung von Standard-Paraffinprimägnier- und Einbettungstechniken hergestellt. 4 µm-Schnitte wurden vorgenommen und unter Verwendung von filtriertem Harris-Hemotoxylin und alkoholischem Eosin gefärbt; sie wurden dann unter einem Mikroskop betrachtet. Alle Proben wurden von zwei Forschern ohne Kenntnis der Versuchsanordnung an gleichmäßig über die Schnitte verteilten Punkten bewertet. Die Breiten der Epithel- und Bindegewebeschichten wurden unter Verwendung eines im Okular des Mikroskops angeordneten Rasters bewertet; die Messung wurde dann unter Verwendung eines Mikrometers, das unter den gleichen Bedingungen betrachtet wurde, in mm umgewandelt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der histologischen Bewertung wiesen darauf hin, daß Wunden, die mit der Kombination aus gereinigtem menschlichem PDGF oder rekombinantem PDGF und IGF-II behandelt wurden, dickere Bindegewebe- und Epithelschichten und umfassendere diese Schichten verbindende Epithelvorsprünge aufwiesen als Wunden, die keine Behandlung, reinen IGF-II oder reinen PDGF allein erhielten. Bis zu 6 Wochen nach der Behandlung gab es keinen Hinweis auf Narbenbildung.
Das wie oben beschrieben hergestellte rekombinante gereinigte PDGF-2-Homodimer wurde in Wunden in Teilen der Hautdicke auch allein und in Kombination mit IGF-II getestet. Die histologische Analyse der 6 Tage alten Wunden weist darauf hin, daß die Anwendung von PDGF-2 oder IGF-II allein nur zu leichten Unterschieden gegenüber Vergleichen in der Bindegewebe- oder Epidermismorphologie führten. Wenn PDGF-2 jedoch mit IGF-II kombiniert wurde, führte die Kombination zu einer signifikanten 90%igen Zunahme der Breite der neuen Bindegewebeschicht und einer 50%igen Zunahme der Epidermisdicke in 7 Tagen nach der Operation. Das Bindegewebe von mit PDGF-2/IGF-II behandelten Wunden wies deutliche Lichtpolarisationsbereiche auf, die darauf hinwiesen, daß diese Wunden mehr reifes Bindegewebe enthielten als Wunden, die PDGF-2 allein, IGF-II allein oder keine Behandlung erhielten.
Somit führt die Anwendung von rekombinantem PDGF-2 oder gereinigtem menschlichem PDGF beim oben geschriebenen Wundheilungstiermodell zu ähnlichen Ergebnissen, wenn sie mit IGF-II angewandt wurden. Die Kombination aus rekombinantem PDGF-2 und IGF-II führt im Vergleich zum Vergleichstier ohne Behandlung oder mit Behandlung mit rekombinantem PDGF-2 oder IGF-II allein zu einem drastischen Anstieg der Anzahl neuer Fibroblasten und der Kollagensyntheserate, begleitet von Hyperplasie der Dermis und Epidermis.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß sowohl rekombinantes PDGF-2-Homodimer als auch nativer gereinigter menschlicher PDGF synergistisch mit IGF-II interagieren, wenn sie topisch auf Wunden aufgetragen werden.

Knochenregeneration

Um die Wirksamkeit von PDGF/IGF-II-Präparaten bei der Förderung der Peridontal- und/oder Knochenwachstums zu ermitteln, kännen die folgenden Versuche durchgeführt werden.
Beagle-Hunde mit natürlich auftretender Periodontalerkrankung werden auf Basis einer anfänglichen radiographischen Untersuchung ausgewählt. Die Zähne, die 30 bis 80% Knochenverlust aufweisen, werden zunächst unter Verwendung von Ultraschallinstrumenten von Zahnstein befreit. Dann werden chirurgische Hautlappen- und Wurzelbearbeitungstechniken durchgeführt und die Versuchszähne mit einer Zusammensetzung behandelt, die gereinigten PDGF und IGF-II in einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz enthielt, z.B. im Handel erhältliche inerte Gele, wie z.B. Methylzellulose. Die Zähne in den verbleibenden Quadranten erhalten nur Vergleichsgel allein oder reinen PDGF oder IGF-II allein. Blockbiopsien der Zähne und des Knochen werden zwei Wochen nach der Operation vorgenommen und unter Einsatz von Standard-Dem ineral isierungs- und Bearbeitungstechniken zur histologischen Beurteilung vorbereitet.

Dosierung

Um die geeignete Dosierung für gereinigten PDGF zu ermitteln, wurden die oben beschriebenen Versuche wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Wunden mit 2,5 ng, 5,0 ng und 10 ng gereinigtem PDGF pro mm² Wunde in Kombination mit 5,0 ng/mm² IGF-II, in 30 ml biokompatiblem Gel dispergiert, behandelt wurden. Die Ergebnisse zeigten, daß optimale Wirkungen erzielt wurden, wenn der PDGF-Gehalt 5,0 ng/mm² oder mehr betrug.
Um die geeignete Dosierung von reinem PDGF plus IGF-II zu ermitteln, wurden Kombinationen, in denen das Gewichtsverhältnis zwischen PDGF und IGF-II im Bereich von 1:25 bis 25:1 lag, wie oben beschrieben beurteilt. Optimale Ergebnisse wurden mit einem Verhältnis zwischen 1:2 und 2:1 erzielt.
Es werden auch andere Ausführungsformen in Erwägung gezogen. Beispielsweise ist die Kombination aus IGF-II und PDGF nützlich, um das Knochenwachstum und/oder Periodontalwachstum zu fördern.

Claims

1. Zusammensetzung, die gereinigten, von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor und gereinigten, insulinartigen Wachstumsfaktor II umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Gewichtsverhältnis zwischen gereinigtem, von B Iutplättchen stammendem Wachstumsfaktor und gereinigtem, insulinartigem Wachstumsfaktor II im Bereich zwischen 1:25 und 25:1 und vorzugsweise zwischen 1:10 und 10:1 liegt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Verhältnis zwischen 1:2 und 2:1 liegt.

4. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Heilen von Wunden oder zur Förderung des/der Knochen- oder Periodontalwachstums oder -regeneration, umfassend das Vermischen von gereinigtem, von Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor und gereinigtem, insulinartigem Wachstumsfaktor II mit einem pharmakologisch akzeptablen Träger.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Gewichtsverhältnis zwischen gereinigtem, von Blutplättchen stammendem Wachstumfaktor und gereinigtem, insulinartigem Wachstumsfaktor II im Gemisch zwischen 1:25 und 25:1 und vorzugsweise zwischen 1:10 und 10:1 liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Verhältnis zwischen 1:2 und 2:1 liegt.

7. Zusammensetzung, die gereinigten, von Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor und gereinigten, insulinartigen Wachstumsfaktor II umfaßt, zur Verwendung beim Heilen von Wunden oder zur Förderung von Knochen- oder Periodontalwachstum oder -regeneration.

8. Gleichzeitige Verwendung von gereinigtem, von Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor und gereinigtem, insulinartigem Wachstumsfaktor II zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Heilen von Wunden oder zur Förderung von Knochen- oder Periodontalwachstum oder -regeneration.

9. Verwendung von gereinigtem, von Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor für die Herstellung eines Medikaments, das zusätzlich gereinigten, insulinartigen Wachstumsfaktor II umfaßt, zum Heilen von Wunden oder zur Förderung von Knochen- oder Periodontalwachstum oder -regeneration.

10. Verwendung von gereinigtem, insulinartigem Wachstumsfaktor II zur Herstellung eines Medikaments, das zusätzlich gereinigten, von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor umfaßt, zum Heilen von Wunden und zur Förderung von Knochenoder Periodontalwachstum oder -regeneration.