DE69025969T2

DE69025969T2 - Verfahren zur Charakterisierung von Teilchen

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Publication number: DE69025969T2
Application number: DE69025969T
Authority: DE
Inventors: David C. New York New York 10012 Schwartz
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 1989-04-05
Filing date: 1990-04-03
Publication date: 1996-08-08
Anticipated expiration: 2010-04-04
Also published as: EP0391674A2; JPH02291944A; US5599664A; EP0391674B1; EP0391674A3; DE69025969D1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung einer Nukleinsäure durch Bestimmung der Größe von individuellen Teilchen und gegebenenfalls durch Bestimmung der Gewichtsverteilung einer Probe, die Teilchen varuerender Größe enthält. Um solche Teilchen zu charakterisieren können eine Messung der positionellen und konformationellen Veränderungen in Nukleinsäuren, wenn sie einer externen Kraft ausgesetzt werden, sowie Messungen ihrer Länge, ihres Durchmessers oder ihres Radius mittels Mikroskopie und/oder Mikroskopie in Kombination mit spektroskopischen Methoden durchgeführt werden. Solche Messungen schließen die Raten der Relaxation, Reorientierung und Rotation von Teilchen, die einer externen Kraft ausgesetzt sind, und Messungen der Länge und des Durchmessers von Teilchen ein bevor, während oder nachdem sie einer externen Kraft ausgesetzt werden oder worden sind.
Solche Messungen werden verwendet, um die Teilchengröße zu bestimmen. Die Erfindung ist insbesondere gut geeignet für die Größenbestimmung von Nukleinsäuremolekülen in einer polydispersen Probe (d.h. einer Probe, die Teilchen varuerender Größe enthält), wenn die Teilchen in einer Art von Medium angeordnet worden sind, und sie ist brauchbar für die Vermessung sehr großer Nukleinsäuremoleküle, die aufgespalten werden, wenn sie bei Anwendung herkömmlicher Verfahren auf einen Objektträger gegeben werden.
Verfahren zur Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung einer polydispersen Probe von Teilchen sind in einer Vielfalt von verschiedenen Gebieten brauchbar. In der Molekularbiologie liefert die Molekulargewichtsverteilung einer polydispersen Probe wie beispielsweise eine Probe von DNA-Restriktionsenzym- Spaltprodukten wertvolle Tnformation über die Organisation der DNA. Diese Information kann verwendet werden, um Chromosomenkarten und umfassende molekulargenetische Charakterisierungen herzustellen.
Traditionellerweise ist die Molekulargewichtsverteilung einer Probe von Teilchen bestimmt worden, indem die Rate gemessen worden ist, mit der Teilchen, die einer störenden Kraft ausgesetzt worden sind, sich durch ein geeignetes Medium bewegen, z.B. ein Medium, das die Teilchen dazu bringt, sich entsprechend ihrer Größe zu trennen. Es wird eine mathematische Beziehung berechnet, die die Größe von Teilchen mit ihrer Migrationsrate durch ein Medium in Verbindung setzt, wenn eine spezifizierte Kraft angewendet wird. Bei der Gelpermeationschromatographie, eine bekannte Technik, wird beispielsweise ein zu charakterisierendes Polymer in einem Lösungsmittel gelöst und anschließend wird die resultierende Lösung durch eine Säule geführt, die ein vernetztes oder poröses Gelpolymer in der stationären Phase aufweist. Große Moleküle laufen schnell durch das Gel, während die Bewegung kleinerer Moleküle durch ihren Eintritt in die Poren der Substanz gehindert wird, die die stationre Phase umfaßt. Die Molekulargewichtsverteilung der Probe wird durch Messung des Gehalts des aus der Säule austretenden Eluats bestimmt, z.B. durch Messung des Brechungsindex des austretenden eluats über einen Zeitraum. Verschiedene Grenzen der Gelpermeationschromatographie bestehen darin, daß sie nicht verwendet werden kann, um DNA-Moleküle zu trennen, die größer als etwa 5 kB sind, und sie kann nur für Proben verwendet werden, die in (zumindest in einem von) einer begrenzten Zahl von geeigneten Lösungsmitteln löslich sind.
Sedimentation ist eine bekannte Verfahrensweise zur Messung der Teilchengröße, aber dieses Verfahren iet, wenn es auf Polymere angewendet wird, auf Moleküle mit einer maximalen Größe von etwa 50 bis 100 Kilobasen (kB) begrenzt. Ein Versuch, größere Moleküle durch diese Verfahrensweise zu bestimmen, würde vermutlich zu einer zu geringen Abschätzung der Molekulargröße führen, hauptsächlich weil der Sedimentationskoeffizient hinsichtlich der Zentrifugengeschwindigkeit empfindlich ist (siehe Kavenoff et al., Cold Spring Harbor Symp. Quantit. Biol., 38, 1 (1974).
Ein anderes populäres Verfahren zur Trennung von Polymerteilchen nach Größe ist die Gelelektrophorese (siehe beispielsweise Freifelder, Physical Biochemistry, W.H. Freeman (1976)) die besonders brauchbar für die Trennung von Restriktionsspaltprodukten ist. Kurz gesagt, bringt die Anwendung eines elektrischen Feldes auf ein Agarose- oder ein Polyacrylamidgel, in dem Polymerteilchen gelöst sind, die kleineren Teilchen dazu, mit einer schnelleren Rate durch das Gel zu migrieren als die größeren Teilchen. Das Molekulargewicht des Polymers in jedem Band wird durch einen Vergleich der Migrationsrate einer unbekannten Substanz mit der Mobilität von Polymerfragmenten bekannter Länge kalibriert. Die Menge an Polymer in jedem Band kann auf Basis der Breite und/oder Farbintensität (optische Dichte) des gefärbten Bandes abgeschätzt werden, diese Art von Abschätzung ist jedoch üblicherweise nicht sehr genau.
Pulsfeldelektrophorese, die in der US-A-4 473 452 beschrieben ist, ist eine Elektrophoresetechnik, bei der die Trennung von großen DNA-Molekülen in einem Gel im Vergleich zur Trennung unter Verwendung von herkömmlicher Elektrophorese verbessert ist. Gemäß dieser Technik werden absichtlich alternierende elektrische Felder verwendet, um Teilchen zu trennen, anstelle daß die kontinuierlichen Felder verwendet werden, die in den zuvor bekannten Elektrophoreseverfahren angewendet wurden. Insbesondere werden Teilchen unter Verwendung von elektrischen Feldern gleicher Stärke getrennt, die quer zueinander verlaufen und zwischen hohen und niedrigen Intensitäten phasenverschoben miteinander bei einer Frequenz alternieren, die auf die Masse der Teilchen bezogen ist. Die Kräfte bewegen die Teilchen in einer Gesamtrichtung quer zu den jeweiligen Feldrichtungen. Es ist daher anzumerken, daß der Ausdruck "quer", sowie er hierin verwendet wird, nicht auf einen Winkel von oder nahe bei 90º beschränkt ist, sondern andere substantielle Schnittwinkel umfaßt.
Eines der signifikantesten Probleme bei der Bestimmung des Gewichts von Molekülen durch indirekte Meßverfahren, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, besteht darin, daß die Parameter, die direkt gemessen werden, z.B. die Migrationsrate, relativ unempfindlich gegenüber kleinen Unterschieden in der Molekülgröße sind. Daher ist eine präzise Bestimmung der Teilchengrößeverteilung schwierig zu erhalten. Der Mangel an Präzision kann insbesondere ein Problem sein, wenn biologische Polymerproben umfaßt sind, die dazu neigen, instabil zu sein und Einzelmoleküle mit einer Länge im Inchbereich zu enthalten. Während einige der bekannten Verfahren zur Bestimmung der Teilchengrößeverteilung in einer polydispersen Probe eine bessere Auflösung liefern als andere, liefern wenige, wenn überhaupt irgendeine der zuvor bekannten Techniken, eine Auflösung, die so hoch ist, wie sie benötigt wird, um zwischen Teilchen von nahezu identischer Größe zu unterscheiden. Bei der Gelpermeationschromatographie und der Sedimentation variiert der gemessene Parameter um nur etwa M1/2 (M = Molekulargewicht). Bei einer Standardagarosegelelektrophorese und einer Polyacrylamidgelelektrophorese variiert der gemessene Parameter wie -logM. Pulselektrophoresetechniken sind effektiv hinsichtlich der Trennung von außergewöhnlich großen Molekülen, aber liefern keine viel bessere Auflösung als eine Standardelektrophorese. Die Fähigkeit, zwischen Teilchen ähnlicher Größe zu unterscheiden, z.B. zwischen Teilchen, die sich in der Länge um einen Bruchteil eines Prozent unterscheiden, ist recht begrenzt, wenn die oben beschriebenen Meßtechniken angewendet werden.
Unter speziellen experimentellen Umständen löst DNA-Gelelektrophorese eine Polymermischung auf, wobei der gemessene Parameter wie M¹ variiert. Dieser Genauigkeitsgrad wird jedoch nur erreicht, wenn Variable wie die Gelkonzentration und die Feldstärke sorgfältig kontrolliert werden.
Teilchen mit höherer Masse (d.h. bis zu ungefähr 600 kB) können unter Verwendung einer herkömmlichen Gelelektrophorese aufgelöst werden, indem die Gelkonzentration auf sowenig wie 0,035 % verringert wird und die Feldstärke verringert wird, wobei es jedoch Nachteile dieses Verfahrens gibt. Am erwähnenswertesten ist, daß eine dramatische Reduktion der Gelkonzentration zu einem Gel führt, das mechanisch instabil ist, und es kann weniger Probe aufgegeben werden. Ein Elektrophoresedurchlauf kann, um sehr große DNA-Moleküle aufzulösen und bei Verwendung einer verringerten Gelkonzentration und einer verringerten Feldstärke, 1 Woche oder mehr in Anspruch nehmen, um vollständig abzulaufen. Ferner ist eine verringerte Gelkonzentration nicht brauchbar, um Moleküle in einer Probe mit einem weiten Bereich von Teilchengrößen zu trennen, weil eine Trennung kleiner Moleküle nicht erreicht wird. Wenn eine Probe, die Moleküle mit einem weiten Bereich von Größen enthält, zu trennen ist, können daher mehrere Elektrophoresedurchläufe erforderlich sein, z.B. zuerst eine Trennung der größeren Moleküle und dann eine weitere Trennung der kleineren Moleküle.
Andere Teilchenmeßtechniken, die in der Technik bekannt sind, sind zur Größenbestimmung bestimmter Moleküle brauchbar, die in einer Massenprobe vorhanden sind (z.B. der größten Moleküle in der Probe oder der durchschnittlichen Molekülgröße), aber sie sind ungeeignet für die Vermessung vieler Polymere mit varuerender Länge in einer vorgegebenen Probe. Die viskoelastische Technik der Helixrückbildung (siehe Kavenoff et al., "Chromosome-sized DNA molecules from Drosophila," Chromosoma 41, 1 (1973)), die in der Technik bekannt ist, umfaßt das Ausstecken von spiralisierten Molekülen in einem Lösungsmittelfließfeld (z.B. einem Feld, das erzeugt wird, wenn Flüssigkeit zwischen zwei sich bewegenden Platten gestört wird) und die Bestimmung der Zeit, die benötigt wird, bis das größte Molekül zu einem entspannten Zustand zurückgekehrt ist. Die Relaxationszeit (Entspannungszeit) wird gemessen, indem die Rotation eines konzentrischen Rotors beobachtet wird, der sich während der Dauer der Relaxation bewegt. Während diese Technik recht präzise dahingehend ist, daß Probenbestimmungen wie M1,66 variieren, wenn sie auf große DNA-Moleküle angewendet wird, ist sie für die Größenbestimmung von anderen Molekülen als dem größten Molekül in der Probe nicht brauchbar.
Unter Verwendung von Lichtstreutechniken, die in der Technik bekannt sind (z.B. quasi-elastische Lichtstreuung) werden die Größe und Gestalt von Teilchen durch ein Zimm-Plot bestimmt, ein Datenanalyseverfahren, das in der Technik bekannt ist. Mit diesen Techniken variiert die Größenabhängigkeit wie M¹. Eine Lichtstreuung erfordert, daß die Lösung, in die die zu vermessenden Moleküle gegeben werden, rein ist, d.h., frei von Staub oder andere Verunreinigung ist, und sie ist daher für die Größenbestimmung von einer DNA-Probe ungeeignet. Ferner ist sie unbrauchbar für die Größenbestimmung von Molekülen, die so groß sind, wie viele DNA-Moleküle, und sie ist nur zur Bestimmung des durchschnittlichen Gewichts von Teilchen in einer Probe brauchbar, jedoch nicht der Gewichtsverteilung einer Probe mit Teilchen verschiedener Größen.
Ein noch anderes Teilchenvermessungsverfahren, das in der Technik zur Bestimmung einzelner Moleküle bekannt ist, liefert Messungen der Teilchengröße mit begrenzter Genauigkeit. Die durchschnittliche Größe und Gestalt individueller, entspannter DNA-Moleküle ist bestimmt worden, indem die Moleküle unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet worden sind und die Haupt- und Nebenachsen von Molekülen mit einer kugelförmigen oder ellipsoiden Gestalt gemessen worden sind (siehe Yanagida et al., Cold Spring Harbor Symp. Quantit. Biol., 47, 177, (1983)). Die in der oben angegebenen Schrift beschriebene Technik wird in einer freien Lösung ohne Störung der Moleküle durchgeführt.
Es ist die Bewegung kleiner DNA-Moleküle während einer Elektrophorese beobachtet worden (siehe Smith et al. Science, 243, 203 (1989). Das in dieser Veröffentlichung beschriebene Verfahren ist nicht für die Beobachtung sehr großer DNA-Moleküle geeignet und Techniken zur Vermessung von Molekülen sind nicht beschrieben worden.
Es ist anzumerken, daß praktische Gewichtsbestimmungen von Teilchen wie beispielsweise Polymermolekülen nicht nur von der Maximierung der Größenabhängigkeiten der direkt gemessenen Parameter sondern auch von Faktoren wie beispielsweise der Menge der benötigten Probe, der zur Vervollständigung der Analyse benötigten Zeit und der Genauigkeit der Messungen abhängen. Eine Gelpermeationschromatographie kann zeitaufwendig sein und erfordert eine große Menge an Probe. Verfahren wie beispielsweise eine herkömmliche Gelelektrophorese kann relativ zeitaufwendig sein, erfordert moderate Mengen an Probe und kann sehr große DNA-Teilchen nicht in ihrer Größe bestimmen.
Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren zur effektiven Charakterisierung von Nukleinsäuren durch Bestimmung ihrer Größe oder der Größenverteilung einer polydispersen Probe zu liefern. Es ist weiterhin wünschenswert, Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäuren bereitzustellen, die eine bessere Auflösung liefern als in der Technik bekannte Verfahren oder andere Vorteile.
Allgemein beschrieben, umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren die Charakterisierung einer Nukleinsäure durch Anordnung der Nukleinsäure in einem Medium und Anwendung einer externen Kraft in einer kontrollierten Weise auf die Nukleinsäure für einen Zeitraum, wobei die Kraft von einer Art ist, die eine von der Molekülgröße abhängige meßbare Veränderung in der Nukleinsäure hervorruft, die dadurch gekennzeichnet ist, daß diese Veränderung unter Verwendung eines Mikroskops gemessen wird und daß die Molekülgröße der Nukleinsäure aus der Messung bestimmt wird, die unter Verwendung des Mikroskops durchgeführt wurde.
Solche Verfahren sind für die Charakterisierung von Nukleinsäuremolekülen mit einer Vielfalt von Größen brauchbar, einschließlich der kleinsten Moleküle, die durch ein geeignetes Mikroskop detektiert werden (das Mikroskop kann gegebenenfalls mit einem spektrokopischen Gerät verbunden sein, wodurch Moleküle, die zu klein sind, als daß sie gesehen werden können, immer noch detektiert werden können), und große Polymere, die bis zu mehreren Inch in der Länge aufweisen können, wenn sie zu einer linearen Konformation gestreckt sind. Scherempfindliche Moleküle (z.B. große Moleküle), die nicht auf einen Objektträger gegeben werden können, ohne zu zerbrechen, wenn herkömmliche Verfahrensweisen angewendet werden, können erfindungsgemäß vermessen werden, indem die Moleküle bevor sie in das Medium gegeben werden, verkleinert/geschrumpft (verdichten/kondensiert) werden.
Diese Verfahren sind auf deformierbare und nicht-deformierbare Nukleinsäureteilchen und auf polydisperse Proben anwendbar.
Deformierbare Teilchen sind Teilchen, die eine Neigung zur Veränderung der Konformation (Gestalt) sowie der Position auf weisen, wenn sie einer externen Kraft ausgesetzt sind. Nichtdeformierbare Teilchen neigen dazu, eine im wesentlichen stabile Konformation aufzuweisen, sogar wenn sie einer externen Kraft ausgesetzt sind, aber sie können Veränderungen in der Position eingehen. Deformierbare Teilchen sind üblicherweise reversibel deformierbar, z.B. sie können ihre Konformation ändern, wenn eine externe Kraft angewendet wird, und dann zu einer Konfiguration zurückkehren, die mit ihrer ursprünglichen Gestalt vergleichbar ist, wenn die Einwirkung der Kraft aufhört.
Diese Erfindung ist insbesondere brauchbar zur Vermessung von Nukleinsäuremolekülen, die gefaltet, spiralisiert oder möglicherweise sogar überspiralisiert (supercoiled) sind, wenn sie in einem entspannten Zustand vorliegen, und konformationelle Änderungen wie Streckung, Biegung, Verdrehung, Kontraktion usw. sowie positionelle Änderungen wie Rotation und Translation usw. erfahren.
Teilchen, die groß sind, um bei Verwendung eines Mikroskops gesehen zu werden, können durch Betrachten vermessen werden, z.B. durch direkte Beobachtung eines mikroskopischen Bildes. Alternativ können Teilchen unter Verwendung der Mikroskopie in Kombination mit einer geeigneten Spektroskopietechnik vermessen werden, insbesondere, wenn die Teilchen zu klein sind, als daß sie abgebildet werden können (mit akzeptabler Auflösung gesehen werden können).
Verschiedene nicht-einschränkende Beispiele brauchbarer spektroskopischer Verfahren umfassen die Verwendung von polansierter Strahlung, wie sie durch einen Laser erzeugt wird, in Kombination mit einer Messung des Brechungsindex oder des Fluoreszenzdichroismus, oder unter Verwendung empfindlicher Videokameras wie beispielsweise Vorrichtungen die mit gekühlter Beladung gekoppelt sind, siliciumverstärkte Zielvorrichtungen und Mikrokanalplattendetektoren.
Proben, die eine Mischung von sowohl kleinen als auch großen Teilchen enthalten, beispielsweise kleine und große DNA- Moleküle, können schnell hinsichtlich der Größe vermessen werden, wobei jedes Teilchen der Probe gleichzeitig vermessen wird. Die erfindungsgemäßen Verfahren können die Messung konformationeller und positioneller Veränderungen von individuellen, diskreten Molekülen (oder anderen Teilchen) umfassen, im Gegensatz zu in der Technik bekannten Verfahren, die eine Probe als Masse charakterisieren. Die erfindungsgemäßen Verfahren können angewendet werden, um irgendeine Zahl von Teilchen zu vermessen, die von einem einzelnen Teilchen bis zu einer großen Anzahl von Teilchen reicht. Wenn eine Probe vermessen wird, die eine große Anzahl von Teilchen enthält, hängt die Anzahl von Teilchen, die zur gleichen Zeit beobachtet werden, zum Teil von dem Sichtfeld des Mikroskops und dem Ausmaß ab, in dem die Teilchen voneinander getrennt werden. Die Betrachtung diskreter, individueller Teilchen oder die Messung ihrer Relaxationsrate nach der Einwirkung einer externen Kraft erlaubt eine vollständige Dekonvolution oder Trennung gemessener Parameter.
Das erfindungsgemäß verwendete Medium ist irgendein geeignetes Material. Vorzugsweise hält das Medium entspannte Teilchen in einer relativ stationären Position und erlaubt dennoch eine Bewegung von Teilchen, die einer externen Kraft ausgesetzt sind. Eine freie Lösung kann jedoch ebenfalls verwendet werden. Ein für Messungen der molekularen Bewegung geeignetes Medium ist jedes Medium, das es verschiedenen Teilchen erlaubt, ihre Konformation und Position mit unterschiedlichen Raten in Abhängigkeit von ihrer Größe und möglicherweise in Abhängigkeit von ihrer chemischen Zusammensetzung zu ändern.
Bei vielen Anwendung dieser Erfindung ist das bevorzugte Medium ein Gel oder eine Flüssigkeit. Vorzugsweise ist das Medium antikonvektiv, aber dies ist nicht absolut notwendig. Das Medium kann oder kann nicht inert sein. Die Auswahl eines geeigneten Mediums hängt zum Teil von der Größe der Teilchen ab, die vermessen werden, der Neigung der Teilchen zur Veränderung der Position und Gestalt und der gewünschten Präzision der Messungen. Wenn beispielsweise große Moleküle (oder andere Teilchen ähnlicher Größe) vermessen werden, wird vorzugsweise ein Gel mit einer großen Porengröße verwendet.
Die auf die Teilchen einwirkende externe Kraft kann irgendeine Kraft sein, die die nicht-deformierbaren oder deformierbaren Teilchen dazu bringt, Änderungen in der Konformation oder Position einzugehen. Die Kraft kann beispielsweise ein elektrisches Feld, ein Lösungsmittelfließfeld oder ein magnetisches Feld sein, ist aber nicht auf diese Arten begrenzt. Die Kraft kann in der Richtung, der Dauer und der Intensität variieren. Ein besonders brauchbarer Weg, die Teilchen zu stören, ist die Verwendung von Elektrophorese.
Die Arten von Veränderungen oder Eigenschaften, die erfindungsgemäß gemessen werden, umfassen primär Änderungen in der Konformation oder Gestalt, einschließlich Streckungs- und Relaxationsraten-, sowie Längen- und auch Durchmesser-(oder Radius-) messungen, und Änderungen in der Position, einschließlich Änderungen in der Orientierung und der Rotation sowie der Translation innerhalb des Mediums. Die Teilchen können Änderungen in der Konformation oder Position erfahren oder beides. Verschiedene Arten von Veränderungen werden gemäß verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung gemessen.
Die Techniken zur Messung von konformationellen und positionellen Änderungen umfassen, ohne notwendigerweise darauf eingeschränkt zu sein, Mikroskopie (allein) und Mikroskopie in Kombination mit Spektroskopie. Verschiedene nicht-einschränkende Beispiele brauchbarer spektroskopischer Techniken umfassen die Doppelbrechung, den linearen oder zirkularen Dichroismus und die Detektion der Fluoreszenzintensität.
Teilchen, die groß genug sind, daß sie unter einem Mikroskop gesehen werden können, können durch Betrachtung (Abbildung) der Teilchen vermessen werden. Als nicht-einschränkende Beispiele können ein Lichtmikroskop oder ein Raster-/Tunnelmikroskop verwendet werden. Während Teilchen direkt beobachtet werden können, ist es nützlich, das Mikroskop mit einer für wenig Licht empfindlichen Videokameras zu verbinden, die mit einem computerisierten Bildprozessor verbunden ist (der im folgenden ausführlich beschrieben ist), der eine Reihe von Bildern aufzeichnet, sogar ein bewegtes Bild, indem die Bilder, die empfangen werden, digitalisiert werden. Der Bildprozessor kann selbst einen Computer umfassen oder kann mit einem Computer verbunden sein, der auf den Bildern basierende Daten verarbeitet. Die Verwendung eines computerisierten Geräts ermöglicht die gleichzeitige Messung der Bewegung jedes individuellen Moleküls. Die Beziehungen von Molekülen zueinander kann ferner detektiert werden und es können verschiedene unterschiedliche Parameter eines einzelnen Teilchens gleichzeitig gemessen werden.
Gegebenenfalls werden das Mikroskop und der Bildprozessor mit einem spektroskopischen Gerät verbunden. Diese Technik ist besonders bei Teilchen brauchbar, die zu klein sind, als daß sie gesehen werden können, aber sie ist auch für die Bestimmung der Größe größerer Teilchen brauchbar.
Um die Messungen der Veränderungen der Konformation und Position in Größenbestimmungen umzuwandeln, ist es im allgemeinen notwendig, Daten zu erzeugen (oder anderweitig zu erhalten), die mit physikalischen Veränderungen von Teilchen bekannter Größe in Relation stehen, wenn die Teilchen externen Kräften ausgesetzt werden. Es werden "Marker" (Markierungen) entwickelt, indem die Parameter von Molekülen mit bekannten Molekulargewichtswerten gemessen werden. Diese Information kann in den Computer eingegeben werden, um eine Relation zwischen dem Molekulargewicht und den besonderen konformationellen und positionellen Veränderungen aufzustellen, die gemessen werden. Die Marker sind vorzugsweise Teilchen mit ähnlicher Struktur wie die Nukleinsäureteilchen unbekannter Größe (z.B. beide Teilchen enthalten die gleichen chemischen Komponenten), weil die Raten der Relaxation, Reorientierung und Rotation von der Teilchenzusammensetzung abhängen können. Dies kann jedoch von verschiedenen Variablen abhängen, z.B. der Polymergröße, der Zusammensetzung usw., und es kann daher für die "Marker" nicht immer notwendig sein, eine Zusammensetzung aufzuweisen, die der der Nukleinsäuren unbekannter Größe ähnlich ist.
Scherempfindliche Teilchen sind Teilchen, die zerbrochen werden, wenn sie unter Verwendung herkömmlicher Verfahren auf einen Objektträger angeordnet werden. Gemäß einem bevorzugten Aspekt dieser Erfindung werden solche Teilchen zu einer Konformation höherer Dichte verdichtet/geschrumpft, bevor sie in dem Medium angeordnet werden, um ein Zerbrechen zu verhindern, wenn die Teilchen auf einen Gbjektträger angebracht werden. Nachdem sie einmal in das Medium gegeben worden sind, können sie entschrumpft werden und mit den gleichen Verfahren wie die kleineren Moleküle vermessen werden.
Vorzugsweise werden die scherempfindlichen Nukleinsäuremoleküle mit hohem Molekulargewicht daher mit einem Kondensationsmittel behandelt, um die Moleküle dazu zu bringen, zu einer kompakten, scherbeständigen Konformation zu verdichten. Die Moleküle können mindestens einem Handhabungsvorgang wie einer Überführung mittels Pipette unterzogen werden und können dann entschrumpft werden.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden fluoreszierend gefärbte, deformierbare Moleküle, die spiralisiert, gefaltet oder anderweitig in einer entspannten, natürlichen Konformation konf iguriert sind, in ein Medium gegeben und vorübergehend deformiert oder gestreckt, indem eine externe Kraft angewendet wird. Wenn die Einwirkung der Kraft beendet wird, wird die Relaxationszeit der Moleküle (z.B. die Zeit, die die Moleküle benötigen, um zu ihrem ursprünglichen entspannten Zustand zurückzukehren) durch direkte mikroskopische Beobachtung der molekularen Bewegung oder durch eine Kombination von Mikroskopie und Spektroskopie beobachtet. Alternativ werden die Kinetiken der Streckung gemessen, indem die Streckung der Moleküle nach Einsetzen der externen Kraft verfolgt wird. Ratenmessungen werden auf verschiedene Weise berechnet, z.B. durch Bestimmung der Größe einer Veränderung pro Einheitszeit. Raten von Veränderungen für Moleküle mit unbekannter Größe werden auf Basis von Raten von Molekülen bekannter Größe bestimmt wie beispielsweise durch Interpolation oder Extrapolation.
Wie bei der bekannten viskoelastischen Meßtechnik variiert die Relaxationszeit von Teilchen in einer Flüssigkeit gemäß dieser Ausführungsform wie etwa M1,66. Bei einem Gel wird angenommen, daß die Relaxationszeit mit so viel wie M²&supmin;&sup4; variieren kann. Dies basiert auf theoretischen Prinzipien, die zeigen, daß Moleküle in Gelen oder einengenden Matrizes in ihrer Bewegung eingeschränkt sind und das ihre Relaxationszeit in einem Gel viel größer ist als in einer Lösung (DeGennes, P.E., Scaling Concepts in Polymer Physics, Cornell University Press, N.Y. (1979)).
Bei einer zweiten Ausführungsform wird die Reorientierungszeit eines deformierbaren oder nicht-deformierbaren Teilchens gemessen. Wenn die Teilchen zuerst einer störenden Kraft in einer Richtung ausgesetzt werden und die Richtung der störenden Kraft dann verändert wird, beispielsweise um 90º, orientieren sich kleine Teilchen schnell selbst und beginnen eine neue Migration entlang dem neuen Weg. Größere Teilchen bleiben demge genüber im wesentlichen unbewegt, bis sie in die Richtung des elektrischen Feldes reorientiert sind. Dann beginnen sie sich ebenfalls in die neue Richtung zu bewegen. Zu diesem Zeitpunkt haben sich die kleineren Teilchen bereits fortbewegt. Messungen der Rate, mit der die Position eines Moleküls in bezug auf eine externe Kraft wechselt, können beispielsweise durch Messung von Änderungen in der Position (z.B. lateral Bewegung und/oder Rotationsbewegung) pro Einheitszeit gemessen werden.
Bei einer dritten Ausführungsform wird die Rate bestimmt, mit der ein Teilchen rotiert, wenn eine Reihe von externen Kräf ten angewendet wird. Dieses Verfahren ist insbesondere auf stabförmige Moleküle wie kleine DNA-Moleküle und längliche Moleküle anwendbar, die in einer relativ gleichmäßigen Konformation gehalten werden. "Rotationszeit" gemäß dieser Erfindung ist die Zeit, die ein Moleküle benötigt, um eine positionelle Rotation um ein spezielles Kreisinkrement wie beispielsweise 360º zu durchlaufen, wenn ein spezieller Satz von externen Kräften angewendet wird.
Durch periodisches Umschalten der Pulsrichtung, -intensität und -länge werden Moleküle dazu gebracht, sich etwas vor- und zurückzubewegen, wenn sie gedreht werden. Dies erleichtert die Rotation und entspricht dem Weg, auf dem ein Automobil in eine parallele Parklücke hinein- oder herausgesteuert wird, wobei die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung alterniert. Anders als bei einem Automobil kann ein stabförmiges oder spiralisiertes Molekül jedoch gebogen werden, wenn es rotiert. Eine Pulsfolge kann auch dahingehend funktionieren, daß sie ein deformierbares Teilchen in einer im allgemeinen konsistenten Konformation hält, um brauchbare Messungen zu liefern wie beispielsweise Messungen, die die Rotationszeit mit der Molekülgröße in Zusammenhang bringen.
Die Daten für die Reorientierungs- und/oder Rotationsraten für Teilchen mit bekannter Größe können verwendet werden, um eine Beziehung zwischen der Reorientierungs- und/oder Rotationsrate und der Molekülgröße zu entwickeln, die dann verwendet werden kann, um die Größe verschiedener Polymermoleküle ähnlicher Zusammensetzung und unbekannter Größe zu bestimmen wie beispielsweise denjenigen, die in einer polydispersen Probe vorhanden sind. Die Reorientierungs- und Rotationsraten können bestimmt werden, indem Mikroskopie (bevorzugt kombiniert mit Bildverarbeitung) verwendet wird, um positionelle Veränderungen direkt zu beobachten, oder indem Mikroskopie mit spektroskopischen Messungen kombiniert wird. Dieser Ausführungsformen sind daher nicht nur für Moleküle mit mittlerer und großer Größe brauchbar, sondern auch für Moleküle, die zu klein sind, als daß sie mit akzeptabler Auflösung abgebildet werden könnten.
Bei einer noch anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird die Länge eines Moleküls oder eines anderen Teilchens, das in ein Medium gegeben worden ist, direkt unter Verwendung der Mikroskopie gemessen. Diese Technik liefert eine direkte Messung der Molekülgröße irgendeiner Anzahl von Molekülen. Dieses Ver fahren umfaßt im allgemeinen die Beobachtung der krummlinigen Länge deformierter Moleküle, die in einem gestreckten Zustand vorliegen, z.B. während der Einwirkung einer externen Kraft, oder unmittelbar nach Beendigung einer Kraft, die ein Molekül gestreckt hat. Dieses Verfahren kann jedoch auch auf nicht-de formierbare Moleküle mit einer länglichen Gestalt angewendet werden und eine Vermessung solcher Moleküle erfordert nicht die Einwirkung einer externen Kraft bevor Messungen vorgenommen werden. Vorzugsweise wird bei dieser Ausführungsform die gleiche Mikroskopie- und Abbildungsausrüstung verwendet, wie sie oben beschrieben ist.
Bei einer fünften Ausführungsform wird der Durchmesser (oder Radius) von Molekülen oder anderen Teilchen gemessen, die in einem Medium suspendiert sind. Die Einwirkung einer störenden Kraft ist optionell, weil der Durchmesser eines deformierbaren Moleküls vorzugsweise gemessen wird, wenn das Molekül in einem entspannten Zustand vorliegt und das Molekül in seiner Gestalt kugelförmig, ellipsoid oder globulär ist. Diese Ausführungsform kann zur Vermessung von Teilchen verwendet werden, die deformierbar oder nicht-deformierbar sind, und umfaßt die Verwendung eines Lichtmikroskops, das mit einer computerisierten Abbildungsvorrichtung verbunden ist.
Diese fünf Ausführungsformen können kombiniert werden, so daß einige oder alle der oben erwähnten Parameter gleichzeitig für ein oder mehrere Moleküle gemessen werden können.
Wie oben erwähnt ist, können sehr große Teilchen, die dazu neigen, zu zerbrechen, wenn sie unter Verwendung herkömmlicher Verfahren auf einen Objektträger aufgebracht werden, verdichtet werden, bevor sie in das Medium gegeben werden, wobei ein Mittel verwendet wird, das sie dazu bringt zu kondensieren, und dann, nachdem sie in das Medium gegeben worden sind, entschrumpft werden. Die Moleküle werden dann hinsichtlich der Größe vermessen oder anderweitig gemäß den Verfahren der Ausführungsformen 1 bis 5 charakterisiert. Das Verfahren zur chemischen Verdichtung von Molekülen kann auch angewendet werden, wenn es wünschenswert ist, eine große Zahl von Molekülen in ein kleines Gebiet aufzubringen, wie bei der Mikroinjektion, sogar wenn die Moleküle nicht groß oder scherempfindlich sind.
Die Erfindung stellt eine neue Technik zur Kartierung von Nukleinsäuremolekülen bereit. Wenn beispielsweise eine Nukleinsäure in eine Matrix gegeben und geschnitten wird, werden die Fragmente durch das computerisierte Gerät geordnet und dann durch die oben beschriebenen Verfahren hinsichtlich der Größe vermessen. Die Abfolge der Schnitte wird daher schnell und akkurat bestimmt.
Ein Nukleinsäuremolekül kann sequenziert werden, indem an Teile des Moleküls Sonden hybridisiert werden. Eine Nukleinsäure wird in ein Medium gegeben, zu dem geeignete, gewünschte Sonden zugesetzt werden. Ein rekombinanatorisches Enzym kann anschließend zugegeben werden, falls erforderlich. Eine Reaktion wird durch geeignete Mittel initiiert, beispielsweise durch Zugabe von ATP (Adenosintriphosphat) und Magnesiumionen. Nachdem die Sonden hybridisiert worden sind, werden sie nach den oben beschriebenen Verfahren detektiert, nämlich durch Mikroskopie (allein) oder Mikroskopie in Kombination mit Spektroskopie.
Diese Kartierungs- und Sequenzierungstechniken können einzeln oder in Kombination verwendet werden, um den Karyotyp eines prokaryotischen oder eukaryotischen Organismus zu bestimmen.
Die Erfindung ist ferner unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben und veranschaulicht, wobei:
Figur 1 eine schematische Zeichnung einer elektrophoretischen Mikroskopiekammer ist, die speziell an Fluoreszenzmikroskopieuntersuchungen angepaßt ist,
Figur 2 ein teilweise schematisches und teilweise blockförmiges Diagramm ist, das die Verbindung beispielhafter Kammerelektroden in einer Elektrophoresekammer zeigt, die erfindungs gemäß verwendet werden kann,
Figur 3 eine schematische Darstellung der Vorrichtungen ist, die bei der mikroskopischen Untersuchung von DNA-Molekülen in einem Medium gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden und ein detaillierteres Diagramm ist, das die Vorrichtungen zur Messung der Doppelbrechung zeigt,
Figur 4 die konformationellen und positionellen Veränderungen der DNA zeigt, wenn Moleküle des Bakteriophagen G zwei sequentiellen elektrischen Feldern in unterschiedlichen Richtungen ausgesetzt werden,
Figur 5 die konformationellen und positionellen Änderungen der DNA-Moleküle während der Relaxation von DNA-Molekülen des Bakteriophagen G zeigt, nachdem 600 Sekunden lang Elektrophorese erfolgt ist, wie sie sich anhand der in Beispiel 4 beschriebenen Fluoreszenzmikroskopieexperimente ergeben haben.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann die Anordnung von Nukleinsäuren in einen Medium umfassen, um sie zu beobachten und ihre Größe zu vermessen. Bei verschiedenen Ausführungsformen werden Nukleinsäuren vermessen, entweder während oder nachdem sie durch eine externe Kraft deformiert oder repositioniert worden sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere geeignet für die Untersuchung von Nukleinsäuren und anderen Polymeren, die spiralisiert sind oder möglicherweise sogar überspiralisiert sind, wenn sie in einer entspannten (ungestörten) Konformation vorliegen.
Die Teilchen werden in ein Medium wie ein Lösungsmittel, ein Pulver, ein Glas oder ein Gel gegeben. Andere geeignete Medien können ebenfalls verwendet werden. Das Medium, das die Teilchen enthält, kann auf einen Objektträger gegeben werden oder kann auf eine andere Weise so positioniert werden, daß die Moleküle unter dem Mikroskop beobachtet werden können. Die Eignung eines speziellen Mediums kann zum Teil von der zu verwendeten Meßtechnik abhängen. Das Medium muß es den Molekülen erlauben, die Konformation oder die Position zu verändern. Wenn direkte Beobachtungen und einem Lichtmikroskop gemacht werden, erlaubt es ein geeignetes Medium auch, die Teilchen klar zu sehen. Wenn Mikroskopie mit Doppelbrechungsmessungen kombiniert wird, verhindert ein bevorzugtes Medium eine Konvektion und vergrößert die Größenabhängigkeit des beobachteten Signals. Außerdem ist das Medium selbst unter den experimentellen Bedingungen vorzugsweise relativ frei von einer signifikanten Doppelbrechung.
Eine Charakterisierung von Teilchen auf Basis von Messungen der Fluoreszenzintensität kann durch Verwendung einer Matrix (z.B. eines Mediums, das die Teilchenbewegung teilweise behindert) als Medium erheblich verbessert werden. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist das Medium vorzugsweise eine Lösung oder ein Gel. Agarose- und Polyacrylamidgele sind besonders gut für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Glycerin/Wasser, Polydextran/Wasser und organische Lösungsmittel. Diese Beispiele sollen jedoch den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird Agarose, ein Polysaccharid, das sich von Agar mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 100 000 Dalton ableitet, in einem wäßrigen Puffer (typischerweise eine 1%ige Lösung) gelöst und abkühlen gelassen, wobei sich ein starres Gel bildet, das gelatineähnlich ist. Die Gelmatrix besteht aus einem dreidimensionalen Netzwerk von Agarosepolymerketten, die miteinander durch Wasserstoffbindungen verbunden sind. Eine Erwärmung des Agarosegels überführt es in einen flüssigen Zustand zurück, so daß das Gel als reversibel bezeichnet wird, ebenso wie Gelatine. Das wichtige Merkmal eines Agarosegels ist seine außergewöhnlich große durchschnittliche Porengröße. Obwohl die Porenhohlräume im Agarosegel zur Zeit noch nicht vollständig charakterisiert sind, wird von ihnen angenommen, daß sie ungefähr 0,3 µm groß sind und außerdem kleinere Hohlräume enthalten. Aufgrund seiner großen Porengröße und Inertheit wird Agarose in der DNA-Gelelektrophorese verwendet, weil sie es DNA-Molekülen erlaubt, sich in einem Gel zu strecken und zu bewegen.
Wenn ein Fluoreszenzmikroskop verwendet werden soll (oder wenn die Fluoreszenzintensität durch andere Mittel gemessen werden soll), sind die Teilchen im allgemeinen gefärbt. Färbeverfahren sind in der Technik bekannt. Übliche Färbungen oder Chromophore gemäß dieser Erfindung umfassen, ohne Einschränkung darauf, Ethidiumbromid und 4',6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI). Die meisten Arten von Teilchen werden einige Zeit bevor sie abgebildet werden gefärbt und können gefärbt werden, bevor oder nachdem sie in ein Medium gegeben worden sind.
Wenn ein deformierbares Teilchen in ein Medium gegeben wird und auf einer Scheibe befestigt wird, gibt es mehrere mögliche Wege, die Teilchen zu stören. Einige nicht-einschränkende Verfahren sind wie folgt: (1) Ein Teilchen wird durch Einwirkung eines elektrischen Feldes gestört, das ein geladenes Teilchen wie DNA durch eine Matrix bewegt, die Spiralenkonformation deformiert, ähnlich wie ein Kuchenteig deformiert wird, wenn er durch eine Formgebungsvorrichtung läuft. Dies ist das Phänomen, daß durch Gelelektrophorese hervorgerufen wird. (2) Ein Fließfeld wird in der Agarose/DNA-Flüssigkeit erzeugt und die Teilchen enthaltende Flüssigkeit wird dann schnell durch Abschrecken auf niedrige Temperatur geliert, aber schnell genug, um jedes signifikante Spiralisierungsentspannen zu verhindern. Dieses Verfahren ist unabhängig davon brauchbar, ob das Teilchen geladen ist oder nicht. (3) Bei Verwendung des dielektrophoretischen Effekts werden ungeladene Teilchen mit Feldgradienten (elektrische Felder, die ihre Stärke mit der Position ändern) bewegt, indem die molekularen Elektronenwolken deformiert werden, wodurch anziehungsfähige Dipole induziert werden. Es wird angenommen, daß Dielektrophorese in einer Matrix wie Agarose verwendet werden kann.
Einer der Vorteile der Verwendung von Elektrophorese besteht darin, daß DNA-Teilchen von anderen Teilchen unterschieden werden, die in dem DNA enthaltenden Medium vorhanden sein können, weil sich ungeladene Teilchen nicht als Reaktion auf die Einwirkung eines elektrischen Feldes bewegen. Ein anderer möglicher Weg, um DNA-Teilchen von anderen zu unterscheiden, besteht darin, die DNA zu multiplizieren.
Das Ausmaß, in dem ein Molekül zu stören ist, z.B. in dem seine Konformation und/oder Position Änderungen unterzogen wird, bevor die Messung erfolgt, kann variieren. Beispielsweise werden brauchbare Daten der molekularen Relaxation erhalten, sogar wenn ein spiralisiertes Molekül so gestört wird, daß es nur teilweise entspiralisiert ist.
Wie oben erwähnt ist, verwendet eines der bevorzugten Verfahren zur Störung von Molekülen gemäß dieser Erfindung Elektrophorese. Es kann irgendein für die Verwendung mit einem Mikroskop geeignetes Elektrophoreseverfahren erfindungsgemäß verwendet werden, um die Teilchen zu stören. Elektrophorese kann bei dieser Erfindung gegebenenfalls andere Funktionen erfüllen. Wenn eine Probengröße zu groß oder zu komplex ist, als daß sie unter einem Mikroskop auf einmal betrachtet werden kann, können Moleküle in Unterproben aufgeteilt werden, die dann separat abgebildet werden.
Die Elektrophorese von Molekülen zur Betrachtung und Vermessung kann gegebenenfalls in einer Kammer durchgeführt werden, die geeignet ist, in einer Pulsfeldelektrophorese verwendet zu werden, wie sie in der US-A-4 695 548 beschrieben ist, oder für Pulsorientierungselektrophorese verwendet werden, die im folgenden beschrieben ist. Diese Verfahrensweisen sind besonders in dem Fall brauchbar, wenn es wünschenswert ist, Reorientierungsund/oder Rotationszeiten zu messen, weil die Feldwinkel kontrolliert werden können.
Pulsorientierungselektrophorese (POE) verbessert die Trennung von polydispersen Polymermolekülen in einer Probe, indem kurze elektrische Pulse verwendet werden, um Feldwinkel zu erzeugen und zu variieren, wobei der effektive Feldwinkel durch die Vektorsumme einer Reihe von Pulsen definiert ist, die in ihrer Dauer, Intensität und Richtung variieren können. Pulszeiten und Pulsintensitäten werden moduliert, um eine Trennung zu bewirken. Die POE ist auch zur Erzeugung von effektiven Feldwinkeln während der Abbildung brauchbar. Die benötigten Vorrichtungen werden leicht an das Mikroskop angepaßt.
Ein beispielhaftes Laborgerät für die POE ist in Figur 1 veranschaulicht und eine schematische Ansicht ist in Figur 2 gezeigt.
Das in den Figuren 1 und 2 beispielhaft angegebene Gerät ist ähnlich wie eine Miniaturversion von demjenigen, das in der US-A-4 473 452 beschrieben ist, unterscheidet sich aber darin, daß das POE-Instrument zwei Sätze von Dioden 34 aufweist, die eine bipolare Operation der diskreten Elektrodenanordnungen ermöglichen. Die Dioden 34 können durch ein Mehrwegrelais (nicht gezeigt) ersetzt werden, um eine ähnliche elektrische Isolierung zu liefern. Es ist jedoch am besten, die Dioden 34 zu verwenden, wenn ein sehr schnelles Pulsieren (weniger als 1 Sekunde) erforderlich ist.
Wie in den Figuren 1 und 2 abgebildet ist, weist die Miniatorelektrophoresekammer 50, die erfindungsgemäß verwendet wird, etwa die Größe einer Standardabdeckscheibe auf. Sie weist Elektroden 42 auf, die mit Dioden 34 verbunden sind (Figur 2). Um die gewünschten elektrischen Felder zu erzeugen, werden die Platinelektroden 42 miteinander verbunden, wie es in Figur 2 gezeigt ist. Speziell liefert die Gleichstromquelle 28 Gleichstrom an die Relais 30, die durch einen Computer 32 kontrolliert werden, um ausgewählte Ausgänge mit dem Gleichstrom aus der Gleichstromquelle 28 zu verbinden. Der Computer 32 kontrolliert auch die Gleichstromquelle 28, so daß das Potential der Stromquelle variiert werden kann. Die Ausgänge zu den Relais 30 sind mit den Elektroden 42 über die jeweiligen Dioden 34 für jede Elektrode verbunden.
Wie in Figur 1 gezeigt ist, weist die Miniatur-POE-Vorrichtung einen Halter 52 auf, der auf einen Mikroskoptisch paßt. Eine Scheibe 54, die ein Agarosegel trägt, wird in den Halter eingesetzt und die Elektroden 42 stellen elektrischen Kontakt mit dem Scheibe 54/Gel/Abdeckscheibe 40-Sandwich her, wobei Tropfen von 30 % Glycerin-Agarose an die die Agarose elektrisch verbindenden Drähte 44 gegeben werden. Das Glycerin verhindert ein Austrocknen des Gels. Der elektrische Verbinder 46, der Teil des Halters 52 ist, liefert eine Verbindung zu den bipolaren Dioden 34 und dem pulserzeugenden Gerät, das in Figur 2 gezeigt ist. In Figur 1 verbindet der elektrische Verbinder 46 mit dem Diodenbus und der Pulskontrolle 48.
Wie im Fall der Geräte, die in der US-A-4 473 452 beschrieben sind, erzeugt das vorliegende beispielhafte Gerät elektrische Felder, die orthogonal zueinander sind, zwischen hohen und niedrigen Intensitäten phasenverschoben zueinander entsprechend der gewählten Pulsfplge wie oben beschrieben alternieren und die Teilchen, die durch die Gelmatrix inkrementartig eine Trennung erfahren, in eine Gesamtrichtung bewegen, die zu den jeweiligen Richtungen der erzeugten elektrischen Felder quer verläuft. Aufgrund der neuen bipolaren Natur der Elektrodenausführung ist es möglich, Polaritäten zu verändern, falls gewünscht gleichzeitig, zusätzlich zu einer Alternierung von hohen und niedrigen Intensitäten, ohne signifikante elektrodeninduzierte Feldstörungen zu erzeugen.
Die Bestimmung des effektiven Feldwinkels durch eine Pulsfolge anstelle durch Anordnung einer Elektrodenreihe erlaubt molekulare Orientierungen (und Trennungen), die anderweitig schwierig wären. Wie in Beispiel 4 im folgenden beschrieben ist, ist POE bei DNA-Abbildungsexperimenten verwendet worden. Das in den Figuren 1 und 2 abgebildete und in Beispiel 4 verwendete Elektrophoresegerät kann gegenüber demjenigen der US-A-4 695 548 bevorzugt sein, weil eine Variierung des Feldwinkels durch Bewegung von Elektroden, wie sie durch herkömmliche Pulsfeldelektrophorese gelehrt wird, bei physikalischen Mikroskoptischmessungen unpraktisch ist. Die Verwendung einer POE-Vorrichtung ist jedoch nicht notwendig, um diese Erfindung durchzuführen, wenn die Moleküle durch andere Mittel ausreichend gestört werden können. Herkömmliche Elektrophorese unter Verwendung einer Vorrichtung, die etwa die Größe einer mikroskopischen Scheibe aufweist, ist ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Störung geladener Teilchen.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine kleine Elektrophoresekammer, die Polymerteilchen ent hält, auf einen Objektträger gegeben und die Polymerteilchen werden unter einem Lichtmikroskop betrachtet. Wie in Figur 3a abgebildet ist, wird eine Abbildung einzelner Moleküle mit einem Epifluoreszenzmikroskop 62 erreicht, das mit einer Quecksilberlampe zur Fluoreszenzabbildung ausgestattet ist (anregendes Licht kommt von oberhalb der Probe wie von einem Laser 60, Argonionen für die Fluoreszenz, 2-Frequenz-Helium-Neon für die Doppelbrechung), gekoppelt mit einer für wenig Licht empfindlichen Videokamera, SIT oder Mikrokanalplatte, die mit einem Bildprozessor 66 verbunden ist, die videodigitalisierende elektronische Einrichtungen enthält, die wiederum mit einem Videomonitor 68 verbunden ist. Die Verwendung der Epifluoreszenzmikroskopie in dieser Erfindung ist eine Ausdehnung auf die Methode, die zuerst von Yanigida et al., in Application of Fluorescence in the Biomedical Science, (Herausgeber D.L. Taylor et al.), 321-345 (Alan R. Liss, Inc., New York, 1986) entwickelt worden ist. In dem Mikroskop wird vorzugsweise eine starke Flüssigkeitslinse 48 verwendet. Das Schlüsselerfordernis ist die Verwendung von Objektiven mit einer hohen numerischen Öffnung, die Licht effektiv sammelt. Eine siliciumverstärkte Zielkamera (SIT) mit einem Mikrokanalplattendetektor wird verwendet, um die Lichtempfindlichkeit bis zu dem Punkt der Zählung von Photonen zu verstärken. Der Bildprozessor ist ein Computer, der die Digitalisierung, Verarbeitung und Speicherung von Bildern aus der Videokamera übernimmt. Diese Art von Bildprozessor ist in der Technik bekannt. Die Bilder können radikal verstärkt werden, um Kontrast zu bringen, eine Pseudofarbendarstellung von Grauniveaus zu liefern (Farben können dazu bestimmt sein, Bilder auf einer willkürlichen Basis zu verstärken, nicht anders, als daß was mit der "Einfärbung" alter Schwarzweißfilme erfolgt), und eine Merkmalsanalyse zu liefern, die die Zählung von Objekten im Gesichtsfeld umfassen kann. Es ist möglich, einzelne DNA-Moleküle zu beobachten, die mit einem geeigneten Chromophor gefärbt sind, wie 4',4-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI), wobei Epifluoreszenzmikroskopie verwendet wird.
Die kleinste Größenbestimmung dieser Sichtungstechnik ist durch die Mikroskopauflösung begrenzt, die zur Zeit ungefähr 0,1 Mikron oder ungefähr 300 Nukleotidbasen in einem DNA-Molekül beträgt. Diese Länge entspricht der Länge eines kleinen bakteriellen Gens, wobei jedoch einige DNA-Moleküle bis zu mehreren Inch in der Länge betragen, wie es bei einem menschlichen Chromosom der Fall ist. Da es möglich ist, mehrere Moleküle in einer Probe gleichzeitig zu betrachten, ist es auch möglich, die Größen vieler diskreter Moleküle gleichzeitig zu bestimmen.
Ein alternativer Weg zur Bestimmung der Größe von Teilchen gemäß dieser Erfindung umfaßt die spektroskopische Vermessung von Teilchen. Diese Technik ist, wenn sie mit Mikroskopie kombiniert ist, besonders brauchbar zur Größenbestimmung von Molekülen, die zu klein sind, als daß sie mit zufriedenstellender Auflösung abgebildet werden können, und sie ist ausführlich in Beispiel 6 beschrieben. Sie ist auch für Teilchen mit mittlerer oder großer Größe anwendbar. Die Auflösung bei Verwendung dieser Techniken ist einfach durch Signal/Rauschen begrenzt, wie durch Photonenzählung bestimmt.
Die Größenparameter, die gemäß den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung gemessen werden, umfassen die Relaxations- oder Streckungsraten eines gestörten Teilchens, die Reorientierungsrate und/oder die Rotationsrate eines Teilchens, das störenden Kräften in verschiedenen Richtungen ausgesetzt ist, die krummlinige Länge eines gestörten Teilchens und den Durchmesser eines kugelförmigen, ellipsoiden oder globulären Teilchens. Jede Ausführungsform basiert auf einer mathematischen Beziehung zwischen dem Parameter, der gemessen wird, und der Molekülgröße.
Eine erste bevorzugte Ausführungsform umfaßt die Messung der Zeit, die von einem gestörten Molekül benötigt wird, um in einen entspannten Zustand zurückzukehren, nachdem die Einwirkung einer externen Kraft beendet worden ist. Die Messung von Relaxationskinetiken ist in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben. Diese Ausführungsform basiert zum Teil auf Prinzipien, die mathematisch die Relaxationszeit mit der Molekülgröße verknüpfen. Ein wichtiger Vorteil der Messung von Fragmentgrößen unter Verwendung von Relaxation anstelle von anderen Verfahren wie der Messung der krummlinigen Länge besteht darin, daß die DNA-Moleküle nicht vollständig ausgestreckt werden müssen, um eine genaue Messung zu erhalten. Die gemessene Relaxationszeit ist unabhängig von dem Grad der Spiralenstreckung. Dies ist deutlich bei Messungen von DNA-Relaxationszeiten gezeigt worden, bei denen die viskoelastische Technik verwendet wurde (D.J. Massa, Biopolymers 12:1071-1081 (1973)).
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform umfaßt die Messung der Reorientierungszeit eines Moleküls, das mindestens einer externen Kraft ausgesetzt worden ist, beispielsweise sequentiellen elektrischen Feldern in unterschiedlichen Richtungen. Dies ist in Beispiel 6 im folgenden beschrieben und in den Figuren 4(a) und 5(j) gezeigt. Die Prinzipien, auf denen die Reorientierungsrate basiert, ist von den Erfindern unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie/Bildverarbeitung untersucht worden. Unter Verwendung des im folgenden in den Beispielen beschriebenen Verfahrens ist bestimmt worden, daß während der Pulsfeldelektrophorese der Tropfenzug (blob train) eines DNA-Moleküls sich mit dem angelegten elektrischen Feld auf eine sehr komplizierte Weise orientiert und während dieses Verfahrens die Elektrophoresemobilität verzögert ist, bis die Ausrichtung vollständig erfolgt ist, z.B. bis das Molekül mit dem angelegten Feld ausgerichtet ist. Bei Änderung der Feldrichtung bewegt sich der Tropfenzug gleichzeitig in verschiedene neue Richtungen (d.h. die Tropfen scheinen sich recht unabhängig voneinander zu bewegen). Manchmal dominiert ein Teil des Tropfenzuges bei der Reorientierung mit dem angelegten Feld und zieht den Rest der Tropfen entlang seines erzeugten Weges durch das Gel. Die Zeit, die zur Vervollständigung der Ausrichtung des tropfenzuges notwendig ist, variiert direkt mit der Größe, d.h. ein 10 MB Molekül (1 MB - 1000 kB) benötigt bei Verwendung ähnlicher Feldstärken nur Sekunden. Das Phänomen ist in Figur 4 veranschaulicht. Die Reorientierung wird auf verschiedene Weisen gemessen, einschließlich Lichtmikroskopie und Mikroskop kombiniert mit spektroskopischen Verfahren.
Eine dritte bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt eine Messung der Rotationszeit eines Moleküls, das sequentiellen elektrischen Feldern in verschiedenen Richtungen ausgesetzt wird. In einem Sinn erfordert die Rotation eines Moleküls eine Reihe von inkrementartigen Reorientierungsschritten, wovon jeder das Teilchen dazu bringt, weiter in die gleiche Richtung zu rotieren, bis das Teilchen eine Rotation mit einem spezifizierten Kreis inkrement erfahren hat, beispielsweise 360º. Diese Ausführungsform ist besonders gut geeignet, um steife, stabartige Teilchen zu charakterisieren, wie kleine DNA-Moleküle, die sich bei Einwirkung einer externen Kraft in ihrer Konformation nicht wesentlich verändern. Es können jedoch auch große Moleküle durch dieses Verfahren hinsichtlich der Größe vermessen werden, wenn die Konformation des Moleküls nahezu konstant gehalten wird, vorzugsweise in einer stabartigen oder länglichen Konformation. Dies wird bewirkt, indem eine Pulsfolge angewendet wird, die für Größe, Gestalt und möglicherweise auch der Zusammensetzung des Moleküls geeignet ist.
Als ein nicht-einschränkendes Beispiel werden Moleküle in Gegenwart von sinusartig variierenden elektrischen Feldern gedreht, die mit 90º zueinander angelegt werden. Steife, stabartige Moleküle oder gestreckte Moleküle werden um die langen oder kurzen Achsen gedreht. Die Rotation um die lange Achse weist die größte Molekulargewichtsabhängigkeit auf, wobei die Rotationsdiffusion um etwa M³ variiert. Eine Drehbewegung eines stabartigen Moleküls, das in ein Gel oder ein anderes einengendes Medium eingetaucht ist, kann schwierig sein, wenn ein Versuch gemacht wird, daß Molekül einfach so zu drehen, wie sich eine Schiffsschraube im Wasser dreht. Wenn ein Gel verwendet wird, beeinflußt die Matrix die Drehung des Moleküls ebenso viel wie Seetang die Drehung eines Schiffsschraube beeinflußt. Es wird daher eine Pulsfolge angewendet, die auch eine Vorwärts- und Rückwärtsbewegung der Teilchen liefert, wodurch Rotation erleichtert wird.
Die Pulsfolge kann durch einen Algorithmus definiert werden. Allgemein gesagt, kann der Algorithmus von Variablen wie dem Winkelinkrement, der Zeit, der Intensität des elektrischen Feldes usw. abhängen, und diese können wiederum eine Funktion verschiedener Variablen sein. Die Arten von brauchbaren Algorithmen sind daher zahlreich.
Eine bevorzugte Pulsfolge für die Erfindung kann wie folgt definiert werden:
worin:
1(t) und 2(t) elektrische Feldvektoren multipliziert mit der Zeit sind (Volt.Sekunde/cm);
E(t, θi) die Intensität des elektrischen Feldes in Volt/cm ist;
i und j Einheitsvektoren sind,
θi der Feldwinkel in Bogenmaß oder Grad ist, wobei i = 1Tn ist, wobei
oder 360º ist, für eine vollständige Drehung;
Δt die Pulslänge in Sekunden ist;
t die Zeit in Sekunden ist;
k&sub1; und k&sub2; die Zahlen aufeinanderfolgender identischer Pulse ist und
P eine Pulsfolge ist, die wiederholt werden kann.
Unter Verwendung der obigen Folge rotiert ein Teilchen, auf das geeignete Pulse angewendet werden, etwa (θi+1 - θi) Bogenmaß oder Grad, wenn jeder Satz von Pulsen P initiiert wird. Das Molekül wird auch translatorisch (seitlich bewegt) in die Richtung von (t) und - (t) bewegt, wodurch die Drehung vereinfacht wird.
In der obigen Gleichung ist Δt eine Konstante, dies muß jedoch nicht der Fall sein. kann eine Funktion irgendeiner Variablen oder eines Satzes von Variablen sein. Beispielsweise kann E eine Funktion der insgesamt verstrichenen Zeit und/oder des Winkelinkrements sein. Die Summe aller kreisförmigen Inkremente muß außerdem nicht 360º sein und kann irgendeine Anzahl von Teil- oder Gesamtdrehungen sein, die Messungen mit ausreichender Genauigkeit liefern.
Eine spezifischer Satz von Bedingungen für die Messung der Rotationsrate von Molekülen ist in Beispiel 7 angegeben.
Gemäß einer vierten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht ein brauchbarer Weg zur Messung der Größe von Teilchen wie von Polymermolekülen darin, sie zu betrachten und ihre krummlinige Länge zu vermessen (äquivalent zur Messung der Länge eines Seiles) und zwar direkt unter Verwendung eines Lichtmikroskops. Es ist im folgenden in Beispiel 4 und in den Figuren 4 und 5 gezeigt, daß Fluoreszenzmikroskopie einzelne Polymermoleküle abbilden kann, die mit einem geeigneten Chromophor gefärbt sind. Unglaublicherweise sind sogar einzelne Moleküle leicht erkennbar, obwohl die Polymerdurchmesserdimensionen nur gerade etwa 20 Angström betragen. Wenn das Molekül ausgestreckt ist und eine computerisierte Abbildungsvorrichtung verwendet wird, um die Länge des betrachteten Moleküls zu vermessen, variiert die Größenabhängigkeit der Messung wie etwa M¹. Messungen der Länge sind besonders brauchbar, bei der Größenbestimmung und der Ordnung von DNA-Fragmenten wie Restriktionsspaltprodukten, wie in Beispiel 10 ausführlich beschrieben ist.
Große Teilchen wie beispielsweise große DNA-Moleküle sind schwierig auf einem Objektträger zu befestigen, ohne ein Zerbrechen zu verursachen. Ein typisches menschliches Chromosom kann ein einzelnes DNA-Molekül enthalten, das sich in der Länge über mehrere Inch erstreckt. Die Natur liefert ein kluges Verpackungsschema, um ungefähr 6 Fuß DNA in eine Zelle einzufügen, die nur einige wenige Mikrometer im Durchmesser mißt. Diese großen DNA-Moleküle sind jedoch sehr bruchempfindlich. Lösungen von großen DNA-Molekülen können beispielsweise nicht gegossen, pipettiert oder gerührt werden, ohne daß die Moleküle zerbrechen. Die Arbeit mit großen DNA-Molekülen kann daher sehr schwierig sein. Vor einigen Jahren haben die Erfinder ein auf Gel basierendes Verfahren zur Herstellung großer DNA-Moleküle ohne Zerbrechen entwickelt, das auch Biochemie unter Verwendung intakter Moleküle erlaubt (siehe US-A-4 695 548). Dieses Verfahren wird das Einsetzverfahren genannt und arbeitet wie folgt: Es werden Zellen gewaschen und mit bei niedriger Temperatur gelierender Agarose gemischt, die bei 37 ºC gehalten worden ist. Die Zell/Agarose-Mischung wird in eine Form pipettiert (um kleine Blöcke herzustellen, die in die Löcher eines Scheibengels passen) und gelieren gelassen. Die resultierenden Blöcke oder "Einsätze", wie sie genannt werden, werden dann in eine Lyselösung gegeben, die EDTA, Protease und Reinigungsmittel enthält.
Die Lyselösung diffundiert in den Einsatz, lysiert die Zellen und befreit intakte, nackte DNA-Moleküle von ihren anhängenden Proteinen. Die DNA-Moleküle diffundieren nicht aus der Matrix heraus, weil sehr große Spiralen im allgemeinen nicht fähig sind, zu diffundieren.
Es ist gefunden worden, daß DNA-Moleküle bis zu mindestens einer Megabase (1 Megabase gleich 1 Million Basen 660 x 10&sup6; Dalton), wenn sie in flüssiger Agarose suspendiert sind, gegenüber einer Scherung geschützt sind, wenn sie auf einen Objektträger angebracht werden. Für Moleküle, die größer als 2 oder 3 Megabasen sind, oder in Situationen, wo die Integrität von 100 % der Moleküle sichergestellt werden muß, ist dieses Verfahren jedoch nicht effektiv.
Eine sechste Ausführungsform der Erfindung verringert das oben erwähnte Problem, das bei der Anordnung von Molekülen größer als eine 1 Megabase auf einen Objektträger auftritt. Es ist ein Protokoll entwickelt worden, bei dem ein Kondensationsmittel verwendet wird, um Gel gebundene DNA (wie erhalten aus Einsätzen) zu kleinen scherbeständigen Bällen zu verdichten, die ent faltet werden können, nachdem sie befestigt worden sind, wie durch Zugabe einer ionischen Verbindung, beispielsweise eines Salzes wie Natriumchlorid oder Magnesiumchlorid. Vorzugsweise ist das Verdichtungsmittel Spermin. Das Sperminprotokoll, das in Beispiel 10 weiter beschrieben ist, erlaubt die Anbringung von DNA-Molekülen von sogar den orößten bekannten DNA-Molekülen und wahrscheinlich sogar größeren Molekülen, ohne ein nachweisbares scherbedingtes Zerbrechen. Während die Verwendung von Spermin bevorzugt ist, umfassen andere geeignete Materialien zur Verdichtung des Moleküls irgendein Material, das ein spezielles Teilchen zum Verdichten bringen kann, z.B. irgendein Verdichtungsmittel, das Teilchen dazu bringt, sich vorzugsweise selbst zu solvatieren. Beispiele solcher Materialien umfassen ohne Einschränkung darauf Spermin, Alkohole und Hexaminkobalt.
Eine siebte bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be trifft eine spezifische Anwendung der obigen Ausführungsformen dieser Erfindung, um DNA-Moleküle unter Verwendung von Restriktionsenzymen zu kartieren. Das zuvor bekannte Verfahren zur Konstruktion einer Restriktion besteht darin, DNA mit einem Restriktionsenzym zu inkubieren und die Größe der resultierenden Fragmente separat unter Verwendung herkömmlicher Gelelektrophorese oder Pulsgelelektrophorese zu bestimmen. Eine Größentrennung liefert Information über die Zahl und Größe der Fragmente aber keine Information über die relative Lokalisierung von Fragmenten oder Schnittstellen an dem ungeschnittenen DNA-Molekül. Bei Verwendung des Mikroskops, um Moleküle abzubilden, die durch Restriktionsenzyme geschnitten werden, wird (1) die Größenauflösung akkurat durch die Messung der Relaxationskinetiken bestimmt, kann (2) die Positionierung der Fragmente relativ zueinander bestimmt werden und muß (3) nur ein Molekül zerschnitten werden (wobei jedoch viele Moleküle parallel bildverarbeitet werden können). Die einzige Beschränkung ist der Platz auf dem Probenhalter.
Kurz gesagt, umfaßt eine Restriktionskartierung unter Verwendung des Mikroskops die Anbringung großer in Gel eingebetteter DNA-Moleküle auf einen Objektträger, die Streckung derselben in einem gewissen Ausmaß (es ist nicht notwendig, daß die Moleküle vollständig gestreckt werden), und anschließend die Induzierung einer Spaltung. Die Fragmentpositionen werden aufgezeichnet und ihre Größen werden bestimmt, indem die in den Ausführungsformen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren verwendet werden, wobei Betrachtung oder Spektroskopie eingesetzt wird. Eine bevorzugte Ausführungsform gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist ausführlich in Beispiel 11 beschrieben.
Eine achte bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung betrifft die Kartierung von Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung von Hybridisierungssonden. Mit dieser Technik werden eine Nukleinsäure, eine Sonde (eine charakterisierte Nukleinsäure) und unter bestimmten Umständen ein rekombinationales Enzym in einer Matrix kombiniert. Die Sonde kann von irgendeiner praktischen Länge sein und kann mit irgendeinem geeigneten Kennzeichnungsmittel gekennzeichnet sein. Wenn ein rekombinationales Enzym verwendet wird (z.B. wenn die sonde nicht fähig ist, in das Zielmolekül ohne Verwendung eines restriktionalen Enzyms einzudringen) kann es irgendein geeignetes Enzym sein, beispielsweise eines das in der Technik zur herkömmlichen Kennzeichnung von DNA-Sonden bekannt ist. Ein nicht-einschränkendes spezifisches Beispiel eines brauchbaren rekombinationalen Enzyms ist recA.
Die Hybridisierung kann durch irgendein geeignetes Mittel initiiert werden, beispielsweise durch Diffusion von ATP und Magnesiumionen in den Objektträger.
Die Sonden können an ein Zielmolekül hybridisiert und auf mindestens zwei verschiedenen Wegen betrachtet werden. Ersten kann die Sonde direkt betrachtet werden, wenn sie ausreichend groß ist. Beispielsweise kann eine Sonde, die größer als 1 kB ist, wahrscheinlich unter Verwendung eines Mikroskops gesehen werden, daß zur Zeit erhältlich ist. Zweitens kann ein Chromophor oder ein anderes geeignetes Kennzeichnungsmittel an der Sonde angebracht werden und visuell oder spektroskopisch detektiert werden. Beispielsweise können Texas Red oder Rhodamin sowie andere Chromophore verwendet werden.
Nachdem die Sonde an das Zielmolekül hybridisiert worden ist, gibt es mindestens zwei bevorzugte Wege, die Position der Sonde aufzuzeichnen. Es liegen jedoch auch andere Verfahren im Bereich der Erfindung. Als eine erste bevorzugte Alternative kann die krummlinige Länge des Zielmoleküls vermessen werden. Wenn ein Lichtmikroskop verwendet wird, kann Fluoreszenzintensitätsmessung verwendet werden, um die linearen Regionen zu lokalisieren und zu quantifizieren, die nicht vollständig ausgestreckt sind. Die Position der Sonde wird auf Basis ihres charakterisierenden Merkmals lokalisiert, z.B. des Chromophors, der radioaktiven Kennzeichnung und/oder der Größe.
Als eine zweite bevorzugte Alternative wird ein Zielmolekül mit Restriktionsenzymen zerschnitten und alle Fragmente werden durch die erfindungsgemäßen Verfahren hinsichtlich ihrer Größe bestimmt und vermessen. Die Position des hybridisierten Fragments wird nach einem der oben beschriebenen Verfahren bestimmt, z.B. durch direkte Sichtung des Moleküls oder durch Mikroskopie kombiniert mit spektroskopischen Techniken. Alle Fragmente werden hinsichtlich ihrer Größe bestimmt und der Abstand von den gekennzeichneten Fragmenten zu jedem Ende des Zielmoleküls wird dann leicht berechnet. Die exakte Position der Sonde an einem speziellen Restriktionsspaltprodukt kann durch Zugabe eines neuen Enzyms zur weiteren Digestion aufgezeichnet werden und diese Fragmente können dann visuell kartiert werden.
Zusammengefaßt umfaßt das auf einem Medium basierende erfindungsgemäße Verfahren zur Größenbestimmung die Charakterisierung von Teilchen unter Verwendung eines Mikroskops. Teilchen, die besonders klein sind oder mittelgroße Teilchen werden in ein Medium gegeben und auf einem Träger unter Verwendung herkömmlicher Techniken befestigt. Große Moleküle werden auf einen Objektträger unter Anwendung von Sperminkondensation befestigt, die die Probleme des Zerbrechens beseitigt. An einigen Stellen können die Moleküle gefärbt sein. Die Moleküle können in dem Medium durch Einwirkung eines elektrischen Feldes gestört werden. Das Feld wird dann abgeschaltet, was den Molekülen erlaubt, in ihre Gleichgewichtskonformation zu entspannen, die durchschnittlich kugelförmig oder ellipsoid ist, oder eine bestimmte Position einzunehmen. Ein Bildprozessor, der mit einer Videokamera verbunden ist, zählt die Moleküle und verfolgt die Veränderungen ihrer Gestalt. Die Kinetiken der Relaxation, Reorientierung und Rotation der Moleküle sowie ihre Länge und ihr Durchmesser werden automatisch berechnet und die Molekulargewichte für alle abgebildeten Moleküle werden anhand von aufgestellten Beziehungen berechnet.
Die folgenden Beispiele sind angeboten, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, sollen den Umfang derselben aber nicht einschränken.

BEISPIEL 1

Herstellung von DNA für die Mikroskodie

G Bakteriophage wurde wie von W.L. Fangman, Nucl. Acids. Res., 5, 653-665 (1978), beschrieben aufgezogen und DNA wurde hergestellt, indem das intakte Virus in 1/2 x TBE Puffer (1X: 85 mM Trizma-Base (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 89 mM Borsäure und 2,5 mM Dinatrium EDTA) lysiert wurde und anschließend durch Ethanol gefällt wurde; dieser Schritt schert die DNA nicht, wie durch Pulselektrophorese und mikroskopische Analyse betätigt wurde.
DNA-Lösungen (0,1 µg/µl in 1/2 x TBE) wurden mit (ungefähr 0,1 bis 0,2 ng/al Agarose) 1,0 % bei niedriger Temperatur geherender Agarose (Sea Plague, FMC Corp., Rockport, ME) in 1/2 x 10 TBE, 0,3 µg/ml DAPI (Sigma Chemical Co.), 1,0 % 2-Mercaptoethanol verdünnt und bei 65 ºC gehalten. Alle Materialien ausgenommen die DNA wurden durch einen 0,2 jim Filter geführt, um Fluoreszenztrümmer zu verringern. Jegliches mögliche DNA-Schmelzen aufgrund von experimentellen Bedingungen wurde unter Verwendung der Pulselektrophoreseanalyse überprüft und nicht als Problem befunden.

BEISPIEL 2

Abbildung von DNA in einem Gel

Die Probe von Beispiel 1 wurde auf einen Objektträger gegeben. Um die Probe zu befestigen, wurden ungefähr 3 µl der DNA/Agarose-Mischung vorsichtig auf einen vorgeheizten Träger überführt und unter Verwendung einer Pipettiervorrichtung und von Pipettenspitzen, die abgeschnittene Enden aufwiesen, um Scherung zu reduzieren, mit einem Deckglas abgedeckt. Die hergestellten Träger wurden in eine Miniaturpulselektrophoresevorrichtung gegeben, wie sie in den Figuren 1 und 2 gezeigt ist. Alle restlichen Schritten wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Proben wurden ein paar Minuten lang pre-elektrophorisiert und entspannen gelassen, bevor irgendwelche Daten gesammelt wurden. Es wurden gepulste Felder mit entweder einer Chontrol-Zeit (Chrontrol Corp., San Diego, CA) oder einer Adtron-Daten generierenden Karte (Adtron Corp., Gilbert, AZ) in einen IBM AT Computer erzeugt und durch eine Hewlett Packard 6115A Präzisionsstromversorgung mit Strom versorgt. Die Feldstärken wurden mit Hilfselektroden gemessen, die mit einem Fluke-Digitalmultimeter (J. Fluke Co., Everett, WA) verbunden waren. Ein Zeiss- Axioplanmikroskop (Carl Zeiss, West Deutschland), das mit Epifluoreszenzoptiken ausgestattet war, die für die DAPI-Fluoreszenz geeignet waren, und einem Zeiss-loox Plan Neofluarflüssigkeitsobjektiv ausgestattet war, wurde zur visuellen Betrachtung der Proben verwendet. Anregungslicht wurde unter Verwendung neutraler Dichtefilter gedämpft, um eine Lichtbeschädigung der fluoreszenzmarkierten DNA zu vermeiden. Eine C2400 siliciumverstärkte Zielkamera (SIT) (Hamamatsu Corp., Middlesex, NJ) wurde in Verbindung mit einem IC-1 Bildverarbeitungssystem (Inovision Corp., Research Triangle Park, NC) verwendet, um Videobilder von dem Mikroskop zu erhalten und zu verarbeiten. Es wurden kontinuierlich Bilder mit einer Rate von einem in jeweils fünf oder sechs Sekunden erhalten und soviele wie 200 digitalisierte Bilder konnten pro Zeitdurchlauf gespeichert werden. Jedes digitalisierte Zeitrafferbild profitierte von der Integration von 8 Rahmen, die bei 30 Hz erhalten wurden, was schnell genug war, um einen Fahneneffekt aufgrund von Spiralenbewegung zu vermei den. Nachdem die Zeitrafferaquisition vollständig war, wurde das Mikroskop entfokussiert und ein Hintergrundbild aufgenommen. Jedes Zeitrafferbild wurde verarbeitet, indem zuerst eine Kopie des Hintergrundbildes gedämpft wurde, so daß die durchschnittliche Hintergrundintensität 82 % der durchschnittlichen Intensität des Zeitrafferbildes betrug. Der gedämpfte Hintergrund wurde von dem Zeitrafferbild abgezogen und das resultierende Bild wurde dann einem linearen Streckungskontrastverstärkungsalgorithmus unterzogen. Photographien der verarbeiteten Bilder wurden unter Verwendung eines Polaroideinzelbild-Videobildrekorders (Polaroid Corp., Cambridge, MA) erhalten.

BEISPIEL 3

Störung von Molekülen in einem Gel

Die Moleküle von Beispiel 2 wurden durch POE gestört. POE wurde durchgeführt, indem eine Reihe von relativ kurzen normalen Pulsen mit einem gewählten Verhältnis verwendet wurden und dann nach einer längeren Zeit die Polarität eines der Felder umgeschaltet wurde. Die Umschaltzeit und das normale Feldverhältnis waren analog zu den Pulselektrophoresevariablen der Pulszeit und des Feldwinkels.
Die Nomenklatur, die verwendet wird, um ein POE-Experiment zu beschreiben, ist wie folgt: 3,5-80 Sekunden Pulse, 3 Volt/cm). "3,5-80 Sekunden" bedeutet einen 3-Sekundenpuls in Nord- Süd-Richtung gefolgt von einem 5-Sekundenpuls in Ost-West-Richtung; nach 80 Sekunden dieses 3,5-Sekundenzyklus wurde die Polarität des 5-Sekundenpulses geändert (West-Ost) für weitere 80 Sekunden, und es wurde ein Zickzack-Treppenweg für die betroffenen Moleküle definiert. Die Pulsintensität betrug 3 Volt/cm.
Bei diesem Beispiel war Epifluoreszenzmikroskopie mit dem POE-Verfahren gekoppelt, um eine allgemeine Untersuchung von DNA konformationellen und positionellen Änderungen während der Elektrophorese untersuchen zu können. Während bei diesem Experiment das POE-Verfahren unter Verwendung der angepaßten in Figur 2 gezeigten Mikroskopiekammer durchgeführt wurde, konnten übliche elektrische Felder angeschaltet und abgeschaltet verwendet werden. POE bietet bestimmte Vorteile, wenn elektrische Felder in verschiedenen Winkeln anzuwenden sind, da es nötig sein kann, ein Molekül um seine Längsachse zu rotieren.
Die Figuren 1 und 2 zeigen Darstellungen der angepaßten POE-Kammer.

BEISPIEL 4

Beobachtung und Vermessung der molekularen

Relaxation in einem Gel

Diese Relaxation der G Bakteriophagen DNA der Beispiele 1 bis 3 wurde beobachtet, nachdem POE 600 Sekunden lang durchgeführt wurde (3,5-80 Sekundenpulse, 3 Volt/cm).
Der Bildprozessor wurde verwendet, um das Abbilden des Relaxationsvorgangs zu quantifizieren und zu automatisieren, beispielsweise durch "Merkmalsanalyse". Die Merkmalsanalyse erfolgte, nachdem aufeinanderfolgende Bilder digitalisiert und gespeichert worden sind, wie in Figur 3(a) gezeigt ist. Der Bildprozessor identifizierte dann diskrete Objekte in den Bil dem, numerierte und charakterisierte sie gemäß der Gestalt. Beispielsweise bestimmte der Computer die effektiven Ellipsenachsen (lang und kurz) für eine Sammlung deformierter Spiralen und berechnete diese Merkmale als Funktion der Zeit, wenn die Spirale sich während des Relaxationsvorganges einer kugelförmigen Konformation nähert. Andere Arten computerisierter Messungen können ebenfalls vorgenommen werden, um die DNA zu charakterisieren.
Die in Figur 5 gezeigten Bilder, die in 12-Sekundenintervallen erhalten wurden, zeigen die Relaxation verschiedener Moleküle über eine 60-Sekundenzeitspanne. In (a) sind verschiedene Spiralen 3 Sekunden nachdem das angelegte Feld abgeschaltet wurde gezeigt. Die Spiralen scheinen durch den gleichen gewellten Treppenweg zu relaxieren, der durch die angelegten elektrischen Pulse definiert ist (siehe die Moleküle, die durch Pfeile markiert sind), wie durch die Grenzen der mikroskopischen Auflösung bestimmt ist. In (c) ist ein Molekül gezeigt, daß in zwei aufgesplittet ist, und in (j) sind alle Spiralen zu einer runden, ungedehnten Konformation entspannt. Der in (j) gezeigte Balken weist 10 µm in der Länge auf.

BEISPIEL 5

Bestimmung des Molekulargewichts von einem oder mehreren

Molekülen durch Messung der Relaxationskinetiken

Es wurden Moleküle mit bekanntem Molekulargewicht zur Abbildung gemäß dem Verfahren der Beispiele 1 bis 3 hergestellt und ihre Relaxationszeit der Moleküle wurde durch die Verfahren der Beispiele 1 bis 4 bestimmt. Es wurden Relaxationszeitdaten durch Abbildung gesammelt und verwendet, um eine mathematische Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der Relaxationszeit von DNA-Molekülen ähnlicher Zusammensetzung zu berechnen. Die Relaxationszeit einer Probe von Molekülen mit unbekannter Größe wurde anschließend vermessen und die Größe der Moleküle wurde berechnet, indem die mathematische Beziehung verwendet wurde, die auf der Basis von Molekülen mit bekannter Größe bestimmt wurde.

BEISPIEL 6

Bestimmung des Molekulargewichts von einem oder mehreren

Molekülen durch Messung der Reorientierungsrate

in einem Gel

Polymere mit irgendeiner Größe aber insbesondere solche die zu klein sind für eine Abbildung (kleiner als ungefähr 0,1 µm) wurden in einer Matrix wie Agarose- oder Polyacrylamidgel in ihrer Größe vermessen, indem die Reorientierungsrate gemessen wurde, wie sie durch ein angelegtes elektrisches Feld induziert wurde. Obwohl Reorientierungsmessungen in freier Lösung durchgeführt werden können, ist eine Matrix bevorzugt, weil sie eine unnötige Polymerkonvektion und -bewegung verhindert. Außerdem kann die Gegenwart einer Matrix die Größenempf indlichkeit vergrößern, zum Teil weil der Orientierungsmechanismus anders ist. POE ist für die Messung der Reorientierungszeit wegen ihrer experimentellen Vielseitigkeit und sehr hohen Größenauflösung von vielleicht 15 bis 20 Megabasen besonders brauchbar. Steife Polymere wie DNA-Moleküle (mit einer Größe kleiner als 150 Basepaaren) existieren in Lösung als Stäbe und der Rotationsdiffusionkoeffizient (die Reibung, die von dem Stab erfahren wird, wenn man versucht ihn um seine Längsachse zu drehen) variiert wie M³. Unter Verwendung von Mikroskopie wurden Moleküle, die groß genug waren um abgebildet zu werden, visuell betrachtet und ihre Relaxationszeit wurde aus den Bildern bestimmt. Für irgendeine Größe von Molekülen, insbesondere denjenigen, die zu klein sind um visualisiert zu werden, wurde die Reorientierungszeit für jeden Stab in dem Sichtfeld vorzugsweise durch spektoskopische Verfahren gemessen. Es sind im folgenden ausführlich zwei solcher Verfahren beschrieben, nämlich Fluoroeszenzdichroismus und Doppelbrechung:
(1) Ein Chromophor, das auf eine sterisch vorhersagbare Weise gebunden wird (Ethidiumbromid interkaliert in DNA-Moleküle) wird an einem Polymermolekül angebracht. Polarisierte Strahlung wird verwendet, um das Chromophor anzuregen. Eine Messung der Gesamtfluoreszenzintensität liefert zeitlich Orientierungsinformation für jedes Molekül. Die Fluoreszenzstrahlung jedes Moleküls im Mikroskopfeld wird unter Verwendung eines empfindlichen Mikrokanalplattendetektors gemessen.
(2) Die Orientierungsdynamiken eines Moleküls wird mittels Doppelbrechungsmessungen verfolgt. Doppelbrechungstechniken messen die Änderung des Brechungsindex, der leicht mit der Orientierung von Makromolekülen in einer Lösung oder in einer Matrix korreliert wird. Doppelbrechungsmessungen werden durchgeführt, während die DNA-Moleküle Gelelektrophorese erfahren. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, strecken sich die DNA- Moleküle aus und richten sich mit dem Feld aus, wodurch der Brechungsindex geändert wird. Durch Messung der Änderung der Doppelbrechung mit der Zeit ist es möglich, Einzelheiten der DNA-Trpofenzugbewegung zu verstehen, wenn sich das Molekül mit dem angelegten elektrischen Feld ausrichtet.
Insbesondere werden Doppelbrechungsmessungen durchgeführt, indem die Phasendifferenz von zwei orthogonal polarisierten Ebenen der Laserstrahlung (rotes Licht) bestimmt wird, die sich durch einen kleine Frequenzunterschied unterscheiden (geliefert durch Zwei-Frequenz-Laser). Wenn sich die Moleküle mit dem angelegten elektrischen Feld ausrichten (POE-Kammer), das durch einen Pulskontroller 82 erzeugt wird, ändert sich der Brechungsindex mit der molekularen Ausrichtung. Licht aus dem Laser 70 wird von dem Spiegel 72 durch die Mikroskop-POE-Kammer 74 reflektiert, wird durch den Detektor 76 detektiert und führt zu einem Phasenunterschied in der transmittierten Strahlung, die durch den Phasendetektor 78 gemessen wird (Figur 3b), indem der Wert mit einem Standard verglichen wird, der seine Quelle im Laser 70 hat. Die Phasendifferenzdaten, die als Funktion der Zeit erhalten werden (der Dauer der Feldeinwirkung) werden digitalisiert und im Computer 80 für spätere Heranziehung und Analyse gespeichert.
Die in den Figuren 1 und 2 abgebildeten Vorrichtungen lassen die notwendigen Felder einwirken, um eine molekulare Reorientierung zu verursachen. Es können viele verschiedene Rotationsschemen beschrieben werden, um die Größe von Molekülen in dem Feld optimal zu bestimmen. Beispielsweise kann die Frequenz des rotierenden Feldes verändert werden, um Resonanzfrequenzen mit der Polymerprobe zu finden.

BEISPIEL 7

Bestimmung des Molekulargewichts von einem oder mehreren

DNA-Molekülen durch Messung der Rotationszeit

der Moleküle in einem Gel

Es wurden Moleküle mit der Gestalt von Stäben oder steifen Spiralen hergestellt und wie in den Beispielen 1 bis 4 beobachtet, ausgenommen, daß gegebenenfalls ein Acrylamidgel anstelle des Agarosegels verwendet werden kann.
Die Rate der Rotation einer Spirale oder eines Stabes wurde mit einem auf einem Mikroskop basierenden System gemessen, wobei irgendeine der oben in Beispiel 6 beschriebenen Techniken verwendet wurde. Es wurden Messungen eines sinusartig variierten Signals durchgeführt, wenn das Molekül um sein Zentrum dreht. Das sinusartige Signal wurde verwendet, um die Polymergröße oder das Polymergewicht zu bestimmen, indem die Dauer des sinusartigen Signals an den Rotationsreibungskoeffizienten angepaßt wurde, der sich wie Kubikpotenz der Stablänge ändert. Mit anderen Worten, variiert die gemessene anguläre Geschwindigkeit, wie sie anhand des sinusartigen Signals gemessen wurde (Bogenmaß pro Sekunde) in freier Lösung wie die Stablänge mit der dritten Potenz (S. Boersma, (1969) J. Chem. Phys. 32:1626-1631, 1632- 1635).
Die Bedingungen für eine vorgeschlagene Reihe von experimentellen Durchläufen mit konstantem t sind im folgenden angegeben. Molekülgröße (Basepaare oder Kilobasen) Elektrische Feldstärke (Volt/cm) Dauer jedes Pulses Inkrementwinkel (in Uhrzeigerrichtung (Grad)
In dem ersten Beispiel wurden daher Paare, Tripletts oder andere Sätze von Pulsen von 5 Volt/cm nacheinander für 0,1 Millisekunden in entgegengesetzten Richtungen angelegt, wobei die Richtung des ersten von jedem aufeinanderfolgenden Satz von Pulsen um 100 in Uhrzeigerrichtung von dem Startpunkt aus erhöht wird.
Moleküle mit unbekanntem Molekulargewicht wurden in ein Gel gegeben und ihre Rotationsrate wurde bestimmt, wenn die oben beschriebenen elektrischen Felder angelegt wurden. Rotationszeitdaten wurden gesammelt und verwendet, um eine mathematische Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der Rotationszeit von G Bakteriophagen DNA-Molekülen in einem speziellen Gel zu berechnen. Die Rotationszeit von Molekülen unbekannter Größe wurde anschließend gemessen, vorzugsweise unter Verwendung eines ähnlichen elektrischen Feldes, und die Größe der Moleküle wurde unter Verwendung der mathematischen Beziehung berechnet, die auf Basis von Molekülen bekannter Größe bestimmt worden ist.

BEISPIEL 8

Bestimmung des Molekulargewichts von einem oder mehreren Molekülen durch Messung der krummlinigen Länge von DNA- Molekülen in einem Gel

Das Verfahren der Beispiele 1 bis 4 wurde für Moleküle mit unbekanntem Molekulargewicht durchgeführt. Es wurden Messungen der krummlinigen Länge der Moleküle, während sie in gestörtem Zustand sind, gesammelt, indem die Moleküle betrachtet wurden, und wurden verwendet, urn eine mathematische Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und der Länge zu berechnen. Die krummlinige Länge von gestörten Molekülen ähnlicher Zusammensetzung und unbekannter Größe wurde dann unter Verwendung der Verfahren der Beispiele 1 bis 4 vermessen und die Größe der Moleküle wurde unter Verwendung der mathematischen Beziehung berechnet, die auf Basis von Molekülen bekannter Größe bestimmt wurden. Die Figuren 4 und 5 zeigen gestörte Moleküle, für die Messungen der krummlinigen Länge durchgeführt werden können.

BEISPIEL 9

Bestimmung des Molekulargewichts von einem oder mehreren Molekülen durch Messung des Durchmessers von DNAMolekülen in einem Gel

Das Verfahren der Beispiele 1 bis 4 wurde auf Moleküle mit unbekanntem Molekulargewicht angewendet, ausgenommen, daß die Messungen erfolgten, wenn die Moleküle in einem vollständig entspannten Zustand vorlagen. Messungen des Durchmessers oder der Durchmesser der im wesentlichen kugelförmigen oder ellipsoiden G Bakteriophagen DNA-Moleküle wurden gesammelt und verwendet, um eine mathematische Beziehung zwischen dem Molekulargewicht und dem Durchmesser von G Bakteriophagen DNA-Molekülen in dem Gel zu berechnen. Anschließend wurde der Durchmesser von Molekülen unbekannter Größe gemessen und die Größe der Moleküle wurde berechnet, indem die mathematische Beziehung verwendet wurde, die auf Basis von Molekülen bekannter Größe bestimmt wurde. Die Figuren 4(a) und 5(j) zeigen entspannte Moleküle, bei denen Durchmessermessungen vorgenommen werden können.

BEISPIEL 10

Herstellung von großen DNA-Molekülen für die Abbildung

Es wurden chromosomale DNA-Moleküle aus Saccharomyces cerevisiae hergestellt und isoliert, indem das Einsatzverfahren und die Pulselektrophorese verwendet wurden. Bei niedriger Temperatur gelierendes Agarosegel (FMC Corp., Rockland Maine) wurde für die Herstellung verwendet, um ein Schmelzen bei relativ niedriger Temperatur zu erlauben. Da UV-Strahlung DNA-Moleküle aufbrechen kann, wurden gewünschten Banden aus dem Gel herausgeschnitten, geführt durch mit Ethidium gefärbte Flankenrandabschnitte, die aus dem Gel herausgeschnitten wurden, und dann mit einem 301 nm Transilluminationsgerät photographiert wurden. Die Bänder wurden dann gewogen und mit einer 10fach überschüssigen Menge von 10 mM Spermin in Wasser 3 Stunden lang bei Raumtemperatur ins Gleichgewicht gebracht. Sperinin erfordert eine Umgebung mit sehr niedriger Ionenstärke, um DNA zu verdichten, und glücklicherweise sind die in der Elektrophorese verwendeten Puffer von geringer Ionenstärke, wodurch die Notwendigkeit für eine Gleichgewichtsbildung beseitigt wird. Die ins Gleichgewicht gebrachten Proben wurden dann in einem Ofen 2 Stunden lang bei 74 ºC geschmolzen und nach dem Schmelzen wurden DAPI (1 µg/ml) und 2-Mercaptoethanol (1 %) zugesetzt. 3 µl der geschmolzenen Agarose/DNA-Mischung wurden vorsichtig auf einen vorgeheizten Objektträger aufgebracht und eine Objektträgerabdeckung wurde aufgesetzt, bevor die Mischung gelierte. Der Träger wurde unter Verwendung eines Zeiss-Axioplanepifluoreszenzmikroskops, das mit einem 100x Plan Neofluar-Objektiv ausgestattet war, betrachtet und zeigte kleine intensiv helle Kugeln, die durch Zugabe von Salz durch die Ränder des Abdeckung/Träger-Sandwiches entschrumpft werden konnten.
Wie oben erwähnt ist, ist Spermin besonders brauchbar in einer Umgebung mit geringer Ionenstärke. Andererseits wird die gleiche Art von Verdichtungseffekt mit Alkohol bewirkt, wenn DNA-Moleküle in einer hochionischen Umgebung angeordnet sind. Keines dieser Beispiele soll den Umfang der Erfindung einschränken.

BEISPIEL 11

Restriktionskartierung von Schizosaccharomyces pombe chromosomalen DNA-Molekülen

Die DNA von Schizosaccharomyces pombe, einem Pilz mit einer Genomgröße von etwa 17 bis 19 Megabasen verteilt auf drei Chromosomen mit 3, 6 und 8-10 Megabasen in der Größe, wurde für die Mikroskopie durch Verdichtung und Entschrumpfung gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 hergestellt. Die 3 bis 5 µl Agarosemischung enthielt ungefähr 0,1 Nanogramm DNA, 0,5 % b-Mercaptoethanol, 1 µg/ml DAPI, 100 µg/ml Rinderserumalbumin (acetyliert; Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) und 10 bis Einheiten eines geeigneten Restriktionsenzyms. Diese Mischung wurde kurz bei 37 ºC gehalten und vorsichtig auf einen Objektträger gegeben und anschließend mit einer Trägerabdeckung bedeckt. Vor der Digestion mit Restriktionsenzymen wurde die DNA auf einem von zwei Wegen gestreckt: (1) das flüssige Träger/Agarose/Trägerabdeckung-Sandwich wurde gegebenenfalls leicht durch Bewegung der Trägerabdeckung geschert oder (2) es wurde ein elektrisches Feld angelegt, indem beispielsweise die in Figur 3 beschriebene POE-Vorrichtung verwendet wurde. Eine 10 mM Magnesiumchloridlösung wurde dann in das Sandwich diffundiert, nachdem das Gel einmal gehärtet war. Als die Magnesiumionen den DNA/Enzym-Komplex erreichten, zerschnitt das Enzym die DNA-Moleküle.
Die Positionen der Restriktionsschnittstellen wurden bestimmt, indem der DNA-Strang von einem Ende zum anderen verfolgt wurde, wobei der Mikroskopaufbau verwendet wurde und die Schnittstellen notiert wurden. Diese Stellen erscheinen in dem Strang, der vor der enzymatischen Digestion kontinuierlich war, als Spalten. Die Größe jedes der Fragmente wurde dann durch das mikroskopische Verfahren gemäß dieser Erfindung bestimmt, einschließlich (1) Messung der krummlinigen Länge jedes Fragments, (2) Relaxierenlassen der Fragmente und Messung ihrer Durchmesser, (3) Störung der Konformation jedes Fragments mit einem angelegten elektrischen Feld oder einem Fließfeld (wie erzeugt durch Bewegung von Lösungsmittel durch ein Gel) und Messung der Relaxationskinetiken mit einer direkten visuellen Detektion der konformationellen und positionellen Änderungen oder mittels Mikroskopie kombiniert mit Spektroskopie. Eine direkte visuelle Beobachtung ist für größere Moleküle bevorzugt, während die anderen Verfahren für Fragmente gut geeignet sind, die zu klein für eine Abbildung sind.
Die resultierende Probe zeigte, wenn sie durch ein Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurde, eine Reihe von hellen Kugeln mit drei unterschiedlichen Größen, wobei die Durchmesser wie M0,33 variierten. Was auf der Formel für das Volumen einer Kugel basiert, 4/3πR³. Das Gel enthielt auch Restriktionsenzym, das nur aktiv ist, wenn Magnesiumionen vorhanden sind.

BEISPIEL 12

In situ-Hybridisierung von Nukleinsäuresonden an

einzelne DNA-Moleküle

Nukleinsäuren wurden für die Mikroskopie wie in den Beispielen 1 bis 4 oben beschrieben hergestellt. Das Agarosemedium, das die Nukleinsäureteuchen enthielt, enthielt auch markierte Sonden und ein rekombinatorisches Enzym, recA, das eine Strangverschiebung des Zielmoleküls durch die Sonde vermittelt. Eine Strangverschiebung und Paarung tritt durch Ausbildung einer D- Schleife auf (siehe C. Radding, Ann. Rev. Genet. 16:405-37 (1982)). ATP und Magnesiumionen wurden zu Beginn der Reaktionen zugesetzt. Die Bestandteile wurden in das Träger/Gel/Trägerabdeckung-Sandwich wie in Beispiel 11 beschrieben diffundiert. Die Reaktion wurde bei 37 ºC inkubiert. Es wurde viele verschiedene Zielmoleküle gleichzeitig analysiert, indem Sonden mit verschiedenen Markierungen verwendet wurden.
Variationen der erfindungsgemäßen Verfahren, die von denjenigen abweichen, die spezifisch vorstehend beschrieben worden sind, liegen im Bereich der Erfindung. Beispielsweise können andere Parameter der Moleküle zusätzlich gemessen werden und verschiedene Arten von Mikroskopen und spektroskopischer Ausrüstung können verwendet werden. Die Pulsfolgen zur Bewirkung von Teilchenrotation kann variiert werden. Kombinationen der oben beschriebenen Techniken sind ebenfalls umfaßt. Beispielsweise liegen Kombinationen von verschiedenen Arten von externen Kräften, Medien und spektroskopischen Techniken im Bereich der Erfindung. Ferner kann eine Meßtechnik mehrere Male wiederholt werden und die Messungen aus jedem Versuch können gemittelt werden.
Die Verfahren gemäß einem der Beispiele 4 bis 9 können mit dem Verfahren von Beispiel 11 oder Beispiel 12 kombiniert werden, um einen unbekannten Karyotyp eines prokaryotischen oder eukaryotischen Organismus zu bestimmen.
Wie in den obigen Beispielen veranschaulicht ist, wird ein Verfahren zur Beobachtung großer Moleküle oder anderer großer Teilchen bereitgestellt (einschließlich Moleküle, die zu groß sind, als daß eine andere Methode verwendet werden kann), wobei ihre Größe bestimmt wird und die Molekulargewichtsverteilung einer Probe bestimmt wird, die große Moleküle enthält.
Ferner ist ein schnelleres und effizienteres Verfahren zur Bestimmung der Größe einzelner Teilchen und der Gewichtsverteilung einer Probe von Teilchen beschrieben, bei dem die Größenbestimmung eines oder mehrerer Teilchen durch Anwendung eines extrem empfindlichen Verfahrens erfolgt, z.B. eines Verfahrens, das eine Menge einer Probe so klein wie ein einzelnes Teilchen verwenden kann.
Es ist außerdem ein Verfahren beispielhaft beschrieben, das eine genaue Größeninformation für eine polydisperse Probe liefert, die Teilchen mit einem großen Bereich von Größen enthält, und diese Information schneller liefert, als es bei Anwendung zuvor bekannter Techniken möglich ist.
Die Beispiele zeigen daher ein genaues Verfahren zur Bestimmung der Größe von einzelnen Teilchen und der Gewichtsverteilung einer polydispersen Probe von Teilchen. Ein anderer wichtiger Vorteil der beschriebenen Verfahren gegenüber den bekannten Techniken besteht darin, daß die meßbaren Parameter für jedes der Teilchen in einer polydispersen Proben und nicht für die größten Teilchen bestimmt werden. Zusätzliche Vorteile bestehen darin, daß (1) nur ein Molekül benötigt wird und die Probe sehr klein sein kann, z.B. aus nur einem oder nur ein paar Molekülen bestehen kann, (2) die Messungen auf ein repräsentatives Teilchen für jede Größe in der Probe basieren können, (3) die Technik für sehr große Teilchen verwendet werden kann (Teilchen, die zu groß sind, als daß sie durch bekannte Verfahren gemessen werden können, (4) die Daten effizient durch einen Computer verarbeitet werden können, (5) die Messungen schneller durchgeführt werden können als bei bekannten Verfahren (z.B. insbesondere im Vergleich zu langsamen Elektrophoreseverfahren, die mehrere Wochen dauern können), und (6) die Messungen extrem genau sind.

Claims

1. Verfahren zur Charakterisierung einer Nukleinsäure, bei dem die Nukleinsäure in ein Medium gegeben wird und eine externe Kraft auf eine kontrollierte Weise auf die Nukleinsäure eine Zeit lang einwirkt, wobei die Kraft von einer Art ist, die in der Nukleinsäure eine von der Molekülgröße abhängige, meßbare Veränderung hervorruft, dadurch gekennzeichnet, daß diese Veränderung unter Verwendung eines Mikroskops gemessen wird und die Molekülgröße der Nukleinsäure anhand der unter Verwendung des Mikroskops durchgeführten Messung bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ferner eine Nukleinsäure in dem Medium mindestens einem Restriktionsenzym unter solchen Bedingungen ausgesetzt wird, daß Restriktionsaufspaltung auftritt, wobei die Fragmente der externen Kraft ausgesetzt werden, von der Molekülgröße abhängige Veränderungen in den Fragmenten unter Verwendung des Mikroskops gemessen werden und die Molekülgrößen der Fragmente anhand der mit dem Mikroskop durchgeführten Messungen bestimmt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem ferner die Restriktionsfragmente unter dem Mikroskop beobachtet werden, um die Kartenposition der aus der Nukleinsäure enthaltenen Fragmente zu bestimmen.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, bei dem die Nukleinsäure vor der Restriktionsaufspaltung gestreckt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Molekülgrößenbestimmung (Molekülgrößenbestimmungen) unter Bezugnahme auf Änderungen durchgeführt wird/werden, die mit einem Mikroskop bei mindestens zwei Nukleinsäuren bekannter Größe gemessen wurden, die im wesentlichen ähnlichen Charakterisierungsbedingungen ausgesetzt waren wie die Nukleinsäure oder die Restriktionsfragmente derselben.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Nukleinsäure scherempfindlich ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Nukleinsäure ferner mit einem Verdichtungsmittel verdichtet wird, bevor sie in das Medium gegeben wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Verdichtungsmittel Spermin, Spermidin, ein Alkohol oder Hexaminkobalt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, bei dem die Nukleinsäure ferner mit einer ionischen Substanz entschrumpft wird, nachdem sie in das Medium gegeben worden ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Nukleinsäure mit einem Markierungsmittel markiert wird, um die Beobachtung der Nukleinsäure unter Verwendung des Mikroskops zu erleichtern.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Nukleinsäure/Restriktionsfragmente unter Hybridisierungsbedingungen einer Sonde ausgesetzt wird/werden, die fähig ist, an einen Teil der Nukleinsäure oder eines oder mehrere Restriktionsfragmente zu hybridisieren.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Sonde und die Nukleinsäure/Restriktionsfragmente einem rekombinatorischen Enzym ausgesetzt werden, um ihre Hybridisierung zu erleichtern.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, bei dem die Sonde mit einem Chromophor markiert wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Medium mindestens eines von einer Lösung, einem Gel, einem Pulver oder einem Glas umfaßt.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die externe Kraft ein oder mehrere von einem Lösungsmittelfließfeld, einem elektrischen Feld und einem magnetischen Feld umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die externe Kraft ein gepulstes elektrophoretisches Feld ist, dessen Pulse in mindestens einem von der Dauer, der Intensität und der Orientierung variieren.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das gepulste elektrophoretische Feld ein gepulstes orientiertes elektrophoretisches Feld ist.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Mikroskop ein Lichtmikroskop oder ein Raster-/Tunnel- Mikroskop ist.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Messung eine spektroskopische Messung einer Veränderung von mindestens einem von der Fluoreszenzintensität, des Brechungsindexes, der Absorption von polarisierter Strahlung und der Emission von polarisierter Strahlung ist.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Veränderung eine konformationelle Veränderung umfaßt und die Rate der Veränderung nach der Inituerung der Kraft gemessen wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bei dem die Veränderung eine positionelle Veränderung umfaßt und die Rate der Veränderung nach der Inituerung der Kraft gemessen wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die positionelle Veränderung eine Rotationsveränderung umfaßt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Konformation der Nukleinsäure oder des Restriktionsfragments im wesentlichen während dieser Rotation gleichförmig bleibt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem das Medium eine Matrix umfaßt und die Rotationsveränderung durch eine Reihe von sequentiellen Pulsen in der einwirkenden externen Kraft bewirkt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die sequentiellen Pulse durch einen Algorithmus definiert werden.

26. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die sequentiellen Pulse elektrisch sind und gemäß dem folgenden Algorithmus geliefert werden:

worin:

E1(t) und E2(t) elektrische Feldvektoren multipliziert mit der Zeit sind (Volt Sekunde/cm) sind;

E(t, θi) die Intensität des elektrischen Feldes in Volt/cm ist;

i und j Einheitsvektoren sind,

θi der Feldwinkel in Bogenmaß oder Grad ist, wobei

i = 1Tn ist, wobei

oder 360º ist, für eine

vollständiger Drehung ist;

Δt die Pulslänge in Sekunden ist;

t die Zeit in Sekunden ist;

k&sub1; und k&sub2; die Zahlen aufeinanderfolgender identischer Pulse ist und

P eine Pulsfolge ist, die wiederholt werden kann.

27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem ferner ein Radius oder Durchmesser der Nukleinsäure oder des Nukleinsäurefragments gemessen wird, wenn die Nukleinsäure oder das Fragment im wesentlichen kugelförmig oder ellipsenförmig ist.

28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Nukleinsäure eine Population von Nukleinsäuren umfaßt und die Änderungen bei jeder der Nukleinsäuren oder jedem Restriktionsfragment gleichzeitig gemessen werden.

29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Nukleinsäure ein im wesentlichen intaktes Chromosom eines Organismus ist.