DE69025763T2

DE69025763T2 - Vasodilatierende und immunsupprimierende peptide

Info

Publication number: DE69025763T2
Application number: DE69025763T
Authority: DE
Inventors: Ethan Lerner; Heinz Remold; Jose Ribeiro; Richard Titus
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2010-06-30
Also published as: EP0479899B1; WO1991000293A1; EP0479899A1; AU5966490A; DE69025763D1; ATE135015T1; CA2063260A1; JPH06502385A

Description

Die Regierung der USA hat möglicherweise Rechte an dieser Erfindung im Nachgang zu den Erteilungsnummern AI 24511, AI 18694 und AI 22794 des National Institute of Health.

Allgemeiner Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die in der Lage sind, bei Säugern eine Vasodilatation oder temporäre Immunsuppression herbeizuführen, Zusammensetzungen, die solche Proteine enthalten, Verfahren zur Herstellung der Proteine durch Peptidsynthese- und rekombinante DNA-Techniken sowie synthetische Formen solcher Proteine. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Desensibilisierung eines Säugers gegenüber der Wirkung eines Immunogens durch Verabreichung bestimmter Peptide, die das Immunsystem vorübergehend inaktivieren.
Vasodilatatoren sind Arzneimittel, die zur Behandlung verschiedener Leiden nützlich sind, die durch verengte Blutgefäße hervorgerufen werden. Solche Leiden sind z. B. das Raynaud-Syndrom, verschiedene postoperative Komplikationen bei Hirnoperationen, die eine subarachnoidale Blutung zur Folge haben, Herzinsuffizienz, Angina pectoris und Hypertonie . Seit kurzem wird das Neuropeptid CGRP (Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid) als wirksamster und in seiner Wirkung anhaltendster, bekannter Vasodilatator genannt. Calcitonin, ein weiteres Neuropeptid, das in erster Linie für seine Fähigkeit bekannt ist, Knochenschwund in Phasen von Calciumbeanspruchung zu verhindern, ist von demselben Gen wie CGRP abgeleitet. Trotz geringer struktureller Homologien sind die Konformationen von Calcitonin und CGRP ähnlich genug, um gegenseitig auf die Rezeptoren wirken zu können. CGRP hat auf Knochen eine schwache, calcitoninähnliche Wirkung (Zaidi et al., Quart. J. Exp. Physiol., 72, S. 371 (1987)).
Ribeiro et al. (Science, 243, S. 212 - 214 (1989)) beschreiben ein vasodilatatorisches Peptid von der Sandfliege Lutzoyia longipalpis und legen erste Ergebnisse vor, die darauf hindeuten, daß das Peptid vasodilatatorische Aktivität hat.
Die Makrophage, ein großer Phagozyt des retikubendothelialen Systems, spielt bei der Induktion und Expression von Zellimmunität die Hauptrolle. Durch Verarbeitung des antigenen Reizes und nachfolgende Antigenpräsentation durch Makrophagen in Gegenwart von Histokompatibilitätsantigenen der Klasse II kann eine Reaktion der T-Lymphozyt-Helferzelle ausgelöst werden (Buss et al., Immunol. Rev., 98, S. 115 (1987)). Außerdem können Makrophagen über die Bildung von Zytokinen, z. B. IL-1, die Reaktionen der T-Zellen steuern (Unanue et al., Ann. L'Institute Pasteur, 138, S. 489 (1987)).
Durch Aktivierung von Makrophagen wird die mikrobizide und tumorvernichtende Aktivität der Zellen erhöht, ein Vorgang, der von starken Veränderungen der verschiedenen Intrazellular-, Sekret- und Zelloberflächen-Proteinspiegel gekennzeichnet ist (Adains et al., Ann. Rev. Immunol., 2, S. 283 (1984)). Die Spiegel von Sekret-IL-1 und exprimiertem Histokompatibilitätsantigen der Klasse II steigen (vergleiche Adams et al.), während der 5'-Nucleotidase- Spiegel sinkt (Johnson et al., J. Immunol., 131, S. 1038 (1983)). Außerdem steigt die Produktion von H&sub2;O&sub2; durch aktivierte Makrophagen (siehe oben Adams et al.). Makrophagen können durch eine Reihe von Lymphokinen, z. B. IFN-γ (Merry et al., J. Immunol., 134, S. 1619 (1985)), sowie durch bakterielle Zellwandprodukte, z. B. Lipopolysaccharid (Pabst et al., J. Exp. Med., 151, S. 101 (1980)), aktiviert werden. Seit kurzem wird die Meinung vertreten, daß aktivierte Makrophagen, da sie den Entzündungsort sterilisieren, deaktiviert werden und so über die anhaltende Freisetzung von zytotoxischen Produkten eine mögliche Schädigung des Wirtsgewebes verhindern (Tsunawaki et al., Nature, 334, S. 260 (1988)).
Erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Proteinen, die von dem Speicheldrüsenlysat der Sandfliege Lutzomyia longipalpis abgeleitet sind und bei Säugern Vasodilatation und temporäre Immunsuppression bewirken. Weitere Aufgaben sind die Charakterisierung des Proteins, die Bereitstellung natürlicher und rekombinanter Formen des Proteins sowie die Bereitstellung von proteincodierenden Genen und Verfahren zur Herstellung des Proteins durch rekombinante DNA- und Peptidsynthese-Techniken. Die zweite Aufgabe ist die Bereitstellung von Verfahren zur Desensibilisierung eines Säugers gegenüber der Wirkung eines Immunogens durch Verabreichung des von Lutzomyia, CGRP, Calcitonin, aktiven Analoga oder deren synthetischen Formen abgeleiteten Proteins.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde gefunden, daß ein vom Speicheldrüsenlysat der Sandfliege Lutzomyia longipalpis ableitbares Protein die Fähigkeit besitzt, bei Säugern eine Vasodilatation und/ oder temporäre Immunsuppression hervorzurufen. In einem Ausführungsbeispiel ist das Protein ein im wesentlichen reines Protein oder ein aktives Fragment davon, ableitbar vom Speicheldrüsenlysat der Sandfliege Lutzomyia longipalpis, das bei einem Säuger eine Vasodilatation oder temporäre Immunsuppression verursacht und ein Molekulargewicht von etwa 6839 Dalton hat, massenspektrometrisch bestimmt. Das Protein ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Acetonitril-H&sub2;O-Trifluoressigsäure-Elution in einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesäule (HPLC) mit umgekehrten Phasen vor dem CGRP eluiert wird oder eine vasodilatatorische Aktivität zeigt, gemessen durch Erytheminduktion in Tierhaut, die mindestens etwa 80 - 100 mal stärker als die des CGRP ist, oder ca. 1 % der Gesamtproteinmenge in den Speicheldrüsen der Sandfliege ausmacht. Die vasodilatatorische Aktivität kann, wie beim CGRP, relativ lange andauern, z. B. mehrere Tage.
Eine durch dieses Protein verursachte, temporäre Immunsuppression erfolgt in Form einer Inhibierung der Makrophagenfunktion. Angezeigt wird dies dadurch, daß eine Zunahme der H&sub2;O&sub2;-Produktion durch IFN-γ verhindert und die Fähigkeit der Makrophage, den T-Zellen ein Antigen zu präsentieren, unterdrückt wird. Es wird angenommen, daß ein aktives Protein sowohl für die Vasodilatation als auch für die Immunsuppression verantwortlich ist.
Das Protein (Lutzomyia-Protein, abgekürzt 'LP') kann durch die hier offenbarte, chromatographische Reinigung vom Speicheldrüsenlysat der Sandfliege abgeleitet werden. Die Nucleotidsequenz eines LP-codierenden Gens wurde bestimmt, und die Aminosäuresequenz wurde daraus abgeleitet. Eine zweite, LP-codierende DNA-Sequenz wurde ebenfalls identifiziert. Sie unterscheidet sich geringfügig von der ersten Sequenz, sowohl bezüglich der Nucleotidsequenz als auch der abgeleiteten Aminosäuresequenz. Daraus geht hervor, daß es zwei oder mehrere LP-Varianten gibt. Das Protein und verschiedene, aktive Analoga und Fragmente davon können durch Expression rekombinanter DNA in einer Wirtszelle oder durch Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden. Zusammensetzungen mit einem hohen Anteil an LP oder seinen aktiven Analoga und Fragmenten können pharmazeutisch als Immunsuppressiva oder starke Vasodilatatoren verwendet werden. Typische, aktive Analoga und Fragmente des Lutzomyia-Proteins sind Proteine oder Peptide, die eine Aminosäuresequenz mit ausreichender Duplikationsfähigkeit der Sequenz des aktiven Teils eines Lutzomyia-Proteins aufweisen, so daß die Proteine oder Peptide in der Lage sind, bei einem Säuger eine Vasodilatation oder temporäre Immunsuppression herbeizuführen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die therapeutische Verwendung des erf indungsgemäßen Proteins, z. B. zur Steigerung der Durchblutung im Kreislaufsystem eines Säugers durch Verabreichung einer wirksamen Menge des Lutzomyia-Proteins oder eines aktiven Analogons oder Fragments davon, um bei dem Säuger eine Vasodilatation herbeizuführen. Parenterale Applikation kann zu systemischer, vasodilatatorischer Aktivität führen. Durch äußerliche Applikation, z. B. auf ein Gefäßbett während einer Operation, kann die vasodilatatorische Wirkung auf den Applikationsort konzentriert werden.
Ein anderer Aspekt beruht auf der Entdeckung, daß außer dem Lutzomyia-Protein auch die strukturell verwandten CGRP und Calcitoninpeptide zur temporären Immunsuppression verwendet werden können. Die Erfindung ermöglicht somit ferner die Verwendung dieser Proteine für die Herstellung eines Medikaments zur Desensibilisierung eines Säugers gegenüber der Wirkunq eines Immunogens durch temporäre Immunsuppression des Säugers während der Immunogenexposition, wobei das Immunogen z. B. aus einer für den betreffenden Säuger xenotypischen Quelle abgeleitet ist, beim Menschen z. B. Streptokinase oder ein monoklonaler Mausantikörper. Diese temporären Immunsuppressiva können so z. B. zusammen mit einem für den Säuger xenotypischen Protein verabreicht werden, beim Menschen z. B. Streptokinase oder ein monoklonaler Mausantikörper, um so die Bildung von Antikörpern oder Zellimmunität gegenüber dem Medikament zu hemmen oder zu verhindern. Die Immunsuppressiva können auch zur Behandlung von Transplantatabstoßung und Autoimmunkrankheiten verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die obengenannten Aufgaben und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung sowie die Erfindung selbst werden durch folgende Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen besser verständlich.
Abbildung 1 zeigt ein Chromatogramm einer HPLC mit umgekehrten Phasen eines Speicheldrüsenextrakts.
Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese von Lutzomyia-Protein, das durch HPLC mit umgekehr ten Phasen gereinigt wurde.
Abbildung 3 zeigt die Stärke und Persistenz von durch Lutzomyia-Protein und CGRP hervorgerufenem Erythem.
Abbildung 4 zeigt den Relaxationsgrad eines verengten Aortarings bei Kaninchen durch das Speicheldrüsenlysat der Lutzomyia longipalpis, wobei die Spannung in Abhängigkeit von der Zeit gemessen wurde. A kennzeichnet die Zugabe des Vasokonstriktors Adrenalin, S die Zugabe von Speicheidrüsenlysaten, W das Spülen des Präparats, das zweite A die zweite Zugabe von Adrenalin.
Abbildung 5 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von CGRP auf die H&sub2;O&sub2;-Produktion von Humanmakrophagen zeigt, die mit Interferon-γ vorbehandelt wurden. Die Balken stellen die durchschnittliche H&sub2;O&sub2;-Produktion für drei Kulturen ± Standardabweichung (SD) dar.
Abbildung 6 zeigt einen Vergleich der Wirkung von zwei Neuropeptiden, Calcitonin (Δ) und CGRP ( ), auf die Makrophagenfunkt ion (senkrechte Striche = Standardabweichung).

Beschreibung

Ein aktives Protein (Lutzomyia-Protein, LP) im Speicheldrüsenlysat der Sandfliege Lutzomyia longipalpis wurde als starker Vasodilatator ausfindig gemacht. Außerdem wurde entdeckt, daß Calcitonin, CGRP und LP die Fähigkeit besitzen, bei Säugern eine temporäre Immunsuppression herbeizuführen.
LP kann man, wie unten dargelegt, durch herkömmliche, chromatographische Reinigung von operativ entfernten Speicheldrüsen der Lutzomyia longipalpis erhalten. Ein Paar Speicheldrüsen enthält 10 - 15 ng LP.
Die für das Lutzomyia-Protein codierende Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz von LP sind aus der Aufstellung auf Seite 26 ersichtlich. Erfahrene Techniker können durch Kenntnis der LP-Sequenz große Mengen des Proteins für therapeutische Zwecke herstellen. Der Fachmann kann LP oder dessen aktive Analoga mit Hilfe herkömmlicher, chemischer Fest- oder Flüssigphasen-Peptidsynthesetechniken synthetisieren. Außerdem erlaubt die Kenntnis der Sequenz die Ausbildung der DNA-Sequenz, die das Lutzomyia-Protein oder dessen aktive Analoga oder Fragmente codiert, in unterschiedlichen Wirtszellen, einschließlich Prokaryoten und Eukaryoten, um große Mengen des Proteins oder dessen aktiver Analoga oder Fragmente sowie andere Zusammensetzungen, die in der Lage sind, bei Säugern Vasodilatation oder temporäre Immunsuppression hervorzurufen, herzustellen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eignen sich für die Formulierung pharmazeutischer Präparate für therapeutische Zwecke. Insbesondere LP kann als therapeutischer Vasodilatator und folglich als Blutdruckregulator verwendet werden. Außerdem können CGRP und Calcitonin - beide im Handel erhältlich - sowie LP zur temporären Immunsuppression verwendet werden.
Bei veterinärer Verwendung können diese Verbindungen Säugern, z. B. Haustieren, verabreicht werden. Die klinische Verwendung kann bei Menschen in ähnlicher Weise wie mit anderen Therapeutika erfolgen. Im allgemeinen liegt die Dosierung bei ca. 2 pg bis 0,25 µg pro kg Körpergewicht des Wirts. Dosierungen in dieser Größenordnung können pro Applikation in Abhängigkeit von der Schwere des zu behandelnden Zustands verwendet werden bis eine Besserung eintritt. Das Protein kann intravaskulär injiziert werden, um z. B. zur Behandlung des Raynaud-Syndroms eine systemische Vasodilatation zu bewirken. Es kann auch äußerlich oder durch Infusion appliziert werden, um lokal eine vasodilatatorische Wirkung zu induzieren, z. B. während Gehirnoperationen, um eine Blutgefäßkonstriktion und nachfolgende Hirnschädigung zu mildern. Diese Verbindungen eignen sich für die orale, bukkale, parenterale oder rektale Applikation, können aber auch in einer Form verwendet werden, die für die nasale oder inhalative Applikation oder zur Insufflation geeignet ist.
Diese Verbindungen können unverdünnt, als Mixturen mit anderen, pharmakologisch aktiven oder inaktiven Stoffen oder mit physiologisch geeigneten Trägern, z. B. Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder physiologisch verträglichen Puffern verwendet werden. Die Injektion kann subkutan, intravenös oder intramuskulär erfolgen. Diese Verbindungen können als pharmakologisch akzeptable Salze, z. B. Säureadditionssalze, verabreicht werden. Das Protein kann in lyophilisierter Form gelagert und unmittelbar vor der Verwendung wiederhergerichtet werden.
Der hier beanspruchte Erfindungsgegenstand wird durch die nachfolgenden Erläuterungen verständlich.

Isolierung von LP

Sandfliegen wurden aus einem Laborstamm der Lutzomyia longipalpis gezüchtet, der vom Walter Reed Army Institute of Research nach dem von Modi et al. beschriebenen Verfahren (J. Med. Entomol., 20, S. 568 - 570 (1983)) bereitgestellt worden war. Wilde Exemplare können in verschiedenen, tropischen Regionen Südamerikas gefangen werden. Die Larven wurden mit einem Gemisch aus fermentiertem Kaninchenfutter (Purina), Kaninchenkot und Leberpulver gefüttert. Die ausgewachsenen Fliegen wurde bei 100 % relativer Feuchte gehalten und hatten freien Zugang zu gesättigter Saccharoselösung. Die Speicheldrüsen wurden 5 bis 7 Tage alten, weiblichen Fliegen entnommen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelagert, die 1 mg pro ml Rinderserumalbumin enthielt. Die hinter dem Kopf vorstehenden Drüsen wurden mit einer Pinzette (Nr. 5) und Operationsnadeln entfernt und paarweise in 20 µl Tris- HC1-Puffer, 5mM, pH 7,4, überführt. Sie können bei -70 ºC bis zur Verwendung eingefroren werden.

Charakterisierung von LP

Abbildung 1 zeigt die Umkehrphasen-HPLC des Extrakts von 105 Speicheldrüsenpaaren, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung präpariert wurden. Durch Einfrieren und Auftauen wurden Lysate erhalten. Vor Auftragen auf die Säule wurde das Extrakt 30 Sekunden in einer Mikrozentrifuge geschleudert. Eine C-18 Mikrofilm-HPLC-Säule (Glycotech) wurde mit 20 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure bei 50 ºC und einem Durchsatz von 0,6 ml/minute äquilibriert. Drei Minuten nach der Injektion zeigte sich über einen Zeitraum von 20 Minuten ein linearer Gradient, der 44 % Acetonitril erreichte. Alle 30 Sekunden wurden Fraktionen gesammelt und auf ihre vasodilatatorische Wirkung überprüft. Für diesen Vasodilatationstest wurde der Gradient zehnfach verdünnt, und 50 µl davon wurden intradermal in den geschorenen Rücken eines Kaninchens injiziert. Das Erythem an der Injektionsstelle entwickelte sich so wie durch den Peak angezeigt. Ein µg Human-CGRP, das als Kontrollpeptid diente, wurde 5 Minuten später als Peak eluiert, der die gleiche Fläche hatte (nicht abgebildet). Aus dieser Beobachtung ergibt sich, daß pro Speicheldrüsenpaar etwa 10 ng LP vorliegen.
Da bei der HPLC mehrere Komponenten durch einen einzigen Peak verdeckt werden können, war eine unabhängige Messung der LP-Reinheit erforderlich. Ausgewählt wurde die Kapillarelektrophorese, die Moleküle aufgrund der Ladung trennen kann. Voraussetzung für diese Messung war ein Quantum von einigen Mikrolitern, um eine LP-Konzentration von etwa 1 mg/ml für die Kapillarelektrophorese zu erreichen. 250 Speicheldrüsenpaare wurden präpariert, und nach mehreren Durchläufen auf einer Umkehrphasen-HPLC-Säule wurden 2,5 µg LP isoliert. Die LP-haltigen Fraktionen wurden gesammelt und ergaben eine Menge von etwa 2 ml. Als Vorbereitung auf die Kapillarelektrophorese wurde LP in einem Speed-Vac auf 10 µl konzentriert. Die Probe wurde über einen Zeitraum von drei Sekunden bei einem Druck von ca. 0,035 bar (0,5 psi) eingespritzt und bei 25 kv in einem Beckman P/ACE 2000 der Elektrophorese unterzogen. Ein Boratpuffer (100 mM, pH 8,3) wurde gewählt, weil die isoelektrische Fokussierung des durch HPLC gereinigten EIP bei einem pI von 7,8 Aktivität zeigte. Die Peakneigung bei etwa 6 Minuten stellt die aus dem HPLC-Lauf verbleibende Trifluoressigsäure dar. Nach ca. 3 Minuten Elektrophorese zeigte sich ein großer Peak (Abb. 2).
Zur Bestimmung der Masse wurde 0,5 Mikrogramm des durch Umkehrphasen-HPLC gereinigten Lutzomyia-Proteins analysiert (massenspektrometrisch, Beschuß mit schnellen Atomen). Es wurde eine einzige Komponente mit 6839 Masseeinheiten erfaßt. Die LP-Masse unterscheidet sich somit von der des CGRP (3900).
Die vasodilatatorische Aktivität von durch Umkehrphasen- HPLC gereinigtem LP im Vergleich zu synthetischem Humanα-CGRP auf Kaninchenhaut ist in Abbildung 3 dargestellt. Die in die Haut injizierte LP-Menge richtete sich nach der Fläche des bei der Umkehrphasen-HPLC erhaltenen Absorptionspeaks. Die angegebenen Mengen des durch Umkehrphasen-HPLC gereinigten Lutzomyia-Proteins oder von synthetischem CGRP - in 50 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung - wurden in den geschorenen Rücken eines Kaninchens injiziert. Die Fläche des dadurch hervorgerufenen Erythems wurde nach 2 Stunden (Dreiecke) und nach 4 Stunden (Kreise) gemessen. Die Striche zeigen die durchschnittliche und die Standardabweichung bei drei Injektionen. Zwei Stunden nach Injektion von 0,1 Nanogramm LP war das Erythem 50 stark wie nach Injektion von 50 Nano-gramm CGRP. Nach 4 Stunden war das durch LP verursachte Erythem noch vorhanden, während die Injektionsstelle von CGRP nur noch eine schwache Rötung zeigte.

Beweis für die vasodilatatorische Aktivität von LP

Die vasodilatatorische Aktivität des Lutzomyia-Proteins wird durch die Relaxation eines verengten Aortarings von Kaninchen durch Speicheldrüsenlysate der Lutzomyia longipalpis bewiesen In Abb. 4 kennzeichnet A die Zugabe von Adrenalin (insgesamt 200 mg), S die Zugabe des Speicheldrüsenlysats von drei Sandfliegen (etwa 30 - 40 ng LP) und W das Spülen des Präparats. Die Thoraxaorten stammten von ausgewachsenen Neuseeland-Kaninchen. Die Ringe (4 mm breit) wurden in einem Bad (3 ml) suspendiert, das Tyrode-Lösung enthielt und durch das 95 % O&sub2; und 5 % CO&sub2; geperlt wurden. Die Badtemperatur betrug 37 ºC, die Anfangsspannung 1 g (Webster et al., Meth. Enzymol., 293, S. 531 - 541 (1970)).
Die Kontraktionen wurden mit einem auxotonischen Pendel gemessen (Paton, J. Physiol. Lond., 137, S. 35P - 36P (1957)), das an einen isotonischen Transducer gekoppelt war. In vier Versuchen wurde eine Relaxation von über 50 % erreicht, wenn das Homogenat von drei Drüsenpaaren in die 2,5 ml fassende Kammer gegeben wurde (58 ± 8 %, ± mittlere SD). In allen Versuchen lag zwischen der Zugabe des Speicheldrüsenhomogenats und dem Beginn der Relaxation eine Zeitspanne von 15 - 30 Sekunden. Nachdem das Präparat gespült war, führte eine weitere Zufuhr von Adrenalin nicht zu dem Kontraktionsgrad, der vor der Behandlung herrschte, was darauf hindeutete, daß die Aktivität anhielt (Abb. 4). Aus der Dauer des Erythems, hervorgerufen durch Injektion von LP in die Haut von Säugern, kann geschlossen werden, daß die vasodilatatorische Aktivität mindestens 24 Stun-den anhält.

Bestimmung der Aminosäuresequenz

Durch HPLC gereinigtes, biologisch aktives LP wurde einer Aminosäure-Mikrosequenzierung unterzogen. Die Aminosäurereste 3-13 wurden bestimmt, jedoch nicht die Reste 1 oder 2 der reifen Proteinsequenz. Ein degeneriertes Oligonucleotid wurde in Verbindung mit einem Oligo-dT-Primer in der Polymerase-Kettenreaktion verwendet, um eine unmittelbare Amplifikation der begrenzten LP-cDNA-Menge zu erreichen, die aus ca. 60 Zellen oder einem Fünftel eines Speicheldrüsenpaars stammte. Bei dieser vervielfachten DNA-Sequenz fehlte das meiste des für die Aminosäuren 1 und 2 sowie die oberen Sequenzen, einschließlich Signalsequenz und Promotor, codierenden 5'-Endes. Diese DNA- Sequenz lieferte allerdings für die den Aminosäurerest 14 codierenden Nudeotide die Nucleotidsequenz 3'. Mit Hilfe dieser Sequenzinformation wurde ein Gen-Klon aus einer Sandfliegen-Genbank ausgewählt. Ein neues Oligonucleotid wurde dann aus der Gen-DNA hergestellt mit der Sequenz vom Signalpeptid und zusammen mit einem Oligonucleotid des nichttranslatierten 3'-Abschnitts der LP-cDNA.
Diese Oligonudeotide wurden als Primer für die Amplifikation der für die vollständige Sequenz codierenden cDNA verwendet, einschließlich der Reste 1 und 2, die dann nach der Standardmethode sequenziert wurde. Die Nucleotidsequenz der cDNA und die hergeleitete Aminosäuresequenz des reifen Lutzomyia-Proteins ist als Sequenz 1 auf Seite 23 aufgeführt. Die Gen-LP-DNA-Sequenz (Sequenz 2 auf Seite 24) unterscheidet sich geringfügig von der LP-cDNA-Sequenz und stellt vermutlich eine LP-Genvariante dar. Sie enthält die DNA-Sequenz und hergeleitete Aminosäuresequenz des 17-Aminosäure-Leaderpeptids. Die Signalsequenz von LP liegt ebenfalls in Sequenz 2 vor (Nucleotide 1-51).

Festphasen- Pedtidsynthese

Die LP-Peptide können leicht nach der herkömmlichen Festphasen-Peptidsynthese hergestellt werden (Merrifield, FED. PRC. Fed. Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 24, S. 412 (1962)). Bei dieser Synthese wirkt die feste Phase als C-terminale Schutzqruppe für die wachsende Oligomerkette. Im allgemeinen wird so die (das) durch die N-terminale Gruppe qeschützte Aminosäure oder Peptid mit einem entsprechend funktionalisierten und löslichen Polymer reagiert, so daß der C-terminale Rest an den unlöslichen Träger gekoppelt wird. Die N-terminale Schutzgruppe wird dann selektiv vom Aminoacylpolymer entfernt, und die (das) nächste N-geschützte Aminosäure oder Peptid wird mit Hilfe eines Reagens, das für die Reaktion der Carboxylgruppe der einzufügenden Aminosäure oder des Peptids geeignet ist, an das Polymer gekoppelt. Der Zyklus von Freilegung und Kopplung kann unter Verwendung der geeigneten Aminosäure- oder Peptidderivate so oft wiederholt werden, bis die gewünschte Aminosäuresequenz des Peptids auf dem Polymerträger zusammengesetzt ist. Sobald die Sequenz vollständig ist, wird das Peptid/ Polymer einem stärkeren Reagens ausgesetzt, um die Bindung zwischen Peptid und Polymer zu spalten, wodurch das Pep-tid freigesetzt wird. Es kann durch herkömmliche Verfahren gewonnen werden. In Abhängigkeit von den Bedingungen kann das Peptid eine C-terminale Säure oder Amidgruppe und gegebenenfalls eine N-terminale Schutzgruppe haben.
Es ist ebenfalls bedeutend, daß jede andere, reaktive Gruppe oder Gruppen, z. B. Amino-, Carboxy-, Hydroxy- oder Mercaptogruppe(n), während der Synthese gut geschützt ist (sind) und sich auch nach der Spaltung von Peptid und Polymer noch in geschütztem Zustand befindet(n). Das Peptid muß daher häufig weiterbehandelt werden, um die gewünschte Verbindung zu erhalten.
Die Peptidsynthese, einschließlich Einbringen und Entfernen von Schutzgruppen, ist ein bekanntes Verfahren (siehe z. B. 'The Peptides', Vol. 3, Gross und Meienhoffer, Academic Press, 1931). Die Einsatzstoffe, d. h. Aminosäure oder Peptid oder deren reaktive Derivate, die für die Festphasensynthese verwendet werden, sind entweder bekannte Verbindungen oder können nach den gleichen Verfahren wie die bekannten Verbindungen hergestellt werden. Spezielle Reagenzien, die für die Aktivierung der Carboxylgruppe der Aminosäure oder des Peptids verwendet werden, sind z. B. Imide wie das Dicyclohexylcarbodiimid.
Das Harz kann z. B. ein unlöslicher, polymerer Träger sein, z. B. ein Polyamidharz, z. B. ein vernetztes Polydimethylacrylamidharz oder jedes inerte, makrovernetzte Harz wie z. B. mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol oder ein Methylbenzhydrylaminharz.
Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen haben sich zwei Verfahren als geeignet erwiesen. Das erste Verfahren ist das BOC Verfahren, bei dem die in der Synthese verwendete Schutzgruppe eine tertiäre Butoxycarbonylgruppe ist. Die BOC Schutzgruppe wird unter Verwendung von Trifluoressigsäure und Dichlormethan in jeder Stufe selektiv entfernt. Nach Beendigung der Synthese wird das Peptid durch Behandlung mit Fluorwasserstoff und Anisol vom Harz entfernt. Das zweite Verfahren ist als FMOC Verfahren bekannt. Hierbei wird eine Fluorenylmethoxycarbonylgruppe verwendet, die mit Hilfe von 20 %igem Piperidin in Dimethylformamid selektiv entfernt wird. Das Peptid wird vom Harz tirch Behandlung mit Trifluoressigsäure und Anisol getrennt.
Calcitonin und CGRP haben eine C-terminale Amidgruppe, die für die Aktivität notwendig ist. Wenn das Lutzomyia- Protein amidiert werden muß, kann dies durch geeignete Spaltungsbedingungen in der obenbeschriebenen Festphasensynthese erreicht werden. Die Verbindung kann auf diese Weise vom Träger getrennt und in einem einstufigen Verfahren durch Behandlung z. B. mit Methanol und Ammoniak amidiert werden. Alternativ dazu kann das Amid, wenn die Spaltungsbedingungen so gewählt werden, daß ein Peptid mit einer C-terminalen Carbonsäure entstehen soll, durch konventionelle Mittel erhalten werden, z. B. durch enzymatische Behandlung mit carboxypeptidase Y, wenn der vorletzte, C-terminale Rest Leucin ist, und durch ein amidierendes Enzym, wenn der vorletzte Rest Glycin ist (Bradbury et al., Nature, 298, S. 240 - 244 (1982)), oder durch chemische Behandlung des Peptids, z. B. mit Ammoniak. Eine weitere Alternative zur Herstellung des LP- Peptids bieten Flüssigphasen-Peptidsyntheseverfahren.

Rekombinante Herstellung von LP

Durch Kenntnis der Aminosäuresequenz des Lutzomyia-Proteins ist auch die Herstellung des Proteins durch die bekannten, rekombinanten DNA-Verfahren möglich. Auf diese Weise kann ein die Aminosäuresequenz oder deren verschiedene Analoga codierendes Gen hergestellt werden, z. B. durch Oligonucleotidsynthese und gegebenenfalls anschließende Ligation, um einen vollständigen, codierenden Abschnitt zu erhalten. Der codierende Teil kann zu 3' und 5' nichttranslatierten DNA-Abschnitten verknüpft werden, die wie erforderlich einen Poly-A-Ort, Promotor, Ribosom- Bindungsort, Stop- und Startcodons usw. darstellen. Fusionierte DNAs zum Beispiel, die eine für ein Wirtspolypeptid und LP-Polypeptid codierende DNA aufweisen, können zur Herstellung von Fusionsproteinen, die LP-Polypeptide aufweisen, verwendet werden. Die Bildung eines Expressionsvektors, der sich für die Herstellung von LP- Produkten in einem ausgewählten Zelltyp eignet, ist dem Fachmann ebenfalls bekannt. Die Züchtung von transformierten Zellen führt zu intrazellulärer Akkumulation oder Sekretion von Protein, das gereinigt, erneut gefaltet und wie gewünscht oder erforderlich auf andere Weise posttranslational modifiziert werden kann.

Temporäre Immunsuppression

Prüfung der H&sub2;O&sub2;-Produktion durch Makrophagen als Marker für die Immunstimulation

Durch Leukophorese von gesunden Freiwilligen gewonnene Monozyten wurden an Ficoll-Hypaque und Percoll Gradienten (Pharmacia, Piscataway, NJ) gereinigt und in Mikrotiter- Vertiefungen (5 x 10&sup5; pro Vertiefung) in ein RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, NY) mit 5 % gesammeltem, normalem Humanserum und 1 % Gentamycin (M. A. Bioproducts, Walkinville, MD) überführt. Mehr als 95 % der Zellen waren Makrophagen, bestimmt durch Esterasefärbung (The Manual of Macrophage Methodology, Herscowitz et al., Eds., Marcel Dekker, NY, S. 199 (1981)). Nach eintägiger Kultivierung wurden nichtadhärente Zellen ausgespült, und die Makrophagen wurden z. B. mit Human-CGRP, Calcitonin oder LP wie oben beschrieben behandelt. Im Anschluß an die Behandlung wurden die Makrophagen drei Tage mit 100 bis 400 Einheiten Interferon-γ (Amgen Biologicals, Thousand Oaks, CA) in einem Medium mit 15 % gesammeltem, normalem Humanserum inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die H&sub2;O&sub2;-Konzentration in den Zellen bestimmt.
Die H&sub2;O&sub2;-Produktion durch Makrophagen wurde fluorometrisch mit Hilfe des Fluorophors Scopoletin bestimmt (de la Harpe et al., J. Immunol. Methods, 78, S. 323 (1985)). Die Vertiefungen mit den Makrophagen wurden gespült und 90 Minuten mit einer gepufferten Lösung aus Scopoletin (Sigma, St. Louis, MO), PMA (Sigma, St. Louis, MO) und Meerrettich-Peroxidase (Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Durch den Auslöser PMA setzt eine aktivierte Makrophage H&sub2;O&sub2; frei, das Scopoletin in einer durch Meerrettich-Peroxidase katalysierten Reaktion zu einem nichtfluoreszierenden Produkt oxydiert. Die pro Kultur freigesetzte Menge H&sub2;O&sub2; wird als Nanomol H&sub2;O&sub2; gemessen. Um die von Kultur zu Kultur unterschiedliche Anzahl der Zellen zu überprüfen, wurden die Werte einheitlich in µg DNA pro Kultur ausgedrückt. Alle Werte wurden als Nanomol freigesetztes H&sub2;O&sub2; pro µg DNA pro Stunde angegeben. Die DNA wurde durch einen Fluoreszenztest bestimmt (Kissane et al., J. Biol. Chem., 233, 5. 184 (1958)).

Inhibierung der Makrophagenfunktion durch CGRP

Einschichtkulturen von Humanmakrophagen wurden drei Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen Human-CGRP vorbehandelt. Die Zellen wurden mit IFN-γ (100 bis 400 Einheiten/ml) 72 Stunden aktiviert. Die durch die Zellen produzierte Menge H&sub2;O&sub2; wurde dann nach dem obenbeschriebenen Verfahren bestimmt. Die Balken in Abb. 5 stellen die durchschnittliche H&sub2;O&sub2;-Produktion von drei Kulturen ± Standardabweichung dar. Die p-Werte wurde abgeleitet aus dem Vergleich der durchschnittlichen H&sub2;O&sub2;-Antwort jeder mit CGRP behandelten Gruppe mit der H&sub2;O&sub2;-Antwort der positiven Kontrollkulturen, die nicht mit CGRP behandelt, jedoch mit IFN-γ stimuliert waren. In vier Wiederholungsversuchen wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Es wurde gefunden, daß CGRP die Fähigkeit der Makrophagen zur H&sub2;O&sub2;-Antwort auf IFN-γ deutlich inhibiert (Abb. 5). Geringe CGRP-Konzentrationen von nur 2,5 x 10&supmin;&sup9; M inhibierten deutlich die H&sub2;O&sub2;-Produktion der Makrophagen. Bei höheren Konzentrationen wurde kein H&sub2;O&sub2; mehr produziert (Abb. 5). Bei den in Abb. 5 dargestellten Ergebnissen wurden 200 Einheiten/ml IFN-γ verwendet, d. h. die zur Stimulation der Makrophagen optimale Konzentration. Bei anderen Dosierungen wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Die IFN-γ-Konzentrationen lagen bei 100 Einheiten/ml der durch die Makrophagen hervorgebrachten H&sub2;O&sub2;-Produktion, die sich von den Background-Werten deutlich unterschieden.

Inhibierung der Makrophagenfunktion durch Calcitonin

Als Präinkubation wurden Humanmakrophagen 3 Stunden mit den in Abb. 6 angegebenen Mengen CGRP ( ) oder Calcitonin (Δ) behandelt. Der Versuch wurde wie oben für CGRP beschrieben fortgesetzt. Die Zellen wurden gespült, und IFN-γ (200 Einheiten/ml) wurden zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen wurde die H&sub2;O&sub2;-Produktion bestimmt. Die Balken zeigen die durchschnittliche H&sub2;O&sub2;-Produktion für drei Kulturen ± Standardabweichung. Da das Molekulargewicht von CGRP und Calcitonin fast identisch ist, und zwar 1000 ng/ml, wurde für beide Substanzen eine Konzentration von 2,5 x 10&supmin;&sup7; M verwendet. Es wurde gefunden, daß Calcitonin die H&sub2;O&sub2;-Produktion der Makrophagen ähnlich wie CGRP inhibiert (Abb. 6).

Inhibierung der Makrophagenfunktion durch LP

Humanmakrophagen wurden 3 Stunden mit unterschiedlichen Mengen der LP-haltigen Sandfliegen-Speicheldrüsenlysate oder Medium vorbehandelt. Die Speicheldrüsensubstanz wurde ausgespült, und die Zellen wurden mit IFN-γ (200 Einheiten/ml) aktiviert. Nach drei Tagen wurde die von den Zellen als Antwort auf IFN-γ produzierte H&sub2;O&sub2;-Menge bestimmt (pM H&sub2;O&sub2; pro Kultur ± Standardabweichung). Zur Kontrolle der von Kultur zu Kultur unterschiedlichen Anzahl Zellen wurden diese Werte einheitlich in µg DNA pro Kultur angegeben. Die Inhibierung der durch IFN-γ induzierten H&sub2;O&sub2;-Antwort der Makrophagen ist in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Vorbehandlung Stimulation Antwort {pM H&sub2;O&sub2;/µg DNA} Keine Speichel {1 µg / ml} * Keine Inhibierung der durch IFN-γ induzierten Antwort, da Vorbehandlung mit Lysat für die Inhibierung erforderlich

Inhibierung der Makrophagen -Antigenpräsentation durch CGRP

Eine OVA-spezifische T-Zellinie wurde in BALB/c-Mäusen produziert (Titus et al., S. Immunol., 133, S. 1594 (1984)). Die Linie war L3T4&spplus; und wurde unter sich abwechselnden Restimulations- und Ruhephasen in vitro gehalten (Kimono et al., J. Exp. Med., 152, S. 759 (1980)). Als ein Stammantigen präsentierende Zellen wurden BALB/c- Perilonealzellen (Titus et al., Clin Exp. Immunol., 55, S. 157 (1984)) in Mikrotiter-Vertiefungen (10&sup4; pro Vertiefung) in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Maryanski et al., Eur. J. Immunol., 12, S. 401 (1982)), ergänzt mit 5 % Kalbfetus-Serum (Hyclone, Logan, UT) gelegt und über Nacht kultiviert. Nichtadhärente Zellen wurden aus den Vertiefungen gespült, und das Medium mit oder ohne Ratten-CGRP (1,25 x 10&supmin;&sup7; M) wurde als Präinkubation zugegeben. Nach drei Stunden wurden die Vertiefungen gespült, um das CGRP zu entfernen, und die angegebene Zahl OVA-spezifischer T-Zellen (Sigma, St. Louis, MO) wurde zugegeben. Danach wurden die Vertiefungen zu verschiedenen Zeiten mit 1µCi³H Methylthymidin (³H TdR) (Amersham, Arlington Heights, IL) gepulst, und die Thymidininkorporation wurde beurteilt (Titus et al., J. Immunol., 133, S. 1594 (1984)).
Als Antigen-präsentierende Zellen wurden BALB/c-Peritonealmakrophagen (10&sup4;/Vertiefung) verwendet. Die Makrophagen wurden 3 Stunden in 1,25 x 10&supmin;&sup7; M Ratten-CGRP präinkubiert. Anschließend wurde das CGRP ausgespült. Danach wurden OVA-spezifische T-Zellen und OVA zu den Kulturen gegeben, um die Antigen-präsentierende Fähigkeit der mit CGRP behandelten Makrophagen, gemessen am Proliferationsgrad der T-Zellen, zu unterstützen. Nach 48 Stunden wurden die Kulturen mit ³H TdR gepulst, um den Proliferationsgrad der T-Zellen zu bestimmen. In der nachfolgenden Tabelle ist die durchschnittliche Thymidininkorporation von vier Kulturen ± Standardabweichung angegeben. Die Background-Antworten (Makrophagen + T-Zellen, jedoch keine OVA, oder T-Zellen + OVA, jedoch keine Makrophagen) lagen bei 300 bis 500 CPM. Mit unterschiedlicher Anzahl peritonealer Zellmakrophagen (10³ bis 2 x 10&sup4;/Vertiefung) wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Die Ergebnisse in der Tabelle zeigen, daß die Fähigkeit von Mäusemakrophagen, OVA zu einer OVA-spezifischen T-Zellinie zu präsentieren, durch CGRP inhibiert wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden mit verschiedenen Anzahlen T-Zellen und unterschiedlichen OVA-Dosierungen zur Stimulation der Kulturen erhalten. Außerdem war die Inhibierung der Makrophagen-Antigenpräsentation durch CGRP nicht einfach auf die verzögerte Kinetik der Antwort der OVA-spezifischen T-Zellen zurückzuführen, da am zweiten Tag der Kultivierung eine ähnliche Inhibierung der T-Zellenproliferation beobachtet wurde. Makrophagen, präinkubiert in Anzahl T-Zeilen / Vertiefung Antwort (CPM ± Standardabweichung) auf Stimulation mit Medium

Inhibierung der Makrodhagen-Antigendräsentation durch LP

Das Verfahren entsprach dem für CGRP. BALB/c-Peritonealmakrophagen (2 x 10&sup4;/Vertiefung) wurden 3 Stunden nur mit Medium (positive Kontrolle) oder mit den angegebenen Konzentrationen LP-haltiger Speicheidrüsenlysate der Lutzomyia longipalpis präinkubiert und anschließend gespült. Danach wurden 2 x 10&sup4; Leishmania major-spezifische T-Zellen und 2 x 10&sup4; L. major zu den Kulturen gegeben. Nach 24 Stunden wurden die Kulturen mit ³H gepulst, um den Proliferationsgrad der T-Zellen zu beurteilen. In der nachfolgenden Tabelle ist die durchschnittliche Thymidininkorporation von drei Kulturen ± Standardabweichung angegeben. Makrophagen, präinkubiert in Antwort {durchschnittliche ³H TdR-Inkorporation} Inhibierung Medium

Sequenzierung

Sequenz Nr.: 1
Sequenzart: Nucleotidsequenz mit entsprechender Aminosäuresequenz
Sequenzlänge: 315
Molekülart: cDNA
TGT GAT GCA ACA TGC CAA TTT CGC AAG G(T)CC ATA GAT GAC TGC CAG AAG 48
Cys Asp Ala Thr Cys Gln Phe Arg Lys Ala lle Asp Asp Cys Gln Lys
CAG GCG CAT CAT AGC AAT GTT TTG CAG ACT TCT GTA CAA ACA ACT GCA 96
Gln Ala His His Ser Asn Val Leu Gln Thr Ser Val Gln Thr Thr Ala
ACA TTC ACA TCA ATG GAT ACC TCC CAA CTA CCT GGA AAT AGT GTC TTC 144
Thr Phe Thr Ser Met Asp Thr Ser Gln Leu Pro Gly Asn Ser Val Phe
AAA GAA TGT ATG AAG CAG AAG AAA AAG GAA TTT AAG GCA GGA AAG TAA 192
Lys Glu Cys Met Lys Gln Lys Lys Lys Lys Phe Lys Ala Gly Lys
AATGATTGAA GAAAATTGTA GCCGAGGAGA GAAAGAAAGA AAGTCCCATA CCATATTTTG 252
TTTGTTAATT GTAACGAATT TTCCGAAAAA ATAAAATATT ATGCACTCAA TTTAAAAAA 312
AAA 315
Sequenz Nr.: 2
Sequenzart: Nucleotidsequenz
Sequenzlänge: 243
Molekülart: Genom-DNA
ATG AAA TAT TCT TTA AAT AAT CTC CAT TTT CTT GTA GAC GTT GCT GAG 48
Met Lys Tyr Ser Leu Asn Asn Leu His Phe Leu Val Asp Val Ala Glu
GGC TGT GAT GCA ACA TGT CAA TTT CGC AAG GCC ATA GAA GAC TGC AGG 96
Gly Cys Asp Ala Thr Cys Gln Phe Arg Lys Ala lle Glu Asp Cys Arg
AAG AAG GCG CAT CAT AGC GAT GTT TTG CAG ACT TCT GTA CAA ACA ACT 144
Lys Lys Ala His His Ser Asp Val Leu Gin Thr Ser Val Gln Thr Thr
GCA ACA TTT ACA TCA ATG GAT ACC TCC CAA CTA CCT GGA AGT GGT GTT 192
Ala Thr Phe Thr Ser Met Asp Thr Ser Gln Leu Pro Gly Ser Gly Val
TTC AAA GAA TGC ATG AAG GAG AAA GCT AAG GAA TTT AAG GCA GGA AAG 240
Phe Lys Glu Cys Met Lys Gln Lys Ala Lys Lys Phe Lys Ala Gly Lys
TAG 243

Claims

1. Ein im wesentlichen reines Protein oder aktives Fragment davon, ableitbar vom Speicheidrüsenlysat der Sandfliege Lutzomyia longipalpis, wobei das Protein bei einem Säuger Vasodilatation oder temporäre Immunsuppression verursacht und ein Molekulargewicht von etwa 6839 Dalton hat, massenspektrometrisch bestimmt.

2. Ein Protein oder Fragment gemäß Anspruch 1, wobei das Protein durch eines oder mehrere der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

(a) Elution vor dem Calcitonin-Gen-verwandten Peptid (CGRP) in einer Acetonitril-H&sub2;O-Trifluoressigsäure-Elution in einer Hochleistungsflüssigchromatographiesäule mit Umkehrphasen; oder

(b) vasodilatatorische Aktivität, gemessen durch Erytheminduktion in Tierhaut, die mindestens etwa 80 - 100 mal stärker als die des CGRP ist; oder

(c) das Protein ca. 1 % der Gesamtproteinmenge in der Speicheldrüse der Fliege ausmacht.

3. Eine Zusammensetzung, bestehend aus oder enthaltend ein vasodilatatorisches Protein oder ein aktives Fragment davon, ableitbar vom Speicheldrüsenlysat der Sandfliege Lutzomyia longipalpis und einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei das Protein ein Molekulargewicht von etwa 6839 Dalton hat, massenspektrometrisch bestimmt.

4. Ein vom Speicheldrüsenlysat der Sandfliege Lutzomyia longipalpis ableitbares Protein, das die Makrophagenfunktion inhibiert und ein Molekulargewicht von etwa 6839 Dalton hat, massenspektrometrisch bestimmt.

5. Das Protein gemäß Anspruch 4, wobei das Protein durch eines oder mehrere der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

(a) Elution vor CGRP in einer Acetonitril-H&sub2;O- Trifluoressigsäure-Elution in einer Hochleistungsflüssigchromatographiesäule mit Umkehrphasen; oder

(b) das Protein ca. 1 % der Gesamtproteinmenge in der Speicheldrüse der Fliege ausmacht.

6. Ein synthetisches Protein oder Peptid, bestehend aus oder enthaltend eine Aminosäuresequenz mit ausreichender Duplikationsfähigkeit der Sequenz des aktiven Teils des Proteins gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 4, so daß das Protein in der Lage ist, bei einem Säuger Vasodilatation oder temporäre Immunsuppression herbeizuführen.

7. Das Protein gemäß Anspruch 6, hergestellt durch (a) Expression der rekombinanten DNA in einer Wirts zelle; oder (b) chemische Peptidsynthese.

8. Ein vasodilatatorisches Protein mit einer Aminosäuresequenz, die der Nucleotidsequenz entspricht wie in der Sequenzliste der Sequenz Nr. 1 oder Sequenz Nr. 2 dargestellt, oder mit einer Aminosäuresequenz, die der der Nucleotidsequenz entspricht, die als codierende Reste 18-80 in Sequenz Nr. 2 dargestellt ist.

9. Eine das Protein gemäß Anspruch 1, Anspruch 4 oder Anspruch 6 codierende Nucleinsäure.

10. Eine das vasodilatatorische Protein gemäß Anspruch 8 codierende DNA, die z. B. die in der Sequenzuste der Sequenz Nr. 1 oder Sequenz Nr. 2 aufgeführte Nucleotidsequenz oder die in Sequenz Nr. 2 dargestellte Nucleotidsequenz 52 bis 240 hat.

11. Ein Expressionsvektor, der die DNA gemäß Anspruch 10 enthält; oder eine mit diesem Expressionsvektor transformierte Zelle.

12. Eine für eine Signalsequenz eines Proteins gemäß Anspruch 1 codierende DNA.

13. Die DNA gemäß Anspruch 12, wobei die Nucleotidsequenz dem Nucleotid 1 bis 51 der Sequenz 2 in der Sequenzliste entspricht.

14. Ein Protein, ein aktives Fragment davon oder ein Peptid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 6 zur therapeutischen Verwendung, z. B. zur

(a) Steigerung der Durchblutung im Kreislaufsystem eines Säugers durch parenterale Applikation des Proteins, aktiven Fragments oder Peptids, um Vasodilatation herbeizuführen; oder

(b) lokalen Steigerung der Durchblutung in einem Gefäßbett durch äußerliche Applikation des Proteins, aktiven Fragments oder Peptids, um eine Vasodilatation herbeizuführen; oder

(c) Induktion einer temporären Immunsuppression bei einem Säuger.

15. Verwendung eines Proteins oder Peptids gemäß Anspruch 4 und/oder Anspruch 6 und CGRP, Calcitonins oder Gemischen davon zur Herstellung eines parenteralen Medikaments zur Desensibilisierung eines Säugers gegenüber der Wirkung eines Immunogens durch temporäre Unterdrückung des Immunsystems des Säugers während der Immunogenexposition, wobei das Immunogen z. B. aus einer für den betreffenden Säuger xenotypischen Quelle abgeleitet ist, z. B. beim Menschen Streptokinase oder einem monoklonalen Mausantikörper.