DE69024639T2

DE69024639T2 - Inosin-guanosin-kinase

Info

Publication number: DE69024639T2
Application number: DE69024639T
Authority: DE
Inventors: Tatsuro Yamaguchi 747 Fujio; Akihiro Tokyo 194 Iida; Hideo Tokyo 194 Mori; Sadao Tokyo 194-01 Teshiba
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1989-12-05
Filing date: 1990-12-04
Publication date: 1996-06-05
Anticipated expiration: 2010-12-05
Also published as: DE69024639D1; EP0458971A4; CA2046865C; ES2084046T3; EP0458971B1; KR920701444A; ATE132528T1; WO1991008286A1; CA2046865A1; EP0458971A1; KR0145418B1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Inosin-Guanosin-Kinase, die die Reaktion der 5'-Inosinsäure (5'-IMP)-Bildung aus Inosin und Adenosintriphosphat (ATP) oder Desoxyadenosintriphosphat (dATP) sowie die Reaktion der 5'-Guanylsäure (5'-GMP)-Bildung aus Guanosin und ATP oder dATP katalysiert, sowie ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden unter Verwendung des Enzyms.

Stand der Technik

5'-Nucleotide, unter anderem 5'-IMP und 5'-GMP, wirken geschmacksverstärkend und werden allgemein als Würzmittel verwendet. Als Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden sind ein Verfahren zum enzymatischen Abbau von in Hefezellen vorhandener RNA (Journal of Agricultural and Chemical Society of Japan, 34 (1969), 489), ein Verfahren zur Züchtung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur 5'-IMP-Produktion [Agricultural and Biological Chemistry 46 (1982), 2557], ein Verfahren zur chemischen Phosphorylierung von Nudeosiden, wie Inosin und Guanosin [Bulletin of the Chemical Society of Japan 42 (1969), 3505-3508], und dergleichen bekannt. Vom industriellen Standpunkt ist gegenwärtig die chemische Phosphorylierung unter Verwendung dieser Nudeoside am vorteilhaftesten, da Inosin und Guanosin durch Fermentation einfach zu gewinnen sind. Im Fall der Durchführung einer chemischen Phosphorylierung werden jedoch große Mengen an Chloriden bei einer niedrigeren Temperatur verwendet [Bulletin of the Chemical Society of Japan 42 (1969), 3505- 35081, so daß das Verfahren sowohl unter dem Gesichtspunkt der Kosten als auch des Umweltschutzes nicht wünschenswert ist. Dementsprechend ist eine enzymatische Phosphorylierung von Nudeosiden unter milden Bedingungen erwünscht. Die biochemische Phosphorylierung von Purin-Nucleosiden unter Verwendung gezüchteter Zellen verschiedener Mikroorganismen ist bereits beschrieben worden (ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldungen 116698/83 und 230094/88), die jedoch der chemischen Phosphorylierung in puncto Umsetzungsrate und Ausbeute unterlegen ist.
Als Inosin-phosphorylierendes Enzym ist die Inosin-Kinase (EC. 2.7.1.73) bekannt, aber es gibt nur Berichte über eine aktive Roh-Fraktion, die aus tierischen Geweben oder Mikroorganismen stammt [The Enzymes, Bd. IX (1973), 54-56, Academic Press; Nudeosides and Nudeobases in Microorganisms (1983), 5. 66, Academic Press]. Man hat die Hypothese aufgestellt, daß auch in E. coli eine Guanosin-Kinase-Aktivität vorhanden ist, die Guanosin phosphoryliert [J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 1263-1273]. Die Aktivität ist jedoch gering und die Aufreinigung des Enzyms ist außerordentlich schwierig, so daß eine industrielle Nutzung kaum möglich ist. Außerdem sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Enzyms nicht geklärt. Jedenfalls ist die Inosin-Guanosin-Kinase ein Enzym, das bisher weder isoliert noch gereinigt worden ist.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Inosin-Guanosin-Kinase sowie die Bereitstellung eines Verfahrens zur industriellen kostengünstigen Herstellung von 5'-Nucleotiden, u.a. von 5'- IMP und 5'-GMP, die allgemein als Würzmittel verwendet werden.

Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß werden eine Inosin-Guanosin-Kinase, die aus einem zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus stammt und die Reaktion, in der 5'-IMP aus Inosin und ATP oder dATP gebildet wird und die Reaktion, in der 5'-GMP aus Guanosin und ATP oder dATP gebildet wird, katalysiert, ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms und ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden unter Verwendung des Enzyms bereitgestellt.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben.
Die erfindungsgemäße Inosin-Guanosin-Kinase kann gewonnen werden, indem ein zur Gattung Escherichia gehörender Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion der Inosin-Guanosin-Kinase in einem Medium gezüchtet, die Inosin-Guanosin-Kinase in gezüchteten Zellen produziert und angereichert und dann daraus gewonnen wird.
Als Mikroorganismus kann ein beliebiger Mikroorganismus verwendet werden, der in der Natur vorkommt oder durch gentechnische Verfahren konstruiert wird, sofern zur Gattung Escherichia gehört und die Fähigkeit zur Produktion der Inosin-Guanosin-Kinase aufweist.
Nachstehend werden ein Verfahren zum Erhalt von erfindungsgemäßen, durch gentechnische Verfahren konstruierten Mikroorganismen und ein Verfahren zur Herstellung von Inosin-Guanosin-Kinase unter Verwendung der Mikroorganismen angegeben.
Die Inosin-Guanosin-Kinase kann durch Isolierung chromosomaler DNA aus einem zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus, Clonierung eines Inosin-Guanosin-Kinase codierenden Gens unter Verwendung gentechnischer Verfahren zur Herstellung eines Bakterienstammes mit erhöhter Inosin-Guanosin-Kinase-Ativität und Züchtung des Stammes gewonnen werden.
Isolierung und Clonierung des Inosin-Guanosin-Kinase codierenden Gens, das aus einem zur Gattung Escherichia gehörenden Stamm stammt, können wie nachstehend beschrieben durchgeführt werden. Dazu wird chromosomale DNA aus Stämmen der Gattung Escherichia mittels eines üblichen Verfahrens zur DNA-Isolation, beispielsweise des Phenol-Verfahrens [Biochim. Biophys. Acta 72 (1963), 619-629] isoliert, Die erhaltene chromosomale DNA wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z.B. BamHI, Sau3AI, BglII, usw., gespalten. Durch Insertion der mit dem Restriktionsenzym gespaltenen Fragmente in eine Vektor-DNA wird im Gemisch mit verschiedenen anderen rekombinanten DNAS eine rekombinante DNA erhalten, in die das DNA-Fragment inseriert worden ist, das das aus einem Stamm der Gattung Escherichia stammende, Inosin-Guanosin-Kinase codierende Gen enthält. In dem vorstehend beschriebenen Gemisch aus rekombinanten DNAS befindet sich die rekombinante DNA, die das DNA-Fragment umfaßt, das das Inosin-Guanosin-Kinase codierende Gen enthält. Unter Verwendung des rekombinanten DNA-Gemisches wird ein wirts-Mikroorganismus nach dem Verfahren von Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69 (1979), 2110] transformiert.
Ausgangsmaterial für das Inosin-Guanosin-Kinase codierende Gen ist die chromosomale DNA eines zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus. Spezifische Beispiele sind der Escherichia coli-Stamm HM70, der Escherichia coli-Stamm W3110 [Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Laboratory; ATCC 14948], usw.
Als Vektor, der das DNA-Fragment mit dem darin inserierten, Inosin- Guanosin-Kinase codierenden Gen enthält, kann ein beliebiger Phagen-Vek tor, Plasmid-Vektor, usw. verwendet werden, sofern der Vektor in einem zur Gattung Escherichia gehörenden Stamm autonom repliziert wird. Bevorzugte Beispiele sind PBR322 [Gene 2 (1977), 95], pUC19 [Gene 33 (1985), 103], pTrS30 [Doktorarbeit von Tatsuya Nishi (1988), S. 130, Tokyo University], usw.
Jeder beliebige Wirts-Mikroorganismus kann verwendet werden, sofern er zur Gattung Escherichia gehört und eine rekombinante DNA tragen kann, die erhalten wird, indem das Gen, das Inosin-Guanosin-Kinase codiert und aus einem zur Gattung Escherichia gehörenden Stamm stammt, in einen Vektor inseriert wird. Spezifische Beispiele sind der Escherichia coli- Stamm HM70, der Escherichia coli-Stamm MC1OOO [J. of Molecular Biology 138 (1980), 179-207], der Escherichia coli-Stamm DH1 [Molecular Cloning (1982), 505, Cold Spring Harbor Laboratory], usw.
Das Gen kann auch in andere Bakterienarten inseriert werden, indem das Gen aus der so erhaltenen rekombinanten DNA, die das Inosin-Guanosin-Kinase codierende und aus einem zur Gattung Escherichia gehörenden Stamm stammende Gen enthält, unter Verwendung des Wirts-Vektor-Systems anderer Arten subcloniert wird.
Als Wirts-Vektor-System können alle bekannten Systeme verwendet werden. Beispiele umfassen die Wirts-Vektor-Systeme der Gattungen Serratia, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Bacillus, usw.
Der Escherichia coli-Stamm HM70, der einer der Quellen für das Inosin-Guanosin-Kinase codierende Gen ist, wurde erhalten, indem bei dem vom National Genetics Research Institute, Japan, erhaltenen Escherichia coli-Stamm SΦ609 [Molec. Gen. Genet. 143 (1975), 85-91] ein Teil der Nucleosid-Abbau-Aktivität auf genetischer Ebene durch Behandlung mit UV- Strahlen zerstört wurde. Der Stamm HM70 wird nicht nur als Quelle des Gens verwendet, sondern auch als Wirt zur Clonierung des Gens.
Die Selektion des Stammes HM70 erfolgte wie folgt. Der Stamm SΦ609 besitzt eine Inosin-Abbau-Aktivität und baut daher bei Züchtung auf einem mit Inosin angereicherten Plattenmedium Inosin zu Hypoxanthin und Ribose ab. Der Stamm SΦ609 kann außerdem Ribose als Zuckerauelle verwenden und assimiliert daher bei Züchtung auf einer mit Inosin angereicherten Platte zur Untersuchung des Zuckerstoffwechsels (mit Inosin angereicherte MacCONKEY-Platte) Ribose, so daß rote Kolonien gebildet werden. Der Stamm SΦ609 wurde deshalb auf einer mit Inosin angereicherten MacCONKEY-Platte ausgestrichen und mit UV-Strahlen so bestrahlt, daß die Abtötungsrate bei 95 & lag, wobei Mutationen induziert wurden. Die erscheinenden weißen Kolonien waren Stämme Ribose schlechter verwerten konnten, d.h. Stämme mit verminderter Inosin-Abbau-Aktivität. Der Stamm mit der niedrigsten Inosin-Abbau-Aktivität wurde aus den Kolonien ausgewählt und als Stamm HM70 bezeichnet.
Die Stämme SΦ609 und HM70 können nicht auf mit Hypoxanthin angereicherten Minimalagar-Platten wachsen, da diesen Stämmen der Stoffwechselweg zur Biosynthese von Purin-Nudeotiden und der Salvage-Stoffwechselweg, bei dem 5'-IMP aus Hypoxanthin produziert wird, fehlen. Der Stamm HM70 mit verminderter Inosin-Abbau-Aktivität, die etwa ein Viertel der Aktivität des Stammes SΦ609 betrug, konnte jedoch Inosin verwerten. Der Stamm HM70 konnte daher sogar auf Platten mit Minimalagar-Medium wachsen, das mit Inosin angereichert war [das Plattenmedium wurde durch Auflösen von 6 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g NaCl, 1 g NH&sub4;Cl 15 g Agar in 1 Liter destilliertem Wasser, Einstellen des pH-Wertes auf 7,4 mit 1 N NAOH, dann Sterilisieren mittels Autoklavieren und Zugabe einer sterilen Lösung aus 2 ml 1 M MgSO&sub4;, 10 ml 20%-iger Glucose und 0,1 ml 1 M CaCl&sub2; hergestellt (Inosin wurde bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt)], während der Stamm SΦ609 auf diesem Medium nicht wachsen konnte. Die Wiederherstellung der Wachstumsfähigkeit war jedoch auf die geringe Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität zurückzuführen, die der Stamm HM70 von Natur aus besitzt, wobei die Wachstumsgeschwindigkeit äußerst gering war. Wenn das mit einem Plasmid-Vektor ligierte Strukturgen der Inosin-Guanosin-Kinase in den Stamm HM70 eingeführt wurde, erhöhte sich die Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität in den Zellen und das Wachstum auf Platten mit Minimalagar-Medium, das mit Inosin angereichert war, nahm zu. Da der Elternstamm SΦ609 andererseits starke Inosin-Abbau-Aktivität aufwies, konnte er wegen des Abbaus von Inosin im Medium nicht auf Platten mit Minimalagar-Medium wachsen, das mit Inosin angereichert war, selbst wenn eine das Inosin-Guanosin-Kinase-Gen und einen Plasmid-Vektor umfassende rekombinante DNA in den Elternstamm eingeführt wurde.
Aus den so erhaltenen Transformanten wurde wie folgt ein Stamm selektiert, der die Fähigkeit besitzt, die Reaktion,in der 5'-IMP aus Inosin und ATP oder dATF gebildet wird, sowie die Reaktion, in der 5'-GMP aus Guanosin und ATP oder dATP gebildet wird, zu katalysieren.
Die erhaltenen Transformanten wurden mit einem organischen Lösungsmittel behandelt, das die Durchlässigkeit der Membranen erhöhte. Unter Verwendung des so behandelten Produkts als Enzymquelle wurde die Reaktion, in der 5'-IMP- aus Inosin und ATP oder dATP gebildet wird, bzw. die Reaktion, in der 5'-GMP aus Guanosin und ATP oder dATP gebildet wird, durchgeführt. Die produzierte 5'-IMP- bzw. 5'-GMP-Menge wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) quantitativ bestimmt. Ein Stamm, der eine erhöhte Menge von produziertem 5'-IMP oder 5'-GMP zeigte, ist ein Inosin-Guanosin-Kinase-Clon. Wenn eine unter Verwendung des Stammes HM70 als Wirt konstruierte Transformante auf Platten mit Minimalagar-Medium, das mit Inosin angereichert war, überimpft und bei 30ºC gehalten wurde, wuchsen einige Kolonien schnell und erschienen innerhalb von 2 bis 3 Tagen. Die meisten der schnell wachsenden Stämme waren Inosin-Guanosin-Kinase-Clone. Aus den erhaltenen Transformanten wurden rekombinante DNA-Moleküle isoliert, die das aus einem zur Gattung Escherichia gehörenden Stamm stammende, Inosin-Guanosin-Kinase codierende Gen umfaßten.
Beispiele für Stämme mit erhöhter Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität umfassen den Escherichia coli-Stamm HM70/pBM2, der eine rekombinante DNA trägt, die durch Insertion eines aus dem Escherichia coli-Stamm HM70 stammenden, Inosin-Guanosin-Kinase codierenden Gens in einen Vektor konstruiert wurde, den Escherichia coli-Stamm DH1/pBM1, der eine rekombinante DNA trägt, die durch Insertion eines aus dem Escherichia coli- Stamm W3110 stammenden, Inosin-Guanosin-Kinase codierenden Gens in einen Vektor konstruiert wurde, usw. Die Escherichia coli-Stämme HM70/pBM2 und DH1/pBM1 sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages wie in Tabelle 1 gezeigt als Escherichia coli HM72 bzw. Eschenchia coli HM1 hinterlegt worden. Tabelle 1 Mikroorganismen-Bezeichnung Datum der Hinterlegung Escherichia coli Oktober Dezember
Die Stämme mit erhöhter Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität werden entsprechend eines üblichen Verfahrens zur Bakterien-Züchtung gezüchtet. D. h. die Mikroorganismen können in einem üblichen Medium, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen, Aminosäuren, Vitamine, usw. enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden, wobei Temperatur, pH-Wert, usw. kontrolliert werden.
Für das Medium können als Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Melasse, Restmelasse, Stärkehydrolysate, usw., Alkohole, wie Ethanol, Glycerin, Sorbit, usw., organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure, usw., sowie Aminosäuren, -wie Glycin, Alanin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, usw. verwendet werden, sofern die Mikroorganismen diese Verbindungen assimilieren können. Vorzugsweise liegt die Konzentration der verwendeten Kohlenstoffquellen bei 5 % bis 30 %.
Als Stickstoffquellen können Ammoniak, Ammoniumsalze verschiedener anorganischer und organischer Säuren, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, usw., stickstoffhaltige organische Verbindungen, wie Harnstoff, Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder Spaltprodukte davon, usw., sowie verschiedene Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, usw. verwendet werden. Die Konzentration der verwendeten Stickstoffquellen liegt im allgemeinen bei 0,1 % bis 10 %.
Als anorganische Verbindungen können Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumphosphat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Calciumcarbonat, usw. verwendet werden.
Wenn der verwendete Mikroorganismus für sein Wachstum einen bestimmten Nährstoff benötigt, wie z.B. eine Aminosäure, Nudeinsäure, ein Vitamin, usw., wird das Medium mit einer geeigneten Menge dieser Stoffe angereichert.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen z.B. als Schüttelkultur, Submerskultur unter Rühren, usw., durchgeführt. Die bevorzugte Züchtungstemperatur liegt im allgemeinen bei 28ºC bis 32ºC. Die Zeitspanne der Züchtung beträgt im allgemeinen 1 bis 24 Stunden. Wünschenswerterweise wird der pH-Wert des Mediums mit Ammoniak, Harnstoff, einer Natriumhydroxid-Lösung, usw., im neutralen Bereich gehalten.
Nach Beendigung der Züchtung kann die Inosin-Guanosin-Kinase aus den gezüchteten Zellen in einer zur Gewinnung eines Enzyms üblichen Weise isoliert werden, z.B. wie nachfolgend beschrieben. Zuerst werden die erhaltenen Zellen gründlich gewaschen und dann einer Ultraschallbehandlung unterworfen, wobei ein zelifreier Extrakt erhalten wird. Nach Zentrifugation wird dem erhaltenen überstand Protaminsulfat zugegeben. Das Gemisch wird zentrifugiert, um hochmolekulare Nudeinsäuren in Form von Präzipitaten zu entfernen. Der Überstand wird auf eine Sephadex-G- 50-Säule gegeben und danach mittels Gelfiltration entsalzt. Zum Erhalt des gereinigten Produkts werden anschließend eine Anionenaustausch-Chromatographie-Behandlung unter Verwendung von DEAE-Sepharose und eine Gelfutration durch Sephacryl-S-200 durchgeführt.
Die folgenden Verbindungen sind Bestandteile der in der Beschreibung aufgeführten Puffer.
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure
PIPES: Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)
TAPS N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-1-propansulfonsäure
CHES: Cyclohexylamino-ethansulfonsäure
Die Aktivität der gewonnenen Inosin-Guanosin-Kinase wurde wie folgt bestimmt. Eine Reaktionslösung (nachstehend als Reaktionslösung bezeichnet), die aus 100 mM HEPES-Puffer (pH-Wert 7,2), 10 mM MgSO&sub4;, 50 mM Kai, 1 mM ATP und 1 mM Inosin bestand, wurde mit der Inosin-Guanosin-Kinase in einer Konzentration von etwa 10 µg Protein/ml in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgte eine etwa 30minütige Reaktion bei 30ºC. Im Verlauf der Reaktion wurden der Reaktionslösung in gewissen Zeitabständen Stichproben entnommen. Nachdem die Reaktionslösung zur Beendigung der Reaktion mit 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4; (mit H&sub3;PO&sub4; auf einen pH-Wert von 2,6 eingestellt) 1/20 verdünnt worden war, wurde die 5'-IMP-Menge in der nicht mehr reagierenden Reaktionslösung mittels HPLC quantitativ bestimmt. Die Analyse mittels HPLC erfolgte unter Verwendung von 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4; (pH- Wert 2,6) als Elutionslösung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 milmin und einer Asahipak-GS-320H-Säule (hergestellt von Asahi Chemical Co., Ltd.). Die Messung der Bestandteile erfolgte unter Verwendung der UV-Extinktion bei 254 nm als Bezugsgröße. Eine quantitative Bestimmung erfolgte durch den Vergleich der Extinktion mit der eines Standardmitteis.
Nachfolgend werden die physikalisch-chemischen Eigenschaften der gewonnenen Inosin-Guanosin-Kinase beschrieben.

(1) Wirkung

Die Wirkung des Enzyms besteht in der Bildung von ADP und 5'-IMP aus ATP und Inosin, der Bildung von DADP und 5'-IMP aus dATP und Inosin, der Bildung von ADP und 5'-GMP aus ATP und Guanosin sowie der Bildung von dADP und 5'-GMP aus ATP und Guanosin.

(2) pH-Optimum

In ähnlicher Weise wie bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität wurden 20minütige Reaktionen bei 30ºC durchgeführt, wobei allerdings in der Zusammensetzung der Reaktionslösung die Puffersubstanz (100 mM) gegen PIPES (pH- Wert 6,6 - 7,1), HEPES (pH-Wert 6,9 - 8,3), TAPS (pH-Wert 7,9 - 8,8) oder CHES (pH-Wert 8,7 - 10,1) ausgetauscht wurde. Es stellte sich heraus, daß das pH-Optimum bei 6,9 - 8,2 lag.

(3) pH-Stabilität

Sowohl in Abwesenheit von KCl als auch in Gegenwart von 250 mM KCl wurde das Enzym 16 Stunden bei 4ºC in einer wäßrigen Lösung behandelt, die 50 mM Puffer (CHES, pH-Wert 10,0 - 9,0; TAPS, pH-Wert 8,2; HEPES, pH-Wert 8,3 - 7,3, oder PIPES, pH-Wert 6,6) und 5 mM β-Mercaptoethanol enthielt. Nach der Behandlung wurde die Aktivität bestimmt. Bei Behandlung in einem pH-Bereich von 6,6 bis 9,0 behielt das behandelte Enzym eine Restaktivität von 90 % und mehr der Aktivität des intakten Standardenzyms bei, wobei die Aktivität in diesem pH-Bereich stabil blieb. Durch Zugabe von KCl erhöhte sich die Stabilität während der Aufbewahrung.

(4) Temperatur-Optimum

Die Aktivität wurde mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität ermittelt, wobei die Temperatur von 0ºC auf 50ºC und von 31ºC auf 41ºC geändert wurde. Die optimale Temperatur lag bei 25ºC bis 40ºC.

(5) Temperaturstabilität

Eine Reaktionslösung, die aus 20% Glycerin, 50 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH-Wert 8), 5 mM β-Mercaptoethanol und 100 mM NaCl bestand, wurde mit Inosin-Guanosin-Kinase in einer Konzentration von etwa 10 Protein/ml in Kontakt gebracht und 15 Minuten bei Temperaturen von 26ºC bis 50ºC behandelt, um die bei diesen Temperaturen jeweils vorherrschenden Restaktivitäten zu bestimmen. Es stellte sich heraus, daß das Enzym bis zu einer Temperatur von 40ºC stabil war, da eine Behandlung bei einer Temperatur von 40ºC oder weniger das Enzym nur um etwa 20 % oder weniger inaktivierte. Im Gegensatz dazu ging die Aktivität bei einer Behandlung bei 50ºC schnell verloren.

(6) Substratspezifität

Mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität wurde eine Reaktion bei 30ºC durchgeführt, wobei in der Zusammensetzung der Reaktionslösung die KCl-Konzentration auf 300 mM angehoben und der Reaktionslösung anstelle von ATP verschiedene neutralisierte Phosphatquellen in einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt wurden. Wie in Figur 1 gezeigt, schritt die Reaktion bei Verwendung von ATP oder dATP, die gute Phosphatdonoren für das Substrat waren, voran. Weiterhin schritt die Reaktion im Fall der Verwendung von Uridintriphosphat (UTP) etwas voran. Adenosindiphosphat (ADP), Adenosinmonophosphat (5'-AMP), Guanosintriphosphat (GTP), Orotsäuremonophosphat (5'-OMP), Cytidinmonophosphat (5'-CMP), p-Nitrophenylphosphat (PNPP), Acetylphosphorsäure, Tripolyphosphorsäure, Tetrapolyphosphorsäure, Pyrophosphorsäure und Phosphorsäure wirkten jedoch nicht als Phosphatdonoren. Das zeigt, daß das Enzym einer als Kinasen bezeichneten Enzymgruppe zugeordnet werden kann und sich deutlich von in den ungeprüften veröffentlichten Japanischen Patentanmeldungen 119898/83 und 230094/88 verwendeten Enzymen unterscheidet, die die Transphosphorylierung kontrollieren, nämlich den Nucleosid-Phospotransferasen (EC 2.7.1.77). Bei Verwendung von ATP oder dATP als Phosphatdonor sind Inosin und Guanosin als Phosphatakzeptoren bevorzugt.

(7) Inhibitor

Die Aktivität wurde mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität durch eine 30minütige Reaktion bei 30ºC bestimmt, wobei allerdings die KCl-Konzentration geändert wurde und 300 mM betrug und der Zusammensetzung der Reaktionslösung ein Metallsalz in einer Konzentration von 1 mM zugesetzt wurde. Als Standard wurde die Aktivität ohne Zugabe eines Metalisalzes bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Das Enzym wurde durch Metall-Ionen wie Co², Cu²&spplus;, Zn²&spplus;, usw. gehemmt. Tabelle 2 Metallsalz (1 mM) Relative Aktivität (%) kein Metallsalz

(8) Aktivierung

Mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität wurde eine Reaktion durchgeführt, wobei als Puffer Tris-hydrochlond-Puffer (pH-Wert 8,0) verwendet und in der Zusammensetzung der Reaktionslösung die KCL-Konzentration geändert wurde. Die Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt. Bei Zugabe von 100 mM NaCl anstelle von KCl erfolgte keine Reaktion. Das zeigte, daß das Enzym zur Aktivierung K&spplus; benötigt. Danach wurde die Aktivierung in einem System untersucht, bei dem die Zusammensetzung der Reaktionslösung KCl in einer Konzentration von 300 mM enthielt und anstelle von MgSO&sub4; verschiedene zweiwertige oder dreiwertige Metallionensalze zugegeben wurden. Wie in Tabelle 3 gezeigt, wirken Mg²&spplus; und Mn²&spplus; aktivierend. Dadurch zeigte sich, daß das Enzym eine von zwei Kombinationen benötigt: entweder K&spplus; und Mg²&spplus; oder K&spplus; und Mn²&spplus;. Tabelle 3 Metallsalz (10 mM) Produzierte IMP-Menge (mM) Kein Metallsalz

(9) Km-Wert

In der Reaktionslösung, die aus 2 mM ATP, 10 mM MgSO&sub4;, 300 mM KCl und 0,1 M HEPES-Puffer (pH-Wert 7,2) bestand, betrug der Km-Wert für Inosin 2,1 mM und für Guanosin 6,1 µM.

(10) Aminosäuresequenz und Nucleotidsequenz

Die Nucleotidsequenz des das Enzym codierenden Strukturgens wurde mittels des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens [Science 214 (1981), 1205- 1210; Gene 19 (1982), 269-276] bestimmt und die Aminosäuresequenz wurde aus der Nucleotidsequenz abgeleitet. Die Aminosäuresequenz und die Nucleotidsequenz sind in den Tabellen 4 bzw. 5 gezeigt. Tabelle 4 Tabelle 5
Die Sequenz von 10 Aminosäuren am N-Terminus des Enzyms wurde unter Verwendung einer Aminosäure-Sequenziervorrichtung von Applied Biosystems Co., Ltd., bestimmt. Die Aminosäuresequenz stimmte mit der Aminosäuresequenz (Tabelle 4) überein, die aus der in Tabelle 5 gezeigten Nucleotidsequenz abgeleitet worden war. Die erste Aminosäure des Enzyms, Methionin, war nicht abgespalten. Aus Peptidgemischen, die durch Spaltung des Enzyms mit Lysylendopeptidase erhalten worden waren, wurde außerdem das C-terminale Peptid isoliert und gewonnen. Die Aminosäuresequenz des C- terminalen Peptids wurde mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens bestimmt. Die Aminosäuresequenz stimmte mit der in Tabelle 4 gezeigten C-terminalen Aminosäuresequenz überein. Die vorangegangenen Erläuterungen zeigen, daß die Aminosäuresequenz des Enzyms mit der Aminosäuresequenz (Tabelle 4) übereinstimmt, die aus der in Tabelle 5 gezeigten Nucleotidsequenz abgeleitet ist.

(11) Molekulargewicht

Das aus der Aminosäuresequenz abgeleitete Molekulargewicht beträgt etwa 48 400 Dalton. Gemäß Bestimmung mittels SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese (Standard für niedrige Molekulargewichte, hergestellt von Biorad Co., Ltd., Katalog-Nr. 161-0304) beträgt das Molekulargewicht etwa 43 000 Dalton.
Die in Tabelle 5 gezeigte Nucleotidsequenz entspricht Inosin-Guanosin-Kinase mit der in Tabelle 4 gezeigten Aminosäuresequenz. Als Stamm mit erhöhter Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität kann jedoch in ähnlicher Weise ein Stamm verwendet werden, der eine rekombinante DNA enthält, in die ein durch Modifikation der Nucleotidsequenz erhaltenes Gen inseriert ist, es sei denn, die Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität ist verloren gegangen. Selbst ein mutiertes Enzym, das durch Modifikation des Guanin- Restes an Position 1282 erzeugt wurde und anschließend die in Tabelle 6 gezeigte Nucleotidsequenz aufwies, zeigte Inosin-Guanosin-Kinase-Aktivität. Tabelle 6 C-Terminus des natürlich vorkommenden Proteintyps C-Terminus des mutierten Proteintyps
Nachfolgend wird nun ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden unter Verwendung des Enzyms beschrieben, das die Reaktion katalysiert, in der 5'-Nucleotid aus Nudeosiden und ATP oder dATP gebildet wird.
5'-Nucleotide können durch Inkontaktbringen von Nudeosiden mit ATP oder dATP in einem wäßrigen Medium in Gegenwart einer Enzymquelle erhalten werden, die eine Enzymaktivität besitzt, die die Reaktion katalysiert, in der 5'-Nucleotid aus Nudeosiden und ATP oder dATP gebildet wird.
Beispiele für Nudeoside sind Inosin oder Guanosin. Beispiele für 5'-Nucleotide sind 5'-IMP oder 5'-GMP.
Als Enzymquelle können Inosin-Guanosin-Kinase und Bakterienzellen mit der Fähigkeit zur Produktion des Enzyms verwendet werdens Verwendet werden können ferner Bakterienzellen mit rekombinanter DNA, die dadurch erhalten wird, daß man in einen Vektor ein DNA-Fragment inseriert, in welchem das Gen enthalten ist, das das Enzym codiert, welches an der Bildung des 5'-Nucleotids aus Nudeosiden und ATP oder dATP beteiligt ist. Ferner können eine Kultur davon oder behandelte Materialien davon verwendet werden.
Als behandelte Materialien können verwendet werden: ein Konzentrat der Kultur oder eine getrocknete Kultur, eine mit einem oberflächenaktiven Mittel und/oder einem organischen Lösungsmittel oder einem lytischen Enzym behandelte Kultur, durch Zentrifugation der Kultur gewonnene Bakterienzellen, getrocknete Bakterienzellen, mit Aceton behandelte Zellen, mit oberflächenaktiven Mitteln und/oder organischen Lösungsmitteln behandelte Zellen, mit einem lytischen Enzym behandelte Zellen, immobihsierte Bakterienzellen oder ein aus Bakterienzellen extrahiertes Enzympräparat, usw.
Als Inosin und Guanosin können in der Reaktion gereinigte Produkte oder Rohprodukte, Fermentationsnährbrühe oder zelifreie Überstände von Inosin und Guanosin verwendet werden, sofern sie die Reaktion in der 5'- Nucleotid gebildet wird, nicht beeinträchtigen. Die Konzentration der Nudeoside liegt im Bereich von 10 g/l bis 80 g/l.
Als Phosphatdonor dienen ATP oder dATP. Als ATP- oder dATP-Quelle können gereinigte Präparate oder Rohpräparate von ATP und dATP oder Materialien verwendet werden, die ATP oder dATP enthalten, sofern sie keinen Stoff enthalten, der die Reaktion beeinträchtigt.
Da ATP und dATP teuer sind, ist es vorteilhaft, dem Reaktionssystem einen Mikroorganismus zuzugeben, der ATP neu bilden kann (ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung 74595/86), oder ATP aus Glucose und anorganischer Phosphorsäure zu synthetisieren.
In diesem Fall enthält die Reaktionslösung anstelle von ATP einen ATP-Vorläufer, einen Energiedonor zur ATP-Neubildung, einen Phosphat-Donor und einen Mikroorganismus, mit ATP-Biosynthese-Aktivität. Bei Verwendung des an das ATP-Neubildungssystem gekoppelten Reaktionssystems reicht es aus, ATP in einer katalytischen Menge zu verwenden (1,0 g/l oder weniger). Wenn Bakterien oder eine Kultur die Reaktionslösung mit der benötigten ATP-Menge versorgen oder diese in die Reaktionslösung einbringen, ist eine spezifische Anreicherung mit ATP nicht erforderlich. Beispiele für Stämme mit einer ATP-Neubildungsaktivität sind der Brevibacterium ammoniagenes-Stamm KY13761 [Agric. Biol. Chem. 42 (1978), 399-405], der Brevibacterium ammoniagenes-Stamm ATCC 21477, usw.
Brevibacterium ammoniagenes KY13761 produziert Inosin durch Fermentation. Bei Verwendung von durch Züchtung des Stammes Kv13761 gewonnener Inosin-Fermentationsnährbrühe (die Zellen enthält) als Nucleosid-Quelle und als Quelle für neugebildetes ATP kann deshalb das in der Fermentationsnährbrühe enthaltene Inosin direkt phosphoryliert werden, ohne daß eine Reinigung von Inosin erforderlich ist, so daß ein wirksames, kostengünstiges Verfahren zur Herstellung von 5'-IMP bereitgestellt wird.
Die Reaktion der 5'-Nucleotidbildung aus Inosin oder Guanosin und ATP oder dATP wird 1 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 20ºC bis 40ºC durchgeführt, wobei der pH-Wert auf 6-8 eingestellt wird, vorzugsweise durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels und/oder eines organischen Lösungsmittels. Als oberflächenaktives Mittel, das sich zur Behandlung von Bakterienzellen und zur Reaktion eignet, können kationische oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylenstearylamin (z.B. Nymeen S-215, hergestellt von Nippon Oil and Fats, Co., Ltd.; falls nicht anders angegeben, wird dieses nachstehend verwendet), Cetyltrimethylammoniumbromid, Cation FB, Cation F2-40E, usw., anionische oberflächenaktive Mittel, wie Natriumoleylamidsulfat, Newrex TAB, Rapizol 80, usw., amphotere oberflächenaktive Mittel, wie Polyoxyethylen-sorbitan-monostearat (z.B. Nonion ST221), usw., tertiäres Amin PB, Hexadecyldimethylamin, usw., verwendet werden. Andere oberflächenaktive Mittel können auch verwendet werden, sofern sie die Reaktion der 5'-Nucleotidbildung aus Nudeosiden und ATP oder dATP beschleunigen. Im allgemeinen werden die oberflächenaktiven Mittel in einer Konzentration von 0,1 mg/ml bis 50 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml bis 20 mg/ml, verwendet.
Als organisches Lösungsmittel können Toluol, Xylol, aliphatische Alkohole, Benzol und Ethylacetat verwendet werden. Das organische Lösungsmittel kann im allgemeinen in einer Konzentration von 0,1 µl/ml bis 50 µl/ml, vorzugsweise 1 µl/ml bis 20 µl/ml verwendet werden.
Nach Beendigung der Reaktion werden die in der Reaktionslösung produzierten und angereicherten 5'-Nucleotide in üblicher Weise unter Verwendung eines lonenaustauscherharzes, usw., gewonnen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Substratspezifität der Inosin-Guanosin-Kinase, wobei die Ordinate die Menge des produzierten 5'-IMP angibt und die Abszisse die Zeit.
Figur 2 zeigt die KCl-Abhängigkeit der Inosin-Guanosin-Kinase, wobei die Ordinate die Menge des produzierten 5'-IMP angibt und die Abszisse die Menge des zugegebenen KCl.
Figur 3 ist eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids pBM2, das ein Gen enthält, das die Inosin-Guanosin-Kinase codiert und aus dem Eschenchia coli-Stamm HM70 stammt.
Figur 4 ist eine Restriktionsenzymkarte des mutierten Plasmids pBM Δ14, in dem eine Deletion bis zum 5'-Ende des Strukturgens der Inosin- Guanosin-Kinase vorhanden ist.
Figur 5 ist eine Restriktionsenzymkarte des mutierten Plasmids pBMMS, in dem eine Deletion bis zum 3'-Ende des Strukturgens der Inosin- Guanosin-Kinase vorhanden ist.
Figur 6 ist eine Restriktionsenzymkarte des Vektors pTrS30.
Figur 7 ist eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids PIK75, das die Inosin-Guanosin-Kinase effizient exprimiert.
Figur 8 zeigt die Nucleotidsequenz an der Verbindungsstelle zwischen dem Tryptophan-Promotor und dem Strukturgen der Inosin-Guanosin- Kinase.
Figur 9 ist eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids pBM1, das ein die Inosin-Guanosin-Kinase codierendes Gen enthält, das aus dem Eschenchia coli-Stamm W3110 stammt.

Beste Art der praktischen Umsetzung der Erfindung

Die in den gentechnischen Experimenten der folgenden Beispiele verwendeten Reagenzien und Vektoren sind alle von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt. Die anderen Reagenzien sind von Nakarai Tesque Co., Ltd. hergestellt.

Beispiel 1

(1) DNA-Isolierung

Der Escherichia coli-Stamm HM70 wurde in LB-Flüssigmedium [1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt und 1 % Natriumchlorid (pH 7,5)] überimpft und anschließend über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Nachdem 15 g gezüchtete Zellen in 120 ml 2 mM EDTA enthaltendem 20 mM Tris-hydrochlond-Puffer (pH-Wert 7,5) gelöst worden waren, wurden der Suspension 15 ml Lysozymlösung (Lysozym wurde in einer Konzentration von 20 mg/ml in 2 mM EDTA enthaltendem 20 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,5) gelöst) zugegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 30ºC stehengelassen. Danach wurden 15 ml 20%-iges Natriumlaurylsulfat zugegeben und das Gemisch wurde langsam gerührt. Anschließend wurden der Lösung 150 ml Phenol zugegeben, das mit 1 mM EDTA enthaltendem 10 mM Tris-hydrochlond-Puffer gesättigt worden war, und danach wurde gründlich gerührt. Die Lösung wurde zentrifugiert und es wurden 150 ml der wäßrigen Phase entnommen. Das Phenolextraktions-Verfahren wurde 3mal wiederholt. 150 ml der so gewonnenen wäßrigen Phase wurden 15 ml 2,5 M Natriumacetatlösung und weiterhin 300 ml Ethanol zugegeben. Die präzipitierte chromosomale DNA wurde auf einen Glasstab aufgewickelt und getrocknet. Danach wurde die chromosomale DNA in 30 ml 1 mM EDTA enthaltendem 10 mM Tris-hydrochlond-Puffer gelöst und der Lösung wurden 50 µg/ml Ribonudease zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37ºC stehengelassen. Nachdem eine Phenolextraktion wie beschrieben durchgeführt worden war, wurden der wäßrigen Phase 3 ml 2,5 M Natriumacetatlösung sowie 60 ml Ethanol zugegeben und danach ließ man das Gemisch 16 Stunden bei -20ºC stehen. Nach Zentrifugation wurde das gewonnene Pellet mit einer 70%-igen Ethanollösung gewaschen und getrocknet, wobei gereinigte chromosomale DNA erhalten wurde. Die chromosomale DNA wurde in 1 mM EDTA enthaltendem 10 mM Tris-hydrochlond-Puffer suspendiert.

(2) Herstellung rekombinanter DNA

Einer Suspension, die 1 µg der in (1) erhaltenen chromosomalen DNA enthielt, wurde Sau3AI zur Durchführung einer partiellen Spaltung zugegeben. In einem getrennten Ansatz wurde einer Lösung, die 1 µg Vektor puclg enthielt, zur Spaltung BamHI zugegeben. Dazu wurden dann 2 µl 1 M Tris-hydrochlond-Puffer (pH-Wert 8,0) gegeben und das Gemisch wurde eine Stunde bei 65ºC mit alkalischer Phosphatase behandelt. Die vorstehend beschriebene gespaltene chromosomale DNA und Vektor-DNA wurden ebenso wie in (1) mittels Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Nach Suspension von 100 ng gereinigter chromosomaler DNA und 20 ng gereinigter Vektor-DNA in einer Lösung, die 66 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH-Wert 7,6), 66 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,1 mM ATP enthielt, wurden der Suspension 10 Einheiten T4-Ligase zugegeben. Um rekombinante DNA zu erhalten, wurde das Gemisch zur Ligierung der chromosomalen DNA mit der Vektor-DNA 16 Stunden bei 14ºC stehengelassen.

(3) Herstellung eines Escherichia coli-Stamms mit der darin eingeführten rekombinanten DNA

Der Escherichia coli-Stamm HM70 wurde in 50 ml LB-Flüssigmedium überimpft und anschließend 4 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die durch 7minütige Zentrifugation bei 3000 Upm geernteten Bakterien wurden bei 0ºC in 20 ml 50mM Calciumchlorid-Lösung suspendiert. Nachdem man die Suspension 20 Minuten bei 0ºC stehengelassen hatte, wurden die Zellen mittels Zentrifugation in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben gewonnen und bei 0ºC in 40 ml 50mM Calciumchlorid-Lösung suspendiert. Die Suspension wurde mit der Lösung gemischt, die die in (2) gewonnene rekombinante DNA enthielt, und das Gemisch wurde 10 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Nach einer 90 Sekunden langen Hitzebehandlung bei 42ºC wurde das Gemisch auf Platten mit Minimalagarmedium, das 50 µg/ml Ampicillin und 5 mM Inosin enthielt, ausgestrichen. Die Platten wurden 48 bis 72 Stunden bei 30ºC gehalten.

(4) Isolierung von Inosin-Guanosin-Kinase codierender DNA

Nach 2 bis 3 Tagen erschienen auf den in (3) beschriebenen Platten verschiedene Kolonien. Jede der Kolonien wurde über Nacht bei 30ºC in LB-Flüssigmedium gezüchtet. Ein Teil jeder Kultur wurde auf Platten mit Minimalagarmedium, das 50 µg/ml Ampicillin und 5 mM Inosin enthielt, ausgestrichen und 36 bis 48 Stunden bei 30ºC gehalten. Am zweiten Tag wurde eine gut wachsende Kolonie selektiert, d.h. eine Transformante, die eine rekombinante DNA mit dem Inosin-Guanosin-Kinase-Gen enthielt. Die Transformante, die eine rekombinante DNA mit dem Inosin-Guanosin-Kinase-Gen enthielt, wurde über Nacht bei 30ºC in LB-Flüssigmedium gezüchtet. Nach der Zellernte wurde Plasmid-DNA mit Hilfe des in Maniatis et al. beschriebenen Verfahrens [Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Laboratory] isoliert und ihre Nucleotidsequenz mittels des Didesoxy-Verfahrens [Messing, J., Methods in Enzymology 101 (1983), 20-78] bestimmt. Die Nucleotidsequenz des Strukturgen-Anteus der Inosin-Guanosin-Kinase ist in Tabelle 5 gezeigt.
Die so gewonnene rekombinante DNA, die das Gen enthält, das die Inosin-Guanosin-Kinase codiert und aus dem Escherichia coli-Stamm HM70 stammt, wurde als pBM2 bezeichnet. Eine Restriktionsenzymkarte von pBM2 ist in Figur 3 gezeigt.
In Figur 3 stellt der mit einer dicken schwarzen Linie markierte Teil das Strukturgen dar, das die Inosin-Guanosin-Kinase codiert und aus dem Escherichia coli-Stamm HM70 stammt. In der Figur verläuft die Richtung der Transkription des Gens von der ClaI-Restriktionsstelle zur BglII-Stelle.

(5) Konstruktion eines Plasmids hoher Inosin-Guanosin-Kinase-Expression und seine Einführung in einen Mikroorganismus

Das Strukturgen der Inosin-Guanosin-Kinase wurde stromabwärts vom Tryptophan-Promotor von Escherichia coli ligiert, was eine sehr effiziente Expression der Inosin-Guanosin-Kinase ermöglicht.
Das in (4) erhaltene Plasmid pBM2 wurde nach dem in "Molecular Cloning" beschriebenen Verfahren (S. 86-96) aufgereinigt. Unter Verwendung der Restriktionsenzyme SmaI (5 Einheiten) und KpnI (5 Einheiten) wurden 10 µg pBM2 vollständig gespalten. Zur Herstellung einer Mutante, bei der in Richtung des inserierten Fragments befindliche Nudeotide deletiert sind, wurde das erhaltene Spaltprodukt mit ExoIII-Nuclease behandelt. Dabei wurde das mutierte Plasmid PBMΔ14 (Figur 4) selektiert, bei dem eine Deletion bis zum 5'-Ende des Strukturgens der Inosin-Guanosin-Kinase vorlag. Zur Konstruktion der Deletionsmutante wurde der von Takara, Japan, hergestellte Deletionskit zur Kib-Sequenzierung entsprechend der beigefügten Broschüre verwendet. Das Plasmid PBMΔ14 wurde mit PstI und XbaI gespalten. Dann wurde in gleicher Weise wie vorstehend beschrieben eine Mutante hergestellt, indem in Richtung des inserierten Fragments befindliche Nudeotide durch ExoIII-Nudease abgespalten wurden. Dadurch wurde das mutierte Plasmid pBMM5 (Figur 5) erhalten, bei dem eine Deletion bis zum 3'-Ende des Strukturgens der Inosin-Guanosin- Kinase vorlag. Nach Spaltung von 10 µg pBMM5 mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII wurden die überhängenden Enden unter Verwendung eines Kits zur Herstellung glatter DNA-Enden in glatte Enden überführt. Zur Gewinnung präzipitierter DNA mit glatten Enden wurde Ethanol zugegeben. Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Saci gespalten. Das Spaltprodukt wurde mittels Agarose-Gelelektrophcrese isoliert, wobei aus dem Gel ein das Strukturgen der Inosin-Guanosin-Kinase enthaltendes Fragment gewonnen wurde (wobei DNA-Prep, hergestellt von Asahi Glass Co., Ltd., verwendet wurde). Das gewonnene Fragment wurde in die Saci-Nrui-Stellen des Vektors pTrS30 (Figur 6) inseriert, wobei das Plasmid pIK1 erhalten wurde. Danach wurden 10 µg pIK1-DNA mit 5 Einheiten ClaI gespalten (die ClaI-Stelle im Strukturgen der Inosin-Guanosin-Kinase wird nicht gespalten, da sie im allgemeinen durch Methylierung modifiziert ist). Nach Gewinnung des präzipitierten Spaltprodukts durch Zugabe von Ethanol wurden an beiden Spalt-Enden unter Verwendung von Nudease BAL31 Deletionen eingeführt. Das deletierte Plasmid wurde mittels Präzipitation nach Zugabe von Ethanol gewonnen und anschließend ligiert (Ligierungs-Kit). Das deletierte Plasmid wurde zur Transformation des Stammes MC1000 verwendet. Aus den erhaltenen Transformanten wurden verschiedene deletierte Plasmide gewonnen. Aus diesen Plasmiden wurde Plasmid pIK75 (Figur 7) ausgewählt, bei dem das Strukturgen der Inosin-Guanosin-Kinase unmittelbar stromabwärts der aus dem Vektor stammenden Shine-Dalgarno-Sequenz ligiert war. Die Nucleotidsequenz an der Verbindungsstelle zwischen dem Tryptophan-Promotor und dem Strukturgen der Inosin-Guanosin-Kinase ist in Figur 8 gezeigt. Soweit nicht anders angegeben, wurden die in diesem Abschnitt verwendeten gentechnischen Verfahren, wie Spaltung mit Restriktionsenzymen, usw., nach den in "Molecular Cloning" beschriebenen Verfahren durchgeführt.

(6) Züchtung eines Mikroorganismus hoher Inosin-Guanosin-Kinase-Expression

Zur Züchtung des Stammes MC1000, der das in (5) erhaltene Plasmid pIK75 enthält [nachstehend als MC1000(pIK75) bezeichnet], eignet sich das Züchtungsverfahren bei hoher Dichte [Biotechnol. Bioeng. 17 (1975), 227-239]. Der Stamm MC1000(pIK75) wurde mit Hilfe des Züchtungsverfahren bei hoher Dichte gezüchtet.
Der Stamm MC1000(pIK75) wurde in 500 ml Anzuchtmedium folgender Zusammensetzung überimpft und anschließend 16 Stunden bei 30ºC gezüchtet.
Zusammensetzung des Anzuchtmediums: 3,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 3,5 g/l (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 1,0 g/l MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 5 g/l Glucose, 5 g/l Hefeextrakt, 3 ml/l Spurenelemente-Lösung (30 Minuten bei 120ºC dampfsterilisiert).
Zusammensetzung der Spurenelemente-Lösung: 27 g/l FeCl&sub3; x 6 H&sub2;O, 2 g/l ZnCl&sub2; x 4 H&sub2;O, 2 g/l CoCl&sub2; x 6 H&sub2;O, 2 g/l Na&sub2;MoO&sub4; x 2 H&sub2;O, 1 g/l CaCl&sub2; x 2 H&sub2;O, 1 g/l CuCl&sub2;, 0,5 g/l H&sub3;BO&sub3;, 100 ml/l konzentrierte HCl.
Danach wurden 3 l Fermentationsmedium (Medium, das durch weitere Zugabe von 10 g KH&sub2;PO&sub4; x 3 HO und 5 g MGSO&sub4; x 7 H&sub2;O zu 3 l Anzuchtmedium vorstehend beschriebener Zusammensetzung erhalten wurde) in einen Fermentationstank mit einem Volumen von 7,5 l gegeben und anschließend wurde 30 Minuten bei 120ºC dampfsterilisiert. Nach Zugabe von 150 ml einer 50%-igen (Gew./Vol.) sterilen Glucoselösung in den Fermentationstank wurden 500 ml Anzuchtmedium, in dem MC1000(pIK75) gezüchtet worden war, zugegeben.
Der pH-Wert wurde mit 5,5 M wäßrigem Ammoniak auf 6,8 eingestellt und die Züchtung wurde 24 Stunden unter Rühren (6000 Upm) und Belüftung (3 l/min) fortgeführt. Während einer Zeitspanne von 4 bis 6 Stunden nach Züchtungsbeginn wurde die Glucosekonzentration in der Kultur auf 2,5 % oder weniger verringert. Zur Aufrechterhaltung einer Glucosekonzentration von 2 % bis 3 % in der Kultur wurde von diesem Punkt an eine 50%- ige (Gew./Vol.) Glucoselösung kontinuierlich nach und nach in den Fermentationstank eingeleitet. (Die Kultur wurde zentrifugiert und die als Niederschlag gewonnenen Zellen wurden bei -20ºC aufbewahrt. Die Zellen wurden nachfolgend in (7) und (9) verwendet. Nach Beendigung der Züchtung wurde außerdem das Medium bei -20ºC eingefroren und unmittelbar vor Verwendung in (10) bei 30ºC aufgetaut.

(7) Aufreinigung der Inosin-Guanosin-Kinase

6 g der in (6) erhaltenen und bei -20ºC aufbewahrten Zellen wurden in 24 ml Reinigungspuffer [20 % Glycerin, 50 mM Tris-hydrochlond-Puffer (pH 8) und 5 mM β-Mercaptoethanol] suspendiert. Die Suspension wurde mit einer Homogenisiervorrichtung (hergestellt von Brown Biotech Co., Ltd., Durchmesser der Glaskugeln 0,1 mm) aufgeschlossen. Das Homogenat wurde zentrifugiert, wobei etwa 20 ml Überstand erhalten wurden. Dem Uberstand wurde Protaminsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,4 % zugegeben und anschließend erfolgte eine Zentrifugation. Auf diese Weise wurden hochmolekulare Nucleinsäure-Bestandteile als Präzipitat entfernt. Man ließ den erhaltenen Überstand durch eine Sephadex-G-50-Säule laufen, die vorher mit Reinigungspuffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Reinigungspuffer eluiert, wobei etwa 30 ml einer entsaizten aktiven Fraktion erhalten wurden. Man ließ die Fraktion durch eine DEAE-Sepharose-Säule hindurchlaufen, die vorher mit Reinigungspuffer äquilibriert worden war, und gab danach 60 ml 0,1 M NaCl enthaltenden Reinigungspuffer auf die Säule. Dann wurde das gewünschte Enzym mit 200 ml Reinigungspuffer mit einem linearen NaCl-Konzentrations-Gradienten von 0,1 M bis 0,6 M eluiert. Von den eluierten aktiven Fraktionen wurden 3 ml von der Fraktion gesammelt, die die höchste Enzymkonzentration aufwies. Man ließ diese aktive Fraktion durch eine Sephacryl-S-200-Säule hindurchlaufen und eluierte mit 0,1 M NaCl enthaltendem Reinigungspuffer. Die aktive Fraktion wurde mittels Gelfutration gewonnen. Zum Schluß wurden 10 ml einer Lösung des gereinigten Enzyms (1,4 µg Protein/ml) erhalten. Das gereinigte Enzym wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese analysiert, wobei keine Verunreinigungen nachzuweisen waren. Das Enzym wurde 9 bei -20ºC in 0,1 M NaCl enthaltendem Reinigungspuffer stabil aufbewahrt.

(8) Züchtung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Neubildung von ATP

Der Brevibacterium ammoniagenes-Stamm KY13761 wurde 2 Tage bei 30ºC auf einer Platte mit Anzucht-Agarmedium gezüchtet, das durch Zugabe von 25 g/l Agar zu einem Anzuchtmedium der in Tabelle 7 beschriebenen Zusammensetzung hergestellt worden war. Die erhaltenen Zellen wurden in 30 ml Anzuchtmedium überimpft, das in einer Erlenmeyer-Flasche mit einem Volumen von 250 ml enthalten war. Anschließend wurde eine 24-stündige Schüttelkultur bei 30ºC durchgeführt.
30 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 l Anzuchtmedium der in Tabelle 7 beschriebenen Zusammensetzung überimpft, das sich in einem Fermentationstank mit einem Volumen von 5 l befand. Der pH-Wert wurde mit 5,5 M wäßrigem Ammoniak auf 6,8 eingestellt. Die Züchtung wurde unter Rühren bei 600 Upm und Belüftung von 3 l/min 24 Stunden fortgeführt.
300 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 1 Fermentationsmedium der in Tabelle 7 beschriebenen Zusammensetzung überimpft, das sich in einem Fermentationstank mit einem Volumen von 5 l befand. Der pH-Wert wurde mit 5,5 M wäßrigem Ammoniak auf 6,8 eingestellt. Die Züchtung wurde unter Rühren bei 600 Upm und Belüftung von 3 l/min 42 Stunden bei 32ºC fortgeführt. [Das Medium wurde zentrifugiert und die Zellen wurden als Niederschlag bei -20ºC aufbewahrt. Die Zellen wurden nachfolgend in (9) verwendet. Nach Beendigung der Züchtung wurde außerdem das Medium (enthaltend etwa 30 g/l Inosin) direkt bei -20ºC eingefroren und unmittelbar vor Verwendung in (10) bei 30ºC aufgetaut.] Tabelle 7 Zusammensetzung (g/l) Anzuchtmedium Fermentationsmedium Glucose L-Cystein-HCl Thiamin Ca-D-pantothenat Nicotinsäure Biotin Harnstoff Fleischextrakt Polypepton Hefeextrakt Adenin pH-Wert nicht zugegeben [Verwendung nach Dampfsterilisation (120ºC, 30 Minuten)]

(9) Produktion von 5'-Nucleotiden aus Nudeosiden durch Reaktion mit Zellen in Ruhephase

Mit 20 ml einer Lösung, die die in Tabelle 8 gezeigte Zusammensetzung aufwies, wurde unter starkem Rühren eine 24-stündige Reaktion durchgeführt, wobei die Temperatur bei 32ºC und der pH-Wert unter Verwendung von 4 N NaOH bei 7,2 gehalten wurde. Zur Bestimmung der Konzentrationen von Phosphorsäure, Inosin und 5'-IMP im Gemisch wurden in gewissen Zeitabständen kleine Mengen des Reaktionsgemisches als Probe entnommen. Zur quantitativen Untersuchung von Phosphorsäure wurde Phospho- B-test-WAKO (hergestellt von Wako Pure Chemical Industry Co., Ltd.) verwendet. Zur Aufrechterhaltung einer konstanten Konzentration von Phosophat-Ionen wurden Unterschiede zwischen den jeweiligen Meßwerten und der Anfangskonzentration durch Zugabe von Monokaliumphosphat ausgeglichen.
Die Konzentrationen von Inosin und 5'-IMP wurden mittels HPLC nach dem vorstehend beschriebenen modifizierten Verfahren quantitativ bestimmt. 24 Stunden nach Beginn der Reaktion waren etwa 100 g/l 5'-IMP (berechnet als Dinatrium-7,5-hydrat) aus etwa 50 g/l des anfangs vorhandenen Inosin produziert worden. In diesem Fall betrug die molare Umsetzungsrate 90 % oder mehr. Bei Zugabe von Guanosin anstelle von Inosin wurde bei einem ähnlichen Zeitverlauf 5'-GMP mit einer molaren Umsetzungsrate von 90 % oder mehr produziert. Tabelle 8 Zusammensetzung der Reaktionslösung Stamm Inosin Monokaliumphosphat Glucose Magnesiumsulfat Xylol Nymeen S-215 Phytinsäure Naßzellmasse/l

(10) Produktion von 5'-IMP aus Inosin unter Verwendung von Inosin-Fermentationsmedium

Nach Beendigung der Fermentation waren etwa 30 g/l Inosin in dem vorstehend in (8) erhaltenen Medium akkumuliert. Wie in Tabelle 9 gezeigt, wurden 20 ml eines Reaktionsgemisches hergestellt, das dieses Medium enthielt. In ähnlicher Weise wie in (9) wurde eine 13-stündige Reaktion durchgeführt, wobei das Gemisch unter kräftigem Rühren bei 32ºC und der pH-Wert mit 4 N NaOH bei 7,2 gehalten wurde. Während des Reaktionsverlaufs wurde wie in (9) Monokaliumphosphat zugegeben. Aus 23,5 g/l des am Anfang vorhandenen Inosins waren 46 g/l 5'-IMP produziert und akkumuliert worden. Auch in diesem Fall betrug die molare Umsetzungsrate wie in (9) 90 % oder mehr. Tabelle 9 Zusammensetzung der Reaktionslösung Inosin-Kulturnährlösung (enthaltend KY13761-Zellen) MC1000 (pIK75)-Kulturnährlösung Monokaliumphosphat Glucose Magnesiumsulfat Xylol Nymeen S-215 Phytinsäure (Den vorstehend angegebenen Bestandteilen wurde destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 ml zugesetzt)

Beispiel 2

(1) Isolierung von DNA

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (1) beschrieben wurde gereinigte chromosomale DNA gewonnen, wobei allerdings anstelle des Escherichia coli-Stamms HM70 der Escherichia coli-Stamm W3110 verwendet wurde. Die chromosomale DNA wurde in 1 mM EDTA enthaltendem 10 mM Tris-hydrochiond-Puffer suspendiert.

(2) Herstellung rekombinanter DNA

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (2) beschrieben wurde rekombinante DNA gewonnen, wobei allerdings anstelle der in Beispiel 1 (1) erhaltenen Suspension eine Suspension verwendet wurde, die 1 µg der in Beispiel 2 (1) erhaltenen chromosomalen DNA enthielt.

(3) Herstellung eines Escherichia coli-Stamms mit darin eingeführter rekombinanter DNA

Der Escherichia coli-Stamm DHI wurde in 50 ml LB-Flüssigmedium überimpft und anschließend 4 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die durch 7minütige Zentrifugation bei 3000 Upm geernteten Bakterien wurden bei 0ºC in 20 ml 50 mM Calciumchlorid-Lösung suspendiert. Man ließ die Suspension 20 Minuten bei 0ºC stehen, dann wurden die Zellen wie vorstehend beschrieben zentrifugiert und bei 0ºC in 40 ml 50 mM Calciumchlorid-Lösung suspendiert. Die Suspension wurde mit der Lösung gemischt, die die in Beispiel 2 (2) erhaltene rekombinante DNA enthielt, und das Gemisch wurde 10 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Nach 90 Sekunden Hitzebehandlung bei 42ºC wurde das Gemisch auf Platten mit LB-Agarmedium (1,5 % Agar enthaltendes LB-Flüssigmedium) ausgestrichen, das mit 50 µg/ml Ampicillin, 0,1 mM Isopropylthiogalactosid (IPTG) und 0,004 % 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid ergänzt worden war.
Eine so erhaltene weiße Kolonie wurde über Nacht bei 30ºC in 10 ml LB-Flüssigmedium gezüchtet und die Zellen wurden mittels Zentrifugation isoliert. Die isolierten Zellen wurden bei -20ºC aufbewahrt und die Aktivität ihrer Inosin-Guanosin-Kinase wurde mit Hilfe des nachstehend gezeigten Verfahrens bestimmt.

(4) Isolation von DNA, die Inosin-Guanosin-Kinase codiert

Escherichia coli-Zellen, die die in Beispiel 2 (3) gewonnene rekombinante DNA enthielten, wurden in 100 mM Tris-hydrochlond-Puffer (pH- Wert 8,0) suspendiert, der 10 mM ATP, 10 mM Inosin und 5 mM Magnesiumsulfat enthielt (die Zellkonzentration betrug 100 g Naßzellmasse/ml) Der Suspension wurde Xylol in einer Konzentration von 10 ml/l zugegeben. Nach gründlichem Rühren wurde das Gemisch eine Stunde bei 30ºC stehengelassen. Die Reaktionslösung wurde mittels HPLC untersucht und die 5'- IMP-Menge in der Reaktionslösung wurde quantitativ bestimmt. Fast alle Transformanten produzierten kein 5'-IMP, jedoch wurden 5'-IMP-produzierende Bakterien in einem Verhältnis von 1 zu 50 000 Proben erhalten. Die so erhaltenen 5'-IMP-produzierenden Bakterien waren Transformanten, die rekombinante DNA mit dem Inosin-Guanosin-Kinase-Gen enthielten.
Die erhaltenen Transformanten wurden über Nacht bei 30ºC in LB- Flüssigmedium gezüchtet und die Zellen wurden gesammelt. Danach wurde Plasmid-DNA mittels des in "Molecular Cloning" beschriebenen Verfahrens isoliert und die Nucleotidsequenz davon mittels des Didesoxy-Verfahrens bestimmt. Die Nucleotidsequenz des Strukturgen-Anteus der Inosin-Guanosin-Kinase ist in Tabelle 5 gezeigt.
Die so gewonnene rekombinante DNA, die das Inosin-Guanosin-Kinase codierende, aus dem Escherichia coli-Stamm W3110 stammende Gen enthielt, wurde als pBM1 bezeichnet. Eine Restriktionsenzymkarte von pBM1 ist in Figur 9 gezeigt.

(5) Herstellung von 5'-IMP

Die Transformante Escherichia coli HM1 (FERM BP-2669), die mit der in Beispiel 2 (4) erhaltenen rekombinanten pbml-DNA transformiert war, wurde 16 Stunden bei 30ºC in 400 ml LB-Flüssigmedium (enthaltend so µg/ml Ampicillin) gezüchtet. Das Medium wurde dann zur Zellgewinnung zentrifugiert. Zur Kontrolle wurden gezüchtete Zellen von Escherichia coli DH1/pUC19, die ausschließlich den Vektor pUC19 enthielten, in ähnlicher Weise wie vorstehend beschrieben gewonnen. Nachdem 20 ml der in Tabelle 10 beschriebenen Lösung, die die erhaltenen Zellen enthielt, eine Stunde bei 30ºC umgesetzt worden waren, wurde die in der Lösung produzierte 5'-IMP-Menge mittels HPLC quantitativ bestimmt, wobei diese Menge 5 mg betrug. Bei Verwendung von Zellen des Kontroll-Stamms, der nur den Vektor enthielt, konnte in der Lösung kein 5'-IMP nachgewiesen werden. Tabelle 10 Zusammensetzung der Reaktionslösung Zellen Inosin Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0) Magnesiumsulfat Xylol Naßzellmasse/l

(6) Herstellung von 5'-GMP

Die Transformante Escherichia coli HM1, die mit der in Beispiel 2 (4) erhaltenen rekombinanten pBM1-DNA transformiert war, wurde 16 Stunden bei 30ºC in 400 ml LB-Flüssigmedium (enthaltend 50 µg/ml Ampicillin) gezüchtet. Das Medium wurde dann zur Zellgewinnung zentrifugiert. Zur Kontrolle wurden gezüchtete Zellen von Escherichia coli DH1/pUC19, die ausschließlich den Vektor pUC19 enthielten, in ähnlicher Weise wie vorstehend beschrieben, gewonnen. Nachdem 20 ml der in Tabelle 11 beschriebenen Lösung, die die erhaltenen Zellen enthielt, eine Stunde bei 30ºC inkubiert worden waren, wurde die in der Lösung produzierte 5'-GMP-Menge mittels HPLC quantitativ bestimmt, wobei diese Menge 2 mg betrug. Bei Verwendung von Zellen des Kontroll-Stamms, der nur den Vektor enthielt, konnte in der Lösung kein 5'-GMP nachgewiesen werden. Tabelle 11 Zusammensetzung der Reaktionslösung Zellen Guanosin Tris-hydrochlond-Puffer (pH 8,0) Magnesiumsulfat Xylol Naßzellmasse/l

(7) Erhöhung der Aktivität mittels gentechnischer Verfahren

Durch Ligierung einer SD-Sequenz und der Sequenz eines starken Promotors stromaufwärts vom Strukturgen der Inosin-Guanosin-Kinase mit Hilfe gentechnischer Verfahren konnte die Expression der Inosin-Guanosin-Kinase erhöht werden. Das Verfahren zur Aktivitätserhöhung wurde wie folgt durchgeführt.
1 µg des in Beispiel 2 (4) erhaltenen Plasmids pbml wurde mit 10 Einheiten BamHI, 10 Einheiten SacI und 10 Einheiten ScaI in 20 µl Lösung vollständig gespalten. Danach wurde ein 2,8 kb großes Fragment, das das Strukturgen der Inosin-Guanosin-Kinase enthielt, mittels Agarose-Gel- elektrophorese isoliert und gereinigt (nach dem in "Molecular Cloning" beschriebenen Verfahren). Nach 10-minütiger Spaltung des gereinigten Fragments mit BAL31-Nuclease bei 37ºC wurden eine Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation durchgeführt, wobei ein DNA-Fragment mit einer endständigen Deletion erhalten wurde. In einem getrennten Ansatz wurde 1 µg Vektor pUC19 in 20 µl Lösung durch Zugabe von 10 Einheiten SmaI vollständig gespalten. Danach wurden 2 µl 1M Tris-hydrochlorid-Puffer (pH- Wert 8,0) und weiterhin 5 Einheiten alkalische Phophatase zugegeben und anschließend eine einstündige Reaktion bei 65ºC durchgeführt. Das gereinigte DNA-Fragment (100 ng), das das Inosin-Guanosin-Kinase-Gen enthielt, und 20 ng der mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor- DNA wurden in einer Lösung suspendiert, die 66 mM Tris-hydrochlond-Puffer (pH 7,6), 66 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,1 mM ATP enthielt. Der Suspension wurden 10 Einheiten T4-Ligase zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei 14ºC zur Ligierung beider DNAS umgesetzt, wodurch eine rekombinante DNA erhalten wurde. Die rekombinante DNA wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 2 (3) beschrieben in den Escherichia coli-Stamm DH1 eingeführt. Die erhaltenen Transformanten wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 2 (3) beschrieben gezüchtet. Die Inosin-Guanosin- Kinase-Aktivität wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 2 (4) beschrieben bestimmt. Ein Stamm mit einer hohen 5'-IMP-Produktion wurde ausgewählt. Der Stamm wurde als Escherichia coli-Stamm BM100 bezeichnet. In dem im Escherichia coli-Stamm BM100 enthaltenen rekombinanten Plasmid war die Sequenz des Lactose-Promotors stromaufwärts vom Strukturgen der 4-Inosin-Guanosin-Kinase in richtiger Orientierung ligiert.

(8) Herstellung von 5'-IMP

Der Escherichia coli-Stamm BM100 wurde in 400 ml LB-Flüssigmedium (enthaltend 50 µg/ml Ampicillin) 16 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Dann wurden die Zellen abzentrifugiert. 20 ml der in Tabelle 12 beschriebenen Lösung, die die erhaltenen Zellen sowie einen Stamm mit der Fähigkeit zur ATP-Neubildung enthielt (ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung 74595/86), wurden 20 Stunden bei 30ºC und einem pH-Wert von 7,6 inkubiert. Danach wurde die in der Lösung produzierte 5'-IMP- Menge quantitativ bestimmt, wobei es sich herausstellte, daß diese Menge 25 g/l betrug (berechnet als Hydrat). Ein ähnlicher Titer konnte auch im Fall der Verwendung eines Stamms erhalten werden, der eine rekombinante DNA enthielt, die ein DNA-Molekül umfaßte, bei dem ein Teil des Strukturgens, d.h. der die Aminosäuresequenz codierenden DNA-Sequenz, im Anschluß an den 8. Leu-Rest vom C-Terminus modifiziert worden war, wobei die folgende Aminosäuresequenz codiert wurde:
Gly-Met -Gln-Ala-Gly-Thr-Glu-Leu-Glu- Phe-Thr-Gly-Arg-Arg- Phe-Thr-Thr-Ser. Tabelle 12 Zusammensetzung der Reaktionslösung Brevibacterium ammoniagenes ATCC21477-Zellen (Zellen, die ATP neu bilden) Escherichia coli mit erhöhter Aktivität der Inosin-Guanosin-Kinase Inosin Monokaliumphosphat Glucose Magnesiumsulfat Xylol Naßzellmasse/ml

Industrielle Anwendbarkeit

Erfindungsgemäß wird eine Inosin-Guanosin-Kinase bereitgestellt, die von einem zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismus stammt. Die Aufklärung verschiedener Eigenschaften des Enzyms hat außerdem erstmais zu seiner industriellen Verwendung geführt. Überdies ist eine das Enzym codierende DNA isoliert worden. Wenn ein Mikroorganismus, der eine 4 durch Einführung dieser DNA in einen Vektor erhaltene rekombinante DNA enthält, als Katalysator verwendet wird, können 5'-Nucleotide, z.B. 5'- IMP oder 5'-GMP, mit hoher Umsetzungsrate aus Nudeosiden, z.B. Inosin oder Guanosin, produziert werden.

Claims

1. Gereinigte Inosin-Guanosin-Kinase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(1) Wirkung

Das Enzym katalysiert die Bildung von Adenosindiphosphat (ADP) und 5'-Inosinsäure (5'-IMP) aus Adenosintriphosphat (ATP) und Inosin, die Bildung von Desoxyadenosindiphosphat (ATP) und 5'-IMP aus Desoxyadenosintriphosphat (ATP) und Inosin, die Bildung von ADP und 5'-Guanylsäure (5'-GMP) aus ATP und Guanosin und die Bildung von DADP und 5'-GMP aus ATP und Guanosin,

(2) pH-Optimum

6,9 - 8,2,

(3) pH-Stabilität

das Enzym ist stabil in einem pH-Bereich von 6,6 bis 9,0 bei einer 16stündigen Behandlung bei 4ºC, die Zugabe von KCl verbessert die Stabilität während der Lagerung,

(4) Temperaturoptimum

25-40ºC,

(5) Temperaturstabilität

stabil bis zu 40ºC bei einer 15minütigen Behandlung bei pH 8,0,

(6) Substratspezifität

Phosphorsäure an der γ-Position von ATP oder dATP als Phosphatdonor wird auf Inosin oder Guanosin als Phosphatakzeptoren übertragen,

(7) Inhibitoren

Metallionen von Co²&spplus;, Cu²&spplus; und Zn²&spplus;,

(8) Aktivierung

das Enzym erfordert eine der beiden Ionengruppen: die eine ist K&spplus; und Mg²&spplus; und die andere ist K&spplus; und Mn²&spplus;,

(9) Km-Wert

Der Km-Wert in der Reaktionslösung, die zusammengesetzt ist aus 2 mM ATP, 10 mM MgSO&sub4;, 300 mM KCl und 0,1 M HEPES-Puffer (pH 7,2) beträgt 2,1 mM für Inosin und 6,1 µM für Guanosin,

(10) Molekulargewicht

das Molekulargewicht, das von der Aminosäuresequenz abgeleitet ist, beträgt etwa 48 400 Daltons, eine Messung durch SDS-Polyacrylamidelektrophorese ergibt ein Molekulargewicht von etwa 43 000 Daltons.

2. Gereinigte Inosin-Guanosin-Kinase mit der folgenden Aminosäuresequenz:

3. Gen, das eine Inosin-Guanosin-Kinase mit der Aminosäuresequenz gemäß der Definition in Anspruch 2 codiert.

4. Gen nach Anspruch 3, wobei das Gen die folgende Nucleotidsequenz aufweist:

5. Gen nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Gen von Eschenchia coli stammt.

6. Rekombinante DNA, erhalten durch Insertion eines ein Gen gemäß der Definition in einem der Ansprüche 3 bis 5 enthaltenden DNA-Fragments in einen Vektor.

7. Mikroorganismus, der eine rekombinante DNA gemäß der Definition in Anspruch 6 trägt.

8. Mikroorganismus nach Anspruch 7, wobei der Mikroorganismus Escherichia coli ist.

9. Verfahren zur Herstellung einer Inosin-Guanosin-Kinase, umfassend die Züchtung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört und eine rekombinante DNA gemäß der Definition in Anspruch 6 trägt, in einem Medium zur Erzeugung und Anreicherung der Inosin-Guanosin-Kinase in den gezüchteten Zellen und die Gewinnung der Inosin-Guanosin-Kinase aus der Kultur.

10. Verfahren zur Herstellung von 5'-IMP oder 5'-GMP, umfassend die Umsetzung von Inosin oder Guanosin mit einem Phosphatdonor in einem wäßrigen Medium in Gegenwart einer Enzymquelle, die (1) eine gereinigte Inosin-Guanosin-Kinase gemäß der Definition in Anspruch 1 oder 2 oder (2) eine Zelle, eine Kulturbrühe oder ein nach Behandlung der Mikroorganismen gemäß der Definition in Anspruch 7 erhaltenes Produkt ist, zur Erzeugung und An reicherung von 5'-IMP oder 5'-GMP im Reaktionsgemisch und Gewinnung von 5'-IMP oder 5'-GMP aus dem Reaktionsgemisch.

11. Verfahren zur Herstellung von 5'-IMP oder 5'-GMP nach Anspruch 10, wobei der Phosphatdonor ATP oder dATP ist.

12. Verfahren zur Herstellung von 5'-IMP oder 5'-GMP nach Anspruch 10, wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia ist.