DE69023642T2

DE69023642T2 - Bestimmung der die genregelung und/oder genreplikation betreffenden faktoren.

Info

Publication number: DE69023642T2
Application number: DE69023642T
Authority: DE
Inventors: Matti Karp; Matti Korpela
Original assignee: Bio Orbit Oy
Current assignee: Bio Orbit Oy
Priority date: 1989-04-20
Filing date: 1990-04-20
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2010-04-21
Also published as: FI891899A0; EP0469021B1; ES2081981T3; FI88309C; WO1990012887A1; FI891899A; DE69023642D1; US6475719B1; EP0469021A1; FI88309B

Description

Biotests sind Verfahren, bei denen lebende Zellen oder Organismen als Werkzeuge zum Nachweis verschiedener zu analysierender Substanzen verwendet werden. Viele dieser Verfahren verwenden bakterielle oder Hefezellen.
Prokariotische Organismen und insbesondere das Escherichia coli Bakterium ist sehr gut untersucht. Hefezellen sind eukariotisch und wachsen ohnehin als Einzelzellen. Die Kultivierung von Hefezellen ist einfacher als die Kultivierung höherer Eukaryonten. Hefezellen wachsen in einfachen Kulturmedien, und sie benötigen nicht die Zugabe komplizierter Wachstumsfaktoren. Die Kenntnisse über Hefe nehmen rasch zu und umfassende Genkarten sind bekannt. Hunderte von spezifischen Mutationen sowohl für Bakterien als auch für Hefe sind bekannt, durch die es möglich wird, die Aktivität von spezifischen Reaktionen und metabolischen Stoffwechselgängen zu untersuchen. Im Falle von Bakterienmutanten, die zum Beispiel gegenüber Antibiotika empfindlich sind, verursachen sogar Spuren von Antibiotika Veränderungen im Metabolismus oder in den Membranen. Bei Verwendung solcher Mutanten ist es möglich, Tests zu entwickeln, die Restmengen von Antibiotika in biologischem Material sehr empfindlich messen können. Mutanten, deren Zellmembranen für verschiedene Substanzen mit geringem molekularem Gewicht, wie z. B. Antibiotika, porös sein können. Sowohl Bakterien- als auch Hefemutationen, bei denen die Reparaturmechanismen ihres genetischen Materials, der DNA, nicht so gut arbeiten wie bei den Wildtyp-Stämmen, sind empfindlich gegenüber genotoxischen Substanzen. Bei Verwendung verschiedener Mutantenstämme ist man in der Lage den Nachweis von Antibiotika und toxischen oder mutagenen Agenzien zu führen.
Es ist ziemlich einfach, neue Eigenschaften, Proteine, durch gentechnische Methoden in die Bakterien- oder Hefezellen zu übertragen. Diese Proteine, für die Viren codieren, eukariotische oder prokariotische Zellen-DNA, existieren im natürlichen Zustand nicht im Zielorganismus der Genübertragung. Dieses Phänomen erweitert die Anwendbarkeit dieser Organismen in Biotests. Das Verhältnis zwischen Karzinogenität und Mutagenität ist die Basis für die Verwendung von mutagenen Substanzentests als Vorsondierungstest (prescreening) für karzinogene Agenzien. Das Überprüfen der Karzinogenität unter Verwendung von Versuchstieren ist extrem teuer und zeitaufwendig. Das Testen auf mutagene Substanzen als Schnell-Screening auf Karzinogenität hat große Hoffnungen und viel Interesse geweckt. Indem man schnelle mikrobielle Tests verwendet, kann man Karzinoginitätstests auf der Basis von Versuchstieren verringern. Die Basis dafür ist der universelle genetische Code der DNA, dessen Struktur und Aktionsmodus in jedem Organismus annähernd gleich ist.
Der am häufigsten benutzte Test für mutagene Substanzen ist der AMES-Test (Ames, B.N., McCann, J and Yamasaki, E. (1975) Mutat. Rs. 31, 347), der das Salmonella typhimurium- Bakterium als Testorganismus verwendet. Mit diesem Test ist es möglich, die Genotoxizität der meisten Mykotoxine, aromatischen Amine und polyzyklischen Kohlenwasserstoffe nachzuweisen. Der Ames-Test ist jedoch nicht in der Lage, die Genotoxizität von karzinogenen Metallsalzen oder chlorierten Kohlenwasserstoffen nachzuweisen. Im Test enthalten die verwendeten S. typhimurium-Stämme Punktmutationen, die die Biosynthesemechanismen der Aminosäure Histidin betreffen. Wenn die Bakterien der Wirkung einer mutagenen Substanz ausgesetzt sind, kommt es zu einer Rückverwandlung im Gen für die Histidin-Biosynthese und das Bakterium beginnt Histidin endogen zu produzieren, wodurch die Zelle die Fähigkeit erhält, in einem Minimalmedium zu wachsen, das kein zugesetztes Histidin enthält. Ein Nachteil bei diesem Test ist die geringe Empfindlichkeit und der langsame Ablauf. In diesem Test bleiben alle anderen genotoxischen Veränderungen unbemerkt, wie z. B. solche, die auf Enzyme wirken. Der Test ist außerdem für jede einzelne zu testende chemische Verbindung recht kostspielig.
Es wurde ein Test zum Nachweis von genotoxischen Substanzen auf Bioluminiszenz-Basis entwickelt (Ulizur, S., Weiser, I. und Yannai, S. (1980), Mut. Res., 74, 113-121). Bei diesem Verfahren werden dunkle Mutanten von Photobacterium leiognathi und P. fischeri verwendet. In Gegenwart von genotoxischen Substanzen beginnen diese Stämme Licht auszusenden. Der theoretische Hintergrund dieses Verfahrens liegt noch etwas im Dunkeln. Es wird angenommen, daß die Wirkung der Beseitigung eines Repressors oder die Verhinderung seiner Ausbildung, kombiniert mit einer Änderung der chromosomalen DNA des Bakteriums, die Bildung der Licht produzierenden Proteine auslöst. Verschiedene genotoxische Substanzen wirken in diesem Test in unterschiedlichen Mengen aufgrund der Mannigfaltigkeit der verschiedenen Substanzklassen zusammen. Dieser Test ist schneller als der Ames-Test, ist dabei aber auf keinen Fall einfacher zu handhaben. Die im Test verwendeten Bakterien sollten in Abhängigkeit von der verwendeten Substanz Licht für lange und unterschiedliche Zeitperioden (30 Min. bis 10 h) aussenden. Die verwendeten Bakterien sind nicht in der Lage, eine stabile Lichtemission aufzubauen, wodurch das Verfahren etwas problematisch wird. Aus diesen Gründen kann das Verfahren nicht einfach automatisiert werden, damit es zur routinemäßigen Anwendung kommt, wenn große Mengen von Proben analysiert werden sollen. Ferner ist die Kultivierungstemperatur aufgrund des marinen Ursprungs des Bakteriums recht niedrig, 15ºC - es ist nicht bekannt, wie sehr die Wirkung von genotoxischen Substanzen in Wechselbeziehung zu den Wirkungen auf den Menschen steht, dessen Körpertemperatur bei 37ºC liegt.
Antibiotika, die als Medikamente gegen mikrobielle Eindringlinge Verwendung finden, werden in den Körperflüssigkeiten untersucht, um die Dosierung und den Eindringungsgrad der Medikamente zu studieren. Der effektive therapeutische Bereich des Antibiotikums ist oft relativ eng und die Risiken einer Überdosierung können groß sein. Es ist auch wichtig, das Vorhandensein/die Konzentration von Antibiotika in Fleisch oder Kuhmilch aufgrund von Symptomen bei Allergikern zu messen. Die Kuhmilch in der Käseproduktion sollte keine Antibiotika enthalten, da die Bakterien, die den Käse produzieren, nicht in der Lage sind, kontaminierte Milch zu verarbeiten. Die üblichen Verfahren zum Nachweis von antimikrobieller Medikamente sind mikrobiologische Verfahren, die auf Agar durchgeführt werden. Ein direktes Verfahren besteht in der Messung der Wachstumshemmung von empfindlichen Bakterienstämmen. Man kann auch verschiedene Stoffwechselparameter messen, wie z. B. Säureproduktion eines empfindlichen Bakterienstammes unter Verwendung von entsprechenden Farbindikatoren.
Typische Beispiele sind Einfachdiffusion, Doppeldiffusion oder Plattendiffusionstests (Zylinder-, Loch-, oder Scheibchentest), um Agardiffusionstests durchzuführen. Der Unterschied zwischen diesen Testverfahren ist darauf beschränkt, wie die Probe auf dem Agar appliziert wird und wie die Bakterien im Test verwendet werden.
Seit es mikrobiologische Verfahren gibt, die Bakterien oder deren Sporen verwenden, kommt der Empfindlichkeit der Testbakterien die größte Bedeutung zu.
Bisher mußte man Kompromisse in der Wahl eines geeigneten Teststammes machen, da eine große Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Agenzien und andere Merkmale, die der Teststamm aufweisen sollte, keine üblichen Eigenschaften eines einzelnen Bakterienstammes waren.
Ein Hauptnachteil bei der Verwendung von Mikroben in Verfahren zum Nachweis von Antibiotikarückständen, besteht darin, daß sie langsam und unempfindlich reagieren. Bei diesen Verfahren muß man immer auf die ein oder andere Weise das Wachstum eines Teststammes kontrollieren, und man kann sich nicht vorstellen, den Test innerhalb einer Stunde durchzuführen. Dies liegt in der Tatsache begründet, daß_das Mikrobenwachstum langsam vor sich geht, selbst auf die schnellste Art. Auch werden oft Sporen oder gefriergetrocknete Mikroben verwendet, wodurch der Test noch langsamer abläuft.
Es wurden Nachweisverfahren für Antibiotika entwickelt, die auf Bioluminiszenzmessung basieren. Ulizur (1986, Methods Enzymol., 133, 275-284) beschreibt drei verschiedene Arten, Bioluminiszenz zum Nachweis von antimikrobiellen Substanzen zu verwenden: a) Lyse-Test, b) Induktionstest und c) Bakteriophagentest.
Im ersten produzieren die aus Vibrio fischeri isolierten lux-Gene Luciferaseprotein (Leuchtenzymprotein), das in der Gegenwart von Substraten Licht erzeugt. Die Gene werden in ein Plasmid eingebaut, welches in Bacillus subtilis übertragen wird, das gegenüber bakterielle Membranen beeinträchtigende Antibiotika, wie z. B. Penicilline und Cephalosporine, empfindlich ist. Im Test wird das die lux-Gene enthaltene B. subtilis zusammen mit einer Probe vermehrt. Bei Vorhandensein eines Antibiotikums wird die Synthese der Zellwandbestandteile verhindert und die Bakterien werden aufgelöst, so daß es zu einem geringeren Lichtemissionsgrad kommt im Vergleich zu einem Vergleichstest.
Im Induktionstest benutzt man nicht-leuchtende Mutanten der P. phosphoreum Bakterien, die kein Licht erzeugen. Dieser, wie auch andere von Ulizur entwickelte Bioluminiszenztests, basiert auf der Ausnutzung der chromosomalen DNA der Zielzelle. Beim Induktionstest ist man in der Lage Antibiotika nachzuweisen, die die Proteinsynthese beeinträchtigen. Wenn die Bakterien zusammen mit Verbindungen inkubiert werden, die an DNA binden, beginnen sie Licht auszusenden, d.h. die Proteinsynthese wird in Gang gesetzt. Bei Vorhandensein von jeglichem Antibiotikum, das die Proteinsynthese beeinträchtigt, kommt es zu einer Verringerung der Lichtemission. Die vorhandene Menge an Antibiotikum wird durch Vergleich mit einem Vergleichstest ohne Antibiotikum quantitativ bestimmt. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist man nicht in der Lage, Antibiotika nachzuweisen, die die DNA-Synthese beeinträchtigen. Auch ist die tatsächliche Leistungsfähigkeit dieses Verfahrens aufgrund der Tatsache fraglich, daß man die Grundlage dieses Verfahrens nicht gut kennt. Um den Test durchzuführen, ist es wesentlich, Salze (z. B. Ca²&spplus;- und Mg²&spplus;-Ionen) in minimalen Mengen hinzuzufügen, von denen bekannt ist, daß sie die Wirkung von Aminoglykosiden (Streptomycin, Kanamycin, Neomycin, Erythromycin) verringern oder vollständig verhindern. Die Induktionsparameter sind ebenfalls sehr eng gefaßt, und wenn Proben andere Antibiotika enthalten (z. B. Nalidixinsäure) oder andere Substanzen, die die Lichterzeugung anregen, kann dies zu Problemen bei der Bewertung der Resultate führen. Das Problem bei diesem Test könnte in der großen Anzahl von Induktionssubstanzen liegen. Auch die Bakterienmenge im Test wird als kritischer Parameter angesehen. Ist die Bakterienkonzentration zu hoch, so muß der Test aufgrund der absoluten Notwendigkeit der Anwesenheit von Sauerstoff für die Luminiszenzreaktion in diesen Bakterien belüftet werden. Es kommt zu Problemen bei Verwendung von Spezialmeßgeräten und die Wiederholbarkeit des Tests (Assays) wird durch diese Tatsachen beeinträchtigt.
Mit Hilfe des Bakteriophagentests ist es möglich, Antibiotika aufzuspüren, die die DNA-Synthese, Transkription und Translation beeinträchtigen. Licht aussendende P. phosphoreum Bakterien vom Wildtyp werden in diesem Test mit lytischen Bakteriophagen infiziert. In Gegenwart von Antibiotikum können keine neuen infektiösen Phagen synthetisiert werden, weil die DNA-, RNA- oder Proteinsynthese blockiert ist. In Gegenwart von Antibiotikum bleibt die Lichtemission im Vergleich zum Anfangsleuchtgrad unverändert. Wenn jedoch kein Antibiotikum vorhanden ist, vermehren sich die Phagen schnell und inaktivieren die Wirtsbakterien, so daß sie kein Licht mehr erzeugen können. Die Durchführung des Bakteriophagentests ist schwierig, da es notwendig ist, der Testmischung Phagen zuzusetzen (manchmal mit unterschiedlichen Titern) und die Wahl des richtigen Zeitpunkts für die Zugabe von Antibiotikum muß sehr genau berechnet werden. Bei diesem Testverfahren kommt es zu den gleichen Problemen, wie beim Induktionstest im Hinblick auf die Zusammensetzung der Testmischung und der im Test verwendeten Bakterienmenge.
Bislang ist man nicht in der Lage gewesen, eine einzelne antimikrobielle Chemikalie oder Gruppen von ihnen mit Hilfe der bis heute verwendeten mikrobiellen Verfahren für Antibiotika zu bestimmen. Statt dessen weisen diese Verfahren alle Antibiotika nach, gegenüber denen die Testmikrobe empfindlich ist. Durch Veränderung der Meßbedingungen oder durch Zugabe von Enzymen, die bestimmte Verbindungen abbauen, läßt sich die Wirkung von einigen Antibiotika blockieren. Es besteht eine große Nachfrage nach Nachweisverfahren für Schwermetalle, Gifte oder Lebensmittelzusätze, die einfach und schnell sind. Zur Zeit wird der Nachweis solcher Verbindungen gesammelt in zentralen Labors durchgeführt, da die Geräte zu ihrer Bestimmung extrem teuer sind und von spezialisiertem Personal bedient werden müssen. Schnelle qualitative Tests, die vor Ort durchgeführt werden, könnten als nicht zu unterschätzender Filter für solche Proben dienen, die aufwendigere Gerätschaften und Forschung erfordern. Auf diese Weise würde der Druck auf die Zentrallabors verringert und die Bestimmung von problematischen Proben könnte beschleunigt werden.
Ein kommerzieller "Microtox"-Test ist in der Lage, giftige Substanzen in Umweltproben nachzuweisen. Dieser Test basiert auf der Verwendung der Licht emittierenden P. phosphoreum Bakterien. Die zu analysierende Probe wird zusammen mit den Bakterien inkubiert und das Vorhandensein der toxischen Substanz wird nach der verringerten Lichtmenge berechnet, die von den Bakterien im Vergleich zu einem Kontrolltest erzeugt wird . Ein schwerwiegender Nachteil bei diesem Test ist die Notwendigkeit einer hohen Salzhaltigkeit (2 %) des Organismus, die, so wurde gezeigt, die biologischen Wirkungen insbesondere von Schwermetallen vermindert. Auch die Meßtemperatur von 15ºC verursacht Probleme. Es wurden auch Testverfahren entwickelt, die ganze Tiere oder Tierzellenlinien verwenden, um toxische Substanzen zu messen, doch der Nachteil bei diesen Verfahren besteht in der komplizierten Kultivierung der Zellen, einem langsamen Ablauf des Verfahrens und der Notwendigkeit von Fachpersonal.
Giftige und mutagene Substanzen sollte man z. B. in verschiedenen Wasserarten nachweisen können, wie Abwasser, Brauch-, Roh- und Grundwasser und Wasser für Erfrischungszwecke. Auch Wasser, das für industrielle Prozesse oder die Verarbeitung von Lebensmitteln benötigt wird sowie Rohwasser für die pharmazeutische Industrie sind von Interesse. Proben von Bodensedimenten und Luft sollte man auf ihre Toxizität und Mutagenität untersuchen können. Die in der Lebensmittelindustrie verwendeten Rohstoffe sowie die Qualitätssicherung von Lebensmittel sind auch ein wichtiger Bereich. Von bestimmten Wassersorten sollte es möglich sein, die organischen Substanzen aufzuspüren, welche z. B. von Mikroben, die das Wasser kontaminieren, für die Atmung oder für biosynthetische Zwecke verwendet werden könnten. Die organischen Substanzen können einfache Zucker, organische Säuren, Peptide oder Proteine, Verbindungen, die Amino- oder Phosphatgruppen enthalten und die mit einer Kohlenstoffkette verbunden sind, usw. Es gibt einen Bedarf an schnellen, kostengünstigen Tests für diese Art von Verbindungen, da die konventionellen Verfahren mehrere Tage bis zur Fertigstellung in Anspruch nehmen, um in der Lage zu sein, die Qualität von Wasser für verschiedene Zwecke zu bewerten.
Die hier beschriebene Erfindung beruht auf bekannten und akzeptierten Prinzipien im Hinblick auf die Genexpression und die Faktoren, die ihre Regulation beeinträchtigen und auf der Verwendung dieser Phänomene in Organismen mit rekombinanter DNA wie z. B. Bakterien und Hefe.
So ist auch ein Verfahren zur Veränderung der Kopienzahl eines Plasmids in einer Zelle aus dem Stand der Technik bekannt. In Proc. Natl Acad. Sci., Vol 78, No. 8, August 1981, H. Danbara et al.: Regulation of DNA replication: "Target" determinant of the replication control elements of plasmid R6-5 lies within a control element gene" (Regulation der DNA-Replikation: Die "Ziel"-Determinante der Kontrollelemente der Replikation von Plasmid R6-5 liegt innerhalb eines Kontrollelementgens), Seiten 4699 bis 4703, werden Plasmidmutanten mit hoher Kopienzahl zur quantitativen Analyse der Inkompatibilität verwendet, die durch diese Mutanten exprimiert wird, um Informationen über die veränderten Plasmid-Kontrollmechanismen zu erhalten. Die Entgegenhaltung beschreibt Wechselwirkungen von definierten Faktoren im Innern der Zelle, wo die genannten Faktoren an der Replikationen des Plasmids beteiligt sind. Die Titration des Replikationsinhibitors und die in der Entgegenhaltung beschriebene entwickelte in-vivo-Bestimmung werden nur zum Nachweis bestimmter natürlicher Inhibitoren verwendet, die bereits in der Zelle existieren. Die Entgegenhaltung offenbart ein neues Verfahren zur Untersuchung eines Gegenstandes, der sich auf reine Grundlagenforschung bezieht, d.h. die Replikation und Faktoren zu ihrer Kontrolle.
Nature, Vol 322, August 1986, Mark Ptashne: Genregulation durch Proteine, die aus der Nähe und aus einer Entfernung wirken", Seiten 697-701, bezieht sich auf einen Presseartikel, der die Replikationsprozesse detailliert beschreibt.
EP-A-0 281 104 beschreibt einen Plasmidvektor mit einem trp- Promotor, der als Vektor zur Herstellung von L-Tryptophan verwendet wird.
EP-A-0 121 386 beschreibt induzierbare Plasmide, die zur Herstellung von gewünschten Proteinen bestimmt sind.
Keine der zitierten Stand der Technik-Schriften offenbart jedoch irgend etwas über ein allgemeines analytisches Testverfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung eines unspezifischen exogenen Faktors, der die Replikationsvorgänge beeinträchtigt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung eines Faktors in einer zu untersuchenden Probe bereit, wobei der Faktor die DNA, RNA und/oder Zellproteine oder deren Synthesemechanismen direkt oder indirekt beeinträchtigen kann, gekennzeichnet durch
a) Inkubation einer zu untersuchenden Probe mit einer Population aus transformierten Zellen für eine Dauer, die für den genannten Faktor, wenn er in der Probe vorhanden ist, ausreicht, um die genannten Zellen zu beeinträchtigen, wobei die genannten Zellen durch ein rekombinantes DNA-Plasmid transformiert werden und die Replikation des genannten Plasmids einem regulierbaren Promotor unterworfen ist, der durch einen exogenen Reiz unabhängig von der Replikation der Zellen induziert werden kann;
b) nachfolgendes Einwirken des genannten exogenen Reizes auf die Zellen, um die Replikation des genannten Plasmids zu induzieren, worauf die Kopienzahl des Plasmids in der Zelle anzusteigen beginnt, sofern der Faktor das Plasmid nicht durch Hemmung der Replikation beeinträchtigt hat ; und
c) direkte oder indirekte Bestimmung der Veränderung der Kopienzahl des rekombinanten DNA-Plasmids in der Zelle und Vergleich mit einem Vergleichstest, bei dem der Faktor nicht vorhanden oder bei dem er in bekannter Menge vorhanden war, wodurch der Nachweis des Faktors erbracht oder die Menge des Faktors bestimmt wird.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung eines Faktors in einer zu untersuchenden Probe bereit, wobei der Faktor direkt oder indirekt die DNA, RNA und/oder Proteine der Zelle oder deren Synthesemechanismen beeinträchtigt, gekennzeichnet durch
a) Inkubation einer zu untersuchenden Probe mit einer Population transformierter Zellen für eine Dauer, die für den genannten Faktor, wenn er in der Probe vorhanden ist, ausreicht, um die genannten Zellen zu beeinträchtigen, wobei die genannten Zellen durch ein rekombinantes DNA-Plasmid mit hoher Kopienzahl transformiert werden, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Markerprotein oder für einen Teil davon codiert, der für die biologische Aktivität des Proteins unentbehrlich ist, wobei diese Sequenz mit einem regulierbaren Promotor gekoppelt ist, so daß die Expression des genannten Markerproteins durch einen exogenen Reiz induzierbar ist;
b) nachfolgende Einwirkung des genannten exogenen Reizes auf die genannte Zellpopulation, um die Expression des genannten Markerproteins zu induzieren, wobei die Menge des Markerproteins in der Zelle anwächst, wenn der Faktor die Proteinsynthese nicht direkt oder indirekt beeinflußt hat;
c) Bestimmung des von der genannten Zellpopulation exprimierten Markerproteins und Vergleich mit einem Vergleichstest, bei dem der Faktor nicht vorhanden oder bei dem er in bekannter Menge vorhanden war, wodurch der Nachweis des Faktors erbracht oder die Menge des Faktors bestimmt wird.
Die Gentechnologie hat es möglich gemacht, Bakterien und Hefezellen als Wirtszellen zu verwenden, um sogar solche Proteine zu erzeugen, die diese Organismen im natürlichen Zustand nicht produzieren. Für diese Zwecke sind mehrere Arten von Vektoren mit rekombinanter DNA präpariert worden; in den meisten Fällen handelt es sich um extrachromosomale Plasmide. Rekombinante DNA-Plasmide können mehrere Gene enthalten, und sie können sich unabhängig vermehren. Die Technik, die rekombinante DNA verwendet, ist das am häufigsten benutzte Verfahren, um Fremdgene in neue Wirtszellen zu übertragen. Das betreffende Gen kann in einen Plasmidvektor eingebaut werden, indem das Gen und die Plasmid-DNA zuerst mit spezifischen Restriktionsendonukleasen gespalten werden und nachfolgend durch die Wirkung des Enzyms DNA-Ligase kovalente Bindungen zwischen dem Gen und dem Vektor entstehen. Die Übertragung eines hybriden DNA- Plasmids in eine mikrobielle Zelle kann durch ein Transformationsverfahren durchgeführt werden, bei dem die Zellwand des Ziel- Organismus für die DNA durchlässig gemacht wird. Es gibt verschiedene Verfahren. Bei der Arbeit mit eukariotischen Zellen verwendet man rekombinante DNA-Plasmide, die DNA-Teile aus prokariotischen, eukariotischen und Viruszellen in geeigneten Kombinationen enthalten. Die Übertragung von DNA in eukariotische Zellen wird z. B. durch Ca-Fällungs- oder Elektroporationsverfahren durchgeführt.
In den letzten Jahren wurden viele rekombinante DNA-Plasmide entwickelt, bei denen die Produktion von Fremdprotein unter die Kontrolle starker Promotoren gestellt wurde. Dabei war das Ziel in allen Fällen, die Fremdproteinproduktion in einem neuen Organismus, wie z. B. dem E. coli, zu maximieren. In diesen Fällen kann die Produktion von Fremdprotein bis zu 25 % des gesamten Zellproteins betragen (Caulcott & Rhodes, 1986, Trends in Biotech., Juni, 142- 146). Wenn solch großen Proteinmengen produziert werden, ist es einsichtig, daß diese Produktion für die Wirtszelle und ihren Stoffwechsel schädlich ist. Aufgrund der schädlichen Auswirkungen wurden mehrere Plasmide entwickelt, bei denen die Produktion des Fremdproteins unter die Kontrolle von regulierbaren Promotoren gestellt wurde. Hier kann die Proteinproduktion in einer optimalen Wachstumsphase der Mikrobe in Gang gesetzt werden. In diesen Fällen wird die Züchtung der Mikrobe unter streßfreien Bedingungen durchgeführt, bis durch das Wachstum die für eine maximale Proteinproduktion geeignete Zelldichte erreicht ist. Die Proteinproduktion wird dann durch Zugabe einer chemischen Substanz zum Kulturmedium eingeschaltet, wodurch die Produktion in Gang gesetzt wird. Auch eine Änderung der physikalischen Parameter, wie z. B. die Erhöhung oder Verringerung der Kultivierungstemperatur können in bestimmten Fällen die Proteinproduktion einleiten. Figur 6 zeigt ein pCSS108-Plasmid (Korpela & Karp, Biotechnol. Lett., 10(6), 1988, 382-388), bei dem die Produktion von bakterieller Luciferase durch die Zugabe des chemischen Bindungsstoffes Isopropyl-β-D- thiogalactosid (IPTG) in einem klonierten E. coli-Bakterium eingeschaltet wird.
Die üblicherweise verwendeten Plasmide verfügen über einen oder mehrere Resistenzfaktoren, mit deren Hilfe es möglich ist, nur die Zellen, die das Plasmid enthalten, aus einer großen Zellpopulation zu selektieren. Der Resistenzfaktor hilft der Zelle unter Bedingungen zu überleben, die für andere Zellen giftig ist. Der selektierende Faktor wird dem Kulturmedium zugesetzt, um das Zellwachstum anderer Zellen zu verhindern, die nicht das Plasmid enthalten. Die Resistenzdeterminante ist ein Gen, das für ein Protein codiert, das den im Kulturmedium vorhandenen Giftfaktor (welches z. B. ein Antibiotikum sein kann) abbaut oder anderweitig inaktiviert macht. Es sind mehrere für Resistenzfaktoren codierende Gene bekannt, wobei das am häufigsten verwendete das Gen ist, welches für β- Lactamase codiert, die in der Lage ist, Penicilline oder β-Lactame, ihre Derivate, abzubauen. Als Ergebnis verliert Penicillin seinen toxischen Eigenschaften und die Bakterien können wachsen. Andere üblicherweise benutzte Resistenzgene sind solche, die für Chloramphenicol Acetyl-Transferase, Kanamycin Acetyl-Transferase und Tetrahydrofolat-Reductase. Abhängig vom Zelltyp verwendet man auch Gene, die der Zelle die Fähigkeit verleihen, in Gegenwart von Tetracyclin, Erythromycin, Spectinomycin, Streptomycin, Sulfonamiden, Neomycin, Thiostrepton, Viomycin und Colicine zu wachsen. Es sind auch einige Resistenzfaktoren bekannt, die das im Medium vorhandene Schwermetall eliminieren oder verändern. Der Selektionsdruck zugunsten von Zellen, die ein Plasmid enthalten, kann auch durch die Übertragung eines Gens erreicht werden, das für eine Funktion codiert, die einen Wachstumsdefekt komplementiert und die dem Chromosom des Organismus fehlt. Diese Genarten sind normalerweise die, die für Faktoren codieren, die bei den Vorgängen zur Aminosäurebiosynthese mitwirken. In solchen Fällen ist eine bestimmte lebenswichtige Aminosäure nicht ausreichend im Nährsubstrat vorhanden, und die Zelle kann nicht wachsen, wenn nicht das Gen im Plasmid das Enzym herstellt, das die betreffende Aminosäure oder dessen Zwischenstufe synthesiert. Auch andere lebenswichtige Funktionen führen zu einer vorteilhaften Situation für Zellen, die das Plasmid enthalten, im Vergleich zu Zellen ohne Plasmid. Das Plasmid kann beispielsweise ein Gen enthalten, das für ein Protein codiert, das bei der Bildung der Zellwandkomponenten oder des Erbmaterials beteiligt ist.
Die Kopienzahl verschiedener Plasmide innerhalb der Zelle kann zwischen 1 und mehreren Hundert, sogar mehr als eintausend betragen. Das am häufigsten verwendete Plasmid pBR322 hat eine Kopienzahl von etwa 60, während eins ihrer Derivate pUC8 eine Kopienzahl von etwa 500 hat. Der Grund für den großen Unterschied zwischen zwei relativ ähnlichen Plasmiden wurde in einer Basenpaarmutation in der Sequenz des Replikationsursprungs (ori) des Plasmids erkannt (Chambers et al., 1988, GENE, 68, 139-149). Man kann die Kopienzahl eines Plasmids in einer geeigneten Wachstumsphase künstlich erhöhen, indem man einen Vektor konstruiert, bei dem ori (der Replikationsursprung) unter die Kontrolle eines starken und regulierbaren Promotors gestellt wird. Zur Zeit sind mehrere Plasmide bekannt, deren Kopienzahl während des Mikrobenwachstum künstlich erhöht werden kann. Diese Plasmide werden hauptsächlich in industriellen Prozessen verwendet, um Protein aus rekombinanter Fremd-DNA in großen Mengen zu produzieren. Die Verwendung solcher Vektoren mit unkontrollierter Replikation für oben beschriebene Zwecke schließt somit die Möglichkeit einer Benutzung in dieser Erfindung zur Messung von verschiedenen Substanzen, die die Zelle beeinträchtigen, nicht aus. Als Beispiele dieser Erfindung beschreiben wir verschiedene Plasmide mit unkontrollierter Replikation, bei denen die Veränderung der Kopienzahl möglich ist. Diejenigen, die am meisten untersucht und benutzt werden, um Fremdproteine zu produzieren, sind Plasmide der pOU-Serie, bei denen der Replikationsursprungsbereich unter die Kontrolle des starken und regulierbaren Promotors pR des lambda- Phagen gestellt wurde (Larsen et al., 1984, GENE, 28, 45-54). Der Promotor pR des lambda-Phagen wird durch das Repressorprotein cI857 reguliert, das durch Hitzebehandlung bis auf 42ºC zerstört wird. Die Produktion dieses Proteins kann von einem lysogenen Phagen, von einem Phagen, dessen DNA mit einem Chromosom der Wirtszelle konjugiert ist, von einem Plasmid, in das die Codiersequenz eingebaut wurde oder von einem Plasmid ausgeführt werden, das zu einer anderen Inkompatibilitätsklasse zählt. Mit Inkompatibilitätsklassen von Plasmiden meinen wir in diesem Zusammenhang solche Plasmide, die in der Lage sind, unabhängig von der Anwesenheit eines anderen Plasmids in der selben Zelle zu replizieren. Nach Zerstörung der des Repressorproteins wird der Promotor pR eingeschaltet und beginnt unkontrolliert mit der Produktion von copB und repA genannten Proteinen (die ihren Ursprung im Plasmid R1 mit geringer Kopienzahl haben) sowie von deren Transkriptionsprodukten und des copA-Gens. Diese Faktoren und insbesondere die starke Überproduktion des repA-Proteins führen zu einer vermehrten oder sogar unkontrollierten Produktion von Plasmid-DNA im E. coli Bakterium.
Hefen, wie auch Bakterien, sind einzellige Organismen, wobei aber Hefen sich insoweit von Bakterien unterscheiden als sie ein Vertreter der eukariotischen Zellen sind. Im Vergleich zu höheren eukariotischen Zellen sind Hefen viel besser genetisch untersucht. Die Genkarten von Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces bombei sind bereits weitgehend bekannt (Petes, 1980, Ann. Rev. Biochem., 49, 845-876). Es sind auch wirkungsvolle Methoden zum Gentransfer in Hefezellen bekannt. Tatsächlich sind Hefen üblicherweise benutzte Wirtszellen für rekombinante DNA.
Es gibt vier Typen von Vektoren mit rekombinanter DNA, die bei Hefen benutzt werden: YIp-Vektoren (yeast integrating plasmid), YEp-Vektoren (yeast episomal plasmids), YRp-Vektoren (yeast replicating plasmids) sowie YAC-Vektoren (yeast artificial chromosome). Die YIp-Vektoren der Hefe können DNA enthalten, das von Bakterien stammt und Teil(e) der Hefegene. Dieser Plasmidtyp bindet exakt an (einen) bestimmte(n) Punkt(en) im Hefechromosom. Die YRp-Vektoren enthalten DNA von Bakterien, einen Teil der Hefe- DNA und einen spezifischen Bereich des Hefechromosoms, der für die Replikation des Plasmids verantwortlich ist. Dieser Bereich erlaubt es dem Plasmid, sich als extrachromosomales DNA-Molekül in der Hefezelle zu vermehren. Die YEp-Vektoren enthalten Bakterien-DNA, ein Hefegen und einen Teil oder das ganze 2-Mikrometer große Hefeplasmid (Hollenberg, 1982, Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 119-144). YAC-Vektoren sind lineare DNA-Vektoren, die nicht gut für die Expression von heterologen Proteinen geeignet sind.
Es wurde eine Plasmidstruktur für Hefe beschrieben, dessen Kopienzahl reguliert werden kann. Die Centromere der Hefe sind während der Trennung der Chromosomen in den Mitose- und Meiose- Phasen erforderlich. Centromer-DNA (CEN3) wurde extrahiert, übertragen und unter die Kontrolle des Alkohol-Dehydrogenase Promotors (ADH2) gestellt, der durch Glukose reprimiert wird. Die Funktion eines solchen CEN3-Plasmids kann durch den Kohlenstofflieferanten kontrolliert werden, der bei der Kultivierung von Hefe verwendet wird. Wird Glukose als Kohlenstofflieferant verwendet, so wird der Promotor ADH2 unterdrückt und CEN3 arbeitet normal, indem es die Plasmidstruktur (YRp) während der Mitosevorgänge in der Balance hält. Bei Änderung des Kohlenstofflieferanten im Kulturmedium beginnt das Plasmid in der Zelle zu replizieren und die Kopienzahl kann bis auf einhundert je Hefezelle ansteigen (Chlebowicz-Sledziewska, E. & Sledziewska, A., 1985, GENE, 39, 25-31).
Die bei Hefen verwendeten Expressionsvektoren enthalten normalerweise die folgenden starken, regulierbaren Promotoren: Genpromotor für Alkohol-Dehydrogenase-Isoenzym I (ADHI), Phosphoglycerat-Kinase (PGK)-Promotor, reprimierbarer saure Phosphatase (PHO5)-Promotor und den Promotor für den Alphafaktor. ADHI ist ein cytoplasmatisches Hefeenzym, das Ethanol aus Acetaldehyd herstellt und das NADH als Co-Faktor benötigt. Wenn Hefezellen in Gegenwart von Glukose kultiviert werden, beträgt der Anteil des ADHI-Proteins zumindest 1 % der gesamten Proteinproduktion in Hefe. Der Promotor PGK kann durch den verwendeten Kohlenstofflieferanten (z. B. Glukose) kontrolliert werden, der die Expression des Proteins aktiviert, die vom Promotor kontrolliert wird. Die Expression von PHO5 kann durch Zusatz von anorganisches Phosphat verhindert werden und wieder aktiviert werden, indem anorganisches Phosphat aus dem Wachstumsmedium entfernt wird. Die Kontrolle von PHO5 geschieht mit Hilfe spezieller Regulatorelemente, die durch die Genprodukte von PHO2, PHO4, PHO80 und PHO85 gebildet werden (Bosfiana, K.A., 1980, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 77, 6541-6545). Es sind auch einige Mutanten (PHO4 und PHO80) bekannt, die durch eine einfache Temperaturänderung aktiviert werden können. Diese Hefezellenmutanten wachsen bei 35ºC und produzieren kein saures Phosphatase-Enzym, selbst wenn kein anorganisches Phosphat im Medium vorhanden ist. Wird die Kultivierungstemperatur nach unten verändert, so kommt es zur wirksamen Produktion von saurer Phosphatase, gleichgültig ob Phosphat im Medium enthalten ist oder nicht. Dieses System, die Proteinproduktion durch Veränderung der Kultivierungstemperatur zu steuern, wurde beispielsweise für die Herstellung von Interferonen verwendet (Kramer et al., 1984, Proc. Natl.. Acad. Sci. USA, 81, 367-370).
Die Verwendung von höheren Eukaryonten als Wirtszelle für rekombinante DNA-Vektoren zur Produktion von Fremdproteinen nimmt rasch zu. Der Wunsch geht dahin, Proteine eukaryotischen Ursprungs in großen Mengen herzustellen. In einem optimalen Expressionssystem wäre es möglich, Proteine in mehreren verschiedenen Typen von Zellinien zu produzieren. Ein vollständig regulierbares Expressionssystem für die Proteinproduktion wäre eine ideale Lösung. Die am häufigsten verwendeten regulierbaren Promotoren arbeiten jedoch nur in bestimmten Wirtszellen. Oft ist die Regulation dieser Promotoren schlecht und die Expressionsvektoren stammen von einer Tumor produzierenden Virus-DNA, wodurch es auch zu gewissen Risiken bei deren Verwendung kommt.
Bei höheren Eukaryonten kann die Genexpression mit Hilfe der folgenden Mittel reguliert werden: Simian Virus 40 (SV40) T- Antigen, Metallothionein-Gene, heat-shock-Gene, Glucocorticoid- Hormone, DNA-Methylierung oder mit antisense RNA. Das vom SV40 produzierte Antigen kontrolliert seine eigene Transkription. T- Antigene werden in großen Mengen produziert, sobald der Virus die Zielzelle infiziert hat, und später bindet das T-Antigen an seinen eigenen Promotor und verhindert die Transkription. Wenn SV40- Vektoren zur Klonierung eingesetzt werden, kann die Regulation des T-Antigen durch Verwendung eines geeigneten temperaturempfindlichen T-Antigenmutanten verhindert werden. In diesen Fällen produzieren die T-Antigenmutanten das T-Antigen normal bei hohen Temperaturen, aber die Produktion wird bei Raumtemperatur unterbunden (Rio et al., 1985 Science, 227, 23-28). Metallothioneine sind Proteine, die Schwermetalle an sich binden. Viele eukaryotische Zellen produzieren dieses Protein in Gegenwart von Schwermetallen. Man schätzt, daß_die Produktion von Metallothioneinen auf mehr als das 50-fache ansteigt, wenn Cadmium dem Wachstumsmedium in einer molaren Konzentration von 4 x 10&supmin;&sup6; zugefügt wird (Hammer, D.H. & Walling, M.J., 1982, J. Mol. Appl. Genet., 1, 273-288). Die durch Cadmium induzierte Proteinproduktion kann durch Verwendung von Wachstumsmedien mit niedrigem Cd²&spplus;-Gehalt noch weiter erhöht werden.
Für viele Promotoren von heat-shock Genen wurde bewiesen, daß sie in mehreren verschiedenen Zellinien einsetzbar und gut regulierbar sind. Die Regulation dieser Promotoren erfolgt einfach durch Veränderung der Wachstumstemperatur. Die Gene werden bei hohen Temperaturen zur Proteinproduktion aktiviert, während andererseits die Proteine bei niedrigen Temperaturen nur in kleinen Mengen oder gar nicht produziert werden. Der am gründlichsten untersuchte Fall ist das heat-shock System der gemeinen Taufliege, Drosophila melanogaster, bei dem die Erhöhung der Temperatur von 25ºC auf 37ºC die normale Proteinproduktion zum Erliegen bringt, während die heat-shock Proteine dann erst auftreten. Das wichtigste und am besten bekannte heat-shock-Protein wird hsp70 genannt. Die Regulationsmechanismen für die Expression der Proteine sind nicht gut bekannt. Durch Verwendung von heat-shock-Promotoren (hsp70) wurde es möglich, die Produktion von hGH (menschliches Wachstumshormon) auf das 1200-fache im Vergleich zu nicht aktivierten Zellen zu erhöhen (Dreano et al., 1986, GENE, 49, 1-8).
In der vorliegenden Erfindung finden prokaryotische und eukaryotische Organismen Verwendung, die sorgfältig ausgewählt wurden und die geeignete Vektorkonstruktionen aus rekombinanter DNA beinhalten. Durch Einschalten der Synthese von DNA, RNA oder von Proteinen unter strenger Kontrolle ist man in der Lage entweder direkt oder indirekt alle jenen Faktoren zu messen oder nachzuweisen, die die oben beschriebenen Synthesemechanismen beeinträchtigen. Als Meßbasis kann man das vom Vektor mit rekombinanter DNA codierte Proteinprodukt verwenden, das Markerprotein oder seine Aktivität oder die gesamte Stoffwechselaktivität. Durch die Aktivierung der Replikation des Vektors mit rekombinanter DNA in kontrollierter Form kann man die DNA-Menge auch direkt messen, indem man radioaktive Markierungen verwendet oder mit Hilfe von Durchfluß- Zellzählungstechniken.
Man kann geeignete Vektoren mit rekombinanter DNA für die Messung verschiedener Chemikalienklassen in Abhängigkeit davon präparieren, welches Ziel diese Chemikalie hat. Es ist z. B. möglich, die chemischen Verbindungen, die die DNA-Synthese (Nukleotide) und DNA- Replikation hemmen oder die Verbindungen, die an die DNA binden, wie z. B. mehrere Krebswirkstoffe, mit Hilfe von E. coli-Bakterien, die Plasmide mit unkontrollierter Replikation beinhalten, zu quantifizieren. Die Replikation der DNA bei dieser Art von Plasmiden wird zum Beispiel durch den induzierbaren Promotor pRE des Lambda-Phagen kontrolliert. So kann die DNA-Synthese und die Replikation des Plasmids zu einem vorbestimmten Zeitpunkt in Gang gesetzt werden und die zu messenden Analysestoffe können direkt mit dieser regulierbaren und starken Biosynthese der DNA gekoppelt werden, die nicht von der Zellteilung der Zelle abhängig ist. Wenn die Synthese oder die Replikation der DNA gehemmt ist, ist dies dadurch erkennbar, daß die Kopienzahl des Plasmids gleich bleibt oder sogar im Vergleich zum Ausgangszustand abnimmt. In den nichtinhibierten Vergleichszellen wächst die Kopienzahl des Plasmids pro Zelle rasch an. Die Änderung der Kopienzahl kann entweder direkt durch Messung der DNA-Menge oder indirekt durch Messung der Genproduktmengen oder der Aktivitäten bestimmt werden, für die die Plasmid-DNA codiert. Mit Hilfe dieser Art von Plasmiden ist es möglich, Agenzien zu nachzuweisen, die sehr verschiedene Auswirkungen auf die Zelle haben. Das liegt in der Tatsache, daß man auch ein Gen synthetisieren kann, das für ein Markerprotein unter der Kontrolle eines starken und regulierbaren Promotors codiert, dessen Expression im Test gemessen wird. So kann alles, was die DNA, RNA, Proteine, ihre Biosynthese auf die ein oder andere Art beeinträchtigt, gemessen werden. Wenn man einen Test mit weitreichender Kompetenz entwickeln möchte, der Agenzien berücksichtigt, die die Zellwand, Nukleinsäuren, Proteine und den Stoffwechsel beeinträchtigen, basiert ein ideales Mittel dafür auf dieser Art von Plasmiden mit unkontrollierter Replikation, um diese Agenzien nachzuweisen. In diesen Fällen dürfen sich Zellen verdoppeln, wonach der Promotor, der die Replikation reguliert, aktiviert wird und gleichzeitig oder nach einer bestimmten Zeit wird der Promotor aktiviert, der das für das Marker-Protein codierende Gen reguliert. Ein Vektor mit ähnlichen Eigenschaften kann auch für eukaryotische Zellen entwickelt werden.
Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung von Plasmiden, deren Replikation fest mit der Zellteilung der Wirtszelle verbunden ist. Multi-copy-Plasmide mit rekombinanter DNA, bei denen das für das Markerprotein codierende Gen unter der Kontrolle eines starken und regulierbaren Promotors steht, können für den Nachweis von Agenzien verwendet werden, die die Zellmembrane, Proteine und den Stoffwechsel beeinträchtigen. Agenzien, die die DNA oder Zellmembrane beeinträchtigen, können mit dem System nachgewiesen werden, wenn aktiv sich teilende Zellen verwendet werden. Das Multi-copy- Plasmid wird an Tochterzellen weitergegeben und das System ist gegenüber Agenzien empfindlich, die die DNA beeinträchtigen. Aktiv sich teilende Zellen sind auch gegenüber Agenzien empfindlich, die die Zellmembranen beeinträchtigen. Wenn der starke Promotor aktiviert wird, der die Expression des Markerproteins reguliert, wird das System auch gegenüber Agenzien empfindlich sein, die die mRNA und die Proteinsynthese beeinträchtigen.
Mit der Verwendung von Genen, die für Luciferase codieren, ist es als besondere Anwendung überdies möglich, Agenzien zu bestimmen, die den Energiestoffwechsel beeinträchtigen. Der Grund dafür liegt in der Tatsache , daß für die Reaktionen, die durch Luciferase katalysiert werden, energiereiche Substanzen der Zelle gebraucht werden. Agenzien, die den energetischen Zustand der Zelle auf allen Biosynthese-Ebenen (Replikation, Transkription und Translation) oder beim Stoffwechsel beeinträchtigen können, können mit Hilfe der Bioluminiszenz, d.h. der Lichtemission durch die Zelle, nachgewiesen werden. Ein besonderer Fall ist bakterielle Luciferase, die zentrale Stoffwechselprodukte, NAD(P) und FMNH&sub2; verwendet. Ein weiterer Spezialfall ist die Leuchtkäfer- und Schnellkäfer- Luciferasen, die ein zentrales Stoffwechselprodukt, ATP, zur Lichterzeugung benutzen.
Das Wesen der hier beschriebenen Erfindung macht es möglich, sehr verschiedene Arten von Meßtechniken zu verwenden, z. B. spektrophotometrische, fluorometrische, luminometrische und visuelle Verfahren. Spektrophotometrische Verfahren können eine Alternative darstellen, wenn ein Gen in ein Plasmid kloniert ist, dessen Produkt man durch Überwachung der Farbänderung wie z. B. β- Galactosidase, alkalische Phosphatase, Amylasen, Peroxydasen, Glucoronidasen und Oxidoreductasen messen kann. Fluorometrische Verfahren verwenden fluoreszierende Substrate, die für verschiedene Enzyme entwickelt wurden, wodurch sie über eine etwas größere Empfindlichkeit im Vergleich zu spektrophotometrischen Verfahren verfügen. Das luminometrische Verfahren wird mit Hilfe von Genen durchgeführt, die entweder für bakterielle oder für Käferluciferase codieren. Es existieren mehrere Lumineszenzbakterienspezies, wie z. B. V. harveyi, V. fischeri, P. leiognathi, P. phosphoreum, Xenorhabdus luminescens etc.. Leuchtkäfer sind z. B. Luciola mingrelica, Photinus pyralis, Pyrophorus plagiothalamus etc. Es existieren auch mehrere eukaryotische Leuchtspezies im Meer, wie z. B. die Muschelkrebse Vargula hilgendorfii, Aequorea victoria- Quallen, krötenähnliche Fische Porichtys notatus, die Fisch-Art Parapriacanthus ransonneti etc., die für verschiedene Anwendungen in der Zukunft nützlich sein könnten. Der Vorteil gegenüber spektrophotometrischen und fluorometrischen Verfahren liegt hier in der extrem empfindlichen Messung der Lichtemission. Ein wichtiger Nutzen bei Luminszenzverfahren besteht in der Möglichkeit, die Messungen intern zu eichen, indem andere Gene im Innern derselben Zelle verwendet werden, die für eine Luciferase codieren, die eine andere Farbe emittiert, die mit einem speziellen Zwei-Wellenlängen- Meßgerät gemessen werden könnte. Das andere Gen kann in den selben Vektor mit rekombinanter DNA oder in einen anderen, zu einer anderen Inkompatibilitätsklasse gehörenden, Vektor kloniert werden, es kann in das Wirts-Chromosom eingebaut oder in einem Phagen getragen werden, etc. Ein Beispiel ist die Luciferase des Schnellkäfers, die vier verschiedene Farben aussendet, deren Wellenlängen zwischen 547nm und 593 nm liegen (Wood et al., 1989, Science, 244, 700-702). Das andere Gen das zu einer anderen Wellenlänge führt, kann unter die Kontrolle eines induzierbaren Produktionssystem ("Indikatorgen") gestellt werden, oder es kann konstitutiv exprimiert werden (interner Standard), um mögliche Sekundäreffekte zu kompensieren, die durch heterologe Proben auftreten können. Die Verwendung eines einfachen Farbindikators ist nützlich in den Fällen, wo zwar keine große Empfindlichkeit erforderlich ist, aber die Einfachheit und Schnelligkeit wichtiger sind. Wenn die Veränderungen im Zellstoffwechsel nachgewiesen werden sollen, kann man z. B. Tetrazoliumsalze verwenden, die nach einer Reduktion eine gering lösliche Formazan-Farbe bilden. In diesen Fällen haben die für Dehydrogenasen oder Oxidoreductasen codierenden Gene die Funktion von Beschleunigern der Reduktion von größeren Mengen, um die intensive Farbe von Formazan hervorzubringen. Es sind auch immunologische Methoden (Antikörper) in Verbindung mit empfindlichen Meßsystemen (RIA, FIA) möglich. Die Verwendung von radioaktiven Markern und Durchflußcytometrie-Methoden bei der Bestimmung des Endpunktes des Verfahrens sind möglich.

Das Verfahren, das auf der Veränderung der Kopienzahl von Vektoren mit rekombinanter DNA beruht:

Die Zelle bildet ihr Erbmaterial, die DNA, aus Desoxyribonukleotiden auf. Es können auch extrachromosomale oder episomale DNA als Plasmide in der Zelle vorliegen. Die Replikation des Plasmids ist nicht direkt von der Zellvermehrung abhängig. Jedes Plasmid hat seinen eigenen Replikationsursprung, mit dessen Hilfe es sich im Verlauf der Zellteilung verdoppelt und in Tochterzellen teilt. Das Plasmid benutzt jedoch die DNA-Replikationsmechanismen der Wirtszelle für seine eigene Replikation.
In Figur 1 wird eine schematische Darstellung einer Methode gezeigt, die auf der Veränderung der Kopienzahl des Plasmids beruht, bei der die Zelle, die ein spezielles Plasmid enthält ( z. B. Plasmid pCSS123 mit unkontrollierter Replikation), dazu gebracht werden kann, zu einem bestimmten Zeitpunkt und in kontrollierter Weise zu replizieren. Zu Anfang enthält die Zelle nur eine kleine Anzahl von Plasmidkopien. Dem zu untersuchenden Agens wird erlaubt, auf die Zelle für eine geeignete Zeitspanne einzuwirken, nach der die Replikation des Plasmids eingeleitet wird. Das Plasmid wird dann in Gegenwart des Agens so gut wie möglich replizieren. Die Replikation des Plasmids kann durch Zugabe einer Kopplungschemikalie in Gang gesetzt werden oder durch physikalische Mittel, wie z. B. ausreichende Erhöhung der Temperatur, damit die Replikation beginnt. Gleichzeitig oder nach Einleitung der Replikation kann die Expression des Markerproteins durch dasselbe spezielle Plasmid eingeschaltet werden. In diesem Fall kann der Grad der Plasmidreplikation direkt durch Messung der Markerproteinmenge oder seiner Aktivität quantifiziert werden, die von der Anzahl der Kopienzahl des Plasmids im Inneren der Zelle abhängig ist. Dies wird in Figur 1 als eine Menge von Enzymaktivität, die durch das im Plasmid enthaltene Gen codiert wird. Dadurch wird es möglich, Faktoren, die die Synthese von RNA, die Transkription, Translation, die Zellwände, spezifische Stoffwechselgänge und Enzymaktivität beeinträchtigen, zu studieren und zu messen.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung der Möglichkeiten, die, bei unterschiedlichen Agenzien, eine Wirkung in der Zelle entfalten können und wie sie miteinander verbunden werden können, um die Kopienzahl des Plasmids zu verändern. Die Biosynthese von DNA, RNA und Proteinen sind Vorgänge, die aus vielen Schritten bestehen, und sie erfordern das Zusammenwirken verschiedener Faktoren. Zu jedem Schritt gibt es natürliche und künstliche Agenzien, die das System entweder durch Aktivierung oder Hemmung beeinträchtigen. Zum Beispiel besteht die Wirkung von Nalidixinsäure auf die Replikation von DNA in einer Hemmung der DNA-Polymerasewirkung.
Bemerkenswert ist, daß der Startpunkt nur wenige regulierbare DNA- Moleküle umfaßt, die ohne Zellvermehrung zur Replikation gebracht werden können. Dadurch wird es möglich, sich nicht-teilende Zellen zum Testen von Effektoren zu verwenden, so daß die Zeit, die für den Test gebraucht wird, nicht durch das langsame Wachstum und die Vermehrung der Zellen beschränkt wird. Die erfinderische Leistung bei diesem Verfahren beruht auf der kontrollierten Vervielfältigung der Plasmid-DNA und dadurch auf einer Möglichkeit, sehr große Gruppen chemischer Verbindungen zu untersuchen.
Bei der Erfindung werden regulierbare Promotoren und Mechanismen, die durch diese Promotoren kontrolliert werden, ausgenutzt, wie z. B. die Erhöhung der Kopienzahl eines Plasmids und/oder die Produktion eines Markerproteins durch die Zelle in einer vorbestimmten Wachtumsphase. In diesem Zusammenhang sind Promotoren in DNA-Bereichen gemeint, an die das Enzym RNA-Polymerase binden kann und wo auch ein spezielles Regulatorprotein oder anderes Molekül eine Wechselwirkung ausüben kann. Promotoren sind Bereiche in der DNA, die die Ausprägung eines daneben oder in der Nähe liegenden Gens kontrollieren. Induzierbare E. coli Promotoren sind z. B. lac, trp, der Hybridpromotor tac und die Promotoren pL und pR des Lambda- Phagen. Diese Promotoren unterscheiden sich voneinander beispielsweise im Hinblick auf ihre Stärke und der Art der Induktion. Lac- und tac-Promotoren können mit Hilfe von Chemikalien induziert werden, während die Induktion des Promotors pL durch eine einfache Wärmebehandlung erfolgt.

Nachweis von toxischen Substanzen unter Verwendung eines Verfahrens, bei der die Proteinbiosynthese durch einen regulierbaren Promotor im Plasmid mit rekombinanter DNA kontrolliert wird:

Es gibt noch eine weitere Substanz in der Zelle außer der DNA, die Informationen enthält, nämlich die RNA, speziell die Boten-RNA (mRNA). Die Boten-RNA aus Ribonukleotid-Triphosphaten aufgebaut, die in der Zelle vorrätig sind. Boten-RNA wird entsprechend jedem Gen in der DNA mit Hilfe spezieller Transkriptionsmechanismen synthetisiert, die die Moleküle umfassen, die für diese Vorgänge verantwortlich sind. Auf der anderen Seite werden Proteine nach allgemein akzeptierten Prinzipien gemäß den mRNA-Molekülmatrizen angefertigt. Sowohl die RNA-Synthese als auch die Synthese eines Proteins, für das die entsprechende RNA codiert, kann sehr schnell eingeschaltet werden. In der Erfindung werden spezielle Plasmide mit rekombinanter DNA verwendet, die so präpariert wurden, daß sie zur Produktion von großen Mengen geeigneter Proteine aktiviert werden können. In diesem Fall wurde ein spezielles Plasmid konstruiert, so daß die Kopienzahl des Plasmids nicht ausgewählt werden kann, sondern daß sie für das in bestimmten Wirtszellen verwendete Plasmid konstant ist. Die zur Verwendung kommenden Plasmide sollten eine hohe Kopienzahl aufweisen, wodurch folglich die Proteinproduktion sehr hoch wäre. Da Zellen, die diese Art von Plasmiden enthalten, vor der Induktion mit Agenzien, wie z. B. Antibiotika, behandelt werden, die die mRNA- oder Proteinsynthese beeinträchtigen, kann man aufgrund der geänderten Proteinproduktion die Antibiotikamenge, die Wirkungsweise oder die Gesamtpräsenz im System abschätzen. Das Wesen der Erfindung wird hier in solchen Fällen angewandt, wo Mikroben Agenzien ausgesetzt sind, die die Biosynthesevorgänge beeinträchtigen, die spezifisch und streng kontrolliert in Gegenwart dieser Agenzien in Gang gesetzt werden. Da Plasmide mit rekombinanter DNA, wie in dieser Erfindung beschrieben, benutzt werden, ist es möglich, die ausgewählte Proteinproduktion in Abhängigkeit von den verwendeten Agenzien zu erhalten.
Bemerkenswert ist, daß man die Agenzien, die die DNA-Synthese und Zellmembrane beeinträchtigen, nachweisen kann. Dies ist aufgrund der Tatsache möglich, daß eine Mikrobe bei der Vermehrung gezwungen ist, diese Plasmide mit hoher Kopienzahl ebenfalls zu synthetisieren und daher sind diese speziellen Plasmide empfindlich gegenüber diesen Agenzien. Aktiv sich vermehrende Zellen sind besonders empfindlich gegenüber Agenzien, die auf die Zellmembranen und ihre Biosynthese wirken.
In Figur 3 wird die praktische Durchführung der oben beschriebenen Erfindung für den Fall dargestellt, daß das spezielle Plasmid in vielen Kopien in der Mikrobe existiert. Die Mikrobe wird einem Agens ausgesetzt, das die Biosynthese hemmt, und nach einer Zeitspanne werden die speziellen Plasmide zur Produktion von Protein aktiviert, das in diesem Fall ein Enzym ist. Die Dicke der in der Figur gezeigten Pfeile entspricht der Wirksamkeit der mRNA und Proteinsynthese und damit auch der Wirksamkeit der Agenzien. In diesem Fall, wo der Hemmstoff vorhanden war, blieb die Produktion des Enzyms gering. Durch Vergleich mit einem Fall, wo das beeinträchtigende Agens nicht vorhanden war oder wo bekannte Menge davon vorhanden waren, kann man die Messung entweder qualitativ oder quantitativ durchführen.
In Figur 4 werden in vereinfachter Form jene Biosysntheseprozesse dargestellt, die bei dem oben beschriebenen Plasmid mit rekombinanter DNA beeinträchtigt werden können, wenn sich nicht stark vermehrende Zellen nicht verwendet werden. Bei Verwendung von sich aktiv stark vermehrenden Zellen in der Messung ist es auch möglich, die Agenzien, die die DNA beeinträchtigen, zu studieren, wie es in Figur 2 dargestellt ist. Der Unterschied zu Figur 1 besteht in der anfänglichen Anzahl von Plasmidkopien in der Zelle und der Möglichkeit, die Kopienzahl in sich nicht-vermehrenden Zellen künstlich zu erhöhen.
Es gibt Promotoren, die durch geeignete Behandlungen eingeschaltet werden können. Die Stärke der Promotoren variiert erheblich und jeder in dieser Erfindung beschriebene Promotor ist recht stark. Man kann jedoch sagen, daß der Promotor pL stärker ist als die lac- und tac-Promotoren. Der Promotor pL des Lambda-Phagen ist auch viel schneller, d.h. die Wirkung der Induktion ist viel früher klar erkennbar als bei den zwei anderen. Dieses Verhältnis kann teilweise durch die langsame Aufnahme des induzierenden Moleküls durch die Zellmembranen im Fall der lac- und tac-Promotoren erklärt werden und auch durch die Effektorstelle im Innern der Zelle (z. B. sei hier der Induktor des lac-Promotors, IPTG, genannt). Auch die Kopienzahl des verwendeten Plasmids erklärt teilweise die relativen Unterschiede bei der Induktion. Die Kopienzahl des Plasmids pCSS112 (siehe Figur 7) in E. coli beträgt etwa 60, während das Plasmid pCSS108 (siehe Figur 6) eine Kopienzahl von etwa 600 aufweist. Die Produktion von bakterieller Luciferase durch Plasmide wird beim Plasmid pCSS112 durch den Promotor pL des Lambda-Phagen und beim pCSS108 durch den lac-Promotor des E. coli Lactose-Operon kontrolliert. Beide Promotoren werden von bestimmten Repressorproteinen kontrolliert, die in begrenzter Menge produziert werden. Da die Kopienzahl des Plasmids im ersten Fall zehn Mal geringer ist als im letzteren Fall, wird die Produktion des Luciferaseproteins besser abgestellt, d.h. unterdrückt. Im letzteren Fall ist der lac- Promotor aufgrund der relativ geringen Mengen von Repressorproteinen durchgängig und so ist die erzeugte Menge des zu bestimmenden Proteins oder das erzeugte Niveau seiner Aktivität bereits bereits sehr hoch. Die Wirkung von toxischen Substanzen kann wirkungsvoller gezeigt werden, wenn ein starker und schnell- induzierter Promotor zur Regulation eines bestimmten Gens oder einer Wirkung in einem Vektor mit rekombinanter DNA verwendet wird.

Die in der Erfindung verwendete Bakterienstämme, Plasmide und ihre Konstruktion sowie Verfahren:

Als Klonierungswirte und in Toxizitätsmessungen wurden E. coli JM 103 (lac-pro, thi, strA, supE, endA, sbsB15, hsd4R4 (F'traD34, proAB, lacIqZλM15) (Messing et al., Nucl. Acids Res., 9, 1981, 309- 321), MC1061 (cI&spplus;, araD139, λ(ara-leu) 7696, lacX74, galU&supmin;, galK&supmin;, hsr&supmin;, hsm&spplus;, strA) Casadaban & Cohen, J. Mol. Biol., 138, 1980, 179- 207), BW322 (CGSC, rfa-210::Tn10, thi-1, relA1, spoT1, pyrE) und K- 12 (M72 SmR-lacZamλbio-uvrB, trpEA2 (Nam7Nam53cI857 HI) (Remaut et al., 1981, GENE, 15, 81-93) und Bacillus subtilis 1A40 (Genetisches Vorratszentrum für Bazillen [Bacillus Genetic Stock Center], lys-3, metB10, trpC2) verwendet. Die Zellen wurden auf geeigneten Minimalmedium-Agarplatten gezüchtet, und für maximal einen Monat bei +4ºC aufbewahrt, wonach neue Platten bestrichen wurden. Die Stämme wurden auch in 15%igem Glycerin bei -70ºC aufbewahrt, von wo aus das Wachstum auf Minimalmedium-Platten gestartet wurde. Zellen für die Plasmidextraktion wurden zuerst in 5ml 2xTY-Medium (16 g Bacto Trypton, 8 g Hefeextrakt, 8 g NaCl, H&sub2;O ad 1 l, pH 7,4, mit geeignetem Antibiotikum) für 10 h bei 30ºC in einem Schüttler gezüchtet, wonach die Kultur in ein größeres Volumen für 10 h im gleichen Medium überführt wurde.
In den Figuren 5a und 5b wird die Konstruktion eines Plasmids pCSS123 mit rekombinanter DNA (hinterlegt unter der DSM-Nummer 5119) gezeigt, in Figur 5c der Aufbau eines Plasmids pCSS302 mit rekombinanter DNA und in Figur 5d der Aufbau eines Plasmids pCSS305 Plasmids mit rekombinanter DNA. Das Plasmid pWH102 (Gupta et al., 1985, Arch. Microbiol., 143, 325-329) wurde mit dem Restriktionsenzymen SalI und PvuII gespalten, und es wurde einer Agarose- Gelelektrophorese unterzogen. Ein DNA-Band von 2300 Basenpaaren (Bp) wurde unter UV-Licht abgetrennt und die bei geringen Temperaturen gelierende Agarose wurde bei 65ºC geschmolzen und mit Hilfe von Ligase-Enzym mit Plasmid pEMBL19(-) ligiert (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res., 11, 1645-1655), welches durch SalI und SmaI gespalten worden war. Das erhaltene Plasmid wurde mit Hilfe der später beschriebenen Methode in E. coli JM103-Zellen umgewandelt. Es wurde eine Plasmidextraktion in Miniaturform nach Maniatis et al., (1982, Molekulares Klonieren: Eine Laboranleitung [Molecular Cloning: A Laboratory Manual], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) durchgeführt und die korrekten Konstruktionen wurden mit Hilfe einer geeigneten Restriktionsenzym-Analyse bestimmt. Eine große Plasmidextraktion wurde gemäß derselben Anleitung durchgeführt. Das in Figur 5a gezeigte Plasmid (pCSS111) wurde mit der Restriktions-Endonuclease PvuII gespalten und ein DNA-Stück mit 2400 Bp wurde, wie zuvor beschrieben, separiert. Dieses Stück, das bakterielle Luciferasegene von V. harveyi enthielt, die unter der Kontrolle des lac-Promotors stehen, wurde mit einem Plasmid pOU6 ligiert (Larsen et al., 1984, GENE, 28, 45- 54), welches mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten wurde und das zuerst mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffersystem aufgefüllt wurde. Die Ligationsmischung wurde, wie später beschrieben ist, in E. Coli JM101 Stämme umgewandelt und die korrekten, das Plasmid enthaltenden, Kolonien wurden anhand ihrer Fähigkeit, Licht zu erzeugen, durch Sichtprüfung der Platten im dunklen Raum herausgezogen. Dies wurde durch Zugabe von 5 µl eines 10 % Decanal auf den Deckel der Kultivierungsplatte, das die Licht erzeugenden Kolonien nach einigen Minuten erkennbar machte, nachdem das Aldehyd in die Zellen eingedrungen war. Das erhaltene Plasmid wird in Figur 5b dargestellt und wurde mit pCSS123 bezeichnet. Ein analoges Plasmid pCSS302 mit unkontrollierter Replikation wurde wie folgt konstruiert: Plasmid pLucGR(tac) (Wood et al., 1989, Science, 244, 700-702) wurde mit den Restriktions-Endonucleasen XhoI und HindIII gespalten und mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt gemacht. Nach der Trennung der Fragmente auf Agarose-Gel wurde ein Stück mit 1800 Bp, das das für grüne Luciferase des Schnellkäfers codierende Gen unter der Kontrolle des tac-Promotors enthält, mit dem Plasmid pOU61 ligiert, welches mit BamHI aufgeschnitten und, wie oben beschrieben, aufgefüllt wurde. Die Ligationsmischung wurde in E. coli JM103 umgewandelt und die korrekten Transformanten wurden aus Plasmid-Präparationen mit kleinen Mengen bestimmt, und das resultierende Plasmid pCSS302 ist in Figur 5c dargestellt. Ein zweites analoges Plasmid pCSS305 mit unkontrollierter Replikation wurde wie folgt konstruiert: Plasmid pCGLS11 (K. Nealson, persönliche Kontakte und in der Presse) wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII aufgeschlossen und ein 7 kb-Fragment, das die Gene enthält, die für die Luciferasen α- und β-Untereinheiten der X. luminescens unter der Kontrolle des lac-Promotors von E. coli codieren, wurden mit Plasmid pOU61 ligiert, das mit BamHI gespalten und, wie oben beschrieben, aufgefüllt wurde. Die Ligationsmischung wurde in E. coli JM103 umgewandelt und die korrekten Transformanten aus einer Plasmid-Präparation mit kleine Mengen bestimmt.
Die verwendeten Symbole and Abkürzungen bedeuten: ampr = Gen, das für β-Lactamase codiert, ori = Replikationsursprung des Plasmids, luxA und B = Gene, die für die Untereinheiten von Luciferase codieren, lacP = Promotor des Lactose-Operons von E. coli, F1 (IG) = Region zwischen den Genen des Phagen F1, MCS = multiple Klonierungsstelle von pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985, GENE, 33, 103- 109), kb = 1000 Basenpaare, repA , copA und cobB = Gene, die für Proteine codieren, die für die Kopienzahl der Plasmide und die Teilung des Plasmids in Tochterzellen zuständig sind, cI857 = temperaturempfindlicher Repressor des Lambda-Phagen. Die Abkürzungen der verwendeten Restriktions-Endonucleasen: R = EcoRI, H = HindIII, B = BamHI, S = SalI, P = PvuII, Sa = SacI, K = KpnI, Sm = SmaI, X = XbaI, Ps = PstI, Sp = SphI.
B/P = der Ligationspunkt BamHI, aufgefüllt, PvuII.
B/H = Ligationspunkt BamHI, aufgefüllt, HindIII.
B/Xh = Ligationspunkt BamHI, aufgefüllt, XhoI.
Figur 6 zeigt ein Plasmid pCSS108 (Korpela & Karp, Biotechnol. Lett., 10, 1988, 383-388), welches für die Produktion von bakterieller Luciferase unter Zugabe einer Substanz namens IPTG verwendet wird, die die Proteinproduktion in Gang setzt, indem sie an das lac-Repressorprotein bindet. Die Gene, die für Luciferase von Vibrio harveyi codieren wurden aus dem Plasmid pWH102 übertragen (Gupta et al., 1985, Arch. Microbiol., 143, 325-329) indem das Plasmid mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten wurde. Die zwei Teilstücke wurden mit dem Enzym alkalische Phosphatase (CIP) behandelt, um die Phosphatgruppen an den Enden zu entfernen, so daß die Teilstücke nicht miteinander ligieren können. Ein 5000-Bp-Stück wurde, wie zuvor beschrieben, auf Agarose-Gel separiert. Dieses Fragment wurde mit Hilfe von T4-DNA-Ligase mit einem Plasmid pEMBL18(+) ligiert , welches zuvor durch das gleiche Enzym gespalten worden war. Nach Umwandlung in E. coli JM103 und Inkubation der Transformanten über Nacht, wurden die Kultivierungsplatten im dunklen Raum, wie zuvor beschrieben, auf Licht erzeugende Kolonien abgesucht. Die verwendeten Symbole sind die gleichen wie in Figur 5.
Die Konstruktion des Plasmids pCSS112 (hinterlegt unter der DSM- Nummer 5120) wird in Figur 7a dargestellt. Das Plasmid enthält Luciferase-Gene von V. harveyi, und sie stehen unter der Kontrolle des Promotors pL des Lambda-Phagen. Der Promotor ist durch das Repressorprotein CI857 des Lambda-Phagen regulierbar, das durch kurze Wärmebehandlung in geeigneten Wirten wie E. coli K-12 HI trp zerstört werden kann. Das Plasmid pWH102 wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI gespalten. Das Plasmid pPLcAT110 (Stanssens et al, 1985 GENE, 36, 211-233, teilweise unveröffentlicht) wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und BglII gespalten. Die DNA-Fragmente wurden, wie bereits beschrieben, abgetrennt und ein Stück mit 3200 Bp von Plasmid pWH102 und ein Stück mit 2900 Bp von pPLcAT110 mit Hilfe von T4-DNA-Ligase ligiert. Nach Umwandlung in E. coli MC1061 (cI&spplus;) wurde die korrekte Transformante, die das Plasmid enthält, wie zuvor beschrieben, ermittelt. Das erhaltene Plasmid wurde in E. coli K-12 HI trp Wirtszelle umgewandelt. In Figur 7b ist ein Plasmid pCSS301 gezeigt, das grundsätzlich pCSS112 ähnlich ist, mit der Ausnahme, daß anstelle des für bakterielle Luciferase codierende Gen, ein Gen vorhanden ist, das für grüne Schnellkäfer-Luciferase codiert (Wood et al., 1989, Science, 244, 700-702). Ein Plasmid pLucGR (tac), das ein Luciferase-Gen vom Schnellkäfer enthält, wurde mit dem Restriktionsenzym BspHI aufgeschlossen, wobei die klebrigen Enden durch eine Behandlung mit einer Mungobohnen-Nudease stumpf gemacht wurden und ein DNA- Fragment mit 1643 Bp wurde auf einem Agarose-Gel wie beschrieben abgetrennt. Dieses Fragment wurde mit einem durch XbaI - BglII aufgeschlossenen Vektor pPLcAT110 (zuvor beschrieben) ligiert, der aufgefüllt wurde und mit CIP behandelt wurde. Die Ligationsmischung wurde zuerst in E. coli MC1061 Zellen umgewandelt und nachdem das korrekte Plasmid in einer Plasmid-Präparation mit kleinen Mengen aufgefunden wurde, wurde es in E. coli K-12λHIλtrp umgewandelt. Es wurden die gleichen Symbole wie in den Figuren 5 verwendet, daneben auch pL = linker Promotor des Lambda-Phagen, Pv = PvuI, Xb/Bs = Ligierungspunkt XbaI, aufgefüllt, BsphI, mit Mungobohne behandelt, Bs/Bg = Ligierungspunkt BsphI, mit Mungobohne behandelt, BglII, aufgefüllt.
Ein Plasmid pCSS962 wurde wie folgt konstruiert: Ein Shuttle-Vektor p602/22, der sowohl in E. coli als auch in B. subtilis replizieren kann (LeGrice et al., 1987, GENE, 55, 95-103), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten, mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP) behandelt. Das Plasmid pLucGr(tac), welches das Gen enthält, das für grüne Schnellkäfer-Luciferase codiert, wurde mit dem Restriktionsenzym BspHI aufgeschlossen, mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und auf Agarose-Gel, wie zuvor beschrieben, abgetrennt und mit dem oben genannten Shuttle-Vekor ligiert. Die Ligationsmischung wurde in E. coli MC1061 umgewandelt, wie unten beschrieben ist, und die korrekten Plasmidkonstruktionen wurden durch die Analyse von Plasmidpräparationen in kleinen Mengen mit Hilfe einer geeigneten Restriktionsenzymanalyse bestimmt. Das korrekte Plasmid wurde mit einem Helferplasmid pBL1 (LeGrice et al., 1987, GENE, 55, 95-103) in einen B. subtilis 1A40 Stamm co-transformiert. Das Plasmid und seine Konstruktion sind in Figur 7c gezeigt. Die verwendeten Symbole sind: P/O = Promotor-/Operator; ori- = E. coli-Replikationsursprung; ori+ = B. subtilis-Replikationsursprung; kan = Gen, das für Kanamycin-Acetyl-Transferase codiert; cat = Gen, das für Chloramphenicol-Acetyl-Transferase codiert, T1 = transkriptionaler Terminator.

Kompetenzinduktion bei E. coli-Stämmen:

E. coli-Stämme werden wie folgt kompetent gemacht, d. h. in die Lage versetzt, Fremd-DNA in die Zelle aufzunehmen: E. coli wurden in einer Übernachtkultur in einem Volumen von 5 ml in 2xTY-Medium vermehrt und dann in 100 ml des gleichen Mediums übertragen. Nach etwa zwei Stunden lag die optische Dichte, gemessen bei 600 nm, bei 0,8. Die Zellen wurden in einem Eisbad abgekühlt und bei 4000g für 5 Minuten zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in 50 ml einer 50 mM CaCl&sub2;-Lösung suspendiert und bei 3000g für 5 Minuten bei 0ºC zentrifugiert. Die Zellen wurden in 4 ml von 50 mM CaCl&sub2;, das 15% Glycerin enthielt, suspendiert. Diese kompetenten Zellen wurden in 1 ml aliquote Teile geteilt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70ºC für späteren Gebrauch aufbewahrt.

Kompetenzinduktion bei B. subtilis:

B. subtilis 1A40 wurde in einer Übernachtkultur in 5 ml 2xTY bei 37ºC vermehrt, abgetrennt und in 15 ml Wachstumsmedium 1 suspendiert [ (SMS = (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 0,2%, K&sub2;HPO&sub4; 1,4 %, KH&sub2;PO&sub4; 0,6 %, Na-Citrat 0,1 %, MgSO&sub4; 0,02 %)), Glukose 0,5 %, Casaminosäuren 0,05 %, Hefeextrakt 0,06 %, MgCl&sub2; 1,5 mM] und solange vermehrt, bis die optische Dichte 1,8 bei 600nm betrug. Die Kultur wurde dann in 150 ml des Wachstumsmediums 2 (SMS, Glukose 0,5 %, Casaminosäuren 0,01 %, Hefeextrakt 0,025 %, MgCl&sub2; 5mM, Ca(NO&sub3;)&sub2; 2,5 mM für 90 Minuten bei 37ºC übertragen. Nach Zentrifugation bei 8000 U/m für 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Sediment in 15 ml des Überstands suspendiert. Glycerin wurde mit 8 % zugesetzt und die Zellen wurden in 1 ml aliquoter Teile geteilt, die unter Verwendung von flüssigem N&sub2; schockgefroren und auf -70ºC gebracht wurden.

Transformation von E. coli Stämmen bei Plasmiden mit rekombinanter DNA:

Die Plasmid-DNA oder Ligationsmischung wurde Mikrozentrifugenröhrchen von 1 bis 10µl im Eisbad zugesetzt. Zu diesen wurde hinzugefügt: 250 µl kompetenter Zellen und 26 µl von 10xTMC (100 mM TRIS-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM CaCl&sub2;) und für 10 Minuten im Eisbad unter gelegentlichem vorsichtigen Umrühren gehalten. Die Zellen wurden für 2 Minuten einem Hitzeschock bei 42ºC ausgesetzt und ein ml von 2xTY wurde zugesetzt. Die Zellen wurden danach für eine Stunde bei 30ºC gehalten und dann 3 Minuten bei 8000g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden im übriggebliebenen Überstand (ca. 100 µl) suspendiert. Die Zellsuspension wurde auf Antibiotika-Selektionsplatten verteilt und diese wurden über Nacht bei 30ºC gehalten.

Transformation der B. subtilis mit Plasmiden mit rekombinanter DNA:

Ein ml gefrorener, kompetenter B. subtilis Zellen wurde schnell in einem 37ºC Wasserbad aufgetaut, und in 10ml SMS Verdünnungsmedium (SMS, Glukose 0,5%, MgCl&sub2; 20 mM, EDTA 1mM) verdünnt. Ein ml der verdünnten Zellen wurden mit 1_µg pCSS962 und 1 µg pBL1 vermischt und bei 37ºC für 30 Minuten unter Schütteln inkubiert. Danach wurden die Zellen auf 2xTY-Platten verteilt, die 10 µg/ml Kanamycin und Erythromycin enthielten. Die Platten wurden für 22 Stunden bei 30ºC inkubiert.

Beispiel 1:

Änderung der Kopienzahl des Plasmids bei Behandlung der Zellen mit Nalidixinsäure:

Das in der Erfindung beschriebene Plasmid pCSS123 ist ein Plasmid mit unkontrollierter Replikation, bei dem die Änderung der Kopienzahl durch Veränderung der Temperatur erreicht wird. Dies wird in Figur 8 dargestellt, in der die Menge und Qualität der Plasmid-DNA untersucht wird, die aus den wärmebehandelten E. coli Zellen extrahiert wurde. Die Wirkung eines Agens, von dem bekannt ist, daß es die DNA-Replikation hemmt, Nalidixinsäure, auf die DNA von Zellen und insbesondere auf die DNA von Plasmid pCSS123 ist in der Figur untersucht.
E. coli-pCSS123/JM103-Zellen wurden in 20 ml 2xTY-Medium bei 30ºC in vier Erlenmeyerkolben kultiviert bis die dekadische Extinktion, gemessen bei 600 nm, 0,3 betrug. Nalidixinsäure, ein bekannter Hemmstoff der DNA-Replikation, wurde so zugefügt, daß sie in einer Endkonzentration von 0, 1, 10 und 100 µg/ml vorlag. Sofort gezogene, parallele Proben von 1,5ml aus jedem Kolben wurden in 15 ml Röhrchen abgezweigt und für 20 Minuten bei 30ºC gehalten. Die Röhrchen wurden für eine Stunde auf 42ºC gebracht, während die Kolben auf 30ºC gehalten wurden. Danach wurden sowohl die Röhrchen als auch die Kolben für eine weitere Stunde bei 30ºC im Schüttler gehalten, wonach eine Extraktion der Gesamt-DNA aus jeweils 1,5 ml der Kulturen durchgeführt wurde. Die Zellen wurden zentrifugiert und das Sediment wurden in 500 µl von 50 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA suspendiert. Die Zellen wurden in einem Eisbad für 30 Minuten gehalten und 50 µl Lysozym (10mg/ml) wurde zugesetzt und im Eisbad für 45 Min. gehalten. Einhundert µl einer STEP-Lösung (0,5 % SDS, 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 0,4 M EDTA) wurde hinzugefügt und auf 50ºC für 60 Min. gehalten. Danach wurden 600 µl Phenol zugesetzt und die Röhrchen wurden vorsichtig für 5 Min. vermischt und 10 Min. bei 12000g zentrifugiert. Zwei Volumen reines Ethanol und Kaliumacetat, pH 6,0 zu 0,3 M, wurden dem Überstand zugesetzt, um die DNA auszufällen. Nach 30 Min. bei -70ºC wurden die Röhrchen für 10 Min. bei 12000g zentrifugiert und das Sediment mit 500 µl aus 70 %igem Ethanol gewaschen, zentrifugiert und das Sediment für 5 Min. in einem Vakuumtrockner getrocknet. Das getrocknete Sediment wurde in 50 µl einer Lösung aus 50 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 µg/ml RNase A gelöst und für 20 Min. bei 65ºC gehalten. Eine gebräuchliche Agarose-Gelelektrophorese-Analyse wurde für die extrahierte DNA durchgeführt. Dies ist in Figur 8 dargestellt, worin zu erkennen ist, daß sich die DNA-Menge der Proben, die nicht wärmebehandelt wurden, mit steigender Nalidixinsäure-Konzentration kaum ändert. Andererseits zeigen die Proben, die wärmebehandelt wurden, aber keine Nalidixinsäure enthielten, eine mehrfache Erhöhung der DNA- Plasmidmengen. Große Mengen von Nalidixinsäure in Gegenwart von Zellen, die entweder wärmebehandelt wurden oder nicht, änderten die Plasmid-Menge im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht. Aber schon 1µg Nalidixinsäure reichten aus, um eine deutliche Verringerung der Menge von DNA-Plasmiden in den wärmebehandelten Proben im Vergleich zu den unbehandelten Proben zu bewirken.

Beispiel 2:

Nachweis von toxischen Substanzen durch die Messung der Lichtproduktion von Zellen, die Plasmide enthalten, deren Kopienzahl verändert werden kann.

E. coli-pCSS123/JM103-Zellen, die in einer Übernachtkultur vermehrt wurden, wurden im Verhältnis 1: 1000 verdünnt. Verdünnte Zellen in 2xTY wurden genommen (0,5 ml) und verschiedene Mengen von Antibiotika oder anderer toxischer Substanzen wurden hinzugefügt. Diese Lösungen wurden für 20 Min. bei 30ºC inkubiert. Danach wurden die Proben für eine Stunde auf 42ºC gebracht. Jedes Röhrchen wurde dann auf 30ºC im Wasserbad temperiert und IPTG wurde zu 1 mM und n- Decanal zu 0,01 % zugesetzt. Die Röhrchen wurden in ein automatisches Lichtmeßgerät überführt, d.h. in Luminometer 1251 (LKB- Wallac, Turku, Finnland), dessen Meßkammer auf 30ºC vorgewärmt war. Die Messung der Lichtemission der Zellen wurde im Auto-Mode- Programm durchgeführt, so daß jedes Röhrchen automatische alle zwei Minuten gemessen wurde. Die Daten wurden im Speicher des Computers zur späteren Analyse gesammelt. In Figur 9a ist der Nachweis von Nalidixinsäure bei Verwendung von E. coli-Zellen gezeigt, die mit pCSS123-Plasmiden kloniert wurden. In der Figur ist erkennbar, daß schon 2 µg Nalidixinsäure bei den Meßbedingungen sehr schnell nachgewiesen werden können. In Figur 9b wird der Nachweis von Chloramphenicol mit Hilfe der gleichen Methode wie in Figur 9a dargestellt. Zur Klarheit wurden nur zwei Konzentrationen von Chloramphenicol mit den unbehandelten Kontrollproben verglichen. In Figur 9c wird der Nachweis des Schwermetalls Kadmium dargestellt, wobei die gleiche Methode wie in den Figuren 9a und 9b verwendet wurde.
Gefriergetrocknete E. coli pCSS123/BW322 wurden mit 1,0 ml 2XTY rekonstituiert und 45 µl davon wurden im Verhältnis 1:10 mit 2xTY verdünnt. Fünf µl Trimethoprim- Verdünnungen wurden zugesetzt und für 25 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, wonach die Zellen für 10 Minuten in einem 30ºC-Wasserbad temperiert und nach Zugabe von 0,001 % n-Decanal im LKB-Wallac 1250 manuellen Luminometer auf Lichtproduktion gemessen wurden. Die gleichen Konzentrationen von Trimethoprim zusammen mit rekonstituierten, gefriergetrockneten Zellen, die nicht wärmebehandelt wurden, dienten als Kontrollproben. Wie in Figur 9d erkennbar, ist die Empfindlichkeit des Testverfahrens sehr hoch. In Figur 9e wird der Nachweis von Oflaxacin dargestellt, wobei die gleiche Methode wie in Figur 9d verwendet wurde.
100 µl von rekonstituierten E. coli pCSS123/BW322 wurden auf eine Petrischale ausgestrichen. Durch Veränderung der Dauer wurde die Wirkung des UV-Lichts (254 nm) getestet. Danach wurden die Proben für 45 Min. auf 42ºC gebracht und n-Decanal wurde zu 0,01% hinzugefügt. Dies ist in Figur 9g zu sehen.
E. coli-pCSS302/BW322-Zellen wurden in einer Übernachtkultur vermehrt und in 2xTY verdünnt. 90 µl der verdünnten Zellen wurde abgenommen, und die Antibiotika wurden zugesetzt. Die Lösungen wurden für 20 Min. bei RT inkubiert. Danach wurden die Proben für 45 Min. auf 42ºC gebracht. Die Zellen wurden durch Hinzufügen von 100 µl einer Lösung, die 1 mM D-Luciferin und 1mM ATP in einem 0,1M Na-Citrat-Puffer, pH 5,0 enthielt, auf Lichtemission untersucht. In Figur 9g ist der Nachweis von Oflaxacin und in Figur 9h der Nachweis von Citrofloxacin gezeigt.
E. coli-pCSS305/BW322-Zellen wurden verwendet, um das System zu testen, wo keine Substratzugabe für eine Lichtemission aus Zellen notwendig war. Zu 90 µl der Zellen in 2xTY wurden 10 µl Antibiotika gegeben. Verschiedene Konzentrationen von Oflaxacin (Figur 9j) und Citrofloxacin (Figur 9i) wurden hinzugefügt und die Röhrchen wurden für 25 Min. auf RT gehalten. Danach wurde die Induktion durch Erhöhung der Temperatur auf 42ºC für 45 Min. bewirkt. Die Röhrchen wurden in den Luminometer zur Lichtemissionsmessung geladen.

Beispiel 3:

Nachweis von Antibiotika mit einem Verfahren, bei der die Kontrolle der Plasmidreplikation nicht möglich ist:

In diesem Beispiel wird ein Vergleich zwischen Plasmiden gezogen, bei denen die Expression von bakterieller Luciferasegene entweder von einem lac- (langsam) or einem pL-Promotor (schnell) kontrolliert wird. E. coli-Klone pCSS112/K-12λHIλtrp(cI857) wurden in einer Übernachtkultur in 2xTY-Medium vermehrt, das 100 µg/ml Ampicillin enthielt. Danach wurde eine geeignete Verdünnung in HBSS-Puffer oder in Milch angesetzt und 500 µl davon wurden in 3 ml Luminometer-Teströhrchen gefüllt. Die Röhrchen wurden bei 30ºC temperiert und verschiedene Mengen unterschiedlicher toxischer Substanzen wurden den Röhrchen zugesetzt. Die Röhrchen wurden für 20 Min. bei 30ºC gehalten, wonach die Temperatur für 10 Min. auf 42ºC erhöht wurde. Sodann wurden die Röhrchen zur automatisierten Messung in die Luminometer-Kammer verbracht, die auf 30ºC vorgewärmt war. Als Vergleich diente ein E. coli JM103-Klon, der das Plasmid pCSS108 enthielt, der, abgesehen von der Hitzeschock-Stufe, gleich behandelt worden war. In diesem Fall wurde die mRNA- und Proteinsynthese durch Zugabe von IPTG zu 1 mM in Gang gesetzt. In Figur 10 ist erkennbar, daß es bei der Plasmidkonstruktion, deren Proteinsynthese vom pL-Promotor bestimmt ist, möglich ist, toxische Substanzen in viel geringeren Konzentrationen aufzuspüren als bei Verwendung eines langsamen und schwächeren lac-Promotor. Im Fall von Chloramphenicol wird die Kinetik der Lichtproduktion in Figur 11a dargestellt, wobei das Plasmid pCSS112 im E. coli K- 12λHIλtrp(cI857)-Stamm verwendet wurde. Man kann in dieser Figur erkennen, daß Unterschiede in der gemessenen Aktivität (Lichtproduktion) von Anfang der Messung an sichtbar sind, selbst bei so niedrigen Konzentrationen wie 0,1 µl in der Küvette.
Der Nachweis von Antibiotika, die zur Penicillin-Familie gehören, ist von äußerster Wichtigkeit, da diese Antibiotika sehr gebräuchlich sind und es keine schnellen Verfahren gibt, um ihr Vorhandensein zu bestimmen. In Figur 11b wird der Nachweis von Ampicillin und auch Oxytetracyclin und Streptomycin unter Verwendung von B. subtilis 1A40-Zellen dargestellt, die mit Luciferasegenen eines Schnellkäfers kloniert wurden. Das in der Messung verwendete Plasmid ist in Figur 7c gezeigt. Bei Verwendung dieser Konstruktion kann die Produktion von Luciferase in B. subtilis einfach durch Hinzufügen von IPTG in Gang gesetzt werden, das an den lac- Repressor bindet, für den ein Helfer-Plasmid pBL1 codiert, das sich in derselben Zelle befindet. Nach Bindung an den Repressor ist dieser nicht mehr in der Lage, an die DNA-Region zwischen dem Phagenpromotor T5 und den Luciferasegenen zu binden, wodurch die Expression von Luciferase ermöglicht wird. Die Zellen, die beide Plasmide enthalten wurden einer Übernachtkultur in 2xTY vermehrt, das Erythromycin (10 µg/ml, um pBL1 in der Zelle zu halten) und Kanamycin (10 µg/ml, um pCSS962 in der Zelle zu halten). Eine geeignete Verdünnung wurde durchgeführt und verschiedene Mengen von Antibiotika wurden den Zellen zugesetzt. Nach einer Inkubationsdauer von 2 Stunden bei 30ºC wurden die Röhrchen nach Zugabe von 1 mM D-Luciferin-Substrat in 0,1 M Na-Citrat auf Lichtemission untersucht. Wie in der Figur zu sehen ist, können so geringe Mengen wie 0,1 µg/ml Ampicillin und sogar noch kleinere Mengen von Oxytetracyclin und Streptomycin nachgewiesen werden.

Beispiel 4:

Nachweis von toxischen Substanzen unter Verwendung eines Verfahrens, bei dem E. coli ein Plasmid mit rekombinanter DNA mit konstanter Kopienzahl enthält und bei dem der Promotor pL des Lambda-Phagen die Biosynthese von bakterieller Luciferase oder Schnellkäfer-Luciferase kontrolliert:

Nachfolgend werden einige Beispiele zum Nachweis von Substanzen dargestellt, die andere Biosynthesewege und den Metabolismus der Zellen beeinträchtigen. Die Tests wurden auf die gleiche Weise ausgeführt wie in den vorhergehenden Beispielen. Das Ziel ist es gewesen, eine extrem schnelle Methode zu entwickeln, die dabei aber auch sehr empfindlich ist. Das in den E. coli K-12-Stamm klonierte Plasmid pCSS112 wurde während aller folgenden Beispiele verwendet.
Die folgenden Figuren zeigen die Wirkung jeder getesteten Substanz mit Hilfe einer Messung der Lichtproduktion. Wie in vorhergehenden Messungen bewirkt die Anwesenheit eines Hemmfaktors eine Verringerung der Lichtproduktion im Vergleich zu Fällen, bei denen der Faktor nicht vorhanden ist. In Figur 12 ist der Nachweis eines Antibiotikums, Rifampicin, zu sehen, welches ein bekannter Hemmstoff bei der Transkription ist, d.h. bei der Bildung der Boten-RNA.
Eine so geringe Menge wie ein µg kann sehr schnell mit dem in dieser Erfindung beschriebenen Test optisch erkannt werden. Die Wirkung von Oxytetracyclin, das an die 305 ribosomale Untereinheit bindet, auf das hier beschriebene Meßsystem ist in Figur 13 dargestellt. Wie es bei Rifampicin der Fall war, ist auch hier die Wirkung dieses Antibiotikums stark und leicht zu erkennen. Die Wirkung von Sulphit, ein bekannter Stoffwechselhemmstoff, der in der lebensmittelverarbeitenden Industrie sehr gebräuchlich ist, ist in Figur 14a dargestellt. Die Wirkung von Schwermetallkadmium, ebenfalls ein bekannter Stoffwechselhemmstoff, der Boden und Wasser kontaminiert, ist in Figur 14b gezeigt. Diese Resultate zeigen, daß das in dieser Erfindung beschriebene Testsystem auch bei der schnellen Bestimmung von Stoffwechselhemmstoffen anwendbar ist. Außerdem zeigen sie, daß man mit Hilfe der Methode auch das Vorhandensein anderer Agenzien als Antibiotika nachweisen kann.
Man kann andere Luciferasen als die bakterielle Luciferase von V. harveyi verwenden, ohne daß der Test an Empfindlichkeit oder anderen Eigenschaften verliert. In Figur 15 ist eine Messung analog zu denen in den Figuren 13 und 14 gezeigt. In dem in diesem Test verwendeten Plasmid (pCSS301) wurde die bakterielle Luciferase durch Schnellkäfer-Luciferase ersetzt, wie in Figur 7b beschrieben. Der Test wurde im wesentlichen wie der mit bakterieller Luciferase durchgeführt, außer daß, nachdem die Zellen mit oder ohne toxische Substanzen für 10 Min. bei 42ºC inkubiert wurden, die Zellen nach 15 Minuten Temperierungszeit bei 30ºC durch Hinzufügen von 100 µl einer Lösung, die 1 mM D-Luciferin, 1mM ATP in 0,1 M Na-Citratpuffer, pH 5,0, auf Lichtproduktion untersucht wurden. Danach wurde die Lichtproduktion mit Hilfe eines manuellen Luminometers 1250 (LKB-Wallac, Turku, Finnland) gemessen. Wie aus der Figur erkennbar ist, liegt die Empfindlichkeit des Verfahrens zum Nachweis von Oxytetracyclin oder Rifampicin extrem hoch und ist vergleichbar mit dem Nachweis Hilfe von bakterieller Luciferase.

Beispiel 5:

Nachweis einer toxischen Substanz unter Verwendung eines Verfahrens, bei dem der Promotor pL des Lambda-Phagen die Biosynthesemechanismen aktiviert, um β-Galaktosidase herzustellen:

In den vorhergehenden Beispielen war die Basis der Messungen das von den Bakterien produzierte Licht, das durch die für Luciferase codierenden Gene bewirkt wurde. Als Protein kann man jedes beliebige Protein oder Peptid verwenden, für das es ein Meßverfahren gibt. In diesem Beispiel wurde das für Luciferase codierende Gen durch ein für β-Galactosidase codierendes Gen von E. coli ausgetauscht. Das verwendete Plasmid pPLcAT14 wurde bereits oben beschrieben (Stanssens, P., Remaut, E. & Fiers, W., 1985, GENE, 36, 211-223).
E. coli-Klone pPLcAT14/K-12λHIλtrp wurden in einer Übernachtkultur in 2xTY-Medium vermehrt, das mit 100 µg/ml Ampicillin versetzt war. Danach wurden die Bakterien in geeigneter Weise in HBSS-Puffer verdünnt und 80 µl davon wurden in Glasröhrchen gefüllt. Verschiedene Konzentrationen von Chloramphenicol wurden zugesetzt und die Röhrchen wurden für 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Nach der Inkubation wurde die Aktivierung des Promotors PL durch Erhöhung der Temperatur auf 42ºC für 30 Minuten durchgeführt. Als Folge davon werden die Biosynthesemechanismen aktiviert, um β- Galactosidase zu produzieren, für die das β-Galactosidase-Gen codiert, das unter dem Promotor PL in das Plasmid pPLcAT14 kloniert wurde. Nach der Induktion wird den Röhrchen Tuluol zu 10 % zugesetzt, das die Zellen für ONPG-Chemikalien durchlässig macht. β-Galactosidase bildet eine gelbe Farbe, die mit einem Spektrophotometer bei 420 nm nach Reaktion mit ONPG gemessen werden kann. Danach wurden die Röhrchen zentrifugiert und bei 420 nm gemessen. In Figur 16 wird die Wirkung von Chloramphenicol unter Verwendung unseres Verfahrens dargestellt, wobei das nachzuweisende Protein β-Galactosidase war und sein Substrat eine farbige Substanz produzierte.

Beispiel 6:

Nachweis von organischem Anteilen in einer Lösung unter Verwendung eines Verfahrens, bei dem der Promotor pL des Lambda-Phagen die Biosynthesemechanismen zur Herstellung von Luciferase aktiviert:

E. coli pCSS112/K-12λHIλtrp-Zellen wurden in einer Übernachtkultur in 2xTY Medium vermehrt, das Ampicillin (100 µg/ml) enthielt. Die Zellen wurden abgetrennt und zweimal mit HBSS-Medium (Korpela & Karp, 1988, Biotech. Lett., 10, 383-388) gewaschen, das keinen Traubenzucker und keine Gelatine enthielt, das aber mit 0,02 % Tryptophan versetzt war. Die Zellen wurden geschüttelt bei diesem Medium für weitere 4 Stunden geschüttelt, zentrifugiert und in HBSS-Puffer suspendiert, der entweder 0,1 % Glukose oder 0,1 % (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; enthielt, je nachdem, ob Kohlenstofflieferanten bzw. Stickstofflieferanten bewertet werden sollten. Von den behandelten Zellen wurde eine geeignete Verdünnung in Minimal-Salz-Lösung angesetzt, dann wurden verschiedene Mengen von entweder Kohlenstoff- oder Stickstofflieferanten zugesetzt und die Zellen für 10 Minuten bei 30ºC inkubiert. Die Zellen wurden für 10 Minuten einer Wärmebehandlung bei 42ºC unterzogen, um die Proteinsynthese in Gang zu setzen, wonach die Zellen 10 Minuten bei 30ºC temperiert wurden, bevor die Röhrchen nach Zugabe von n-Decanal zu 0.001 % in den auf Automatik gestellten Luminometer zur Lichtproduktionsmessung geladen wurden. Die Figur 17a zeigt den Nachweis von Glukose. Tabelle 1 Biochemische Ziele für Arzneimittelwirkung Zellwände Inhibitoren der Proteinsynthese Inhibitoren der Nudeinsäuresynthese Beta-Lactame Cephalosporine Bacitracin Vancomycin Polymyxine Gramicidine Valinomycin Chloramphenicol Tetracycline Aminoglycoside Makrolide Erythromycin Lincomycin Puromycin Nalidixinsäure Novobiocin Rifamcine Phleomycin Mithramycin Actinomycin Quinolone

Claims

1. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung der Menge eines Faktors in einer zu untersuchenden Probe, wobei der Faktor die DNA, RNA und/oder Zellproteine oder deren Synthesemechanismen direkt oder indirekt beeinträchtigen kann, gekennzeichnet durch

a) Inkubation einer zu untersuchenden Probe mit einer Population aus transformierten Zellen für eine Dauer, die für den genannten Faktor, wenn er in der Probe vorhanden ist, ausreicht, um die genannten Zellen zu beeinträchtigen, wobei die genannten Zellen durch ein rekombinantes DNA-Plasmid transformiert werden und die Replikation des genannten Plasmids einem regulierbaren Promotor unterworfen ist, der durch einen exogenen Reiz unabhängig von der Replikation der Zellen induziert werden kann;

b) nachfolgendes Einwirken des genannten exogenen Reizes auf die Zellen, um die Replikation des genannten Plasmids zu induzieren, worauf die Kopienzahl des Plasmids in der Zelle anzusteigen beginnt, sofern der Faktor das Plasmid nicht durch Hemmung der Replikation beeinträchtigt hat ; und

c) direkte oder indirekte Bestimmung der Veränderung der Kopienzahl des rekombinanten DNA-Plasmids in der Zelle und Vergleich mit einem Vergleichstest, bei dem der Faktor nicht vorhanden oder bei dem er in bekannter Menge vorhanden war, wodurch der Nachweis des Faktors erbracht oder die Menge des Faktors bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Plasmid eine DNA-Sequenz aufweist, die zumindest für ein ausgewähltes Protein oder einen Teil desselben kodiert, der unentbehrlich für die biologische Aktivität des genannten Proteins ist, und wobei das rekombinante DNA-Plasmid eine oder mehrere DNA-Sequenzen umfassen kann, die die Zelle resistent gegenüber einem Antibiotikum, einem Schwermetall oder einem Toxin machen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Protein kodierende DNA-Sequenz einem regulierbaren Promotor unterworfen ist, der durch positive oder negative Rückkopplung kontrolliert wird und in den genannten Zellen regulierbar ist und gleichzeitig mit oder zu einem beliebigen Zeitpunkt nach der Einleitung der Plasmidreplikation aktiviert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Faktor ein Faktor ist, der die Biosynthese oder die Replikation des rekombinanten DNA-Plasmids, die Biosynthese der RNA, die Transkription, die Translation, die Zellmembranen, den Metabolismus oder die Enzymaktivität beeinträchtigt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Faktor Aflatoxin, Schwermetall, Ethidiumbromid, Nalidixinsäure, Trimethoprim, Fluoroquinolon, Aminoglycosid, Penicillin, Cephalosporin, Rifampicin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Sulfonamid ist und die verwendete Zelle gegenüber dem zu bestimmenden Faktor empfindlich ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle Escherichia coli ist und der in den Bakterien enthaltene Mechanismus, der für die Replikation des rekombinanten DNA-Plasmids verantwortlich ist, präzise mit Hilfe eines starken Promotors, wie z. B. lambda PL und PR Promotoren, lac, trp, verschiedene Hybridpromotoren wie z. B. tac und künstliche Promotoren reguliert werden kann.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Plasmid pCSS123, pCSS302 oder pCSS305 ist.

8. Verfahren zum Nachweis oder zur Mengenbestimmung eines Faktors in einer zu untersuchenden Probe, wobei der Faktor direkt oder indirekt die DNA, RNA und/oder Proteine der Zelle oder deren Synthesemechanismen beeinträchtigt, gekennzeichnet durch

a) Inkubation einer zu untersuchenden Probe mit einer Population transformierter Zellen für eine Dauer, die für den genannten Faktor, wenn er in der Probe vorhanden ist, ausreicht, um die genannten Zellen zu beeinträchtigen, wobei die genannten Zellen durch ein rekombinantes DNA-Plasmid mit hoher Kopienzahl transformiert werden, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die für ein Markerprotein oder für einen Teil davon kodiert, der für die biologische Aktivität des Proteins unentbehrlich ist, wobei diese Sequenz mit einem regulierbaren Promotor gekoppelt ist, so daß die Expression des genannten Markerproteins durch einen exogenen Reiz induzierbar ist;

b) nachfolgende Einwirkung des genannten exogenen Reizes auf die genannte Zellpopulation, um die Expression des genannten Markerproteins zu induzieren, wobei die Menge des Markerproteins in der Zelle anwächst, wenn der Faktor die Proteinsynthese nicht direkt oder indirekt beeinflußt hat;

c) Bestimmung des von der genannten Zellpopulation exprimierten Markerproteins und Vergleich mit einem Vergleichstest, bei dem der Faktor nicht vorhanden oder bei dem er in bekannter Menge vorhanden war, wodurch der Nachweis des Faktors erbracht oder die Menge des Faktors bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ein gramnegatives oder grampositives Bakterium ist, z. B. eines der Enterobacteriaceae-Gruppe, vorzugsweise Escherichia coli, oder eines der Bacillus-Gruppe, vorzugsweise Bacillus subtilis.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der exogene Reiz entweder von der chromosomalen DNA der Wirtszelle, einem Plasmid der Zelle, das zu einer anderen Inkompatibilitätsklasse gehört, dem gleichen Plasmid, einem lytischen oder lysogenen Phagen oder Virus ausgeht, oder der exogene Reiz wird von außerhalb der Zellen zugeführt wird, zum Beispiel durch Zugabe von chemischen Verbindungen, Temperaturänderungen oder durch Strahlung.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Plasmid eine oder mehrere DNA- Sequenzen aufweisen kann, die die Zelle gegenüber Antibiotika, Schwermetallen oder Toxinen resistent machen.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die untersuchte Probe ein Aerosol mit gasförmigen, flüssigen oder festen Bestandteilen ist, oder die Probe radioaktiv, ultraviolett oder anderweitig strahlend ist und biologischen oder nicht-biologischen Ursprungs ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 8 dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor der Bestimmung in einer geeigneten Flüssigkeit oder Kulturmedium gefriergetrocknet und rehydratisiert werden.

14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Faktor ein Faktor ist, der die Biosynthese der DNA, die Biosynthese der RNA, die Transkription, die Translation, die Zellmembranen oder den Metabolismus der Zelle beeinflußt, die das genannte rekombinante Plasmid enthält, wie z. B. ein Mutagen, ein Antibiotikum, ein Schwermetall oder ein Toxin.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle ein Bacillus subtilis ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Markerprotein im rekombinanten DNA-Plasmid einem regulierbaren starken Promotor unterworfen ist, wie z. B. Φ 105, Phage T5-Promotor, der von einem lac-Operator kontrolliert wird, oder ein Saccharose-regulierbarer Promotor, und daß das Markerprotein Alpha-Amylase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Luciferase, Peroxidase, T4-Lysozym, β-Glucuronidase, Oxidoreductase oder Pyrophosphatase ist.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle Escherichia coli ist.

18. Verfahren nach Anspruch 6 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Plasmid eine DNA-Sequenz umfaßt, die für das Protein eines Virus, einer prokariotischen Zelle oder einer eukaryotischen Zelle kodiert oder deren für die biologische Aktivität unentbehrlichen Teil, und daß die Expression des Proteins mit Hilfe eines regulierbaren Promotors kontrolliert werden kann, wie z. B. lac-, trp-, PL- und PR-Promotoren, verschiedene Hybridpromotoren wie z. B. tac oder künstliche Promotoren.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Luciferase, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, T4-Lysozym, β-Glucuronidase, Oxidoreductase oder Pyrophosphatase ist.

20. Verfahren nach Anspruch 16 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Plasmid für die Luciferase von Vibrio harveyi oder für eine andere Bakterienluciferase oder für Käferluciferase kodiert.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das rekombinante DNA-Plasmid ein pCSS112-, pCSS301- oder pCSS962-Plasmid ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß Aldehyd oder Luciferin der Reaktion zugegeben werden, wenn die Menge/Aktivität der exprimierten Luciferase in den Bakterien gemessen wird.

23. Verfahren nach Anspruch 4, 5 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung bei Milch, Serum oder Wasser durchgeführt wird.