DE69022034T2

DE69022034T2 - Verfahren zur herstellung von vesikeln.

Info

Publication number: DE69022034T2
Application number: DE69022034T
Authority: DE
Inventors: Kevin Bracken
Original assignee: Vestar Inc
Current assignee: Nexstar Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-01-27
Filing date: 1990-01-22
Publication date: 1996-04-11
Anticipated expiration: 2010-01-23
Also published as: ATE127014T1; EP0457833B1; US4935171A; WO1990008535A1; DE69022034D1; ES2075894T3; JPH04504527A; DK0457833T3; EP0457833A4; EP0457833A1; AU5103990A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Bildung mizellarer Lipidpartikel und insbesondere auf die koinmerzielle Herstellung von Phospholipidvesikeln.

Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung

Mizellare Lipidpartikel in Form von Vesikeln, auch als Liposome bekannt, sind bekannt und können im Labor durch die Bildung eines Lipidfilms durch Rotationsverdampfung eines organischen Lösungsmittels, gefolgt von der Hydratation des Lipidfilms unter Anwendung von Beschallungs-, Dialyse-, Injektionsoder Umkehrphasenverdampfung, um die Liposome zu bilden, hergestellt werden.
Solche Laborverfahren waren bislang schwierig anzupassen, um Liposome in kommerziellen Mengen bzw. Handelsmengen herzustellen. Im allgemeinen wird der Lipidfilm oder das -pulver in einem ersten Schritt gebildet, z.B. durch Sprühtrocknen des Lipids, und dann wird dieser Film in einer separaten Vorrichtung hydratisiert. Ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung bedeutender Mengen kleiner unilamellarer Vesikeln durch die Hydratation eines getrockneten Lipidfilms in einer Homogenisierungseinrichtung ist zum Beispiel in US-Patent Nr. 4 753 788 beschrieben. Bestehende Verfahren zur Herstellung von Liposomen sehen jedoch nicht die Bildung von Lipidfilmen und deren Verarbeitung zu Vesikeln in einem einzigen Behälter vor, was bedeutende Vorteile bei der Produktion von Liposomen, insbesondere von multilamellaren Vesikeln (MLVs), in einer sterilen Umgebung liefern wurde. Ein solches Verfahren wäre insofern vorteilhaft, als MLVs nicht durch Filtration oder Hitzesterilisation für einen pharmazeutischen Gebrauch sterilisiert werden können. Außerdem liefert die bestehende Technik kein Verfahren für die effektive Großfabrikation von Liposomen, welche ein amphiphiles oder lipophiles (d.h. hydrophobes) Heilmittel enthalten, das in dem Lipidfilm gelöst sein muß, in einem einzigen Gefäß, und die Überführung eines eine Arznei enthaltenden Lipidfilms aus einem Verdampfungsgefäß zu einem Hydratationsgefäß kann bedeutende Probleme nach sich ziehen.
Folglich war es ein Bedürfnis, eine Vorrichtung und ein Verfahren sowohl zur Herstellung als auch zur Hydratation eines Lipidfilms bereitzustellen, um Liposome in einem einzigen Gefäß in Mengen und unter Bedingungen zu bilden, welche an die kommerzielle Herstellung anpaßbar sind.
Die Erfindung kann kurz als Verfahren und Vorrichtung zur Bildung von Vesikeln aus amphiphilem Lipidmaterial in einer wäßrigen Phase zusarninengefaßt werden, welche die Verwendung eines modifizierten Dünnschichtverdampfers sowohl für den Filmbildungs- als auch den Lipidhydratationsschritt der Liposombildung umfaßt. Insbesondere beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Bildung von Liposomen, vorzugsweise multilamellaren Vesikeln, das die Schritte des Einführens einer Mischung, die ein amphiphiles Lipidmaterial enthält (das vorzugsweise ein amphiphiles oder lipophiles biologisch aktives Mittel enthält), und einer Flüssigkeit in eine geschlossene Kammer mit einer zylindrischen Innenwand, einer drehbaren Welle, die bezüglich der Wand koaxial angeordnet ist und wenigstens einen Rotorflügel aufweist, der daran befestigt ist und sich davon radial bis zu einem Filmbildungsabstand von der Wand erstreckt, des Bildens eines Films aus dem Lipidmaterial auf der Wand durch Drehung des Flügels und Verdampfung der Flüssigkeit, des Einführens einer wäßrigen Phase in die Kammer und des Hydratisierens des Films durch Drehen des Flügels mit einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um Liposome zu bilden, umfaßt.
Vorzugsweise ist der Lipidfilm gleichmäßig dick, und im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit, die in die geschlossene Kammer während des Filmbildungsvorgangs eingeführt wurde, wird vor der Einführung der wäßrigen Phase in die Kammer verdampft.
Das Verfahren der Erfindung sieht die Verwendung der beschriebenen Vorrichtung vor, bei der die Filmbildungszone zwischen dem Rotorflügel (den Rotorflügeln) und der Wand gleichmäßig dick ist, d.h. die Zone ist frei von Schwankungen in der Dicke, die unvollstandiges oder ungleichmäßiges Trocknen der Lipidmischung hervorrufen, und ist insbesondere frei von Vertiefungen in dem dem Rotorflügel benachbarten Wandabschnitt. Die Vorrichtung beinhaltet einen Fluidzufuhreinlaß und einen Fluidauslaß in Fluidverbindung mit der Kammer, die jeweils in einer Weise angeordnet sind, die die gleichmäßige Dicke der Filmbildungszone erhält, z.B. sind weder die Einlaß- noch die Auslaßöffnung innerhalb der Zone den Rotorflügeln radial benachbart angeordnet. Vorzugsweise ist der Fluidauslaß entweder an einem Ende der geschlossenen Kammer außerhalb der Filmbildungszone angeordnet oder umfaßt ein Ventil, das eine ebene Oberfläche bereitstellt, die mit der Oberfläche der geschlossenen Kammer bündig ist, um eine solche gleichmäßige Dicke aufrechtzuerhalten.
Weitere Aspekter der Erfindung werden beim Lesen der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung deutlich.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausfunrungsform

Dünnschichtverdampfer sind als Konzentrierungsvorrichtungen mit kontinuierlicher Zufuhr für eine Reihe von Lösungen bekannt, wobei eine relativ verdünnte Lösung in die Verdampferkammer eingeführt wird, ein dünner Film dieser Lösung auf einer inneren Wärmeaustauschoberfläche durch Flügel an einer Rotorwelle gebildet wird und der Film durch Fluiddruck auf die verdünnten Lösung, schraubenförmige Rotorflügel oder, im Falle von vertikalen Verdampfern, durch Gravitation axial zu einem Produktauslaß hin bewegt wird. Wenn der dünne Film gebildet ist, verdampft durch die Wand übertragene Wärme und/oder auf die Kammer angewendet er Unterdruck Lösungsmittel und konzentriert die Lösung, die zur weiteren Behandlung kontinuierlich, z.B. als fließfähiger Schlamm, durch einen Fluidauslaß abgezogen wird oder aus einem offenen Ende der Kammer strömt. Somit sind vorhandene Dünnschichtverdampfer Durchfluß-, d.h. offene, Systeme im Gegensatz zu dem modifizierten Dünnschichtverdampfer der Erfindung, bei dem eine geschlossene Kammer in einem diskontinuierlichen Verfahren sowohl für die Filmbildung als auch die Hydratation des Films eingesetzt wird.
Die Erfindung kann mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, in denen:
Fig. 1 eine schematische Querschnittsansicht einer Dünnschichtverdampfervorrichtung ist, die an die vorliegende Erfindung angepaßt ist,
Fig. 2 eine Schnittansicht entlang der Linie 2-2 in Fig. 1 ist und
Fig. 3 eine schematische Querschnittsansicht einer alternativen Ausführungsform eines Verdampfers zur Verwendung bei der Erfindung ist.
Da der grundlegende Aufbau von Dünnschichtverdampfern den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt ist, ist die Beschreibung der Vorrichtung in ihrer Form allgemein, mit Bezug auf allgemein bekannte Gegenstände, und konzentriert sich in erster Linie auf neue Merkmale, die die Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung ermöglichen.
Fig. 1 und 2 sind schematische Ansichten eines Dünnschichtverdampfers und zeigen eine Verdampfervorrichtung 10, die ein Gehäuse 12 umfaßt, das eine geschlossene oder verschließbare bzw. abdichtbare innere zylindrische Kammer 14 bildet. Die Kammer 14 ist von einer inneren Wärmeübertragungswand 16 genau definiert, die Wärme zwischen der Kammer 14 und einem Wärmeaustauschmantel 18 überträgt. Fluid tritt durch einen Einlaß 20 in den Mantel 18 ein und verläßt den Mantel über einen Auslaß 22, wobei es von einer geeigneten äußeren Heizung oder Kühlvorrichtung zyklisch durchläuft, um in der Kammer 14 die richtige Temperatur zu liefern.
Ein Rotor 30 ist in der Kammer 14 durch ein Traglager, nicht ausdrücklich gezeigt, innerhalb eines Endflansches 34 an einer drehbaren Welle 32 angeordnet. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet klar, daß der Flansch auch eine Dichtungseinrichtung beinhaltet, um zu ermöglichen, in der Kammer 14 ein bedeutendes Vakuum, mit einem so niedrigen Druck wie 2,67 Pa (20 um), zu erreichen. Die Welle 32 wird von einem Elektromotor, nicht gezeigt, angetrieben, der bei dieser Ausführungsform die Welle bei regelbaren Drehzahlen bis zu 3600 U/min dreht.
An der drehbaren Welle sind zur Drehung mit ihr Rotorflügel 36 befestigt und erstrecken sich radial von der Rotorwellenachse bis zu einem Filmbildungsabstand 38 von der Wand 16 und erstrecken sich axial entlang der Wand, um eine Filmbildungszone zwischen den Rotorflügeln und einem den Rotorflügeln benachbarten Filmbildungsabschnitt der Wand zu definieren, wobei die Zone gleichmäßig dick und frei von Vertiefungen ist. Eine große Vielfalt von Dünnschichtverdampferflügeln und Rotortypen kann bei der Erfindung eingesetzt werden. Der Begriff Flügel, wie er hier verwendet wird, soll jegliche Fortsatzeinrichtung von einer sich drehenden Welle einschließen, die fähig ist, an den Wänden der Kammer eines Dünnschichtverdampfers einen Film zu bilden.
Für die meisten Liposome bildenden Lösungen sollte der Abstand zwischen den Rotorflügeln und der zylindrischen Wand etwa 0,75 mm betragen, obwohl der Abstand in erster Linie von der Viskosität der zugeführten Lösung äbhängt und von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ohne übermäßiges Experimentieren berechnet werden kann. Im allgemeinen wird bei dem Verfahren die größte Effizienz durch Aufrechterhalten des größtmöglichen Abstandes, der die Homogenität des gegossenen Films aufrechterhält, erreicht. Der Rotor 30 ist an der Welle 32 in einem Nabenelement 40, das an der Kreuzung der Flügel 36 angeordnet ist, mit einer Vielzahl mit Gewinde versehener Befestigungselemente 42, wie sie in Fig. 2 gezeigt sind, befestigt.
Ausgangsmaterial tritt in die Vorrichtung 10 durch ein Einlaßanschlußstück 50 ein und fließt über einen Zufuhreinlaß 52 in die Kammer 14. Sowohl ein Materialauslaß 54 und ein Dampfauslaß 56 an dem gegenüberliegenden Bnde des Gehäuses 12 als auch ein in einer Endabdeckung 60 angeordnetes Schauglas 58 sind in Fig. 1 gezeigt. Das Materialauslaßventil 54 ist am oberen (stromabwärtigen) Ende jenseits der Filmbildungszone angeordnet, die von den Rotorflügeln definiert ist, wodurch die Vertiefung vermieden wird, die in der Wand der Zone gebildet würde, wenn der offene Auslaß den Flügeln radial benachbart (innerhalb der Zone) läge, wie er in früheren Verdampfern angeordnet war.
Eine alternative Ausführungsform ist in Fig. 3 gezeigt, in der gleiche Bezugszahlen verwendet werden, um ähnliche Merkmale zu beschreiben. Ein Verdampfer 70 besitzt ein Gehäuse 72, das eine innere zylindrische Kammer 14 enthält. Die Kammer 14 ist bei dieser Ausführungsform wieder durch eine innere Wärmeübertragungswand 16 definiert, die Wärme zwischen der Kammer 14 und einem Wärmeaustauschmantel 18 überträgt. Fluid tritt durch einen Einlaß 20 in den Mantel 18 ein und verläßt den Mantel über einen Auslaß 22, wobei es wie mit Bezug auf Fig. 1 beschrieben zyklisch durchläuft.
Ein Rotor 80, der bei dieser Ausführungsform Rotorflügel 81 beinhaltet, die durch Halter 82 mit Abstand von der Welle 32 angeordnet sind, ist in der Kammer 14 durch Traglager, nicht genau gezeigt, in Flanschen 83 und 84 an einer drehbaren Welle 32 angebracht, wobei die letzteren am Antriebsende des Verdampfers durch Befestigungselemente 86 angebracht sind. Für Fachleute auf dem Gebiet ist klar, daß die Flansche auch Dichtungsmittel beinhalten, wie schematisch durch die Endabschnitte 88 und 90 angegeben, um zu ermöglichen, ein bedeutendes Vakuum in der Kammer 14 zu erreichen. In der Praxis sind die Wellen durch mit Wasser gespülten Stopfbüchsen (stuffing boxes) mit Gleitringdichtung abgedichtet, wie es in der Technik bekannt ist.
Die Vorrichtung 70 beinhaltet wenigstens einen Schauglasaufbau 92 im Flansch 84, der der Bedienperson gestattet, den Inhalt der Kammer 14 zu sehen. Die Rotorflügel 81 sind zur Drehung mit der drehbaren Welle an dieser befestigt und erstrecken sich, wie im Falle der Flügel 36, radial von der Rotorwellenachse bis zu einem Filmbildungsabstand 38 von der Wand 16 und definieren eine Filmbildungszone zwischen den Rotorflügeln und einem den Rotorflügeln benachbarten Filmbildungsabschnitt der Wand, wobei die Zone gleichmäßig dick und frei von Vertiefungen ist. Ausgangsmaterial tritt durch ein Einlaßanschlußstück 50 in die Vorrichtung 10 ein und strömt über einen Zufuhreinlaß 52 in die Kammer 14, und ein Dampfauslaß 56 ist am gegenüberliegenden Ende des Gehäuses 72 gezeigt.
Es zeigte sich, daß ein Materialauslaßventil des mit der Bezugszahl 100 bezeichneten Typs in Flansch 83 bedeutende Vorteile verschaffte. Dieses Ventil beinhaltet einen Plunger 102, der die gesamte innere Ventilbohrung einnimmt, wenn er in der geschlossenen Position wie in der Zeichnung gezeigt ist, wobei er eine Oberfläche hinterläßt, die mit der Innenfläche der Kammer 14 bündig ist. Es ist zu sehen, daß der untere Abschnitt der Bohrung des Ventils 100 in gleicher Höhe mit der untersten Kante der zylindrischen Wand 16 ist, so daß ein vollstandiges Ablaufen der hydratisierten Lösung aus der Kammer sichergestellt ist.
Das Ventil 100 beinhaltet einen Körper 103 und ein Einlaßrohr 104 und einen mit der Bezugszahl 106 bezeichneten, am Griff mit einem Gewinde versehenen Schaftaufbau, der so arbeitet, daß er den Plunger 102 zuruckzieht und vorschiebt. Ventile dieses Typs werden von Fetterolf Corporation, Skippack, Pennsylvania unter dem Warenzeichen RAM-SEAL hergestellt und verkauft.
Es ist klar, daß beim Betrieb der Vorrichtung das filmbildende Lipid während des Einströmens und Verdampfens der Flüssigkeit innerhalb der Zone 38 gehalten werden muß. Aus diesem Grund ist es vorzugsweise wichtig, den Dünnschichtverdampfer in einem Winkel von 5-10º gegenüber der Horizontalen mit dem Einlaßende (den Flanschen 34 und 83 in Fig. 1 bzw. 3) an einer niedrigeren Position zu halten.
Das Verfahren beginnt mit der Herstellung einer Lösung oder Dispersion aus Materialien, die fähig sind, hydratisiert zu werden, um Liposome zu bilden, wobei solche Materialien den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Somit kann eine Reihe amphiphiler Lipidmaterialien bei dem Verfahren und der Vorrichtung der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise werden Phosphoglyceride oder Phospholipide, wie beispielsweise Dipalmitoyl und Distearoylphosphatidcholin allein oder in Verbindung mit Cholesterin, in Chloroform, Ethanol oder anderen organischen Lösungsmitteln gelöst. Wie in den Beispielen beschrieben, können vor der Hydratation einer oder mehrere aufeinanderfolgende Filme in dem Verdampfer ausgebildet werden.
Wenn ein lipophiles oder amphiphiles Mittel oder Inhaltsstoff in den Liposomen enthalten sein soll, kann diese Mittel der Lipidlösung beigefügt werden. Hydrophile Mittel können der hydratisierenden Lösung beigefügt werden. Jedes Heil- oder Diagnosemittel, das nach Laborverfahren in Liposome inkorporiert werden kann, kann verwendet werden, um die erfindungsgemäßen MLVs zu bilden, obwohl bessere Ergebnisse bei der Einkapselung von Anthracyclinen, wie beispielsweise Doxorubicin, gezeigt wurden. Wenn SUVs erwunscht sind, kann die aus dem Dünnschichtverdampfer abgezogene Suspension weiter verarbeitet werden, z.B. in der modifizierten Homogenisierungsvorrichtung, wie sie in US-Patent Nr. 4 753 788 beschrieben wurde, um kleinere Vesikeln zu bilden.
Verfahren und Materialien zur Herstellung solcher Lösungen aus amphiphilen Materialien sind in der Technik bekannt und werden hier nicht ausführlich beschrieben. Wenn die Liposome für pharmazeutische Zwecke verwendet werden sollen, wird die Herstellung unter aseptischen Bedingungen vorgenommen. Dies erfolgt durch Sterilisierung der Verdampferkammer, durch Techniken, bei denen im Autoklaven oder an der Verwendungsstelle mit Dampf behandelt wird (autoclaving or steam-in-place techniques) - je nach spezieller Größe des Verdampfers - und Zuführen und Abziehen des Materials unter sterilen Bedingungen, wobei z.B. alle eingelassenen Fluide durch sterile Filter der Kammer zugeführt werden.
Die Lipidlösung wird, während der Rotor arbeitet, über eine an einem Einlaßanschlußstück 50 angebrachte Leitung in die Vorrichtung eingeführt und durch einen Unterdruck, z.B. etwa 90,67kPa (68 cm Quecksilber), der von einer an dem Dampfauslaß 56 angebrachten Vakuumpumpe erzeugt wird, angesaugt. Alternativ kann eine peristaltische Pumpe eingesetzt werden, um die Kammer zu beladen. Obwohl der Rotor in den folgenden Beispielen mit einer Geschwindigkeit von 3600 U/min betrieben wurde, ist eine bedeutende Anderung der Rotorgeschwindigkeit möglich, und die optimale Geschwindigkeit für ein spezielles Lipid kann durch das Schauglas durch Einstellung des Motorantriebs mit regelbarer Drehzahl ohne übermäßiges Experimentieren visuell bestimmt werden.
Die Menge der zum Füllen der Kammer erforderlichen Lösung kann experimentell durch Nutzung des Schauglases am oberen Ende der Vorrichtung bestimmt werden. Wenn die Lösung in die Kammer gesaugt wird, verteilt die Zentrifugalkraft die Flüssigkeit auf den inneren Wärmeübertragungswänden, deren Temperatur durch Wiederumlauf von Wasser mit geeigneter Temperatur im Wärmeaustauschmantel bei etwa 30ºC (für das Lösungsmittel Chloroform) gehalten wird. Gleichzeitig wird in der Kammer ein Grobvakuum, typischerweise 66,5 bis 95,76 kPa (50 bis 72 cm Hg) aufgebaut. Somit verdampft das Lösungsmittel der Lösung an den Wänden der Kammer und wird durch den Auslaß 56 aus der Kammer gesaugt. Da der Einlaß 52 an einer Oberkante der Kammer angeordnet ist, kann der Einlaß von Lipid und Lösungsmittel trocken bzw. frei gepumpt werden, wenn die Kammer gefüllt ist, um restliches unverdampftes Lösungsmittel in der Kammer während der Hydratation zu vermeiden.
Die Menge der in die Kammer eingeführten Lösung wird anfangs durch Sehen durch das Schauglas und Aufrechterhalten der Flüssigkeitsströmung, bis die Flüssigkeit das Ende (das obere Bnde) der Filmbildungszone, d.h. das stromabwärtige Ende des Rotors erreicht, bestimmt. An diesem Punkt wird das Einströmen der Lösung gestoppt, ihr wird gestattet zu trocknen, und dann wird zusätzliche Lösung zugegeben, bis der Rotor zu vibrieren beginnt, was anzeigt, daß die Rotorenden an dem Film in der Kammer reißen und somit das maximale Fassungsvermögen erreicht wurde. Die Gesamtmenge der zugegebenen Lösung kann in einem ersten Durchlauf gemessen werden, und diese Menge kann in den nachfolgenden Arbeitsgängen eingesetzt werden.
Nach dem Gießen des Films wird der Rotor angehalten, und der Film kann, falls nötig, einem erhöhten Vakuum (Druck von ca. 13,33 Pa (100 um)) wenigstens 1/2 Stunde lang unterworfen werden, um den Film vollständig zu trocknen. Dies wird von einem leichten Spülen der Kammer mit Luft oder vorzugsweise einem Inertgas, wie beispielsweise Stickstoff, (das durch den Einlaß 50 eingelassen wird) gefolgt, um das hohe Vakuum zu vermindern. Die hydratisierende Lösung wird dann durch den Einlaß 50 eingelassen, wobei ihre Menge durch die gewünschte Konzentration der Liposomdispersion bestimmt wird.
Während dieses Füll- und Hydratisierschritts kann das Material ständig mit Stickstoff gespült werden, um eine Oxidation der Komponenten zu vermeiden. Der Betrieb des Rotors wird dann für einen für die Liposomenbildung ausreichenden Zeitraum, vorzugsweise eine halbe bis eine Stunde, wieder aufgenommen, während dem die Bewegung des Rotors den Film von der Wand zieht und Vesikeln in der wäßrigen Phase bildet. Die Temperatur der Innenwand wird während des Hydratisierungsvorgangs in den folgenden Beispielen bei etwa 30ºC gehalten, obwohl bei alternativen Mischungen andere Temperaturen vorteilhaft angewendet werden könnten. Der Liposomenbildung folgend wird die wäßrige Dispersion aus der Kammer über den Materialauslaß entfernt, während die Stickstoffspülung aufrechterhalten wird.
Der Entfernung der Dispersion folgend kann die Vorrichtung leicht durch Verwendung geeigneter Lösungsmittel gereinigt werden. Die Lipide können zum Beispiel mit einer Natriumhydroxidlösung entfernt werden, und Lösungsmittel für die Heilmittel, z.B. Bleichmittel HCl für Doxorubicin, werden sofort offenbar.

BEISPIEL I

Bildung mulitlamellarer Vesikeln mit DSPC/CHOL von 2:1

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung eines Artisan-1/4 sq. ft.-Dünnschichtverdampfers, der in Fig. 1 schematisch gezeigt ist, für die Herstellung von Filmen und die Hydratation von Filmen zu Liposomen. Bei diesem Verdampfer war das Gehäusevolumen 385,98 cm³ (einschließlich des von dem Rotor eingenommenen Raumes), und das maximale Fassungsvermögen des Raums zwischen Rotor und Gehäuse wurde für das Beschickungsvolumen berechnet.
Innendurchmesser des Gehäuses: 50,80 mm ± 0,05
Außendurchmesser des Rotors: 49,28 mm ± 0,05
Abstand = 1,524 mm Rotorlänge = 190,5 mm
Zonenvolumen = 190,5 π [(50,8/2)² - (49,28/2)²]
= 22754 mm³ x 0,001 = 22,75 cm³, etwa 23 ml
Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Cholesterin (CHOL) wurden im Molverhältnis zwei zu eins (DSPC:CHOL 2:1) bei einer Konzentration von 36 Gew.-% in CHCl&sub3; gemischt. Der Rotor wurde mit 3600 U/min angetrieben, und das Vakuum in der Kammer wurde durch Öffnen eines Ventils an einer über eine Rohrleitung mit dem Dampfauslaß 56 verbundene Vakuumpumpe auf etwa 33,25 kPa (250 mm Hg) gesetzt.
Ein Nadelventil in der Einlaßrohrleitung wurde geöffnet, und etwa 24 ml der DSPC:CHOL-Lösung wurden von dem Vakuum in die Kammer gesaugt, bis sie durch das Schauglas am Ende des Gehäuses sichtbar war. Das Vakuum in der Kammer wurde bei konstanter Drehung auf 92,0 kPa (69 cm Hg) erhöht, und es konnte beobachtet werden, daß ein dünner Film trocknete, wie durch einen Taschenlampenstrahl durch das Schauglas gesehen wurde. Die in diesem Absatz beschriebenen Tätigkeiten dauerten etwa 2 Minuten lang.
Wenn sich zeigte, daß sich in der Zone ein Film vollständig ausgebildet hatte, wurde der Rotor abgeschaltet, die Vakuumleitung zur Kammer geschlossen und die Vakuumpumpe abgekoppelt. Eine größere Kinney-Vakuumpumpe wurde angeschlossen und zu einem Vakuum von > 98,67 kPa (> 740 mm Hg) angetrieben. Der Film knallte ("popped") während dieses Trocknens bei hohem Vakuum und schien sich von dem Gehäuseinneren in dünnen Schichten zu lösen. Dieser Trocknungsvorgang bei höherem Vakuum dauerte etwa 1/2 Stunde lang. Das Vakuum wurde unter Verwendung gefilterter trockener Luft entspannt.
Die Kammer wurde dann durch Zirkulation heißen Wassers im Wärmeaustauschmantel auf etwa 65ºC erwärmt, und die Kammer mit einer kleinen Vakuumpumpe auf etwa 91,33 kPa (685 mm Hg) evakuiert. Die Vakuumleitung wurde dann geschlossen. 200 ml 0,9%iger Kochsalzlösung (auch bei einer Temperatur von 65ºC) wurde dann von dem Vakuum in der Kammer durch den Einlaß eingesaugt. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Rotor erneut mit 3600 U/min in Gang gesetzt.
Nach 10-minütigem Rühren wurde die gerührte Suspension durch eine peristaltische Pumpe auf einem an dem Materialauslaß angebrachten Aufnahmerohr in einen Auffangkolben abgezogen. Während dieses Abziehvorgangs war der Rotor abgeschaltet, und das Nadelventil in der Einlaßrohrleitung war geöffnet, um zu gestatten, daß während des Abziehens Luft den Druck ausgleicht. Zusätzliche 100 ml 0,9%iger Kochsalzlösung wurde durch eine ähnliche Vorgehensweise zugegeben und in denselben Auffangkolben gepumpt.
Die aufgefangene Suspension wurde mit einem Coulter counter auf die Größe der Liposomen untersucht. Es zeigte sich eine Gaußsche Normalverteilung von MLVs:
Mittelwert durch Zahlendifferenz: 4,7 um
10% größer als 7,75 um
50% bei 5,04 um
90% weniger als 3,23 um

BEISPIEL 11

Herstellung von in MLVs eingekapseltem Doxorubicin

150 mg Doxorubicin (zusammen mit 750 mg Lactose-Arzneimittelträger) und 225 mg Cardiolipin in Ethanol (50 ml insgesamt) wurden in 150 ml Methanol gelöst und unter sterilen Bedinungen in einem Kolben kurz zusammengemischt. Eine sterile Rohrleitung wurde in den Kolben gegeben und mit dem Materialeinlaß eines sterilisierten Artisan-1/4 sq. ft.-Dünnschichtverdampfer verbunden, der schematisch in Fig. 1 gezeigt ist. Der Rotor wurde mit 3600 U/min in Gang gesetzt, und das Vakuum in der Kammer wurde durch Öffnen eines Ventils an einer Vakuumpumpe auf 33,87 kPa (25,4 cm Hg) gesetzt, wodurch Doxorubicin/Lipid- Lösung in die Kammer gesaugt wurde, bis die Filmbildungszone gefüllt war, wie durch das Schauglas gesehen wurde. Alle Vakuum- und Abziehrohrleitungen und die Vorrichtung wurden bei diesem Arbeitsgang sterilisiert.
Die Temperatur im Wassermantel und der Enddichtung und in einem am Dampfauslaß 56 angebrachten Kondensator, wie auch das Kammervakuum, wurden über die Zeit überwacht. Die Ergebnisse waren wie folgt: Zeit (min) Mantel, ºC Dichtung, ºC Vakuum, kPa (mm Hg) Kondensator, ºC
Bei 15:40 wurde der Rotor abgeschaltet, und ein Vakuum größer als 98,67 kPa (740 mm Hg) wurde auf die Kammer etwa 30 Minuten lang angwendet, um den Film weiter zu trocknen, obwohl eine kürzere Trocknungszeit nach der Bildung dieses ersten Films bevorzugt ist, um das Mitreißen von Staub zu verringern.
Eine zweite sterile Lipidlösung, bestehend aus 562,5 mg Ei- Phosphatidylcholin (PC), 188,1 mg Cholesterin und 56,2 mg Stearylamin in 100 ml Chloroform, wurde hergestellt. Nachdem Stickstoff in die Kammer gesaugt worden war, um das hohe Vakuum zu vermindern, wurde das frühere niedrigere Vakuum auf die Kammer angewendet, um die zweite Lipidlösung hinein zu saugen. Wieder wurden die Temperatur des Wassermantels, der Enddichtung und des Kondensators und das Kammervakuum während des Arbeitsgangs überwacht. Die Ergebnisse waren wie folgt: Zeit (min) Mantel, ºC Dichtung, ºC Vakuum, kPa (mm Hg) Kondensator, ºC
Die Zufuhr wurde bei etwa 10 Minuten abgeschaltet, und eine Vibration des Rotors bei 12:55 zeigte an, daß das maximale Fassungsvermögen erreicht war. Im Kondensator hörten Kondensationstropfen bei 14:30 auf, was einen trockenen Film anzeigte. Bei 16:10 Minuten wurde die Rotortätigkeit unterbrochen und das höhere Vakuum angewendet.
Als nächstes wurden 75 ml eines 20 mM Natriumpyrophosphatpuffers in 9% Lactose mit 0,47 ml 1 M NaOH (pH-Wert der Pufferlö- Sung: 9,19) über Vakuum zugegeben, und der Rotor wurde mit 3600 U/min eingeschaltet. Während dieses Hydratationsschrittes war die Temperatur im Wassermantel 27,5ºC, und die Drehung wurde 15 Minuten lang fortgesetzt. Der pH-Wert nach der Hydratation betrug 9,06, und das aus dem Auslaß 54 aufgefangene Volumen betrug 62 ml. Dieses aufgefangene Material (collectant) wurde zu 32 ml- und 30 ml-Aliquoten in getrennte Glasfläschchen aufgeteilt. Die Liposomensuspension in einem Glasfläschchen wurde mit 18 ml 1 M HCl auf einen pH-Wert von 7,48 neutralisiert, und die Liposomen in beiden Glasfläschchen wurden auf die Konzentration an Doxorubicin hin untersucht, von dem gezeigt wurde, daß es in den sterilen MLVs eingeschlossen war, welche gebildet wurden.
Die pharmazeutische Auswertung der durch diesen Arbeitsgang gebildeten MLVs war sowohl in der Pharmakokinetik als auch in den Charakteristiken der biologischen Verteilung (biodistribution characteristics) äquivalent, wenn sie mit dieser Formulierung von durch die herkömmlichen Laborverfahren der Rotationsverdampfung und der Badbeschallung hergestellten Liposomen verglichen wurden.

BEISPIEL III

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung des Artisan-1/4 sq. ft.-Dünnschichtverdampfers für die Herstellung von in Liposomen eingekapseltem Hämoglobin. 5,92 g hydriertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC), 2,62 g Cholesterin, 0,51 g Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) und 0,15 g α-Tocopherol (ein Antioxidans) wurden in 60 ml CHCl&sub3; unter Wärme und Rühren gelöst.
Der Rotor wurde mit 3600 U/min in Gang gesetzt, und die Lösung wurde durch Vakuum in die Kammer des Dünnschichtverdampfers gesaugt, bis sie durch das Schauglas am Ende des Gehäuses sichtbar war. Die Temperatur im Wassermantel wurde bei 28ºC gehalten. Nach der Bildung eines Films wie oben beschrieben, wurde der Rotor angehalten und der Druck in der Kammer zur vollständigen Trocknung des Films verringert, was durch die Verwendung einer durch das Schauglas leuchtenden Taschenlampe beobachtet wurde. Der Filmbildungs- und Trocknungsvorgang dauerte etwa drei Stunden.
Die Kammer wurde dann durch Zirkulation von heißem Wasser im Wärmeaustauschmantel auf etwa 32ºC erwärmt, und eine Dispersion von 28 Gew.-% Hämoglobin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurde mit der kleinen Vakuumpumpe in die Kammer gesaugt. Eine Gesamtmenge von 317 g von 28 Gew.-%igem Hämoglobin wurde in die Kammer gegeben. Der Rotor wurde erneut mit 3600 U/min in Gang gesetzt.
Nach einer Stunde Rühren wurde die geruhrte Suspension in einen Auffangkolben abgezogen. Während dieser Abziehtätigkeit war der Rotor abgeschaltet.
Die aufgefangene Suspension wurde mit einem Coulter counter auf Partikelgröße hin untersucht, wobei sich ein mittlerer Durchmesser von 3,1 um zeigte, der für MLVs typisch ist. Eine vom Naval Research Laboratory entwickelte Hemocritanalyse (hemocrit assay), um den Prozentsatz an in Liposomen eingekapseltem Hämoglobin zu messen, wies einen Bereich von 2 bis 8% Hemocrit nach, was anzeigte, daß Hämoglobin in den Liposomen eingekapselt war.
Aus der vorangehenden Beschreibung können die wesentlichen Merkmale der Erfindung leicht festgestellt werden, und die Erfindung kann an verschiedene Verwendungen angepaßt werden, ohne ihren Grundgedanken und Umfang zu verlassen. Änderungen der Form und Ersatz von Äquvalenten werden betrachtet, wie die Umstände sie nahelegen oder ratsam machen können, und obwohl hier bestimmte Begriffe verwendet wurden, sollen sie nur beschreibenden Charakter haben und nicht zu Begrenzungszwecken dienen.

Claims

1. Diskontinuierliches Verfahren zur Bildung von Liposomen, das die Schritte umfaßt:

(a) Einführen einer Mischung, die ein amphiphiles Lipidmaterial und ein organisches Lösungsmittel umfaßt, in welchem das Lipid löslich ist, in eine Kammer mit einer zylindrischen inneren Wärmeübertragungswand, die Wärme zwischen der Kammer und einem Wärmeaustauschmantel überträgt, einer drehbaren Welle, die in bezug auf die Wand koaxial angeordnet ist, und wenigstens einem Rotorflügel, der an der drehbaren Welle zur Drehung mit ihr angeordnet ist und sich von ihr radial bis zu einem Filmbildungsabstand von der Wand erstreckt;

(b) Bilden eines Films aus dem Lipidmaterial an der Wand durch Drehung des Flügels und Verdampfen der Flüssigkeit;

(c) Einführen einer wäßrigen Phase in die Kammer; und

(d) Hydrieren des Films durch Drehen des Flügels mit einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um Liposome zu bilden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das amphiphile Lipidmaterial ein Phospholipid beinhaltet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das weiterhin den Schritt des Trocknens des Lipidfilms vor dem Einführen der wäßrigen Phase in die Kammer beinhaltet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Trocknen unter Vakuum ausgeführt wird.

5. Verwendung einer Verdampfungsvorrichtung bei einem Verfahren zur Bildung von Liposomen durch Hydratation eines Films aus amphiphilem Lipidmaterial, welche umfaßt:

(a) eine Kammer zur Aufnahme des amphiphilen Lipidmaterials, eines organischen Lösungsmittels, in dem das Lipid löslich ist, und einer wäßrigen Phase zur Hydratation des Lipidmaterials, wobei die Kammer eine zylindrische innere Wärmeübertragungswand aufweist, an der der Lipidfilm gebildet werden kann, und wahlfrei abdichtbar ist, um zu ermöglichen, daß ein Vakuum mit einem Druck von 13,33 Pa (100 um Hg) darin aufrecht- erhalten wird;

w (b) eine drehbare Welle, die bezüglich der Wand koaxial angeordnet ist; und

(c) wenigstens einen Rotorflügel, der an der drehbaren Wand zur Drehung mit ihr befestigt ist, wobei sich der Flügel von der Achse der drehbaren Welle radial bis zu einem Filmbildungsabstand von der Wand erstreckt und sich axial bezüglich der drehbaren Welle entlang der Wand erstreckt, um eine Filmbildungszone von gleichmäßiger Dicke zwischen dem Rotorflügel und einem Filmbildungsabschnitt der Wand zu definieren.

6. Verwendung nach Anspruch 5, bei der die Kammer der Vorrichtung weiterhin einen Fluidzufuhreinlaß und einen Fluidauslaß beinhaltet, die jeweils mit der Kammer in Fluidverbindung stehen und außerhalb der Filmbildungszone angeordnet sind.

7. Verwendung nach Anspruch 5, bei der die Kammer der Vorrichtung weiterhin einen Fluidzufuhreinlaß und einen Fluidauslaß beinhaltet, wobei der Fluidauslaß in einem ebenen Ende der geschlossenen Kammer außerhalb der Filmbildungszone angeordnet ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, bei der der Fluidauslaß ein Ventil umfaßt, das eine ebene Oberfläche bereitstellt, die mit dem ebenen Ende der geschlossenen Kammer bündig ist.

9. Verdampfungsvorrichtung zum Durchführen eines diskontinuierlichen Verfahrens zur Bildung eines Films aus einem amphiphilen Lipid und Verarbeiten des Films zu Vesikeln in einer wäßrigen Phase, welche umfaßt:

(a) eine Kammer mit einer zylindrischen inneren Wärmeübertragungswand, an der der Lipidfilm gebildet werden kann, und einem ebenen Ende, wobei die Kammer wahlfrei abdichtbar ist, um zu ermöglichen, daß darin ein Vakuum mit einem Druck von 13,33 Pa (100 um Hg) aufrechterhalten wird;

(b) eine drehbare Welle, die bezüglich der Wand koaxial angeordnet ist; und

(c) wenigstens einen Rotorflügel, der an der drehbaren Welle zur Drehung mit ihr befestigt ist, wobei sich der Flügel von der Achse der drehbaren Welle radial bis zu einem Filmbildungsabstand von der Wand erstreckt und sich axial bezüglich der drehbaren Welle entlang der Wand erstreckt, um eine Filmbildungszone zwichen dem Rotorflügel und einem Filmbildungsabschnitt zu definieren, wobei die Zone gleichmäßig dick und frei von Vertiefungen in dem dem Rotorflügel benachbarten Abschnitt der Wand ist;

dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin ein Fluidauslaß bereitgestellt ist, der ein Ventil beinhaltet, das eine ebene Oberfläche bereitstellt, die mit dem ebenen Ende der Kammer bündig ist, wenn es sich in der geschlossenen Stellung befindet.