DE69021640T2

DE69021640T2 - Standard-Reagenzien zur Quantifizierung von HIV p24.

Info

Publication number: DE69021640T2
Application number: DE69021640T
Authority: DE
Inventors: Straw Regina H Mc; James Lawrence Stewart
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1989-06-02
Filing date: 1990-05-28
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2010-05-29
Also published as: ES2078264T3; JPH0329856A; AU639457B2; DE69021640D1; ATE126600T1; CA2018098A1; AU5603190A; EP0400548B1; EP0400548A3; EP0400548A2; KR910001378A

Description

Hintergrund der Erfindung.

Für den Nachweis von Antikörpern gegen HIV in einer biologischen Probe sind Enzymimmunoassays eingesetzt worden. Obwohl solche Tests hochempfindliche Indikatoren für den stattgefundenen Kontakt mit HIV sind, geben sie keinen direkten Beweis für die Anwesenheit des Virus. Der Nachweis des lebensfähigen Virus im Blut und anderen Körperflüssigkeiten kann oft nur über komplizierte Kulturverfahren erzielt werden (Salahuddin et al., PNAS (1985) 82:5530-5534). Das US-Patent Nr. 4448110 beschreibt ein Enzymimmunoassay zum Nachweis von HIV- Antigenen.
Die Bestimmung wechselnder Pegel von viralem Antigen in Indviduen, die mi HIV infiziert sind, ist für die Beobachtung der Patientenantwort auf antivirale Therapien nützlich gewesen. Ein halb-quantitatives Verfahren, das zu diesem Zweck weitläufig benutzt wurde, umfaßt den Erhalt einer Standardkurve, die erhalten wird, indem parallel zu den Proben, die auf Antigen getestet werden, Reihenverdünnungen eines positiven Blindreagenzes analysiert werden, das aus Viral-Lysat-Antigenen besteht. Die Intensitäten von aus Immunoassays erhaltenen Signalen (z.B. den Extinktionswerten bei ELISAs, bei denen das Enzym die Produktion eines chromogenen Produktes katalysiert) von einer Patientenprobe können dann in Antigenkonzentrationen überführt werden, indem die Intensitäten einfach auf der Standardkurve aufgefunden werden. Dieses Verfahren isr nur halbquantitativ, da seine Genauigkeit durch den Mangel an Reinheit und Konsistenz der Viral-Lysat-Antigenpräparate, die als positives Blindreagens eingesetzt werden, durch die Instabilität dieser Mischungen von Antigenen in Lösung und durch die Schwierigkeit bei den Reihenverdünnungn ausreichende Reproduzierbarkeit zu erzielen, ernsthaft eingeschränkt ist.
Es ist bekannt, daß die Konzentration des HIV-Proteins, das als "p24" bekannt ist, im Blutserum oder Plasma von Personen, die mi HIV infiziert sind, gemäß der Schwere der Immununterdrückung bei solchen Personen schwankt. Daher besteht ein Bedarf für ein quantitativ genaues Assay auf HIV-p24, um den Fortschritt der Krankheit und die Wirksamkeit der therapeutischen Verfahren bei Personen zu überwachen, die mit HIV infiziert sind.

Zusammenfassung der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung ist auf verbesserte Imnoassayverfahren und Zusammensetzungen und Kits zur Durchführung der Verfahren zur Mengenbestimmung (d.h. zur Titerbestimmung) von HIV-p24-Antigen in einer biologischen Probe gerichtet.
Es wurde herausgefunden, daß es besonders vorteilhaft ist, gereinigtes virales HIV-p24 als das antigenische Reagens in Blindproben zu verwenden, die benutzt werden, um das Verhältnis zwischen HIV-p24-Titer in einer Probe und der Intensität des Immnoassaysignals einer Probe von HIV-p24 zu ermitteln. Daher erlauben die Verfahren der Erfindung die quantitative Bestimmung von HlV-p24 mit einer Genauigkeit, die bis dahin unerreicht ist.

Eingehende Beschreibung der Erfindung.

Unter einem ihrer Aspekte ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von HIV-p24 in einer Probe, das folgende Schritte umfaßt:
In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper, der für HIV-p24-Antigen spezifisch ist, wodurch ein Antikörper- Antigenkomplex gebildet wird; und
quantitative Bestimmung der Menge an gebildetem Antigen- Antikörperkomplex, wobei als Standard ein Veigleichsmengenbestimmungsschema verwendet wird, das Zusammensetzungen umfaßt, die gereinigtes virales HIV-p24 enthalten.
Dieses Verfahren der Erfindung ist eine wesentliche Verbesserung bezüglich Immunoassays nach dem Stand der Technik zum Nachweis von viralen HIV-Antigenen in biologischen Proben. Die Verbesserung liegt in der Verwendung von gereinigtem viralem HIV-p24 in dem Mengenbestimmungsschema.
Im Rahmen einer weiteren ihrer Aufgaben umfaßt die Verbindung eine Zusammensetzung, die als HIV-p24-Standard geeignet ist, wobei die Zusammensetzung gereinigtes virales HIV- p24 und einen Puffer enthält.
Im Rahmen noch einer weiteren Aufagbe umfaßt die Erfindung ein Kit zur Verwendung bei der quantitativen Pestimmung von HIV-p24 in einer biologischen Probe, wobei das Kit ein Mengenbestimmungsschem enthält, das Zusammensetzungen umfaßt, die gereinigtes virales HIV-p24 enthalten.
Mit gereinigtem viralem HIV-p24" ist HIV-p24 gemeint, das aus HIV-1, HIV-2 oder aus anderen Stämmen des Virus erhalten worden ist, oder HIV-p24, das mittels gentechnischen Verfahren hergestellt worden ist und das immunologisch von dem p24 ununterscheidbar ist, das von einem Stamm des Virus erhalten wurde, vorausgesetzt, daß das p24 wenigstens 95% des Proteins in der Probe ausmacht, die das p24 enthält. Das gereinigte virale HIV-p24 kann hergestellt werden, wie dies unten beschrieben ist, indem Immunoaffinitätsreinigung ausgehend von einem viralen HIV- Antigenpräparat unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen p24 eingesetzt wird.
Die hiesige Bezugnahme auf einen "Antikörper der spezifisch gegen HIV-p24-Antigen" ist, bei einem Verfahren gemäß der Erfindung, steht entweder für einen Antikörper, der ein Epitop auf viralem HIV-p24 erkennt, aber Teil eines polyklonalen Antikörperpräparates ist, oder für einen monoklonalen Antikörper, der ein Epitop auf viralem HIV-p24 erkennt.
Der gebildeten Antigen-Antikörperkomplex kann bei einem Verfahren gemäß der Erfindung mittels jedem der vielzähligen Verfahren nachgewiesen werden, die in der Immunoassaytechnik zum Nachweis solcher Komplexe bekannt sind. Z.B. kann der gegen HIVp24 spezifische Antikörper direkt mit einer nachweisbaren Markierung oder einer funktionellen Gruppe markiert sein, wie min einem Enzym, das zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befahigt ist oder mittels ELISA-Methoden oder es können andere Sandwich-Assayverfahren verwendet werden die einen radiomarkierten zweiten Antikörper verwenden. Alternativ können Konkurrenzassayverfahren eingesetzt werden, wobei HIV-p24 aus einer Probe mit markiertem gereinigtem viralem HIV-p24 um die Bindung an einen Antikörper, der für HIV-p24 spezifisch ist, konkurriert.
Ein "Mengenbestimmungsschema" gemäß der Erfindung kann ein Satz von Lösungen oder ein Satz von Portionen trockener (z.B. gefriergetrockneter) Reagenzien sein. Ein Mengenbestimmungsschema, das aus einem Satz Portionen trockener Reagenzien besteht, kann in ein Mengenbestimmungsschema überführt werden, das aus einem Satz Lösungen besteht, indem im wesentlichen Wasser oder eine geeignete Salzlösung oder wäßrige Puffern und Salzlösungen, wie sie in der Technik bekannt und unten veranschaulicht sind, hinzugegeben werden. Obwohl Tris ein bevorzugter Puffer ist, können andere Puffer wie HEPES (N-[2- Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]), PIPES (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure]) , MOPS (3-[N- Morpholino]propansulfonsäure), BES (N,N-bis[2-Mydroxyethyl]-2- aminoethansulfonsäure), TES (N-tris[Hydroxymethyl]methyl-2- aminoethansulfonsäure) und Phosphat (einbasisches und zweibasisches) verwendet werden, wie dies in der Technik bekannt ist. Obwohl NaCl ein geeignetes Salz bei den Mengenbestimmungsschemata der Erfindung ist, können auch andere Salbe wie KCl verwendet werden, wie dies in der Technik bekannt ist.
Wie dem Fachmann geläufig, ist eine "Blindzusammensetzung" in einem Mengenbestimmungsschema gemäß der Erfindung eine Zusammensetzung, in der sich kein HIV-p24 befindet, die aber ansonsten die gleiche Zusammensetzung hat, wie die Zusammensetzungen, die HIV-p24 enthalten, und die Teil des Mengenbestimmungsschemas sind, von der die Blindzusammensetzung ebenfalls ein Bestandteil ist.
In Übereinstimmung mit der Erfindung werden die Zusammensetzungen einer Vergleichsverdünnungsreihe dazu verwendet, um eine Beziehung (z.B. eine "Standardkurve") zwischen der Intensität eines Signals, das auf dem gebildeten Antigen-Antikörperkomplex im Zusammenhang mit dem Verfahren der Erfindung beruht, und der Konzentration von HIV-p24 in einer Probe herzustellen. Daher enthält ein Mengenbestimmungsschema, in dem die Zusammensetzungen Lösungen sind, Zusammensetzungen mit wenigstens zwei unterschiedlichen Konzentrationen an HIV-p24 und üblicherweise mehr als 3 unterschiedliche Konzentrationen, wobei eine gleich 0 ist (d.h. in der p24 fehlt). Der Konzentrationsbereich in einem Mengenbestimmungsschema, in dem die Zusammensetzungen Lösungen sind, reicht von 0 bis ungefähr 400pg an gereinigtem viralem HIV-p24 pro ml Lösung, vorzugsweise von 0 bis ungefähr 300pg an p24 pro ml und besonders bevorzugt von ungefähr 0 bis ungefähr 100pg an p24 pro ml. Bei den Zusammensetzungen eines Schemas, das Lösungen enthält, die gereinigtes virales HIV-p24 enthalten, reicht der Konzentrationsbereich des p24 von ungefähr 0,5pg/ml bis ungefähr 400pg/ml, vorzugsweise von ungefähr 1pg/ml bis 300pg/ml und besonders bevorzugt von ungefähr 10pg/ml bis ungefähr 100pg/ml.
Die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bei der Mengenbestimmung von HIV-p24 in HIV-Antigen-positiven Proben im Zusammenhang mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde im Vergleich mit der Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit von Eraebnissen festgestellt, die mit dem geläufigen halb- quantitativen Verfahren erhalten wurden, indem eine Mischung aus Antigenen eines viralen Lysats verwendet wird, um eine Standardkurve aufzustellen. Das vorliegende Verfahren erlaubte eine Mengenbestimmung von p24 selbst bis weniger als 1pg/ml. Das Mengenbestimmungsschema der Erfindung, bei dem die Bestandteile der Zusammensetzungen gefriergetrocknet waren, lieferte Assays mit höherer Reproduzierbarkeit (typische Assay-interne Schwanking < 10%, Schwankung von Assay zu Assay < 15%).
Die Verbesserung in der Reinheit durch die Verwendung von gereinigtem HIV-p24 steigert die Stabilität des Mengenbestimmungsschemas und die Reproduzierbarkeit von Assays, die unter dessen Verwendung ausgeführt werden und sorgt daher für eine wesentliche Verbesserung der Zuverlässigkeit bei der Messung von Antigenpegeln im Patienten im Vergleich mit den Assays, die Viral-Lysat-Antigene als Standards verwenden.
Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern bei der Affinitätsreinigung erzeugte virales p24-Antigen von wenigstens 95%iger Reinheit, das in dem Schema verwendet wird. Die Gefriertrocknung verlieh dem Mengenbestimmungsschema über 8 Monate bei 2 bis 8ºC Stabilität, und der Puffer verbesserte die Stabilität des wiederhergestellten Mengenbestimmungsschemas bei 2 bis 8ºC mehr als 6 Wochen lang. Die Reproduzierbarkeit des vorliegenden Verfahrens für quantitative Werte aus Serum- und Plasmaproben wies weniger als 15% Schwankungsbreite auf, verglichen mit 40% bei den geläufigen halb-quantitativen Verfahren. Das Verfahren der Erfindung zur Mengenbestimmung von HIV-p24 in einer biologischen Probe, das gereinigtes virales p24 verwendet, ist aufgrund seiner erhöhten Reinheit, der erhöhten Stabilität der Standards und der erhöhten Reproduzierbarkeit der quantitativen Werte, die aus der Standardkurve erhalten werden, ein nützliches und zuverlässiges Werkzeug zur Überwachung der p24-Antigenpegel in Patienten, die antiviralen Therapien unterzogen werden.
Die biologischen Proben, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung leicht getestet werden, umfassen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten und Gewebe wie Plasma und Serum, wie auch Zellkulturmedien.
Der Puffe, der in der Lösung verwendet wird, um das gereinigte virale HIV-p24 zu verdünnen, verleiht dem Mengenbestimmungsschema nach der Wiederherstellung eine bessere Stabilität. Daher ist die Lösung eine gepufferte Salzlösung. Z.B. Tris(tris[hydroxymethyl]aminomethan), handelsüblich erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, kann zur Pufferung der Salzlösung verwendet werden.
Das p24, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann von HIV-1-infizierten Zellen erhalten werden. Eine Vielzahl von HIV-1-Isolaten ist identifiziert worden, unter denen sich das Isolat befindet, das von HTLV-III(b)-infizierten H9-Zellen produziert wird, die dem Fachmann zugänglich sind. (HTLV-III-Isolate werden im folgenden HIV-1 genannt.) Daher ist jegliche Zelle, die einen HIV-1-Virus birgt, eine geeignete Quelle für die p24-Antigene.
Der Durchschnittsfachmann kann die hierin offenbarten Verfahren verwenden, um einen Mengenbestimmungsstandard für jedweden anderen menschlichen Immunschwächevirus zu entwickeln wie beispielsweise HIV-2, indem er gereinigte virales p24 von diesem erhält.

VERFAHREN

PROTEIN-p24-REINIGUNG.

Mit HTLV-III(b) infizierte H9-Zellen wurden in der logarithmischen Spitzenphase ihres Wachstums (nach ungefähr 7 bis 10 Tagen) geerntet. Die Zellen wurden durch Ultrafiltration konzentriert und dann durch Zentrifugation bei 20000 Upm über Nacht verdichtet (oder alternativ dazu, 25000 Upm 3 Stunden lang oder 43 000upm 2 Stunden lang). Die verdichteten Zellen wurden in einer Lösung resuspendiert, die 1mM Tris, 15mM NaCl und 0,1mM EDTA, pH 7,5 (TNE), enthielt.
Das resuspendierte Pellet wurde durch Zentrifugation bei 10000 Upm ungefähr 15 Minuten lang geklärt. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet wurde in TNE resuspendiert und erneut zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt und noch einmal zentrifugiert.
Der in den oben erhaltenen Überständen erhaltene Virus wurde durch eine 20%ige Saccharoseschicht hindurch niedergeschlagen, indem der Überstand in einem Zentrifugenglas mit einer 20%igen Saccharoselösung unterschichtet wurde und dann bei 35000 Upm 4 Stunden lang bei 2 bis 8ºC (oder alternativ 20000 Upm 16 bis 22 Stunden lang oder bei 43000 Upm 2 Stunden 45 Minuten lang) zentrifugiert wurde. Die Niederschläge wurden in TNE resuspendiert.
Der resuspendierte Virus wurde dann mittels Gleichgewichtssedimentation in einem Saccharosegradienten gemäß in der Technik gut bekannten Verfahren in Banden aufgespalten (siehe z.B. das Verfahren nach Sundquist, Archives of Virology (1981) 68:115-127). Kurz gesagt, wurde ein wie folgt hergestellter Saccharosegradient mit dem resuspendierten Virus übeschichtet. In einem Zentrifugenglas wurde der Gradient durch Unterschichten einer 30%igen Saccharoselösung mit einer 45%igen Saccharoselösung hergestellt und der resuspendierte Virus wurde über den Gradienten geschichtet, und es wurde bei 25000 Upm über Nacht in einem Schwingradrotor (e.g., SW-25) zentrifugiert. Der Gradient wurde fraktioniert und die Fraktionen, die Protein enthielten das p24-Aktivität aufwies, wurden vereinigt. Der Virus, der die Banden gebildet hatte, wurde in TNE verdünnt und durch Zentrifugation bei 35000 Upm 4 Stunden lang bei 2 bis 8ºC (oder alternativ bei 20000 Upm 16 bis 22 Stunden lang oder bei 43000 Upm 2 Stunden und 45 Minuten lang) niedergeschlagen. Der niedergeschlagene Virus wurde in TNE resuspendiert und in einer Lösung, die 0,5M NaCl und 0,5% Triton X-100 enthielt, beschallt und durch Zentrifigation bei 35000 Upm 4 Stunden geklärt (oder auch bei 43000 Upm 2 Stunden und 40 Minuten lang). Der Überstand wurde abgegossen und lieferte gereinigtes Viral-Lysat.
Das p24-Protein wurde aus dem gereinigten viralen Lysat durch Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers isoliert. (Die allgemeinen Methoden für die Herstellung monoklonaler Antikörper sind im Übersichtsartikel Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, ed. J.G.R. Hurrel [CRC Press, Inc., 1982] beschrieben.) Kurz gesagt, wurde Sepharosegel, z.B. Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals Inc., Uppsala, Schweden) zunächst an einen monoklonalen Antikörper gekoppelt, der spezifisch für HIV- 1-p24 ist, mit 0,05%igem Glutaraldehyd vernetzt und mit einer Waschlösung, die 0,01M Tris, 0,001M EDTA, 0,75M NaCl und 0,5% Triton X-100, pH 8,1, enthielt, gewaschen (Waschlösung). Das gewaschene Gel wurde dann mit dem gereinigten Viral-Lysat (2mg Antigen/ml Gel) vermischt und auf einem Rotationsschüttler 12 bis 24 Stunden bei 2 bis 8ºC umgewälzt. Die Lysat-Gelmischung wurde dann auf eine Säule gegossen, mit 5 Säulenvolumina an Waschlösung gewaschen und das p24 wurde mit 4,0M Guanidin-HCl eluiert. Die Protein-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und das eluierte p24 wurde über Nacht in einer 0,017M Phosphatlösung, enthaltend 0,145M NaCl, pH 7,2, dialysiert.
Ein Proteinassay, z.B. unter Verwendung von Bio-Rad- Reagenzien (Bio Rad Laboratories, Richmond, CA) wurde gemäß dem Verfahren des Herstellers durchgeführt, um die Proteinkonzentration zu ermitteln und um die absolute p24- Proteinkonzentration unter Verwendung von abtastender Densitometrie korrigiert. Durch diese Verfahren werden routinemäßig Antigenpräparate mit mehr als 95% HIV-p24 gewonnen.

Herstellung der Bestandteile des Mengenbestimmungsschemas.

Das Mengenbestimmungsschema besteht aus einem 5- gliedrigen Schema mit Konzentrationen von 100, 50, 25, 12,5 und 0 pg/ml an p24. Das Schema wird durch Verdünnen von gereinigtem p24-Antigenvorrat in einer wäßrigen Lösungen von Puffer und NaCl auf eine Endkonzentration von 100 pg/ml erhalten. Die anderen Schemenglieder können durch Reihenverdünnung des ersten Glieds hergestellt werden. Alternativ kann jedes einzelne Schemenglied durch Verdünnung des gereinigten p24-Antigenvorrats in wäßriger Lösung von Puffer und NaCl auf die gewünschte Endkonzentration hergestellt werden.
Der Mengenbestimmungsschema-Ansatz 1 (QP1 "quantitation panel 1") wurde wie folgt hergestellt. Das 100 pg/ml Schemenglied wurde durch Verdünnen einer Stammlösung von gereinigtem HIV-p24-Antigen bekannter Konzentration (17,0 ng/ml) mit 0,02M Tris, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCl, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% NaN&sub3; (0,02M Tris) hergestellt. 1500 ml 0,02M Tris wurden mit 8,82ml der HIV-p24- Antigenstammlösung gemischt. Beim Testen war die Konzentration niedrig. Zusätzliche 0,59ml Stammlösung wurden hinzugegeben. Die anderen Glieder wurden durch Reihenverdünnung des 100pg/ml- Gliedes hergestellt.

Gefriertrocknungsverfahren.

Alle Gefriertrocknungszyklen werden als Sättigungs- und Rampenabschnitte definiert. Ein Sättigungsabschnitt ist so definiert, daß ein Systemwert für ein spezifisches Zeitintervall erhalten bleibt. Ein Rampenabschnitt ist als die Geschwindigkeit oder Zeit definiert, in der sich der Systemwert verändert. Die zugrundeliegende Zyklusabfolge weist drei Abschnitte auf: (1) einen anfänglichen Träger/Produkt-Kühlabschnitt (Sättigung); (2) einen Träger/Produkt-Erwärmungsabschnitt während dem der Kammerdruck gesteuert wird (Rampenabschnitt) und (3) einen Endtrockenabschnitt, während dem der Träger oder das Produkt getrocknet wird, während der Kammerdruck immer noch gesteuert wird (Sättigungsabschnitt).
Es wurde ein Hull-Gefrierttockner eingesetzt, wobei die allgemeinen Anweisungen des Herstellers befolgt wurden (Hull Corporation, Hatboro, Pennsylvania). Der Gefriertrocknungszyklus beruhte auf den Vorkühlerfordernissen für das Produkt, der Prndukt-Gefriertemperatur, dem absoluten Kammerdruck während des Trocknunaszyklus und der gewünschten Trägertrocknungstemperatur. Die Gefriertocknerträger wurden bis -45ºC oder niedriger vorgekühlt. Die gefüllten Gefäße wurden auf die Träger aufgebracht und das Produkt wurde einfrierenlassen, bis die Temperatur -20ºC erreichte und bei dieser oder niedrigerer Temperatur wenigstens 3 Stunden lang verblieb. Mit dem Trocknungszyklus wurde dann begonnen, indem die Kondensatorplatten gekühlt wurden und Vakuum gezogen wurde. Der Systemwert für das Vakuum betrug 100um (Mikron). Die Trägertemperatur wurde von einem Systemwert von -40ºC bis zu 25ºC über 8 Stunden gesteigert. Die Trägertemperatur wurde bei 25ºC gehalten und das Produkt erreichte eine konstante Temperatur überhalb von 0ºC und verblieb für 7 bis zu 20 Stunden bei dieser Temperatur bevor verschlossen wurde. Die Gefäße wurden unter 17 bis 51kPa (5 bis 15inch Quecksilber) Vakuum verschlossen, wobei Stickstoff zur Füllung der Kammer verwendet wurde.
Zwei weitere Vergleichsverdünnungs-Reihenansätze (QP2, QP3) wurden wie oben beschrieben hergestellt.

HIV-Antigentestverfahren.

Ein Enzymimmunoassay zum Nachweis von HIV-1-Antigenen (Ag) wie es von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL im Handel erhältlich ist, wurde zur quantitativen Bestimmung von p24 verwendet. Kurz gesagt wurden Polystyrolperlen, die mit menschlichem Antikörper gegen HIV-1 beschichtet waren, entweder mit einer Probe oder einem Glied des p24- Mengenbestimmungsschemas bei Raumtemperatur 16 bis 20 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die ungebundene Substanz abesaugt und die Perlen wurden gewaschen. Kaninchenantikörper wurde dann mit der Perle bei 40ºC 4 Stunden lang inkubiert, wobei der Kaninchenantikörper an das HIV-1-Antigen zu binden vermochte. Die ungebundenen Substanzen wurden abgesaugt und die Perlen wurden gewaschen. Ziegenantikörper gegen Kaninchen-IgG, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, wurde bei 40ºC 2 Stunden lang mit der Perle inkubiert, wobei dieser an die Perle band. Ungebundene Substanzen wurden abgesaugt und die Perlen wurden gewaschen. Als nächstens wurde eine o-Phenylendiamin (OPD-Lösung, die Wasserstoffperoxid enthielt, zu der Perle hinzugegeben und nach 30-minütiger Inkubation entwickelte sich eine gelborange Farbe proportional zu der Menge an HIV-1- Antigen, das an die Perle gebunden war. Die Enzymreaktion wurde durch die Zugabe von 1N H&sub2;SO&sub4; abgebrochen. Die Farbintensität wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 492nm abgelesen.
Die Anwesenheit oder Abwesenheit von HIV-1-Antigen wird bestimmt, indem der Extinktionswert der Probe einem Schwellenwert zugeordnet wird. Der Schwellenwert ist die Extinktion des Mittelwertes der negativen Blindwerte oder des Mittelwertes der Zellkultur plus dem Faktor 0,050. Proben mit Extinktionswerten, die größer oder gleich dem Schwellenwert sind, werden als reaktiv gegen HIV-1-Antigen betrachtet. Proben mit Extinktionswerten geringer als dem Schwellenwert werden als nicht-reaktiv gegen HIV-1-Antigen betrachtet.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Assayreproduzierbarkeit.

Das 5-gliedrige Schema wurde in dem HIV-Antigenassay gemäß obiger Vorschrift getestet. Die Extinktionswerte der Verdünnungsreihenglieder wurden gegen ihre Konzentrationswerte aufgetragen. Die erzeugten Kurven waren im wesentlichen linear und sehr reproduzierbar. Bei einem besonderen Antigenassaykit, was an drei verschiedenen klinischen Orten getestet wurde, war der zusammengenommene mittlere Korrelationskoeffizient für QP1, QP2 und QP3 0,9967 (n=22) bei einem Variationskoeffizienten (CV, "Coefficient of variation", Standardabweichung/Mittelwert) von 0,2%. Darüber hinaus wurde eine gute Korrelation zwischen unterschiedlichen Antigenassaykits für jedes Mengenbestimmungsschema festgestellt.
Die Reproduzierbarkeit innerhalb eines und von Assay zu Assay für jedes Glied des Mengenbestimmungsschemas wie auch die Ansatz-zu-Ansatz-Reproduzierbarkeit des Mengenbestimmungsschemas ist sehr gut. Bei einem besonderen Antigenassaykit, das mit allen drei Mengenbestimmungsschema-Ansätzen an einem klinischen Ort getestet wurde, war der Extinktionswert für jedes Glied des Schemas sehr reproduzierbar. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, war der Variationskoeffizient eines jeden Gliedes des Schemas geringer als 10%. TABELLE 1 Schemenglied Mittlerer O.D. Werta adie Anzahl der Tests beträgt 28

BEISPIEL 2

Mengenbestimmung von Proben.

Ein 10-gliedriger Probensatz wurde mit jedem von drei HIV-p24-Antigen-Mengenbestimmungsschemen quantitativ bestimmt, und die prozentualen Variationskoeffizienten wurden berechnet. Der Probensatz bestand aus den folgenden Bestandteilen:
Probn 1 bis 3 gereinigtes p24-Antigen, das in bekannten Konzentrationen (pg/ml) in Normal-Humanplasma einpipettiert worden war;
Probe 4 1:2-Verdünnung von Plasma von einem Antigen-positiven Donor (pg/ml);
Proben 5 bis 7 unverdünnte Antigen-positive Donor-Plasmaproben (pg/ml);
Probe 8 gereinigtes p24-Antigen, das in RPMI 1640 Zellkulturmedium mit 5% fetalem Rinderserum und 0,5% Triton X- 100 (pg/ml) einpipettiert worden war;
Probe 9 gereinigtes p24-Antigen, das in Zellkulturmedium, wie oben beschrieben, einpipettiert worden war, aber in höherer Konzentration, was eine 1:100- Verdünnung vor dem Testen notwendig machte; und
Probe 10 gereinigtes p24-Antigen, das in die obengenannte Zellkulturflüssigkeit einpipettiert worden war und eine 1:300- Verdünnung vor dem Testen verlangte.
Wie unten in der Tabelle 2 gezeigt war die Ansatz-zu- Ansatz-Reproduzierbarkeit des HIV-p24-Antigen-Schemas über alle drei Ansätze (QP1, QP2 und QP3) hinweg hervorragend. Die vorliegende Methode zur quantitativen Bestimmung von HIV-p24 in einer biologischen Probe ergab Assaywerte für das Plasma mit einer mittleren Streubreite von weniger als 7%, die von 4,5% bis 11,2% reichte. Darüber hinaus zeigten die Zellkulturproben, die aufgrund des Detergenziengehalts (0,5% Triton X-100) und der vor dem Testen angefertigten Verdünnung stärker schwankten, weniger als 2,0% Streubreite bei dem Verfahren der Erfindung. TABELLE 2 Schemenglied Mittlerer Assay-Wert
Zusätzlich wurde der Probensatz unter Verwendung eines jeden von drei HIV-p24-Antigen-Mengenbestimmungsschemata (QP1, QP2 und QP3) gegen drei verschiedene HIV-Antigenassaykits quantitativ bestimmt. Für jedes Mengenbestimmungsschema war die Reproduzierbarkeit von Assay zu Assay über alle drei verschiedenen HIV-Antigen-Assaykits hinweg sehr gut. Wie unten in Tabelle 3 gezeigt war die Reproduzierbarkeit der HIV- Antigen-Mengenbestimmungsschemas QP1 hervorragend. Das Verfahren der Erfindung zur quantitativen Bestimmung von HIV-p24 in einer biologischen Probe ergab Assaywerte für das Plasma mit einer durchschnittlichen Streubreite von weniger als 7%, die von 4,8% bis 10,8 % reichte. Zusätzlich zeigten die Zellkulturproben die 0,5,% Triton X-100 enthielten, weniger als 20% Streubreite. TABELLE 3 Schemenglied Mittlerer Assay-Wert
Darüber hinaus waren bei einem Probentest von 100 klinischen Plasma- und Serumproben, die auf HIV-Antigen getestet wurden, 91% der Proben geeignet, innerhalb den Grenzen der Kurve mengenmäßig bestimmt zu werden, d.h. ihre Konzentration betrug zwischen 0 und 100 pg/ml p24.

BEISPIEL 3

Vergleichende Werte.

Ein geläufiges Mengenbestimmungsverfahren besteht in einer reihenweisen Verdünnung eines positiven Blindreagenzes, das in einem diagnostischen Kit zum Nachweis von HIV-1-Antigenen zur Verfügung gestellt wird, um eine Standardkurve zu erhalten. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß die Menge an p24 indirekt gemessen wird, da der positive Blindwert eine Viral-Lysat-Lösung ist. Die Viral-Lysat-Lösung ist von Zellkulturen abgeleitet und enthält viele Arten von Proteinen. Das offenbarte Verfahren der Erfindung verbessert die Reproduzierbarkeit positiver Proben im Vergleich mit den geläufigen Verfahren, die positive Blindverdünnungen verwenden, wesentlich. Die Werte, die unten in Tabelle 4 gezeigt sind, fassen die Streubreiten positiver Proben sowohl für die geläufigen Verfahren als auch für das Verfahren der Erfindung zusammen. Jede positive Probe wurde bei beiden Verfahren gegen fünf verschiedene HIV-Antigenassaykits getestet. Das vorliegende Verfahren verbesserte die Streubreite für jede getestete Probe. TABELLE 4 Probe (Verdünnung)] Geläufiges Verfahren (% cv) Mengenbestimmungsschema (% cv)
Unter dem Strich wurde der prozentuale Variationskoeffizient mit dem HIV-p24-Mengenbestimmungschema verglichen mit den positiven Blindverdünnungen um 28 bis 69% verbessert, was beweist, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die quantitative Bestimmung von HIV-p24 in einer biologischen Probe eine Verbesserung im Vergleich mit dem geläufigen Verfahren zur Messung von HIV-p24-Antigenpegeln darstellt.

BEISPIEL 4

Linearität des Mengenbestimmungsschemas.

Die Linearität der Vergleichsverdünnungsreihe erstreckt sich über die 100-pg/ml-Grenze hinaus. Es wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem Schemenglieder hinzugefügt wurden, die Konzentrationen von 125, 150, 175 und 200 pg/ml umfaßten. Die so erzeugte Kurve war im wesentlichen linear bei einem Korrelationskoeffizienten von 0,9985.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von HIV-p24 in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt:

In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper, der gegen das HIV-p24-Antigen spezifisch ist, wodurch ein nachweisbarer Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird;

und quantitative Bestimmung der Menge an Antigen- Antikörper-Komplex, der gebildet wurde, wobei als Standard ein Mengenbestimmungsschema verwendet wird, das Zusammensetzungen umfaßt, die gereinigtes virales HIV-p24 enthalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem Mengenbestimmungsschema die Zusammensetzungen, die gereinigtes virales HIV-p24 enthalten, Lösungen sind, die das gereinigte virle HIVp24 und einen Puffer enthalten, und wobei die Konzentrationen des gereinigten viralen HIV-p24 in den Lösungen von 1 bis 300 pg/ml varieren, und wobei das Mengenbestimmungsschema darüberhinaus eine Blindzusammensetzung umfaßt, die eine Lösung ist, welche den Puffer umfaßt, und in der das gereinigte HIV-p24 fehlt.

3. Zusammensetzung, die zur Verwendung als Standard für HIV- p24 in dem Verfahren nach Anspruch 1 geeignet ist, die gereinigtes virales HIV-p24 und einen Puffer umfaßt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3 in gefriergetrockneter Form.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der Puffer Tris ist, und wobei die Zusammensetzung darüberhinaus NaCl enthält.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Puffer Tris ist, sind wobei die Zusammensetzung darüberhinaus NaCl enthält.

7. Kit zur Verwendung bei der quantitativen Bestimmung von HIV-p24 in einer biologischen Probe in dem Verfahren nach Anspruch 1, das ein Mengenbestimmungsschema umfaßt, das Zusammensetzungen umfaßt, die gereinigtes virales HIV-p24 enthalten.

8. Kit nach Anspruch 7, wobei in dem Mengenbestimmungsschema die Zusammensetzungen, die gereinigtes virales HIV p 24 enthalten, darüberhinaus einen Puffer enthalten, und wobei das Mengenbestimmungsschema darüberhinaus eine Blindzusammensetzung umfaßt, die den Puffer umfaßt, und in der gereinigtes HIV p-24 fehlt.

9. Kit nach Anspruch 8, wobei die Zusammensetzungen der Mengenbestimmungstabelle gefriergetrocknet sind.

10. Kit nach Anspruch 9, wobei in den Zusammensetzungen des Mengenbestimmungsschemas Tris der Puffer ist, und wobei die Zusammensetzungen darüberhinaus NACl enthalten.